BR112020021564A2 - estimulador de treg seletivo rur20kd-il-2 e composições relacionadas - Google Patents

estimulador de treg seletivo rur20kd-il-2 e composições relacionadas Download PDF

Info

Publication number
BR112020021564A2
BR112020021564A2 BR112020021564-3A BR112020021564A BR112020021564A2 BR 112020021564 A2 BR112020021564 A2 BR 112020021564A2 BR 112020021564 A BR112020021564 A BR 112020021564A BR 112020021564 A2 BR112020021564 A2 BR 112020021564A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
pegylated
conjugates
mol
fact
composition
Prior art date
Application number
BR112020021564-3A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Benedict Kirk
John L. Langowski
Jonathan Zalevsky
Original Assignee
Nektar Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nektar Therapeutics filed Critical Nektar Therapeutics
Publication of BR112020021564A2 publication Critical patent/BR112020021564A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Abstract

ESTIMULADOR DE TREG SELETIVO RUR20kD-IL-2 E COMPOSIÇÕES RELACIONADAS. A presente invenção refere-se a composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo RUR20kD-IL-2 e composições relacionadas, e métodos de uso dessas composições, por exemplo, para o tratamento de doenças autoimunes e/ou outras condições responsivas à terapia que é eficaz para fornecer um aumento seletivo em número e ativação de células T reguladoras sobre células T efetoras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ESTI- MULADOR DE TREG SELETIVO RURZ20KkD-IL-2 E COMPOSIÇÕES RELACIONADAS".
[001] A presente invenção refere-se a composições estimulado- ras de Treg agonista do receptor de interleucina-2 de ação prolongada (IL-2 R) que aumentam seletivamente o número e a ativação de célu- las T reguladoras, em relação às células T efetoras, e a métodos de uso dessas composições estimuladoras de Treg no tratamento de do- enças autoimunes e inflamatórias e/ou outras condições que respon- dem à terapia estimuladora com Treg. Em particular, o presente pedi- do se refere a uma composição estimuladora de Treg seletiva RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, e métodos para fazer as mesmas, formulações das mesmas e métodos de uso de RUR20ox0-IL-2 e composições relacionadas para o tratamento de doenças autoimu- nes e distúrbios inflamatórios.
[002] O sistema imunológico é a principal linha de defesa do cor- po contra a invasão de organismos infecciosos. Em um sistema imuno- lógico que funciona normalmente, uma resposta imunológica não ocor- re contra os autoantígenos; isso é conhecido como autotolerância. À doença autoimune ocorre quando os tecidos do corpo são atacados pelo próprio sistema imunológico do corpo devido a uma perda de tole- rância a autoantígenos (Dejaco, C., e outro, Immunology. 2006; 117 (3): 289-300). Em indivíduos com doença autoimune, os tecidos corpo- rais são destruídos por células T citotóxicas específicas para antíge- nos ou autoanticorpos, onde a inflamação associada pode causar in- capacidade funcional e, em alguns casos, morte. As doenças autoimu- nes são uma coleção heterogênea de doenças com um amplo espec- tro de sintomas que afetam aproximadamente seis por cento da popu- lação (Siatskas, C., e outro, Curr Gene Ther. 2006; 6 (1): 45-58). Em- bora as características clínicas das doenças autoimunes sejam muito diferentes, os mecanismos imunomediados estão associados à gera- ção de uma resposta imune adaptativa em relação ao antígeno alvo (Kuby, J., 1994: Autoimmunity. Immunology, 2º ed., P 445-467. WH Freeman and Company, Nova York).
[003] Embora vários tratamentos convencionais, como corticoste- roides, ciclofosfamida, azatioprina e metotrexato tenham sido margi- nalmente eficazes em alguns pacientes com doença autoimune, eles não são uniformemente eficazes e estão associados a efeitos colate- rais e toxicidade (Jantunen, E., e outro, Bone Marrow Transplant. 2000; 25 (4): 351-6). Essas abordagens convencionais não conse- guem abordar a patologia subjacente associada à imunidade autorrea- tiva.
[004] À luz dos recentes avanços na compreensão da fisiopatolo- gia das doenças autoimunes, novas terapias potenciais com foco em alvos celulares ou moleculares foram desenvolvidas e estão sendo avaliadas. Embora a etiologia da doença autoimune seja desconheci- da, acredita-se que seja causada pela interação potencial entre fatores genéticos, regulação imunológica inadequada e fatores hormonais e ambientais. Vários mecanismos foram propostos para a indução de doença autoimune, incluindo antígenos sequestrados, mimetismo mo- lecular, expressão irregular de moléculas de MHC de classe |l, dese- quilíbrio de citocinas, disfunção de trilhas regulatórias de rede idiotipo, defeitos regulatórios gerais de células T e ativação de células B poli- clonais (Kuby, 1994, ibid). Várias abordagens foram estudadas para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo depleção de células B, terapia com anticitocinas e terapia com células-tronco, no entanto, es- sas abordagens têm deficiências no que diz respeito à eficácia, segu- rança e/ou efeitos colaterais indesejáveis. As terapias convencionais para tratar a função de doença autoimune suprimindo o sistema imu- nológico geral, levando assim a um risco significativo de infecção e outros efeitos colaterais graves. Desse modo, permanece a necessi- dade de tratamentos adicionais para fornecer uma combinação melho- rada de eficácia, segurança e/ou tolerabilidade para o tratamento de doenças autoimunes.
[005] Por muitos anos, o papel de IL-2 nas respostas autoimunes foi estabelecido como uma citocina pró-inflamatória. No entanto, estu- dos mais recentes sugeriram que IL-2 pode desempenhar um papel protetor na inflamação autoimune crônica sob certas condições. Em particular, um equilíbrio interrompido entre as células T reguladoras (Treg) e as células T efetoras (Teff) foi identificado como uma caracte- rística comum de várias doenças autoimunes, onde esse equilíbrio in- terrompido é considerado afetado por citocinas homeostáticas, como IL-2. Devido ao seu perfil farmacocinético, a administração de |L-2 não modificada para terapia autoimune requer uma dosagem diária fre- quente ou em dias alternados, que geralmente é acompanhada por reações dolorosas no local da injeção. Além disso, a necessidade de injeções frequentes é frequentemente acompanhada de baixa adesão do paciente devido ao desconforto e inconveniência. A administração repetida a longo prazo de |L-2 é da mesma forma acompanhada por um risco elevado de atividade pleiotrópica e sistêmica indesejada de IL-2 e riscos e efeitos adversos associados. Além disso, sua margem terapêutica limitada, o uso de IL-2 não modificada para atingir a ho- meostase imune e a manutenção do equilíbrio Treg/Teff desejado po- de ser desafiador, se não inatingível, por períodos prolongados de tempo. Além disso, sua margem terapêutica limitada para a terapia de doenças autoimunes requer a administração de doses extremamente baixas de IL-2, desse modo afetando adversamente sua eficácia. Em- bora I|L-2 em baixa dosagem possa ser usada para estimular Tregs para algum benefício clínico, os eventos adversos são limitantes da dose e os aumentos de Tregs são modestos e de curta duração. Por exemplo, a administração de IL-2 não modificada para terapia de do- ença autoimune induz um aumento indesejável de IL-5 e subsequente elevação dos níveis de eosinófilos, que pode levar à inflamação. Des- se modo, permanece a necessidade de agentes que possam modular seletivamente a sinalização de |L-2 de uma maneira que promova um equilíbrio de mitigação de células T reguladoras e atividades de célu- las T efetoras em várias doenças autoimunes.
[006] Doenças autoimunes particulares têm etiopatologias subja- centes, incluindo produção prejudicada de IL-2 e/ou deficiências de células T regulatórias, que foram implicadas como mecanismos imuno- lógicos que precedem o início da doença. Permanece a necessidade de composições terapêuticas alternativas e mais eficazes, e regimes de tratamento, para reduzir eficazmente os sintomas autoimunes, para melhorar a qualidade de vida e, de preferência, proporcionar remissão prolongada em várias doenças autoimunes. A presente descrição aborda a disponibilidade limitada e deficiências relacionadas das op- ções atuais para o tratamento de doenças autoimunes crônicas.
SUMÁRIO
[007] A presente descrição é baseada na descoberta do estimu- lador de Treg seletivo RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas. As composições estimuladoras de Treg seletivas de RUR2ox0-IL-2 são misturas de conjugado de IL-2-PEG de heterogeneidade definida. Des- tinam-se à administração subcutânea de baixa dosagem para restau- rar seletivamente a homeostase de Treg com impacto mínimo em ou- tras células imunológicas. As composições estimuladoras de Treg se- letivas para RUR20x0-IL-2 são misturas de conjugados compreendendo interleucina-2 humana recombinante (rhll-2 e, em particular, a se- quência de aminoácidos de aldesleucina sem mutações ou substitui- ções de aminoácidos adicionais), estavelmente covalentemente conju- gada com polietilenoglicol 20kDa ( PEG), em que as misturas têm fra-
ções definidas com certos graus de PEGuilação por porção de IL-2. As composições da presente descrição compreendem misturas selecio- nadas de conjugados de |L-2 PEG com frações definidas de |L-2 pre- dominantemente di-PEGuilada e tri-PEGuilada e frações menores de- finidas de IL-2 mono-PEGuilada e/ou tetra ou IL-2 PEGuilada superior. Em particular, as composições da presente descrição fornecem esti- mulador de Treg seletivo RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, métodos de prepará-los, formulações dos mesmos e métodos de uso de RUR20x0-|L-2 e composições relacionadas para o tratamento de do- enças autoimunes e distúrbios inflamatórios. As composições de RUR>20x0-IL-2 induzem respostas duráveis em distúrbios inflamatórios imunológicos pela ativação e expansão de células T reguladoras es- pecíficas do antígeno. O tratamento de distúrbios autoimunes com administração subcutânea de dose baixa de uma composição de RUR20x0-IL-2 pode fornecer um meio para restaurar seletivamente a homeostase de Treg, com impacto mínimo na função das células T convencionais, desse modo proporcionando uma abordagem alternati- va e/ou melhorada para aliviar esses distúrbios.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[008] FIGs. 1A e 1B são gráficos de HPLC de fase reversa re- presentativos que ilustram a composição geral de uma composição RUR>20x0-IL-2, a preparação da qual é descrita nos Exemplos 1 e 1A. Movendo-se da esquerda para a direita ao longo do eixo x (tempos de eluição, minutos), a composição de conjugado purificado compreende principalmente rlIL-2 di-PEGuilado e tri-PEGuilado.
[009] FIG. 2 é a sequência de aminoácidos de aldesleucina (125- L-serina-2-133 interleucina-2, uma interleucina-2 recombinante não glicosilada expressa em E. coli).
[0010] FIGs. 3A e 3B são gráficos que demonstram os resultados de uma análise farmacodinâmica de Tregs de camundongo no sangue
(FIG. 3A) e baço (FIG. 3B) após a administração de uma dose única de uma composição de RUR20x0-IL-2 em camundongos, como descrito no Exemplo 2
[0011] FIGs. 4A, 4B e 4C são gráficos que mostram os níveis de células NK, células T CD4 e células T CD8, respectivamente, no san- gue, após a administração de uma dose única de uma composição de RUR20x0-IL-2 em camundongos, como descrito no Exemplo 2.
[0012] FIGs. 5A e 5B são gráficos da função e atividade de Treg como medido pela intensidade média de fluorescência (MFI) de CD25 e Foxp3 após a administração de uma dose única de uma composição de RUR20x0-I1L-2 em camundongos, como descrito no Exemplo 2.
[0013] FIGs. 6A-D são gráficos de Treg esplênicos isolados de camundongos tratados com veículo em 1 e 4 dias em um ensaio de supressão de Treg in vitro como descrito no Exemplo 3.
[0014] FIG. 7 é um gráfico que demonstra a capacidade supresso- ra relativa de Treg isolado cultivado com Tcon (células T convencio- nais) em uma relação de 1:2 avaliada ao longo do tempo, como des- crito no Exemplo 3.
[0015] FIGs. 8A e 8B demonstram a extensão do inchaço da ore- lha em camundongos tratados com uma composição de RUR20x0-IL-2; o estudo foi conduzido para avaliar a capacidade da indução de Treg pela administração de RUR2oxp-IL-2 para suprimir inflamação induzida por antígeno de célula T em um modelo de camundongo de hipersen- sibilidade de tipo retardado (DTH), como descrito no Exemplo 4.
[0016] FIGs. 9A-C são gráficos dos níveis de Treg (CD4, CD25, FOXP3, respectivamente) no sangue após a administração de uma dose única de uma composição de RUR2ox0-IL-2 em macacos cinomó- logos, como descrito no Exemplo 5.
[0017] FIGs. 10A e B são gráficos que demonstram os resultados de uma análise farmacodinâmica de Tregs de camundongo após a administração de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 ou IL-2 não modi- ficada (aldesleucina) em camundongos como descrito no Exemplo 7.
[0018] FIG. 11 é um gráfico dos níveis de proteína na urina (g / L) ao longo do tempo para camundongos administrados com uma com- posição de RUR20x0 -IL-2 (0,3 mg/kg) quando avaliados em um modelo de camundongo de lúpus eritematoso sistêmico (SLE), como descrito em detalhes no Exemplo 8
[0019] FIG. 12 é um gráfico que demonstra os resultados de uma análise farmacodinâmica de CD4+FoxP3+CD25"”"s"! Tregs em amos- tras de sangue periférico (células/uL) ao longo do tempo (dias) após uma única administração de doses variáveis de uma composição de RUR20x0-IL-2.
[0020] FIG. 13 é um gráfico que demonstra os resultados da análi- se farmacodinâmica de CD4+FoxP3+CD25+ Tregs totais em amostras de sangue periférico (células/uL) ao longo do tempo (dias) após uma única administração de quantidades variáveis de dosagem de uma composição de RUR2oxo -IL-2 a indivíduos humanos como descrito no Exemplo 10.
[0021] FIGs. 14A-D são gráficos de populações de células Tcon, células Tcon CD4+ (FIG. 14A) e células Tcon CD8+ (FIG. 14B), ex- pressas como uma porcentagem de células CD3, em amostras de sangue periférico ao longo do tempo (dias) após uma única adminis- tração de quantidades de dosagem variável de uma composição de RUR>20x0-IL-2 para indivíduos humanos como descrito no Exemplo 10. As FIGs. 14C e 14D são gráficos que ilustram o número de células T CD8+ (células/uL) e células T Ki67+CD8+ (expressas como uma por- centagem de CD8), respectivamente, em amostras de sangue periféri- co ao longo do tempo (dias) após uma única administração de quanti- dades variáveis de dosagem de uma composição de RUR2ox0-IL-2 pa- ra indivíduos humanos como descrito no Exemplo 10.
[0022] FIGs. 15A, 15B são gráficos de CD25”"s"+/FoxP3+ Tregs enumerados usando citometria de fluxo. Sangue total foi coletado de indivíduos humanos, pré-tratamento e em vários pontos de tempo pós- tratamento com uma única administração de quantidades variáveis de dosagem de RUR20ox0-IL-2, como descrito no Exemplo 10. FIG. 15A ilustra o efeito de pico mediano para cada quantidade de dosagem em números (células/ul) de CD25”"s"+/FoxP3+ Tregs, enquanto a FIG. 15B fornece números absolutos de CD25º"9"+/FoxP3+ Tregs ao longo do tempo (dias) após o tratamento.
[0023] FIGs. 16A, 16B são gráficos de células T CD4+ e CD8+, respectivamente, enumeradas usando citometria de fluxo. Sangue total foi coletado de indivíduos humanos, pré-tratamento e em vários pontos de tempo pós-tratamento com uma única administração de quantida- des variáveis de dosagem de RUR2ox0-IL-2, como descrito no Exemplo
10. Os resultados são apresentados como uma proporção (%) de cada população de células e alteração de dobra calculada com base nos valores de pré-tratamento.
[0024] FIGs. 17A, 17B são gráficos das relações de resposta à dose de Treg para Tcon (FIG. 17A), e CD25""9"t+/FoxP3+ Tregs e cé- lulas T CD8+ (FIG. 17B) enumerados usando citometria de fluxo. San- gue total foi coletado de indivíduos humanos, pré-tratamento e em vá- rios pontos de tempo pós-tratamento com uma única administração de quantidades variáveis de dosagem de RUR2ox0-IL-2, como descrito no Exemplo 10. Os resultados são apresentados como uma relação da proporção (%) de cada população de células e alteração de dobra cal- culada com base nos valores de pré-tratamento. As células Tcon são células T CD8+. Descrição detalhada
[0025] A presente descrição fornece composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composi- ções relacionadas. Geralmente, as composições de conjugado de IL-2 quimicamente modificadas fornecidas no presente documento são ca- racterizadas por terem um número particular e predominante de por- ções de polietilenoglicol ramificado de forma covalente ligada a IL-2 por meio de seus grupos amino. As composições fornecidas no pre- sente documento compreendem misturas selecionadas de conjugados de IL-2 PEG tendo frações definidas de |L-2 predominantemente di- PEGuUilada e tri-PEGuilada e frações menores definidas de IL-2 mono- PEGuUilada e/ou tetra ou IL-2 PEGuilada superiores.
[0026] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição compreendendo conjugados de IL-2 PEGuilados com uma estru- tura:
Q HEE(OCHZCH)ATNH-C-O"CHz o ( o frentes H3C-(OCHZCH3) -NH-C-O-CH, h É " q HSC-(OCHÇCH)NTNH-C-0-GH2 o ( o Hi OCHOA: boo H3C-(OCH3CH3),-NH-C-O0-CH, do em que: I1L-2 é uma interleucina-2; n é, independentemente, em cada ocorrência, um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000.
[0027] Em uma modalidade particular da referida composição, IL-2 é aldesleucina. Em uma modalidade particular das referidas composi- ções, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietileno- glicol ramificado é de cerca de 20.000 daltons. Em uma outra modali- dade particular das referidas composições, os conjugados de IL-2 PE-
Gyalted da composição têm uma porção de PEG ligada à lisina 31.
[0028] Em um aspecto, fornecidas no presente documento são composições compreendendo conjugados da fórmula:
R HC(OCHILHA,NH-S-0-CHz o ( o Tretas H30-(OCHZCHa) -NH-C-O-CH,
DO em que |L-2 é uma interleucina-2, n é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000 e n' é 2e3.
[0029] A porção de polímero da fórmula (1) é da mesma forma re- ferida como 1,3-bis(metoxipoli(etilenoglicol) MW 10.000 carbamoil)-2- propanóxi)-4-butanoila (até e incluindo o grupo carbonila que está co- valentemente ligado a um amino nitrogênio da porção de IL-2). As composições de mistura de acordo com a fórmula (1) são geralmente referidas aqui como RUR-IL2 que abrange uma faixa de tamanhos de PEG. As faixas ilustrativas de n incluem, por exemplo, além de cerca de 3 a cerca de 4000, de cerca de 5-2000, ou de cerca de 10-1000, ou de cerca de 10-750, ou de cerca de 10-500, ou de cerca de 10 -400, ou cerca de 10-300, ou cerca de 10-250, ou cerca de 20-250. Em al- gumas modalidades, n é, em média, cerca de 226.
[0030] Em outro aspecto, fornecidas no presente documento são composições da fórmula:
R HsC(OCHCH)ATNH-C-0-CH o ( o He oo 12CH,2CI dejos HsC-(OCHICHa) -NH-C-O0-CH? A) em que |L-2 é uma interleucina-2, n é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000 en'é 1e2e3.
[0031] Em algumas modalidades, a composição estimuladora de Treg seletiva da fórmula | compreende IL-2R estavelmente covalente-
mente ligado a porções de polietilenoglicol ramificado, onde o número de porções de PEG ramificados por porção de IL-2 (grau de PEGuila- ção) é uma distribuição de predominantemente 2 e 3-mers (di- e tri PEGUuilados) em uma mistura com frações menores incluindo 1-mers (mono-PEGuilados) e 4-mers (tetra PEGuilados). Desse modo, em al- gumas modalidades, as frações menores nas composições de acordo com a fórmula | incluirão conjugados em que n' é 1, 4, 5 ou superior, porém não mais do que 11.
[0032] Por exemplo, em uma modalidade, a composição estimula- dora de Treg seletiva é englobada pela seguinte estrutura:
R HEC(OCHZEHa)-NH-C-O-GH2 o ( o Erectaos H30-(OCH3CHa) -NH-C-O-CH? "(lb em que IL-2 é um dos resíduos de aminoácidos de IL-2 e o "NH" mos- trado na estrutura (lb) é um grupo amino do referido resíduo de IL-2; onde "n" é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000; en'é2e
3.
[0033] Em algumas modalidades fornecidas no presente documen- to, estão composições estimuladoras de Treg seletivas referidas como RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas. Estas composições com- preendem conjugados de IL-2 com anexos de PEG covalentes indivi- duais com pesos moleculares nominais de cerca de 20 kD no total, como aqui descrito. De preferência, a porção de IL-2 é aldesleucina. Estas composições compreendem ainda misturas selecionadas de conjugados de IL-2 PEG com frações definidas de IL-2 predominante- mente di-PEGuilada e tri-PEGuilada e frações menores definidas de IL-2 mono-PEGuilada e/ou tetra ou IL-2 PEGuilada superior. Prepara- ções particulares de composições de RUR2ox0-IL-2 são descritas abai- xo e ao longo deste pedido. Quando aqui utilizadas, composições de
RUR>20x0-IL-2 da Fórmula A, composições de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula B, composições de RUR20x0-IL-2 da Fórmula C, composições de RUR20x0-IL-2 da Fórmula D, e/ou composições de RUR20x0-IL-2 da Fórmula E, representam certas modalidades do estimulador de Treg seletivo RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, e nessas modali- dades a porção |L-2 é aldesleucina (como aqui descrito). Opcional- mente, essas composições compreendem seus sais farmaceuticamen- te aceitáveis.
[0034] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula A, em que a composi- ção compreende, em uma base em mol, cerca de 5% em mol ou me- nos de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados e de cerca de 28% em mol a cerca de 60 em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados, e de cerca de 24 em mol a cerca de 65 em mol de conjugados tri- PEGuilados de IL-2 e cerca de 12 em mol ou menos de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que o peso molecular médio de ca- da porção ramiíficada de polietilenoglicol é de cerca de 20.000 daltons. De preferência, a composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula A compre- ende 80% em mol ou mais conjugados de IL-2 di- e tri-PEGuilados combinados.
[0035] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula B, em que a composi- ção compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,5 a cerca de 4,5 em mol de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados e de cerca de 35 a cerca de 50 em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados, e de cerca de 38 a cerca de 46 em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilados, e de cerca de 3 a cerca de 10 em mol de conjugados de I|L-2 PEGuila- dos maiores, e em que o peso molecular médio nominal de cada por- ção ramíficada de polietilenoglicol é cerca de 20.000 daltons. De prefe- rência, a composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula B compreende um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 80 a cerca de 95% em mol.
[0036] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula C, em que a composi- ção compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de |L-2 di-PEGuilados, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol de conjugados de IL-2 tri- PEGuilados, e de cerca de 7 a cerca de 9 em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que o peso molecular médio nomi- nal de cada porção ramificada de polietilenoglico! é de cerca de 20.000 daltons. De preferência, a composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula C compreende um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
[0037] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula D, em que a composi- ção compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol conjugados de IL-2 tri- PEGuilados, e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que a referida composição compre- ende uma mistura de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada a uma da lisina K7 ou K8 ou K31 ou K75, e em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietile- noglicol ramificado é de cerca de 20.000 daltons. De preferência, a composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula D compreende um total com- binado de conjugados di-PEGuilados e tri-PEGuilados de |L-2 de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
[0038] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula E, em que a composi- ção compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de I|L-2 PEGuilados, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol de conjugados de |IL-2 tri- PEGuilados, e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que a referida composição compre- ende conjugados de I|L-2 mono-PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada à lisina K7, em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado é de cerca de 20.000 dal- tons. De preferência, a composição de RUR2ox0-IL-2 da Fórmula E compreende um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
[0039] Quando utilizadas no presente documento, "RUR20ox0-IL-2 e composições relacionadas" podem referir-se a uma ou mais composi- ções de acordo com qualquer um de um RUR2ox0-IL-2 da Fórmula À e/ou um RUR2ox0-IL-2 da Fórmula B, e/ou um RUR2ox0-IL-2 da Fórmula C e/ou um RUR2ox0-IL-2 da Fórmula D e/ou um RUR2ox0-IL-2 da Fór- mula E e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis destas composições. As preparações do Exemplo 1 e/ou Exemplo 1A são exemplos não limitantes de um "RUR2ox0-IL-2 e composição relacionada" da presente descrição. Outras modalidades das composições estimuladoras de Treg se- letivas fornecidas no presente documento:
[0040] As composições fornecidas no presente documento podem compreender conjugados onde n é igual a 2, por exemplo, um conju- gado di-PEGuilado em que dois polímeros de polietilenoglico! ramifica- do, cada um tendo o estrutura de 1,3- bis(metoxipoli(etilenoglico|)1 OkDcarbamoil)-2-propanóxi)-4-butanoila mostrada acima, são ligadas nas mesmas localizações relativas para substancialmente todos os conjugados de IL-2 di-PEGuilados na com- posição. Alternativamente, um conjugado di-PEGuilado pode compre- ender uma mistura de conjugados di-PEGuilados, por exemplo, uma mistura de conjugados di-PEGuilados onde a ligação da porção de po- lietilenoglicol ramificado ocorre em dois locais em IL-2, onde os sítios de ligação específicos não são os mesmos para todos os conjugados de IL-2 di-PEGuilados compreendidos na composição. Desse modo, tais composições di-PEGuiladas são homogêneas em termos do grau de PEGilação, em particular o número de porções PEG ramificadas ligadas (por exemplo, 2-mers), porém são heterogêneas em termos das localizações de fixação de PEG na IL-2 molécula e, neste caso, representam isômeros posicionais de ligação de PEG.
[0041] As composições podem da mesma forma compreender conjugados únicos em que n é igual a 3, por exemplo, um conjugado tri-PEGuilado em que três frações de polietilenoglicol ramificadas são ligadas nas mesmas localizações relativas para substancialmente to- dos os conjugados de IL-2 na composição. Alternativamente, um con- jugado tri-PEGuilado pode compreender uma mistura de conjugados tri-PEGuilados, por exemplo, uma mistura de conjugados tri- PEGuilados onde o sítio de ligação da porção de polietilenoglicol rami- ficado ocorre em diferentes sítios em IL-2 para os conjugados compre- endidos na composição. Desse modo, tais composições tri- PEGuiladas são homogêneas em termos do grau de PEGilação, em particular o número de porções de PEG ramiíficados ligadas, porém são heterogêneas em termos das localizações de fixação de PEG na molécula de |L-2 e, neste caso, representam isômeros posicionais de fixação PEG.
[0042] As composições podem da mesma forma compreender conjugados únicos onde n é igual a 1, por exemplo, um conjugado mono-PEGuilado em que uma porção de polietilenoglicol ramificado está ligada na mesma localização relativa para substancialmente todos os conjugados de IL-2 na composição. Alternativamente, um conjuga- do mono-PEGuilado pode compreender uma mistura de conjugados mono-PEGuilados, por exemplo, uma mistura de conjugados mono- PEGuilados onde o sítio de ligação da porção de polietilenoglicol rami- ficado ocorre em diferentes sítios em IL-2 para os conjugados compre- endidos na composição. Desse modo, tais composições mono- PEGuiladas são homogêneas em termos do grau de PEGuilação, em particular o número de porções de PEG ramiíficados ligadas, porém são heterogêneas em termos da localização da fixação de PEG na molécula de |L-2 e, neste caso, representam isômeros posicionais de fixação PEG.
[0043] Certos locais de fixação de PEG na molécula de IL-2 são mais prevalentes nas composições aqui descritas. Por exemplo, as lisinas K7 ou K8 ou K31 ou K75 são comumente sítios PEGuilados. As composições de RURz2ox0-IL-2 e composições relacionadas podem compreender conjugados em que as lisinas K7 ou K8 ou K31 ou K75 são sítios PEGuilados. As composições de RUR2ox0-IL-2 e composi- ções relacionadas podem compreender conjugados mono-PEGuilados em que as lisinas K7 ou K8 ou K31 ou K75 são sítios PEGuilados. As composições de RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas podem compreender conjugados mono-PEGuilados em que a lisina K7 é um local PEGuilado. As composições de RUR2ox0-IL-2 e composições re- lacionadas podem compreender conjugados mono-PEGuilados em que a lisina K31 é um sítio PEGuilado.
[0044] Em algumas modalidades, a composição não contém mais do que cerca de 20% em mol e, de preferência, não mais do que cerca de 15% em mol de conjugados, quando considerados coletivamente, abrangidos pela fórmula (1), onde n' é um número inteiro selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5, em que a porcentagem em mol é baseada no total de conjugados de PEG-IL-2. Em algumas modalidades, a composição não contém mais do que cerca de 10% em mol de conjugados, quando consideradas coletivamente, engloba- das pela fórmula (1), onde n' é um número inteiro selecionado de 1,4, 5, ou um número inteiro maior que 5, onde a porcentagem em mol é baseada no total de conjugados de PEG-IL-2. Em algumas modalida- des adicionais, a composição contém não mais do que cerca de 10% em mol de monômeros e, de preferência, não mais do que cerca de 7% em mol de monômeros, ou não mais do que cerca de 5% em mol de monômeros (isto é, de acordo com a estrutura (|) onde n é igual a 1). Em algumas outras modalidades, a composição não contém mais do que cerca de 10% em mol de tetrâmeros e, de preferência, não mais do que cerca de 7% em mol de tetrâmeros, ou não mais do que cerca de 5% em mol de tetrâmeros (ou seja, de acordo com a estrutu- ra (1) onde n é igual a 4). Em certas modalidades adicionais, a compo- sição compreende não mais do que cerca de 10% em mol de monô- meros e não mais do que cerca de 10% em mol de tetrâmeros. Alter- nativamente, a composição compreende não mais do que cerca de 7% em mol de monômeros e não mais do que cerca de 7% em mol de te- trâmeros, ou pode compreender não mais do que cerca de 5% em mol de monômeros e não mais do que cerca de 5% em mol de tetrâmeros.
[0045] Em algumas modalidades, com relação à IL-2 PEGuilada na composição, a composição irá geralmente satisfazer uma ou mais das seguintes características: pelo menos cerca de 80% dos conjuga- dos na composição irão compreender uma mistura de conjugados di- PEGuilados e tri-PEGuilados, alguns tendo 2 e alguns tendo 3 políme- ros ramificados tendo a estrutura mostrada na fórmula (1) acima liga- dos à porção de IL-2; pelo menos cerca de 85% dos conjugados na composição —compreenderão uma mistura de conjugados di- PEGuilados e tri-PEGuilados, alguns tendo 2 e alguns tendo 3 políme-
ros ramificados tendo a estrutura mostrada na fórmula (1) acima ligada à porção de IL-2; pelo menos cerca de 90% dos conjugados na com- posição compreenderão uma mistura de conjugados di-PEGuilados e tri-PEGuilados, alguns tendo 2 e alguns tendo 3 polímeros ramificados tendo a estrutura mostrada na fórmula (|) acima ligada à porção de IL- 2; e pelo menos cerca de 95% dos conjugados na composição com- preenderão uma mistura de conjugados di-PEGuilados e tri- PEGuilados, alguns tendo 2 e alguns tendo 3 polímeros ramificados tendo a estrutura mostrada na fórmula (1) acima ligados à porção de IL-2; não mais do que cerca de 20% dos conjugados na composição terão de 1, ou 4 ou mais polímeros ramificados possuindo a estrutura mostrada na fórmula (1) acima ligados à porção de IL-2; não mais do que cerca de 15% dos conjugados na composição terão de 1, ou 4 ou mais polímeros ramíificados com a estrutura mostrada na fórmula (1) acima ligados à porção de IL-2; não mais do que cerca de 10% dos conjugados na composição terão de 1, 4 ou mais polímeros ramifica- dos possuindo a estrutura mostrada na fórmula (|) acima ligados à porção de IL-2; não mais do que cerca de 7% dos conjugados na composição terão de 1, ou 4 ou mais polímeros ramificados tendo a estrutura mostrada na fórmula (1) acima ligados à porção de IL-2.
[0046] Em algumas modalidades, a composição contém não mais do que cerca de 20% em mol e, de preferência, não mais do que cerca de 15% em mol de compostos, quando considerados coletivamente, englobados pela fórmula (1), onde n' é um número inteiro selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5, em que a porcentagem em mol é baseada no total de conjugados de PEG-IL-2. Em algumas modalidades, a composição não contém mais do que cerca de 10% em mol de conjugados, quando considerados coletivamente, engloba- dos pela fórmula (|), onde n' é um número inteiro selecionado de 1, 4, 5, ou um número inteiro maior que 5, onde a porcentagem em mol é baseada no total de conjugados de PEG-IL-2. Em algumas modalida- des adicionais, a composição contém não mais do que cerca de 10% em mol de monômeros e, de preferência, não mais do que cerca de 7% em mol de monômeros, ou não mais do que cerca de 5% em mol de monômeros (isto é, de acordo com a estrutura (|) onde n é igual a 1). Em algumas outras modalidades, a composição não contém mais do que cerca de 10% em mol de tetrâmeros, e de preferência não mais que cerca de 7% em mol de tetrâmeros, ou não mais que cerca de 5% em mol de tetrâmeros (isto é, de acordo com a estrutura (|) onde n é igual a 4). Em certas modalidades adicionais, a composição compre- ende não mais do que cerca de 10% em mol de monômeros e não mais do que cerca de 10% em mol de tetrâmeros. Alternativamente, a composição compreende não mais do que cerca de 7% em mol de monômeros e não mais do que cerca de 7% em mol de tetrâmeros, ou pode compreender não mais do que cerca de 5% em mol de monôme- ros e não mais do que cerca de 5% em mol de tetrâmeros.
[0047] Em algumas outras modalidades, a composição compreen- de quantidades aproximadamente equimolares de
Q H3€-(OCH2CHa) -NH-C-O0-CH, o ( o prantos H3C-(OCHZCH2) -NH-C-O0-CH, 2 e
Q H;C-(OCHCH) -NH-C-O-CH, o ( o He-ocio bjo n H3$C-(OCHzCH2),-NH-C-O0-CH, 3 .
[0048] Por exemplo, composições ilustrativas podem compreender qualquer uma ou mais das seguintes relações aproximadas de espé- cies di-PEGuiladas para espécies tri-PEGuiladas: 1,4:1; 1,3:1; 1,2:1; 1,1:1; 1:1; 1:1,1; 1:1,2; 1:1,3; ou 1:1,4. O número médio de porções de
PEG por |L-2 para tais composições é selecionado de, por exemplo, 2; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; e 3. Em certas modalida- des, o número médio de frações PEG por IL-2 é cerca de 2,5.
[0049] Por exemplo, em algumas modalidades, as composições compreendem não mais do que cerca de 20 por cento em mol (% em mol) de conjugados de IL-2, quando considerados coletivamente, en- globados pela fórmula
Q H3C-(OCHZCH2), —NH-C-O0-CH, o ( o frentes H3C-(OCH3CH2), -NH-C-0-CH, NO: em que n' é selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
[0050] No entanto, em algumas modalidades adicionais, as com- posições compreendem não mais do que cerca de 15 por cento em mol (% em mol) de conjugados de IL-2, que quando considerados co- letivamente, são abrangidos pela fórmula
Q HIC-(OCHCH), -NH-C-O-CH2 o ( o osentabos H3O0-(OCHACH2), -NH-C-O0-CH, hr e têm n 'selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
[0051] Ainda em algumas modalidades adicionais, as composições compreendem não mais do que cerca de 10 por cento em mol (% em mol) de conjugados de IL-2, que quando considerados coletivamente, são abrangidos pela fórmula
R H;C-(OCH2CH2), -NH-C-0-CH, o ( o font 2) H3C-(OCH;CH2),-NH-C-O0-CH,z no e têm n 'selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
[0052] Em algumas modalidades adicionais dos anteriores, a com- posição compreende não mais do que cerca de 10% em mol de conju- gados de IL-2 e tendo n' igual a 1. Em ainda algumas outras modali- dades, a composição compreende não mais do que cerca de 7% em mol de IL- 2 conjugados com n' igual a 1.
[0053] Em ainda algumas outras modalidades, as composições compreendem não mais do que cerca de 5% em mol de conjugados de IL-2 n' igual a 1. Em ainda algumas modalidades alternativas, a composição compreende menos do que cerca de 5% em mol de con- jugados de IL-2 tendo n' igual a 1.
[0054] Em algumas modalidades adicionais, relacionadas a qual- quer um ou mais dos anteriores, a composição compreende não mais do que cerca de 10% em mol de conjugados de IL-2 tendo n' igual a 4. Ou, em algumas outras modalidades, a composição compreende não mais do que cerca de 7% em mol de conjugados de IL-2 tendo n' igual a 4. Em ainda algumas modalidades adicionais, a composição com- preende não mais do que cerca de 5% em mol de conjugados de |L-2 tendo n' igual a 4.
[0055] Da mesma forma é fornecida no presente documento uma composição que compreende quantidades aproximadamente equimo- lares de
Q H3C-(OCHZ0H3), -NH-C-O0-CH2 o ( o reiontaos H30-(OCH3CH2),-NH-C-O-CH, 2 e
Q HsC(OCHZCH),TNH-C-0-GHa o | o fomato H$0-(OCHZCH2),-NH-C-0-CH, 3 .
[0056] Ainda em modalidades adicionais, é fornecida no presente documento uma composição compreendendo conjugados de IL-2 da fórmula
Q HSC-(OCHZCHa), -NH-C-0-GHa o | o fotos H3C-(OCH3CH2), -NH-C-0-CH, ? e
Q HSC(OCHZCH)ATNH-C-O-CHz o ( o HÇE-OCHaCHa bjo H3C-(OCHZCH)-NH-C-O-CH, 3 . em que a relação em mol de conjugados de diPEG/triPEG é selecio- nada a partir do grupo que consiste em 1,4:1; 1,3:1; 1,2:1; 1,1:1; 1:1; 1:1,1; 1:1,2; 1:1,3; e 1:1,4.
[0057] Em ainda algumas modalidades adicionais, a composição tem um número médio de porções de polietilenoglicol ramificado (ten- do uma estrutura como mostrada acima) por resíduo de I|L-2 selecio- nado a partir do grupo que consiste em 2; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5, 2,6; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; e 3. Em uma modalidade particular, o número médio de porções de polietilenoglicol ramificado (tendo uma estrutura como mostrado acima) por porção de IL-2 é cerca de 2,5. Em algumas mo- dalidades relacionadas a um ou mais dos anteriores, o valor de n varia de 5-2000. Em algumas outras modalidades, o valor de n varia de 10-
1000. Em ainda algumas modalidades adicionais, o valor de n varia de 10-750. Em algumas modalidades, o valor de n varia de 10-500 ou de 20-250.
[0058] O valor de n nas modalidades fornecidas no presente do- cumento pode variar independentemente em cada ocorrência. Em uma ou mais modalidades aqui descritas, o valor de n em cada um dos bra- ços de polietilenoglicol do polímero ramificado é substancialmente o mesmo. Em algumas outras modalidades, o valor de n em cada um dos braços de polímero que compreendem o polímero ramificado varia de cerca de 170 a 285. Em ainda algumas modalidades adicionais, o valor de n em cada um dos braços de polímero que compreendem o polímero ramificado varia de cerca de 204 a cerca de 250. Em uma ou mais modalidades particulares, o valor de n em cada um dos braços de polímero que compreendem o polímero ramificado é de cerca de
226.
[0059] Em uma ou mais modalidades relacionadas a qualquer um ou mais dos aspectos ou modalidades fornecidas no presente docu- mento, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietile- noglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 250 daltons a cerca de 90.000 daltons. Em algumas outras modalidades, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 1000 daltons a cerca de 60.000 daltons. Em ainda outras modalidades, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de
5.000 daltons a cerca de 60.000 daltons. Em algumas outras modali- dades, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietileno- glicol ramificado está em uma faixa de cerca de 10.000 daltons a cerca de 55.000 daltons.
[0060] Em ainda algumas modalidades adicionais, o peso molecu- lar médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 15.000 daltons a cerca de 25.000 daltons. Em ainda uma ou mais modalidades adicionais, o peso molecular mé- dio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramíificado está em uma faixa de cerca de 18.000 daltons a cerca de 22.000 daltons. Em ainda algumas modalidades adicionais, o peso molecular médio nomi- nal de cada porção de polietilenoglicol ramificado é de cerca de 20.000 daltons.
[0061] Composições exemplares adicionais compreendem compo-
sições de acordo com as fórmulas acima, em que a porção total do polímero da molécula tem um peso molecular médio nominal em uma faixa de cerca de 250 daltons a cerca de 90.000 daltons. Faixas adici- onais adequadas para a porção de polímero da molécula incluem pe- sos moleculares médios nominais em uma faixa selecionada de cerca de 1.000 daltons a cerca de 60.000 daltons, em uma faixa de cerca de
5.000 daltons a cerca de 60.000 daltons, em uma faixa de cerca de
10.000 daltons a cerca de 55.000 daltons, em uma faixa de cerca de
15.000 daltons a cerca de 50.000 daltons, e em uma faixa de cerca de
20.000 daltons a cerca de 50.000 daltons.
[0062] Pesos moleculares médios ponderados ilustrativos adicio- nais para a porção de polímero de polietilenoglicol incluem cerca de 200 daltons, cerca de 300 daltons, cerca de 400 daltons, cerca de 500 daltons, cerca de 600 daltons, cerca de 700 daltons, cerca de 750 dal- tons, cerca de 800 daltons, cerca de 900 daltons, cerca de 1.000 dal- tons, cerca de 1.500 daltons, cerca de 2.000 daltons, cerca de 2.200 daltons, cerca de 2.500 daltons, cerca de 3.000 daltons, cerca de 4,000 daltons, cerca de 4.400 daltons, cerca de 4.500 daltons, cerca de 5.000 daltons, cerca de 5.500 daltons, cerca de 6.000 daltons, cer- ca de 7.000 daltons , cerca de 7.500 daltons, cerca de 8.000 daltons, cerca de 9.000 daltons, cerca de 10.000 daltons, cerca de 11.000 dal- tons, cerca de 12.000 daltons, cerca de 13.000 daltons, cerca de
14.000 daltons, cerca de 15.000 daltons, cerca de 20.000 daltons, cer- ca de 22.500 daltons, cerca de 25.000 daltons, cerca de 30.000 dal- tons, cerca de 35.000 daltons, cerca de 40.000 daltons, cerca de
45.000 daltons, cerca de 50.000 daltons, cerca de 55.000 daltons, cer- ca de 60.000 daltons, cerca de 65.000 daltons, cerca de 70,0 00 dal- tons e cerca de 75.000 daltons. Em algumas modalidades preferidas, o peso molecular médio ponderado do polímero de polietilenoglicol rami- ficado é de cerca de 20.000 daltons. Em algumas modalidades particu-
lares em que cada porção de PEG ramiíficado tem um peso molecular nominal de cerca de 20.000 daltons, a faixa de peso molecular resul- tante da composição é de cerca de 55 a 75 kDa, quando caracterizada para a composição geral.
[0063] Outras modalidades das composições estimuladoras de Treg seletivas fornecidas no presente documento compreendem seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Como descrito acima, as composi- ções de conjugado de IL-2 podem estar na forma de um sal farmaceu- ticamente aceitável. Normalmente, esses sais são formados por rea- ção com um ácido farmaceuticamente aceitável ou um ácido equiva- lente. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" a este respeito, ge- ralmente se refere aos sais de adição de ácido inorgânico e orgânico, relativamente não tóxicos. Estes sais podem ser preparados in situ no veículo de administração ou no processo de fabricação da forma de dosagem, ou por reação separada de uma composição de interleuci- na-2 de ação prolongada, como descrito aqui, com um ácido orgânico ou inorgânico adequado e isolando o sal desse modo formado. Os sais representativos incluem o bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, sucinato, tartarato, naftilato, oxilato, sais de mesilato, glucoeptonato, lactobiona- to e laurilsulfonato e similar. (Ver, por exemplo, Berge e outro (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1-19). Desse modo, os sais descritos podem ser derivados de ácidos inorgânicos, tais como clorí- drico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e similar; ou preparado a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, sucínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbi- co, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoi- co, Ssalicíclico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfô- nico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico e similar.
Quando aqui utilizado, o termo "composição" ou "composições", inclu- indo as modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas aqui descritas, compreendem qualquer e/ou todos os sais farmaceuti- camente aceitáveis dos conjugados de IL-2 PEGuilados. Esta descri- ção se aplica se o termo "ou sal farmaceuticamente aceitável do mes- mo" é adicionado à descrição da composição ou não. Métodos de modalidades de uso
[0064] Em contraste com a IL-2 não modificada, as composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL- 2 e composições relacionadas aqui descritas, abordam a patologia subjacente associada à imunidade autorreativa, bem como mecanis- mos específicos de alvo para a produção de funções benéficas de cé- lulas T, fornecem melhorias significativas em relação à administração de IL-2 não modificada. Para abordar deficiências nas terapias de do- enças autoimunes existentes, as composições presentes fornecem exposição prolongada após a administração e têm um perfil farmaco- lógico único. As presentes composições expandem e ativam seletiva- mente Tregs endógenos in vivo, com expansão limitada de células T convencionais e/ou células exterminadoras naturais e, desse modo, fornecem uma abordagem superior para o tratamento de doenças au- toimunes.
[0065] Mais particularmente, as composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, fornecidas no presente documento, tendo um número particular e predominante de frações de polietilenoglicol ramificado de forma covalente ligada a IL-2 através de seus grupos amino, foram descobertas como sendo particularmente eficazes quando administra- das em doses baixas. As presentes composições são eficazes na liga- ção e ativação do receptor de IL 2 para aumentar preferencialmente a população de células e a função imunossupressora de células T regu-
ladoras (Treg), enquanto têm efeito estimulador mínimo nas células T efetoras (Teff). A exposição prolongada às presentes composições (geralmente referida aqui como RUR2ox0-IL-2 e composições relacio- nadas ou em outros casos como composições de RUR-IL-2) em roe- dores, estudos de primatas não humanos e estudos clínicos humanos foi eficaz para fornecer uma magnitude, duração e especificidade das respostas de Treg a Teff que não puderam ser alcançadas com doses equivalentes de IL-2 não modificada.
[0066] A administração de uma única dose subcutânea ascenden- te baixa da composição estimuladora de Treg seletiva RUR20x0-IL-2 (como descrito nos exemplos de apoio) a humanos resultou em ne- nhuma toxicidade limitante de dose, eventos adversos graves ou anormalidades clinicamente significativas. A análise farmacocinética preliminar mostrou que a composição atingiu concentrações máximas em torno de 4-6 dias pós-dose na maioria dos indivíduos, com pouca alteração nas concentrações até aproximadamente 2 semanas pós- dose, após o que as concentrações diminuíram com uma meia-vida de aproximadamente 8-9 dias. A avaliação farmacodinâmica preliminar revelou que a administração da composição do estimulador de Treg do agonista seletivo do receptor de |L-2 de longa ação levou a um aumen- to dependente da dose nas Tregs CD4+FoxP3+CD25""s"!' ou seja, houve um aumento prolongado nos números absolutos de CD4+FoxP3+CD25*”9h"' Tregs circulantes, com níveis não retornando aos valores de referência até aproximadamente 20 a 25 dias após a administração. Houve um aumento médio no número de CD4+FoxP3+CD25"9"' Tregs de várias vezes (com magnitude depen- dendo da dose), em comparação com a pré-dose. Houve também um aumento na população total de CD4+FoxP3+CD25+ Treg, embora a magnitude da mudança tenha sido menor do que a observada para as CD4+FoxP3+CD25"9"' Tregs. Para as doses mais baixas, não houve alteração no número de Tregs nos indivíduos tratados em comparação aos indivíduos com placebo. O efeito primário foi observado em Tregs, uma vez que nenhuma alteração na porcentagem ou número de popu- lações de células T (CD4+, CD8+) foi observada com uma composição de RUR20x0-IL-2 em qualquer dose. Desse modo, as presentes com- posições e métodos são surpreendentemente eficazes para aumentar a capacidade supressora de Treg em bioensaios in vivolex vivo (mes- mo quando comparados com compostos de IL-2 quimicamente modifi- cados alternativos) e em estudos humanos também, como será des- crito, juntamente com outros recursos nas seções a seguir.
[0067] As composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, fornecidas no presente documento, são úteis para (entre outras coisas) o trata- mento de doenças e distúrbios autoimunes. Doenças autoimunes exemplares que podem ser tratadas pela administração de uma com- posição de RUR-IL-2 ou RUR2ox0-IL-2, como descrito aqui, incluem condições sistêmicas, tais como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite reumatóide, dermatite atópi- ca, esclerose sistêmica, espondilite anquilosante, doença do enxerto versus hospedeiro e polimiosite; ou doenças autoimunes específicas de órgãos incluem diabetes tipo 1, doença de Addison, tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, síndrome de Sjogren, vitiligo, anemia perniciosa, glomerulonefrite, miastenia grave, síndrome de Goodpastu- re, anemia hemolítica autoimune, purpura trombocitopênica ideopática, alergia a amendoim e fibrose pulmonar.
[0068] Em algumas modalidades, a condição a ser tratada é lúpus eritematoso sistêmico (SLE). O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença inflamatória autoimune que afeta principalmente mulheres de meia-idade. As características do SLE incluem, por exemplo, erup- ções cutâneas, dores nas articulações, pleurisia recorrente e doenças renais. Um desequilíbrio homeostático progressivo de Tregs em rela- ção aos Tcons é compartilhado por muitas doenças autoimunes, inclu- indo o LES. Tomados em conjunto, a hipótese terapêutica relacionan- do a homeostase de Treg à patologia de LES, a atividade de I|L-2 em baixa dose em pacientes com LES e as propriedades de indução de Treg superiores de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas aqui descritas, em relação a IL -2, fornecem amplo suporte para o uso do presente RUR-IL-2 ou RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas no tratamento de SLE e outras doenças e condições autoimunes. Em uma ou mais modalidades adicionais, é fornecido aqui um método de tratamento de uma condição pela administração de uma composição relacionada a RUR-IL-2 ou RUR20ox0-IL-2 como descrito aqui, em que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em, por exem- plo, alergia, GVHD, doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumató- ide, diabetes tipo 1, esclerose múltipla e psoríase.
[0069] Em ainda algumas modalidades adicionais, as composições relacionadas a RUR-IL-2 ou RUR2ox0-IL-2 são eficazes quando admi- nistradas em uma dose terapeuticamente eficaz a um indivíduo para expandir e ativar preferencialmente células T reguladoras sobre célu- las T convencionais e células exterminadoras naturais.
[0070] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método para au- mentar a relação de células T reguladoras para células T efetoras em um indivíduo pela administração ao indivíduo de uma dose terapeuti- camente eficaz de uma composição relacionada a RUR-IL-2 ou RUR20x0-IL-2 como descrito aqui.
[0071] Em algumas modalidades relacionadas ao método anterior, as células T reguladoras são selecionadas a partir de células Foxp3+ e CD25+. Em uma ou mais modalidades relacionadas à modalidade ou método anterior, as células T efetoras são selecionadas a partir de cé- lulas CD4+ e CD8+.
[0072] Em algumas outras modalidades relacionadas ao método ou às modalidades relacionadas acima, o aumento em células T regu- ladoras quando comparado à linha de referência atinge um valor de pelo menos cerca de 2, ou pelo menos cerca de 4, ou mesmo pelo menos cerca de 6, quando avaliado em um modelo de camundongo in vivo.
[0073] Em algumas modalidades do método, o aumento no núme- ro de células T reguladoras é prolongado acima dos níveis de linha de referência por pelo menos 3 dias após a administração. Em algumas modalidades adicionais, o aumento no número de células T regulado- ras é prolongado acima dos níveis da linha de referência por pelo me- nos 5 dias após a administração. De preferência, o aumento no núme- ro de células T reguladoras é prolongado acima dos níveis de linha de referência por pelo menos 7 dias.
[0074] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição estimuladora de Treg seletiva, inclu- indo RUR-IL-2 ou composição relacionada com RUR2oxD-IL-2 modali- dades como descrito acima ou em outro lugar aqui.
[0075] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição selecionada do grupo que consiste em: RUR2ox0-IL-2 Fórmula A, RUR200-IL -2 Fórmula B, RUR20x0-IL-2 Fórmula C, RUR20x0-IL-2 Fórmula D e RUR20ox0-IL-2 Fórmula E.
[0076] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição selecionada a partir do grupo consis-
tindo em: RUR2ox0-IL-2 Fórmula A, RUR20x0-IL -2 Fórmula B e RUR20x0-IL-2 Fórmula C.
[0077] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula A.
[0078] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição de RUR2oxD-IL-2 Fórmula B.
[0079] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo com uma doença autoimune, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição de RUR2oxD-IL-2 Fórmula C.
[0080] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição selecionada a partir do grupo consistindo em: RUR20x0-IL-2 Fórmula A, RUR20x0-IL-2 Fórmula B, RUR2ox0-IL-2 Fór- mula C, RUR>2ox0-IL -2 Fórmula D e RUR20ox0-IL-2 Fórmula E.
[0081] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula A.
[0082] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula B.
[0083] Ainda em um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula C.
[0084] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula D.
[0085] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso na tera- pia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 Fórmula E.
[0086] Em ainda um outro aspecto, é fornecido aqui o uso de uma composição estimuladora de Treg seletiva selecionada a partir do gru-
po que consiste em: RUR>2ox0-IL-2 Fórmula A, RUR2ox0-IL-2 Fórmula B, RUR>20ox0-IL-2 Fórmula C, RUR2ox0-IL-2 Fórmula D e RUR20x0-IL-2 Fór- mula E, para a fabricação de um fármaco para o tratamento de doen- ças autoimunes.
[0087] Em uma modalidade mais particular, o tratamento do lúpus eritematoso sistêmico (SLE) compreende a administração subcutânea de uma formulação que compreende uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de composições relacionadas com RUR-IL-2 ou RUR20x0-|L-2. Veja, por exemplo, os resultados descritos no Exemplo 8, que ilustram o efeito de Tregs induzidos por composição de RUR2oxD-IL-2 no contro- le da resposta imune fisiológica e progressão da doença em um mode- lo animal representativo de SLE. Como descrito aqui, uma composição de RUR20x0-IL-2 foi eficaz para suprimir o biomarcador de dano renal (uma das características de pacientes com SLE) para quase os mes- mos níveis observados em camundongos normais.
[0088] Em modalidades que se referem a um método de tratamen- to como descrito aqui, tais modalidades são da mesma forma outras modalidades para uso nesse tratamento ou, alternativamente, para uso na fabricação de um fármaco para uso nesse tratamento. A pre- sente descrição fornece ainda uma composição de acordo com qual- quer uma das modalidades de uma composição, incluindo suas formu- lações, como descrito aqui, para uso em terapia. A presente descrição fornece ainda uma composição de acordo com qualquer uma das mo- dalidades de uma composição, incluindo suas formulações, como des- crito aqui, para uso no tratamento de uma doença autoimune.
[0089] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma compo- sição compreendendo conjugados de IL-2 PEGuilados com uma estru- tura:
Q H3€-(OCH2CHa) -NH-C-O-CH, o ( o pretos Hs$C-(OCHZCH2) -NH-C-O0-CH, 2 e
Q H;C-(OCHCH) -NH-C-O-CH, o ( o He-ocio bjo n H3$C-(OCH;CH2),-NH-C-O0-CH, 3; ; em que: I1L-2 é uma interleucina-2; n é independentemente em cada ocorrência um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000; para uso em terapia. Em uma modalidade particular da re- ferida composição para uso em terapia, IL-2 é aldesleucina. Em uma modalidade particular das referidas composições para uso em terapia, o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglico! ramificado é de cerca de 20.000 daltons. Em uma outra modalidade particular das referidas composições para uso em terapia, os conjuga- dos de IL-2 PEGuilados da composição têm uma porção de PEG liga- da à lisina 31. Em uma modalidade particular das referidas composi- ções para uso em terapia, a terapia é para uso em doenças autoimu- nes. Termos
[0090] Ao descrever e reivindicar certos recursos desta descrição, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições des- critas abaixo, a menos que de outra maneira indicado.
[0091] O termo "seletivo", quando usado e descrito aqui, refere-se a uma resposta imunológica in vivo que incorpora características de células imunes induzidas ou respostas de sinal imunológico, em al- guns aspectos, porém não em outros. Em particular, "seletivo" com relação à indução e/ou ativação de Tregs se refere a uma resposta imune apresentando um aumento no número de células Treg (CD25 alto e total por citometria de fluxo) e/ou um aumento no estado de ati- vação de Treg, conforme indicado por um ou mais marcadores de ati- vação, tais como ICOS ou Ki67 ou Stat5, e/ou ativação refere-se a respostas de imunossupressão induzidas a jusante e/ou respostas de tolerância imunológica induzidas, embora faltem certas outras respos- tas imunes. Neste contexto, "indução seletiva de Treg" refere-se a uma resposta imune de Tregs como descrito, enquanto, ao mesmo tempo, carece de células T efetoras significativas e/ou clinicamente materiais e respostas de ativação imunológica associadas. Células T efetoras significativas e/ou clinicamente materiais e respostas de ativação imu- nológica associadas incluem, por exemplo, células T efetoras positivas para CD4 e/ou proliferação de células T efetoras positivas para CD8 e/ou marcadores de ativação, como ICOS ou Ki67, ou outras respos- tas imunes efetoras bem conhecidas. Outros sinais de resposta imune efetora podem incluir elevação de certas citocinas pró-inflamatórias, tais como aquelas conhecidas como "síndrome da citocina" e/ou tais como IL-5, INFgamma, IL-6, IFNapha, IL-17, 11-22, 11-19. A estimulação seletiva de Treg pode da mesma forma refletir na proporção média de Treg: Tcon. De preferência, a relação média Treg: Tcon alcançada em resposta a composições relacionadas com RUR-IL-2 ou RUR2ox0-IL-2 aqui descritas é de pelo menos 5 vezes, e de preferência 7 vezes, e mais preferencialmente 10 vezes ou mais.
[0092] O termo "grau de PEGuilação”, tal como aqui utilizado, refe- re-se ao número de substituintes de PEG estáveis ligados covalente- mente a um(s) grupo(s) amino de um polipeptídeo de aldesleucina in- dividual.
[0093] O termo "cerca de", quando aqui utilizado, significa uma vizinhança razoável do valor numérico declarado, tal como mais ou menos 10% do valor numérico declarado. De preferência, "cerca de" ou "aproximadamente", quando aqui utilizado, significa dentro de mais ou menos 5% de uma determinada quantidade.
[0094] O termo "n' é 2 e 3", tal como aqui utilizado, refere-se a misturas de conjugados de IL-2 em que as misturas compreendem conjugados di-PEGuilados e tri-PEGuilados, como aqui descrito.
[0095] O termo "células T reguladoras" ou "Tregs" refere-se a célu- las T, como fenótipos de CD4+FoxP3+CD25%"sht, (Veja, por exemplo, Jeffrey A. Bluestone e Qizhi Tang, Treg cells - the next frontier of cell therapy, Science, 12 de outubro de 2018 + Vol. 362 Issue 6411, p154-
155.)
[0096] O termo "T cons" ou "células T convencionais" refere-se a linfócitos T que expressam um receptor de células T ab (TCR), bem como um co-receptor de CD4 ou CDB8, e realizam funções efetoras de imunidade adaptativa bem estabelecidas, tais como funções de células T auxiliares e funções efetoras de células T citotóxicas. Por exemplo, Tcon pode referir-se a células T convencionais virgens de CD4*CD25”. "Células T efetoras (Teff)" referem-se a fenótipos efetores celulares CD4* e CD8*, tais como células T auxiliares, células T citotóxicas e outros, como conhecido pelo especialista na técnica. As "células NK", da mesma forma conhecidas como "células exterminadoras naturais", "células K" ou "células exterminadoras" são um tipo de linfócito (glóbu- lo branco) e um componente do sistema imunológico inato. As células NK desempenham um papel importante na rejeição do hospedeiro de tumores e células infectadas por vírus.
[0097] "Intermediário de IL-2" refere-se ao polipeptídeo IL-2, em particular aldesleucina. "RUR20x0-IL-2" refere-se a conjugados de IL-2 PEG em que a porção de IL-2 é aldesleucina como aqui descrito, e a porção de PEG é como aqui descrita. Uma composição de RUR20x0-IL- 2 pode da mesma forma ser referida de uma maneira geral pelo nome químico (1,3-bis(metoxipoli(etilenoglico!);oxpcarbamoil)-2-propanóxi)-4- butanamida) interleucina-2), reconhecendo isso não descreve comple- tamente a composição. Quando aqui utilizado, aldesleucina refere-se a 125-L-serina-2-133 interleucina-2, uma interleucina-2 recombinante não glicosilada expressa em E. coli. A sequência da sequência de aminoácidos da aldesleucina é mostrada na Figura 2. A aldesleucina expressa em outros sistemas hospedeiros conhecidos do especialista na técnica estão da mesma forma dentro do significado do termo quando aqui utilizado.
[0098] O termo "IlL-2" quando utilizado no presento docuemnto, refere-se a uma porção com atividade de IL-2 humana. O termo "uni- dade IL-2" refere-se à unidade IL-2 antes da ligação a uma unidade de polietilenoglicol ramificado, bem como à unidade IL-2 após a ligação covalente. Será entendido que quando a porção de IL-2 original é liga- da a um polímero de polietilenoglicol, tal como o polímero de polietile- noglicol ramificado fornecido aqui, a porção de IL-2 é ligeiramente alte- rada devido à presença de uma ou mais ligações covalentes associa- das com ligação às porções de polietilenoglicol. Essa forma ligeira- mente alterada da porção de IL-2 ligada a outra molécula é aqui referi- da como um "resíduo" da porção de IL-2. O termo, 'resíduo', no con- texto de resíduo de IL-2, significa a porção da molécula de IL-2 que permanece após a ligação covalente a um polímero, como um polieti- lenoglicol, em um ou mais sítios de ligação covalente, como mostrado nas fórmulas aqui. Normalmente, o local de ligação será um dos 11 grupos amina de uma lisina em IL-2.
[0099] Será entendido que quando a IL-2 não modificada é ligada a um polímero, tal como polietilenoglicol, a IL-2 é ligeiramente alterada devido à presença de uma ou mais ligações covalentes associadas à ligação ao(s) polímero(s). Esta forma ligeiramente alterada da IL-2 |li- gada a outra molécula, como uma porção de PEG ramificada, pode ser referida em alguns casos como um "resíduo" da IL-2, ou pode sim- plesmente ser referida como "IL-2" ou similar, com o entendimento de que a IL-2 compreendida nesse conjugado de polímero é ligeiramente alterada devido à presença de uma ou mais ligações covalentes, cada uma ligando uma porção de PEG ramiíificada à IL-2. O termo "conjuga- dos de IL-2 PEGuilados superiores" refere-se a conjugados de tetra PEG ou conjugados de penta PEG ou conjugados de até 11 frações de PEG. De preferência, "conjugados de IL-2 com PEGuilado superior" referem-se a conjugados de tetra-PEG ou conjugados de penta-PEG.
[00100] Por exemplo, proteínas com uma sequência de aminoáci- dos correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NOs:1 a 4 descritas em Publicação de Patente Internacional No. WO 2012/065086 são pro- teínas de IL-2 exemplares, assim como quaisquer proteínas ou poli- peptídeos substancialmente homólogos a elas. O termo substancial- mente homólogo significa que uma sequência objeto particular, por exemplo, uma sequência mutante, varia de uma sequência de referên- cia por uma ou mais substituições, deleções ou adições, cujo efeito líquido não resulta em uma dissimilaridade funcional adversa entre a referência e sequências objetos. Para os propósitos aqui, as sequên- cias com mais de 95 por cento de homologia, atividade biológica equi- valente (embora não necessariamente força equivalente da atividade biológica) e características de expressão equivalentes são considera- das substancialmente homólogas. Para propósitos de determinação da homologia, o truncamento da sequência madura deve ser desconside- rado. Quando aqui utilizado, o termo "IL-2" inclui tais proteínas modifi- cadas deliberadamente, como por exemplo, por mutagênese sítio diri- gida ou acidentalmente através de mutações. Estes termos da mesma forma incluem análogos com 1 a 6 locais de glicosilação adicionais, análogos com pelo menos um aminoácido adicional na extremidade do terminal carboxi da proteína em que o(s) aminoácido(s) adicional(is)
inclui(m) pelo menos um sítio de glicosilação e análogos possuindo uma sequência de aminoácidos que inclui pelo menos um sítio de gli- cosilação. O termo inclui unidades naturais e produzidas de forma re- combinante. Além disso, a IL-2 pode ser derivada de fontes humanas, fontes animais e fontes vegetais. Um exemplo de IL-2 é uma |IL-2 re- combinante humana referida como aldesleucina (veja Figura 2). A refe- rência a um agonista de IL-2R de ação prolongada, como aqui des- crito, pretende abranger as suas formas de sal farmaceuticamente aceitáveis.
[00101] As composições relacionadas com RUR-IL-2 ou RUR20x0- IL-2 aqui descritas são, em um aspecto, agentes de ação prolongada. Ação prolongada, em referência a composições relacionadas a RUR- IL-2 ou RUR20x0-IL-2, como fornecido aqui, refere-se a tal composição tendo uma meia-vida de circulação no plasma que é estendida ao lon- go do mesmo agonista de IL-2R (por exemplo, aldesleucina ou outra sequência de interleucina-2 adequada) que não foi modificada. Por exemplo, o agonista comparador não é modificado por ligação cova- lente a uma ou mais porções de polímero solúvel em água, como por- ções de polietilenoglico|, e é comparado quando administrado a uma dose equivalente de proteína de agonista de IL-2R ao mesmo indiví- duo e avaliado pelo mesma análise farmacocinética.
[00102] "PEG" ou "polietilenoglicol", quando utilizado no presento documento, pretende abranger qualquer poli (óxido de etileno) solúvel em água. A menos que de outra maneira indicado, um "polímero PEG" ou um polietilenoglicol é aquele em que substancialmente todas (de preferência todas) as subunidades monoméricas são subunidades de óxido de etileno, embora o polímero possa conter porções de termina- ção distintas ou grupos funcionais, por exemplo, para conjugação. Os polímeros de PEG para uso na presente descrição compreenderão uma das duas estruturas a seguir: "(CH2CH2O),-" ou "-(CH2CH20O)r-
1CH2CH2-", dependendo de se o(s) oxigênio(s) terminal(s) foram ou não deslocados, por exemplo, durante uma transformação sintética. Como afirmado acima, para os polímeros de PEG, a variável (n) varia de cerca de 3 a 4000, e os grupos terminais e a arquitetura do PEG geral podem variar. De preferência, PEG tem o significado particular como descrito em detalhes aqui.
[00103] “"Ramificado", em referência à geometria ou estrutura geral de um polímero, refere-se a um polímero com dois ou mais "braços" ou "cadeias" de polímero que se estendem de um ponto de ramiífica- ção ou característica estrutural central. Como um exemplo, um rea- gente de PEG ilustrativo, ácido mMPEG2-butanoico, éster N- hidroxisucinimida (1,3-bis(metoxipoli(etilenoglico!|)carbamoil!)-2- propanóxi)-4-sucinimidil butanoato) é um polímero de polietilenoglicol ramiíificado compreendido de duas cadeias de PEG lineares, cada uma ligada covalentemente por meio de uma ligação de carbamato (-NHC(O)O-) aos carbonos 1- e 3, respectivamente, de um grupo propila central, a partir do qual se estende um éster oxibutanoato suci- nimidila.
[00104] O peso molecular no contexto de um polímero solúvel em água, tal como PEG, pode ser expresso como um número (nominal) de peso molecular médio ou um peso molecular médio ponderado. À menos que de outra maneira indicado, todas as referências ao peso molecular aqui referem-se ao peso molecular médio nominal. Ambas as determinações de peso molecular, média numérica e média de pe- so, podem ser medidas usando cromatografia de permeação em gel, cromatografia de filtração em gel ou outras técnicas de cromatografia líquida. Outros métodos para medir os valores de peso molecular po- dem da mesma forma ser usados, como o uso de análise de grupo final ou a medição de propriedades coligativas (por exemplo, depres- são do ponto de congelamento, elevação do ponto de ebulição ou pressão osmótica) para determinar o peso molecular médio ou o uso de técnicas de dispersão de luz, ultracentrifugação ou viscometria para determinar o peso molecular médio ponderado. A cromatografia de filtração em gel é frequentemente usada para determinar o peso mole- cular médio de polímeros ramificados. Os polímeros de PEG são tipi- camente polidispersos (isto é, o peso molecular médio ponderado e o peso molecular médio em peso dos polímeros não são iguais), pos- suindo valores de polidispersidade baixos de preferência inferior a cer- ca de 1,2, mais preferencialmente inferior a cerca de 1,15, ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 1,10, ainda mais preferencial- mente menos do que cerca de 1,05, e mais preferencialmente menos do que cerca de 1,03.
[00105] Uma ligação ou ligação "estável" refere-se a uma ligação química que é substancialmente estável em água, isto é, não sofre hi- drólise em condições fisiológicas em qualquer extensão apreciável du- rante um período de tempo prolongado. Exemplos de ligações hidroliti- camente estáveis geralmente incluem, porém não são limitados ao se- guinte: ligações carbono-carbono (por exemplo, em cadeias alifáticas), éteres, amidas, aminas e similar. Geralmente, uma ligação estável é aquela que exibe uma taxa de hidrólise inferior a cerca de 1-2% por dia sob condições fisiológicas. As taxas de hidrólise de ligações quími- cas representativas podem ser encontradas na maioria dos livros de química padrão.
[00106] Quando usadas nesta especificação, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra maneira.
[00107] "Substancialmente" ou "essencialmente" significa quase total ou completamente, por exemplo e, 95% ou mais de uma determi- nada quantidade, a menos que de outra maneira declarado. Preparações e Exemplos
[00108] Deve ser entendido que as Preparações e Exemplos são apresentados a título de ilustração e não de limitação, e várias modifi- cações podem ser feitas por um especialista na técnica. Os métodos de preparação das composições estimuladoras de Treg seletivas, in- cluindo modalidades de RUR20ox0-IL-2 e composições relacionadas são descritos aqui e/ou conhecidos pelo especialista na técnica. Os rea- gentes e materiais de partida estão facilmente disponíveis ou podem ser facilmente sintetizados por um especialista na técnica. As condi- ções adequadas para as etapas destes métodos são bem conhecidas e as substituições apropriadas de tampões e reagentes estão dentro da habilidade na técnica. Além disso, o especialista na técnica aprecia- rá que em algumas circunstâncias as etapas e a ordem pela qual as composições são produzidas podem ser modificadas e são bem apre- ciadas pelo bioquímico qualificado. Da mesma forma, será apreciado que as preparações podem ser isoladas e/ou purificadas por várias técnicas bem conhecidas conforme necessário ou desejado. Preparação do intermediário IL-2:
[00109] A porção de |L-2 pode ser derivada de métodos não re- combinantes e/ou de métodos recombinantes e a descrição não é limi- tada a este respeito. A porção de I|L-2 pode ser derivada de fontes humanas, fontes animais e fontes vegetais. Por exemplo, é possível isolar IL-2 de sistemas biológicos e, de outra forma, obter IL-2 de mei- os de cultura. Veja, por exemplo, os procedimentos descritos em Pa- tente U.S. No. 4.401.756 e em Pauly e outro (1984) J. Immunol Me- thods 75 (1): 73-84.
[00110] Os métodos para produzir e expressar polipeptídeos re- combinantes in vitro e em células hospedeiras procarióticas e eucarió- ticas são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.614.185. A porção de IL-2 pode ser ex- pressa em bactérias [por exemplo, E. coli, veja, por exemplo, Fischer e outro (1995) Biotechnol. Appl. BiolL-2m. 21 (3): 295-311], mamífero [veja, por exemplo, Kronman e outro (1992) Gene 121: 295-304], leve- dura [por exemplo, Pichia pastoris, veja, por exemplo, Morel e outro (1997) Biochem. J. 328 (1):121-129], e planta [veja, por exemplo, Mor e outro (2001) Biotechnol. Bioeng. 75 (3): 259-266] sistemas de ex- pressão. Embora os métodos baseados em recombinantes para a pre- paração de proteínas possam diferir, os métodos recombinantes nor- malmente envolvem a construção do ácido nucleico que codifica o po- lipeptídeo ou fragmento desejado, clonagem do ácido nucleico em um vetor de expressão, transformação de uma célula hospedeira (por exemplo, planta, bactéria, levedura, célula animal transgênica , ou cé- lula de mamífero, como célula de ovário de hamster chinês ou célula de rim de hamster bebê), e expressando o ácido nucleico para produ- zir o polipeptídeo ou fragmento desejado. Vários métodos de purífica- ção de proteínas podem ser empregados para purificar uma composi- ção da presente descrição e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994). Para facilitar a identificação e purificação do polipeptídeo recombinante, as sequências de ácido nucleico que codificam para um marcador de epítopo ou outra sequên- cia de ligação de afinidade podem ser inseridas ou adicionadas en- quadrada com a sequência de codificação, produzindo assim uma pro- teína de fusão composta pelo polipeptídeo desejado e um polipeptídeo adequado para ligação.
[00111] Dependendo do sistema usado para expressar proteínas com atividade de |L-2, a porção de IL-2 pode ser não glicosilada ou glicosilada e qualquer uma pode ser usada. Isto é, a porção de IL-2 pode ser não glicosilada ou a porção de I|L-2 pode ser glicosilada e, em uma ou mais modalidades preferidas, a porção de IL-2 não é glico- silada. A porção de IL-2 pode da mesma forma ser vantajosamente modificada para incluir e/ou substituir um ou mais resíduos de aminoá- cidos, tais como, por exemplo, lisina, cisteína e/ou arginina, a fim de fornecer ligação fácil do polímero a um átomo dentro da cadeia lateral do aminoácido. Um exemplo de substituição de uma porção de IL-2 é descrito em Patente U.S. No. 5.206.344. Além disso, a porção de IL-2 pode ser modificada para incluir um resíduo de aminoácido de ocor- rência não natural. As técnicas para adicionar resíduos de aminoáci- dos e resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural são bem co- nhecidas por aqueles versados na técnica.
[00112] Além disso, a porção de IL-2 pode ser vantajosamente mo- dificada para incluir a ligação de um grupo funcional (diferente da adi- ção de um grupo funcional contendo resíduo de aminoácido). Por exemplo, a porção de IL-2 pode ser modificada para incluir um grupo tiol. Além disso, a porção de IL-2 pode ser modificada para incluir um carbono alfa do terminal N. Além disso, a porção de IL-2 pode ser mo- dificada para incluir uma ou mais porções carboidratos. Além disso, a porção de IL-2 pode ser modificada para incluir um grupo aldeído. Além disso, a porção de |L-2 pode ser modificada para incluir um gru- po cetona. Em algumas modalidades da descrição, é preferido que a porção de |L-2 não seja modificada para incluir um ou mais de um gru- po tiol, um carbono alfa do terminal N, carboidrato, grupo adeido e grupo cetona.
[00113] Porções de |L-2 exemplares são descritas na literatura e, por exemplo, em Patentes U.S. Nos. 5.116.943, 5.153.310, 5.635.597,
7.101.965 e 7.567.215 e em Publicações do Pedido de Patente U.S. Nos. 2010/0036097 e 2004/0175337. Uma porção de |IL-2 preferida tem a sequência de aminoácidos fornecida na Figura 2 e representa a sequência de aminoácidos de aldesleucina quando utilizada no pre- sente documento.
[00114] Em alguns casos, a porção de IL-2 estará na forma de
"monômero", em que uma única expressão do peptídeo corresponden- te é organizada em uma unidade discreta. Em outros casos, a porção de IL-2 estará na forma de um "dímero" (por exemplo, um dímero de IL-2 recombinante) em que duas formas monoméricas da proteína es- tão associadas (por exemplo, por ligação de dissulfeto) uma à outra. Por exemplo, no contexto de um dímero de IL-2 humana recombinan- te, o dímero pode estar na forma de dois monômeros associados um ao outro por uma ligação de dissulfeto formada a partir de cada resí- duo Cys125 do monômero.
[00115] Para qualquer dado peptídeo ou porção de proteína, ou composição, é possível determinar se essa porção tem atividade de IL-
2. Vários métodos para determinar a atividade de IL-2 in vitro são des- critos na técnica e aqui. Uma abordagem exemplar é o ensaio de proli- feração de células CTTL-2 aqui descrito. Uma abordagem exemplar é da mesma forma descrita em Moreau e outro (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056). Resumidamente, em um ensaio de ligação não especí- fica, uma porção ou composição de IL-2 proposta é permitida pré- incubar por uma hora a 4ºC na presença de uma linha de células con- tendo um receptor de IL-2. Depois disso, a IL-2 1º| rotulada é deixada incubar no sistema por três horas a 4ºC. Os dados são expressos co- mo % da capacidade inibitória da atividade da porção de IL-2 proposta versus IL-2 tipo silvestre. Outras metodologias conhecidas na técnica podem da mesma forma ser usadas para avaliar a função da IL-2, in- cluindo eletrometria, espectrofotometria, cromatografia e metodologias radiométricas. Preparação de composições estimuladoras de Treg seletivas, in- cluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relaciona- das:
[00116] Uma composição estimuladora de Treg seletiva exemplar de RUR20ox0-IL-2 é geralmente preparada pela reação de |L-2 purifica-
da com um excesso em mol de reagente de PEG (excesso de equiva- lentes molares em relação a IL-2), ácido MPEG2(20kD)-butanoico, és- ter N-hidroxissucinimida (ou qualquer outro éster adequadamente ati- vado) (1,3-bis(metoxipoli(etilenoglico)) MW 10.000 carbamoil)-2- propanóxi)-4-sucinimidil butanoato, em uma solução de bicina em pH alto de cerca de 9. Os reagentes são misturados por cerca de 30 minu- tos a cerca de 5 horas, ou de cerca de 30 minutos a 4 horas, ou de cerca de 30 minutos a 2 horas, ou de cerca de 30 minutos a 1 hora, geralmente sob condições suaves, por exemplo, de cerca de 20º C a cerca de 65ºC, ou de cerca de 20ºC a cerca de 40ºC, ou em tempera- tura ambiente ou ambiente. A reação é extinta por acidificação em pH baixo por adição de um ácido adequado, tal como ácido acético.
[00117] O produto da reação de riL-2 PEGuilado é em seguida puri- ficado por um método adequado, tal como cromatografia de troca iôni- ca. Por exemplo, ao empregar cromatografia de troca iônica, a compo- sição de RUR20x0-IL-2 se liga à resina e, em seguida, é eluída com um gradiente adequado, tal como um gradiente de cloreto de sódio. O conjunto de produtos de cromatografia é em seguida concentrado e diafiltrado em tampão de formulação adequado (por exemplo, tampão de acetato de sódio com sacarose) usando, por exemplo, filtração de fluxo tangencial (TFF).
[00118] Se desejado, o conjunto de produtos pode ser adicional- mente separado em isômeros posicionais por cromatografia de fase reversa usando uma cromatografia líquida de alto desempenho de fa- se reversa (RP-HPLC) usando uma coluna adequada (por exemplo, uma coluna C18 ou C3, disponível comercialmente por empresas tais como Amersham Biosciences ou Vydac), ou por cromatografia de tro- ca iônica usando uma coluna de troca iônica, por exemplo, uma coluna de troca iônica Sepharose '"“ disponível a partir Amersham Bioscien- ces. Qualquer uma das abordagens pode ser usada para separar isô-
meros do agente polimérico ativo com o mesmo peso molecular (isto é, isoformas posicionais).
[00119] As composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, podem ser caracterizadas por várias técnicas analíticas e de bioensaios aqui des- critos e/ou conhecidos do especialista na técnica, incluindo HPLC ana- lítica, SDS-Page, LCMS e bioensaios, tais como Proliferação de CTLL- 2 e indução de Treg in vivo. Formulações:
[00120] Em ainda uma ou mais modalidades fornecidas no presente documento, está uma composição estimuladora de Treg seletiva, inclu- indo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas, com- preendendo uma composição de conjugado de IL-2 como aqui descrito e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00121] "Excipiente farmaceuticamente aceitável" ou "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um componente que pode ser incluído nas composições aqui descritas e não causa efeitos toxi- cológicos adversos significativos a um indivíduo. As composições da presente descrição são preferencialmente formuladas como composi- ções farmacêuticas administradas por qualquer via que torne a com- posição biodisponível, tal como administração parenteral, incluindo intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Tais composições farma- cêuticas e processos para prepará-los são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21º Edição, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)). Opcionalmente, as composições fornecidas no presente documento podem compreender ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável e excipientes exemplares incluem, sem limitação, aqueles seleciona- dos a partir do grupo consistindo em carboidratos, sais inorgânicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensoativos, tampões, ácidos,
bases, aminoácidos, e suas combinações.
A quantidade de qualquer excipiente individual na composição irá variar dependendo da ativida- de do excipiente e das necessidades particulares da composição.
Normalmente, a quantidade ideal de qualquer excipiente individual é determinada por meio de experimentação, ou seja, pela preparação de composições contendo quantidades variáveis do excipiente (variando de baixa a alta), examinando a estabilidade e outros parâmetros e, em seguida, determinando a faixa em que o desempenho ideal é alcança- do sem efeitos adversos significativos.
Um carboidrato, tal como um açúcar, um açúcar derivatizado, tal como um alditol, ácido aldônico, um açúcar esterificado e/ou um polímero de açúcar pode estar presen- te como um excipiente.
Excipientes de carboidratos específicos inclu- em, por exemplo: monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galac- tose, glicose, D-manose, sorbose e similar; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e similar; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e simi- lar; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, ciclodextrinas e similar.
O exci- piente pode da mesma forma incluir um sal inorgânico ou tampão, tal como ácido cítrico, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de só- dio, nitrato de potássio, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico e suas combinações.
A composição pode da mesma forma incluir um agente antimicrobiano para prevenir ou impedir o crescimen- to microbiano.
Exemplos não limitantes de agentes antimicrobianos adequados para uma ou mais modalidades da presente descrição in- cluem cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool benzílico, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol, fenol, álcool feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol e combinações dos mesmos.
Um antioxidante pode da mesma forma estar presente na composição.
Os antioxidan- tes são usados para prevenir a oxidação, evitando assim a deteriora-
ção do conjugado ou de outros componentes da preparação.
Antioxi- dantes adequados para uso em uma ou mais modalidades da presente descrição incluem, por exemplo, palmitato de ascorbila, hidroxianiso! butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propilgalato, bissulfito de sódio, sulfoxilato de formaldeído de sódio, metabissulfito de sódio e combinações dos mesmos.
Um tensoativo pode estar presente como um excipiente.
Tensoativos exemplares in- cluem: polissorbatos, tais como "Tween 20" e "Tween 80", e plurôni- cos, tais como F68 e F88 (ambos os quais estão disponíveis de BASF, Mount Olive, New Jersey); ésteres de sorbitano; lípidos, como fosfoli- pidos, como lecitina e outras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (embora de preferência não na forma lipossomal), ácidos graxos e és- teres graxos; esteróides, como colesterol; e agentes quelantes, tais como EDTA; zinco e outros cátions adequados.
Ácidos ou bases po- dem estar presentes como excipientes na composição.
Exemplos não limitantes de ácidos que podem ser usados incluem aqueles ácidos selecionados a partir do grupo consistindo em ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fos- fórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico e combinações dos mesmos.
Exemplos de bases adequadas incluem, sem limitação, bases selecio- nadas a partir do grupo consistindo em hidróxido de sódio, acetato de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, acetato de amônio, acetato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, citrato de sódio, formato de sódio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, fumerato de potássio e combinações dos mesmos.
Um ou mais aminoácidos podem estar presentes como um excipiente nas composições aqui descritas.
Os aminoácidos exemplificativos a este respeito incluem ar- ginina, lisina e glicina.
Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais adequados incluem aqueles descritos, por exemplo, em
Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7º ed., Rowe, RC, Ed., Phar- maceutical Press, 2012. Uma formulação preferida das composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR2ox0-IL- 2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, é 1,5 mg/mL de proteína equivalente, 10 mM de acetato de sódio, 110 mM de cloreto de sódio, 2% de sacarose (p/v), pH 5,0. Uma composi- ção de RUR2ox0-IL-2 pode ser armazenada em garrafas de policarbo- nato de uso único estéreis de volume apropriado com uma tampa de polipropileno com forro de silicone, fornecido estéril e pronto para uso. Dosagem:
[00122] A quantidade de dosagem das composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composi- ções relacionadas fornecidas no presente documento, irá variar de- pendendo de uma série de fatores, porém será idealmente uma dose terapeuticamente eficaz quando a composição é armazenada em um recipiente de dose unitária (por exemplo, um frasco). Além disso, a preparação farmacêutica pode ser acondicionada em uma seringa. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada experimen- talmente por administração repetida de quantidades crescentes das composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, a fim de determinar uma quantidade que produz um ponto final clinicamente desejado, como descrito aqui, tais como alívio de sintomas autoimunes e/ou imunossupressão e/ou indução de tolerân- cia.
[00123] As quantidades de dosagem preferidas são baixas quanti- dades de dosagem que são eficazes para expandir e ativar preferenci- almente células T reguladoras em relação às células T convencionais e células exterminadoras naturais em um indivíduo. A ativação de cé- lulas T reguladoras pode ser medida por uma série de abordagens di-
ferentes. Por exemplo, dado o papel integral de STAT5 em processos de células T dependentes de IL-2, a detecção de STAT5 aumentado em linfócitos pode ser utilizada como um marcador-chave de ativação de Treg. Fenotipicamente, a ativação de Treg pode da mesma forma ser medida por citometria de fluxo através do aumento da superfície celular IL-2Ra (CD25) e/ou aumento da expressão intracelular da pro- teína forkhead box P3 (Foxp3), um regulador mestre da linhagem de Treg, e/ou aumento da expressão da proteína Ki67, que está associa- da à proliferação celular. Coletivamente, esses marcadores estão liga- dos à funcionalidade das células Treg e costumam ser desregulados nessas células em doenças autoimunes. Aqui, uma detecção preferida de indução e ativação de células Treg é por citometria de fluxo. A fun- cionalidade de Treg pode da mesma forma ser avaliada por meio de um ensaio de supressão ex vivo, que mede sua capacidade de inibir a proliferação de células T convencionais. A consequência da mobiliza- ção e ativação de Treg pode da mesma forma ser medida diretamente in vivo usando modelos de inflamação dirigidos por antígeno.
[00124] A administração das modalidades de RUR20x0-IL-2 e com- posições relacionadas fornecidas no presente documento são tipica- mente por meio de injeção. Outros modos de administração são da mesma forma contemplados, tais como pulmonar, nasal, bucal, retal, sublingual e transdérmica. Quando aqui utilizado, o termo "parenteral" inclui injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intratumoral, intra- linfática, intraperitoneal, intracardíaca, intratecal e intramuscular, bem como injeções de infusão. Em uma modalidade particular, a injeção é subcutânea. Por exemplo, a administração a um paciente pode ser conseguida através da injeção de uma composição compreendendo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento e um diluente. Com relação aos possíveis di- luentes, um diluente pode ser selecionado a partir de, por exemplo,
água bacteriostática para injeção, dextrose 5% em água, solução sali- na tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de Ringer com lactato, solução salina, água estéril, água desionizada e combinações dos mesmos. Alguém versado na técnica pode determinar por meio de testes se dois determinados componentes farmacológicos são compa- tíveis entre si em uma determinada formulação. Uma composição exemplar para administração a um paciente, por exemplo, uma formu- lação subcutânea, compreende, por exemplo, uma dose terapeutica- mente eficaz de modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacio- nadas fornecidas no presente documento, água, acetato de sódio, clo- reto de sódio e sacarose. A composição líquida terá um pH na faixa de cerca de 4,5-7,5; ou de cerca de 4,5-6.
[00125] Em certas modalidades, as composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, estão na forma sóli- da. As formas sólidas preferidas são aquelas que são formas sólidas secas, por exemplo, contendo menos de 5 por cento em peso de água, ou de preferência menos de 2 por cento em peso de água. As formas sólidas são geralmente adequadas para reconstituição em um diluente aquoso. As formulações sólidas preferidas são estáveis por pelo me- nos cerca de 24 meses quando armazenadas em recipientes selados em temperaturas de cerca de 0-10 ºC.
[00126] O termo "paciente" ou "indivíduo", quando aqui utilizado, refere-se a um organismo vivo que sofre ou está sujeito a uma condi- ção que pode ser prevenida ou tratada pela administração de uma composição como fornecida no presente documento, tal como uma doença autoimune, e inclui tanto humanos e animais. Os indivíduos incluem, porém não são limitados a mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e similar) e, de preferência, são humanos. Em certas modalidades, o paciente, de pre-
ferência um humano, é ainda caracterizado com uma doença, distúrbio ou condição, tal como uma condição autoimune, que se beneficiaria da administração de uma composição da presente descrição.
[00127] O termo "tratamento" ou "tratando", quando utilizado no presento documento, refere-se à gestão e cuidado de um paciente com uma condição para a qual a administração de uma composição da presente descrição é indicada com a finalidade de combater ou ali- viar os sintomas e complicações dessas condições. O tratamento inclui a administração de uma composição da presente descrição a um paci- ente em necessidade dela para prevenir o aparecimento de sintomas ou complicações, aliviar os sintomas ou complicações ou eliminar a doença, condição ou distúrbio. Por exemplo, uma doença auto-imune. De preferência, o tratamento inclui a administração de uma composi- ção da presente descrição a um paciente em necessidade da mesma para resultar em imunossupressão e/ou tolerância. O paciente a ser tratado é um animal, de preferência um ser humano. A administração, quando aqui utilizada, inclui quando o paciente consome a composição e/ou quando o paciente é direcionado a consumir a composição.
[00128] As frases "quantidade farmaceuticamente eficaz" e "quanti- dade farmacologicamente eficaz" e "quantidade terapeuticamente efi- caz" e "quantidade fisiologicamente eficaz" são usadas indistintamente aqui e referem-se à quantidade de um RUR2ox0-IL-2 e composição re- lacionada fornecida no presente documento que é necessária para atingir um nível desejado da substância na corrente sanguínea ou te- cido-alvo. A quantidade precisa dependerá de vários fatores, tais co- mo, por exemplo, a condição particular a ser tratada, a população de pacientes pretendida, as considerações individuais do paciente, os componentes e as características físicas da composição terapêutica a ser administrada e similar.
[00129] As composições farmacêuticas que compreendem o com-
posto da presente descrição podem ser administradas parenteralmen- te a pacientes em necessidade de tal tratamento. A administração pa- renteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta ou injetor acionado mecanicamente. Alternativamente, a admi- nistração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. As modalidades da presente descrição fornecem composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente, compre- endendo a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da presente descrição e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Es- sas composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer uma de uma variedade de técnicas usando excipientes convencionais para produtos farmacêuticos que são bem conhecidos na técnica. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 21º edição, University of the Sciences na Filadélfia, Filadélfia, PA, EUA (2006)).
[00130] As doses das composições estimuladoras de Treg seleti- vas, incluindo RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, bem como o regime de dosagem associado aos métodos e composições irão variar dependendo da idade, peso e con- dição geral do indivíduo, bem como o tipo e o estado da condição a ser tratada, o julgamento do profissional de saúde e a composição es- timuladora de Treg seletiva específica a ser administrada.
[00131] Quando utilizado no presento documento, o termo "quanti- dade eficaz" refere-se à quantidade ou dose de uma composição da presente descrição que após administração de dose única ou múltipla, ao paciente ou indivíduo, irá induzir a resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado sobre um tecido, sistema, animal, mamífe- ro ou humano que está sendo procurado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. De preferência, uma quantidade eficaz se re-
fere à quantidade ou dose de uma composição da presente descrição que após administração única ou múltipla ao paciente ou indivíduo irá induzir um aumento seletivo de células Treg de pelo menos 10 vezes em relação aos níveis de pré-dose.
Uma dose pode incluir uma dose inicial mais alta, seguida por uma dose mais baixa.
Em um ou mais casos, uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições es- timuladoras de Treg seletivas, incluindo RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, é uma quantidade englobada por uma ou mais das seguintes faixas expressas na quanti- dade de |L-2: de cerca de 0,10 a cerca de 700 ug/Kkg; de cerca de 0,20 a cerca de 650 ug/Kkg, de cerca de 0,30 a cerca de 600 ug/Kkg; de cerca de 1,0 a cerca de 550 ug/Kkg, de cerca de 2,0 a cerca de 500 upg/Kkg, de cerca de 10 a cerca de 450 ug/kg, de cerca de 25 a cerca de 400 Vv9/Kkg, de cerca de 50 a cerca de 350 ug/kg ou de cerca de 100 a cer- ca de 300 ug/kg, incluindo qualquer e todas as combinações dos valo- res iniciais e finais anteriores de cada uma das faixas anteriores.
Em algumas modalidades, por exemplo, para o tratamento de uma doença autoimune, ou uma doença ou condição que pode se beneficiar da ex- pansão e ativação preferencial de células T reguladoras sobre células T convencionais e células exterminadoras naturais em um indivíduo, as composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo as modali- dades de RUR>20x0-|L-2 e as composições relacionadas fornecidas no presente documento são administradas em uma dose, por exemplo, uma dose que é menor ou igual a 500 ug/kg.
Um regime de dosagem preferido da presente descrição é em que um RUR2ox0-IL-2 e composi- ção relacionada, e em particular aqueles da Fórmula A-E, são adminis- trados a uma dose entre 3-24 ug/kg uma vez a cada duas semanas.
Outro regime de dosagem preferido da presente descrição é aquele em que um RUR>2ox0-IL-2 e composição relacionada, e em particular aqueles da Fórmula A-E, são administrados em uma dose entre 3-18
Vv9/kg uma vez a cada duas semanas. Outro regime de dosagem pre- ferido da presente descrição é aquele em que um RUR2ow0-IL-2 e composição relacionada, e em particular aqueles da Fórmula A-E, são administrados a uma dose entre 3-12 ug/kg uma vez a cada duas se- manas. Outro regime de dosagem preferido da presente descrição é aquele em que um RUR20ox0-IL-2 e composição relacionada, e em par- ticular aqueles da Fórmula A-E, são administrados a uma dose entre 3-6 ug/kg uma vez a cada duas semanas. Outro regime de dosagem preferido da presente descrição é aquele em que um RUR2ox0-IL-2 e composição relacionada, e em particular aqueles da Fórmula A-E, são administrados a uma dose de 3 ug/kg uma vez a cada duas semanas.
[00132] As composições fornecidas no presente documento são eficazes para restaurar a capacidade homeostática do sistema imuno- lógico, por exemplo, têm a capacidade de afetar positivamente doen- ças nas quais a disfunção de Treg desempenha um papel, tais como doenças autoimunes, alergia e rejeição de enxerto. Em uma modalida- de, é fornecido aqui um método para expandir seletivamente Treg en- dógeno in vivo pela administração das composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento. As faixas de dosa- gem ilustrativas incluem, por exemplo, de cerca de 100 ug/kg a cerca de 500 ug/Kkg, ou de cerca de 150 ug/Kkg a cerca de 450 ug/Kkg, ou de cerca de 175 ug/kg a cerca de 400 pg/kg, ou mesmo de cerca de 175 v9/kg a cerca de 350 ug/Kkg. Doses e regimes de dosagem preferidos são descritos nos exemplos aqui fornecidos. Doses adequadas são eficazes para atingir uma amplificação máxima de células Treg, com uma estimulação mínima de células Teff e células NK; isso pode ser monitorado por coleta de sangue periférico para análise de citometria de fluxo para identificar a prevalência de células Treg, células T efeto- ras CD4+ e CD8+ e células NK. Com base nesses números, as dosa-
gens podem ser ajustadas adequadamente.
[00133] Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, um efeito terapêutico). Os es- quemas de dosagem, para administração intravenosa (iv) ou não intra- venosa, localizada ou sistêmica, ou combinações dos mesmos, nor- malmente variam de uma única dosagem em bolo ou infusão contínua em múltiplas administrações por dia (por exemplo, a cada 4-6 horas), ou como indicado por um médico assistente e a condição do paciente. No que diz respeito à frequência e cronograma de administração das composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, um especialista na técnica é capaz de determinar um re- gime de dosagem apropriado. Por exemplo, em um ciclo de tratamen- to, um médico pode decidir administrar a composição, seja como uma dose única ou em uma série de doses, por exemplo, ao longo de vá- rios dias ou semanas). Com base na natureza de ação prolongada da composição, é preferido que seja tipicamente administrada com relati- va infrequência (por exemplo, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada 8-10 dias, uma vez por sema- na, etc.). Períodos de tempo exemplares associados ao curso da tera- pia incluem cerca de uma semana; cerca de duas semanas; cerca de três semanas; cerca de quatro semanas; cerca de cinco semanas; cerca de seis semanas; cerca de sete semanas; cerca de oito sema- nas; cerca de nove semanas; cerca de dez semanas; cerca de onze semanas; cerca de doze semanas; cerca de treze semanas; cerca de quatorze semanas; cerca de quinze semanas; cerca de dezesseis se- manas; cerca de dezessete semanas; cerca de dezoito semanas; cer- ca de dezenove semanas; cerca de vinte semanas; cerca de vinte e uma semanas; cerca de vinte e duas semanas; cerca de vinte e três semanas; cerca de vinte e quatro semanas; cerca de sete meses; cer-
ca de oito meses; cerca de nove meses; cerca de dez meses; cerca de Onze meses; cerca de doze meses; cerca de treze meses; cerca de quatorze meses; cerca de quinze meses; cerca de dezesseis meses; cerca de dezessete meses; cerca de dezoito meses; cerca de dezeno- ve meses; cerca de vinte meses; cerca de vinte e um meses; cerca de vinte e dois meses; cerca de vinte e três meses; cerca de vinte e qua- tro meses; cerca de trinta meses; cerca de três anos; cerca de quatro anos e cerca de cinco anos. Os métodos de tratamento descritos aqui são tipicamente continuados enquanto o médico que supervisiona os cuidados do paciente considerar o método de tratamento eficaz, isto é, que o paciente está respondendo ao tratamento, ou até que os sinto- mas relacionados da condição diminuam. Parâmetros não limitantes que indicam que o método de tratamento é eficaz podem incluir um ou mais dos seguintes: aumento do número de células T reguladoras, tais como CD25+ Treg e FoxP3+ Treg, e/ou diminuição do número de célu- las NK e células efetoras CD4+ e CD8+.
[00134] As composições fornecidas no presente documento são úteis para aumentar a proporção de células T reguladoras, como célu- las Foxp3+ e CD25+, para efetuar ou células T, tais como células CD4+ e CD8+, quando administradas a um indivíduo em uma dose terapeuticamente eficaz. Por exemplo, a administração das composi- ções estimuladoras de Treg seletivas, incluindo RUR20x0-IL-2 e com- posições relacionadas fornecidas no presente documento, pode ser eficaz para resultar em pelo menos um aumento de duas vezes nas células T reguladoras, quando comparada à linha de referência e ava- liada em um modelo de camundongo in vivo, por exemplo, como aqui descrito. O método pode da mesma forma, em algumas modalidades, ser eficaz para resultar em pelo menos um aumento de quatro vezes nas células T reguladoras, quando comparado à linha de referência e avaliada em um modelo de camundongo in vivo, por exemplo, tal como aqui descrito. Em alguns casos, o aumento no número de células T reguladoras é prolongado acima dos níveis da linha de referência por pelo menos 3 dias após a administração, ou mesmo por pelo menos 5 dias após a administração.
[00135] Como mostrado nos exemplos anexos, as composições estimuladoras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR20x0-IL- 2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, quando administradas dentro de uma faixa de dosagem adequada, são eficazes para aumentar preferencialmente a população de células e a função imunossupressora de células T reguladoras, embora te- nham efeito estimulador mínimo sobre as células T efetoras. Em certas modalidades, as composições estimuladoras de Treg seletivas, inclu- indo modalidades de RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas forne- cidas no presente documento, são capazes de atingir uma exposição prolongada para fornecer uma magnitude, duração e especificidade de respostas Treg a Teff que não podem ser obtidas com doses equiva- lentes de IL-2 nativa.
EXEMPLOS
[00136] Deve ser entendido que a descrição anterior, bem como os exemplos que se seguem, se destinam a ilustrar e não limitar o escopo da(s) descrição(ões) aqui fornecida(s). Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da descrição serão evidentes para aqueles versados na técnica aos quais a descrição se refere. Materiais e Métodos
[00137] IL-2 humana recombinante tendo uma sequência de ami- noácidos idêntica à da aldesleucina (des-alanil-1, serina-125 interleu- cina-2 humana, veja FIG. 2) é clonada e expressa e usada para prepa- rar as composições estimuladoras de Treg seletivas exemplares refe- ridas aqui como RUR2ox0-IL-2. A sequência exclui o aminoácido *1 (alanina) da sequência de IL-2 humana madura nativa, e há uma mu-
tação de aminoácido cisteína para serina no aminoácido f125. O pri- meiro aminoácido na sequência é uma metionina para expressão bac- teriana direta (nenhum peptídeo de sinal codificado). Após a expres- são, a metionina N-terminal é removida pela metionina amino peptida- se hospedeira. Uma única ligação de dissulfeto é formada entre as cis- teínas nas posições de aminoácidos ft 58 e f& 105. A proteína não é glicosilada porque é derivada de E. coli. Em algumas descrições, as composições de IL-2 conjugadas podem ser descritas em alguns as- pectos como (1,3-bis(metoxipoli(etilenoglico|)carbamoil)-2-propanóxi)- 4-butanamida)interleucina-2), observando que esta nomenclatura não descrever completamente o padrão ou mistura de PEGuilação.
[00138] Reagente de polietilenoglicol ácido mMPEG2(20kD)- butanoico, (1,3-bis(metoxipoli(etilenoglico!);okxDcarbamoil)-2- propanóxi)-4-sucinimidil butanoato de de éster N-hidroxissucinimida (também referido aqui como mPEG2-ru- 20K NHS), é preparado como descrito no Exemplo 2 da Patente US No. 7.887.789. Aparência: pó granular branco a esbranquiçado; peso molecular (Mn) 18-22 kDa (de- vido à polidispersidade do polímero) A estrutura de 1,3- bis(metoxipoli(etilenoglico!);oxpcarbamoil)-2-propanóxi)-4-sucinimidil butanoato é mostrada abaixo. o encon fito en O, o É o) CHILOCHZCHA -HN CO eH, -.
[00139] A menos que de outra maneira especificado, a concentra- ção, a quantidade e os níveis de dosagem das composições estimula- doras de Treg seletivas, incluindo modalidades de RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas fornecidas no presente documento, são re- latados em uma base de proteína que conta apenas a massa contribu- ída pelo componente de proteína e não que contribuiu pelas porções de PEG. Ao usar uma base de proteína, o peso molecular da composi- ção de RUR20ox0-IL-2 eficaz usada para cálculos é de 15,3 kDa, mesmo para uma mistura de moléculas rllL-2 conjugadas com vários graus de PEGUuilação, uma vez que apenas a proteína rlL-2 é contada.
[00140] Uma composição relacionada com RUR2o0-IL-2 é uma composição de mistura de conjugado PEGuilado que consiste em rhIlL- 2 (sequência de aldesleucina), conjugada em múltiplas frações de po- lietilenoglicol (PEG) covalentemente ligadas aos grupos de lisina. O número de porções de PEG por molécula de rhlL-2 (grau de PEGIila- ção) é uma distribuição de predominantemente 2 e 3 porções de PEG por molécula (di- ou tri-PEGuilado) com espécies menores contendo 1 PEG (mono-PEGuilado) e 4 PEG (moléculas tetra-PEGuiladas) e/ou PEGUuiladas superiores, resultando em uma média de cerca de 2,5 fra- ções PEG por rhlL-2. Cada porção de PEG tem um peso molecular nominal de 20 kDa e rhIL-2 tem um peso molecular de 15,3 kDa, resul- tando em um peso molecular nominal de RUR20x0-IL-2 de 65 kDa. EXEMPLO 1 Preparação de RUR2ox0-IL-2 e composições relacionadas
[00141] Uma solução de matéria prima (100 mg/mL) de mPEG2-ru- 20K NHS é preparada em 2 mM de HCl. Uma reação de PEGilação típica de IL-2 é realizada da seguinte forma: 115 mL de solução de matéria prima de IL-2 (aldesleucina) (1,3 mg/mL) são transferidos para uma garrafa de plástico de 250 mL e 15 mL de Bicina 0,5 M (NN- bis(2-hidroxietil)glicina), pH 9,2 e 0,5 mL de água são adicionados à solução de |L-2. A PEGilação é iniciada pela adição gota a gota de 19,5 mL de solução de matéria prima mPEG2-ru-20K NHS à solução contendo IL-2. A mistura reacional resultante contém 1 mg/mL de |IL-2, 50 mM de Bicina e 10 equivalentes molares de mPEG2-ru-20K NHS (em relação à proteína) e tem um pH de 8,7. A reação é permitida prosseguir em temperatura ambiente durante 40 min sob agitação su-
ave. A reação é terminada pela adição de 2,2 mL de ácido acético pa- ra reduzir o pH da reação para 4,1.
[00142] O produto de conjugado de IL-2 resultante é purificado por cromatografia de troca catiônica usando SP FF Sepharose. Após a conclusão da reação de conjugação, a mistura reacional é dialisada contra 20 volumes de tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4,0). A amostra dialisada é diluída 1:4 com água e carregada em uma coluna cheia de resina SP FF Sepharose. Os tampões usados para a croma- tografia de troca catiônica são os seguintes: Tampão A: acetato de só- dio 10 mM (pH 4,0) e Tampão B: acetato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 1,0 M (pH 4,0). A resina é lavada com tampão B e equilibrada com tampão A antes do carregamento da amostra. Após o carrega- mento, a resina é lavada com 3 volumes de coluna de Tampão A. IL-2 conjugado e não conjugado são eluídos usando um gradiente de qua- tro etapas consistindo em O a 50% de Tampão B em 5 volumes de co- luna, 25% a 50% de Tampão B em 1 volume de coluna, 50% de Tam- pão B em 1 volume de coluna, 50% a 100% de Tampão B em 1 volu- me de coluna e 100% de Tampão B em 1 volume de coluna em uma taxa de fluxo de 28 cm/h. As frações contendo conjugados de IL-2 com um grau de PEGuilação (dP) de 2 e 3 (isto é, dímeros e tri-meros) são identificadas por SDS-PAGE e agrupadas.
[00143] As frações combinadas contendo dímeros e trímeros são concentradas usando uma célula de ultrafiltração agitada (Amicon) e gás nitrogênio. A composição do produto final é determinada por RP- HPLC usando fases móveis: A, 0,09% de TFA em água e B, 0,04% de TFA em acetonitrila. Uma coluna Intrada WP-RP C18 (3 x 150 mm) é usada com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 50ºC. Determinou-se que a mistura de conjugado purificada compreende cerca de 4,6% (mol) de rlL-2 mono-PEGuilado, cerca de 47,7% (mol) de riL-2 di-PEGuilado, cerca de 42,9% (mol) de riL-2 tri-
PEGuilado e cerca de 4,8% (mol) de IL-2 tetra-PEGuilado. Veja a FIG. 1, onde os tempos de eluição são fornecidos no eixo x. O grau médio de PEGuilação da mistura do produto final é determinado como sendo 2,48 (isto é, cerca de 2,5). Nenhuma |IL-2 livre é detectada na mistura do produto final. Esta preparação é um exemplo de uma composição de RUR20x0-IL-2 da Fórmula A. EXEMPLO 1-A Preparações alternativas de RUR20x0-IL-2 e composições relacio- nadas
[00144] A preparação de um RUR20x0-IL-2 desejado e composição relacionada consiste em: fermentação e purificação do intermediário do processo da proteína rhlL-2, conjugação de rhll-2 com o material de partida reagente de PEG mPEG2-ru-20K NHS, purificação de IL-2 frações de conjugado tendo graus especificados de PEGuilação e for- mulação final dos conjugados de rhIlL-2 PEGuilados para gerar a com- posição de RURz2ox0-IL-2 da distribuição desejada de acordo com as modalidades descritas no presente documento.
[00145] A composição de RUR20x0-IL-2 desejada é preparada pela reação de 1,3-bis(metoxipoli(etilenoglicol)ioxpcarbamoil)-2-propanóxi)- 4-sucinimidil butanoato (da mesma forma referido aqui como mPEG2- ru-20K NHS) com lisina resíduos na proteína interleucina-2 (IL-2) (se- quência de aldesleucina), resultando em uma distribuição de conjuga- dos de IL-2 PEGuilados. O produto contém espécies predominante- mente di-PEGuiladas e tri-PEGuiladas, com quantidades menores de espécies mono- e/ou tetra-PEGuiladas.
[00146] O material de partida de IL-2 congelado (IL-2 recombinante purificado (sequência de aldesleucina) em 10 mM de acetato, 5% de trealose, tampão de pH 4,5 que foi armazenado a -70ºC) é desconge- lado em temperatura ambiente. O reagente de PEG, mPEG2-ru-20K NHS (pó), é solubilizado por adição a uma solução de 2 mM de HCl a
— 90 g/L em temperatura ambiente e agitado por um mínimo de 15 mi- nutos. A solução é em seguida carregada para o vaso de reação. A IL- 2 descongelada é adicionada ao vaso de reação, diluída apropriada- mente com água, seguido pela adição de tampão de bicina 0,75 M pH 9,7. A concentração final de IL-2 na mistura reacional é de aproxima- damente 1,0 g/L, e a concentração de bicina é de aproximadamente 50 mM para atingir um pH alvo de 8,7. Geralmente, a proporção de massa de PEG: rhll-2 é de cerca de 10:1 a 13:1 em uma solução tamponada com bicina em pH 8,5 a 9,5 para PEGIilar a proteína. A re- ação é incubada com agitação contínua por 40 minutos a 22ºC como medido a partir da conclusão da adição da solução de NHS mPEG2- ru-20K. No final do período de incubação, a reação é extinta com a adição de ácido acético 1 N para diminuir rapidamente o pH, e imedia- tamente seguido por mais titulação passo a passo em pH 4,0 usando 1 N de ácido acético adicional. A reação extinta é diluída 10X por adição de água. A reação diluída extinta é filtrada através de um filtro de 0,22 um para fornecer o produto bruto.
[00147] A cromatografia de troca catiônica SP SEPHAROSEG Fast Flow é em seguida conduzida no produto bruto para separar parcial- mente as frações de reação PEGuiladas. A coluna de cromatografia de troca catiônica SP SEPHAROSEPG Fast Flow é equilibrada e a alimen- tação carregada em temperatura ambiente em um tempo de residência de — 5 minutos, seguido por 5 CV (volumes de coluna) de lavagem com tampão de carga. O rhlL-2 PEGuilado liga-se à resina enquanto PEG livre é lavado. O produto é em seguida eluído usando uma elui- ção de gradiente linear com 0-500 mM de cloreto de sódio em 10 mM de acetato de sódio de pH 4,0 de fundo tampão. As frações são cole- tadas de 0,15 CV cada, começando — 1 CV na eluição. A coleta da fração termina quando a absorvância a 280 nm foi <5% do pico máxi- mo. Concentrações de porção de PEGuilada (ou seja, I|L-2 mono-
PEGuilado (monômero), IL-2 di-PEGuilado (dímero), IL-2 tri-PEGuilado (trímero), IL-2 tetra-PEGuilado (tetrâmero), etc., em cada uma das fra- ções é medida pela absorbância em um comprimento de onda de 280 nm. A distribuição das frações PEGuiladas é medida por RP-HPLC como aqui descrito, e as frações contendo mono-PEG, di-PEG, tri- PEG e componentes superiores, são identificados e usados para de- terminar o re-agrupamento das frações necessárias para gerar com- posições que terão o perfil de distribuição da porção de PEGuilada al- vo, como descrito em uma composição de RUR2ox0-IL-2 como forneci- do aqui, e em particular nas Fórmulas AE. Alíquotas de frações seleci- onadas da composição identificada, por exemplo, di-PEG-IL-2 e tri- PEG-IL-2, e/ou mono-PEG ou PEG superior, são calculadas de modo a atingir o perfil alvo como fornecido aqui, e são em seguida reagrupa- das quando necessário para obter uma composição de RUR2oxD-IL-2 tendo um produto com a distribuição desejada de frações PEGiladas. Alternativamente, esquemas de purificação podem ser concebidos em que a eluição e coleta podem fornecer o perfil desejado de acordo com as modalidades aqui descritas, sem a necessidade de reagrupamento. A preparação purificada por cromatografia desejada (e/ou reunida no- vamente) é em seguida concentrada e diafiltrada em acetato de sódio MM, cloreto de sódio 150 mM, sacarose a 2% p/v, pH 5,0 usando filtração de fluxo tangencial (TFF), para atingir uma concentração final alvo de 1 mg/mL (base de proteína) de uma substância medicamento- sa da composição de RUR20ox0-IL-2.
[00148] Produtos reagrupados e/ou alvo são analisados e a distri- buição da composição é verificada por métodos aqui descritos, incluin- do RP-HPLC, para avaliar o perfil das frações de PEG. As prepara- ções de composições de acordo com as especificações aqui presentes para uma composição de RUR>2ox0-IL-2 das Fórmulas A-E são ilustra- das pelos lotes de produtos de exemplo numerados de 1-4 listados na
Tabela 1 abaixo.
Os ensaios para atributos são conhecidos do técnico versado e/ou descritos nos Exemplos 1-B até Exemplo 1-1, ou de outra forma aqui.
As composições de amostra de referência histórica apro- priadas são estabelecidas e usadas para comparação em preparações subsequentes.
Tabela 1. Sumário das análises ilustrativas de amostras de bate- ladas diferentes de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 por RP- HPLC e SEC-HPLC Fração (quando | Batelada 1 | Batelada 2 | Batelada 3 | Batelada 4 aplicável) Líquido ligei- Aparência da NA líquido claro, ramente opa- líquido claro, |líquido claro, amostra incolor lescente e incolor incolor incolor Identidade por Obedece a | Obedece a | Obedece a SDS-PAGE Identidade por Obedece a | Obedece a | Obedece a Teor de Proteí- ha por BCA (vs, NA 1,58 mg/mL | 0,96 mg/mL | 1,00 mg/mL | 1,42 mg/mL rhil-2) ND (não ND (não ND (não Livre de IL-2 <0,1% mais do que | mais do que | mais do que 0,3%) 0,3%) 0,3%) Di-PEG 42,4% 45,8% 46,8% 44,4% Tri-PEG 46,6% 42,6% 42,4% 44,8% Pureza PEGUIA superior ND (não ND (não ND (não Outros ND mais do que | mais do que | mais do que 0,5%) 0,5%) 0,5%) Di-PEG/Tri- o o o o PEG Total 89,0% 88,4% 89,2% 89,2% Pureza Peso Mole- i o o o o SEC-HPLC cular Baixo 3,0% 3,0% 2,4% 1,4% (Mono)
[free | SS ms eme eee | (quando | Batelada 1 | Batelada 2 | Batelada 3 | Batelada 4 aplicável) eteeso| am | OST NAT | RS (HPLC/ELSD) 0,1%) 0,1%) 0,1%) ND é não detectável, NMT é não mais do que.
[00149] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR>20ox0-IL-2 conterá, em uma base em mol, menos de 1% de IL-2 li- vre não conjugada (mais preferencialmente nenhuma 1IL-2 livre detec- tável), 5% ou menos de IL-2 mono-PEGuilada, de 28% a cerca de 60% de IL-2 di-PEGuilado, de cerca de 24% a cerca de 65% de IL-2 tri- PEGuUilado, 12% ou menos de espécies de I|L-2 PEGuiladas superio- res, e 80% ou mais de espécies combinadas de IL-2 e espécies de |L- 2 tri-PEGuiladas.
[00150] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR20x0-IL-2 conterá, por exemplo, menos de 0,5% em mol de IL-2 livre, de cerca de 2,5 a cerca de 4,5% em mol de IL-2 mono- PEGUuilada, de cerca de 35 a cerca de 50% em mol de IL-2 PEGuilada, de cerca de 38 a cerca de 46% em mol de IL-2 tri-PEGuilada, de cerca de 3 a cerca de 10% em mol de espécies de |L-2 PEGuiladas superio- res, e um total combinado de IL-2 di-PEGuilado e tri-PEGuilado de cerca de 80 a cerca de 95% em mol.
[00151] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR20x0-IL-2 conterá, por exemplo, em uma base em mol, 5% ou me- nos de IL-2 mono-PEGuilado e de 28% a cerca de 60% de IL-2 di- PEGuilado, e de cerca de 24% a cerca de 65% de IL-2 tri-PEGuilada e 12% ou menos de espécies de IL-2 PEGuiladas superiores. De prefe-
rência, a composição compreende 80% ou mais espécies de |IL-2 di- e tri-PEGuiladas combinadas.
[00152] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR20x0-IL-2 conterá, por exemplo, cerca de 2,5 a cerca de 4,5% em mol compreende IL-2 mono-PEGuilada, e de cerca de 35 a cerca de 50% em mol compreende IL-2 di-PEGuilada, e de cerca de 38 a cerca de 46% em mol compreende |IL-2 tri-PEGuilado, e de cerca de 3 a cer- ca de 10% em mol compreende espécies de IL-2 PEGuiladas superio- res. De preferência, a composição compreende um total combinado de IL-2 di-PEGuilado e tri-PEGuilado de cerca de 80 a cerca de 95% em mol.
[00153] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR20x0-IL-2 conterá, por exemplo, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol compreende IL-2 mono-PEGuilado, e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol compreende IL-2 di-PEGuilado, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol compreende IL-2 tri-PEGuilado, e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol compreende espécies de IL-2 PEGuiladas su- periores. De preferência, a composição compreende um total combi- nado de IL-2 di-PEGuilado e tri-PEGuilado de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
[00154] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR>20x0-IL-2 conterá, por exemplo, cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol compreende IL-2 mono-PEGuilada, e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol compreende IL-2 di-PEGuilada, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol compreende IL-2 tri-PEGuilado, e de cerca de 7 a cer- ca de 9% em mol compreende espécies de |L-2 PEGuiladas superio- res, e em que a referida composição compreende uma mistura de con- jugados de IL-2 mono-PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada a um de lisina K7 ou K8 ou K31 ou K75. De preferência, a composição compreende um total combinado de IL-2 di-PEGuilado e tri-PEGuilado de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
[00155] Em algumas modalidades, o produto de composição de RUR20x0-IL-2 conterá, por exemplo, cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol compreende IL-2 mono-PEGuilada, e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol compreende IL-2 di-PEGuilada, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol compreende IL-2 tri-PEGuilado, e de cerca de 7 a cer- ca de 9% em mol compreende espécies de |L-2 PEGuiladas superio- res, e em que a referida composição compreende conjugados de IL-2 mono-PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada a lisina K7. De preferência, a composição compreende um total combinado de IL-2 di- PEGuilado e tri-PEGuilado de cerca de 87 a cerca de 90% em mol. EXEMPLO 1-B Pureza e caracterização de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 por meio de cromatografia líquida de alto desempenho de fase rever- sa
[00156] A cromatografia líquida de alto desempenho de fase rever- sa (RP-HPLC) é usada para avaliar a pureza cromatográfica e a iden- tidade de amostras de uma composição de RUR2ox0-IL-2 usando um instrumento Agilent 1200 equipado com um detector de matriz de dio- dos (UV a 215 nm). A coluna usada pode ser uma coluna ACE 3 Phenyl-300 (Mac-Mod Analytical Inc.) (ou outra coluna adequada) com uma taxa de fluxo de eluente de 0,6 mL/min. RP-HPLC é realizada usando um gradiente contendo misturas de duas fases móveis: (1) Fa- se móvel A, uma solução de ácido fórmico 0,1% em água, e (2) Fase móvel B, uma solução de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila. O gradi- ente linear variou de 60% da fase móvel A/40% da fase móvel B a 40% da fase móvel A/60% da fase móvel B, a 20% da fase móvel A/80% da fase móvel B, a 60% da fase móvel A/40 % De fase móvel B. Os componentes do diluente/tampão de formulação são acetato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, sacarose 2%, a um pH de 5,0.
[00157] O material e as amostras de referência da composição de RUR 20x0-IL-2 congelados são descongelados e diluídos em 1,0 mg/mL com tampão de formulação. Pelo menos um controle em branco do tampão de formulação é primeiro submetido a RP-HPLC por meio de injeção para garantir que não haja interferência com a análise dos pi- cos relacionados à composição de RUR>2ox0-IL-2. Em seguida, o mate- rial de referência da composição de RUR2ox0-IL-2 ou controle foi inje- tado cinco vezes. As amostras de composição de RUR2ox0-IL-2 são injetadas em seguida. O material de referência/controle da composição de RUR2ox0-IL-2 é injetado após cada seis injeções de amostra e no final da sequência de injeção.
[00158] O % de desvio padrão relativo (RSD) do tempo de retenção para as cinco primeiras injeções de material de referência compreen- dendo composições di-PEGuilada (di-PEG) e tri-PEGuilada (tri-PEG) RUR>20x0-IL-2 não são mais do que 2,0%. A porcentagem de área % RSD para todas as injeções de composição de material de referência RUR>20x0-IL-2 dos componentes di-PEG e tri-PEG não são mais do que 5,0%. Todos os picos de composição de RUR2ox0-IL-2 das injeções de referência e de amostra são integrados. Especificamente, para uma concentração de 1,0 mg/mL de uma composição de RUR20ox0-IL-2, as espécies de composição di-PEG e tri-PEG RUR2ox0-IL-2 acima de um limite de detecção de 0,5% (LOD) e o pico de rhIL-2 acima de um LOD de 0,3% são respectivamente integrados. Para uma concentração de 1,0 mg/ml de RUR20x0-IL-2, o limite de quantificação (LOQ) é 1,0% para espécies di-PEG e tri-PEG RUR2ox0-IL-2 e 0,5% para rhlL-2. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 2 (6 amostras) e na Tabela 3 (12 amostras) abaixo.
Tabela 2: Porcentagem de área para frações de Mono-PEG, Di- PEG, Tri-PEG, Tetra-PEG e Penta-PEG de seis amostras replica- das de composição de RUR>2ox0-IL-2 analisadas por RP-HPLC Amostra Id PEG (%| (% de | (% de |PEG(%|PEG(% de Área)| Área) | Área) de Área) de Área) [mãe 256 [425 [4664 | 722 [06 | do que 2,0% para Di- PEG e Tri-PEG) Tabela 3: Porcentagem de área para as frações de Mono-PEG, Di- PEG, Tri-PEG, Tetra-PEG e Penta-PEG de doze amostras replica- das de composição de RUR20x0-IL-2 analisadas por RP-HPLC Amostra Id PEG (% | (% de | (% de |PEG(%PEG(% de Área)| Área) | Área) de Área)|de Área)
Amostra Id PEG (%| (% de | (% de |PEG(%|PEG(% de Área)| Área) | Área) de Área)|de Área) | ma [304 [4240 [4658 | 749 | 020 | do que 2,0% para Di- PEG e Tri-PEG) EXEMPLO 1-C Pureza e caracterização de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 por meio de cromatografia líquida de alto desempenho com exclusão de tamanho
[00159] A cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) pode da mesma forma ser usada para determi- nar a pureza e caracterizar uma composição de RUR20ox0-IL-2 usando um instrumento Agilent 1200 série equipado com um detector de ma- triz de diodos (UV a 280 nm) e um Yarra SEC -2000 coluna (Pheno- menex), e uma taxa de fluxo de eluente de 0,225 mL/minuto. A fase móvel é de acetato de amônio 0,2 M (pH 5,5) em uma proporção de volume de 80:20 com acetonitrila. O diluente/tampão de formulação continha acetato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 200 mM, sacarose a 2%, em um pH de 5,0.
[00160] O material de referência da composição de RUR2ox0-IL-2 congelado e as amostras analíticas são descongelados e diluídos para 1,0 mg/mL com tampão de formulação. As amostras são estáveis até 5 dias a 5ºC em solução.
[00161] —Processualmente, pelo menos um controle em branco do tampão de formulação é primeiro submetido a RP-HPLC por meio de injeção para garantir que não haja interferência com a análise de picos relacionados a RUR20x0-IL-2. Em seguida, a composição de RUR20x0- IL-2, solução de adequação do sistema, é injetada para garantir que os agregados ou espécies de peso molecular mais alto sejam resolvidos a partir de frações tetra-PEG RUR2ox0-IL-2. O material de referência da composição de RUR2ox0-IL-2 ou controle é subsequentemente injetado cinco vezes. As amostras de composição de RUR2ox0-IL-2 são injeta- das em seguida. O material de referência/controle da composição de RUR 20x0-IL-2 é injetado após cada seis injeções de amostra e no final da sequência de injeção.
[00162] O% de RSD do tempo de retenção das frações di-PEG e tri-PEG RUR2ox0-IL-2, para as primeiras cinco injeções de material de referência, não é superior a 2,0%. A porcentagem da área % RSD de di-PEG e tri-PEG RUR2ox0-IL-2 para todas as injeções de material de referência não é superior a 5,0%. Todos os picos de porção de RUR20x0-IL-2 das injeções de referência e amostra são integrados. Es- pecificamente, para uma concentração de 1,0 mg/mL da composição de RUR20x0-IL-2, as frações di-PEG e tri-PEG RUR>2ox0-IL-2 acima de um limite de detecção de 1,0% (LOD) são integradas. Para uma con- centração de 1,0 mg/ml de RURzox0-IL-2, apenas di-PEG e tri-PEG RUR20x0-IL-2 acima de 3,0% LOQ foram relatados.
[00163] As análises de amostras replicadas de composições de RUR2>20ox0-IL-2 são mostradas abaixo nas Tabelas 4 e 5, onde áreas de pico são fornecidas para frações de mono-PEG, di-PEG, tri-PEG, tetra- PEG e penta-PEG de RUR20xo Composição -lL-2. Tabela 4: % das áreas de pico para os componentes de Mono- PEG, Di-PEG, Tri-PEG, Tetra-PEG e Penta-PEG de RUR2ox0-IL-2 por SEC-HPLC Amostra [tado Id| (min) | Tetra- | (min) | Tri- | (min) Di-PEG| (min) |Mono- Tetra-| PEG | Tri- | PEG |Di-PEG Mono-| PEG
PEG PEG PEG
Amostra [tado Id| (min) | Tetra- | (min) | Tri- | (min) IDi-PEG| (min) |Mono- Tetra-| PEG | Tri- | PEG |Di-PEG, Mono-| PEG
PEG PEG PEG [ mesa [ NA [2168 | 457 [2242 [4674 [23,92 [2605 [2874 | 174 | (Critérios (NA) | (NA) | (NA) | (não | (NA) | (não | (NA) | (NA) de Aceita- mais do| mais do| ção) que que 10,0%) 10,0%) Tabela 5: % das áreas de pico para as frações Mono-PEG, Di-PEG, Tri-PEG, Tetra-PEG e Penta-PEG de amostras de composição de RUR>20x0-IL-2 por SEC-HPLC Amostra [tado Id| (min) | Tetra- | (min) | Tri- | (min) IDi-PEG| (min) |Mono- Tetra-| PEG | Tri- | PEG |Di-PEG, Mono-| PEG
PEG PEG PEG mostra 10/ 2024 | 29,82 | 4,90 | 24.17 [45,05 [ 25,59 [46,74 2941 | 351 | mostra 16/ 1122 [ 21.69 | 4,60 | 22,42 [46,08 [ 29,92 46,91 [20.76 | 175 | [ mesa [ NA [2247 | 47 [23,26 [4596 [2475 | 26,06 [ 29,08 | 2.5 | (Critérios (NA) | (NA) | (NA) | (não | (NA) | (não | (NA) | (NA) de Aceita- mais do) mais do) ção) que que 10,0%) 10,0%)
[00164] Um sumário das análises representativas de diferentes amostras de uma composição de RUR2ox0-IL-2 por RP-HPLC e SEC-
HPLC é mostrado na Tabela 1. Como pode ser visto, as preparações de composição de RUR20x0-IL-2 demonstram boa consistência de ba- telada para batelada com respeito às misturas de frações PEGuiladas (isto é, mono-PEGuiladas, di-PEGuiladas, tri-PEGuiladas, tetra- PEGuiladas, penta-PEGuiladas, etc.). EXEMPLO 1-D SDS-Page
[00165] SDS-PAGE é utilizado para a confirmação de uma identi- dade de composição de RUR20x0-IL-2. Amostras de uma composição de RUR20x0-IL-2, um marcador de peso molecular e um material de referência de composição de RUR2ox0-IL-2 apropriado são carregadas em um gel NuPAGE Bis-Tris e migradas através do gel. Após a eletro- forese, os géis são manchados usando GelCodeTM Blue Safe Protein Stain. A comparação do padrão de bandas de migração do gel com o material de referência e a confirmação de que não há novas bandas na amostra confirmam a identidade das amostras. As duas bandas mais intensas corresponderão às frações tri-PEGuilada e di PEGuilada. A banda mais superior nas pistas corresponde às varian- tes PEGuiladas superiores e a banda mais baixa corresponde às vari- antes mono-PEGuiladas. Exemplo 1-E Afinidade para IL-2RaB usando ressonância de plásmon superfi- cial (SPR), e potência em células U-2 OS que expressam o com- plexo de IL-2RaBa humano.
[00166] A afinidade de ligação de uma composição de RUR2ox0-IL-2 é determinada usando Biacore X-100 Surface Plasmon Resonance com detecção de luz polarizada. A técnica envolve a ativação da su- perfície de um chip sensor Biacore CM5 com um complexo 1:1 de N- hidroxissucinimida — 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (NHS EDC) para gerar um éster de NHS ativo. Anticorpo de cabra anti-Fc humano em acetato de sódio, tampão de pH 4,0 é covalentemente |i- gado à superfície do chip. O éster de NHS residual é extinto com eta- nolamina 1M. Uma mistura 1:1 de IL-2-Ra-Fc (Human IL-2Ra-Fc Chi- mera; Symansis) e IL-2RB-Fc (Human IL-2RB-Fc Chimera; Symansis) é capturada no chip usando tampão de HBS-EP (HEPES 1 mM, pH 7,4, NaCl 15 mM, EDTA 0,3 mM, tensoativo P20 0,0005% v/v) com BSA 0,1%. Uma composição de RUR2ox0-IL-2 é diluída em série em tampão de HBS-EP com 0,1% de BSA e injetada sobre o chip sensor. As afinidades de ligação cinética são medidas durante a aplicação das soluções durante 3 minutos (kon) seguido de uma lavagem de 3 minu- tos (koff). A relação entre koff e kKon é usada para calcular a afinidade de ligação cinética, KD. Os resultados das análises em triplicado de dois lotes de uma composição de RUR2ox0-IL-2 estão listados na Tabe- la 6. As afinidades de ligação e as taxas são consistentes para os dois lotes de fármacos. Tabela 6: Afinidade de ligação de Composição de RUR2ox0-IL-2 pa- ra IL-2RafB usando SPR RUR20x0-IL-2 Lote| (x 10ºM sec) (sec) (UM) om Es) A. 6,11, 0,07009, 1,15, 6,11 0,05573 0,912 o LS | SS 5,51, 0,06674, 1,21, 6,77 0,07156 1,06
[00167] Alternativamente, a plataforma PathHunter&, um formato de ensaio de ensaio de células criopreservado pronto para uso, forne- ce uma resposta celular mais robusta e consistente em relação às cé- lulas em cultura. Um ensaio de complementação de fragmento de en- zima (B galactosidase) (plataforma PathHunter&O da DiscoverX Corpo- ration, CA) é usado para medir as interações de fármaco/ligante- receptor. A potência de uma composição de RUR2ox0-IL-2 é medida em células U-2 OS que expressam o complexo de IL-2RaBa humano. A base do ensaio utiliza fragmentos de enzimas divididos, que isola- damente, são inativos. Dois fragmentos de enzima são fundidos aos domínios intracelulares das subunidades IL-2RB ou IL-2Ry e, após in- teração do ligante com o receptor, as subunidades do receptor são colocadas em estreita proximidade para restaurar a atividade enzimá- tica. Com a adição de um substrato, a enzima atua e produz um sinal luminescente. A ativação do receptor por meio de complementação do fragmento de enzima é medida após a incubação da amostra e refe- rência com as células por — 6 horas. As composições de RUR2ox0-IL-2 fornecem sinalização de baixa dose por meio do receptor heterotrimé- rico abBy IL-2 de alta afinidade (IL-2R). EXEMPLO 1-F Ocupação do local de PEGilação de uma composição de RUR20x0- I1L-2
[00168] A ocupação do sítio de PEGuilação de composições de RUR20x0-IL-2 de dois lotes é caracterizada por comparação direta da composição de RUR20KD-IL-2 com rhlL-2 por mapeamento de peptí- deo. Em uma digestão de RUR20KD-IL-2, um peptídeo contendo lisina pode ser PEGuilado e refletido por seu peptídeo contendo lisina nativo correspondente tendo uma abundância inferior, em comparação com o mesmo peptídeo em uma digestão de rhiL-2 de referência. A ocupa- ção do sítio de PEGuilação pode, desse modo, ser calculada com ba- se na redução da abundância do peptídeo nativo na digestão de RURZ20KD-IL-2 analisada. Além disso, o mapeamento de peptídeo de um material substituto pode ser usado para confirmação adicional da ocupação do sítio.
[00169] Geralmente, essa análise pode ser conduzida da seguinte maneira. Em estudos de comparação de mapeamento de peptídeo direto, uma composição de RUR20KD-IL-2 e uma amostra de controle de referência de rhll-2 são digeridas simultaneamente por GluC e GluC/Tripsina, seguido por análise de LC-UV/MS/MS para fornecer identificação e abundância de peptídeo. As comparações de mapea- mento de peptídeos da composição de RUR2ox0-IL-2 e rhlL-2 são usa- das para determinar a ocupação do sítio de PEGuilação.
[00170] Resumidamente, um ou mais peptídeos comuns, sem lisi- na, são selecionados como referência ou referências na composição de RUR20x0-IL-2 e na análise de rhll-2. A intensidade relativa de um peptídeo é a normalização de sua(s) referência(s). A redução da abundância relativa de um peptídeo nativo (RR) com lisina é calculada pelas intensidades relativas do peptídeo (Equação 1). A ocupação do sítio de PEGilação em uma lisina é o RR médio de peptídeos contendo a lisina. Equação 1: RR (% de redução relativa do peptídeo nativo) = [(intensidade relativa do peptídeo em rhIL2)-(intensidade relativa do peptídeo em RURZ20KD-lL2)]/(intensidade relativa do peptídeo em rhlL2) Intensidade relativa do peptídeo (Pep/Ref) = área de pico de UV (peptídeo)/área de pico de UV (peptídeo de referência)
[00171] O material usado como substituto da composição de RUR20x0-IL-2 é o produto resultante da conjugação de PEG 4kD mo- nodisperso com as lisinas de rhlL-2. Para imitar o perfil de PEGilação de uma composição de RUR2ox0-IL-2, o substituto é preparado usando o mesmo ligante de conjugação e a reação de conjugação foi realizada nas mesmas condições de reação usadas para preparar a composição de RUR20x0-IL-2. O mapeamento de GluC baseado em LC MS/MS e o mapeamento de tripsina do substituto identificam as lisinas PEGuUila- das e fornecem informações de suporte para RUR20xD-IL-2.
[00172] O mapa de GluC de RUR2ox0-IL-2 (um lote GMP) tem 95% de cobertura de sequência de rhlL-2. A comparação direta do mapa de GluC de RUR20ox0-IL-2 com rhlL-2 fornece a quantificação relativa de quatro de 11 lisinas em RUR2ox0-IL-2 (veja Tabela 7), onde lisina 7 e 8 foram contadas como um sítio no mapa de peptídeo. Os peptídeos contendo o restante das lisinas no mapa de GluC mostram evidências da PEGilação sem diferenciação do sítio. A clivagem adicional por trip- sina dos peptídeos contendo lisinas no mapa de GluC/Tripsina fornece ocupação de PEG em K31, K34, K42 e K47. A comparação de croma- togramas de mapeamento de GluC/tripsina de RUR20x0-IL-2 e rhiL-2 mostram reduções significativas desses peptídeos (veja Tabela 7). À ocupação de PEGuilação do sítio K48 não está disponível (N/A) no mapa de Tripsina/GluC devido a clivagem enzimática incorreta.
[00173] O mapeamento de peptídeos do substituto de rhiL-2 PEGui- lado 4k identifica os peptídeos com as lisinas marcadas com PEG 4k com alta precisão de massa (<5 ppm). A combinação dos resultados do mapeamento de peptídeo direto de RUR20x0-IL-2 e o substituto de rhiL-2 PEGuilado 4k mostram que K7, K31 e K75 são sítios de PEGui- lação predominantes (veja Tabela 8). Os sítios de PEGuilação menos predominantes da composição de RUR20x0-IL-2 podem ser K8, K34, K42, K47, K53 e K63. K48 pode ser PEGuilado e K96 é indeterminado.
[00174] A ocupação do sítio de PEGilação é comparável em uma segunda preparação de GMP de composição de RUR20x0-|L-2 e em um lote de desenvolvimento (veja Tabela 7). A abordagem combinada de mapeamento de GluC e mapeamento de tripsina/GluC fornece in- formações lote a lote para alguns sítios de PEGuilação predominantes de conjugados em composições de RUR20rD-IL-2.
Tabela 7. Ocupação do Sítio de PEGuilação nas composições de RUR>20x0- I1L-2: um lote de GMP e um lote de DEMO Tripsina/GluC % PEGuilação Posição d GluC Map (%RR) Map Sítio de Ocupa- osição de (%RR) ção Lisina GMP Lo-| DEMO | GMP | DEMO |GMP Lo-| DEMO te Lote Lote Lote te Lote KTKs
[00175] O lote DEMO refere-se a uma preparação feita para de- monstrar a operacionalidade do processo de produção. Tabela 8. Sumário da ocupação do sítio de PEGuilação em uma composição de RUR»2ox0-IL-2 e substituto de rhlL-2 4k PEGuilado Sítios de PEG Predo- | Sítio de PEG Predomi- |Sítios de PEG Pre- minantes de Digestão | nante de substituto de dominantes de Re- Direta (GluC e mapa |rhlL-2 PEGuilado (GluC| sultados Combi- de GluC/Tipsina) e mapa de Tripsina) nados K34 (possível) K34 (não preferido) K48 (desconhecido) K48 (possível) EXEMPLO 1-G Estabilidade de fase de solução de uma composição de RUR20x0-
I1L-2
[00176] A estabilidade de soluções de 1,0 mg/mL de uma composi- ção de RUR2ox0-IL-2 (- 1 mg/mL de rhiL-2 equivalente em acetato de sódio 10 MM, cloreto de sódio 200 mM, pH 5, contendo 2% (p/v) saca- rose) são avaliados sob três condições de armazenamento diferentes - temperatura ambiente (condições ambientais de laboratório), 5ºC (re- frigerado) e -20ºC em pontos de tempo de 1, 3, 5 e 7 dias por RP- HPLC como descrito anteriormente.
[00177] As diferenças entre as soluções de composição de RUR>20ox0-IL-2 são avaliadas contra um controle, solução de amostra de composição de RUR>2ox0-IL-2 recém-preparada. As espécies Di-PEG e tri-PEG de amostras de composição de RUR2ox0-IL-2 armazenadas em TR, 5ºC e -20ºC até 7 dias mostram diferenças relativas de até 1% em comparação com o armazenamento de amostra nominal de -70ºC. A diferença relativa (Rel. Diff.) para espécies PEGuiladas de componen- te de porcentagem menor de RUR2ox0-IL-2 (espécies mono-PEG, tetra- PEG e penta-PEG) é de até 8%. Isso indica que as amostras de solu- ção armazenadas sob essas condições representativas de armazena- mento são estáveis. Bioensaios in vitro:
[00178] Métodos in vitro podem ser usados para medição adicional da potência biológica e caracterização biológica de composições de RUR20x0-IL-2, incluindo ensaios baseados em células para caracterizar a bioatividade após a ativação do receptor, que é representativo do complexo do receptor |L 2: Metodologias de bioensaio
[00179] Resposta de plataforma de ensaio de forma de receptor de IL-2 tipo célula de bioensaio la Receptor de Ensaio IL-2 Celular — tura contínua) IL-2RabBy | Glo6 Viabili- de Receptor e dade de Célu-| proliferação la, Promega celular receptor de | (células con- | IL-2Raby DiscoverX [de Receptor e Ligan- geladas, complemen- te/fármaco | prontas pra tação de en- uso) zima ativação [tura contínua)) IL-2RabBy | Descoberta de Receptor e| de Meso Es- | fosforilação cala
[00180] Em todos os três ensaios, os dados da curva de dose- resposta (resposta versus concentração) são avaliados usando um modelo de regressão não linear. A potência da amostra da composi- ção de RUR2ox0-IL-2 é medida em relação ao material de referência por meio da proporção de metade da concentração efetiva máxima (EC50). EXEMPLO 1-H Ensaio de proliferação celular CTLL-2
[00181] No ensaio de proliferação celular, o crescimento celular é medido in vitro usando células CTLL-2 após a incubação da amostra e referência por — 26 horas, onde a proliferação celular é medida por meio de ensaio baseado em trifosfato de adenosina luminescência (CellTiter-GloO, Promega, WI). Por exemplo, este ensaio de prolifera- ção baseado em células usa a linha celular CTLL-2, que exibe uma resposta de proliferação dependente da dose para a proteína rhlL-2. rhiL-2 é usado como o controle de ensaio e é preparado em uma faixa de concentração diferente de uma composição de RUR2ox0-IL-2 neste método. Este ensaio é realizado em um formato de placa de 96 cavi- dades. As células CTLL-2 são privadas de rhlL-2 em meio de privação e incubadas durante a noite por 20 + 3 horas em uma incubadora de 37ºC e 5% de CO;>. As células privadas são semeadas em placas de 96 cavidades e uma série de diluições da composição de RUR2ox0-IL-2 é alimentada às células e incubada por mais 25 + 3 horas em uma in- cubadora de 37ºC e 5% de CO». O crescimento celular induzido pela composição de RUR20x0-IL-2 em cada cavidade é medido usando um kit de detecção CellTiter Glo& da Promega. CellTiter Glo& gera um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente em ca- da cavidade, que é diretamente proporcional às células viáveis presentes. O sinal de luminescência é lido em uma leitora de placa SpectraMax M5. Uma curva de resposta à dose de material de refe- rência de composição de RUR>2ox0-IL-2 e cada amostra é gerada tra- çando o sinal luminescente (eixo y) para concentrações (eixo x). O gráfico é ajustado a um modelo de regressão não linear logística de 4 parâmetros. O software Parallel Line Analysis (PLA) é usado para ava- liar o Teste de Equivalência para Diferença de Inclinações (paralelis- mo), Significância de Regressão e para calcular a relação de potência da amostra em relação ao material de referência na mesma placa. EXEMPLO 1-1 Ativação de Fosfo-STAT5
[00182] No ensaio de fosfo-STATS após a ligação ao receptor, a sinalização celular a jusante pode então ativar o Transdutor de Sinal e o Ativador da Transcrição 5 (STAT5) por meio da fosforilação para promover a expressão de gene para induzir a proliferação celular. À ativação de fosfo-STAT5 é medida em células CTLL-2, uma linhagem celular de linfócitos T de murinos dependentes de IL-2, usando o en- saio multiplexado fosfo STAT5/STATS5 total (Meso Scale Discovery, MD) em resposta à amostra e tratamento de referência para — 10 mi-
nutos. EXEMPLO 2 Estudo /n Vivo: Estudo PK/PD de dose única em camundongos
[00183] A estimulação seletiva de Tregs por uma composição de RUR 20x0-IL-2 pode ser demonstrada em camundongos. Camundongos C57BL/6 (n = 4/grupo) são administrados com uma única dose subcu- tânea de uma composição de RUR2ox0-IL-2 em doses de 0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg. Após a administração, amostras de sangue e baço são co- letadas nos dias 1-7 e no dia 10 após a administração. Mais particu- larmente, em cada momento, são coletadas amostras de sangue e ba- ço; as amostras são reunidas e avaliadas para análise farmacodinâmi- ca da ação do fármaco em populações de células de linfócitos por ci- tometria de fluxo (veja, por exemplo, Exemplo 5), expressa como uma alteração de dobra em relação ao controle do veículo. Além das mu- danças no número de células, marcadores funcionais e marcadores de atividade são quantificados. Finalmente, a concentração plasmática de fármaco é da mesma forma avaliada.
[00184] Como mostrado nas FIGs. 3A e 3B, a administração de uma composição de RUR2ox0-IL-2 resulta em aumentos dependentes da dose em CD4+ Treg no sangue e no baço, com um pico de aumen- to no número de células quatro dias após a administração. Na dose mais alta testada (0,3 mg/kg), um efeito prolongado na mobilização de Treg é alcançado, com os níveis de Treg não retornando aos níveis basais até 7-10 dias após a administração. No sangue, as células NK são elevadas após a administração da dose mais alta testada, enquan- to as alterações nas células T CD4 são modestas e ocorrem ligeiras diminuições nas células T CD8 (FIGs. 4A-C). As células B e as células T CD8 diminuem ligeiramente após a administração da dose mais alta testada, uma dose que da mesma forma levou a um aumento de me- nos de 2 vezes nas células NK. Marcadores de função e atividade de
Treg (FIGs. 5A e 5B) demonstram que na dose mais alta testada, a administração de uma composição de RUR2ox0-IL-2 leva a um aumen- to na ativação de Treg, como medido pela intensidade média de fluo- rescência (MFI) de CD25 e Foxp3. Embora os números de Treg não atinjam os valores máximos até quatro dias após a administração, es- ses marcadores de ativação atingem seu máximo nos primeiros dois dias após a administração, diminuindo lentamente de acordo com a exposição plasmática de RUR20x0-IL-2. A porcentagem de Treg de pro- liferação rápida, medida pelo Ki67, aumenta rapidamente dois dias após a administração e a porcentagem permaneceu mantida até o dia 6 antes de retornar aos níveis basais. Além disso, a porcentagem de Treg que expressa o coestimulador de células T induzível por marca- dor de superfície celular (ICOS) é da mesma forma aumentada, um achado notável, pois a expressão de ICOS está ligada ao aumento da atividade supressiva de Treg em ambientes autoimunes. Embora o aumento em Ki67 e ICOS pareça estar um pouco atrasado em relação ao pico de concentração da composição de RUR2ox0-IL-2, seu retorno aos níveis basais coincide com uma diminuição da concentração plasmática neste estudo pré-clínico em camundongo. EXEMPLO 3 Ensaio de supressão de Treg in vitro
[00185] O objetivo deste estudo é avaliar a função inibitória das cé- lulas T reguladoras. Tregs são magneticamente isolados de camun- dongos C57BL/6 infantis e tratados com composição de RUR20xD-IL-2 nos dias 1-7 e 10 após a administração subcutânea. Treg e Tcon são co-cultivados em uma faixa de proporções de 1:2 a 1: 512 por três di- as. A proliferação celular é avaliada por incorporação de 3H-timidina ao longo das 16 horas finais do ensaio e é calculado o % de células em proliferação em relação aos controles da placa.
[001868] Em sumário, os baços são coletados de camundongos fê-
meas C57BL/6 tratados com uma composição de RUR2ox0-IL-2 em vá- rios níveis de dose (0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg) ou veículo em tempos indi- cados após a administração da dose (n = 4 camundongos/grupo de tratamento/tempo). Os isolamentos de uma única célula são prepara- dos para cada baço e as misturas de esplenócitos resultantes são reu- nidas para cada grupo de dose em cada ponto de tempo. Uma porção da amostra combinada equivalente a um baço é dividida em alíquotas para o perfil de células imunes. A preparação de esplenócitos restante é utilizada para o isolamento de células T reguladoras (Tregs). Tregs CD4+ CD25+ são isolados de baços de camundongos por classifica- ção de células magneticamente ativadas (MACS) utilizando o isola- mento de células T regulatório CD4+ CD25+, camundongo, kit (Mil- tenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as reco- mendações do fabricante. As células T CD4+ são selecionadas nega- tivamente e em seguida separadas em células T CD4+ CD25- e Tregs CD4+ CD25+. Células T CD4+ CD25- convencionais ingênuas (Tcon) são isoladas por MACS de baços de camundongos colhidos de ani- mais não tratados, usando o kit de isolamento de células T CD4+ in- gênua (Miltenyi Biotec) e seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante.
[00187] Os ensaios de supressão in vitro são realizados em meio de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 1 MM de piruvato de sódio, 0,5 uM de B-mercaptoetanol e 1X antibiótico/antimicótico (100 unidades/mL de penicilina, 100 ug es- treptomicina/mL e anfotericina B 250 ng/mL). 5 x 104 Tcon são estimu- lados com grânulos revestidos com anti-CD3 e anti-CD28 (kit de ativa- ção/expansão de células T, camundongo, Miltenyi Biotec) em uma proporção de 2 grânulos para cada Tcon em 100 uL de meio de cultu- ra em placas de base redonda de 96 cavidades. A capacidade supres- sora de Tregs é avaliada pela adição de Tregs a Tcon em diferentes proporções (proporções de Treg: Tcon de 2:1 a 1: 512). Cada Treg: A proporção de Tcon é testada em triplicata. As células são co-cultivadas por 72 horas a 37ºC e 5% de CO, em uma atmosfera umidificada; 16 horas antes do término do ensaio, 0,5 uCi [3H]-timidina é adicionado às cavidades. Depois de lavar as células livres de [3H]-timidina não incorporada, a absorção de timidina é medida como contagens por mi- nuto (CPM) usando um contador de cintilação de microplaca (To- pCount NXT, Perkin Elmer). Os valores de CPM individuais são nor- malizados para proliferação máxima dividindo pelo CPM médio regis- trado para as quatro diluições Treg: Tcon mais baixas. As curvas de concentração-resposta são representadas graficamente usando re- gressão não linear de quatro parâmetros e ponderação 1/y2 no PrismO 6,03 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia).
[00188] “Como mostrado nas FIGs. 6A-D, Tregs esplênicos isolados de camundongos tratados com veículo em 1 e 4 dias após o início do estudo exibem capacidade supressora com a maior supressão ocor- rendo em uma proporção de 1:2. No entanto, Treg's isolados nestes pontos de tempo após a administração de uma composição de RUR20x0-IL-2 exibem uma capacidade supressora muito aumentada, como evidenciado pela proliferação diminuída de Tcon, particularmen- te em razões maiores do que 1: 8. A capacidade supressora relativa de Tregs isolados cultivados com Tcon em uma relação de 1:2 é da mesma forma avaliada ao longo do tempo (FIG. 7). Após a administra- ção de RUR20x0-IL-2, a atividade supressora de Treg aumentada é mantida por quatro dias antes de retornar à atividade de linha de refe- rência exibida pelo grupo tratado com veículo de controle. EXEMPLO 4 Avaliação de uma composição de RUR2oxp-IL-2 em um modelo de eficácia KLH DTH de camundongo
[00189] Para avaliar a capacidade de indução de Treg pela adminis-
tração de uma composição de RUR2ox0-IL-2 para suprimir a inflamação induzida por antígenos de células T, camundongos Balb/c (n = 6- 10/grupo) são utilizados em um modelo de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH). Os camundongos são sensibilizados por por meio de subcutânea em sua área dorsal com uma injeção subcutânea de 100 pl contendo 100 ug de hemocianina límpida (KLH) em uma emulsão contendo Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incomple- to de Freund, a uma proporção de 1:1:1 respectivamente. Cinco dias depois, a espessura da linha de referência da orelha é medida antes do desafio com 10 ug de KLH intradermicamente na orelha esquerda, com a orelha direita permanecendo sem tratamento. As medições da espessura da orelha são medidas com calibradores 24, 48, 72 e 96 horas após o desafio com KLH em todos os grupos. A composição de RUR>20x0-IL-2 é administrada no dia O, no momento da sensibilização, com doses subcutâneas variando de 0,003 mg/kg a 0,3 mg/kg a cada três dias. Um controle positivo consistindo em ciclosporina (10mg/kg, dose única) foi administrado no dia O.
[00190] Como mostrado nas FIGs. 8A, 8B, após o desafio do antí- geno, o inchaço da orelha é induzido com um aumento médio na es- pessura da orelha atingindo um máximo de mais de 14 mm em 48 ho- ras. As orelhas ingênuas e não desafiadas não exibiram alterações na espessura durante o curso do estudo. A administração de uma com- posição de RUR20x0-IL-2 através do período de sensibilização e desa- fio neste estudo leva a diminuições dependentes da dose significativas no inchaço da orelha, como evidenciado pela inflamação reduzida em cada ponto de tempo em relação ao controle do veículo. Para avaliar mais quantitativamente o efeito após o desafio, uma AUC da mudança na espessura é calculada para cada grupo de tratamento (AUCO 96h). Como mostrado nas FIGs. 8A e 8B, a dose minimamente eficaz é 0,01 mg/kg q3d, enquanto o efeito máximo é alcançado com 0,3 mg/kg q3d.
Os valores de AUC estatisticamente significativos do grupo de veículo são anotados com um asterisco (p <0,05; ANOVA, Tukey). Tomados em conjunto, esses dados demonstram que a mobilização e ativação aumentadas de Treg alcançadas após a administração podem suprimir os mecanismos inflamatórios conduzidos pelo antígeno in vivo.
[00191] A atividade de uma composição de RUR2ox0-IL-2 do Exem- plo 1 é avaliada após administração in vivo em roedores e macacos cinomólogos. Em camundongos, uma composição de RUR2ox0-IL-2 leva a aumentos dependentes da dose em Treg que atingem um má- ximo de quatro dias após a administração. A análise de citometria de fluxo de Treg induzida por uma composição de RUR2ox0-IL-2 em ca- mundongos mostrou que os marcadores de ativação de Treg, como Foxp3 e CD25, a intensidade média de fluorescência (MFI) atingem seu valor máximo nos primeiros dois dias após a administração e di- minuem gradualmente ao longo do tempo de acordo com a exposição plasmática da composição de RUR2ox0-IL-2. A porcentagem de Treg em proliferação ativa também atinge seu valor máximo dentro de dois dias após a administração e é mantida até o dia 6. A expressão do marcador funcional de Treg ICOS atinge o pico no dia 3 antes de re- tornar à linha de referência no dia 7. Treg isolado dos baços de ca- mundongos tratados aumentam muito sua capacidade supressora nos primeiros quatro dias após a administração, antes de retornar aos ní- veis basais de atividade. Uma composição de RUR2ox0-IL-2 do Exem- plo 1 suprimiu uma reação inflamatória induzida por antígeno em um modelo de camundongo de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) quando administrada a cada três dias. EXEMPLO 5 Estudo de dose única em macaco cinomólogo
[00192] Neste estudo, macaco cinomólogo, uma fêmea e um ma- cho, são administrados 25 ug/kg de uma composição de RUR2ox0-|L-2 subcutaneamente. Uma série de amostras de sangue é retirada de cada animal antes do tratamento (dia 6 e -1) e em vários intervalos após o tratamento para avaliação por citometria de fluxo do número de células Treg e estado de ativação.
[00193] Paraa análise de imunofenotipagem, amostras de sangue (aproximadamente 1,0 mL) são coletadas de cada macaco nos seguin- tes pontos de tempo: Pré-tratamento (Dia -6 e -1), Dia 2, Dia 3, Dia 4, Dia 5, Dia 6, Dia 7, Dia 10, Dia 14 e Dia 21 pós-tratamento. As amos- tras de punção venosa são coletadas em tubos contendo o anticoagu- lante K2EDTA. Os tubos são colocados em gelo úmido enquanto se aguarda a transferência. As amostras de sangue total são analisadas por citometria de fluxo usando os seguintes painéis, e as amostras são analisadas para o seguinte: Painel de células T: CD45/CD3/CD4/CD8/ICOS Painel T/B/NK: CD45/CD3/CD16/CD20 Painel pSTATS: CD3/CD4/CD8/CD25/CD127/pPSTATS Painel Treg 1: CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Ki67 Painel Treg 2: CD3/CD4/CD8/CD25/FoxP3/Helios
[00194] Os sistemas computadorizados podem ser usados para a realização do estudo, por exemplo, a aquisição de dados de citometria de fluxo pode usar o software de análise de dados BD FACSCanto IVFACSDiva LEGENDPIex e a análise de dados de citometria de fluxo pode usar o software De Novo FCS Express.
[00195] Os valores de machos e fêmeas são calculados em média, e a magnitude da mudança é mostrada em relação aos valores de d-1, marcados pela linha pontilhada. Como mostrado na FIG. 9, o número de células Treg aumenta substancialmente após a administração, atin- gindo seu nível máximo sete dias após a administração e retornando aos níveis próximos de d-1 aos dias 14 21. Como mostrado pelos tri- ângulos abertos na Figura 9A, quase todas as Tregs induzidas por um
RUR>20x0-IL -2 composições são proliferativas, como medido por Ki67.
[00196] O estado de ativação relativa de Treg's estimulado pela administração de uma composição de RUR2ox0-IL-2 é ainda medido pela intensidade média de fluorescência (MFI) de FoxP3 e CD25. O CD25 MFI atinge seu valor máximo no dia 6 e, em seguida, estabiliza até o dia 10 antes de retornar aos níveis próximos à pré-dose no dia
21. O FoxP3 MFI também atinge um máximo de 6 dias após a admi- nistração antes de quase retornar aos níveis pré-dose no dia 14-21. Empregados em conjunto, esses dados demonstram a capacidade de tradução das constatações em camundongos para macaco cinomólo- go, visto que uma magnitude semelhante de indução de Treg no san- gue é observada, que é acompanhada por um aumento na ativação de Treg. No entanto, em contraste com os resultados em camundongos, os efeitos em macacos cinomolgos são mais prolongados na natureza. EXEMPLO 6 Farmacocinética de dose única e toxicocinética em camundon- gos, ratos e macacos
[00197] Os resultados da farmacocinética/toxicocinética de dose única de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 em camundongos, ratos e macacos são resumidos. Os detalhes do regime de dosagem são for- necidos na Tabela 10. Tabela 10: Visão geral dos estudos de composição de RUR2ox0-IL- 2 farmacocinética e toxicocinética de dose única e To TETE E ee Adminis- Dose tração de Dose Matrizes tração (mL/kg) Dose (mg/kg) coletadas (mg/mL) néticos) nea 0,02, 0,06 0,3
Espe ear] (Farmacoci- STE Urina
[00198] Paraoestudoem camundongos, o veículo para a composi- ção de RUR2ox0-IL-2 é acetato de sódio 10 MM, cloreto de sódio 200 mM e sacarose a 2% (pH 5). Para os estudos em ratos e macacos, o veículo para a composição de RUR20x0-IL-2 é acetato de sódio 50 mM, cloreto de sódio 200 mM e sacarose a 2% (pH 5).
[00199] Após a administração subcutânea, a composição de RUR20x0-IL-2 é lentamente absorvida com Tmax de 0,33-1,0, 1,0-2,3 e 2,0 dias em camundongos, ratos e macacos, respectivamente (Tabela 11). As exposições plasmáticas da composição de RUR20ox0-IL-2 au- mentam mais ou menos proporcionalmente à dose em camundongos e ratos. A biodisponibilidade está na faixa de 29,8-46,0% em ratos e 86,2% em macacos.
[00200] O volume de distribuição no estado estacionário (Vss) da composição de RUR2ox0-IL-2 parece aumentar no rato com a dose e variou entre 25,1 (0,01 mg/kg) e 52,6 mL/kg 1,0 mg/kg) (Tabela 12). No geral, Vss é 1-2 vezes e 2-4 vezes maior do que o volume plasmá- tico específico da espécie em ratos e macacos, respectivamente, su- gerindo que RUR2ox0-IL-2 permanece principalmente no espaço vascu- lar.
[00201] A lieração plasmática (CL) é muito baixa (0,560-1,14 mL/h/kg em ratos e 0,245 mL/h/kg em macacos) (Tabela). Após a do- sagem intravenosa ou subcutânea, as concentrações da composição de RUR20x0-IL-2 parecem exibir um decaimento monoexponencial com meia-vida de 1,85 2,24 dias em camundongos, 1,25-2,44 dias em ratos e 10,4-12,9 dias em macacos (Tabelas 11 e 12 e FIGs. 10A, 10B). A excreção renal de RUR20ox0-|L-2 é projetada para ser baixa devido à sua média m peso olecular de 63 kDa que está próximo do peso mole- cular de corte para o filtro de glomérulo. Tabela 11: Parâmetros Farmacocinéticos/Toxicocinéticos do Plasma Média + SE após a Administração de uma Dose Subcutâã- nea Única de uma Composição RUR2oxn-IL-2 para Camundongos C57BL/6, Ratos Sprague-Dawley ou Macacos Cinomolgos Espécies) , . Biodispo- (Número | 3º Por [AUCIinf AUCIast cm, | Meia | MET] Trac Inibilidade d ti se (rpg!) (hr (pvg/mL) Vida (dia) | (dia) | absoluta o estu" ma/kg)| mL) | pa/mb) | "PS (dia) . do) (%) (LS-2016- 12057, LS-| 2016- | O3 245 | 238 | 3,33 | 1,85 | 298 | 1,00 NA 2073) 7,16+ | 7,12+ [0,095 +| 1,35 + | 2,70 + | 1,33 Sea 01 35,7 + | 35,5+ | 0,38 + | 1,92 + | 342+ | 2,0+ 29,8 2033) ' 5,10 5,10 0,04 0,08 0,28 0,00 ' 1 404 + | 398+ | 4,86 + | 1,27 + | 2,82 + [2,30 + 79,0 74,0 0,93 0,32 0,16 0,33 004) Macaco? (LS-2016-| 0,025 | 86,0 65,4 0,25 10,4 15,0 2,0 86,2 2026)
[00202] —AUCIinf: Área sob a concentração plasmática-curva de tem- po do tempo zero ao tempo infinito; AUCIast: Área sob a concentração plasmática-curva de tempo desde o tempo zero até a última concen-
tração mensurável; Cmax: concentração plasmática máxima observa- da; MRTinf: Tempo médio de residência; Tmax: Tempo de concentra- ção plasmática máxima observada
1. Os parâmetros PK são baseados no valor médio de três ratos por ponto de tempo.
2. Média de macaco macho e fêmea. Tabela 12: Média + SE Parâmetros Farmacocinéticos do Plasma após a Administração de uma Dose Intravenosa Única de uma Composição RUR»2ox0-IL-2 a Ratos Sprague-Dawley ou Macacos Cinomolgos IV Dose a ie (mio! Ne MRTinf] vss (mg/kg) ugmL) |ua/ml) | kg) (dia) (dia) |(mML/kg) me pe pe bre De De De mun- ND ND ND ND dongo ' 1,00 0,90 0,03 0,16 0,21 1,80 [97 Soo oo ooo ooo Go ax Rato 8,00 8,00 0,06 0,01 0,04 3,50 8r7& 114+ | 1,56+ [1,00 +| 52,6 + 1 39,0 B70+35) à . ' Eee
EOODIDOONO ND: Não determinado; AUCinf: Área sob a concentração plasmática- curva de tempo do tempo zero ao tempo infinito; AUCúltimo: Área sob a concentração plasmática-curva de tempo desde o tempo zero até a última concentração mensurável; CL: Liberação; MRTinf: Tempo mé- dio de residência; Vss: Volume aparente de distribuição no estado es- tacionário. * Média de macaco macho e fêmea. EXEMPLO 7 Estudo Comparativo em Ratos
[00203] Um estudo essencialmente semelhante ao descrito no Exemplo 2 é conduzido em que camundongos C57BL/6 são adminis- trados com uma única dose subcutânea de uma composição de RUR20x0-IL-2 a 0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg ou são administrados com IL-2 não modificada (aldesleucina) em dosagens de 0,03 mg/kg (qddx5), 0,1 mg/kg (gdx5) e 1 mg/kg (gdx5). Após a administração, as amostras de sangue e baço são coletadas e analisadas para análise farmacodi- nâmica da ação do fármaco nas populações de células de linfócitos por citometria de fluxo, expressa como uma alteração dobrada em re- lação ao controle do veículo. Os resultados são mostrados nas FIGs. 10A e 10B (a composição de RUR2ox0-IL-2 é rotulada como "RUR-IL- 2", a aldosleucina é rotulada como "IL-2"). EXEMPLO 8 Investigação da eficácia de uma composição de RUR2ox0-IL-2 em um modelo de camundongo com lúpus eritematoso sistêmico (SLE)
[00204] Este estudo é conduzido para determinar a eficácia de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 no desenvolvimento e progressão de LES e suas características associadas usando um modelo de camun- dongo MRL/MpJ-Faslpr, o modelo de camundongo mais comumente estudado desta doença (Perry, D., e outro, J Biomed Biotechnol 2011: 271694). O modelo de camundongo MRL/MpJ-Faslpr desenvolve uma doença autoimune que reflete patologias do LES humano, incluindo aumento dos linfonodos, aumento dos níveis de IgG, produção de an- ticorpos antinucleares, proteinúria e insuficiência renal causada pela inflamação dos glomérulos. Uma solução de matéria prima de uma composição de RUR2ox0-IL-2 como descrito no Exemplo 1 é usada como o artigo de teste (1,58 mg/mL) fornecido em veículo (líquido transparente; 10 mM de acetato de sódio/200 mM de cloreto de só- dio/2% (p/v) sacarose), preparada em água esterilizada para injeção
(SWFI), USP; pH 5,0 + 0,1). Nos dias de dosagem, uma quantidade adequada de artigo de teste é retirada e diluída com veículo para che- gar à concentração de dosagem desejada (dose de 0,03 mg/kg e dose de 0,3 mg/kg); o volume da dose foi de 5 mL/kg. Os animais usados para o estudo são camundongos MRL/MpJ-Faslpr e camundongos fê- meas infantis MRL/MpJ, com idade de 6-8 semanas. Os animais são atribuídos a grupos de tratamento por randomização. Os grupos de tratamento são descritos na Tabela 13 abaixo. 45 camundongos MRL/MpJ-Faslpr são randomizados em 3 grupos (15 cada para os Grupos 2-4) com base no peso corporal e nível de conteúdo de proteí- na na urina antes do início do experimento. Os animais nos Grupos 2 - 4 recebem veículo ou artigo de teste administrado subcutaneamente, como descrito na Tabela 6. Grupo 1 - Os ratos MRL/MpJ recebem o veículo como controlo negativo.
[00205] Três (3) dias após a administração da primeira dose na Semana 8, 3 camundongos dos Grupos 2 - 4 são sacrificados e amos- tras de sangue foram coletadas e processadas. Os pesos corporais são medidos duas vezes por semana desde o início do estudo e conti- nuados ao longo.
[00206] As fotos das lesões cutâneas foram tiradas na primeira ob- servação e depois em intervalos de uma semana.
[00207] Aurina é obtida um dia antes da dosagem (na linha de refe- rência) e depois coletada semanalmente.
[00208] Os níveis de proteína na urina são medidos usando um Si- emens Clinitek Status Analyzer.
[00209] No dia do sacrifício (3 dias após a última dose no final da semana 20), todos os camundongos são anestesiados por injeção in- traperitoneal de hidrato de cloral! (50 mg/kg). Amostras de sangue são coletadas e centrifugadas a 10000 r/min por 10 min para obter amos- tras de soro. O soro é armazenado a -80ºC até o teste de bioquímica clínica.
As amostras de soro (100 ul) são analisadas quanto ao nível de anti-cdsDNA por ELISA (Kit de ELISA específico para IgG anti- dsDNA de camundongo, Alpha Diagnostic International, Cat.
No. 5120) e o soro testado para concentração de BUN usando um Analisador de Bioquímica Automático Hitachi 7020. Para a análise de linfócitos, as amostras de sangue são coletadas em tubos de EDTA-K e testadas para CD3/CD4/CD8/Treg/NK / % de células B por citometria de fluxo.
Os resultados são mostrados na FIG. 11. Como mostrado aqui, a ad- ministração de uma composição de RUR20ox0-IL-2 em uma dose de 0,3 mg/kg é eficaz para suprimir o biomarcador de dano renal (ou seja, níveis de proteína na urina) para quase os mesmos níveis observados em camundongos normais.
Este estudo elucida ainda o efeito das Tregs induzidas por RUR-IL-2 no controle da resposta imune fisiológi- ca e na progressão da doença em um modelo animal representativo de LES.
Tabela 13 - Grupos de tratamento Grupo te tração Uk: Uk: Rotina Regime (mam) | (MI/Kg) | (ml/kg) Duas vezes por| Veículo? semana, da 1 | amRouMp | 3 | NA S NA | SC | somanaga semana 20 veias Pao 2 | (MRUMpJ- | 15 N/A 5 N/A s.c. ' Faslpr) semana 8 a semana 20 RUR2ox0-1L-2 Duas vezes por| Dose 1 semana, da 3 (MRL/MpJ- 15 0,006 5 0,03 s.c. semana 8 a Faslpr) semana 20 RUR20x0-1L-2 Duas vezes por| 4 Dose 2 15 5 0,3 sc. semana, da (MRL/MpJ- semana 8 a Faslpr) semana 20 a: veículo do artigo de teste
Exemplo 9 Estudo de uma composição de RUR>2ox0-IL-2 em um modelo de hi- persensibilidade de tipo retardado (DTH) dependente de antígeno, mediado por células T
[00210] Estes modelos de estudo como a estimulação e expansão de Treg in vivo, por uma composição de RUR2ox0-IL-2, podem regular negativamente a resposta de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) mediada por células T de uma forma dependente de antígeno, em um modelo de alergia alimentar onde um alto grau de anafilaxia é estabelecida.
[00211] Para desenvolver o modelo DTH, os camundongos Balb/c são sensibilizados com uma administração subcutânea de uma hemo- cianina de lapa de antígeno modelo (KLH) emulsificada em adjuvante de Freund completo e incompleto. A administração subcutânea de uma composição de RUR2ox0-IL-2 (0,003, 0,01,0,3,0,1 ou 0,3 mg/kg, q3d) ou Ciclosporina A (10 mg/kg, qd) é iniciada no dia O e continuada até o dia 8, com um desafio intradérmico de KLH administrado no dia 5 e inchaço da orelha medido por quatro dias. Orelhas infamadas são submetidas a imunohistoquímica (IHC) para quantificar a porcentagem de células FoxP3 + Treg após o desafio com KLH. A especificidade da resposta é avaliada após um período adicional de 3-4 semanas sem tratamento por reintrodução de KLH ou pela condução de sensibiliza- ção e desafio com um antígeno não relacionado a ovalbumina (OVA). Para entender o efeito de Tregs de composição expandida de RUR20x0-IL-2 no alérgeno alimentar, os camundongos Balb/C são sen- sibilizados duas vezes por semana, emulsificando-se OVA com alú- men intraperitonealmente. Após dez dias da 2º sensibilização, os ca- mundongos são desafiados com OVA oito vezes oralmente, em dias alternativos. A administração subcutânea de uma composição de RUR20x0-IL-2 (0,1 mg/kg, q3dx3) ou Ciclosporina A (10 mg/kg, qd) é iniciada no dia O e continuada até o dia 8. A gravidade da resposta alérgica é avaliada por pontuação clínica dentro 30-45 min após o 8º desafio. Além disso, os títulos de protease 1 de mastócitos de soro (MCPT 1) e de IgE específica de OVA são quantificados. A porcenta- gem de Treg é determinada por citometria de fluxo no sangue periféri- co e no baço.
[00212] Neste modelo de camundongo de DTH, a administração da composição de RUR2ox0-IL-2 suprimiu a resposta inflamatória à reex- posição de KLH de uma maneira dependente da dose. A análise de IHC de orelhas inflamadas mostra infiltração significativa de células Treg FoxP3 +. O efeito supressor sobre a inflamação é durável e es- pecífico para o antígeno, como exemplificado pelo novo desafio após 3-4 semanas com o mesmo antígeno e pós-sensibilização com antíge- no não relacionado, sem administração adicional da composição de RUR>20x0-IL-2. Finalmente, a administração da composição de RUR20x0- IL-2 é considerada eficaz na diminuição do alto grau de sintomas de anafilaxia causados pela administração repetida do alérgeno alimentar modelo, OVA. A diminuição nas pontuações clínicas de anafilaxia está correlacionada com uma diminuição significativa nos níveis de MCPT1 e títulos de IgE específicos anti-OVA, bem como um aumento significa- tivo em Tregs. A composição de RUR2oxD-IL-2 demonstrou expansão de Treg durável e específica do antígeno e respostas terapêuticas nes- te modelo de hipersensibilidade KLH de camundongos. Portanto, uma composição de RUR2ox0-IL-2 é considerada eficaz em um modelo de alergia alimentar. Estes dados suportam o uso de composições de RUR>20x0-IL-2 para inflamação específica do antígeno, como pode ser o caso em doenças autoimunes e/ou inflamatórias.
[00213] A evidência pré-clínica fornecida no presente documento suporta o conceito de que as composições do estimulador de Treg RUR20x0-IL-2 do conjugado IL-2 aumentam o número e a função de supressão de células T reguladoras para o tratamento de distúrbios autoimunes e inflamatórios.
A produção prejudicada de |L-2 e as dis- funções regulatórias das células T têm sido implicadas como um me- canismo imunológico em várias doenças autoimunes.
Embora a IL-2 em baixa dosagem possa ser usada para estimular Tregs para benefí- cio clínico, a farmacocinética pobre requer administração diária, os eventos adversos são limitantes da dose e os aumentos de Treg são modestos e de curta duração.
As composições de RUR20ox0-IL-2 forne- cem um estimulador de Treg conjugado com |IL-2 destinado à adminis- tração subcutânea de baixa dose para restaurar seletivamente a ho- meostase de Treg com impacto mínimo na função das células T con- vencionais.
Aqui são fornecidos dados para caracterizar a capacidade das composições de RUR2ox0-IL-2 para expandir seletivamente os nú- meros e a atividade de Tregs em modelos de camundongos e primatas não humanos e para avaliar a eficácia das composições de RUR20x0- IL-2 em modelos de autoimunidade.
A afinidade para o receptor de IL- 2 é avaliada por ressonância de plásmon superficial.
A atividade em PBMC humano pode ser medida por indução de pSTATS5 em múltiplas populações de linfócitos usando citometria de fluxo e citometria de massa de tempo de voo (CyToF). A atividade in vivo após administra- ção subcutânea em camundongos C57BL/6 ou macaco cinomolgos é medida por alterações no número de linfócitos e ativação por citome- tria de fluxo.
A função Treg ex vivo é determinada pela inibição da pro- liferação de Tcon por Treg esplênica isolada.
A eficácia é avaliada em um modelo de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) usando camundon- gos MRL/MpJ-Faslpr.
As composições de RUR20x0-|L-2 têm afinidade grandemente atenuada para IL-2RB humano em relação aos comple- xos IL-2Ra e IL-2Rab, sugerindo ativação preferencial de Tregs que expressam o IL-2Raby de alta afinidade sobre Tcon, que expressa a IL- 2RBy.
In vitro, Tregs são mais sensíveis à estimulação da composi-
ção de RUR20x0-IL-2, mostrando fosforilação de STAT5 aumentada em relação a outros subconjuntos de linfócitos em PBMC humanos. Em camundongos, uma única administração leva à mobilização prolonga- da de Treg por 7 a 10 dias no sangue e no baço sem ativação de Tcon, um efeito concomitante com a indução de marcadores de ativa- ção de Treg e aumento da capacidade supressiva ex vivo. Em maca- cos cinomolgos, a exposição plasmática é mais prolongada com mobi- lização e atividade sustentadas de Treg por mais de 14 dias após uma única administração - uma resposta superior em magnitude, duração e especificidade em comparação com uma dose total equivalente de rhiL-2 administrada diariamente por cinco dias. Finalmente, uma com- posição de RUR20x0-IL-2 é eficaz em modelos de camundongo com SLE. No modelo SLE, repetir a administração de uma composição de RUR200-IL-2 ao longo de 12 semanas mantém a elevação de Treg, reduz o nitrogênio da ureia no sangue e retorna os níveis de proteína na urina e a histopatologia renal ao normal. Em um modelo de cGVHD, a administração repetida de uma composição de RUR2ox0-IL-2 aumen- ta Tregs e diminui as células B do centro germinativo no baço, e rever- te a disfunção pulmonar. As composições de RUR20ox0-IL-2 fornecem ativação prolongada e preferencial de Tregs e demonstra eficácia em sistemas modelo de SLE. EXEMPLO 10 Um estudo de Fase |, duplo-cego, randomizado controlado por placebo para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e farmacodinâmica de uma dose subcutânea ascendente única de uma composição de RUR2ox0-IL-2 em voluntários saudáveis
[00214] Um estudo duplo-cego, randomizado e controlado por pla- cebo é conduzido para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacoci- nética e farmacodinâmica de doses subcutâneas baixas crescentes únicas de uma composição de RUR2oxp-IL-2 (RUR20x0-IL-2) em volun-
tários saudáveis. O estudo está dividido em sete grupos, nas quais os indivíduos receberam 0,3, 1,0, 3,0, 6,0, 9,0, 13,5 ou 20,0 ug/kg de RUR>20x0-IL-2. Doze indivíduos são randomizados para cada grupo de dose, nove dos quais receberam uma única dose subcutânea de RUR 20x0-IL-2, enquanto três receberam placebo. RUR20x0-IL-2 é formu- lado como um líquido estéril para injeção subcutânea que foi diluído com solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%. O fármaco é fornecido em frascos de vidro descartáveis e armazenado a 2-8ºC. Cada frasco do fármaco continha 0,75 + 0,1 mg de rhlL-2 (com base em RUR20x0- IL-2). RUR20xD-IL-2 é formulado em acetato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, sacarose a 2% (p/v), pH 5,0 em uma concentração de aproximadamente 1,0 mg/mL de proteína. Placebo é uma solução de cloreto de sódio a 0,9% disponível comercialmente. Uma dose inicial de 0,3 ug/kg é escolhida usando a abordagem de nível de efeito bioló- gico minimamente antecipado (MABEL) e é apoiada pelo nível de efei- to adverso não observado (NOAEL) nas espécies mais sensíveis de estudos de toxicologia não clínica. A dose inicial é definida em 0,3 Vv9/kg para permitir a avaliação da farmacocinética e segurança de RUR>20x0-IL-2. Dois indivíduos, um recebendo RUR2ox0-IL-2 e um pla- cebo, são administrados de forma duplo-cega e monitorados para pos- síveis efeitos colaterais por um período de pelo menos 7 dias antes do início do estudo.
[00215] O objetivo principal do estudo é avaliar a segurança e tole- rabilidade do RUR20x0-IL-2 administrado como dose única subcutânea. Os objetivos secundários do estudo são (1) observar o curso do tempo e a extensão das mudanças no número e/ou atividade das células T reguladoras (Tregs), (2) caracterizar o perfil farmacocinético (PK) de RUR20x0-IL-2 administrado como uma dose subcutânea única e (3) avaliar os efeitos imunológicos de RUR20x0-IL-2 no sangue, incluindo efeitos em citocinas, células T, outras populações de sangue periféri-
co, outras proteínas de soro, alterações na expressão de gene e anti- corpos antifármacos. Em uma primeira fase do estudo, os marcadores imunológicos são testados antes da dose até 20 horas após a dose. Especificamente, Tregs, células T CD4+, células T CD8+, células ex- terminadoras naturais (NK), citocinas, CD25 solúvel e RNA são testa- dos em grupos RUR2ox0-IL-2- e receptor de placebo. Nas fases subse- quentes, os mesmos marcadores imunes são da mesma forma testa- dos em 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 10-, 12-, 15-, 18-, 20-, 25-, 30-, 40, e 50 dias após a dose.
[00216] “Nenhumas toxicidades limitantes de dose (DLTs), eventos adversos graves (SAEs), mortes ou anormalidades clinicamente signi- ficativas são relatadas. Os eventos adversos (AEs) são limitados a re- ações leves (Grau 1) no local da injeção, e nenhuma evidência foi ob- servada de AEs conhecidos por estarem associados a altas doses de I1L-2.
[00217] A análise de PK preliminar mostra que RUR20x0-IL-2 atingiu concentrações máximas em torno de 4-6 dias pós-dose na maioria dos indivíduos, com pouca alteração nas concentrações até aproximada- mente 2 semanas pós-dose, após o que as concentrações diminuíram com meia-vida de aproximadamente 8-9 dias.
[00218] A avaliação farmacodinâmica (PD) revela que RUR2ox0-IL-2 leva a um aumento dependente da dose nas CD4+FoxP3+CD25right Tregs circulantes. Nos grupos de dose única de 3,0, 6,0, 9,0, 13,5 e 20,0 pg/kg, há um aumento prolongado nos números absolutos de CD4+FoxP3+CD25"*"9"' Tregs circulantes, com níveis não retornando aos valores de referência até aproximadamente 20 a 25 dias após a administrtação”.º Há um aumento médio no número de CD4+FoxP3+CD25*"9"' Tregs de 3-, 3,5-, 4,1-, 5 vezes e 8,1 vezes, em comparação com a pré-dose em 3,0, 6,0, 9,0, 13,5 e Doses de 20,0 ug/kg, respectivamente. Há também um aumento na população total de CD4+FoxP3+CD25+ Treg em doses de 3,0, 6,0, 9,0, 13,5 e 20,0 uvg/kg, porém a magnitude da mudança é menor do que a observada para as CD4+FoxP3+CD25”"s"' Tregs. Não há alteração no número de Tregs nos indivíduos tratados com RUR2ox0-IL-2 versus indivíduos pla- cebo em doses de 0,3 e 1,0 ug/kg em comparação com aqueles que receberam placebo. O efeito primário de RUR20x0-IL-2 é observado em Tregs, uma vez que nenhuma alteração na porcentagem ou número de populações de células T (CD4+, CD8+) é observada com RUR20x0- IL-2 em qualquer dose. Há um pequeno aumento na porcentagem e no número absoluto de células NK em 13,5 e 20,0 ug/kg, sem evidências de EAs associados a altas doses de IL-2.
[00219] Como mostrado na Figura 12, uma composição de RUR20x0-IL-2 levou a um aumento dependente da dose em CD4+FoxP3+CD25"*9"' Tregs. Em 3,0, 6,0, 9,0 e 13,5 ug/kg, houve um aumento prolongado nos números absolutos de CD4+FoxP3+CD25*"9"' Tregs, com os níveis não retornando aos valo- res de referência até 20-25 dias após a administração. Houve um au- mento médio no número de CD4+FoxP3+CD25""e"! Tregs de 3,0 ve- zes, 3,5 vezes, 4,1 vezes e 5,0 vezes em comparação com o placebo na dose de 3,0, 6,0, 9,0 e 13,5 ugo/kg, respectivamente, com uma res- posta máxima mudando de um pico de 84 horas a 3,0 ug/kg para uma resposta de pico mais estendida com duração de 7 a 12 dias a 13,5 vo/kg, antes de retornar aos níveis de referência no Dia 20-25. Como mostrado na Figura 13, também houve um aumento dependente da dose na população total de CD4+FoxP3+CD25+ Treg nas doses de 3,0, 6,0, 9,0 e 13,5 ug/kg, porém a magnitude da mudança foi menor do que a observada para o CD4+FoxP3+CD25”"' Tregs. Não foram observadas alterações nas Tregs CD4+ totais nos indivíduos tratados com RUR2ox0-IL-2 versus indivíduos com placebo com doses de 0,3 uvo/kg e 1 ug/kg (Figura 13).
[00220] É importante ressaltar que o efeito primário de RUR20x0-IL-2 foi observado em Tregs, uma vez que nenhuma alteração na porcen- tagem de populações de células Tcon (CD4 +, CD8+) foi observada em ambos os indivíduos tratados com RUR20ox0-IL-2 ou com placebo. No entanto, pequenos aumentos no número absoluto de células T CD8+ e na porcentagem de células T Ki67+CD8+ foram observados em 13,5 ug/kg nos indivíduos RUR2ox0-IL-2 (Figura 14A-D). Não houve alterações nos números absolutos de células T CD4+ em qualquer ní- vel de dose.
[00221] A população de células CD56+ NK também foi analisada. Um aumento foi observado no número absoluto de células NK circu- lantes com um aumento semelhante na porcentagem deste subconjun- to de células no nível de dose de 13,5 ug/Kkg, porém não nos níveis de dose mais baixos. Também observado em 3,0, 6,0, 9,0 e 1 3,5 ug/kg foi um aumento dependente da dose na porcentagem de células CD56+ NK que expressam Ki67, um marcador de proliferação e, por- tanto, um marcador de ativação. Em 3,0, 6,0 e 9,0 ug/kg, a porcenta- gem que expressa Ki67 se aproximou de 10%, 20-30% e 30-40%, res- pectivamente, após a administração de RUR2oxp-IL-2. Não houve au- mento adicional na porcentagem que expressa Ki67 na dose de 13,5 V9/Kkg, que permaneceu em 30-40%.
[00222] O tratamento com RUR2ox0-IL-2 de acordo com o estudo SAD levou a um aumento prolongado no número de CD4+FoxP3+CD25*"9"' Tregs, com os níveis não retornando à linha de referência até 20-25 dias após a administração. Também houve um aumento na população total de CD4+FoxP3+CD25+ Treg, embora a magnitude da mudança tenha sido menor do que a observada para as CD4+FoxP3+CD25*"9"' Tregs. Aumentos no número de células T CD8+ e células NK foram observados em 13,5 ug/Kkg.
[00223] Grupos adicionais de RUR20x0-IL-2, 20,0 mg/kg (n = 13);
Placebo (n = 3) e RUR200-IL-2, 28,0 mg/kg (n = 9); Placebo (n = 3) também foram conduzidos. Cada grupo é seguido por 50 dias para avaliar os efeitos da administração subcutânea de doses crescentes únicas de RUR2ox0-IL-2 em voluntários saudáveis na segurança e tole- rabilidade em indivíduos avaliados por eventos adversos, sinais vitais e avaliações laboratoriais clínicas, bem como o curso do tempo e a extensão das mudanças nos números e na atividade de células Tregs, Tcons e NK e subconjuntos, farmacocinética de RUR20x0-|L-2 e outros efeitos imunológicos, como níveis de citocinas, populações de células de sangue periférico, proteínas de soro e expressão de gene.
[00224] Geralmente, os resultados de segurança não encontraram toxicidades limitantes de dose, mortes ou eventos adversos que leva- ram à descontinuação do estudo, nenhum sinal vital clinicamente signi- ficativo, ECG ou anormalidades no exame físico. Os eventos adversos foram principalmente limitados a reações leves ou moderadas (Grau 1 ou 2) no local da injeção, 4 indivíduos que apresentaram eventos de dor de cabeça de Grau 1, 1 indivíduo na dose mais alta testada (28,0 Vv9/Kkg) que apresentou sinais leves (Grau 1) e sintomas de pirexia, anorexia, vômito, diarreia, taquicardia e mialgia (todos de Grau 1 de gravidade) atribuídos a níveis elevados de citocinas e sem elicitação de anticorpos antifármacos.
[00225] Geralmente, um aumento prolongado e dependente da do- se em CD25-bright Tregs foi observado em resposta a RUR2oxD-IL-2 (veja Figura 15). A 28 ug/kg de uma composição de RUR2ox0-|L-2, um aumento médio de pico de 17 vezes foi observado no número de CD25-bright Tregs acima dos valores pré-dose. Os níveis de Treg atingem o pico nos dias 10-12 e não retornam aos valores de referên- cia até os dias 20-25 após a administração. Aumentos nos marcadores de ativação de Treg ICOS e CTLA4 foram observados em doses> 13,5 ug/kg.
[00226] “Nenhuma mudança substancial foi observada na porcenta- gem de células Tcon, e aumentos mínimos foram observados em célu- las NK CD56+ em resposta a RUR20x0-IL-2 (veja Figura 16). (Células CD16+ CD56+ NK também foram enumeradas, dados não mostrados). Os aumentos nas células NK não foram dependentes da dose. Foi ob- servado um aumento de 2 vezes nas células NK na concentração mais alta de RUR20x0-IL-2. RUR20x0-IL-2 induz aumentos dependentes da dose em Tregs sem indução de células T CD8+ até 28 ug/Kkg. A admi- nistração de RUR2ox0-IL-2 leva a um aumento de 15 vezes no pico médio da relação Treg: CD8 em relação à linha de referência a 28 vo/kg. (Veja a Figura 17).
[00227] Os objetivos do estudo avaliaram a segurança e tolerabili- dade de RUR20ox0-IL-2 em humanos administrados com doses crescen- tes únicas subcutaneamente (SC). Além disso, o curso do tempo e a extensão das mudanças nos números e porcentagens de Tregs, célu- las T CD4+ e CD8+ convencionais, células NK, níveis de citocinas e farmacocinética (PK) de uma composição de RUR2ox0-|IL-2 no sangue periférico foram investigados. Neste primeiro estudo em humanos, du- plo-cego, de dose única ascendente, voluntários saudáveis receberam doses SC variando de 0,3 a 28 ug/kg (9 ativos: 3 placebo por grupo) e os indivíduos foram acompanhados por 50 dias. Todas os 8 grupos planejados completaram a dosagem. Não houve toxicidade limitante da dose, eventos adversos graves, mortes ou anormalidades clinica- mente significativas nos sinais vitais, eletrocardiogramas ou valores de teste laboratorial. Os eventos adversos atribuídos a RUR2ox0-IL-2 fo- ram principalmente limitados a reações leves (grau 1) no local da inje- ção. Um indivíduo com a dose mais alta testada demonstrou sintomas transitórios e leves (grau 1) de níveis elevados de citocinas e linfope- nia, que se resolveram sem tratamento. Nenhum outro indivíduo em qualquer nível de dosagem apresentou sinais ou sintomas sistêmicos conhecidos por estarem associados à terapia com IL-2. Os primeiros 6 grupos foram testados para anticorpos anti-fármacos até o momento e nenhum foi detectado.
RUR2ox0-IL-2 atingiu níveis plasmáticos máxi- mos 4-6 dias após a administração, com pouca mudança por — 2 se- manas, e então diminuiu com meia-vida de — 8-9 dias.
O efeito primá- rio de RUR20x0-IL-2 foi observado em Tregs.
Nos grupos de dose de 3,0 a 28,0 ug/kg, observou-se um aumento prolongado e dependente da dose nos números absolutos e nas porcentagens de CD4+FoxP3+CD25"*9"' Tregs circulantes.
Os níveis elevados atingiram o pico nos dias 10-12 e não retornaram à linha de referência até - 20 a dias após a administração.
Em 28,0 ug/Kkg, o pico médio de aumen- to nos números dessas Tregs CD25""9"' foi 17 vezes acima da linha de referência e a porcentagem média do pico aumentou de 0,5% para 7,4%. Além disso, houve um aumento nos marcadores de ativação de Treg em doses 213,5 ug/kg.
Houve um aumento médio de 3,5 vezes nas porcentagens e números de células NK na dose mais alta testada, porém não foram observadas mudanças nas porcentagens ou núme- ros de células T CD4+ ou CD8+ convencionais.
Uma composição de RUR>20x0-IL-2 induziu seletivamente Tregs, evidenciado por um aumen- to de 15 vezes no pico médio da relação Treg:CD8 sobre a linha de referência no grupo de 28,0 ug/kg.
Em conclusão, as doses únicas do estimulador T-reg do conjugado de IL-2, RUR20x0-IL-2, na faixa de do- sagem testada foram bem toleradas e seguras.
RUR20x0-|L-2 levou a um aumento notável e seletivo dependente da dose em Tregs CD25”"9"! circulantes com efeitos mínimos nas células T convencionais e com efeitos relativamente pequenos nas células NK.
Estes resulta- dos clínicos estendem os estudos anteriores em animais mostrando a ação seletiva prolongada e Treg de RUR2ox0-IL-2 e fornecem um forte suporte para testar RUR20x0-IL-2 como um novo terapêutico em doen- ças autoimunes, tal como lúpus sistêmico.
[00228] Uma composição de RUR2ox0-IL-2 foi segura e bem tolera- da neste primeiro estudo de dose ascendente única em humanos, e levou a um aumento notável e seletivo dependente da dose nas célu- las Treg CD25-bright circulantes. Houve um efeito mínimo nas células Tcons e NK, e os dados deste estudo fornecem suporte para o teste de RUR20ox0-IL-2 em doenças autoimunes e inflamatórias. EXEMPLO 11 Um estudo de fase |, duplo-cego, randomizado, ascendente, con- trolado por placebo, de dose múltipla para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e farmacodinâmica de RUR2ox0-IL-2 subcutâneo em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico
[00229] “Um estudo duplo-cego, randomizado e controlado por pla- cebo para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e efeitos imunológicos de múltiplas doses crescentes de RUR2ox0-|L-2 em qua- tro grupos de dose de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico míi- nimo a moderado (LES) é realizado. Os efeitos sobre a atividade da doença LES são da mesma forma avaliados. Doze pacientes com LES com atividade de doença mínima à moderada são randomizados para cada um dos quatro grupos de dose, nove dos quais receberam várias doses subcutâneas de solução aquosa de 1,0 mg/ml de RUR-IL-2- 20KD, enquanto três receberam placebo. O fármaco RUR2oxD-IL-2 e o placebo são preparados como aqui descrito, por exemplo como no Exemplo 1-A. A atividade clínica ativa da doença de LES não é neces- sária como critério de inclusão. No grupo 1, uma dose inicial de 3,0 v9/kg é administrada três vezes em intervalos de duas semanas (Dias 1, 15 e 29). Esta dose inicial é baseada na segurança favorável e no perfil de DP de doses subcutâneas únicas de RUR2oxD-IL-2 previamen- te determinadas no estudo descrito acima. Os níveis de dose subse- quentes nos Grupos 2, 3 e 4, respectivamente, foram até duas vezes maiores do que no grupo de dose anterior. Os pacientes nos Grupos
1-3 receberam três doses do fármaco do estudo em intervalos de duas semanas durante um total de quatro semanas. As doses a serem ava- liadas ao longo do estudo variam de 3,0 ug/kg a 24 ug/Kkg. Os pacien- tes do Grupo 4 recebem doze semanas de tratamento com RUR20x0- I1L-2, administrado nos Dias 1, 15, 29, 43, 57, 71 e 85. Este grupo for- nece dados sobre a segurança da administração e perfis de PK e PD por mais tempo duração do tratamento com RUR2oxD-IL-2. Após rece- ber a dose final de RUR20x0-IL-2 ou placebo, os pacientes são acom- panhados por mais cinquenta dias para avaliar a segurança, farmaco- cinética, DP e eficácia preliminar. Oito dos doze indivíduos em cada grupo são avaliados duas semanas após a terceira dose do paciente final pelo Comitê de Revisão de Segurança para possíveis problemas de segurança. Além disso, todos os pacientes no Grupo 4 são avalia- dos pelo Comitê de Revisão de Segurança duas vezes: (1) duas se- manas após os primeiros oito indivíduos receberem sua terceira dose e (2) duas semanas após todos os indivíduos receberem todas as do- ses do fármaco do estudo.
[00230] Alterações imunológicas, incluindo Tregs, células T CD4+, células T CD8+ e respostas de células NK, níveis de citocinas e dados de PK disponíveis, além de constatações de segurança, são usados para determinar os níveis de dose. O objetivo principal do estudo é avaliar a segurança e tolerabilidade de RUR20x0-IL-2 administrado co- mo doses subcutâneas ascendentes múltiplas em pacientes com LES. Os objetivos secundários do estudo são (1) caracterizar o perfil farma- cocinético de RUR20x0-IL-2 após múltiplas doses subcutâneas em pa- cientes com LES, (2) avaliar os efeitos de RUR20x0-IL-2 no curso do tempo e extensão de alterações nos biomarcadores de DP, incluindo número e função de subconjuntos Tregs e Treg, células T CD4+, célu- las T CD8+, células NK e níveis de citocinas em pacientes com LES, (3) para avaliar os efeitos de RUR200-IL-2 na presença e os níveis de anticorpos contra DNA de filamento duplo e os níveis de complemento C3 e C4 em pacientes com LES, e (4) para avaliar os efeitos de RUR>20x0-IL-2 na atividade da doença em pacientes com LES.
Os resul- tados que descrevem os dados de PK preliminares do estudo ascen- dente de multi-dose são comparados com os dados do estudo subcu- tâneo único na Tabela 15 abaixo: Tabela 15. Dados de PK em estudos humanos de dose única e multidose | pose | Estudo de Dose Única Estudo de MultiDose AUCo-144 Cmax tmax AUCo-14a Cmax | tmax (ng/mL*dia) | (ng/mL) | (dia) (ng/mL*dia) |((ng/mL)| (dia) Média 214 21 3,5 | |Média 185 18 3,0 (99) (n=9) o AUCo-14a Cmax tmax AUCo-14a Cmax | tmax (ng/mL*dia) | (ng/mL) | (dia) (ng/mL*dia) |(ng/mL)| (dia) Média 542 46 5 | Média 113 14 6,0 (n=9) (n=7) " eejpe je po

Claims (56)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de |L-2 PEGuilados com uma estrutura: Fr H3$0-(OCH2CH) -NH-C-O0-CH,2 o ( o Ne-00 12CH, CI do) H3C-(OCH2CH2) -NH-C-O0-CH? 2? e g H$C-(OCHCH) -NH-C-O-CH? o ( o He-0co, bjos H3C-(OCH3CHa)-NH-C-O0-CH, 3 : nas quais: IL-2 é uma interleucina-2; n é, independentemente, em cada ocorrência, um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 4000.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que |L-2 é aldesleucina.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que a composição compreende não mais do que cerca de 20 por cento em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados, quando considerados coletivamente, abrangidos pela fórmula,
R H3C-(OCH;CH) -NH-C-O-CH, o ( o te-o0 12CH,2 CH djs H3C-(OCHZCH2)-NH-C-0-CH? nº na qual n' é selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zada pelo fato de que a composição compreende não mais do que cerca de 15 por cento em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados, quando considerados coletivamente, abrangidos pela fórmula
R H;C-(OCH2CH2), -NH-C-O-CH, o ( o te-o0 12CH2C jo HgC-(OCHzCH),-NH-C-O0-CHz n" , na qual n' é selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zada pelo fato de que a composição compreende não mais do que cerca de 10 por cento em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados, quando considerados coletivamente, abrangidos pela fórmula
R HJyC-(OCH2CH3), -NH-C-O0-CH, o ( o Treta H;C-(OCHICH), -NH-C-O0-CH,? " , na qual n' é selecionado de 1, 4, 5 ou um número inteiro maior que 5.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 10% em mol de conjugados de I|L-2 PEGuilados com nº igual a 1.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 7% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados com nº igual a 1.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 5% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados com nº igual a 1.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 10% em mol de conjugados de I|L-2 PEGuilados com nº igual a 4.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 7% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados com nº igual a 4.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende não mais do que cerca de 5% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados com nº igual a 4.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de conju- gados de |L-2 PEGuilados, em que a composição compreende quanti- dades aproximadamente equimolares de Rg H3C-(OCH5CHo), -NH-C-O-CH, o ( o He-00 12CH2C de) H3C-(OCHCH2),-NH-C-O0-CH7 2 e
Q H$C-(OCHCH)-NH-C-O-CH, o ( o HE-DCHO, bjos H3C-(OCH3CHa)-NH-C-0-CH, 3 .
13. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizada pelo fato de que compreende uma mistura de conjugados de IL- 2 PEGuilados, em que a composição compreende conjugados de IL-2 PEGuilados com uma fórmula
Q H3C-(OCHICHa) NH-C-O0-CH7 o | o Eronbaos H;C-(OCHZCH2), -NH-C-O0-CH, ? (1); e
Á H3C-(OCH2CH2) NF re oa 2 o | o feto H30-(OCH3CH2) -NH-C-0-CH,
O em que a relação em mol de (II)/(Ill) é selecionada a partir do grupo que consiste em 1,4:1; 1,3:1; 1,2:1; 1,1:1; 1:1; 1:1,1; 1:1,2; 1:1,3; e 11,4.
14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracte- rizada pelo fato de que apresenta um número médio de porções de polietilenoglicol ramificado o grupo amina da E HSC"(OCH2CH2), NH-C-0-CHz o r o HGTOeHEra era em H3C-(OCH2CH2),-NH-C-O0-CH; , por aldesleu- cina é selecionada a partir do grupo que consiste em 2; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,6; 2,7; 2,8,2,9;€ 3,
15. Composição, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizada pelo fato de que o número médio de porções de polietilenogli- col ramificado por aldesleucina é cerca de 2,5.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor de n varia de 5-
2000.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor de n varia de 10-
1000.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor de n varia de 10-
750.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-
cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor de n varia de 10-
500.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor de n varia de 20-
250.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o valor médio de n é cerca de 226.
22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 250 daltons a cerca de 90.000 daltons.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 1000 daltons a cerca de 60.000 daltons.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 5,000 daltons a cerca de 60.000 daltons.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado está em uma faixa de cerca de 10,000 daltons a cerca de 55.000 daltons.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende, em uma base em mol, cerca de 5% em mol ou menos de conjugados de IL-2 mono-PEGuilados, e de cerca de 28% em mol a cerca de 60% em mol de conjugados de |IL- 2 di-PEGuilados, e de cerca de 24% em mol a cerca de 65% em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilado e cerca de 12% em mol ou menos de conjugados de IL-2 PEGuilado superiores, e em que o peso mole- cular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramificado é de cerca de 20.000 daltons.
27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda 80% ou mais conjugados de IL-2 di- e tri-PEGuilados combinados.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,5 a cerca de 4,5% em mol de conjugados de |L-2 mono- PEGuilados e de cerca de 35 a cerca de 50% em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados, e de cerca de 38 a cerca de 46% em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilados e de cerca de 3 a cerca de 10% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramifica- do é de cerca de 20.000 daltons.
29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 80 a cerca de 95% em mol.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de |L-2 mono- PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilados e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglicol ramifica- do é de cerca de 20.000 daltons.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de |L-2 mono- PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilados e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que a referida composição compreende uma mistura de conjugados de IL-2 mono- PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada a uma de lisina K7 ou K8 ou K31 ou K75, e em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglico!l ramificado é de cerca de 20.000 daltons.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizada pelo fato de que compreende, em uma base em mol, de cerca de 2,8 a cerca de 3,8% em mol de conjugados de |L-2 mono- PEGuilados e de cerca de 44 a cerca de 48% em mol de conjugados de IL-2 di-PEGuilados, e de cerca de 41 a cerca de 44% em mol de conjugados de IL-2 tri-PEGuilados, e de cerca de 7 a cerca de 9% em mol de conjugados de IL-2 PEGuilados superiores, e em que a referida composição compreende conjugados de I|L-2 mono-PEGuilados que têm uma porção de PEG ligada à lisina K7, em que o peso molecular médio nominal de cada porção de polietilenoglico!l ramificado é de cer- ca de 20.000 daltons.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda um total combinado de conjugados de IL-2 di-PEGuilados e tri-PEGuilados de cerca de 87 a cerca de 90% em mol.
36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que está em uma forma adequada para administração parenteral.
38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações | a 35, caracterizada pelo fato de que está em uma forma adequada para administração subcutânea.
39. Composição, de acordo com a reivindicação 36, carac- terizada pelo fato de que compreende um diluente aquoso.
40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, carac- terizada pelo fato de que possui um pH de cerca de 5.
41. Composição, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda acetato de sódio, cloreto de sódio e sacarose.
42. Composição, de acordo com a reivindicação 37, carac- terizada pelo fato de que compreende 1,5 mg/mL de equivalente de proteína, acetato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 110 mM, sacarose a 2% (p/v), pH 5,0.
43. Método para aumentar a relação de células T regulado- ras para células T efetoras em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que é por meio da administração ao indivíduo de uma dose terapeuti- camente eficaz de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 42.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que as células T reguladoras são selecionadas a partir de células Foxp3+ e CD25+.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que as células T efetoras são selecionadas a partir de células CD4+ e CD8+.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 45, caracterizado pelo fato de que o aumento das células T reguladoras, quando comparado à linha de referência, atinge um valor de pelo menos cerca de 2 quando avaliado em um modelo de camun- dongo in vivo.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 45, caracterizado pelo fato de que o aumento de células T reguladoras, quando comparado à linha de referência, atinge um valor de pelo menos cerca de 4 quando avaliado em um modelo de camun- dongo in vivo.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 47, caracterizado pelo fato de que o aumento no número de células T reguladoras é prolongado acima dos níveis de linha de refe- rência por pelo menos 3 dias após a administração.
49. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que o aumento no número de células T reguladoras é prolongado acima dos níveis de linha de referência por pelo menos 5 dias após a administração.
50. Método de tratamento de um indivíduo com uma doen- ça autoimune, caracterizado pelo fato de que compreende a adminis- tração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 42.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracteriza- do pelo fato de que a referida administração é por injeção subcutânea.
52. Método, de acordo com a reivindicação 50 ou 51, carac- terizado pelo fato de que a referida administração é realizada uma vez a cada 2 semanas ou uma vez a cada 4 semanas.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 50 a 52, caracterizado pelo fato de que a referida administração compreende uma dose entre 3-24 ug/kg uma vez a cada duas sema- nas.
54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 42, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia.
55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 42, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamen- to de uma doença autoimune.
56. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença au- toimune.
BR112020021564-3A 2018-05-21 2019-05-20 estimulador de treg seletivo rur20kd-il-2 e composições relacionadas BR112020021564A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862674244P 2018-05-21 2018-05-21
US62/674,244 2018-05-21
PCT/US2019/033100 WO2019226538A1 (en) 2018-05-21 2019-05-20 SELECTIVE TREG STIMULATOR RUR20kD-IL-2 AND RELATED COMPOSITIONS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020021564A2 true BR112020021564A2 (pt) 2021-03-02

Family

ID=67002369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020021564-3A BR112020021564A2 (pt) 2018-05-21 2019-05-20 estimulador de treg seletivo rur20kd-il-2 e composições relacionadas

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20210205413A1 (pt)
EP (1) EP3796940A1 (pt)
JP (2) JP7235772B2 (pt)
KR (1) KR20210002577A (pt)
CN (1) CN112399859A (pt)
AU (2) AU2019274409B2 (pt)
BR (1) BR112020021564A2 (pt)
CA (1) CA3100204A1 (pt)
CL (1) CL2020003008A1 (pt)
CO (1) CO2020014510A2 (pt)
CR (1) CR20200546A (pt)
DO (1) DOP2020000212A (pt)
EA (1) EA202092489A1 (pt)
EC (1) ECSP20074392A (pt)
JO (1) JOP20200290A1 (pt)
PE (1) PE20211307A1 (pt)
PH (1) PH12020551976A1 (pt)
SG (1) SG11202011242SA (pt)
WO (1) WO2019226538A1 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023514010A (ja) 2020-01-10 2023-04-05 ブライト ピーク セラピューティクス エージー 修飾ｉｌ－２ポリペプチドおよびその使用
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
EP4092048A4 (en) * 2020-01-15 2023-07-26 Jenkem Technology Co. Ltd. (Tianjin) METHOD FOR PREPARING PEGYLATED BIOMOLECULES HAVING CONTROLLABLE BINDING SITES
WO2021236474A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel processes for preparing conjugates of the il-2 protein
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
WO2022109477A1 (en) * 2020-11-23 2022-05-27 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Use of insulin-like growth factors with gamma-chain cytokines to induce homeostatic proliferation of lymphocytes
WO2023114833A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Eli Lilly And Company Dosing regimens for selective treg stimulator rur20kd-il-2 and related compositions

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401756A (en) 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5153310A (en) 1989-02-28 1992-10-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites
US5635597A (en) 1994-05-27 1997-06-03 Affymax Technologies, N.V. Peptides that bind IL-2 receptors
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
FR2826365B1 (fr) 2001-06-20 2003-09-26 Oreal Compositions cosmetiques photoprotectrices contenant des derives amides, sulfonamides ou carbamates aromatiques d'acrylonitrile et nouveaux derives amides, sulfonamides ou carbamates d'acrylonitrile
AU2004251602B2 (en) 2003-05-23 2010-05-13 Nektar Therapeutics PEG derivatives having an amidocarbonate linkage
US7569215B2 (en) 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
US7567215B1 (en) 2007-10-23 2009-07-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Portable and inflatable antenna device
RS61854B1 (sr) * 2010-11-12 2021-06-30 Nektar Therapeutics Konjugati il-2 dela i polimera
CN103732241A (zh) 2011-03-11 2014-04-16 公共事业救济局-巴黎医院 低剂量il-2用于治疗自身免疫相关病症或炎性病症的应用
WO2017156720A1 (zh) 2016-03-16 2017-09-21 谢彦晖 糖皮质激素联合聚乙二醇修饰的白介素2治疗呼吸道疾病

Also Published As

Publication number Publication date
CA3100204A1 (en) 2019-11-28
CO2020014510A2 (es) 2021-03-08
KR20210002577A (ko) 2021-01-08
AU2022246440A1 (en) 2022-11-03
US20210205413A1 (en) 2021-07-08
CN112399859A (zh) 2021-02-23
EA202092489A1 (ru) 2021-03-16
AU2019274409A1 (en) 2020-11-12
DOP2020000212A (es) 2021-03-15
PH12020551976A1 (en) 2021-09-13
JP2023052053A (ja) 2023-04-11
WO2019226538A1 (en) 2019-11-28
CL2020003008A1 (es) 2021-07-30
JOP20200290A1 (ar) 2020-11-15
ECSP20074392A (es) 2021-03-31
JP7235772B2 (ja) 2023-03-08
JP2021523922A (ja) 2021-09-09
AU2019274409B2 (en) 2022-07-14
EP3796940A1 (en) 2021-03-31
SG11202011242SA (en) 2020-12-30
PE20211307A1 (es) 2021-07-20
CR20200546A (es) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020021564A2 (pt) estimulador de treg seletivo rur20kd-il-2 e composições relacionadas
AU702466B2 (en) Methods for treating tumor necrosis factor mediated diseases
KR100689212B1 (ko) Ｇｃｓｆ 결합체
ES2390082T3 (es) Conjugados de resto de Factor IX y polímeros
AU2019283778A1 (en) Conjugates of an IL-15 moiety and a polymer
CA2150925C (en) Improved synthesis of polymer bio-active conjugates
CA2978330C (en) Conjugates of an il-7 moiety and a polymer
EA037083B1 (ru) Иммуномодулирующий конъюгат, включающий il-2 и водорастворимые полимеры
EP2552470B1 (en) Peptides for promoting angiogenesis and an use thereof
EP3137103B1 (en) Methods and compositions for modulating the immune system with arginase i
JP2007506789A (ja) Ｉｌ−２１を用いた自己免疫疾患の治療方法
KR20190126798A (ko) 당뇨병 치료를 위한 펩티드 및 방법
CN108883166A (zh) 以成为疾病主要原因的生物体内蛋白质为靶标的结合疫苗
JP2011507913A (ja) Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用
WO2015000585A1 (en) Muteins of cytokines of the gamma-chain receptor family conjugated to a non-protein group
JP2018530568A (ja) ＩＬ−２Ｒβ選択的作動薬と長時間作用型ＩＬ−１５作動薬との併用
US20220372095A1 (en) An agent for promoting angiogenesis and methods and uses thereof
US9249185B2 (en) Peptides for promoting angiogenesis and an use thereof
WO2016145840A1 (zh) 抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物
ES2751361T3 (es) Factor VIII de la coagulación con inmunogenicidad reducida
JP2000515007A (ja) Ｔ細胞選択的インターロイキン―４アゴニスト
CN101602793B (zh) 用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的免疫调节多肽及其应用
KR20180017104A (ko) Peg화된 과립세포 콜로니 자극 인자(gcsf)
WO2010129789A2 (en) Modified tumor necrosis factor-beta
KR102204476B1 (ko) 다발성 경화증 치료 및 예방용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]