BR112020021324A2 - Terapia gênica para doenças causadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio incluindo síndromes de depleção do dna mitocondrial - Google Patents

Terapia gênica para doenças causadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio incluindo síndromes de depleção do dna mitocondrial Download PDF

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Abstract

a invenção refere-se, de modo geral, a um método de tratamento para uma doença genética humana, tal como doenças caracterizadas por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, por exemplo, síndromes de depleção do dna mitocondrial e, mais especificamente, deficiência da timidina quinase 2 (tk2), usando terapia gênica. a terapia gênica pode envolver a administração de um ou mais construtos, tal como um vetor viral, contendo um ácido nucleico que codifica uma proteína funcional. a proteína funcional pode corresponder a um gene nuclear. para o tratamento da deficiência de tk2, a terapia gênica pode envolver a administração de um ou mais construtos, tal como um vetor viral, contendo um ácido nucleico que codifica uma enzima tk2 funcional. o tratamento também pode envolver a administração de terapia farmacológica em conjunto com a terapia gênica. os protocolos de tratamento da divulgação, tais como aqueles envolvendo a terapia gênica sozinha ou em combinação com a terapia farmacológica, podem ser usados para tratar, prevenir e/ou curar diversos outros distúrbios de pools de nucleosídeos em desequilíbrio, especialmente aqueles encontrados na síndrome de depleção do dna mitocondrial.

Description

TERAPIA GÊNICA PARA DOENÇAS CAUSADAS POR POOLS DE NUCLEOTÍDEOS EM DESEQUILÍBRIO INCLUINDO SÍNDROMES DE DEPLEÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório US n° 62/659.281 depositado em 18 de abril de 2018, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE APOIO DO GOVERNO
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob HD080642 concedido pelo NIH. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A invenção se refere ao campo da terapia gênica para o tratamento de doenças genéticas, incluindo doenças humanas caracterizadas por pools de nucleotídeos desequilibrados. Exemplos de tais doenças são as síndromes de depleção do DNA mitocondrial, como a deficiência de timidina quinase 2 (TK2).
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] As doenças mitocondriais são doenças clinicamente heterogêneas devido a defeitos da cadeia respiratória (Respiratory Chain, RC) mitocondrial e da fosforilação oxidativa, as vias bioquímicas que convertem a energia dos elétrons em trifosfato de adenosina (ATP). A cadeia respiratória é composta por quatro enzimas com múltiplas subunidades (complexos I-IV) que transferem elétrons para gerar um gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndria. O fluxo de prótons neste gradiente de concentração através do complexo V subsequentemente conduz a síntese de ATP (DiMauro e Schon 2003; DiMauro e Hirano 2005). A coenzima Q10 (CoQ10) é uma molécula essencial que transporta elétrons dos complexos I e II para o complexo III. A cadeia respiratória é única em eucariotos, por exemplo , células de mamíferos, em virtude de serem controladas por dois genomas: um composto de DNA mitocondrial (mtDNA) e outro composto por DNA nuclear (nDNA). Consequentemente, mutações em qualquer um dos genomas podem causar doenças mitocondriais
[005] A síndrome de depleção do DNA mitocondrial (Mitochondrial DNA Depletion Syndrome, MDS), que é um subgrupo da doença mitocondrial, é uma causa frequente de encefalomiopatia infantil grave caracterizada molecularmente pela redução do número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) nos tecidos e síntese insuficiente de complexos de RC mitocondriais (Hirano, et al. 2001). Mutações em vários genes nucleares foram identificadas como causas de MDS infantil, incluindo TK2, DGUOK, POLG, POLG2, SCLA25A4, MPV17, RRM2B, SUCLA2, SUCLG1, TYMP, OPA1 e C10orf2 (PEO1). (Bourdon, et al. 2007; Copeland 2008; Elpeleg, et al. 2005; Mandel, et al. 2001; Naviaux e Nguyen 2004; Ostergaard, et al. 2007; Saada, et al. 2003; Sarzi, et al. 2007; Spinazzola, et al, 2006). Além disso, as mutações nesses genes nucleares também podem causar múltiplas deleções de mtDNA com ou sem depleção de mtDNA (Béhin, et al. 2012; Garone, et al. 2012; Longley, et al. 2006; Nishino, et al. 1999; Paradas, et al. 2012; Ronchi, et al. 2012; Spelbrink, et al. 2001; Tyynismaa, et al. 2012; Tyynismaa, et al. 2009; Van Goethem, et al. 2001).
[006] A maioria das doenças mitocondriais afeta múltiplos órgãos do corpo e tipicamente são fatais na infância ou no início da vida adulta. Não existem tratamentos comprovados ou curas eficazes para doenças mitocondriais, apenas terapias de suporte. Permanece a necessidade de composições e métodos para tratar e prevenir doenças mitocondriais, como MDS.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A presente divulgação se refere a composições e métodos que podem ser usados para tratar um sujeito (por exemplo, um sujeito mamífero, como um sujeito humano) que tem ou está em risco de desenvolver uma doença caracterizada por pools de nucleotídeos desequilibrados. Exemplos de patologias que podem ser tratadas, prevenidas e/ou curadas usando as composições e métodos da divulgação são doenças mitocondriais, incluindo síndromes de depleção de DNA mitocondrial, tais como deficiências em um gene selecionado de TK2, que codifica a proteína timidina quinase 2; DGUOK, que codifica a proteína desoxiguanosina quinase; RRM2B, que codifica p53R2, subunidade induzível por p53 de ribonucleotídeo redutase; TYMP, que codifica a timidina fosforilase; SUCLA2, que codifica a subunidade beta formadora de ADP de succinato-CoA ligase; SUCLG1, que codifica a subunidade alfa formadora de ADP de succinato- CoA ligase; MPV17, que codifica a proteína da membrana interna mitocondrial MPV17; e POLG, que codifica a DNA polimerase gama, subunidade catalítica.
[008] Usando as composições e métodos da divulgação, um sujeito (por exemplo, um sujeito mamífero, como um sujeito humano) que tem ou está em risco de desenvolver uma doença descrita acima pode ser administrado com uma composição contendo um transgene que codifica uma ou mais das proteínas anteriores. A composição pode ser um vetor, por exemplo, um vetor viral, como um vetor de vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com uma segunda composição contendo um transgene que codifica uma ou mais das proteínas anteriores. A segunda composição pode ser um vetor, por exemplo, um vetor viral, como um vetor AAV. Em algumas modalidades, o sujeito é adicionalmente administrado com uma ou mais composições subsequentes, tais como uma terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona e/ou décima composição, contendo um transgene que codifica uma ou mais das proteínas anteriores. As uma ou mais composições subsequentes podem ser, cada uma, independentemente, um vetor, por exemplo, um vetor viral, como um vetor AAV.
[009] Em um primeiro aspecto, a divulgação apresenta um método de tratamento, prevenção e/ou cura de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados em um sujeito em necessidade. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica timidina quinase 2 (TK2), desoxiguanosina quinase (dGK), timidina fosforilase (TP), subunidade pequena induzível por p53 da ribonucleotídeo redutase (p53R2), subunidade beta formadora de ADP da succinil-CoA ligase (SUCLA2), subunidade alfa formadora de GDP da succinil-CoA ligase (SUCLG1), proteína de membrana interna mitocondrial MPV17 (MPV17) e/ou subunidade gama da DNA polimerase (POLG).
[010] Em um aspecto adicional, a divulgação apresenta um método para restaurar a atividade enzimática em um sujeito com uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
[011] Em um aspecto adicional, a divulgação apresenta um método para aliviar um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados em um sujeito em necessidade. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
[012] Em qualquer um dos aspectos desta invenção, a divulgação também fornece uma composição conforme descrito neste documento para uso em um método como descrito neste documento. A divulgação também fornece o uso de uma composição conforme descrito neste documento para a fabricação de um medicamento para um método conforme descrito neste documento. O transgene pode codificar TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG. Por exemplo, o transgene pode codificar TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1 e/ou MPV17
[013] Como parte dos aspectos anteriores, a divulgação, portanto, também fornece uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para uso no tratamento, prevenção e/ou cura de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados. Também é fornecida uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para uso na restauração da atividade enzimática em um sujeito com uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados. Além disso, é fornecida uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para uso no alívio de um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados.
[014] Como parte dos aspectos anteriores, a divulgação também fornece o uso de uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP,
p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para a fabricação de um medicamento para tratamento, prevenção e/ou cura de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados. Também é fornecido o uso de uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para a fabricação de um medicamento para a restauração da atividade enzimática em um sujeito com uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados. Além disso, é fornecido o uso de uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG para a fabricação de um medicamento para alívio de um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos desequilibrados.
[015] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, a doença ou distúrbio é uma doença mitocondrial, como uma síndrome de depleção de DNA mitocondrial (MDS). Em algumas modalidades, a MDS é uma MDS miopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica TK2. Em algumas modalidades, a MDS é uma forma encefalomiopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica SUCLA2. Em algumas modalidades, ao MDS é uma forma encefalopática neurogastrointestinal caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica TP. Em algumas modalidades, a MDS é uma forma hepatopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica dGK, MPV17 e/ou POLG
[016] Em algumas modalidades, o transgene codifica TK2. A TK2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que épelo menos
95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[017] Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TK2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TK2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TK2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 17.
[018] Em algumas modalidades, o transgene codifica dGK. A dGK pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[019] Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica dGK é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica dGK (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica dGK tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 18.
[020] Em algumas modalidades, o transgene codifica TP. A TP pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 5 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 5 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[021] Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TP é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TP (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TP tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 19.
[022] Em algumas modalidades, o transgene codifica p53R2. A p53R2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10,
1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[023] Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica p53R2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 20.
[024] Em algumas modalidades, o transgene codifica SUCLA2. A SUCLA2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[025] Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLA2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 21.
[026] Em algumas modalidades, o transgene codifica SUCLG1. A SUCLG1 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[027] Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da
SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLG1 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 22.
[028] Em algumas modalidades, o transgene codifica MPV17. A MPV17 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições,
inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[029] Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica MPV17 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 23.
[030] Em algumas modalidades, o transgene codifica POLG. A POLG pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[031] Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica POLG é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica POLG (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica POLG tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 24.
[032] Em outro aspecto, a divulgação apresenta um método de tratamento, prevenção e/ou cura de deficiência de TK2 em um sujeito em necessidade. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um transgene que codifica TK2.
[033] Em um aspecto adicional, a divulgação apresenta um método para restaurar a atividade da enzima TK2 em um sujeito em necessidade. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um transgene que codifica TK2.
[034] Em outro aspecto, a divulgação apresenta um método para aliviar um ou mais sintomas associados a uma deficiência de TK2 em um sujeito em necessidade. O método inclui a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um transgene que codifica TK2.
[035] Como parte desses aspectos, a divulgação também fornece uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para uso no tratamento, prevenção e/ou cura da deficiência de TK2. Também é fornecida uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para uso na restauração da atividade da enzima TK2 em um sujeito com deficiência de TK2. Além disso, é fornecida uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para uso no alívio de um ou mais sintomas associados a uma deficiência de TK2. Normalmente, o sujeito tem uma deficiência de TK2.
[036] Como parte desses aspectos, a divulgação também fornece o uso de uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para a fabricação de um medicamento para tratar, prevenir e/ou curar a deficiência de TK2. Também é fornecida a utilização de uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para a fabricação de um medicamento para restaurar a atividade da enzima TK2 em um sujeito com deficiência de TK2. Além disso, é fornecida a utilização de uma composição contendo um transgene que codifica TK2 para a fabricação de um medicamento para o alívio de um ou mais sintomas associados a uma deficiência de TK2. Normalmente, o sujeito tem uma deficiência de TK2.
[037] Em algumas modalidades de qualquer um dos três aspectos anteriores, o sujeito tem ou está em risco de desenvolver uma MDS. A TK2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%
idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que épelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[038] Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TK2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TK2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TK2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 17.
[039] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima da divulgação, a composição compreende um vetor, como um vetor viral. O vetor viral pode ser, por exemplo, um AAV, adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia ou um vírus sintético (por exemplo, um vírus quimérico, vírus do mosaico ou vírus pseudotipado e/ou um vírus que contém uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena).
[040] Em algumas modalidades, o vetor viral é um AAV, como um AAV1 (ou seja, um AAV contendo repetições terminais invertidas (Inverted Terminal Repeats, ITRs) de AAV1 e proteínas do capsídeo AAV1), AAV2 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV2), AAV3 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV3 e proteínas do capsídeo de AAV3), AAV4 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV4 e proteínas do capsídeo de AAV4), AAV5 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV5 e proteínas do capsídeo de AAV5), AAV6 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV6 e proteínas do capsídeo de AAV6), AAV7 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV7 e proteínas do capsídeo de AAV7), AAV8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV8 e proteínas do capsídeo de AAV8), AAV9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV9 e proteínas do capsídeo de AAV9), AAVrh74 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh74 e proteínas do capsídeo de AAVrh74), AAVrh.8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.8 e proteínas do capsídeo de AAVrh.8) ou AAVrh.10 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.10 e proteínas do capsídeo de AAVrh.10).
[041] Em algumas modalidades, o vetor viral é um AAV pseudotipado, contendo ITRs de um sorotipo AAV e proteínas do capsídeo de um sorotipo AAV diferente. Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV9). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV8). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/1 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV1).
[042] Em algumas modalidades, o AAV contém uma proteína do capsídeo recombinante, como uma proteína do capsídeo contendo uma quimera de uma ou mais das proteínas do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh. 8 ou AAVrh.10.
[043] Em certas modalidades, o vetor viral é AAV9. Por exemplo, a composição pode compreender AAV9 compreendendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG. Em certas modalidades, a composição compreende AAV9 compreendendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1 ou MPV17. Em uma modalidade particular, a composição compreende AAV9 compreendendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo um transgene que codifica TK2.
[044] Em certas modalidades, o vetor viral é um AAV e o transgene é TK2. Por exemplo, a composição pode compreender um AAV recombinante (rAAV), tal como AAV9, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional.
[045] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima da divulgação, a composição é um lipossoma, vesícula, vesícula sintética, exossomo, exossomo sintético, dendrímero ou nanopartícula.
[046] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima da divulgação, o transgene está operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor da beta actina de galinha, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor da distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B-cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina ou promotor do fator natriurético atrial.
[047] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima da divulgação, o transgene está operacionalmente ligado a um potenciador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. Exemplos de potenciador que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos da divulgação são um potenciador de CMV, um potencializador do fator potenciador de miócitos 2 (MEF2) e um potenciador de MyoD.
[048] Em algumas modalidades, a composição é administrada ao sujeito assim que, ou imediatamente depois, que o sujeito é diagnosticado como tendo uma deficiência em um gene endógeno que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG. Em algumas modalidades, a composição é administrada ao sujeito assim que, ou imediatamente depois, que o sujeito é diagnosticado como tendo uma deficiência em um gene endógeno que codifica TK2.
[049] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
[050] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica TK2. A TK2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos
85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[051] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TK2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TK2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TK2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 17.
[052] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica dGK. A dGK pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[053] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica dGK é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica dGK (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica dGK tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 18.
[054] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica TP. A TP pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 5 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 5 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[055] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TP é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TP (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TP tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 19.
[056] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica p53R2. A p53R2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo,
uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[057] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica p53R2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
20.
[058] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica SUCLA2. A SUCLA2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[059] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLA2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 21.
[060] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica SUCLG1. A SUCLG1 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[061] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLG1 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 22.
[062] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica MPV17. A MPV17 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[063] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica MPV17 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 23.
[064] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição codifica POLG. A POLG pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[065] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16
(por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica POLG é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica POLG (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica POLG tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 24
[066] Em algumas modalidades, a segunda composição é um vetor, como um vetor viral. O vetor viral pode ser, por exemplo, um AAV, adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia ou um vírus sintético (por exemplo, um vírus quimérico, vírus do mosaico ou vírus pseudotipado e/ou um vírus que contém uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena).
[067] Em algumas modalidades, a segunda composição é um AAV, como um AAV1 (ou seja, um AAV contendo repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV1 e proteínas do capsídeo AAV1), AAV2 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV2), AAV3 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV3 e proteínas do capsídeo de AAV3), AAV4 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV4 e proteínas do capsídeo de AAV4), AAV5 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV5 e proteínas do capsídeo de AAV5), AAV6 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV6 e proteínas do capsídeo de AAV6), AAV7 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV7 e proteínas do capsídeo de AAV7), AAV8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV8 e proteínas do capsídeo de AAV8), AAV9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV9 e proteínas do capsídeo de AAV9), AAVrh74 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh74 e proteínas do capsídeo de AAVrh74), AAVrh.8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.8 e proteínas do capsídeo de AAVrh.8) ou AAVrh.10 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.10 e proteínas do capsídeo de AAVrh.10).
[068] Em algumas modalidades, a segunda composição é um AAV pseudotipado, contendo ITRs de um sorotipo AAV e proteínas do capsídeo de um sorotipo AAV diferente. Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV9). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV8). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/1 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV1).
[069] Em algumas modalidades, a segunda composição é um AAV que contém uma proteína do capsídeo recombinante, como uma proteína do capsídeo contendo uma quimera de uma ou mais das proteínas do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh. 8 ou AAVrh.10.
[070] Em algumas modalidades, a segunda composição é um lipossoma, vesícula, vesícula sintética, exossomo, exossomo sintético, dendrímero ou nanopartícula.
[071] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição está operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor da beta actina de galinha, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor da distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B- cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina ou promotor do fator natriurético atrial.
[072] Em algumas modalidades, o transgene da segunda composição está operacionalmente ligado a um intensificador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. Exemplos de potenciador que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos da divulgação são um potenciador de CMV, um potencializador do fator potenciador de miócitos 2 (MEF2) e um potenciador de MyoD.
[073] Em algumas modalidades, a segunda composição é administrada ao sujeito após a administração da primeira composição ao sujeito. A segunda composição pode ser administrada ao sujeito, por exemplo, dentro de um ou mais dias ou semanas de administração da primeira composição ao sujeito. Em algumas modalidades, a segunda composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da primeira composição ao sujeito. Em algumas modalidades, a administração da primeira composição continua enquanto a segunda composição é administrada ao sujeito.
[074] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terceira composição contendo um agente farmacológico. O agente farmacológico pode ser, por exemplo, desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT), desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG), monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxitimidina (TMP), monofosfato de desoxiadosina (dAMP), monofosfato de desoxiadosina (dGMP) ou uma mistura destes. Em algumas modalidades, o agente farmacológico é dC, dT ou uma mistura destes.
[075] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito após a administração da primeira composição ao sujeito. A terceira composição pode ser administrada ao sujeito, por exemplo, dentro de um ou mais dias ou semanas de administração da primeira composição ao sujeito. Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da primeira composição ao sujeito.
[076] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito após a administração da terceira composição ao sujeito. A terceira composição pode ser administrada ao sujeito, por exemplo, dentro de um ou mais dias ou semanas de administração da segunda composição ao sujeito. Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da segunda composição ao sujeito.
[077] Em algumas modalidades, a administração da primeira composição e a administração da segunda composição continuam enquanto a terceira composição é administrada ao sujeito.
[078] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 100 mg/kg/dia a cerca de 1.000 mg/kg/dia (por exemplo, cerca de 100 mg/kg/dia, 105 mg/kg/dia, 110 mg/kg/dia, 115 mg/kg/dia, 120 mg/kg/dia, 125 mg/kg/dia, 130 mg/kg/dia, 135 mg/kg/dia, 140 mg/kg/dia, 145 mg/kg/dia, 150 mg/kg/dia, 155 mg/kg/dia, 160 mg/kg/dia, 165 mg/kg/dia, 170 mg/kg/dia, 175 mg/kg/dia, 180 mg/kg/dia, 185 mg/kg/dia, 190 mg/kg/dia, 195 mg/kg/dia, 200 mg/kg/dia, 205 mg/kg/dia, 210 mg/kg/dia, 215 mg/kg/dia, 220 mg/kg/dia, 225 mg/kg/dia, 230 mg/kg/dia, 235 mg/kg/dia, 240 mg/kg/dia, 245 mg/kg/dia, 250 mg/kg/dia, 255 mg/kg/dia, 260 mg/kg/dia, 265 mg/kg/dia, 270 mg/kg/dia, 275 mg/kg/dia, 280 mg/kg/dia, 285 mg/kg/dia, 290 mg/kg/dia, 295 mg/kg/dia, 300 mg/kg/dia, 305 mg/kg/dia, 310 mg/kg/dia, 315 mg/kg/dia, 320 mg/kg/dia, 325 mg/kg/dia, 330 mg/kg/dia, 335 mg/kg/dia, 340 mg/kg/dia, 345 mg/kg/dia, 350 mg/kg/dia, 355 mg/kg/dia, 360 mg/kg/dia, 365 mg/kg/dia, 370 mg/kg/dia, 375 mg/kg/dia, 380 mg/kg/dia, 385 mg/kg/dia, 390 mg/kg/dia, 395 mg/kg/dia, 400 mg/kg/dia, 405 mg/kg/dia, 410 mg/kg/dia, 415 mg/kg/dia, 420 mg/kg/dia, 425 mg/kg/dia, 430 mg/kg/dia, 435 mg/kg/dia, 440 mg/kg/dia, 445 mg/kg/dia, 450 mg/kg/dia, 455 mg/kg/dia, 460 mg/kg/dia, 465 mg/kg/dia, 470 mg/kg/dia, 475 mg/kg/dia, 480 mg/kg/dia, 485 mg/kg/dia, 490 mg/kg/dia, 495 mg/kg/dia, 500 mg/kg/dia, 505 mg/kg/dia, 510 mg/kg/dia, 515 mg/kg/dia, 520 mg/kg/dia, 525 mg/kg/dia, 530 mg/kg/dia, 535 mg/kg/dia, 540 mg/kg/dia, 545 mg/kg/dia, 550 mg/kg/dia, 555 mg/kg/dia, 560 mg/kg/dia, 565 mg/kg/dia, 570 mg/kg/dia, 575 mg/kg/dia, 580 mg/kg/dia, 585 mg/kg/dia, 590 mg/kg/dia, 595 mg/kg/dia, 600 mg/kg/dia, 605 mg/kg/dia, 610 mg/kg/dia, 615 mg/kg/dia, 620 mg/kg/dia, 625 mg/kg/dia, 630 mg/kg/dia, 635 mg/kg/dia, 640 mg/kg/dia, 645 mg/kg/dia, 650 mg/kg/dia, 655 mg/kg/dia, 660 mg/kg/dia, 665 mg/kg/dia, 670 mg/kg/dia, 675 mg/kg/dia, 680 mg/kg/dia, 685 mg/kg/dia, 690 mg/kg/dia, 695 mg/kg/dia, 700 mg/kg/dia, 705 mg/kg/dia, 710 mg/kg/dia, 715 mg/kg/dia, 720 mg/kg/dia, 725 mg/kg/dia, 730 mg/kg/dia, 735 mg/kg/dia, 740 mg/kg/dia, 745 mg/kg/dia, 750 mg/kg/dia, 755 mg/kg/dia, 760 mg/kg/dia, 765 mg/kg/dia, 770 mg/kg/dia, 775 mg/kg/dia, 780 mg/kg/dia, 785 mg/kg/dia, 790 mg/kg/dia, 795 mg/kg/dia, 800 mg/kg/dia, 805 mg/kg/dia, 810 mg/kg/dia, 815 mg/kg/dia, 820 mg/kg/dia, 825 mg/kg/dia, 830 mg/kg/dia, 835 mg/kg/dia, 840 mg/kg/dia, 845 mg/kg/dia, 850 mg/kg/dia, 855 mg/kg/dia, 860 mg/kg/dia, 865 mg/kg/dia, 870 mg/kg/dia, 875 mg/kg/dia, 880 mg/kg/dia, 885 mg/kg/dia, 890 mg/kg/dia, 895 mg/kg/dia, 900 mg/kg/dia, 905 mg/kg/dia, 910 mg/kg/dia, 915 mg/kg/dia, 920 mg/kg/dia, 925 mg/kg/dia, 930 mg/kg/dia, 935 mg/kg/dia, 940 mg/kg/dia, 945 mg/kg/dia, 950 mg/kg/dia, 955 mg/kg/dia, 960 mg/kg/dia, 965 mg/kg/dia, 970 mg/kg/dia, 975 mg/kg/dia, 980 mg/kg/dia, 985 mg/kg/dia, 990 mg/kg/dia, 995 mg/kg/dia ou 1.000 mg/kg/dia).
[079] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 200 mg/kg/dia a cerca de 800 mg/kg/dia (por exemplo, cerca de 200 mg/kg/dia, 205 mg/kg/dia, 210 mg/kg/dia, 215 mg/kg/dia, 220 mg/kg/dia, 225 mg/kg/dia, 230 mg/kg/dia, 235 mg/kg/dia, 240 mg/kg/dia, 245 mg/kg/dia, 250 mg/kg/dia, 255 mg/kg/dia, 260 mg/kg/dia, 265 mg/kg/dia, 270 mg/kg/dia, 275 mg/kg/dia, 280 mg/kg/dia, 285 mg/kg/dia, 290 mg/kg/dia, 295 mg/kg/dia, 300 mg/kg/dia, 305 mg/kg/dia, 310 mg/kg/dia, 315 mg/kg/dia, 320 mg/kg/dia, 325 mg/kg/dia, 330 mg/kg/dia, 335 mg/kg/dia, 340 mg/kg/dia, 345 mg/kg/dia, 350 mg/kg/dia, 355 mg/kg/dia, 360 mg/kg/dia, 365 mg/kg/dia, 370 mg/kg/dia, 375 mg/kg/dia, 380 mg/kg/dia, 385 mg/kg/dia, 390 mg/kg/dia, 395 mg/kg/dia, 400 mg/kg/dia, 405 mg/kg/dia, 410 mg/kg/dia, 415 mg/kg/dia, 420 mg/kg/dia, 425 mg/kg/dia, 430 mg/kg/dia, 435 mg/kg/dia, 440 mg/kg/dia, 445 mg/kg/dia, 450 mg/kg/dia, 455 mg/kg/dia, 460 mg/kg/dia, 465 mg/kg/dia, 470 mg/kg/dia, 475 mg/kg/dia, 480 mg / kg / da y, 485 mg/kg/dia, 490 mg/kg/dia, 495 mg/kg/dia, 500 mg/kg/dia, 505 mg/kg/dia, 510 mg/kg/dia, 515 mg/kg/dia, 520 mg/kg/dia, 525 mg/kg/dia, 530 mg/kg/dia, 535 mg/kg/dia, 540 mg/kg/dia, 545 mg/kg/dia, 550 mg/kg/dia, 555 mg/kg/dia, 560 mg/kg/dia, 565 mg/kg/dia, 570 mg/kg/dia, 575 mg/kg/dia, 580 mg/kg/dia, 585 mg/kg/dia, 590 mg/kg/dia, 595 mg/kg/dia, 600 mg/kg/dia, 605 mg/kg/dia, 610 mg/kg/dia, 615 mg/kg/dia, 620 mg/kg/dia, 625 mg/kg/dia, 630 mg/kg/dia, 635 mg/kg/dia, 640 mg/kg/dia, 645 mg/kg/dia, 650 mg/kg/dia, 655 mg/kg/dia, 660 mg/kg/dia, 665 mg/kg/dia, 670 mg/kg/dia, 675 mg/kg/dia, 680 mg/kg/dia, 685 mg/kg/dia, 690 mg/kg/dia, 695 mg/kg/dia, 700 mg/kg/dia, 705 mg/kg/dia, 710 mg/kg/dia, 715 mg/kg/dia, 720 mg/kg/dia, 725 mg/kg/dia, 730 mg/kg/dia, 735 mg/kg/dia, 740 mg/kg/dia, 745 mg/kg/dia, 750 mg/kg/dia, 755 mg/kg/dia, 760 mg/kg/dia, 765 mg/kg/dia, 770 mg/kg/dia, 775 mg/kg/dia, 780 mg/kg/dia, 785 mg/kg/dia, 790 mg/kg/dia, 795 mg/kg/dia ou 800 mg/kg/dia).
[080] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 250 mg/kg/dia a cerca de 400 mg/kg/dia (por exemplo, cerca de 250 mg/kg/dia, 255 mg/kg/dia, 260 mg/kg/dia, 265 mg/kg/dia, 270 mg/kg/dia, 275 mg/kg/dia, 280 mg/kg/dia, 285 mg/kg/dia, 290 mg/kg/dia, 295 mg/kg/dia, 300 mg/kg/dia, 305 mg/kg/dia, 310 mg/kg/dia, 315 mg/kg/dia, 320 mg/kg/dia, 325 mg/kg/dia, 330 mg/kg/dia, 335 mg/kg/dia, 340 mg/kg/dia, 345 mg/kg/dia, 350 mg/kg/dia, 355 mg/kg/dia, 360 mg/kg/dia, 365 mg/kg/dia, 370 mg/kg/dia, 375 mg/kg/dia, 380 mg/kg/dia, 385 mg/kg/dia, 390 mg/kg/dia, 395 mg/kg/dia ou 400 mg/kg/dia).
[081] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia ou seis vezes ao dia. A terceira composição pode ser administrada ao sujeito por via oral em mistura com leite de vaca, leite materno, fórmula infantil e/ou água.
[082] Em algumas modalidades, a primeira composição é administrada ao sujeito por via intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, inalação, perfusão, lavagem e/ou administração oral.
[083] Em algumas modalidades, a segunda composição é administrada ao sujeito por via intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, inalação, perfusão, lavagem e/ou administração oral.
[084] Em algumas modalidades, a terceira composição é administrada ao sujeito por via intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, inalação, perfusão, lavagem e/ou administração oral.
[085] Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero, tal como um humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito humano pediátrico, como um sujeito humano de cerca de 1 mês a cerca de 12 anos de idade (por exemplo, um sujeito humano de cerca de 1 mês a cerca de 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 11 anos ou 12 anos de idade).
[086] Em um outro aspecto, a divulgação apresenta uma composição contendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
[087] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica TK2. A TK2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TK2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 1 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[088] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TK2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TK2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TK2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TK2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 17.
[089] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica dGK. A dGK pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a dGK tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 3 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[090] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID
NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o transgene que codifica dGK é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica dGK é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica dGK (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica dGK tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 18.
[091] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica TP. A TP pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO:
5 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a TP tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 5 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[092] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o transgene que codifica TP é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica TP é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica TP (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica TP tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 19.
[093] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica p53R2. A p53R2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a p53R2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 7 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[094] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70%
idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o transgene que codifica p53R2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica p53R2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica p53R2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
20.
[095] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica SUCLA2. A SUCLA2 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLA2 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 9 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[096] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica
SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLA2 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLA2 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLA2 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 21.
[097] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica SUCLG1. A SUCLG1 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a SUCLG1 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 11 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[098] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o transgene que codifica SUCLG1 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica SUCLG1 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica SUCLG1 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 22.
[099] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica MPV17. A MPV17 pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a MPV17 tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 13 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[100] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o transgene que codifica MPV17 é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica MPV17 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica MPV17 tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 23.
[101] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene codifica POLG. A POLG pode ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%
idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais, substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos). Em algumas modalidades, a POLG tem uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 15 por meio de uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, como por 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais substituições conservativas de aminoácidos).
[102] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica àsequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16 (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o transgene que codifica POLG é otimizado por códons para aumentar a eficiência. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do transgene que codifica POLG é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica POLG (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da sequência de codificação). Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico do transgene que codifica POLG tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
24.
[103] Em algumas modalidades do aspecto anterior, a composição é um vetor, como um vetor viral. O vetor viral pode ser, por exemplo, um AAV, adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia ou um vírus sintético (por exemplo, um vírus quimérico, vírus do mosaico ou vírus pseudotipado e/ou um vírus que contém uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena).
[104] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o vetor viral é um AAV, como um AAV1 (ou seja, um AAV contendo repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV1 e proteínas do capsídeo AAV1), AAV2 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV2), AAV3 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV3 e proteínas do capsídeo de AAV3), AAV4 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV4 e proteínas do capsídeo de AAV4), AAV5 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV5 e proteínas do capsídeo de AAV5), AAV6 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV6 e proteínas do capsídeo de AAV6), AAV7 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV7 e proteínas do capsídeo de AAV7), AAV8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV8 e proteínas do capsídeo de AAV8), AAV9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV9 e proteínas do capsídeo de AAV9), AAVrh74 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh74 e proteínas do capsídeo de AAVrh74), AAVrh.8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.8 e proteínas do capsídeo de AAVrh.8) ou AAVrh.10 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAVrh.10 e proteínas do capsídeo de AAVrh.10).
[105] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o vetor viral é um AAV pseudotipado, contendo ITRs de um sorotipo AAV e proteínas do capsídeo de um sorotipo AAV diferente. Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/9 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV9). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/8 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV8). Em algumas modalidades, o AAV pseudotipado é AAV2/1 (ou seja, um AAV contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV1).
[106] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o AAV contém uma proteína do capsídeo recombinante, como uma proteína do capsídeo contendo uma quimera de uma ou mais das proteínas do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh. 8 ou AAVrh.10.
[107] Em algumas modalidades do aspecto anterior, a composição é um lipossoma, vesícula, vesícula sintética, exossomo, exossomo sintético, dendrímero ou nanopartícula.
[108] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene está operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. O promotor pode ser, por exemplo, um promotor da beta actina de galinha, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor da distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B-
cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina ou promotor do fator natriurético atrial.
[109] Em algumas modalidades do aspecto anterior, o transgene está operacionalmente ligado a um potenciador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular. Exemplos de potenciador que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos da divulgação são um potenciador de CMV, um potencializador do fator potenciador de miócitos 2 (MEF2) e um potenciador de MyoD.
[110] Em outro aspecto, a divulgação apresenta um kit contendo a composição do aspecto anterior. O kit pode conter ainda uma bula, como uma bula instruindo um usuário do kit a administrar a composição a um sujeito de acordo com o método de qualquer um dos aspectos ou modalidades acima da divulgação. O kit pode ainda conter um agente farmacológico selecionado do grupo que consiste em dC, dT, dA, dG, dCMP, TMP, dAMP, dGMP e misturas destes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[111] Com a finalidade de ilustrar a invenção, certas modalidades da invenção estão representadas nas figuras. No entanto, a invenção não está limitada às disposições e instrumentalidades precisas das modalidades representadas nas figuras.
[112] Nas figuras, certas abreviaturas são usadas. “WT” significa camundongos do tipo selvagem que são Tk2+. "Het" significa camundongos heterozigotos para o gene TK2. “Mut” significa camundongos Tk2-/- “P” significa dia pós-natal. "AAV2-hTK2" refere-se a um vetor AAV2 contendo um transgene TK2 humano. "AAV9-hTK2" refere-se a um vetor AAV9 contendo um transgene TK2 humano. “dC” refere-se a desoxicitidina. “dT” refere-se a desoxitimidina. “IV” refere- se à administração intravenosa. “vc” refere-se a uma quantidade de cópias do genoma do vetor.
[113] A FIG. 1 é um esquema de um vetor de vírus adeno-associado (AAV) recombinante compreendendo cDNA de TK2 humano.
[114] A FIG. 2 mostra as curvas de sobrevida dos seguintes ratos (curvas da esquerda para a direita): camundongos não tratados (n=13) Tk2-/- ; camundongos Tk2-/- administrados apenas com leite (n=6); camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1010 vc por IV no dia pós-natal 1 (n=5); camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT (n=11) e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1 (n=10). A sobrevida de Tk2+ não tratados (tipo selvagem) é mostrada pela linha horizontal superior.
[115] A FIG. 3 mostra gráficos de peso versus tempo nos seguintes camundongos machos e fêmeas: Tk2+ tratados com 520 mg de dC+dT; camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT; Tk2+ tratados com AAV9- hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1; e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1010 vc por IV no dia pós-natal 1.
[116] A FIG. 4 mostra gráficos do resultado do teste de força de preensão dos membros anteriores (teste de barra) e ambos os membros anteriores e posteriores (teste de grade) normalizados pelo peso do camundongo no dia 29 pós- natal e no dia 60 pós-natal de camundongos machos e fêmeas, incluindo Tk2+ não tratados, Tk2+ tratados com AAV9-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9- hTK2.
[117] A FIG. 5 mostra gráficos dos resultados da função motora de camundongos, conforme medido pelo teste de desempenho de rotarod acelerado no dia 29 pós-natal e dia 60 pós-natal de camundongos machos e fêmeas, incluindo Tk2+ tratados com AAV9-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2.
[118] A FIG. 6 mostra gráficos da atividade da enzima TK2 medida como pmol/min/mg de proteína no dia 29 pós-natal no cérebro, fígado, músculo e tecido renal dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9- hTK2 a 4,2 x 1011 vc; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc; Tk2+ tratados com 520 mg de dC+dT; e camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT.
[119] A FIG. 7 mostra gráficos de expressão de mRNA de medida de TK2 humana como uma porcentagem de mRNA de TK2 de camundongo no cérebro, fígado, músculo e tecido renal de Tk2+ tratados com AAV9-hTK2 em um mês, dois meses e seis meses.
[120] A FIG. 8 mostra gráficos que mostram o número de cópias de mtDNA (mtDNA/nDNA como um percentual de Tk2+ não tratado) no dia pós-natal 29 em tecidos de cérebro, fígado, rim, coração, músculo e intestino dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9-hTK2; camundongos que são heterozigóticos para o gene de Tk2 tratado com AAV9-hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT.
[121] A FIG. 9 mostra gráficos que mostram o número de cópias de mtDNA (mtDNA /nDNA como percentual de Tk2+ não tratado) no dia pós-natal 60 em tecidos do cérebro, fígado, rim, coração, músculo dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9-hTK2; camundongos que são heterozigóticos para o gene de Tk2 tratados com AAV9-hTK2 e camundongos Tk2- /- tratados com AAV9-hTK2.
[122] A FIG. 10 mostra gráficos da atividade enzimática da cadeia respiratória no dia 29 pós-natal em cérebros dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9-hTK2; camundongos que são heterozigóticos para o gene Tk2 tratado com AAV9-hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9- hTK2; e Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT.
[123] A FIG. 11 mostra gráficos de níveis de enzima da cadeia respiratória (níveis de oxphos em estado estacionário normalizados para vinculina) no dia 29 pós-natal em cérebros dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9-hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT
[124] A FIG. 12 mostra imagens de rins corados (por H.E.) de camundongos mutantes e de tipo selvagem tratados com AAV9-hTK2 no dia pós-natal 96.
[125] A FIG. 13 mostra gráficos de creatinina e índice BUN em camundongos mutantes e de tipo selvagem tratados com AAV9-hTK2 em uma coorte de sobrevida e uma coorte de 60 dias pós-natal.
[126] A FIG. 14 mostra a curva de sobrevida dos seguintes ratos (curvas da esquerda para a direita): Camundongos Tk2-/- não tratados (n=13); camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1010 vc por IV no dia pós-natal 1 (n=5); camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT (n=11); camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1 (n=10); camundongos cotratados com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 no dia 1 e AAV2-hTK2 a 1,05 x 1011 no dia 29 (n=7) e camundongos sob cotratamento com AAV9-hTK2 no dia 1, AAV2-hTK2 no dia 29 e suplementado com 520 mg/kg/dia de dC + dT oral a partir do dia 21 (n = 7). A sobrevida de Tk2+ não tratados (tipo selvagem) émostrada pela linha horizontal superior.
[127] A FIG. 15 mostra o peso em função do tempo nos seguintes camundongos machos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com 520 mg de dC+dT; camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg de dC+dT; Tk2+ tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9- hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1 (“AAV9”); camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1010 vc por IV no dia pós-natal 1; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 vc por IV no dia 1 pós-natal e AAV2-hTK2 a 1,05 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 29 (“AAV9 + AAV2”) e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1, AAV2-hTK2 a 1,05 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 29 e 520 mg/kg/dia de dC+dT oral do dia 21 (“AAV9 + AAV2 + dCdT”).
[128] A FIG. 16 mostra peso versus tempo nos seguintes camundongos fêmeas: Tk2+ não tratadas; Tk2+ tratadas com 520 mg de dC+dT; camundongos fêmeas Tk2-/- tratadas com 520 mg de dC+dT; Tk2+ tratadas com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1; camundongos fêmeas Tk2-/- tratadas com AAV9- hTK2 a 4,2 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1 (“AAV9”); camundongos fêmeas Tk2- /- tratadas com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1010 vc por IV no dia pós-natal 1; camundongos fêmeas Tk2-/- tratadas com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1 e
AAV2-hTK2 a 1,05 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 29 (“AAV9 + AAV2”); e camundongos fêmeas Tk2-/- tratadas com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 1, AAV2-hTK2 a 1,05 x 1011 vc por IV no dia pós-natal 29 e 520 mg/kg/dia de dC+dT oral do dia 21 (AAV9 + AAV2+ dCdT”).
[129] A FIG. 17 mostra gráficos do resultado do teste de força de preensão dos membros anteriores (teste de barra) e ambos os membros anteriores e posteriores (teste de grade) normalizados pelo peso do camundongo no dia pós- natal 60 de camundongos machos e fêmeas, incluindo Tk2+ não tratados, Tk2+ tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, AAV2-hTK2 e dC+dT.
[130] A FIG. 18 mostra gráficos do resultado do teste de força de preensão dos membros anteriores (teste de barra) e ambos os membros anteriores e posteriores (teste de grade) normalizados pelo peso do camundongo no dia pós- natal 90 de camundongos machos e fêmeas Tk2+ não tratados, Tk2+ tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9- hTK2, AAV2-hTK2 e dC+dT.
[131] A FIG. 19 mostra gráficos dos resultados da função motora de camundongos medidos pelo teste de desempenho de rotarod acelerado no dia pós- natal 60 e dia pós-natal 90 de camundongos machos e fêmeas, incluindo Tk2+ não tratados, Tk2+ tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9- hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, AAV2-hTK2 e dC+dT.
[132] A FIG. 20 mostra gráficos mostrando o número de cópias de mtDNA (mtDNA / nDNA como uma porcentagem de Tk2+ não tratada) no dia 60 pós-natal no cérebro, fígado, músculo, coração, rim e tecido do intestino dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, AAV2-hTK2 e dC+dT.
[133] A FIG. 21 mostra os resultados do teste de proteína em uma vareta de imersão de urina usando urina de camundongos com idade de 21-29 dias e 60 dias de idade. Todos os camundongos Tk2-/- foram tratados com AAV9-hTK2 no dia 1, enquanto 3 de quatro camundongos Tk2-/- foram tratados com AAV2-hTK2 no dia
29.
[134] A FIG. 22 mostra gráficos do índice de nitrogênio ureico no sangue (Blood Urea Nitrogen, BUN) em camundongos no dia 60 e camundongos em uma coorte de desfecho incluindo Tk2+ não tratados, Tk2+ tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, AAV2- hTK2 e dC+dT.
[135] A FIG. 23 mostra gráficos da atividade da enzima TK2 medida como pmol/min/mg de proteína no dia 60 pós-natal no cérebro, fígado, músculo e tecido renal dos seguintes camundongos: Tk2+ não tratados; Tk2+ tratados com AAV9- hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2; camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 e camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2, AAV2-hTK2 e dC+dT.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[136] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente de que síndromes de depleção de DNA mitocondrial, incluindo deficiência de TK2, podem ser tratadas, prevenidas e/ou curadas por meio de terapia gênica pela entrega de ácidos nucleicos que codificam para uma proteína funcional, como uma proteína funcional codificada por um gene nuclear. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos da divulgação codificam a timidina quinase 2 (TK2), desoxiguanosina quinase (dGK), timidina fosforilase (TP), subunidade pequena induzível por p53 da ribonucleotídeo redutase (p53R2), subunidade beta formadora de ADP da succinil- CoA ligase (SUCLA2), subunidade alfa formadora de GDP da succinil-CoA ligase (SUCLG1), proteína de membrana interna mitocondrial MPV17 (MPV17) e/ou subunidade gama da DNA polimerase (POLG). Tais ácidos nucleicos podem ser distribuídos por meio de um ou mais vetores virais, como por meio de um vírus adeno-associado (AAV), entre outros descritos neste documento. A terapia gênica pode ser administrada sozinha ou em combinação com terapia farmacológica, tal como terapia com desoxinucleosídeo ou monofosfato de desoxirribonucleosídeo. As seções a seguir descrevem as composições e métodos da divulgação em mais detalhes.
Definições
[137] Os termos usados neste relatório descritivo geralmente têm seus significados comuns na técnica, dentro do contexto desta invenção e do contexto específico em que cada termo é usado. Certos termos são discutidos abaixo ou em outros lugares no relatório descritivo para prover orientação adicional ao profissional na descrição dos métodos da invenção e como usá-los. Além disso, será apreciado que a mesma coisa pode ser dita de mais de uma forma. Consequentemente, linguagem alternativa e sinônimos podem ser usados para qualquer um ou mais dos termos discutidos neste documento, e nenhum significado especial deve ser atribuído à elaboração ou discussão ou não de um termo neste documento. Sinônimos para certos termos são providos. Um relato de um ou mais sinônimos não exclui o uso dos outros sinônimos. O uso de exemplos em qualquer parte do relatório descritivo, incluindo exemplos de quaisquer termos tratados neste documento, é somente ilustrativo e de modo algum limita o escopo e o significado da invenção ou qualquer termo exemplificado. Do mesmo modo, a invenção não está limitada às suas modalidades preferenciais.
[138] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor em particular determinado por alguém ordinariamente versado na técnica, o que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, das limitações do sistema de medição, isto é, do grau de precisão necessário para uma finalidade em particular, tal como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, de acordo com a prática da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, preferencialmente até 10%, mais preferencialmente até 5% e mais preferencialmente ainda até 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente a respeito dos sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude,
preferencialmente dentro de 5 vezes e mais preferencialmente dentro de 2 vezes um valor. Onde valores específicos estiverem descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de forma diferente, o termo "cerca de", significando dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor em particular, deve ser presumido.
[139] Os termos "camundongo mutante", "camundongo knockin para TK2" e “Tk2-/-“ referem-se ao modelo de camundongo mutante knock-in (Tk2-/-) homozigoto para Tk2 H126N, descrito em Akman, et al. 2008. Os termos "camundongo de tipo selvagem", "WT" e "Tk2+” também serão usados indistintamente. Em alguns casos, os camundongos que são heterozigotos para o gene de Tk2 (“Tk2+/-“) são usados para comparação e seria esperado que se comportassem da mesma forma que os camundongos do tipo selvagem. Esses camundongos são designados “Het”
[140] O termo "sujeito", conforme usado neste pedido, refere-se a animais que precisam de tratamento terapêutico ou profilático. Os sujeitos incluem mamíferos, como caninos, felinos, roedores, bovinos, equinos, porcinos, ovinos e primatas. Assim, a invenção pode ser usada em medicina veterinária, por exemplo, para tratar animais domésticos, animais de fazenda, animais de laboratório, em parques zoológicos e animais selvagens. A invenção é particularmente desejável para aplicações médicas humanas.
[141] O termo "paciente" como usado neste pedido significa um sujeito humano. Em algumas modalidades da presente invenção, sabe-se ou suspeita-se que o "paciente" tem uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, doença mitocondrial, síndrome de depleção do DNA mitocondrial ou deficiência de TK2.
[142] A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada neste documento para significar uma quantidade suficiente para causar uma melhora em uma condição clinicamente significativa no sujeito ou que atrasa, minimiza ou mitiga um ou mais sintomas associados com a doença ou distúrbio ou que resulta em uma mudança benéfica da fisiologia no sujeito.
[143] Os termos "tratar", "tratamento" e semelhantes se referem a um meio para desacelerar, atenuar, melhorar ou aliviar pelo menos um dos sintomas da doença ou distúrbio, ou reverter a doença ou distúrbio após o seu início
[144] Os termos "prevenir", "prevenção" e semelhantes se referem à atuação antes da manifestação do início da doença ou distúrbio, a fim de evitar que a doença ou distúrbio se desenvolva ou minimizar o nível da doença ou distúrbio ou desacelerar seu curso de desenvolvimento
[145] O termo “cura” e semelhantes significa curar ou restaurar a boa saúde ou permitir um tempo sem recorrência da doença, de modo que o risco de recorrência seja pequeno
[146] O termo "em necessidade" seria um sujeito que se sabe ou se suspeita que tenha ou esteja em risco de ter uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, doença mitocondrial, síndrome de depleção do DNA mitocondrial ou deficiência de TK2.
[147] O termo "agente", como usado neste documento, significa uma substância que produz ou é capaz de produzir um efeito e incluiria, mas não se limita a, produtos químicos, farmacêuticos, biológicos, pequenas moléculas orgânicas, anticorpos, ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas.
[148] O termo "desoxinucleosídeo" ou "dN", como usado neste documento, significa desoxitimidina ou dT, desoxicitidina ou dC, desoxiadenosina ou dA, e desoxiguanosina ou dG. O nome completo e abreviatura comum para cada um será usado de forma intercambiável. Tais desoxinucleosídeos também incluem derivados fisiologicamente funcionais dos desoxinucleosídeos
[149] O termo "monofosfato de desoxirribonucleosídeo", como utilizado neste documento, significa timidina-5'-monofosfato ou (TMP) ou 2'-desoxicitidina- 5'-monofosfato (dCMP), monofosfato de desoxiadenosina ou dAMP e monofosfato de desoxiguanosina ou dGMP. O nome completo e abreviatura comum para cada um será usado de forma intercambiável.
[150] O termo "agente farmacológico", tal como utilizado neste documento, significa desoxinucleosídeos ou dNs e/ou monofosfato de desoxirribonucleosídeo ou dNMPs, sozinho ou em uma composição ou composição farmacêutica.
[151] Os termos "terapia farmacológica" ou "tratamento farmacológico", conforme usados neste documento, significam a administração de dNs e/ou dNMPs, conforme divulgado neste documento e totalmente descrito no Pedido de Patente US de copropriedade N°de Série 15/082.207 (doravante denominado "o pedido ‘207") e 15/736.092 (doravante o "pedido ‘092”).
[152] Como usado neste documento, o termo "derivado fisiologicamente funcional" se refere a um composto (por exemplo, um precursor de fármaco) que é transformado in vivo para produzir um desoxinucleosídeo. A transformação pode ocorrer por vários mecanismos (por exemplo, por processos metabólicos ou químicos), tais como, por exemplo, por hidrólise no sangue. Os pró-fármacos são tais derivados e uma discussão sobre o uso de pró-fármacos é fornecida por T. Higuchi e W. Stella, "Pro-drug as Novel Delivery Systems", Vol. 14 da ACS Symposium Series e em Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
[153] Como usado neste documento, "um efeito adverso" é uma reação indesejada causada pela administração de um fármaco. Na maioria dos casos, a administração do gene e a terapia farmacológica não causaram efeitos adversos.
[154] Tal como utilizado neste documento, o termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico é administrado e inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardamento da absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica.
[155] O termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou desagradável semelhante quando administradas a um hospedeiro, tal como distúrbio gástrico, tontura e semelhantes, quando administrado a um humano, e aprovado por um regulador agência do governo federal ou estadual ou listada na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.
[156] Uma "molécula de ácido nucleico isolada" significa um DNA ou RNA, de origem genômica, mRNA, cDNA ou de origem sintética ou alguma combinação dos mesmos que não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza ou está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza. Para os fins desta divulgação, deve ser compreendido que "uma molécula de ácido nucleico compreendendo" uma sequência de nucleotídeos em particular não abrange cromossomos intactos. Moléculas de ácido nucleico isoladas "compreendendo" sequências de ácidos nucleicos especificadas podem incluir, adicionalmente às sequências especificadas, sequências de codificação para até dez ou mesmo até vinte ou mais outras proteínas ou porções ou fragmentos das mesmas, ou podem incluir sequências reguladoras operativamente ligadas que controlam a expressão da região de codificação das sequências de ácidos nucleicos recitadas e/ou podem incluir sequências de vetor.
[157] A frase "sequências de controle" refere-se a sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada em um determinado organismo hospedeiro. As sequências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um sítio de ligação ao ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potencializadores.
[158] Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção está ligado operativamente ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de forma a facilitar a translação. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. Todavia, os potencializadores não precisam ser contíguos. A ligação é conseguida por meio da ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.
[159] Tal como utilizado neste documento, as expressões "célula", "linha celular" e "cultivo celular" são utilizadas indiferentemente e todas estas designações incluem a progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária em questão e cultivos dela derivadas, sem levar em conta o número de transferências. É também compreendido que nem toda a progênie terá um teor de DNA exatamente idêntico, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme triada ou selecionada na célula originalmente transformada, está incluída neste documento. Quando designações distintas forem pretendidas, ficará claro a partir do contexto.
[160] Em alguns aspectos, a invenção fornece vetores adeno-associados isolados (AAVs). Tal como utilizado neste documento em relação aos AAVs, o termo "isolado" refere-se a um AAV que foi isolado do seu ambiente natural (por exemplo, de uma célula hospedeira, tecido ou assunto) ou produzido artificialmente. Os AAVs isolados podem ser produzidos usando métodos recombinantes. Tais AAVs são referidos aqui como "AAVs recombinantes". Os AAVs recombinantes (rAAVs) têm preferencialmente capacidades de direcionamento específicas de tecido, de modo que um transgene do rAAV seja entregue especificamente a um ou mais tecidos predeterminados. A capsídeo de AAV é um elemento importante na determinação dessas capacidades de segmentação específica de tecido.
[161] Métodos para obter AAVs recombinantes com uma proteína de capsídeo desejada foram descritos (ver, por exemplo, Patente US n°7.906.111). Várias proteínas do capsídeo de AAV diferentes foram descritas, por exemplo, aquelas divulgadas em Gao, et al., J. Virology 78 (12):6381-6388 (junho de 2004);
Gao, et al., Proc Natl Acad Sci USA 100 (10):6081-6086 (13 de maio de 2003); e Patente US n° 7.906.111; Patente US n° 8.999.678. Para o empacotamento desejado dos construtos e métodos atualmente descritos, o vetor AAV9 e o capsídeo ou o vetor AAV2 e o capsídeo são preferidos. No entanto, é de notar que outros AAVs adequados, tais como rAAVrh.8 e rAAVrh.10 ou outros vetores semelhantes podem ser adaptados para uso na presente invenção. Tipicamente, os métodos envolvem a cultura de uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do capsídeo de AAV ou fragmento do mesmo; um gene rep funcional; um vetor de AAV recombinante composto por repetições de terminal invertidas de AAV (ITRs) e um transgene; e funções auxiliares suficientes para permitir o empacotamento do vetor de AAV recombinante nas proteínas do capsídeo de AAV.
[162] Os componentes a serem cultivados na célula hospedeira para empacotar um vetor de rAAV em um capsídeo de AAV podem ser fornecidos à célula hospedeira em trans. Alternativamente, qualquer um ou mais dos componentes necessários (por exemplo, vetor de AAV recombinante, sequências rep, sequências cap e/ou funções auxiliares) podem ser fornecidos por uma célula hospedeira estável que foi projetada para conter um ou mais dos componentes necessários usando métodos conhecidos pelos versados na técnica. Mais adequadamente, tal célula hospedeira estável conterá os componentes necessários sob o controle de um promotor induzível. No entanto, os componentes requeridos podem estar sob o controle de um promotor constitutivo. Ainda em outra alternativa, uma célula hospedeira estável selecionada pode conter componentes selecionados sob o controle de um promotor constitutivo e outros componentes selecionados sob o controle de um ou mais promotores induzíveis. Por exemplo, uma célula hospedeira estável pode ser gerada, a qual é derivada de células 293 (que contêm funções helper de E1 sob o controle de um promotor constitutivo), mas que contêm as proteínas rep e/ou cap sob o controle de promotores induzíveis.
[163] O vetor de AAV recombinante, as sequências de rep, as sequências de cap e as funções auxiliares para produzir o rAAV podem ser entregues à célula hospedeira de empacotamento usando qualquer elemento genético apropriado (vetor). O elemento genético selecionado pode ser administrado por qualquer método adequado, incluindo os descritos neste documento. Ver, por exemplo, Fisher et al, J. Virology 70: 520-532 (1993) e Patente US n°5.478.745.
[164] Em algumas modalidades, os AAV recombinantes podem ser produzidos utilizando o método de transfecção tripla (por exemplo, como descrito em detalhe na Patente U.S. n°6.001.650). Normalmente, os AAVs recombinantes são produzidos por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de AAV recombinante (compreendendo um transgene) a ser empacotado em partículas de AAV, um vetor de função helper de AAV e um vetor de função acessória. Um vetor de função acessório de AAV codifica as sequências de "função helper de AAV" (isto é, rep e cap), que funcionam in trans para replicação e encapsidação de AAV produtivos. Preferencialmente, o vetor de função helper de AAV suporta uma produção de vetor de AAV eficiente sem gerar vírions de AAV de tipo selvagem detectáveis (isto é, vírions de AAV contendo genes funcionais rep e cap). Exemplos não limitativos de vetores adequados para uso com a presente invenção incluem pHLP19, descrito na Patente US n°6.001.650 e o vetor pRep6cap6, descrito na Patente US n°6.156.303, a totalidade de ambos incorporados neste documento por referência. O vetor de função acessória codifica as sequências de nucleotídeos para funções celulares e/ou virais derivadas não-AAV sobre as quais o AAV é dependente para replicação (ou seja, "funções acessórias"). As funções acessórias incluem as funções necessárias para a replicação de AAV, incluindo, sem limitação, as frações envolvidas na ativação de transcrição do gene de AAV, splicing de mRNA de AAV de fase específica, replicação de DNA de AAV, síntese de produtos de expressão de cap e montagem de capsídeo de AAV. As funções acessórias baseadas em vírus podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos, tais como adenovírus, vírus herpes (diferente do vírus do herpes simples tipo 1) e vírus vaccinia.
[165] Tal como utilizado neste documento, os termos "AAV1," "AAV2," "AAV3," "AAV4" e semelhantes referem-se a vetores de AAV contendo ITRs de AAV1, AAV2, AAV3 ou AAV4, respectivamente, bem como proteínas de capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3 ou AAV4, respectivamente. Os termos "AAV2/1", "AAV2/8", "AAV2/9" e semelhantes referem-se a vetores de AAV pseudotipados contendo ITRs de AAV2 e proteínas de capsídeo de AAV1, AAV8 ou AAV9, respectivamente.
[166] Com respeito às células hospedeiras transfectadas, o termo "transfecção" é usado para se referir à absorção de DNA estranho por uma célula e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Uma série de técnicas de transfecção são geralmente conhecidas na técnica. Ver, e.g., Graham et al., Virology 52:456 (1973), Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nova York (1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986) e Chu et al., Gene 13:197 (1981). Tais técnicas podem ser utilizadas para introduzir um ou mais ácidos nucleicos exógenos, tais como um vetor de integração de nucleotídeos e outras moléculas de ácido nucleico, em células hospedeiras adequadas.
[167] Uma "célula hospedeira" refere-se a qualquer célula que abriga, ou seja capaz de abrigar, uma substância de interesse. Frequentemente, uma célula hospedeira é uma célula de mamífero. Uma célula hospedeira pode ser utilizada como receptor de um construto helper de AAV, um plasmídeo de minigene de AAV, um vetor de função acessória ou outro DNA de transferência associado à produção de AAVs recombinantes. O termo inclui a progênie da célula original que foi transfectada. Dessa forma, o termo uma "célula hospedeira", como usado neste documento, refere-se em geral a uma célula que foi transfectada com uma sequência de DNA exógena. É compreendido que a progênie de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total, como o parente original, devido a mutação natural, acidental ou deliberada.
[168] Com relação às células, o termo "isolado" refere-se a uma célula que foi isolada do seu ambiente natural (por exemplo, de um tecido ou sujeito). O termo "linhagem celular" refere-se a uma população de células capazes de crescimento contínuo ou prolongado e divisão in vitro. Muitas vezes, as linhagens celulares são populações clonais derivadas de uma única célula progenitora. É ainda conhecido na técnica que mudanças espontâneas ou induzidas podem ocorrer no cariótipo durante o armazenamento ou transferência de tais populações clonais. Portanto, as células derivadas da linha celular referida podem não ser exatamente idênticas às células ou culturas ancestrais e a linhagem celular referida inclui tais variantes.
Tal como utilizado neste documento, o termo "célula recombinante" se refere a uma célula na qual um segmento de DNA exógeno, tal como um segmento de DNA que conduz à transcrição de um polipeptídeo biologicamente ativo ou a produção de um ácido nucleico biologicamente ativo tal como um RNA, foi introduzido.
[169] O termo "vetor" inclui qualquer elemento genético, como um plasmídeo, fago, transpóson, cosmídeo, cromossomo, cromossoma artificial, vírus ou vírion, que é capaz de replicação quando associado aos elementos de controle apropriados e que pode transferir sequências de gene entre células. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e de expressão, bem como vetores virais. Em algumas modalidades, os vetores úteis são contemplados para serem aqueles vetores nos quais o segmento de ácido nucleico a ser transcrito está posicionado sob o controle transcricional de um promotor. Um "promotor" refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula ou máquinas sintéticas introduzidas, necessárias para iniciar a transcrição específica de um gene. As frases "operativamente posicionadas", "operativamente ligadas", "sob controle", ou "sob controle transcricional" significam que o promotor está na localização e orientação corretas em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação da RNA polimerase e a expressão do gene.
[170] O termo "vetor de expressão" ou "construto de expressão" ou "construto" significa qualquer tipo de construto genético contendo um ácido nucleico em que parte ou a totalidade da sequência de codificação de ácido nucleico é capaz de ser transcrita. Em algumas modalidades, a expressão inclui a transcrição do ácido nucleico, por exemplo, para gerar um produto polipeptídico biologicamente ativo ou RNA inibitório a partir de um gene transcrito.
[171] Tal como aqui utilizado, o termo "TK2" refere-se a um gene que codifica a timidina quinase 2 ou o produto de proteína correspondente. Os termos "TK2" e "timidina quinase 2" incluem formas de tipo selvagem do gene ou proteína TK2, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatêmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas TK2 de tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%,
71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína TK2 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 1), desde que a variante de TK2 mantenha a função da TK2 de tipo selvagem. Além disso, os termos "TK2" e "timidina quinase 2" podem se referir a proteínas de fusão ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, nos quais a TK2 está operacionalmente ligada a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "TK2" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por aquele versado na técnica.
Exemplo de sequência de aminoácidos de TK2 (SEQ ID NO: 1):
MGAFCQRPSSDKEQEKEKKSVICVEGNIASGKTTCLEFFSNATDVEVLTE PVSKWRNVRGHNPLGLMYHD ASRWGLTLQTYVQLTMLDRHTRPQVSSVRLMERSIHSARYIFVENLYRSG KMPEVDYVVLSEWFDWILRN MDVSVDLIVYLRTNPETCYQRLKKRCREEEKVIPLEYLEAIHHLHEEWLIKG SLFPMAAPVLVIEADHHM
ERMLELFEQNRDRILTPENRKHCP Exemplo de sequência de ácido nucleico de TK2 (SEQ ID NO: 2):
GCCAAGTTATGGGTGCGTTCTGCCAGCGTCCTAGCAGTGATAAAGAAC AGGAAAAAGAGAAAAAATCAGT GATCTGTGTCGAGGGCAATATTGCAAGTGGGAAGACGACATGCCTGG AATTCTTCTCCAACGCGACAGAC GTCGAGGTGTTAACGGAGCCTGTGTCCAAGTGGAGAAATGTCCGTGG CCACAATCCTCTGGGCCTGATGT ACCACGATGCCTCTCGCTGGGGTCTTACGCTACAGACTTATGTGCAGC TCACCATGCTGGACAGGCATAC TCGTCCTCAGGTGTCATCTGTACGGTTGATGGAGAGGTCGATTCACAG CGCAAGATACATTTTTGTAGAA AACCTGTATAGAAGTGGGAAGATGCCAGAAGTGGACTATGTAGTTCTG TCGGAATGGTTTGACTGGATCT TGAGGAACATGGACGTGTCTGTTGATTTGATAGTTTACCTTCGGACCAA TCCTGAGACTTGTTACCAGAG GTTAAAGAAGAGATGCAGGGAAGAGGAGAAGGTCATTCCGCTGGAAT ACCTGGAAGCAATTCACCATCTC CATGAGGAGTGGCTCATCAAAGGCAGCCTTTTCCCCATGGCAGCCCCT GTTCTGGTGATTGAGGCTGACC ACCACATGGAGAGGATGTTAGAACTCTTTGAACAAAATCGGGATCGAA TATTAACTCCAGAGAATCGGAA GCATTGCCCATAGGAGGCAAAAGGTCTATGGCTCATGTCTGAAAAATG CCTGCTGCTGCCAAGTTAGCTA TTGGGAGCAATCTGGAAAAACTTGCTCCCAGGAGGGCTTTGTGTCTGG CCAGCTTGATTTTCCTAATGGT CTCATCTCCTTTGCTAGTGTCTTTGTCATGCGTCTCTGGCCCTCGTGG GTAAATGACAAACGGGACCAAT GGGTTTGCCAAGCCCTTTGCTGTTCGCAGCCTCACATTCCCCCGGTGC CTCTCCCATGGCTTTGTGCTGC TGAGTCGCTCTCATGAAGCCCTTAGGGAGAGCACCTGTTGTGTGCCTG ACACCACGCTGGAGCTGTGTAC CAATCGTCTCAGCCTTCATTAGGAGGCCGAGGTAGGAGTCTTATATCC CAGGTGAGGAATTTGAAGCTCA GAAAGGTTGAGGGGCTCCCCAGAGGTCACACAGCCTGTGTGCAGTGG AGCTGGCACCATTCAGACTTTCA GCCGACTCAGCAACTTTCCCTTGCCCTGGGCTGCCTCCTCCTGAGAG CTGTTCCCCACCGCCCTGCCTCT TCCGGTTGGAGGCTCTCATGTCTCTTTGGGGAGAGCTGGCAGTGTGC GGAGCTGATAACATTTTCCCAAT ATTGAGCAGTTCCCAAGGACAGTCAGCATTTCTAGACTTCCACAAAATT ATGCTGCATTTGGCTGGAGCC CGGTGTTCAGTGGTTTCCCTGCCCGAGGTCGCTGCAGCCCCATCTAC CACATCTTCATGTGGACATTGAG ATTCACATGCTGGCTCCTGAAGGGTGCTCAGTCTCCTTGGTGATTAAG GTCCTGCTTGAACTGCTGCCAA CTCCATGTCAGGGAAGTCGCTTTTGGTGCCTGGCTGGTTTGCCCAGAG CCAAGCTGGGGCAAGGGGCAGC CAGCCCTGGCTTCCAAGGCTCCCGTACTGTCTGTGTCCTTGTATAAGG AGCTTTGCTCTTGGAATTACTG AAAGTCTGTGGCCCAAGAGAGAGACACAAGTGGCCTTAAGTCTTTTTG AAGTGTTATTTCATCCAGGGAA ATGCCTCGAGCCATAGAGCCTGAAATCATCTTTGTTGGCTCAGAAAATA CCTTAGCTTCACTCAGCTGGA CTGCATTGAAGGCGAGGCTGCCCCTTGGATCAAGCAGAAAACAAGAG AAAGAAAGAACGTTCCCTTTGGG GATAGTCTGGAAAGTTGGGATTTGCAAATAAAGGCTCTGGAAGCATTG CTGGTCCTGAAGCTTTGGAGGT GGGCAGAGAGAGCTTCAAGAAGACTAGATGCAAACCCTGGAAAGGAT TAAGGCTCAACTCTGGAGAAACA GGCCACAGCCTCTCAGAGCAGCTGTTGGCTGTAAATAGAGGTAGCAA GGCCGCTCCCAGGCCCCTGTGAG TGTGGGCACCTGTGCATGCAATGCTCCGACTCTGCAGAGGTGCCAAG TGCCCCTGCTGGGCCAGTCCCAG AGAGTTAGGAAGTCAAGGCCTGCAACTCCTGGTTCTTCCTGTTTGGAC CAGTTCTTGTGCCATTGGCAGG ATGAGAGGCAGCAGCCAGGCGGGAGCTGTGTCTAGCAGCACCTGTAG CCCACGTGCTGCTAATTAGCTGG AAAACTGGCGAAGGCAGAACCTTTGCTACCAGGAATCTTGACATGTGG GGTCTGTCTTTGAGAATTTGTA AATGAACAGTCCAATATTTCCTCTCGGCTCATTTTGCACATCCATTTTTG GGGAAATGTGATTTCTCTCT CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCTAAGGCACAATCTCAAGAGGTCCTGAG ACCACGTACCCATGATTTTT TTCTTGCTCTGTGATACCCAATAACTCCTTCACCTAAGCCCTGTTGTTG ATTTTGAAGTGCTTCCTAGGC CAGTGATTTTAGCTTCTGCCAGCTGCTTTTGCCAGTAGATTAACGTGTT TTTATTTTTCAAACTCCGTGT TTCCTAACGTGGAGTGTATGGGTCTAAGAGAGCCTGCTGTCCTCCCTG CCTTCCACCTTGGAGAGGAGGC TGGACGCATCAGCAGTGGCCAGGGCAGGTCGCAAAATCTCCCAGCCT AGAGACCACACCTGAAACGGCTG AAGCCAGCTTGCACAAGGGCTGCTGTCCCTCTGCGGCAGGCAGAGCT GGTGGGGGCAGGGGTCACAGAGC AGTCATAGACACCATGGACCAGGGCAGGAGAAGGGCAGATGGCACAT GGGCACAACAGGGCCTTGTCCTT AGAGCACTGGGGGGTCATGGCTGGGAGGGGCATGGCAGGGGCTGGC ATCCCTGTAGAGCCAGAGGGGCCA CCCAGGGCAGTGACATTCCAGATATGTTGGGCTCACCTCATCCTTGCT GTGAGACTGGAGTTCCATGGGG ACATGAAGTCAGTACACCGCAGAGCTGCTCAGCTGCTCTACCTCTCGC TGACTTTTTTGTTGCACATATA CATTTTCTTTCAATTAGCATTTATTTCAGCTTTTATTTAAGCTTTTTGACA GTACATGTAAAATATATGA TTATAACCATTTAAAAATACCTTATGTACCTGGTTTTTTTTGGAAACTAG ATAGAAATATATTTATCTTT TACATAAAAGAAGTGTGTAGTGGGGTGGTCCAGGGCTTTGTGGTGGCT TAGTGGCCATCGGGGTCCCAGG CTCTTCCCACCTTTCTCTTTTGGGTCCACCTCTTGGCTCCTGGCTTCCT TCCTCTGGGGCCTGACTGTCC AGGATGGCAGCTGGAGCTCCTGCTCTGGGCACGGTTGGCATCAGAGC CCACTGCTCCCCATCCACTCTTT AATCCAGATGCTGGTAATGTCCCTTTCCAAGGCATAACTAAGATAAGCT GGAAGGTTCTTACGAGGCTTT GCTAGAGGCCCTGGGAGGTGGGGGGAAAGGCAAGAGGGCAGTGCCC ACCCATAGACCGGGTCACATGACC TGGCATCAGCGCCGTGGGGTCCTTTGGGCTTCACCTCCCTCTCCCCT CTGCCCCCACGTCATCCCACCCT CATCCTCACCCTCACCATTCCCATCCCGTACCGTAATGTCCCTTGCAA GGCCTAACTCTGTGAGGAATGA AACCACCTCATCCTTGTTCCAATAACATGAGTGACCGAATTTACAAACG AGTGAATGTGGACCTCTGGAA ACATTACCCAGCTTGTTTTTACTTTTCACTTTCTCTTTCTGCCCCTTTCA TTTCCGTAGGAGCCCTTTAC CTAGATGAGAAGTGTCCCCCCGCCTGGGGAATATATCAGTCAGAACAA TCTTCCTGCAGACATGCACCAT TAGACCCGAGTGACGGTGGTGCCATTTAAACCTCAGAGCAGGTAAAAG GTGGTCCTGAAACCTGTCTACC CACAGGGTGCTATGGAATCTGAATCACTTCTTTTTTCCTAGAGCCCTGG GGTGGGGAGCTCCCTCAAGTG TTCACATGTGTGTGGAATGAGGAACACCCATCTCCTTGGCCCTCTCCA CCCTGAAGAGTTAGTTATTAAA ATAATTGGCAAGCTCTTGCAAATGTCAGTCATCCATTGTTCAGAATGGA ATAGCAATAATACATCCCTGG CTGCCCTGGGCTTGGCCAGGATTACTCACTGAAGGCCTCAGGGTTACT GGCACACACTTTCTTTTCCTAA TAATCCCATCCCCTCAGCTTTCCTAAGGCTAGAGTGAATTTCGTGTTCC TTTAGTTTACATAAGATGGTG AACTTGGCAAAAGCTATCATTAAACAGAAGCTAAGAGAAAGCCTATGTC GTGGAATCCAGAATGGGTATT GCCATTCACTGCTGTCCACAGAAGCTGTCTTGAATTTCTTTCTGTGTCT TTTCTTTTTTTTTCTTTAAGA CTGTTGTTTACCAGACTGGGCTCTGTGGAACACAGGTGTCCTGGGAGA TGGTTAATCATTACAAAATATT GGTAACAATCTAAAGATGCATACATAAGAGAGTGGTCAAATAAACCATT TTCCATTCA
[172] Tal como aqui utilizado, o termo "dGK" refere-se a um gene que codifica a desoxiguanosina quinase ou o produto de proteína correspondente. Os termos "dGK" e "deoxiguanosina quinase" incluem formas de tipo selvagem do gene ou proteína dGK, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatêmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas dGK de tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína dGK do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 3), desde que a variante de dGK mantenha a função da dGK de tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "dGK" e "desoxiguanosina quinase" podem referir-se a proteínas de fusão, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, em que o dGK estáoperacionalmente ligado a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "dGK" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de dGK exemplar (SEQ ID NO: 3):
MAAGRLFLSRLRAPFSSMAKSPLEGVSSSRGLHAGRGPRRLSIEGNIAVG KSTFVKLLTKTYPEWHVATE PVATWQNIQAAGTQKACTAQSLGNLLDMMYREPARWSYTFQTFSFLSRL KVQLEPFPEKLLQARKPVQIF
ERLHFEALMNIPVLVLDVNDDFSEEVTKQEDLMREVNTFVKNL Sequência de ácido nucleicos de dGK exemplar (SEQ ID NO: 4):
AACGGTGCGCTGGAGCGAGTGAGCAGCGATACCTAGGGCGGAAGTG CTCTCGGCGGAAGTGATCGCTGTG TGAATCGTGGGTGGGATGGCCGCGGGCCGCCTCTTTCTAAGTCGGCT TCGAGCACCCTTCAGTTCCATGG CCAAGAGCCCACTCGAGGGCGTTTCCTCCTCCAGAGGCCTGCACGCG GGGCGCGGGCCCCGAAGGCTCTC CATCGAAGGCAACATTGCTGTGGGAAAGTCCACGTTTGTGAAGTTACT CACGAAAACTTACCCAGAATGG CACGTAGCTACAGAACCTGTAGCAACATGGCAGAATATCCAGGCTGCT GGCACCCAAAAAGCCTGCACTG CCCAAAGTCTTGGAAACTTGCTGGATATGATGTACCGGGAGCCAGCAC GATGGTCCTACACATTCCAGAC ATTTTCCTTTTTGAGCCGCCTGAAAGTACAGCTGGAGCCCTTCCCTGA GAAACTCTTACAGGCCAGGAAG CCAGTACAGATCTTTGAGAGGCTCCACTTTGAGGCTCTGATGAACATT CCAGTGCTGGTGTTGGATGTCA ATGATGATTTTTCTGAGGAAGTAACCAAACAAGAAGACCTCATGAGAGA GGTAAACACCTTTGTAAAGAA TCTGTAACCAATACCATGAAGTTCAGGCTGTGATCTGGGCTCCCTGAC TTTCTGAAGCTAGAAAAATGTT GTGTCTCCCAACCACCTTTCCATCCCCAGCCCCTCTCATCCCTGGAGC ACTCTGCCGCTCAAGAGCTGGT TTGTTAATTATTGTTAGACTTTGCCATTGTTTTCTTTTGTACCTGAAGCA TTTTGAAAATAAAGTTTACT TAAGTTATGCTTGTTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[173] Conforme utilizado neste documento, o termo "p53R2" refere-se a um gene que codifica a subunidade induzível por p53 de ribonucleotídeo redutase ou o produto de proteína correspondente. Os termos "p53R2" e "subunidade induzível por p53 de ribonucleotídeo redutase" incluem formas do tipo selvagem do gene ou proteína p53R2, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas p53R2 do tipo selvagem e ácidos nucleicos que os codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína p53R2 de tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 5), desde que a variante p53R2 mantenha a função de p53R2 do tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "p53R2" e "subunidade induzível por p53 de ribonucleotídeo redutase" podem se referir a proteínas de fusão ou ácidos nucleicos que os codificam, em que p53R2 estáoperacionalmente ligado a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "p53R2" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos p53R2 exemplar (SEQ ID NO: 5):
MLLLRLPPHRSHASPLDCKLQDRCRKCYSPRSGQACPPALAAAWLRRCE RRGGRPRGGRRKELTLGLRPA RCSAPGPAKDDAWRPQAGRSSSDTNESEIKSNEEPLLRKSSRRFVIFPIQ YPDIWKMYKQAQASFWTAEE VDLSKDLPHWNKLKADEKYFISHILAFFAASDGIVNENLVERFSQEVQVPE ARCFYGFQILIENVHSEMY SLLIDTYIRDPKKREFLFNAIETMPYVKKKADWALRWIADRKSTFGERVVAF AAVEGVFFSGSFAAIFWL KKRGLMPGLTFSNELISRDEGLHCDFACLMFQYLVNKPSEERVREIIVDAV KIEQEFLTEALPVGLIGMN CILMKQYIEFVADRLLVELGFSKVFQAENPFDFMENISLEGKTNFFEKRVS EYQRFAVMAETTDNVFTLD
ADF Sequência de ácidos nucleicos de p53R2 exemplar (SEQ ID NO: 6):
ATGAGGTAAATGTTGCTGTTGCGTCTTCCCCCTCACCGCAGTCACGCC AGCCCGTTAGATTGCAAGTTGC AGGACCGCTGTAGGAAATGTTATTCGCCGCGGTCAGGACAGGCCTGT CCGCCCGCCCTCGCCGCAGCCTG GCTTCGTCGTTGCGAGCGCCGGGGAGGCCGTCCCCGGGGAGGGCGG AGGAAGGAGCTGACTTTGGGTTTG CGTCCCGCTCGCTGCTCTGCCCCGGGGCCAGCCAAGGACGACGCTT GGAGGCCTCAGGCCGGGAGATCAT CTTCAGACACCAACGAAAGTGAAATAAAGTCAAATGAAGAGCCACTCC TAAGAAAGAGTTCTCGCCGGTT TGTCATCTTTCCAATCCAGTACCCTGATATTTGGAAAATGTATAAACAG GCACAGGCTTCCTTCTGGACA GCAGAAGAGGTCGACTTATCAAAGGATCTCCCTCACTGGAACAAGCTT AAAGCAGATGAGAAGTACTTCA TCTCTCACATCTTAGCCTTTTTTGCAGCCAGTGATGGAATTGTAAATGA AAATTTGGTGGAGCGCTTTAG TCAGGAGGTGCAGGTTCCAGAGGCTCGCTGTTTCTATGGCTTTCAAAT TCTCATCGAGAATGTTCACTCA GAGATGTACAGTTTGCTGATAGACACTTACATCAGAGATCCCAAGAAAA GGGAATTTTTATTTAATGCAA TTGAAACCATGCCCTATGTTAAGAAAAAAGCAGATTGGGCCTTGCGAT GGATAGCAGATAGAAAATCTAC TTTTGGGGAAAGAGTGGTGGCCTTTGCTGCTGTAGAAGGAGTTTTCTT CTCAGGATCTTTTGCTGCTATA TTCTGGCTAAAGAAGAGAGGTCTTATGCCAGGACTCACTTTTTCCAATG AACTCATCAGCAGAGATGAAG GACTTCACTGTGACTTTGCTTGCCTGATGTTCCAATACTTAGTAAATAA GCCTTCAGAAGAAAGGGTCAG GGAGATCATTGTTGATGCTGTCAAAATTGAGCAGGAGTTTTTAACAGAA GCCTTGCCAGTTGGCCTCATT GGAATGAATTGCATTTTGATGAAACAGTACATTGAGTTTGTAGCTGACA GATTACTTGTGGAACTTGGAT TCTCAAAGGTTTTTCAGGCAGAAAATCCTTTTGATTTTATGGAAAACATT TCTTTAGAAGGAAAAACAAA TTTCTTTGAGAAACGAGTTTCAGAGTATCAGCGTTTTGCAGTTATGGCA GAAACCACAGATAACGTCTTC ACCTTGGATGCAGATTTTTAAAAAACCTCTCGTTTTAAAACTCTATAAAC TTGTCATTGGTAAATAGTAG TCTATTTTCCTCTGCTTAAAAAAAATTTTAAGTATATCCTTTAAAGGACT GGGGGTTTGCTCAAAAGGAA ATCCAAAACCTATTCTAAACAATTTGCATTTATATAATTTTCCTGTTTAAC AACAAGAGTGTGACCTAAA TGCTTTTGTCTTGTCACTGAAATAAAAGATGGCATTATGTGGTTAAGAG CATGGGGCGAGGGGTCAGACA TGAGTCTAAGGTTCTGCCCTTACTCCAGTGTGTGACCCTTGGCAAGTC AGTTAATCTTGGTAAACCTCGG TGTACTTATCTTTAAAATGGGAGTAATAGTAGGTCCTAAATTCATAGAG TGGATATTAGGATTAGGATGC AAAAATAAATGCTTAACCAACACTACTACTGTTAGCACCACTACTAATTA TCATTCATTGATAATATTAA TTGCAATGATGTTGTAATAAAATACTCTCATTTCCTTAAAATAATTGTGA TTCTAGGTCCTAGGATCTAG AATTAGATCTTTGTATTTTTAATGCTTAGGGGAAGAATATAAGTATCTCC TTAAAAAGAACATAATTCTC ATTCACGCAAGAATAAGTTCTTTGAATTCCTTAGTATGTAGTGAAGAAA ATTTAGTTGTTAGTTGCTTTG GGAAGCCTACTTATGGAGTGGAAACCAGGAGGTTATCATGGTAGTTGA CCTTATAAGAAAAATGATTCTT CTTCAGAAATTAAAAACATAACTATTGCCAGATTTAGCTCTGGAATGTTT AGAATCAGGCTAGAATAGCA TTTTCCAAAGAATATTCTAAGAGCTATTAGCTCCTCTAGATATTTTTTTG GGGGAAAAAGGGGATTCTGT GGTCAGATGAGTTTGGGAAATGCTGAACACTTCATTCTTCTTTAGCAAG TACAGTCAGTACATCAAAGAC TGAGCAGTTCAGTGGTACATAAATTTATCTCGCCCTGCATATTCCCAAC ATACTTAACACAGATGTTTTT TACCTGTTAACATCTCACCCAGCTAGTGTTCCTCAGAACAAAGATTGGA AAAAGCTGGCCGAGAACCATT TATACATAGAGGAAGGGCTTATGGACTGAGAAAGGGAGAACATGGTAG GGATTATTGAATCATTTCAAAT TTATACCAGCCTGAATAGTGTACCAGCAATTGACTTAGGCTGTGTTTCT TTATGGTTTTAAAACTCTTGA GCTGTTATAAGAGATAGTTCTTTTAATGTGACTATGCAACATGATAGCC AATGGTGAGGGAAAAGGAGGT TTCTCTAGAAGAGTCTGATGAAAGGCCGGGAACCAAGGTTTTTGAGAA GTCTGCCCCTATTTATTTTTAG TAAGTATCAAGAGGTAGCCTGAGCCTAGTTAGAGTTAGACCTGTCTTT GGATGAAGAAGTCTTAATACTG AAATACTGAATTTTTAATACATTATTATTTGGTATTCTGTATACCCCTTCA AGCAGTTGTTTCCCATTCC CAACAAACTGTACTTTATACAATTCTGGATGCTAAAACTTAGAGATTTTC TCTTTGCATAAATTTTGGCT CCATTCTTTCCATAACAATCTAATCAAAACTGGGAGTTCTCAAGTGAAT GCAAAAGGAGCAGGCCATAAC TTTATTTGTTAGATACACTGTCAGAAACTTGAGATCTTTTGGCCTATGAT AATACCATTAATTTTTGCAT TGCTTCAGTTTGCCAAGTGTTTTTACATCATCTCATTTGATCTCAAAACA GCTTGACAGAGCAACTGTTA TTGAAATATTACAGATGGAAAGAATGAGGCTCAGGGAAGTTAAATGACT TGGCCAAGATCTGCTCATCGT CACTGTCTGTACAGTATTTTTTTTTAGAGGTTGTAATGTCTCAGATTTAG TCCTTTACCATCTATGTTGA TTTGCTTTTGTCTATTTCCTCATTAATTGAATATACTTTAAATATATATAT TAAAGTATCAAAATATAGA GAGACATTTGAACTGTATTCAGGTAATATGTTTAAAGATATTTATATATT GCCATACAAAAACTTAACAT TTAAAACTGATAATATCTGTAATGACATCAGAATGAAAGAAAAAAAATTG TACAGTGTATATTCCTTTGT TTTGAATCCAAATCTTTTTCATAGGTAATGACAGATGCCTTAATGTGAA GCTTATTTATAATAGCAATAA ACCTAACTGGATTTGGATGAAGAAGTCTTAATACTGACATACTGGATTT TTAATGCACTGGTTTGTTATT TGGTATTCTATCTCTTTTTCCAGGCCTCCAGGTTGCACATTTATTTATTA TGTTCAATACTTTGGTTCTT AGTTCTTAAAGAATCAAGAAGTTGTGTAATCTTTTAAAAATATTATCTTG CAGATAAAGAAAAAAATTAA GAGTGTGTTTACAACTGTTTTCTCTTTTTTACAGTACATGTATTTAAATC ATTGCTATAATAAAGTTAAG TTCATTAGGAATATAAAAACTTGCAGTTCTATGATAGATTGCATTTATTA AAAATGTTTCATTGTATCAC ATAGAAATATGGCCAGGAAGGACTTGAGAAGACAGTTTGATCCATTGC TTTTAGACAGGACTGGGTTTTG CTGTCCAATTATATACAATAATAGTTTTTCTTACAACTAAGCTGGCCCCA GCCTTGTCTTGATATTAATA CATGAAATTTTTATAATTGTCTCATTGTCTCATTTAGAAACATCCATATTT TTCTGCTTTTTCTATTGCC ATTTTTTATTTGTGCATGAATTGATTATTGAGAAAATGTAGCAGTTTGCA TATTTAAAAATTAATCATTT TGCATTTTACATTTAAATATGCTAACATCACTGTCATAGAATTCCCAAAT TTCATTTGTAGATACTGAAC TAAGGGCTAATGTCAGGAGCTGATTTTTAATGATAAAGCTGCAGATGG GCTAAATAAAAGCCAAATTAAT CCTACAATCAGGTATTATGTTTTTAAACCAAGTTGAGTGAATTGGTAGT GGACTTGGGAAATCTTCCCCA GCAGAATCTGGATGAATGGCACAGAATTGAAATCTCTTTGTTTCCCACC ATTTCCCTTTAAGTGCTCTGC TCCTTTGTAAAAAGTTAAAGATTTGAAAGAGAATCTCATATTCCCGAGG CATTAGGAAGAAAGGATTTAA TCCCTTCAATTTGGGGCTTAATCTTGTTTAAAAAAATGTAAGTGAAGAT GGAAGGCTGGAGAGAATGATT GCTTTTTGTACAGTTAAATAAGGTCACAATATTCTTACATACTTTGTTTT ACAACTGTGTTTTCATTTTT TCAAATGTCTGGCCATTTAGCAAAGTTATTTACTATTTACTGTGTACATA GAAAGCTTTATTATGTGTGG TGTATCTAAATTTTTTTTGCTGAAATACATTATGGTCAATCAAGCCAAGC CTGCATGTACAGAATTTGTT TTTTTTTCAAATAAATTAGTTGTTTTCTTATTTTTTTGGCTTAGTATGTTG AAATAAACTATGGTATCTT CATCATTTTGTACATTTCCTTTTTGAGGAAGGTTTCTTTATAAGTGCAAG GGCTACCCTAATAAAGGAAT GTATATACTTACT
[174] Conforme utilizado neste documento, o termo "TP" refere-se a um gene que codifica a timidina fosforilase ou o produto de proteína correspondente. Os termos "TP" e "timidina fosforilase" incluem formas de tipo selvagem do gene ou proteína TP, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas TP do tipo selvagem e ácidos nucleicos que os codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína TP do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 7), desde que a variante TP mantenha a função de TP do tipo selvagem. Além disso, os termos "TP" e "timidina fosforilase" podem referir-se a proteínas de fusão, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, em que a TP está operacionalmente ligada a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "TP" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de TP exemplificativa (SEQ ID NO: 7):
MAALMTPGTGAPPAPGDFSGEGSQGLPDPSPEPKQLPELIRMKRDGGRL SEADIRGFVAAVVNGSAQGAQ IGAMLMAIRLRGMDLEETSVLTQALAQSGQQLEWPEAWRQQLVDKHSTG GVGDKVSLVLAPALAACGCKV PMISGRGLGHTGGTLDKLESIPGFNVIQSPEQMQVLLDQAGCCIVGQSEQ LVPADGILYAARDVTATVDS LPLITASILSKKLVEGLSALVVDVKFGGAAVFPNQEQARELAKTLVGVGASL GLRVAAALTAMDKPLGRC VGHALEVEEALLCMDGAGPPDLRDLVTTLGGALLWLSGHAGTQAQGAAR VAAALDDGSALGRFERMLAAQ GVDPGLARALCSGSPAERRQLLPRAREQEELLAPADGTVELVRALPLALV LHELGAGRSRAGEPLRLGVG AELLVDVGQRLRRGTPWLRVHRDGPALSGPQSRALQEALVLSDRAPFAA
PSPFAELVLPPQQ Sequência de ácidos nucleicos de TP exemplar (SEQ ID NO: 8):
CGACTGCCGAGCTCCGCCCTCCAGGCGGCCCCACCCGCCTGCCGTC CTGGGGCGCCGCCGCCCCGCCGCC GGCAGTGGACCGCTGTGCGCGAACCCTGAACCCTACGGTCCCGACCC GCGGGCGAGGCCGGGTACCTGGG CTGGGATCCGGAGCAAGCGGGCGAGGGCAGCGCCCTAAGCAGGCAT CCCCGCAGGCCCGGAGCGATGGCA GCCTTGATGACCCCGGGAACCGGGGCCCCACCCGCGCCTGGTGACTT CTCCGGGGAAGGGAGCCAGGGAC TTCCCGACCCTTCGCCAGAGCCCAAGCAGCTCCCGGAGCTGATCCGC ATGAAGCGAGACGGAGGCCGCCT GAGCGAAGCGGACATCAGGGGCTTCGTGGCCGCTGTGGTGAATGGG AGCGCGCAGGGCGCACAGATCGGG GCCATGCTGATGGCCATCCGACTTCGGGGCATGGATCTGGAGGAGAC CTCGGTGCTGACCCAGGCCCTGG CTCAGTCGGGACAGCAGCTGGAGTGGCCAGAGGCCTGGCGCCAGCA GCTTGTGGACAAGCATTCCACAGG GGGTGTGGGTGACAAGGTCAGCCTGGTCCTCGCACCTGCCCTGGCG GCATGTGGCTGCAAGGTGCCAATG ATCAGCGGACGTGGTCTGGGGCACACAGGAGGCACCTTGGATAAGCT GGAGTCTATTCCTGGATTCAATG TCATCCAGAGCCCAGAGCAGATGCAAGTGCTGCTGGACCAGGCGGGC TGCTGTATCGTGGGTCAGAGTGA GCAGCTGGTTCCTGCGGACGGAATCCTATATGCAGCCAGAGATGTGA CAGCCACCGTGGACAGCCTGCCA CTCATCACAGCCTCCATTCTCAGTAAGAAACTCGTGGAGGGGCTGTCC GCTCTGGTGGTGGACGTTAAGT TCGGAGGGGCCGCCGTCTTCCCCAACCAGGAGCAGGCCCGGGAGCT GGCAAAGACGCTGGTTGGCGTGGG AGCCAGCCTAGGGCTTCGGGTCGCGGCAGCGCTGACCGCCATGGAC AAGCCCCTGGGTCGCTGCGTGGGC CACGCCCTGGAGGTGGAGGAGGCGCTGCTCTGCATGGACGGCGCAG GCCCGCCAGACTTAAGGGACCTGG TCACCACGCTCGGGGGCGCCCTGCTCTGGCTCAGCGGACACGCGGG GACTCAGGCCCAGGGCGCTGCCCG GGTGGCCGCGGCGCTGGACGACGGCTCGGCCCTTGGCCGCTTCGAG CGGATGCTGGCGGCGCAGGGCGTG GATCCCGGTCTGGCCCGAGCCCTGTGCTCGGGAAGTCCCGCAGAACG CCGGCAGCTGCTGCCTCGCGCCC GGGAGCAGGAGGAGCTGCTGGCGCCCGCAGATGGCACCGTGGAGCT GGTCCGGGCGCTGCCGCTGGCGCT GGTGCTGCACGAGCTCGGGGCCGGGCGCAGCCGCGCTGGGGAGCC GCTCCGCCTGGGGGTGGGCGCAGAG CTGCTGGTCGACGTGGGTCAGAGGCTGCGCCGTGGGACCCCCTGGC TCCGCGTGCACCGGGACGGCCCCG CGCTCAGCGGCCCGCAGAGCCGCGCCCTGCAGGAGGCGCTCGTACT CTCCGACCGCGCGCCATTCGCCGC CCCCTCGCCCTTCGCAGAGCTCGTTCTGCCGCCGCAGCAATAAAGCT CCTTTGCCGCGAAAAAAAAAAA
[175] Conforme utilizado neste documento, o termo "SUCLA2" refere-se a um gene que codifica a subunidade beta formadora de ADP de succinato CoA ligase ou o produto de proteína correspondente. Os termos "SUCLA2" e "subunidade beta formadora de ADP de succinato CoA ligase" incluem formas do tipo selvagem do gene ou proteína SUCLA2, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas SUCLA2 do tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína SUCLA2 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 9), desde que a variante SUCLA2 mantenha a função de SUCLA2 do tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "SUCLA2" e "subunidade beta formadora de ADP de succinato-CoA ligase" podem referir-se a proteínas de fusão, ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas, em que a SUCLA2 está operacionalmente ligada a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida, ou agente terapêutico. O termo "SUCLA2" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de SUCLA2 exemplar (SEQ ID NO: 9):
MAASMFYGRLVAVATLRNHRPRTAQRAAAQVLGSSGLFNNHGLQVQQQ QQRNLSLHEYMSMELLQEAGVS VPKGYVAKSPDEAYAIAKKLGSKDVVIKAQVLAGGRGKGTFESGLKGGVKI VFSPEEAKAVSSQMIGKKL FTKQTGEKGRICNQVLVCERKYPRREYYFAITMERSFQGPVLIGSSHGGV NIEDVAAESPEAIIKEPIDI EEGIKKEQALQLAQKMGFPPNIVESAAENMVKLYSLFLKYDATMIEINPMV EDSDGAVLCMDAKINFDSN SAYRQKKIFDLQDWTQEDERDKDAAKANLNYIGLDGNIGCLVNGAGLAMA TMDIIKLHGGTPANFLDVGG GATVHQVTEAFKLITSDKKVLAILVNIFGGIMRCDVIAQGIVMAVKDLEIKIPV VVRLQGTRVDDAKALI
ADSGLKILACDDLDEAARMVVKLSEIVTLAKQAHVDVKFQLPI Sequência de ácidos nucleicos de SUCLA2 exemplar (SEQ ID NO: 10):
CCGCCTGTCGCCTGTGCGCCTGCGCGCGGCGCCGAGGGGACGGGGT CCGACTCAGAAATGGCGGCCTCCA TGTTCTACGGCAGGCTAGTGGCCGTGGCCACCCTTCGGAACCACCGG CCTCGGACGGCCCAGCGGGCTGC TGCTCAGGTTCTGGGAAGTTCTGGATTGTTTAATAACCATGGACTCCAA GTACAGCAGCAACAGCAAAGG AATCTCTCACTACATGAATACATGAGTATGGAATTATTGCAAGAAGCTG GTGTCTCCGTTCCCAAAGGAT ATGTGGCAAAGTCACCAGATGAAGCTTATGCAATTGCCAAAAAATTAG GTTCAAAAGATGTCGTGATAAA GGCACAGGTTTTAGCTGGTGGTAGAGGAAAAGGAACATTTGAAAGTGG CCTCAAAGGAGGAGTGAAGATA GTTTTCTCTCCAGAAGAAGCAAAAGCTGTTTCTTCACAAATGATTGGGA AAAAATTGTTTACCAAGCAAA CGGGAGAAAAGGGCAGAATATGCAATCAAGTATTGGTCTGTGAGCGAA AATATCCCAGGAGAGAATACTA CTTTGCAATAACAATGGAAAGGTCATTTCAAGGTCCTGTATTAATAGGA AGTTCACATGGTGGTGTCAAC ATTGAAGATGTTGCTGCTGAGTCTCCTGAAGCAATAATTAAAGAACCTA TTGATATTGAAGAAGGCATCA AAAAGGAACAAGCTCTCCAGCTTGCACAGAAGATGGGATTTCCACCTA ATATTGTGGAATCAGCAGCAGA AAACATGGTCAAGCTTTACAGCCTTTTTCTGAAATACGATGCAACCATG ATAGAAATAAATCCAATGGTG GAAGATTCAGATGGAGCTGTATTGTGTATGGATGCAAAGATCAATTTTG ACTCTAATTCAGCCTATCGCC AAAAGAAAATCTTTGATCTACAGGACTGGACCCAGGAAGATGAAAGGG ACAAAGATGCTGCTAAGGCAAA TCTCAACTACATTGGCCTCGATGGAAATATAGGCTGCCTAGTAAATGGT GCTGGTTTGGCTATGGCCACA ATGGATATAATAAAACTTCATGGAGGGACTCCAGCCAACTTCCTTGATG TTGGTGGTGGTGCTACAGTCC ATCAAGTAACAGAAGCATTTAAGCTTATCACTTCAGATAAAAAGGTACT GGCTATTCTGGTCAACATTTT TGGAGGAATCATGCGCTGTGATGTTATTGCACAGGGTATAGTCATGGC AGTAAAAGACTTGGAAATTAAA ATACCTGTTGTGGTACGGTTACAAGGTACACGAGTCGATGATGCTAAG GCACTGATAGCGGACAGTGGAC TTAAAATACTTGCTTGTGATGACTTGGATGAAGCTGCTAGAATGGTTGT AAAGCTCTCTGAAATAGTGAC CTTAGCGAAGCAAGCACATGTGGATGTGAAATTTCAGTTGCCAATATG ATCTGAAAACCCAGTGGATGGC TGAAGGTGTTAAATGTGCTATAATCATTAAGAATACTGTGTTCTGTGTTA TTGTTCTTTTTCTTTTTAGT GTGTGGAGATTGTAATTGCCATCTAGGCACACAAACATTTAAAAGGATT TGGACTGCATTTAATTGTACC ATTCAGAATGGACTGTTTGTACGAAGCATGTATAATGCAGTTATCTTCT TTCTTTTGTCGCAGCCAGTCT TTTTTGCTTCTCCTACAAAACGTAACTTGCAATTTGCCAGTTTATTATTG TTGGATACAAAGTTCTTCAT TGATAAGAGTCCTATAAATAAGATAAATACGAAGATAAAGCTTTATTCTT TAGTGTTAAAATACAGTATA TCTAATAACTAGCCTCATTAGTAGAGCAGTATATTAAAACAATGTTTTAT GTAAAAAGTGTTTATCTTCA GCACCAAATACATGATAAATGTATCAATCACTATTTATAAACAGAGCTTT CAAACACTCCTCAGAATATT CTTCTAAGTATTTTGATGAAGTAACTTTGTAATTATTTGAACATTGTTTTA ATCATTAGGAAACACTGAT TAACTGCAAGTCTTCATGATTCTGTCATATTAAGAAACACCTGTAGGTT TGCTTCAAATAAAGGCATATA TACCAAGGACTTACAGACAAAATTAAGAATGTCAATTTAAGTTAATAAAA ATCTCCCAATATGAAAAAAA AAAAAAAAAAAA
[176] Conforme utilizado neste documento, o termo "SUCLG1" refere-se a um gene que codifica a subunidade alfa formadora de ADP de succinato CoA ligase ou o produto de proteína correspondente. Os termos "SUCLG1" e "subunidade alfa formadora de ADP de succinato CoA ligase" incluem formas do tipo selvagem do gene ou proteína SUCLG1, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas SUCLG1 do tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína SUCLG1 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 11), desde que a variante SUCLG1 mantenha a função de SUCLG1 do tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "SUCLG1" e "subunidade alfa formadora de ADP de succinato CoA ligase" podem referir-se a proteínas de fusão, ou ácidos nucleicos que codificam as mesmas, em que a SUCLG1 está operacionalmente ligada a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida, ou agente terapêutico. O termo "SUCLG1" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de SUCLG1 exemplar (SEQ ID NO: 11):
MTATLAAAADIATMVSGSSGLAAARLLSRSFLLPQNGIRHCSYTASRQHLY VDKNTKIICQGFTGKQGTF HSQQALEYGTKLVGGTTPGKGGQTHLGLPVFNTVKEAKEQTGATASVIYV PPPFAAAAINEAIEAEIPLV VCITEGIPQQDMVRVKHKLLRQEKTRLIGPNCPGVINPGECKIGIMPGHIHK KGRIGIVSRSGTLTYEAV HQTTQVGLGQSLCVGIGGDPFNGTDFIDCLEIFLNDSATEGIILIGEIGGNAE ENAAEFLKQHNSGPNSK PVVSFIAGLTAPPGRRMGHAGAIIAGGKGGAKEKISALQSAGVVVSMSPA
QLGTTIYKEFEKRKML Sequência de ácidos nucleicos de SUCLG1 exemplar (SEQ ID NO: 12):
GTCATTGGCGTATGACCGCAACCCTTGCCGCTGCCGCTGACATCGCTA CCATGGTCTCCGGCAGCAGCGG CCTCGCCGCCGCCCGTCTCCTGTCGCGCAGCTTCCTCCTGCCGCAGA ATGGAATTCGGCATTGTTCCTAC ACAGCTTCTCGGCAACATCTCTATGTTGATAAAAATACAAAGATTATTT GCCAGGGTTTCACTGGCAAAC AGGGCACCTTTCACAGCCAGCAGGCATTGGAATATGGCACCAAACTCG TTGGAGGAACCACTCCAGGGAA AGGAGGCCAGACACATCTGGGCTTACCTGTCTTTAATACTGTGAAGGA GGCCAAAGAACAGACAGGAGCA ACGGCTTCTGTCATTTATGTTCCTCCGCCTTTTGCTGCTGCTGCCATTA ATGAAGCTATTGAGGCAGAAA TTCCCTTGGTTGTGTGTATCACTGAAGGAATTCCCCAGCAGGACATGG TACGAGTCAAGCACAAACTGCT GCGCCAGGAAAAGACAAGGCTAATTGGGCCCAACTGCCCTGGAGTCA TCAATCCTGGAGAATGTAAAATT GGCATCATGCCTGGCCATATTCACAAAAAAGGAAGGATTGGCATTGTG TCCAGATCTGGCACCCTGACTT ATGAAGCAGTTCACCAAACAACGCAAGTTGGATTGGGGCAGTCTTTGT GCGTTGGCATTGGAGGTGATCC TTTTAATGGAACAGATTTTATTGACTGCCTCGAAATCTTTTTGAACGATT CTGCCACAGAAGGCATCATA TTGATTGGTGAAATTGGTGGTAATGCAGAAGAGAATGCTGCAGAATTTT TGAAGCAACATAATTCAGGTC CAAATTCCAAGCCTGTAGTGTCCTTCATTGCTGGTTTAACTGCTCCTCC TGGGAGAAGAATGGGTCATGC CGGGGCAATTATTGCTGGAGGAAAAGGTGGAGCTAAAGAGAAGATCT CTGCCCTTCAGAGTGCAGGAGTT GTGGTCAGTATGTCTCCTGCACAGCTGGGAACCACGATCTACAAGGAA TTTGAAAAGAGGAAGATGCTAT GAAAGAAAAAAAAAATTCCTAAAACTGTGGAATGGATCACGTAGACATG TAACCCAGCAGCAGTTTGCTT CTGTTGTCCACTGATTAATCAGCCTATGTGCCTGACACTGGTCTTGCA GTACAACTGGAAGCCAAAACAA GGTGGAAGATGTCCTGAATTAAGATGTTTTCACCACATTGTATTACAGA GACAGCCAATAAATCTACTAT TTGATTTCAA
[177] Conforme utilizado neste documento, o termo "MPV17" refere-se a um gene que codifica a proteína de membrana interna mitocondrial MPV17 ou o produto de proteína correspondente. Os termos "MPV17" e "proteína da membrana interna mitocondrial MPV17" incluem formas do tipo selvagem do gene ou proteína MPV17, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas MPV17 do tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína MPV17 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 13), desde que a variante MPV17 mantenha a função de MPV17 do tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "MPV17" e "proteína de membrana interna mitocondrial MPV17" podem referir-se a proteínas de fusão ou ácidos nucleicos que as codificam, em que a MPV17 está operacionalmente ligada a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "MPV17" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de MPV17 exemplar (SEQ ID NO: 13):
MALWRAYQRALAAHPWKVQVLTAGSLMGLGDIISQQLVERRGLQEHQRG RTLTMVSLGCGFVGPVVGGWY KVLDRFIPGTTKVDALKKMLLDQGGFAPCFLGCFLPLVGALNGLSAQDNW AKLQRDYPDALITNYYLWPA
VQLANFYLVPLHYRLAVVQCVAVIWNSYLSWKAHRL Sequência de ácidos nucleicos de MPV17 exemplar (SEQ ID NO: 14):
AGTTCCTAGGCCAGCCTGTCACGTGGGAGGGAGGCTCGGCGCTCAG GAAGCATGGCACTCTGGCGGGCAT ACCAGCGGGCCCTGGCCGCTCACCCGTGGAAAGTACAGGTCCTGACA GCTGGGTCCCTGATGGGCCTGGG TGACATTATCTCACAGCAGCTGGTGGAGAGGCGGGGTCTGCAGGAAC ACCAGAGAGGCCGGACTCTGACC ATGGTGTCCCTGGGCTGTGGCTTTGTGGGCCCTGTGGTAGGAGGCTG GTACAAGGTTTTGGATCGGTTCA TCCCTGGCACCACCAAAGTGGATGCACTGAAGAAGATGTTGTTGGATC AGGGGGGCTTTGCCCCGTGTTT TCTAGGCTGCTTTCTCCCACTGGTAGGGGCACTTAATGGACTGTCAGC CCAGGACAACTGGGCCAAACTA CAGCGGGATTATCCTGATGCCCTTATCACCAACTACTATCTATGGCCT GCTGTGCAGTTAGCCAACTTCT ACCTGGTCCCCCTTCATTACAGGTTGGCCGTTGTCCAATGTGTTGCTG TTATCTGGAACTCCTACCTGTC CTGGAAGGCACATCGGCTCTAAGCCTGCCTCACTCCATCGTTTCCACC TTGCAGTGATGCAGCTTGACCC TGGAACGGTCAGACAACCTCCTCAAAGTGGGCATACCAGTTTCCACGG GGTTGGGTTGCCGGTCAGAGCT TAAGAGGACTAGCACCCTGCAATGCCCCTCTTCACTCTAAAATGTACA CTGACTGCTTTAGAGCCCTTGA TAATAGTCTTATTCCCACCACATACTAGGCACTCCATAAATATCTGTTG AACCTTCATGACCTTATCAAC TTTACACCCATATCCCAGCAAATGCCACTCATCCCCACTCTTCATAGAC ACATTTGTTACTCTAACCCTG CCTAGGCTTCTTGTAGCTCCAGCTCTTTAGAGACTCCCGGAACCCTTT ATATGGTGCCTCAGTAAATATG TTATTAAATATGTAATCCGGAA
[178] Conforme utilizado neste documento, o termo "POLG" refere-se a um gene que codifica a DNA polimerase gama, subunidade catalítica ou o produto de proteína correspondente. Os termos "POLG" e "DNA polimerase gama, subunidade catalítica" incluem formas de tipo selvagem do gene ou proteína POLG, bem como variantes (por exemplo, variantes de splice, truncamentos, concatâmeros e construtos de fusão, entre outros) de proteínas POLG do tipo selvagem e ácidos nucleicos que as codificam. Exemplos de tais variantes são proteínas com pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou mais) com qualquer uma das sequências de aminoácidos de uma proteína POLG do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO: 15), desde que a variante POLG mantenha a função de POLG do tipo selvagem. Adicionalmente, os termos "POLG" e "DNA polimerase gama, subunidade catalítica" podem referir-se a proteínas de fusão, ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, em que o POLG está operacionalmente ligado a outro polipeptídeo, agente modificador de meia-vida ou agente terapêutico. O termo "POLG" pode se referir à proteína ou ao gene que codifica esta proteína, dependendo do contexto, como será apreciado por um versado na técnica.
Sequência de aminoácidos de POLG exemplar (SEQ ID NO: 15):
MSRLLWRKVAGATVGPGPVPAPGRWVSSSVPASDPSDGQRRRQQQQQ QQQQQQQQPQQPQVLSSEGGQLR HNPLDIQMLSRGLHEQIFGQGGEMPGEAAVRRSVEHLQKHGLWGQPAV PLPDVELRLPPLYGDNLDQHFR LLAQKQSLPYLEAANLLLQAQLPPKPPAWAWAEGWTRYGPEGEAVPVAI PEERALVFDVEVCLAEGTCPT LAVAISPSAWYSWCSQRLVEERYSWTSQLSPADLIPLEVPTGASSPTQRD WQEQLVVGHNVSFDRAHIRE QYLIQGSRMRFLDTMSMHMAISGLSSFQRSLWIAAKQGKHKVQPPTKQG QKSQRKARRGPAISSWDWLDI SSVNSLAEVHRLYVGGPPLEKEPRELFVKGTMKDIRENFQDLMQYCAQD VWATHEVFQQQLPLFLERCPH PVTLAGMLEMGVSYLPVNQNWERYLAEAQGTYEELQREMKKSLMDLAN DACQLLSGERYKEDPWLWDLEW DLQEFKQKKAKKVKKEPATASKLPIEGAGAPGDPMDQEDLGPCSEEEEF QQDVMARACLQKLKGTTELLP KRPQHLPGHPGWYRKLCPRLDDPAWTPGPSLLSLQMRVTPKLMALTWD GFPLHYSERHGWGYLVPGRRDN LAKLPTGTTLESAGVVCPYRAIESLYRKHCLEQGKQQLMPQEAGLAEEFL LTDNSAIWQTVEELDYLEVE AEAKMENLRAAVPGQPLALTARGGPKDTQPSYHHGNGPYNDVDIPGCW FFKLPHKDGNSCNVGSPFAKDF LPKMEDGTLQAGPGGASGPRALEINKMISFWRNAHKRISSQMVVWLPRS ALPRAVIRHPDYDEEGLYGAI LPQVVTAGTITRRAVEPTWLTASNARPDRVGSELKAMVQAPPGYTLVGAD VDSQELWIAAVLGDAHFAGM HGCTAFGWMTLQGRKSRGTDLHSKTATTVGISREHAKIFNYGRIYGAGQP FAERLLMQFNHRLTQQEAAE KAQQMYAATKGLRWYRLSDEGEWLVRELNLPVDRTEGGWISLQDLRKV QRETARKSQWKKWEVVAERAWK GGTESEMFNKLESIATSDIPRTPVLGCCISRALEPSAVQEEFMTSRVNWVV QSSAVDYLHLMLVAMKWLF EEFAIDGRFCISIHDEVRYLVREEDRYRAALALQITNLLTRCMFAYKLGLND LPQSVAFFSAVDIDRCLR
KEVTMDCKTPSNPTGMERRYGIPQGEALDIYQIIELTKGSLEKRSQPGP Sequência de ácidos nucleicos de POLG exemplar (SEQ ID NO: 16):
GCGGACCGGCCGGGTGGAGGCCACACGCTACCCCGAGGCTGCGTAG GCCGCGCGAAGGGGGACGCCGTGC CGTGGGCCTGGGGTCGGGGGAGCAGCAGACCGGGAAGCACCGATTT GGGGTGGAAGGCAGGCATGGTCAA ACCCATTTCACTGACAGGAGAGCAGAGACAGGACGTGTCTCTCTCCAC GTCTTCCAGCCAGTAAAAGAAG CCAAGCTGGAGCCCAAAGCCAGGTGTTCTGACTCCCAGCGTGGGGGT CCCTGCACCAACCATGAGCCGCC TGCTCTGGAGGAAGGTGGCCGGCGCCACCGTCGGGCCAGGGCCGGT TCCAGCTCCGGGGCGCTGGGTCTC CAGCTCCGTCCCCGCGTCCGACCCCAGCGACGGGCAGCGGCGGCGG CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG CAGCAGCAACAGCAGCCTCAGCAGCCGCAAGTGCTATCCTCGGAGGG CGGGCAGCTGCGGCACAACCCAT TGGACATCCAGATGCTCTCGAGAGGGCTGCACGAGCAAATCTTCGGG CAAGGAGGGGAGATGCCTGGCGA GGCCGCGGTGCGCCGCAGCGTCGAGCACCTGCAGAAGCACGGGCTC TGGGGGCAGCCAGCCGTGCCCTTG CCCGACGTGGAGCTGCGCCTGCCGCCCCTCTACGGGGACAACCTGG ACCAGCACTTCCGCCTCCTGGCCC AGAAGCAGAGCCTGCCCTACCTGGAGGCGGCCAACTTGCTGTTGCAG GCCCAGCTGCCCCCGAAGCCCCC GGCTTGGGCCTGGGCGGAGGGCTGGACCCGGTACGGCCCCGAGGG GGAGGCCGTACCCGTGGCCATCCCC GAGGAGCGGGCCCTGGTGTTCGACGTGGAGGTCTGCTTGGCAGAGG GAACTTGCCCCACATTGGCGGTGG CCATATCCCCCTCGGCCTGGTATTCCTGGTGCAGCCAGCGGCTGGTG GAAGAGCGTTACTCTTGGACCAG CCAGCTGTCGCCGGCTGACCTCATCCCCCTGGAGGTCCCTACTGGTG CCAGCAGCCCCACCCAGAGAGAC TGGCAGGAGCAGTTAGTGGTGGGGCACAATGTTTCCTTTGACCGAGCT CATATCAGGGAGCAGTACCTGA TCCAGGGTTCCCGCATGCGTTTCCTGGACACCATGAGCATGCACATGG CCATCTCAGGGCTAAGCAGCTT CCAGCGCAGTCTGTGGATAGCAGCCAAGCAGGGCAAACACAAGGTCC AGCCCCCCACAAAGCAAGGCCAG AAGTCCCAGAGGAAAGCCAGAAGAGGCCCAGCGATCTCATCCTGGGA CTGGCTGGACATCAGCAGTGTCA ACAGTCTGGCAGAGGTGCACAGACTTTATGTAGGGGGGCCTCCCTTA GAGAAGGAGCCTCGAGAACTGTT TGTGAAGGGCACCATGAAGGACATTCGTGAGAACTTCCAGGACCTGAT GCAGTACTGTGCCCAGGACGTG TGGGCCACCCATGAGGTTTTCCAGCAGCAGCTACCGCTCTTCTTGGAG AGGTGTCCCCACCCAGTGACTC TGGCCGGCATGCTGGAGATGGGTGTCTCCTACCTGCCTGTCAACCAG AACTGGGAGCGTTACCTGGCAGA GGCACAGGGCACTTATGAGGAGCTCCAGCGGGAGATGAAGAAGTCGT TGATGGATCTGGCCAATGATGCC TGCCAGCTGCTCTCAGGAGAGAGGTACAAAGAAGACCCCTGGCTCTG GGACCTGGAGTGGGACCTGCAAG AATTTAAGCAGAAGAAAGCTAAGAAGGTGAAGAAGGAACCAGCCACAG CCAGCAAGTTGCCCATCGAGGG GGCTGGGGCCCCTGGTGATCCCATGGATCAGGAAGACCTCGGCCCCT GCAGTGAGGAGGAGGAGTTTCAA CAAGATGTCATGGCCCGCGCCTGCTTGCAGAAGCTGAAGGGGACCAC AGAGCTCCTGCCCAAGCGGCCCC AGCACCTTCCTGGACACCCTGGATGGTACCGGAAGCTCTGCCCCCGG CTAGACGACCCTGCATGGACCCC GGGCCCCAGCCTCCTCAGCCTGCAGATGCGGGTCACACCTAAACTCA TGGCACTTACCTGGGATGGCTTC CCTCTGCACTACTCAGAGCGTCATGGCTGGGGCTACTTGGTGCCTGG GCGGCGGGACAACCTGGCCAAGC TGCCGACAGGTACCACCCTGGAGTCAGCTGGGGTGGTCTGCCCCTAC AGAGCCATCGAGTCCCTGTACAG GAAGCACTGTCTCGAACAGGGGAAGCAGCAGCTGATGCCCCAGGAGG CCGGCCTGGCGGAGGAGTTCCTG CTCACTGACAATAGTGCCATATGGCAAACGGTAGAAGAACTGGATTAC TTAGAAGTGGAGGCTGAGGCCA AGATGGAGAACTTGCGAGCTGCAGTGCCAGGTCAACCCCTAGCTCTG ACTGCCCGTGGTGGCCCCAAGGA CACCCAGCCCAGCTATCACCATGGCAATGGACCTTACAACGACGTGGA CATCCCTGGCTGCTGGTTTTTC AAGCTGCCTCACAAGGATGGTAATAGCTGTAATGTGGGAAGCCCCTTT GCCAAGGACTTCCTGCCCAAGA TGGAGGATGGCACCCTGCAGGCTGGCCCAGGAGGTGCCAGTGGGCC CCGTGCTCTGGAAATCAACAAAAT GATTTCTTTCTGGAGGAACGCCCATAAACGTATCAGCTCCCAGATGGT GGTGTGGCTGCCCAGGTCAGCT CTGCCCCGTGCTGTGATCAGGCACCCCGACTATGATGAGGAAGGCCT CTATGGGGCCATCCTGCCCCAAG TGGTGACTGCCGGCACCATCACTCGCCGGGCTGTGGAGCCCACATGG CTCACCGCCAGCAATGCCCGGCC TGACCGAGTAGGCAGTGAGTTGAAAGCCATGGTGCAGGCCCCACCTG GCTACACCCTTGTGGGTGCTGAT GTGGACTCCCAAGAGCTGTGGATTGCAGCTGTGCTTGGAGACGCCCA CTTTGCCGGCATGCATGGCTGCA CAGCCTTTGGGTGGATGACACTGCAGGGCAGGAAGAGCAGGGGCACT GATCTACACAGTAAGACAGCCAC TACTGTGGGCATCAGCCGTGAGCATGCCAAAATCTTCAACTACGGCCG CATCTATGGTGCTGGGCAGCCC TTTGCTGAGCGCTTACTAATGCAGTTTAACCACCGGCTCACACAGCAG GAGGCAGCTGAGAAGGCCCAGC AGATGTACGCTGCCACCAAGGGCCTCCGCTGGTATCGGCTGTCGGAT GAGGGCGAGTGGCTGGTGAGGGA GTTGAACCTCCCAGTGGACAGGACTGAGGGTGGCTGGATTTCCCTGC AGGATCTGCGCAAGGTCCAGAGA GAAACTGCAAGGAAGTCACAGTGGAAGAAGTGGGAGGTGGTTGCTGA ACGGGCATGGAAGGGGGGCACAG AGTCAGAAATGTTCAATAAGCTTGAGAGCATTGCTACGTCTGACATACC ACGTACCCCGGTGCTGGGCTG CTGCATCAGCCGAGCCCTGGAGCCCTCGGCTGTCCAGGAAGAGTTTA TGACCAGCCGTGTGAATTGGGTG GTACAGAGCTCTGCTGTTGACTACTTACACCTCATGCTTGTGGCCATG AAGTGGCTGTTTGAAGAGTTTG CCATAGATGGGCGCTTCTGCATCAGCATCCATGACGAGGTTCGCTACC TGGTGCGGGAGGAGGACCGCTA CCGCGCTGCCCTGGCCTTGCAGATCACCAACCTCTTGACCAGGTGCA TGTTTGCCTACAAGCTGGGTCTG AATGACTTGCCCCAGTCAGTCGCCTTTTTCAGTGCAGTCGATATTGAC CGGTGCCTCAGGAAGGAAGTGA CCATGGATTGTAAAACCCCTTCCAACCCAACTGGGATGGAAAGGAGAT ACGGGATTCCCCAGGGTGAAGC GCTGGATATTTACCAGATAATTGAACTCACCAAAGGCTCCTTGGAAAAA CGAAGCCAGCCTGGACCATAG CACTGCCTGGAGGCTCTGTATTTGCTCCCGTGGAGCTTCATCGGGGT GGTGCAGGCTCCCAAACTCAGGC TTTCAGCTGTGCTTTTTGCAAAAGGGCTTGCCTAAGGCCAGCCATTTTT CAGTAGCAGGACCTGCCAAGA AGATTCCTTCTAACTGAAGGTGCAGTTGAATTCAGTGGGTTCAGAACC AAGATGCCAACATCGGTGTGGA CTACAGGACAAGGGGCATTGTTGCTTGTTGGGTAAAAATGAAGCAGAA GCCCCAAAGTTCACATTAACTC AGGCATTTCATTTATTTTTTCCTTTTCTTCTTGGCTGGTTCTTTGTTCTG TCCCCCATGCTCTGATGCAG TGCCCTAGAAGGGGAAAGAATTAATGCTCTAACGTGATAAACCTGCTC CAAGGCAGTGGAAATAAAAAGA AGGAAAAAAAAGACTCTATCTTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAA
[179] Os métodos padrão em biologia molecular são descritos em Sambrook, Fritsch e Maniatis Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982 & 1989 2ªEdição, 2001 3ª Edição); Sambrook e Russel Molecular Cloning, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Wu Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA) (1993). Métodos padrão também aparecem em Ausbel, et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nova York, NY (2001).
Tratamento e Prevenção da Síndrome de Depleção do DNA Mitocondrial
[180] As composições e métodos da presente divulgação podem ser usados para tratar, prevenir e/ou curar uma variedade de patologias. Por exemplo, os métodos de terapia genética descritos neste documento, podem envolver a administração de uma ou mais composições contendo um ácido nucleico que codifica uma proteína funcional de modo a tratar, prevenir e/ou curar uma doença associada à disfunção mitocondrial. Para o tratamento de uma síndrome de depleção de DNA mitocondrial, tal como uma deficiência de TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG, a terapia gênica pode envolver a administração de uma ou mais composições contendo um gene que codifica um forma funcional da proteína deficiente. O tratamento também pode envolver a administração de terapia farmacológica em conjunto com a terapia gênica. Este protocolo de tratamento envolvendo terapia gênica sozinha ou em combinação com terapia farmacológica pode ser usado para tratar uma variedade de distúrbios caracterizados por pools de nucleosídeos desequilibrados, como os encontrados na síndrome de depleção de DNA mitocondrial.
[181] A síndrome de depleção do DNA mitocondrial (mtDNA) (MDS) compreende diversas doenças autossômicas graves caracterizadas por uma redução do número de cópias de mtDNA nos tecidos afetados. A maioria dos genes nucleares causadores de MDS codificam proteínas que pertencem à maquinaria de replicação do mtDNA ou estão envolvidas no metabolismo do trifosfato de desoxirribonucleosídeo (dNTP), tornando todas essas doenças candidatas à terapia gênica.
[182] Uma forma de MDS é a deficiência de timidina quinase ou TK2. TK2 codificada pelo gene nuclear, TK2, é uma proteína de matriz mitocondrial que fosforila os nucleosídeos timidina e citidina para gerar desoxitimidina monofosfato (TMP) e desoxicitidina monofosfato (dCMP), que, por sua vez, são convertidos em desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs) necessários para a síntese de DNA mitocondrial. Mutações de TK2 autossômico recessivo causam fraqueza neuromuscular devastadora com depleção grave de DNA mitocondrial (mtDNA) em bebês e crianças, bem como oftalmoplegia externa progressiva com múltiplas deleções de mtDNA em adultos. Muitos pacientes não podem caminhar e necessitam de algum tipo de ventilação mecânica e tubo de alimentação. O sistema nervoso central está envolvido de forma variável nesses distúrbios, com sintomas que incluem convulsões, encefalopatia, comprometimento cognitivo e perda auditiva. Menos de 7% dos pacientes vivem mais de 42 anos.
[183] Com base nas descobertas clínicas e de genética molecular de pacientes com este diagnóstico, três apresentações da doença foram identificadas: i) miopatia com início na primeira infância (≤1 ano de idade) com início de fraqueza no primeiro ano de vida com depleção de mtDNA grave e mortalidade precoce; ii)
miopatia com início na infância (>1-11 anos de idade) com depleção grave de mtDNA; e iii) miopatia com início tardio (≥12 anos de idade) com fraqueza leve no início e progressão lenta para a perda de ambulação, insuficiência respiratória ou ambas, muitas vezes com oftalmoparesis externa crônica progressiva na adolescência ou vida adulta em associação com múltiplas deleções do mtDNA, número de cópias de mtDNA reduzido, ou ambos. Ver Garone, et al. 2018.
[184] Tentativas de estudar a patogênese e terapias de teste para a deficiência de TK2 usando fibroblastos cultivados a partir de pacientes não tiveram sucesso, pois as células replicantes não conseguiram manifestar a depleção do mtDNA. Por outro lado, um modelo de camundongo mutante homozigótico com knock-in de Tk2 H126N (Tk2-/-), manifesta um fenótipo que é extremamente semelhante à encefalomiopatia infantil humana causada por mutações em TK2, caracterizado pelo início aos 10 dias de idade com diminuição da ambulação, marcha instável, tremor grosseiro, retardo de crescimento e depleção de DNA mitocondrial (mtDNA), progredindo rapidamente para a morte precoce aos 14 a 16 dias, que é um período de tempo análogo àquele da doença humana de início na primeira infância (Akman, et al. 2008; Dorado, et al. 2011). Este modelo de camundongo foi usado para mostrar que a administração de dC/dT oral retardou o início dos sintomas clínicos da deficiência de TK2 e prolongou a vida dos camundongos em duas a três vezes (pedido '092). Também foi usado para mostrar que a administração oral de dCMP/TMP, retardou os sintomas clínicos e prolongou a vida (pedido '207).
Descobertas exemplares de vetores AAV que codificam TK2 em modelos de camundongo de MDS
[185] Conforme apresentado neste documento, usando um modelo de camundongo com deficiência de Tk2, a doença pode ser curada substituindo o gene mutante por um gene normal que codifica uma proteína Tk2 funcional. Uma terapia gênica exemplar descrita neste documento, envolve o uso de um AAV (por exemplo, um vírus AAV2 ou AAV9) contendo um transgene que codifica TK2. Foi descoberto que a administração de um vírus AAV9 que expressa TK2 humana (referido como "AAV9-hTK2" nos Exemplos fornecidos abaixo) prolongou a duração da vida de camundongos mutantes TK2 até uma duração máxima de cerca de 4 meses e uma média de cerca de 3 meses de vida. Isso foi mais do que o dobro do tempo de vida dos camundongos mutantes TK2 tratados farmacologicamente com dC/dT por via oral, que foi em média 43 dias, e cinco vezes mais do que os camundongos mutantes TK2 não tratados, que foi de 18 dias (ver, por exemplo, Exemplo 2). O peso também aumentou de cerca de 55% em relação aos camundongos tratados somente com dC/dT e cerca de 80% em relação ao peso de camundongos do tipo selvagem (ver, por exemplo, o Exemplo 3).
[186] A força muscular (normalizada para o peso) e a função motora avaliadas pelo teste Rotarod que foi realizado no dia 60 pós-natal e não apresentaram diferenças entre os camundongos mutantes TK2 tratados e os camundongos do tipo selvagem não tratados (ver, por exemplo, os Exemplos 3 e 4). Os camundongos do tipo selvagem não apresentaram efeitos colaterais adversos relacionados à terapia e eram saudáveis em geral
[187] A atividade e os níveis de complexos enzimáticos OXPHOS no cérebro de camundongos mutantes tratados foram semelhantes aos apresentados em camundongos do tipo selvagem não tratados e tratados (ver, por exemplo, Exemplos 7 e 8).
[188] Adicionalmente, camundongos mutantes tratados nunca apresentaram tremor na cabeça, característico de camundongos Tk2-/- não tratados e tratados com dC+dT, confirmando que o resgate da função mitocondrial no sistema nervoso central previne a patologia.
[189] O DNA mitocondrial também foi resgatado pela administração de AAV9 na maioria dos tecidos dos camundongos mutantes (ver, por exemplo, o Exemplo 6).
[190] O tratamento com 4,2x1011 vc de AAV9-hTK2 em P1 não transduz de forma eficiente as células renais, conforme observado anteriormente em outros estudos. Consequentemente, a atividade de TK2 em camundongos mutantes tratados foi muito ruim em comparação com camundongos do tipo selvagem e havia sinais de depleção de mtDNA tão cedo quanto o dia 29 pós-natal. A histologia e a análise bioquímica mostraram função renal comprometida, que pode ser a condição subjacente que leva à morte precoce de camundongos Tk2-/- (ver, por exemplo, o Exemplo 8).
[191] No entanto, quando os camundongos mutantes TK2 foram administrados com uma combinação de um vírus AAV9-hTK2 e AAV2 que expressa o gene de TK2 humana (AAV2-hTK2), eles tiveram uma sobrevida significativamente maior, apesar de terem níveis mais baixos da dose viral total. Os camundongos mutantes tratados com ambos os construtos cresceram tanto quanto os camundongos tratados apenas com AAV9-hTK2 e tinham níveis ligeiramente mais elevados de mtDNA do que os camundongos tratados apenas com AAV9- hTK2. Eles tinham crescimento, força e coordenação motora iguais aos dos camundongos mutantes tratados apenas com AAV9-hTK2, bem como uma diminuição da proteína em sua urina e níveis mais baixos de índice BUN (ver, por exemplo, o Exemplo 9).
[192] Além disso, quando os camundongos mutantes foram tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 foram administrados ainda com dC+dT por via oral em água, eles tiveram uma sobrevida ainda maior e aumentaram os níveis de crescimento e mtDNA no fígado e rim e diminuíram as proteínas em sua urina (ver, por exemplo, o Exemplo 10).
[193] Além disso, os camundongos mutantes TK2 são tratados com dC/dT por via oral, conforme descrito no pedido '092 ou dCMP/TMP por via oral, como descrito no pedido '207, começando em uma idade precoce, por exemplo, dia 4 pós-natal e subsequentemente foi administrado o vetor AAV9-hTK2, sozinho ou em combinação com o vetor AAV2-hTK2, em uma idade posterior, variando de um mês a cerca de dois meses, com cerca de 21 dias sendo o ideal. O vetor AAV2-hTK2 pode ser administrado simultaneamente com o vetor AAV9-hTK2 ou subsequentemente. Esses camundongos mutantes tiveram uma sobrevida maior do que os camundongos mutantes que foram administrados somente com AAV9- hTK2 e aumentaram o crescimento e a força, e o mtDNA e os RCEs foram restaurados em todos os tecidos, incluindo o rim (ver, por exemplo, os Exemplos 11 e 12).
Métodos de tratamento, prevenção e/ou cura de doenças mitocondriais em pacientes
[194] Pacientes que se beneficiariam da administração da terapia gênica descrita incluem aqueles diagnosticados com deficiência em um ou mais de TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG. Nestes pacientes, composições contendo um ácido nucleico que codifica uma ou mais das proteínas deficientes (por exemplo, vetores virais, tais como vetores AAV, contendo estes ácidos nucleicos) podem ser administradas ao paciente. Estas composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com agentes farmacológicos, tais como desoxinucleosídeos (por exemplo, dC e dT ou misturas destes), ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos (por exemplo, dCMP e TMP ou misturas destes). Por exemplo, o sujeito pode ter uma síndrome de depleção do DNA mitocondrial e o tratamento compreende a administração (i) de uma composição contendo um vetor viral (por exemplo, AAV, como um AAV que tem como alvo pelo menos tecido muscular, opcionalmente pelo menos tecido muscular e SNC, por exemplo AAV9) contendo um ácido nucleico que codifica uma ou mais das proteínas deficientes, e (ii) uma composição compreendendo desoxinucleosídeos (por exemplo, dC e dT ou misturas destes), ou monofosfatos desoxirribonucleosídeos (por exemplo, dCMP e TMP ou misturas destes). Em uma modalidade, a síndrome de depleção do DNA mitocondrial é a deficiência de TK2 e o vetor viral (por exemplo, AAV, como um AAV que tem como alvo pelo menos tecido muscular, opcionalmente, pelo menos tecido muscular e SNC, por exemplo AAV9) compreende um ácido nucleico que codifica TK2. Em uma modalidade particular, a síndrome de depleção do DNA mitocondrial é a deficiência de TK2 e o vetor viral é AAV9 compreendendo um ácido nucleico que codifica TK2.
[195] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de tratamento, prevenção, cura e/ou redução da gravidade ou extensão da deficiência de TK2 através da administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição, como um vetor viral (por exemplo, um AAV), compreendendo um ácido nucleico que codifica TK2. Em algumas modalidades, o vetor viral é um AAV, como AAV9 ou AAV2. Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, vetor viral, como um AAV) compreendendo um ácido nucleico que codifica TK2 é administrada assim que a deficiência de TK2 é diagnosticada ou surge uma suspeita. Em algumas modalidades, a quantidade de AAV que compreende o transgene administrado é de cerca de 4,2 x 1011 ou 4,2 x 1010 o genoma ou vetor ou cópias de vetor.
[196] A divulgação também fornece métodos de tratamento, prevenção, cura e/ou redução da gravidade ou extensão da deficiência de TK2 pela administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma primeira composição (por exemplo, vetor viral, como AAV) contendo um ácido nucleico que codifica TK2 e compreende ainda a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição (por exemplo, vetor viral, como AAV) contendo um ácido nucleico que codifica TK2. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo AAV são, cada um, independentemente, um vetor AAV2 ou AAV9 que codifica TK2. Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV é administrado antes do segundo vetor AAV. Em algumas modalidades, a primeira composição (por exemplo, vetor AAV) é administrada assim que a deficiência de TK2 é diagnosticada ou surge uma suspeita, e a segunda composição (por exemplo, vetor AAV) é administrada um tempo após a primeira composição. Em algumas modalidades, a segunda composição (por exemplo, vetor AAV) é administrada alguns dias depois da primeira composição (por exemplo, vetor AAV). Em algumas modalidades, a segunda composição (por exemplo, vetor AAV) é administrada semanas após a primeira composição (por exemplo, vetor AAV). Em algumas modalidades, a segunda composição (por exemplo, vetor AAV) é administrada meses depois da primeira composição (por exemplo, vetor AAV). Em algumas modalidades, a primeira composição (por exemplo, vetor AAV) e a segunda composição (por exemplo, vetor AAV) são administradas simultaneamente a qualquer momento. Em algumas modalidades, as duas composições (por exemplo, vetores AAV) estão presentes na mesma composição maior e, em algumas modalidades, as duas são composições separadas.
[197] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente farmacológico, como dC e/ou dT. O agente farmacológico pode ser administrado ao mesmo tempo que a primeira composição (por exemplo, vetor viral, como um vetor AAV) é administrada ou um tempo após a administração da primeira composição. Em algumas modalidades, o agente farmacológico, como dC e/ou dT, éadministrado alguns dias depois da primeira composição. Em algumas modalidades, o agente farmacológico, como dC e/ou dT, é administrado semanas depois da primeira composição e, em algumas modalidades, o agente farmacológico, como dC e/ou dT, é administrado meses após a primeira composição. Em algumas modalidades, a primeira composição, a segunda composição e o agente farmacológico são administrados simultaneamente a qualquer momento.
[198] Em algumas modalidades, a primeira composição (por exemplo, vetor viral, como um AAV, que codifica um transgene descrito neste documento, por exemplo TK2) é administrada assim que a deficiência de TK2 for conhecida ou surgir uma suspeita. O agente farmacológico (por exemplo, dC e/ou dT) pode ser administrado a partir de cerca de 7 dias a cerca de 35 dias após a administração da primeira composição, a partir de cerca de 14 dias a cerca de 28 dias após a administração da primeira composição, começando de cerca de 14 dias a cerca de 21 dias após a administração da primeira composição, ou a partir de cerca de 21 dias após a administração da primeira composição. A segunda composição (por exemplo, vetor viral, como um AAV, que codifica um transgene descrito neste documento, por exemplo, TK2) pode ser administrada a partir de cerca de 14 dias a cerca de 45 dias após a administração da primeira composição, a partir de cerca de 21 dias a cerca de 35 dias após a administração da primeira composição, começando cerca de 21 dias a cerca de 30 dias após a administração da primeira composição, ou começando cerca de 29 dias após a administração da primeira composição. Em algumas modalidades, a administração do agente farmacológico (por exemplo, dC e/ou dT) continua ao longo da vida do sujeito.
[199] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de tratamento, prevenção, cura e/ou redução da gravidade ou extensão da deficiência de TK2 pela administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente farmacológico (por exemplo, dC e/ou dT) e inclui ainda a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um vetor viral, como um vetor AAV (por exemplo, rAAV), contendo um ácido nucleico que codifica TK2. Por exemplo, a composição pode conter um AAV2 ou AAV9 contendo um ácido nucleico que codifica TK2. Em certas modalidades, o AAV é AAV9. Em algumas modalidades, o agente farmacológico é administrado antes do vetor AAV. Em algumas modalidades, o agente farmacológico é administrado assim que a deficiência de TK2 é diagnosticada ou surge uma suspeita e o vetor AAV é administrado em um momento posterior. Em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado dias depois do agente farmacológico e, em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado semanas depois do agente farmacológico. Em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado meses depois do agente farmacológico. Em algumas modalidades, o agente farmacológico e o vetor AAV são administrados simultaneamente a qualquer momento. Em algumas modalidades, um segundo vetor AAV (por exemplo, AAV2 ou AAV9) que codifica TK2 também é administrado. O primeiro e o segundo vetor AAV podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o primeiro vetor AAV pode ser um vetor AAV2 (ou seja, contendo ITRs de AAV2 e proteínas do capsídeo de AAV2) e o segundo vetor AAV pode ser um vetor AAV9 (por exemplo, contendo ITRs de AAV9 e proteínas do capsídeo de AAV9). Em algumas modalidades, um ou ambos o primeiro e o segundo vetores são um vetor AAV pseudotipado contendo ITRs de AAV2 e proteínas de capsídeo de um sorotipo AAV diferente (por exemplo, um vetor AAV2/1, AAV2/8 ou AAV2/9). Em algumas modalidades, o primeiro vetor AAV é administrado simultaneamente ou posteriormente em relação ao momento da administração do segundo vetor AAV. O primeiro e o segundo vetores podem ser administrados na mesma composição ou em composições diferentes.
[200] Em algumas modalidades, a divulgação fornece métodos de tratamento, prevenção e/ou redução da gravidade ou extensão da deficiência de TK2 pela administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente farmacológico contendo dCMP e/ou TMP e a administração adicional ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um vetor AAV (por exemplo, AAV2 ou AAV9) contendo um ácido nucleico que codifica TK2. Em algumas modalidades, dCMP e/ou TMP é administrado antes da administração do vetor AAV. Em algumas modalidades, dCMP e/ou TMP é administrado assim que a deficiência de TK2 é diagnosticada ou surge uma suspeita e o vetor AAV é administrado em um momento posterior. Em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado dias depois da administração de dCMP e/ou TMP, e em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado semanas depois de dCMP e/ou TMP. Em algumas modalidades, o vetor AAV é administrado meses após dCMP e/ou TMP. Em algumas modalidades, dCMP e/ou TMP e o vetor AAV são administrados simultaneamente a qualquer momento. Em algumas modalidades, um vetor AAV adicional (por exemplo, um vetor AAV2 ou AAV9) contendo um ácido nucleico que codifica TK2 também é administrado ao sujeito. O segundo vetor AAV pode ser administrado simultaneamente ou posteriormente em relação ao momento da administração do primeiro vetor AAV. O primeiro e o segundo vetores AAV podem ser administrados como parte da mesma composição ou como uma composição diferente.
[201] Todos os métodos mencionados acima podem ser usados para restaurar a função de uma proteína TK2 disfuncional em um sujeito com deficiência de TK2.
[202] Um defeito paralelo da dGK, devido a mutações autossômicas recessivas em DGUOK com deficiências de dGMP e dAMP causa depleção do mtDNA que tipicamente se manifesta como doença hepatocerebral com início no início da infância (Mandel, et al. 2001). Esses pacientes se beneficiariam da administração de um vetor AAV compreendendo o ácido nucleico que codifica dGK e pelo menos uma desoxipurina, dG ou dA ou misturas destas. Da mesma forma, os pacientes com deficiências de TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG podem ser tratados usando as composições e métodos da divulgação, por exemplo, fornecendo a tal paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição (por exemplo, um vetor viral, como um vetor AAV) contendo um transgene que codifica a proteína deficiente. A composição pode ser fornecida ao paciente sozinha ou em combinação com um agente farmacológico, como um desoxinucleosídeo ou monofosfato de desoxinucleosídeo descrito neste documento.
[203] Por exemplo, outras formas de MDS, bem como outros distúrbios relacionados a pools de nucleotídeos em desequilíbrio, podem ser tratados pela administração de composições (por exemplo, vetores virais, como vetores AAV) contendo ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG. A composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com um agente farmacológico, como desoxinucleosídeos (por exemplo, dA, dG, dC ou dT, ou uma mistura destes) ou monofosfato de desoxinucleosídeo (por exemplo, dAMP, dGMP, dCMP, ou TMP ou mistura destes). Esses distúrbios incluem, mas não estão limitados a, deficiências relacionadas a RRM2B (que codifica p53R2, a subunidade pequena induzível p53 de ribonucleotídeo redutase, RNR) e mutações em TYMP (que codifica timidina fosforilase, TP) que causam encefalomiopatia neurogastrointestinal mitocondrial (MNGIE). Genes nucleares adicionais que perturbam os pools de dNTP mitocondriais incluem, mas não estão limitados a, SUCLA2, SUCLG1 e MPV17.
Avaliação da condição de um paciente com doença mitocondrial
[204] Pacientes que exibem o fenótipo discutido acima para deficiência de TK2, incluindo a apresentação mais típica da doença muscular progressiva caracterizada por hipotonia generalizada, fraqueza muscular proximal, perda de habilidades motoras adquiridas anteriormente, dificuldade de alimentação e dificuldades respiratórias, podem ser testados para diagnosticar definitivamente a doença.
[205] Se a apresentação clínica for altamente suspeita para a síndrome de depleção do mtDNA, testes genéticos moleculares usando um painel de genes conhecidos por causar síndrome de depleção do mtDNA devem ser realizados (Chanprasert, et al. 2012). O gene TK2 é o único gene no qual se sabe que as mutações causam síndrome de depleção do DNA mitocondrial relacionada a TK2. Este teste pode incluir uma análise de sequência de toda a codificação e regiões de junção de éxon/íntron de TK2 para variantes de sequência e deleção/duplicação. Se mutações deletérias heterozigotas ou homozigotas compostas forem identificadas na análise de sequência, o diagnóstico de deficiência de TK2 é confirmado e, assim, o sujeito se beneficiaria da terapia descrita neste documento. Se a análise de sequência não identificar duas mutações deletérias heterozigóticas ou homozigóticas compostas, a análise de deleção/duplicação deverá ser considerada para determinar e/ou confirmar um diagnóstico de deficiência de TK2.
[206] Testes adicionais para determinar e/ou confirmar um diagnóstico de deficiência de TK2 podem incluir testar a concentração de creatina quinase (CK) sérica, eletromiografia, histopatologia no músculo esquelético, conteúdo de DNA mitocondrial (mtDNA) (número de cópias) e atividade da cadeia de transporte de elétrons (ETC) no músculo esquelético. Se um ou mais dos itens a seguir forem encontrados nesses testes, a deficiência de TK2 é determinada e/ou confirmada. Concentração de CK elevada em comparação com controles saudáveis pode indicar deficiência de TK2. Uma biópsia do músculo esquelético pode ser feita e depois uma análise do conteúdo de mtDNA no músculo esquelético pode ser feita. Se a biópsia do músculo esquelético apresentar variância prominente no tamanho da fibra, vacúolos sarcoplásmicos variáveis, tecido conjuntivo aumentado variável e fibras vermelhas irregulares, bem como aumento da atividade da succinato desidrogenase (SDH) e atividade da citocromo c oxidase (COX) baixa a ausente, e número de cópias de mtDNA for severamente reduzido (tipicamente menos de 20% dos controles saudáveis compatíveis com idade e tecido), um diagnóstico de deficiência de TK2 pode ser determinado e/ou confirmado (Chanprasert, et al. 2012).
[207] Adicionalmente, a deficiência de TK2 é herdada de maneira autossômica recessiva . Assim, um irmão de um paciente afetado pode ser testado o mais rápido possível após o nascimento para diagnosticar a doença.
[208] Em todos esses exemplos, a terapia gênica sozinha ou em combinação com a terapia com desoxinucleosídeo ou terapia com monofosfato de desoxirribonucleosídeo deve ser iniciada o mais rápido possível após o diagnóstico de deficiência de TK2.
Vetores AAV Recombinantes
[209] "Vetores AAV recombinantes (rAAV)" descritos neste documento geralmente incluem um transgene (por exemplo, codificando TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG). O transgene é flanqueado pelas ITRs 5' e 3' e pode estar operacionalmente ligado a um ou mais elementos reguladores de uma maneira que permita a transcrição, tradução e/ou expressão do transgene em uma célula de um tecido alvo. Tais elementos reguladores podem incluir um promotor ou potenciador, tal como o promotor de beta actina de frango ou potenciador de citomegalovírus, entre outros descritos neste documento. O genoma de AAV recombinante é geralmente encapsidado por proteínas do capsídeo (por exemplo, do mesmo sorotipo de AAV daquele do qual as ITRs são derivadas ou de um sorotipo de AAV diferente daquele do qual as ITRs são derivadas). O vetor AAV pode então ser distribuído a uma célula alvo selecionada. Em algumas modalidades, o transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga às sequências de vetores, que codifica um polipeptídeo, proteína, molécula de RNA funcional (por exemplo, miRNA, inibidor de miRNA) ou outro produto genético de interesse (por exemplo, TK2). Componentes de vetores AAV exemplares que podem ser usados juntamente com as composições e métodos da divulgação são descritos abaixo.
[210] Qualquer sorotipo de AAV ou combinação de sorotipo de AAV pode ser usado nos métodos e composições da presente invenção. Como os métodos e composições da presente invenção são para o tratamento e cura de distúrbios mitocondriais, os sorotipos de AAV que têm como alvo pelo menos o músculo, ou pelo menos o músculo e o sistema nervoso central podem ser usados em algumas modalidades e incluem, mas não estão limitados a AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9.
[211] Em algumas modalidades, o sorotipo de AAV9, que tem um amplo tropismo, é usado.
Componentes de vetores AAV
[212] Os vetores AAV descritos neste documento podem conter ITRs 5' e 3' de ação cis (ver, por exemplo, Carter, em "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)). As sequências de ITR normalmente têm cerca de 145 bp de comprimento. Preferencialmente, substancialmente todas as sequências que codificam as ITRs são utilizadas na molécula, embora algum grau de modificação menor dessas sequências seja permissível. (Ver, por exemplo, textos como Sambrook et al, (1989) e Fisher et al., (1996)). Um exemplo de tal molécula empregada na presente invenção é um plasmídeo de "ação cis" contendo o transgene, no qual a sequência de transgenes selecionados e os elementos regulatórios associados são flanqueados pelas sequências de ITR 5' e 3' de AAV. As sequências de ITR de AAV podem ser obtidas a partir de qualquer AAV conhecido, incluindo tipos de AAV de mamífero atualmente identificados.
[213] Além dos elementos identificados acima para os vetores AAV recombinantes, o vetor também pode incluir elementos de controle convencionais que estão operacionalmente ligados ao transgene de uma maneira que permita a sua transcrição, tradução e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor plasmídeo ou infectada com o vírus produzido pela invenção. Conforme utilizado neste documento, as sequências "operacionalmente ligadas" incluem ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e as sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. As sequências de controle de expressão incluem sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotora e potencializadora de transcrição; sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de splicing e poliadenilação (poliA); sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que potencializam a eficiência da tradução (ou seja, sequência de consenso de Kozak); sequências que potencializam a estabilidade proteica; e quando desejado, sequências que potencializam a secreção do produto codificado. Um grande número de sequências de controle de expressão, incluindo promotores que são nativos, constitutivos, induzíveis e/ou específicos do tecido, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados.
[214] Conforme utilizado neste documento, acredita-se que uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, sequência de codificação) e sequências reguladoras estão operacionalmente ligadas quando estão ligadas de forma covalente, de modo a colocar a expressão ou a transcrição da sequência de ácido nucleico sob a influência ou controle das sequências reguladoras. Se deseja-se que as sequencias de ácido nucleico sejam traduzidas em uma proteína funcional, duas sequências de DNA são referidas a serem ligadas operacionalmente se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resulta na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resulta na introdução de uma mutação de frame-shift, (2) interfere com a capacidade da região promotora de direcionar a transcrição da sequência de codificação, ou (3) interfere com a capacidade da transcrição de RNA correspondente de ser traduzida em uma proteína. Assim, uma região promotora seria operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico se a região promotora fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de DNA de modo que o transcrito resultante possa ser traduzido para a proteína ou polipeptídeo desejado. De modo semelhante, duas ou mais regiões de codificação estão operacionalmente ligadas quando estão ligadas de tal forma que a sua transcrição a partir de um promotor comum resulta na expressão de duas ou mais proteínas que foram traduzidas em quadro. Em algumas modalidades, sequências de codificação ligadas operacionalmente produzem uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, as sequências de codificação ligadas operacionalmente produzem um RNA funcional (por exemplo, shRNA, miRNA).
[215] Para os ácidos nucleicos que codificam proteínas, uma sequência de poliadenilação geralmente é inserida após as sequências de transgene e antes da sequência de ITR 3' de AAV. Um construto de rAAV útil na presente invenção também pode conter um íntron, preferencialmente localizado entre a sequência promotora/potenciadora e o transgene. Uma possível sequência de íntron é derivada de SV-40, e é referida como a sequência de íntron SV-40 T.
[216] Outro elemento vetorial que pode ser usado é um sítio interno de entrada de ribossomo (IRES). Uma sequência IRES é usada para produzir mais de um polipeptídeo a partir de um único transcrito genético. Uma sequência IRES seria utilizada para produzir uma proteína que contenha mais de uma cadeia polipeptídica. A seleção desses e de outros elementos vetoriais comuns é convencional e muitas dessas sequências estão disponíveis (ver, por exemplo, Sambrook et al, e referências citadas). Este padrão pode ser útil, por exemplo, para casos em que múltiplos genes ou porções dos mesmos são expressos a partir do mesmo vetor AAV.
[217] A natureza precisa das sequências reguladoras necessárias para a expressão gênica nas células hospedeiras pode variar entre espécies, tecidos ou tipos de células, mas deve, em geral, incluir, se necessário, sequências 5' não- transcritas e 5' não-traduzidas, envolvidas com o início de transcrição e tradução,
respectivamente, como uma caixa TATA, sequência de capping, sequência CAAT, elementos potenciadores e similares. Especialmente, tais sequências reguladoras 5' não-transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle da transcrição do gene unido operacionalmente. As sequências reguladoras também podem incluir sequências do potenciador ou sequências ativadoras a montante como desejado. Os vetores podem incluir opcionalmente sequências 5' líder ou de sinal.
[218] Exemplos de promotores constitutivos incluem, sem limitação, um promotor de beta actina de galinha, um promotor LTR do vírus do sarcoma de Rous retroviral (RSV) (opcionalmente com um potenciador de RSV), um promotor de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com um potenciador de CMV), um promotor de SV40, um promotor diidrofolato redutase, um promotor 13-actina, um promotor fosfoglicerol quinase (PGK) e um promotor EFla (Invitrogen).
[219] Os promotores induzíveis permitem a regulação da expressão gênica e podem ser regulados por compostos fornecidos exogenamente, fatores ambientais como temperatura ou a presença de um estado fisiológico específico, por exemplo, fase aguda, um estado de diferenciação específico da célula ou apenas na replicação de células. Os promotores induzíveis e os sistemas induzíveis estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, incluindo, sem limitação, Invitrogen, Clontech e Ariad. Exemplos de promotores induzíveis regulados por promotores fornecidos exogenamente incluem um promotor de metalotionina de ovelha induzível por zinco (MT), um promotor (MMTV) de vírus de tumor mamário de camundongo de dexametasona (Dex)-induzível, um sistema promotor de polimerase T7 (WO 98/10088); um promotor de ecdisona de inseto (No et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 3346-3351 (1996)), um sistema repressível de tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551 (1992)), um sistema induzível por tetraciclina (Gossen et al., Science 268: 1766-1769 (1995), um sistema induzível por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) e Wang et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)) e um sistema induzível por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997)). Ainda outros tipos de promotores induzíveis que podem ser úteis neste contexto são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, um estado de diferenciação particular da célula ou apenas na replicação de células.
[220] Em outra modalidade, o promotor nativo, ou o fragmento deste, para o transgene será usado. O promotor nativo pode ser preferencial quando se deseja que a expressão do transgene imite a expressão nativa. O promotor nativo pode ser usado quando a expressão do transgene deve ser regulada temporariamente ou em desenvolvimento, ou de forma específica de tecido, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Em uma outra modalidade, outros elementos de controle de expressão nativos, tais como elementos potenciadores, sítios de poliadenilação ou sequências de consenso de Kozak, podem também ser usados para imitar a expressão nativa.
[221] Em algumas modalidades, as sequências reguladoras conferem capacidades de expressão de genes específicos de tecido. Em alguns casos, as sequências reguladoras específicas do tecido se ligam aos fatores de transcrição específicos de tecido que induzem a transcrição de maneira específica de tecido.
[222] Em algumas modalidades, um ou mais sítios de ligação para um ou mais miRNAs são incorporados em um transgene de um vetor de rAAV, para inibir a expressão do transgene em um ou mais tecidos de um sujeito que abrigam os transgenes. Os sítios alvo de miRNA no mRNA podem estar na 5' UTR, na 3' UTR ou na região de codificação. Normalmente, o sítio alvo está na 3' UTR do mRNA. Além disso, o transgene pode ser projetado de forma que múltiplos miRNAs regulam o mRNA reconhecendo o mesmo ou múltiplos sítios. A presença de vários sítios de ligação de miRNA pode resultar na ação cooperativa de múltiplos RISCs e proporcionar uma inibição de expressão altamente eficiente. A sequência do sítio alvo pode compreender um total de 5-100, 10-60 ou mais nucleotídeos. A sequência do sítio alvo pode compreender pelo menos 5 nucleotídeos da sequência de um sítio de ligação do gene alvo.
[223] Por exemplo, um sítio 3'UTR que inibiria a expressão do transgene no fígado pode ser incorporado em um transgene. Isso seria benéfico para os transgenes que codificam proteínas terapêuticas que são tóxicas para o fígado, uma vez que a maior parte do vírus administrado (aproximadamente 60 a 90%) é eventualmente encontrado no fígado. Assim, suprimir a expressão do gene terapêutico no fígado alivia a carga das células hepáticas.
[224] Em algumas modalidades, o vetor AAV será modificado para ser um AAV auto complementar. Um AAV auto complementar carrega a sequência complementar do transgene (ou seja, uma cópia dupla do transgene). A autocomplementação torna o gene mais estável depois de entrar na célula.
Sequências de Codificação de Transgene
[225] As sequências de ácido nucleico de transgenes descritas neste documento podem ser projetadas com base no conhecimento da composição específica (por exemplo, vetor viral) que expressará o transgene. Por exemplo, um tipo de sequência do transgene inclui uma sequência repórter, que após a expressão produz um sinal detectável. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína terapêutica ou RNA funcional terapêutico. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser utilizado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abrigue o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgênico. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença. As sequências de codificação de transgenes apropriadas serão evidentes para o versado na técnica.
[226] Em modalidades da presente invenção, os transgenes codificariam uma proteína funcional incluindo, mas não se limitando a TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17.
[227] O gene TK2 humano (Gene ID: 7084) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional. O DGUOK humano (Gene ID: 1716) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína dGK funcional. O gene TYMP humano (Gene ID: 1890) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína TP funcional. O gene RRM2B humano (Gene ID: 50584) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína p53R2 funcional. O gene SUCLA2 humano (Gene ID: 8803) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína SUCLA2 funcional. O gene SUCLG1 humano (Gene ID: 8802) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína SUCLG1 funcional. O gene POLG humano (Gene ID: 5428) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína POLG1 funcional. O gene MPV17 humano (Gene ID: 4538) pode ser usado para obter um transgene que codifica uma proteína de membrana mitocondrial funcional MPV17.
Otimização de códon de sequências de codificação de transgene
[228] A otimização de códons das sequências de codificação de transgene pode aumentar a eficiência da terapia gênica. Assim, em algumas modalidades, um ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntico à sequência de codificação do transgene que codifica a proteína terapêutica (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que é 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à sequência de ácido nucleico) é usado.
[229] As ferramentas de otimização de códons são conhecidas na técnica.
[230] Ácidos nucleicos otimizados por códon exemplares são os seguintes.
Ácido nucleico de TK2 otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 17):
ATGGGAGCATTTTGCCAGCGACCTAGTTCCGATAAAGAACAGGAGAAA GAGAAGAAGAGCGTCATCTGTGTGGAAGGTAACATCGCTAGTGGCAAAACGA CCTGTTTGGAATTTTTCTCTAATGCCACCGATGTGGAGGTGCTTACAGAGCCT GTTAGTAAATGGCGAAATGTTCGAGGACATAATCCGCTGGGACTGATGTATC ACGATGCCTCCAGATGGGGACTGACCCTTCAGACTTATGTCCAACTTACAAT GCTTGACAGGCACACTAGACCGCAGGTTAGCAGCGTGAGGCTGATGGAGCG CTCAATTCACTCTGCCAGGTATATATTCGTTGAGAACCTCTACCGATCTGGTA AGATGCCTGAGGTAGATTACGTAGTGCTGAGTGAATGGTTTGACTGGATTCTT CGCAACATGGATGTATCAGTGGATCTCATTGTTTACCTTAGGACTAACCCGGA GACGTGTTATCAGCGCTTGAAAAAGCGCTGCCGGGAAGAGGAAAAAGTGATT CCTCTGGAATACTTGGAAGCTATTCATCACCTTCACGAAGAGTGGCTGATAAA AGGTTCCCTGTTTCCCATGGCGGCCCCCGTGCTTGTCATAGAAGCGGATCAC CACATGGAAAGGATGCTCGAACTTTTCGAGCAAAATCGAGACCGGATTCTCA
CGCCGGAGAATCGAAAACATTGCCCATAG Ácido nucleico de dGK otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 18):
ATGGCTGCAGGGAGGCTTTTTTTGTCTAGATTGAGGGCACCTTTTAGC TCCATGGCGAAGTCTCCGCTTGAGGGGGTGAGTAGCAGCCGGGGGCTCCAT GCTGGCAGAGGGCCCCGGAGGCTGTCTATTGAGGGGAATATTGCAGTTGGT AAGAGCACGTTTGTTAAATTGCTCACGAAGACCTATCCAGAATGGCACGTTGC TACAGAACCAGTAGCTACATGGCAAAACATTCAAGCAGCAGGCACACAGAAG GCTTGCACTGCACAGTCTCTCGGAAACCTGCTCGATATGATGTACAGAGAGC CCGCCCGGTGGTCATACACGTTTCAGACCTTCAGCTTTCTTTCTCGGTTGAAG GTACAGTTGGAGCCCTTCCCAGAGAAGTTGCTTCAAGCACGGAAACCTGTAC AGATATTCGAACGATTGCATTTCGAGGCGCTGATGAACATACCTGTGCTTGTT CTGGATGTGAACGACGATTTTTCCGAGGAAGTTACTAAGCAAGAGGACCTCA
TGCGGGAGGTAAACACGTTCGTTAAGAACCTGTAA Ácido nucleico de TP otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 19):
ATGGCAGCATTGATGACACCAGGAACGGGGGCTCCGCCTGCGCCTGG CGATTTTTCAGGAGAGGGGAGTCAAGGTCTGCCGGACCCTTCACCGGAACC CAAACAGCTTCCCGAGCTTATTAGAATGAAGCGAGATGGGGGTCGCCTCTCT GAGGCTGACATACGCGGCTTTGTTGCGGCGGTCGTCAACGGCTCAGCACAA GGTGCGCAAATAGGAGCGATGCTGATGGCTATCAGGCTGAGGGGAATGGAT TTGGAAGAGACCAGTGTGCTGACTCAAGCGCTGGCACAGAGCGGCCAGCAG CTTGAATGGCCAGAAGCTTGGCGCCAACAATTGGTCGATAAACACTCAACCG GGGGCGTCGGGGACAAAGTCTCCCTTGTACTGGCACCTGCTCTGGCTGCGT GCGGATGTAAGGTTCCTATGATTAGCGGGCGGGGCTTGGGACATACGGGAG GAACGTTGGACAAACTCGAATCCATCCCTGGTTTCAACGTGATTCAGAGCCC TGAACAAATGCAAGTACTCCTGGATCAGGCAGGCTGCTGTATTGTTGGCCAA AGCGAACAACTCGTGCCTGCGGATGGTATCCTCTATGCTGCCAGGGATGTGA CCGCCACAGTTGACTCCCTCCCGCTGATAACAGCGTCAATTTTGAGTAAGAA GCTCGTCGAAGGGCTCAGCGCTCTTGTGGTTGATGTAAAATTTGGGGGGGC CGCAGTATTCCCCAACCAGGAACAAGCACGGGAACTGGCAAAAACCCTGGTT GGTGTGGGCGCTTCACTGGGCCTGAGAGTTGCCGCTGCCTTGACCGCCATG GATAAGCCGCTCGGTAGGTGCGTAGGTCATGCACTTGAAGTAGAAGAAGCCC TTTTGTGCATGGATGGGGCCGGTCCCCCTGACTTGCGGGATCTCGTAACCAC GCTTGGCGGCGCGTTGCTTTGGCTTTCTGGACACGCTGGTACCCAAGCGCA AGGGGCAGCAAGAGTCGCAGCAGCGCTTGATGACGGATCAGCTCTTGGGCG ATTTGAAAGAATGCTTGCAGCTCAGGGCGTAGATCCAGGGCTGGCGCGGGC CCTTTGCTCAGGTTCTCCAGCAGAGCGCCGACAGCTCCTTCCCAGGGCGCG AGAGCAGGAAGAATTGCTGGCCCCGGCTGATGGTACCGTCGAACTCGTACG GGCTTTGCCGCTGGCTCTTGTTTTGCACGAACTGGGGGCTGGGCGGAGTCG CGCCGGTGAACCTCTCAGACTCGGTGTGGGTGCGGAGCTCCTCGTTGACGT CGGGCAACGACTTCGCAGGGGAACCCCTTGGCTTAGGGTACACAGGGACGG GCCAGCACTCAGCGGCCCTCAGTCCAGGGCCCTTCAAGAAGCTCTCGTGCT GAGTGATCGAGCGCCTTTTGCCGCTCCCTCACCATTTGCTGAATTGGTATTG
CCACCCCAGCAGTAA Ácido nucleico de p53R2 otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 20):
ATGCTGCTTCTCAGACTGCCACCCCACCGCAGTCATGCTTCCCCACTT GACTGTAAACTTCAAGATAGGTGCCGGAAGTGTTACTCACCCCGATCAGGAC AAGCGTGCCCTCCTGCGTTGGCGGCCGCCTGGCTTCGGCGGTGTGAACGCC GAGGAGGTCGGCCGAGGGGTGGGCGACGCAAGGAACTGACCCTTGGCCTG CGCCCTGCACGGTGTTCAGCTCCCGGTCCTGCCAAGGATGATGCATGGAGA CCTCAGGCAGGTCGCTCCTCCTCAGATACCAACGAGAGTGAAATTAAATCTA ATGAAGAACCCCTTCTTCGCAAGAGTAGTCGCAGGTTCGTGATATTCCCCATA CAATATCCTGATATCTGGAAAATGTACAAGCAAGCCCAAGCATCATTCTGGAC CGCAGAAGAGGTTGATCTCAGTAAGGACCTCCCACACTGGAACAAACTGAAA GCCGACGAAAAATATTTCATATCCCATATACTTGCTTTCTTTGCAGCCTCAGAT GGAATTGTGAATGAAAACTTGGTAGAGCGCTTCTCTCAAGAGGTCCAAGTTC CTGAAGCACGATGCTTTTACGGATTTCAAATCCTGATAGAAAATGTACATTCC GAAATGTATTCCTTGCTTATAGACACGTATATCAGAGATCCCAAAAAAAGGGA GTTCTTGTTCAATGCGATCGAGACCATGCCATATGTTAAGAAAAAAGCCGATT GGGCCCTGAGGTGGATAGCTGATAGGAAGTCTACATTTGGGGAACGCGTTGT TGCCTTCGCCGCCGTCGAGGGAGTCTTCTTCTCCGGATCCTTCGCTGCTATC TTTTGGCTGAAAAAACGCGGCTTGATGCCTGGTTTGACCTTTAGCAATGAGTT GATATCACGGGATGAAGGGCTGCATTGTGACTTTGCCTGCCTTATGTTCCAG TACTTGGTGAACAAACCGTCTGAGGAACGGGTAAGGGAAATCATAGTGGATG CAGTAAAAATAGAGCAGGAGTTCCTTACTGAAGCGCTCCCCGTAGGGCTCAT TGGCATGAACTGCATTCTTATGAAGCAGTACATCGAGTTCGTGGCCGATAGA CTTTTGGTGGAGCTCGGGTTCTCAAAGGTTTTTCAGGCTGAAAATCCTTTTGA TTTTATGGAGAACATATCTCTGGAGGGCAAGACTAACTTTTTTGAAAAAAGAG TATCCGAGTATCAAAGGTTTGCCGTGATGGCAGAAACAACAGATAATGTCTTC
ACACTTGATGCGGATTTTTAA Ácido nucleico de SUCLA2 otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 21):
ATGGCGGCTTCTATGTTCTATGGACGCCTGGTCGCCGTTGCCACGTTG CGGAATCACAGGCCCCGAACTGCACAAAGGGCTGCCGCTCAGGTGCTTGGA AGCAGCGGATTGTTCAACAATCACGGCCTCCAAGTTCAGCAACAGCAGCAGA GAAACCTCTCTCTGCATGAGTATATGAGTATGGAACTGCTCCAGGAAGCAGG GGTGTCTGTACCAAAGGGCTACGTAGCAAAAAGCCCCGACGAGGCGTACGC CATAGCTAAAAAACTGGGAAGTAAGGACGTAGTTATCAAAGCACAGGTTCTG GCCGGTGGCCGCGGTAAGGGAACCTTCGAGAGTGGTTTGAAAGGCGGTGTC AAGATCGTATTTAGTCCCGAGGAGGCCAAGGCTGTAAGTTCCCAGATGATCG GCAAAAAATTGTTCACAAAGCAAACCGGCGAAAAGGGTAGAATTTGCAACCA AGTACTTGTCTGCGAAAGAAAGTATCCGAGAAGGGAGTATTATTTCGCTATAA CCATGGAAAGATCATTCCAAGGTCCCGTGCTCATCGGCAGTTCACACGGGGG CGTTAATATAGAGGATGTCGCTGCAGAGTCTCCGGAGGCCATAATTAAGGAG CCTATAGACATCGAGGAAGGCATTAAAAAAGAACAAGCCTTGCAACTGGCAC AAAAAATGGGTTTTCCTCCGAACATCGTCGAGAGTGCCGCAGAAAATATGGT GAAACTGTACAGCCTGTTTTTGAAGTACGATGCGACAATGATAGAAATTAATC CGATGGTCGAGGACTCAGATGGAGCCGTGCTTTGTATGGACGCCAAAATTAA CTTCGATTCAAACAGCGCTTATCGACAGAAGAAAATTTTCGATTTGCAAGATT GGACCCAAGAGGATGAGCGAGACAAAGATGCCGCCAAAGCAAATCTCAATTA TATAGGACTCGATGGTAATATTGGATGTTTGGTCAATGGTGCCGGTCTCGCG ATGGCAACTATGGATATAATCAAGTTGCATGGTGGGACTCCCGCCAACTTTCT TGACGTCGGGGGAGGCGCCACCGTTCACCAAGTTACGGAGGCTTTCAAACT CATAACCTCTGACAAGAAGGTGCTGGCGATTCTTGTAAATATCTTTGGTGGCA TTATGCGGTGTGATGTTATTGCCCAGGGAATAGTAATGGCTGTCAAAGATTTG GAGATTAAAATACCCGTCGTGGTGCGGCTCCAAGGTACTCGAGTAGATGATG CTAAGGCTCTGATTGCCGACAGCGGGCTGAAGATTCTGGCATGTGATGATTT GGACGAGGCAGCGAGAATGGTCGTGAAGCTCTCAGAAATAGTAACTTTGGCG
AAACAGGCTCATGTCGATGTAAAGTTCCAACTTCCTATATGA Ácido nucleico de SUCLG1 otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 22):
ATGACCGCTACGCTTGCGGCTGCAGCCGACATCGCGACAATGGTCTC TGGAAGTTCAGGCTTGGCCGCGGCTCGGCTTCTGAGTAGAAGTTTCTTGTTG CCGCAAAACGGTATCAGGCACTGCTCCTACACCGCCAGTAGACAACACCTTT ATGTTGATAAGAACACGAAGATAATTTGCCAAGGATTCACCGGTAAACAGGG GACCTTCCATTCCCAGCAGGCACTGGAATATGGAACTAAATTGGTAGGCGGC ACTACGCCTGGGAAGGGTGGCCAAACACATCTTGGTCTTCCCGTTTTTAACA CAGTGAAGGAGGCTAAAGAACAAACGGGGGCAACGGCTAGCGTTATCTATGT CCCACCCCCGTTTGCCGCTGCAGCCATAAATGAGGCGATTGAAGCCGAGATC CCGCTTGTAGTCTGCATAACGGAGGGAATTCCGCAACAAGACATGGTGCGAG TAAAGCACAAGCTTCTTCGACAGGAAAAAACAAGACTGATAGGTCCGAATTGT CCTGGCGTAATTAACCCCGGTGAATGCAAAATCGGAATTATGCCGGGACATA TTCACAAAAAAGGCCGAATCGGGATAGTCAGCAGATCAGGCACCTTGACATA CGAAGCGGTTCACCAGACTACGCAAGTCGGTTTGGGACAAAGCCTTTGCGTC GGTATCGGTGGCGACCCATTTAACGGGACGGATTTCATTGACTGTCTGGAGA TCTTCCTCAACGATTCCGCGACAGAAGGAATCATTTTGATAGGAGAAATAGGC GGGAACGCCGAAGAGAATGCAGCGGAATTCCTCAAACAACATAACTCTGGCC CTAATAGTAAGCCGGTGGTATCATTCATAGCCGGTCTTACAGCGCCGCCGGG TCGCAGAATGGGCCACGCAGGTGCAATTATAGCGGGGGGCAAGGGAGGTGC CAAAGAAAAGATATCCGCTCTTCAAAGCGCAGGTGTAGTAGTTAGTATGAGTC CAGCTCAACTGGGCACAACCATCTACAAAGAATTTGAAAAGCGGAAAATGCTT
TGA Ácido nucleico de MPV17 otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 23):
ATGGCCCTCTGGAGAGCTTACCAACGAGCCTTGGCCGCGCACCCTTG GAAGGTACAGGTCTTGACCGCCGGATCTTTGATGGGTCTTGGAGATATTATTT CTCAACAGTTGGTTGAACGGCGAGGCCTCCAGGAACACCAAAGGGGGAGAA CCCTTACAATGGTAAGTCTGGGTTGCGGATTCGTCGGGCCTGTCGTGGGGG GATGGTATAAGGTTCTGGATCGCTTTATACCGGGGACCACCAAGGTCGATGC CTTGAAGAAGATGTTGCTGGATCAGGGAGGATTCGCTCCGTGTTTTTTGGGA TGTTTTCTGCCACTTGTTGGGGCTCTGAACGGACTGTCCGCGCAGGATAACT GGGCGAAGTTGCAACGCGACTACCCAGACGCCCTGATAACAAATTACTATCT CTGGCCAGCAGTTCAGTTGGCCAATTTTTACCTGGTACCTCTCCACTATCGCC TTGCTGTAGTACAGTGTGTCGCCGTCATCTGGAACTCATACCTTTCATGGAAG
GCTCATAGATTGTAA Ácido nucleico de POLG otimizado por códon exemplar (SEQ ID NO: 24):
ATGTCCAGGCTGCTCTGGCGGAAGGTCGCAGGCGCCACTGTCGGTCC AGGACCAGTTCCAGCTCCCGGTCGCTGGGTGAGCAGCAGCGTGCCAGCTAG CGATCCGAGCGACGGTCAGCGGCGACGGCAACAACAGCAGCAACAGCAACA ACAGCAACAACAACAGCCCCAGCAGCCTCAGGTTCTCAGTTCCGAGGGTGG CCAACTCCGACACAACCCACTGGATATACAGATGCTCTCCCGCGGTCTCCAC GAACAAATATTCGGACAAGGGGGTGAGATGCCGGGAGAGGCTGCGGTCAGG CGCAGTGTAGAACATCTCCAGAAACACGGGTTGTGGGGCCAACCGGCCGTT CCTCTCCCCGATGTTGAACTGCGGCTTCCACCTCTCTACGGTGATAATCTGG ACCAGCACTTTAGACTGCTCGCTCAAAAGCAGAGTCTCCCTTACCTGGAAGC CGCTAACCTCCTGCTCCAAGCCCAATTGCCCCCTAAACCGCCAGCCTGGGCT TGGGCGGAGGGATGGACGAGGTATGGACCCGAAGGGGAGGCTGTGCCAGT TGCTATACCAGAGGAACGCGCTCTGGTTTTCGACGTAGAGGTTTGTCTCGCG GAGGGAACTTGTCCTACACTGGCTGTAGCAATTTCCCCTTCAGCCTGGTACA GCTGGTGCTCTCAGAGATTGGTGGAAGAAAGGTATAGCTGGACTAGCCAGCT GAGTCCCGCGGACCTCATTCCACTTGAGGTACCCACCGGGGCGTCAAGCCC AACTCAGAGGGACTGGCAGGAACAATTGGTAGTTGGGCATAATGTGAGTTTT GACAGGGCTCATATCCGCGAACAGTATCTTATCCAGGGCTCTAGAATGCGAT TCCTTGACACGATGAGCATGCACATGGCAATCAGCGGACTTAGTTCCTTTCA GAGGTCATTGTGGATTGCAGCCAAGCAGGGAAAGCATAAGGTCCAACCCCC GACAAAACAAGGTCAGAAATCCCAGAGAAAAGCCCGGCGAGGCCCCGCCAT CAGTTCCTGGGATTGGTTGGATATCAGTAGTGTGAATAGCCTTGCTGAGGTG CATCGCCTGTATGTGGGTGGACCCCCACTTGAGAAAGAGCCTAGGGAGCTCT TCGTCAAAGGCACCATGAAGGATATTAGAGAGAATTTTCAAGATCTCATGCAA TACTGCGCACAAGACGTATGGGCAACGCATGAGGTCTTTCAACAGCAACTCC CCCTCTTTTTGGAACGATGTCCACATCCCGTCACTCTTGCTGGGATGTTGGAA ATGGGTGTAAGTTATTTGCCAGTCAATCAAAATTGGGAGAGATACTTGGCTGA AGCGCAGGGTACATATGAGGAACTTCAGCGAGAAATGAAAAAAAGTCTTATG GATTTGGCCAATGACGCCTGCCAGCTGCTTTCCGGTGAGCGGTACAAAGAAG ATCCATGGCTTTGGGATCTCGAATGGGATTTGCAGGAATTTAAACAGAAAAAG GCCAAGAAGGTCAAGAAAGAGCCAGCTACAGCCTCAAAGCTCCCTATAGAGG GAGCGGGAGCACCGGGTGATCCGATGGATCAAGAGGATTTGGGACCTTGCT CCGAAGAGGAGGAATTCCAACAAGATGTAATGGCAAGGGCCTGCCTGCAAAA GCTCAAAGGGACAACAGAACTCTTGCCCAAGAGGCCTCAACATCTGCCCGGC CATCCAGGTTGGTATCGCAAACTCTGTCCAAGGCTGGACGATCCCGCCTGGA CCCCGGGGCCCTCCCTTCTGAGTCTGCAGATGAGAGTGACACCTAAGCTGAT GGCACTTACTTGGGATGGGTTCCCTCTTCACTATTCAGAGAGACACGGGTGG GGATATCTTGTCCCAGGTCGAAGGGACAATCTGGCGAAGCTTCCCACAGGAA CTACCTTGGAGAGTGCGGGCGTAGTATGTCCTTATCGAGCCATAGAAAGTCT GTATAGAAAGCATTGCCTTGAACAAGGCAAACAACAACTCATGCCTCAGGAA GCCGGCCTCGCTGAAGAATTTCTTCTTACTGATAACTCTGCTATCTGGCAAAC AGTGGAGGAACTGGATTACCTCGAAGTCGAGGCCGAAGCGAAGATGGAAAA TTTGCGGGCGGCGGTCCCAGGTCAGCCCCTTGCTTTGACAGCACGGGGGGG CCCTAAGGATACCCAGCCCAGCTATCATCACGGGAACGGTCCATATAATGAT GTTGATATACCTGGTTGTTGGTTTTTTAAACTTCCTCATAAAGATGGCAATTCA TGTAACGTTGGATCCCCATTCGCAAAGGACTTCCTCCCCAAAATGGAGGATG GGACGTTGCAAGCAGGTCCCGGTGGAGCTTCTGGGCCGCGAGCCCTGGAAA TAAATAAGATGATTAGCTTCTGGAGGAATGCACACAAGCGCATTTCTTCACAG ATGGTAGTGTGGCTGCCTCGGAGTGCTTTGCCCAGGGCTGTGATCAGACAC CCCGATTATGATGAAGAGGGACTGTACGGGGCAATATTGCCCCAGGTGGTTA CGGCTGGTACTATTACCCGCCGGGCAGTTGAGCCGACCTGGCTGACAGCAT CTAATGCCAGGCCTGATCGCGTGGGTTCTGAACTTAAAGCAATGGTCCAAGC TCCGCCTGGATACACGCTTGTCGGCGCGGACGTGGACTCCCAGGAACTTTG GATAGCGGCTGTCCTTGGCGATGCACATTTTGCAGGGATGCACGGGTGCAC GGCTTTTGGCTGGATGACACTTCAGGGGAGGAAATCAAGGGGGACCGACCT GCACTCCAAGACCGCGACAACGGTAGGAATCTCAAGGGAACACGCTAAAATT TTCAATTATGGGAGAATATATGGTGCCGGTCAACCGTTCGCTGAGCGCCTTC TGATGCAGTTTAACCATAGGCTGACACAGCAGGAGGCAGCGGAGAAGGCGC AGCAGATGTACGCCGCAACTAAGGGTCTCAGATGGTATCGCCTCTCAGACGA GGGCGAGTGGCTTGTCCGGGAATTGAACCTCCCGGTCGATCGGACGGAAGG TGGTTGGATTAGTCTTCAGGATCTCAGAAAGGTGCAGCGGGAAACAGCACGC AAGTCTCAGTGGAAGAAATGGGAGGTGGTCGCCGAGCGGGCATGGAAGGGT GGAACAGAATCCGAGATGTTTAACAAGCTGGAGAGCATAGCAACTAGTGACA TCCCTAGGACACCGGTCTTGGGATGTTGCATTAGCCGGGCACTCGAGCCATC TGCCGTACAGGAAGAATTCATGACGTCACGGGTCAACTGGGTTGTCCAGTCT TCAGCCGTCGATTATCTGCATTTGATGCTGGTCGCGATGAAGTGGCTCTTCG AAGAGTTTGCTATAGATGGCCGATTTTGCATCTCTATTCACGATGAGGTGCGC TACCTGGTAAGGGAAGAAGACCGATACCGAGCCGCCCTCGCCCTTCAGATAA CAAATCTGCTTACCAGGTGTATGTTTGCATACAAGCTGGGGTTGAACGACCTT CCCCAGTCCGTCGCTTTCTTTTCAGCTGTTGATATAGATCGCTGCCTGAGAAA AGAGGTTACGATGGACTGCAAAACGCCCTCAAACCCCACTGGTATGGAGCGC AGATATGGCATCCCCCAAGGAGAAGCCCTCGACATATACCAGATAATTGAGC
TCACGAAGGGCAGCCTGGAGAAGAGATCCCAACCTGGCCCATAG Composições de AAV Recombinantes Exemplares
[231] A presente divulgação fornece composições contendo um AAV recombinante contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína funcional. Essas proteínas incluem, sem limitação, TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um promotor de beta actina de galinha. Em algumas modalidades, o rAAV compreende ainda um potenciador de CMV. Em algumas modalidades, o rAAV compreende ainda ITRs. Em algumas modalidades, o rAAV compreende ainda um 3' UTR. Em algumas modalidades, o rAAV é AAV 2 ou AAV9. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma enzima TK2 funcional.
[232] Um vetor rAAV-hTK2 exemplar compreendendo o transgene TK2 humano, um promotor de beta actina de galinha, um potenciador de CMV IE, um BGH 3'UTR, um sinal poli A e uma ITR 5'e 3' é mostrado na Figura 1.
[233] Ambos os vetores rAAV9-hTK2 e rAAV2-hTK2 foram usados nos Exemplos. Estes construtos têm a mesma ITR, mas diferentes sequências de proteínas de capsídeo.
[234] Em certas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmacêutico.
[235] Em algumas modalidades, a composição compreende mais de um rAAV compreendendo um transgene que codifica uma proteína funcional incluindo, mas não se limitando a TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17.
Vias de Administração e Dosagem
[236] A presente invenção fornece vetores rAAV para uso em métodos de tratamento, prevenção e/ou cura de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio e/ou restauração da função de uma proteína que é disfuncional em uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio e/ou aliviar em um sujeito pelo menos um dos sintomas associados a pools de nucleotídeos em desequilíbrio. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a administração de um vetor rAAV que codifica um ou mais peptídeos terapêuticos, polipeptídeos, shRNAs, microRNAs ou nucleotídeos antisense, em um carreador farmaceuticamente aceitável para o sujeito em uma quantidade e por um período de tempo suficiente para tratar, prevenir e/ou curar a doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio no sujeito com ou suspeito de ter tal distúrbio.
[237] Doenças ou distúrbios caracterizados por pools de nucleotídeos em desequilíbrio que podem ser tratados, prevenidos e/ou curados pelo método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles caracterizados por mutações nos seguintes genes: TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLG1; e MPV17. As proteínas codificadas por estes genes podem ser restauradas pelo método da invenção e incluem, mas não estão limitadas a TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17.
[238] Os rAAVs podem ser administrados a um sujeito em composições de acordo com quaisquer métodos apropriados conhecidos na técnica. O rAAV, preferencialmente suspenso em um carreador fisiologicamente compatível (por exemplo, em uma composição), pode ser administrado a um sujeito. Em certas modalidades, as composições podem compreender um rAAV sozinho ou em combinação com um ou mais outros vírus (por exemplo, uma segunda codificação de rAAV com um ou mais transgenes diferentes). Em uma modalidade, uma composição pode compreender um vetor rAAV9 que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica uma proteína funcional incluindo, mas não se limitando a TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17.
[239] Em uma modalidade adicional, uma composição pode compreender um vetor rAAV2 compreendendo uma sequência de ácido nucleico compreendendo um transgene que codifica uma proteína funcional incluindo, mas não se limitando a, TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e uma proteína de membrana mitocondrial MPV17.
[240] Em outra modalidade adicional, uma composição pode compreender um vetor rAAV9 que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica uma TK2 funcional. Em uma modalidade adicional, uma composição pode compreender um vetor rAAV2 que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica uma TK2 funcional. Em uma modalidade adicional, uma composição pode compreender um vetor rAAV9 que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica TK2 e um vetor rAAV2 que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica TK2.
[241] Os carreadores adequados podem ser facilmente selecionados por um versado na técnica de acordo com a indicação para a qual o rAAV édirecionado. Por exemplo, um carreador adequado inclui solução salina, que pode ser formulada com uma variedade de soluções tampão (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Outros carreadores exemplares incluem solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrano, ágar, pectina, óleo de amendoim, óleo de gergelim e água. A seleção do carreador não é uma limitação da presente invenção.
[242] Opcionalmente, as composições da invenção podem conter, além do rAAV e do(s) carreador(es), outros ingredientes farmacêuticos convencionais, tais como conservantes ou estabilizadores químicos. Conservantes exemplares adequados incluem clorobutanol, sorbato de potássio, ácido sórbico, dióxido de enxofre, galato de propila, parabenos, etilvanilina, glicerina, fenol e paraclorofenol. Estabilizadores químicos adequados incluem gelatina e albumina.
[243] Em algumas modalidades, as composições de rAAV são formuladas para reduzir a agregação de partículas de AAV na composição, particularmente onde estão presentes concentrações elevadas de rAAV (por exemplo, cerca de 1013 GC/ml ou mais). Métodos para reduzir a agregação de rAAVs são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, adição de surfactantes, ajuste de pH e ajuste de concentração de sal (ver, por exemplo, Wright, et al., Molecular Therapy 12: 171- 178 (2005).
[244] A formulação de excipientes farmaceuticamente aceitáveis e soluções carreadoras ébem conhecida dos versados na técnica, bem como desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para utilizar as composições específicas descritas neste documento em uma variedade de regimes de tratamento. Normalmente, essas formulações podem conter pelo menos cerca de 0,1% do ingrediente ativo ou mais, embora a porcentagem do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa, é claro, ser variada e pode estar convenientemente entre cerca de 1 ou 2% e cerca de 70% ou 80% ou mais do peso ou volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade de ingredientes ativos em cada composição terapeuticamente útil pode ser preparada de modo que uma dosagem adequada seráobtida em qualquer dose unitária do composto. Fatores, tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, vida útil do produto, assim como outras considerações farmacológicas, serão contemplados por aqueles versados na técnica de preparação de tais formulações farmacêuticas, e como tal, uma variedade das dosagens e regimes de tratamento pode ser desejável.
[245] As formas farmacêuticas apropriadas para uso em injeção podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microrganismos. Em muitos casos, a forma é estéril e fluida, na medida em que existe facilidade de seringa. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e similares), misturas apropriadas destes e/ou óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso da dispersão e pela utilização de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que atrasam a absorção, por exemplo, o monoestearato de alumínio e gelatina.
[246] Para a administração de uma solução aquosa injetável, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário e o diluente líquido primeiro se tornou isotônico com salina ou glicose suficientes. Essas soluções aquosas específicas são especialmente adequadas para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. A este respeito, um meio aquoso estéril que pode ser utilizado será conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto para a infusão. Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do hospedeiro. O responsável pela administração pode, em qualquer caso, determinar a dose adequada para o hospedeiro individual.
[247] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação dos rAAV ativos nas quantidades necessárias, no solvente adequado com vários outros ingredientes enumerados neste documento, conforme necessário, seguido da esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões podem ser preparadas pela incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados a um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferenciais são secagem a vácuo e de liofilização que produz um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada esterilizada deste
[248] Além dos métodos de administração descritos acima, as seguintes técnicas são também contempladas como métodos alternativos de distribuição das composições de rAAV a um hospedeiro. A sonoforese (ou seja, ultrassom) foi usada e descrita na Patente US Nº5.656.016 como um dispositivo para aumentar a taxa e eficácia de permeação de fármacos no e através do sistema circulatório. Outras alternativas de distribuição de fármacos contempladas são a injeção intraóssea (Patente US nº5.779.708), dispositivos de microchip (Patente US nº5.797.898), formulações oftálmicas, matrizes transdérmicas (Patentes US nº 5.770.219 e
5.783.208) e liberação controlada por feedback (Patente US nº5.797.899).
[249] Os rAAVS são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e proporcionar níveis suficientes de transferência e expressão gênica sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitadas a, distribuição direta ao tecido selecionado (por exemplo, administração intracerebral, administração intratecal), intravenosa, oral, inalatória (incluindo administração intranasal e intratraqueal), intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intratumoral e outras vias de administração parenterais. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado. O regime de administração depende de vários fatores, incluindo a taxa de rotatividade de soro ou tecidos da composição terapêutica, o nível de sintomas e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Preferencialmente, o regime de administração distribui composição terapêutica suficiente para realizar a melhora no estado da doença alvo, ao mesmo tempo que minimiza os efeitos colaterais indesejáveis. Consequentemente, a quantidade de liberação biológica depende em parte da composição terapêutica específica e da gravidade da condição a ser tratada.
[250] A presente invenção fornece composições farmacêuticas estáveis compreendendo vírions de rAAV. As composições permanecem estáveis e ativas mesmo quando sujeitas a ciclos de congelamento/descongelamento e quando armazenadas em recipientes feitos de vários materiais, incluindo vidro.
[251] As doses apropriadas dependerão do sujeito a ser tratado (por exemplo, primata humano ou não humano ou outro mamífero), idade e condição geral do sujeito a ser tratado, a gravidade da condição a ser tratada, o modo de administração dos vírions de rAAV, entre outros fatores. Uma quantidade terapeuticamente eficaz apropriada pode ser facilmente determinada por um versado na técnica.
[252] A dose de vírions rAAV necessária para se obter um efeito desejado ou "efeito terapêutico", por exemplo, as unidades de dose nos genomas do vetor/por quilograma de peso corporal (vg/kg), irá variar com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a: a via de administração do rAAV; o nível de expressão de gene ou RNA necessário para se obter um efeito terapêutico; a doença ou distúrbio específico a ser tratado; e a estabilidade do produto gênico ou de RNA. Um versado na técnica pode facilmente determinar uma faixa de dosagem do vírion de rAAV para tratar um sujeito com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores mencionados acima, bem como outros fatores que são bem conhecidos na técnica. Uma quantidade eficaz do rAAV geralmente fica na faixa de cerca de 10 µl a cerca de 100 ml de solução contendo de cerca de 10 9 a 1016 cópias do genoma por sujeito. Outros volumes de solução podem ser usados. O volume usado normalmente dependerá, entre outras coisas, do tamanho do sujeito, da dose de rAAV e da via de administração. Por exemplo, para administração intratecal ou intracerebral, pode ser usado um volume na faixa de 1 μl a 10 μl ou 10 μl a 100 μl. Para administração intravenosa, pode ser usado um volume na faixa de 10 μl a 100 μl, 100 μl a 1 ml, 1 ml a 10 ml ou mais. Em alguns casos, uma dosagem entre cerca de 1010 a 1012 cópias do genoma de rAAV por sujeito é apropriada. Em certas modalidades, 1012 cópias de genoma de rAAV por sujeito são eficazes para direcionamento para os tecidos desejados. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 ou 1015 cópias do genoma por sujeito. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de 10 10, 1011, 1012, 1013 ou 1014 cópias do genoma por kg.
[253] Assim, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ficará dentro de uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios clínicos. Por exemplo, para injeção in vivo, isto é, injeção diretamente no sujeito, uma dose terapeuticamente eficaz será da ordem de cerca de 10 5 a 1016 dos vírions do rAAV, mais preferencialmente 108 a 1014 vírions do rAAV. Para a transdução in vitro, uma quantidade eficaz de vírions do rAAV a ser distribuída às células será da ordem de 105 a 1013, preferencialmente 108 a 1013 vírions do rAAV. Se a composição compreender células transduzidas para serem devolvidas ao sujeito, a quantidade de células transduzidas nas composições farmacêuticas será de cerca de 104 a 1010 células, mais preferencialmente 105 a 108 células. É claro que a dose depende da eficiência da transdução, da força do promotor, da estabilidade da mensagem e da proteína codificada por ela, etc. As dosagens eficazes podem ser facilmente estabelecidas por uma pessoa de competência comum na técnica através de ensaios de rotina que estabelecem curvas de resposta à dose.
[254] O tratamento de dosagem pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas para, por fim, distribuir a quantidade especificada acima. Além disso, o sujeito pode receber tantas doses quanto apropriado. Assim, o sujeito pode receber, por exemplo, 105 a 1016 vírions do rAAV em uma dose única, ou duas, quatro, cinco, seis ou mais doses que resultam coletivamente na distribuição de, por exemplo, 105 a 1016 vírions do rAAV. Um versado na técnica pode facilmente determinar um número apropriado de doses a serem administradas.
[255] Composições farmacêuticas compreenderão assim material genético suficiente para produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de interesse, ou seja, em uma quantidade suficiente para reduzir ou melhorar os sintomas do estado de doença em questão, ou uma quantidade suficiente para conferir o benefício desejado. Assim, os vírions do rAAV estarão presentes nas composições em questão em uma quantidade suficiente para proporcionar um efeito terapêutico quando administrado em uma ou mais doses. Os vírions do rAAV podem ser fornecidos como preparações liofilizadas e diluídos nas composições estabilizadoras de vírions para uso imediato ou futuro. Alternativamente, os vírions de rAAV podem ser fornecidos imediatamente após a produção e armazenados para uso futuro.
[256] As composições farmacêuticas também conterão um excipiente farmaceuticamente aceitável ou carreadores. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza ele próprio a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição, e que poderão ser administrados sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos, por exemplo, sais ácidos de minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes de pH e similares, podem estar presentes em tais veículos. Uma discussão completa sobre excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences e US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).
[257] As formulações de agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas por mistura com carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas, soluções aquosas ou suspensões.
[258] A toxicidade e a eficácia terapêutica das composições terapêuticas, administradas sozinhas ou em combinação com outro agente, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais de experimento, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapêutica efetiva em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico (LD 50/ ED50). Em aspectos específicos, são desejáveis composições terapêuticas que apresentam índices terapêuticos elevados. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura celular e estudos em animais podem ser usados na formulação de um faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem desses compostos encontra-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração.
[259] A determinação da dose apropriada é feita pelo médico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores na técnica que sabidamente afetam ou que haja suspeita de que afetem o tratamento. Geralmente, a dose começa com uma quantidade um pouco menor que a dose ideal e daípor diante é aumentada por incrementos pequenos até que seja atingido o efeito desejado ou ideal em relação a quaisquer efeitos colaterais negativos. As medidas diagnósticas importantes incluem os sintomas de, por exemplo, a inflamação ou o nível de citocinas inflamatórias produzidas. Em geral, é desejável que um produto biológico que será usado seja derivado da mesma espécie que o animal ao qual o tratamento é direcionado, minimizando assim qualquer resposta imunológica ao reagente.
[260] Uma via de administração preferencial dos AAVs é a intravenosa.
[261] Uma dose preferencial varia de cerca de 1x1010 a cerca de 8x1011, de cerca de 2x1010 a cerca de 6x1011, de cerca de 4x1010 a cerca de 4x1011 de administração total de genoma ou cópia viral (vc). Uma dose preferencial é de cerca de 4x1011 de administração total de genoma ou cópia viral (vc) de rAAV.
[262] Se mais do que um rAAV for usado uma dose total preferencial do vetor varia de cerca de 1x1010 a cerca de 6x1011, de cerca de 2x1010 a cerca de 5x1011, de cerca de 1x1010 a cerca de 4x1011 de administração total de genoma ou cópia viral (vc). Uma dose preferencial de vetor total é de cerca de 3x1011. O AAV pode ser administrado em quantidades iguais, por exemplo, razão de 50/50, ou em ou em razões de cerca de 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35 / 65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10 e 95/5.
[263] As doses podem ser ajustadas para otimizar os efeitos no sujeito. Adicionalmente, um sujeito pode ser monitorado para melhorar sua condição antes de aumentar a dosagem. A resposta de um sujeito à administração terapêutica do rAAV pode ser monitorada através de observação da força e controle muscular e mobilidade do sujeito bem como mudanças na altura e no peso. Se um ou mais desses parâmetros aumentarem após a administração, o tratamento pode continuar. Se um ou mais desses parâmetros permanecerem iguais ou diminuírem, a dosagem pode ser aumentada.
Terapia Farmacológica - Métodos de Administração e Dosagem
[264] A presente invenção abrange a administração de desoxinucleosídeos e/ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos, em combinação com a administração de uma composição contendo um transgene que codifica uma proteína descrita neste documento
[265] Os métodos mais preferenciais de administração são oral, intratecal, e parenteral, incluindo intravenosa. Os desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos devem estar na forma apropriada para a administração escolhida.
[266] Os desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo são facilmente dissolvidos em líquido e facilmente dissolvidos em líquido (como água, fórmula ou leite), enquanto a forma livre de ácido não se dissolve facilmente em líquido.
[267] Estas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos para administração podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz dos desoxinucleosídeosou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como soluções salinas em água e óleos, incluindo os de petróleo, animais, vegetais ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. Uma solução salina é um carreador preferencial quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH.
[268] A administração oral é um método preferencial de administração. Os desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos podem ser adicionados a qualquer forma de líquido que um paciente consumiria, incluindo, mas não se limitando a, leite, tanto de vaca quanto humano, fórmula infantil e água.
[269] Adicionalmente, composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser cápsulas, comprimidos, pós, grânulos, soluções, xaropes, suspensões (em líquidos não aquosos ou aquosos) ou emulsões. Comprimidos ou cápsulas de gelatina dura podem compreender lactose, amido ou derivados dos mesmos, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, ácido esteárico ou sais destes. Cápsulas de gelatina mole podem compreender óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semissólidos ou líquidos. Soluções e xaropes podem compreender água, polióis e açúcares. Um agente ativo destinado para administração oral pode ser revestido ou misturado por adição com um material que retarda a desintegração e/ou a absorção do agente ativo no trato gastrointestinal. Assim, a liberação prolongada pode ser atingida ao longo de muitas horas e, se necessário, o agente ativo pode ser protegido da degradação dentro do estômago. Composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas para facilitar a liberação de um agente ativo em um determinado local gastrointestinal devido a condições específicas de pH ou enzimáticas.
[270] A fim de superar qualquer problema dos desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos ao cruzar a barreira hematoencefálica, a administração intratecal é uma forma de administração adicional preferencial (Galbiati, et al. 2006; Gotz, et al. 2008). A administração intratecal envolve a injeção do fármaco no canal espinhal, mais especificamente no espaço subaracnóideo, de forma que ele alcance o fluido cefalorraquidiano. Esse método é comumente usado para anestesia espinhal, quimioterapia e medicação para dor. A administração intratecal pode ser desempenhada por punção lombar (injeção de bólus) ou por um sistema porta-cateter (bólus ou infusão). O cateter é mais comummente inserido entre as lâminas das vértebras lombares e a ponta é roscada no espaço tecal no nível desejado (geralmente L3-L4). As formulações intratecais mais comumente usam água e solução salina como excipientes, mas também foram usados EDTA e lipídios.
[271] Uma forma de administração adicionalmente preferencial é parenteral, incluindo a administração intravenosa. Composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral, incluindo administração intravenosa,
incluem soluções ou suspensões aquosas e não aquosas injetáveis estéreis, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam as composições substancialmente isotônicas ao sangue do sujeito. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais. Composições adaptadas para administração parenteral podem ser apresentadas em recipientes de doses unitárias ou múltiplas, tais como ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) que requer somente a adição de um carreador estéril, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis. Os veículos adequados que podem ser usados para fornecer as formas de dosagem parenteral da invenção são bem conhecidos dos versados na técnica. Os exemplos incluem: Água para Injeção USP; veículos aquosos como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose, Injeção de Dextrose e Cloreto de Sódio e Injeção de Solução Lática de Ringer; veículos miscíveis com água, tais como álcool etílico, polietilenoglicol e polipropilenoglicol; e veículos não aquosos, tais como óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila.
[272] Adicionalmente, uma vez que alguns pacientes podem estar recebendo nutrição enteral no momento em que o tratamento com desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo começa, os dNs ou dNMPs podem ser administrados através de um tubo de alimentação gastronômica ou outros meios de nutrição enteral.
[273] Métodos adicionais de administração incluem mucosas, tais como nasal, sublingual, vaginal, bucal ou retal; ou administração transdérmica a um sujeito.
[274] As composições farmacêuticas adaptadas para administração nasal e pulmonar podem compreender carreadores sólidos, tais como pós, os quais podem ser administrados por inalação rápida através do nariz. As composições para administração nasal podem compreender carreadores líquidos, tais como pulverizadores ou gotas. Alternativamente, a inalação direta através dos pulmões pode ser realizada por inalação profunda ou instalação através de um bocal. Essas composições podem compreender soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo. As composições para inalação podem ser fornecidas em dispositivos especialmente adaptados, incluindo, mas não limitados a, aerossóis, nebulizadores ou insufladores pressurizados, que podem ser construídos de forma a fornecer dosagens predeterminadas do ingrediente ativo.
[275] As composições farmacêuticas adaptadas para administração retal podem ser providas como supositórios ou enemas. As composições farmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser providas como pessários, absorventes internos, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações para pulverização.
[276] As composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser providas como adesivos discretos destinados a permanecerem em contato íntimo com a epiderme do receptor ao longo de um período prolongado de tempo.
[277] A terapia com desoxinucleosídeos compreende a administração de um ou mais desoxinucleosídeos escolhidos dentre o grupo que consiste em desoxitimidina (dT), desoxicitidina (dC), desoxiadenosina (dA) e desoxiguanosina (dG).
[278] Um profissional qualificado pode determinar quais deoxinucleosídeos são benéficos com base na deficiência. Também faz parte da técnica que o profissional determine se misturas dos desoxinucleosídeos devem ser administradas e em que razão. Se dois desoxinucleosídeos forem administrados, eles podem estar em uma razão de 50/50 de cada desoxinucleosídeo, por exemplo, dC e dT, ou em razões de cerca de 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10 e 95/5.
[279] A título de exemplo, dT e dC são administradas em mistura de quantidades iguais para deficiência de TK2.
[280] A terapia com monofosfatos de desoxirribonucleosídeo compreende a administração de um ou mais monofosfatos de desoxirribonucleosídeos escolhidos do grupo que consiste em TMP, dCMP, dAMP e dGMP. Se houver dois monofosfatos de desoxirribonucleosídeo, as razões podem ser determinadas.
[281] A título de exemplo, TMP e dCMP são administradas em mistura de quantidades iguais para deficiência de TK2.
[282] A seleção de uma dose terapeuticamente eficaz será determinada pelo versado na técnica considerando vários fatores, que serão conhecidos por uma pessoa de competência comum na técnica. Tais fatores incluem a forma específica do desoxinucleosídeo ou monofosfato de desoxirribonucleosídeo e seus parâmetros farmacocinéticos, tais como biodisponibilidade, metabolismo e meia- vida, que terão sido estabelecidos durante os procedimentos de desenvolvimento normais tipicamente empregados na obtenção de aprovação regulatória para um composto farmacêutico. Fatores adicionais ao considerar a dose incluem a condição ou doença a ser tratada ou o benefício a ser obtido em um indivíduo normal, a massa corporal do paciente, a via de administração, se a administração é aguda ou crônica, medicamentos concomitantes e outros fatores bem conhecidos por afetar a eficácia de agentes farmacêuticos administrados. Assim, a dose deve ser decidida de acordo com o julgamento da pessoa versada na técnica e as circunstâncias de cada paciente, e de acordo com técnicas clínicas padrão.
[283] Uma dose preferencial varia de cerca de 100 mg/kg/dia a cerca de 1000 mg/kg/dia. Uma dose preferencial adicional varia de cerca de 200 mg/kg/dia a cerca de 800 mg/kg/dia. Uma dose preferencial adicional varia de cerca de 250 mg/kg/dia a cerca de 400 mg/kg/dia. Estas quantidades de dosagem são de desoxinucleosídeos individuais ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo ou de uma composição com uma mistura de mais de um desoxinucleosídeo, por exemplo, dT e dC ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo. Por exemplo, uma dose pode compreender 400 mg/kg/dia somente de dT. Em um exemplo adicional, uma dose pode compreender uma mistura de 200 mg/kg/dia de dT e 200 mg/kg/dia de dC. Em um exemplo adicional, uma dose pode compreender 400 mg/kg/dia de uma mistura de dT e dC.
[284] A administração dos desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeos pode ser uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, até seis vezes ao dia, preferencialmente em intervalos regulares. Por exemplo, quando os desoxinucleosídeos são administrados quatro vezes ao dia, as doses seriam às 8:00, 12:00, 16:00 e 20:00.
[285] As doses também podem ser reduzidas se forem administradas por via intravenosa ou intratecal. Faixas de dosagem preferenciais para tal administração são de cerca de 50 mg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia
[286] Conforme mostrado no pedido '092, as doses podem ser ajustadas para otimizar os efeitos no sujeito. Por exemplo, os desoxinucleosídeos podem ser administrados a 100 mg/kg/dia no início e então aumentados ao longo do tempo para 200 mg/kg/dia, para 400 mg/kg/dia, para 800 mg/kg/dia, até 1000 mg/kg/dia, dependendo da resposta e tolerabilidade do sujeito.
[287] Um sujeito pode ser monitorado quanto à melhora da sua condição antes de aumentar a dosagem. A resposta de um sujeito à administração terapêutica dos desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo pode ser monitorada através de observação da força e controle muscular e mobilidade do sujeito, bem como mudanças na altura e no peso. Se um ou mais desses parâmetros aumentarem após a administração, o tratamento pode continuar. Se um ou mais desses parâmetros permanecerem iguais ou diminuírem, a dosagem dos desoxinucleosídeos pode ser aumentada.
[288] Conforme mostrado nos pedidos de patente anteriores, a terapia farmacológica é bem tolerada. Todos os efeitos adversos observados foram sem importância e foram principalmente diarreia, inchaço abdominal e outras manifestações gastrointestinais. Um sujeito também pode ser monitorado quanto a quaisquer efeitos adversos, tais como intolerância gastrointestinal, por exemplo, diarreia. Se um ou mais efeitos adversos forem observados após a administração, a dosagem pode ser diminuída. Se estes efeitos adversos não forem observados, a dosagem pode ser aumentada. Adicionalmente, uma vez que uma dosagem for diminuída devido àobservação de um efeito adverso e o efeito adverso não for mais observado, a dosagem pode ser aumentada.
[289] Os desoxinucleosídeos ou monofosfatos de desoxirribonucleosídeo também podem ser coadministrados com outros agentes. Tais agentes incluem agentes terapêuticos para tratar os sintomas da forma específica de MDS. Em particular, para a deficiência de TK2, dT e dC podem ser coadministradas com um inibidor de enzimas catabólicas de nucleosídeos ubíquas, incluindo, mas não limitadas a, inibidores enzimáticos, tais como tetra-hidrouridina (inibidora da citidina desaminase) e imucilina H (inibidora da purina nucleosídeo fosforilase) e tipiracil (inibidor da timidina fosforilase). Tais inibidores são conhecidos e usados no tratamento de alguns cânceres.
Kits
[290] A presente invenção também fornece kits compreendendo os componentes das combinações da invenção em forma de kit. Um kit da presente invenção inclui um ou mais componentes incluindo, mas não se limitando a, vetores virais (por exemplo, vetores AAV) e/ou agentes farmacológicos (por exemplo, desoxinucleosídeos e/ou monofosfatos de nucleosídeos) descritos neste documento. Os kits podem incluir ainda um carreador farmaceuticamente aceitável, conforme discutido neste documento. O vetor viral ou agente farmacológico pode ser formulado como uma composição pura ou em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável, em uma composição farmacêutica.
[291] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV contendo um transgene descrito neste documento em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[292] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV contendo um transgene descrito neste documento em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril) e um segundo vetor AAV que codifica um transgene descrito neste documento em outro recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[293] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV contendo um transgene descrito neste documento em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril) e um agente farmacológico em outro recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[294] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV2 contendo um transgene descrito neste documento em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril) e um agente farmacológico em outro recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[295] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV9 contendo um transgene descrito neste documento em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril) e um agente farmacológico em outro recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[296] Em algumas modalidades, um kit inclui um vetor AAV que codifica TK2, dGK, p53R2, TP, SUCLA2, SUCLG1, POLG1 e/ou uma proteína de membrana mitocondrial MPV17, ou uma composição farmacêutica desta em um recipiente (por exemplo, em um frasco de vidro ou plástico estéril).
[297] Se o kit incluir uma ou mais composições farmacêuticas para administração parentérica a um sujeito, o kit pode incluir um dispositivo para realizar tal administração. Por exemplo, o kit pode incluir uma ou mais agulhas hipodérmicas ou outros dispositivos de injeção conforme discutido acima.
[298] O kit pode incluir uma bula contendo informações relativas às composições farmacêuticas e formas farmacêuticas no kit. Geralmente, essa informação ajuda pacientes e médicos a usar as composições farmacêuticas e as formas farmacêuticas incluídas de forma eficaz e segura. Por exemplo, as seguintes informações relativas a uma combinação da invenção podem ser fornecidas na inserção: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, advertências, precauções, reações adversas, superdosagem, dosagem e administração adequadas, como fornecido, condições de armazenamento adequadas, referências, informações do fabricante/distribuidor e informações sobre patentes.
As modalidades exemplares da invenção incluem:
1. Um método para prevenir ou tratar a deficiência de timidina quinase 2
(TK2) em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional.
2. O método da modalidade 1, em que o rAAV é escolhido do grupo que consiste em AAV9 e AAV2.
3. O método da modalidade 1, em que o sujeito é um mamífero.
4. O método da modalidade 1, em que o sujeito é um humano.
5. O método da modalidade 1, em que a composição é uma composição farmacêutica.
6. O método da modalidade 1, em que a composição é a primeira composição que compreende um primeiro rAAV, em que o primeiro rAAV é AAV9 e compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um segundo rAAV que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica um proteína TK2 funcional, em que o segundo rAAV éAAV2 e éadministrado um tempo após a administração do primeiro rAAV.
7. O método da modalidade 6, em que a segunda composição é uma composição farmacêutica.
8. O método da modalidade 6, em que a primeira composição éadministrada assim que o sujeito é diagnosticado com deficiência de TK2 ou suspeita de ter deficiência de TK2, e continua a ser administrada durante a administração da segunda composição.
9. O método da modalidade 6, em que a segunda composição é administrada dias após a primeira composição.
10. O método, de acordo com a modalidade 6, em que a segunda composição é administrada semanas após a primeira composição.
11. O método, de acordo com a modalidade 6, em que a segunda composição é administrada pelo menos um mês após a primeira composição.
12. O método da modalidade 6, compreendendo ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terceira composição que compreende um agente farmacológico escolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT) e suas misturas.
13. O método da modalidade 12, em que a terceira composição é administrada ao mesmo tempo que a segunda composição.
14. O método da modalidade 12, em que a terceira composição é administrada após a segunda composição.
15. O método da modalidade 12, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 100 mg/kg/dia e cerca de 1000 mg/kg/dia.
16. O método da modalidade 12, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 200 mg/kg/dia e cerca de 800 mg/kg/dia.
17. O método da modalidade 12, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 250 mg/kg/dia e cerca de 400 mg/kg/dia.
18. O método da modalidade 12, em que a terceira composição é administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia ou seis vezes ao dia.
19. O método da modalidade 12, em que a terceira composição é administrada por via oral, intratecal, enteral ou intravenosa.
20. O método da modalidade 19, em que a terceira composição é administrada oralmente e compreende desoxinucleosídeo misturado com leite de vaca, leite humano, fórmula infantil ou água.
21. Um método para prevenir ou tratar a deficiência de timidina quinase 2 (TK2) em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma primeira composição compreendendo um agente farmacológico e a administração adicional de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional.
22. O método da modalidade 21, em que o agente farmacológico éescolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT) e suas misturas; e monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP) e suas misturas.
23. O método da modalidade 21, em que o rAAV é AAV9.
24. O método da modalidade 21, em que a segunda composição é uma composição farmacêutica.
25. O método da modalidade 21, em que a primeira composição é administrada assim que o sujeito é diagnosticado com deficiência de TK2 ou suspeita de ter deficiência de TK2 e continua a ser administrada durante a administração da segunda composição.
26. O método da modalidade 21, em que a segunda composição é administrada dias após a primeira composição.
27. O método da modalidade 21, em que a segunda composição é administrada semanas após a primeira composição.
28. O método da modalidade 21, em que a segunda composição é administrada pelo menos um mês após a primeira composição.
29. O método da modalidade 21, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 100 mg/kg/dia e cerca de 1000 mg/kg/dia.
30. O método da modalidade 21, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da primeira composição está entre cerca de 200 mg/kg/dia e cerca de 800 mg/kg/dia.
31. O método da modalidade 21, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da primeira composição está entre cerca de 250 mg/kg/dia e cerca de 400 mg/kg/dia.
32. O método da modalidade 21, em que a primeira composição é administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia ou seis vezes ao dia.
33. O método da modalidade 21, em que a primeira composição é administrada por via oral, intratecal, enteral ou intravenosa.
34. O método da modalidade 33, em que a primeira composição é administrada oralmente e compreende o agente farmacológico misturado com leite de vaca, leite humano, fórmula infantil ou água.
35. O método da modalidade 21, compreendendo ainda a administração de uma terceira composição que compreende um segundo rAAV que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional em que o segundo rAAV é AAV2.
36. Um método para restaurar a atividade da enzima timidina quinase 2 em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional.
37. O método da modalidade 36, em que o rAAV é escolhido do grupo que consiste em AAV9 e AAV2.
38. O método da modalidade 36, em que o sujeito é um mamífero.
39. O método da modalidade 36, em que o sujeito é um humano.
40. O método da modalidade 36, em que a composição é uma composição farmacêutica.
41. O método da modalidade 36, em que a composição é a primeira composição que compreende um primeiro rAAV, em que o primeiro rAAV é AAV9 e que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um segundo rAAV que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional, em que o segundo rAAV é AAV2 e é administrado após a administração do primeiro rAAV.
42. O método da modalidade 41, em que a segunda composição é uma composição farmacêutica.
43. O método da modalidade 41, em que a primeira composição é administrada assim que o sujeito é diagnosticado com deficiência de TK2 ou suspeita de ter deficiência de TK2 e continua a ser administrada durante a administração da segunda composição.
44. O método da modalidade 41, em que a segunda composição é administrada dias após a primeira composição.
45. O método da modalidade 41, em que a segunda composição é administrada semanas após a primeira composição.
46. O método da modalidade 41, em que a segunda composição é administrada pelo menos um mês após a primeira composição.
47. O método da modalidade 41, compreendendo ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terceira composição que compreende um agente farmacológico escolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT) e suas misturas.
48. O método da modalidade 47, em que a terceira composição é administrada ao mesmo tempo que a segunda composição.
49. O método, de acordo com a modalidade 47, em que a terceira composição é administrada após a segunda composição.
50. O método da modalidade 47, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 100 mg/kg/dia e cerca de 1000 mg/kg/dia.
51. O método da modalidade 47, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 200 mg/kg/dia e cerca de 800 mg/kg/dia.
52. O método, de acordo com a modalidade 47, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da terceira composição está entre cerca de 250 mg/kg/dia e cerca de 400 mg/kg/dia.
53. O método da modalidade 47, em que a terceira composição é administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia ou seis vezes ao dia.
54. O método da modalidade 47, em que a terceira composição é administrada por via oral, intratecal, enteral ou intravenosa.
55. O método da modalidade 54, em que a terceira composição é administrada oralmente e compreende desoxinucleosídeo misturado com leite de vaca, leite humano, fórmula infantil ou água.
56. Um método para restaurar a atividade da enzima timidina quinase 2 a um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma primeira composição compreendendo um agente farmacológico e a administração adicional de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional.
57. O método da modalidade 56, em que o agente farmacológico éescolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT) e suas misturas; e monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP) e suas misturas.
58. O método da modalidade 56, em que o rAAV é AAV9.
59. O método da modalidade 56, em que a segunda composição é uma composição farmacêutica.
60. O método da modalidade 56, em que a primeira composição é administrada assim que o sujeito é diagnosticado com deficiência de TK2 ou suspeita de ter deficiência de TK2 e continua a ser administrada durante a administração da segunda composição.
61. O método da modalidade 56, em que a segunda composição é administrada dias após a primeira composição.
62. O método da modalidade 56, em que a segunda composição é administrada semanas após a primeira composição.
63. O método da modalidade 56, em que a segunda composição é administrada pelo menos um mês após a primeira composição.
64. O método da modalidade 56, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da primeira composição está entre cerca de 100 mg/kg/dia e cerca de 1000 mg/kg/dia.
65. O método da modalidade 56, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da primeira composição está entre cerca de 200 mg/kg/dia e cerca de 800 mg/kg/dia.
66. O método da modalidade 56, em que a quantidade terapeuticamente eficaz da primeira composição está entre cerca de 250 mg/kg/dia e cerca de 400 mg/kg/dia.
67. O método da modalidade 56, em que a primeira composição é administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia ou seis vezes ao dia.
68. O método da modalidade 56, em que a primeira composição é administrada por via oral, intratecal, enteral ou intravenosa.
69. O método da modalidade 56, em que a primeira composição é administrada oralmente e compreende o agente farmacológico misturado com leite de vaca, leite humano, fórmula infantil ou água.
70. O método da modalidade 56, compreendendo ainda a administração de uma terceira composição que compreende um segundo rAAV que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene que codifica uma proteína TK2 funcional em que o segundo rAAV é AAV2.
71. Um método para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um vetor adeno- associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene escolhido do grupo que consiste em TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLGJ; e MPV17.
72. Um método para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma primeira composição que compreende um agente farmacológico e a administração adicional de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene escolhido do grupo que consiste em TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLGJ; e MPV17.
73. O método da modalidade 72, em que o agente farmacológico éescolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT), desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG) e suas misturas; e monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP), monofosfato de desoxiadenosina (dAMP), monofosfato de desoxiguanosina (dGMP) e suas misturas.
74. Um método para restaurar a atividade enzimática em uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende um vetor adeno- associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene escolhido do grupo que consiste em TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLGJ; e MPV17.
75. Um método para restaurar a atividade enzimática em uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma primeira composição que compreende um agente farmacológico e a administração adicional de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição que compreende um vetor adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um transgene escolhido do grupo que consiste em TK2; DGUOK; TYMP; RRM2B; SUCLA2; SUCLGJ; e MPV17.
76. O método da modalidade 75, em que o agente farmacológico éescolhido do grupo que consiste em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT), desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG) e suas misturas; e monofosfato de desoxicitidina (dCMP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP), monofosfato de desoxiadenosina (dAMP), monofosfato de desoxiguanosina (dGMP) e suas misturas.
EXEMPLOS
[299] A presente invenção pode ser melhor entendida por referência aos seguintes exemplos não limitantes, que são apresentados a fim de ilustrar de forma mais completa as modalidades preferenciais da invenção. Eles não devem, de forma alguma, ser interpretados como limitando o amplo escopo da invenção.
Exemplo 1 - Materiais e Métodos Modelo de Camundongo da Deficiência de TK2
[300] Um camundongo mutante homozigótico com knock-in de Tk2H126N (Tk2-/-) que manifesta um fenótipo surpreendentemente semelhante à encefalomiopatia infantil humana foi relatado anteriormente (Akman, et al. 2008). Entre o dia 10 e 13 pós-natal, os camundongos Tk2-/- desenvolvem rapidamente encefalomiopatia fatal caracterizada por diminuição da deambulação, marcha instável, tremor grosso, atraso do crescimento e rápida progressão para morte precoce aos 14 a 16 dias. Análises moleculares e bioquímicas do modelo de camundongo demonstraram que a patogênese da doença é devido à perda de atividade enzimática e desequilíbrios do pool de dNTP subsequentes com diminuição dos níveis de dTTP no cérebro e níveis de dTTP e dCTP no fígado, o que, por sua vez, produz depleção de mtDNA e defeitos das enzimas da cadeia respiratória contendo subunidades codificadas pelo mtDNA, mais proeminentemente no cérebro e na medula espinhal.
[301] Todos os experimentos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais Institucionais (Institutional Animal Care and Use Committee) do Centro Médico da Universidade de Columbia e foram consistentes com o Guia de Saúde de Institutos Nacionais para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institute of Health para Care and Use of Laboratory Animals). Os camundongos foram alojados e criados de acordo com condições padrão internacionais, com um ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de escuridão e sacrificados aos 4, 13 e 29 dias de idade.
[302] Órgãos (cérebro, medula espinhal, fígado, coração, rim, músculo quadríceps, pulmão e trato gastrointestinal) foram removidos e congelados na fase líquida de isopentano, pré-resfriado até próximo ao seu ponto de congelamento (- 160 °C) com gelo seco ou fixados em formalina tamponada neutra a 10% e incluídos em parafina usando procedimentos padrão. Tecido embebido em parafina foi então corado com hematoxilina e eosina (H&E) para estudo morfológico ou processado para estudos de imunocoloração com GFAP, COX I ou complexo I. Ambos os camundongos heterozigóticos e homozigóticos do tipo selvagem foram considerados como grupo de controle (Tk2+), pois diferenças clínicas e bioquímicas não foram descritas anteriormente (Akman, et al. 2008; Dorado, et al. 2011).
Construto hTK2
[303] O vetor que compreende o gene TK2 humano (pAAVsc CB6 PI TK2 é mostrado na Figura 1). Os principais componentes do construto incluem o cDNA de TK2 humano, bem como uma ITR 5', um potenciador de CMV IE, um promotor de beta actina de galinha, um BGH 3'UTR, um sinal Poli A, GRE e uma ITR 3'.
[304] Este vetor foi encapsulado em capsídeos AAV9 e AAV2 para os experimentos subsequentes.
Administração de Terapia Gênica
[305] Com base em resultados anteriores usando um vetor AAV9-GFP em camundongos do tipo selvagem e analisando a distribuição do vetor, mostrou-se que o vírus AAV9 não tem como alvo o cérebro quando administrado por via I.P. (resultados não mostrados). Com base neste trabalho, a administração do construto AAV9-hTK2 foi feita por injeção intravenosa (IV).
[306] O AAV9-hTK2 foi administrado via IV com uma injeção retro-orbital de um volume total de 35 µl de PBS 1X contendo cerca de 4,2 x 10 11 ou 4,2 x 1010 genoma ou cópias do vetor no dia 1 pós-natal.
[307] Alternativamente, AAV9-hTK2 foi administrado por via IV com uma injeção retro-orbital de 35 µL de PBS 1X contendo cerca de 2,1 x 10 11 cópias do vetor no dia 1 pós-natal, seguido pela administração de 100 µL de AAV2-hTK2 por via IV com uma injeção na veia da cauda contendo cerca de 1,05 x 1011 cópias do vetor no dia 29 e com e sem suplementação com 520 mg/kg/dia de dC+dT oral (em água potável) a partir do dia 21, presumindo um consumo de água de 4 ml/dia/camundongo.
Administração do Tratamento Farmacológico e Plano Experimental
[308] A desoxicitidina (dC) e a desoxitimidina (dT) são administradas em 50 µl de fórmula de leite Esbilac para animais de estimação pequenos (Pet-Ag) por gavagem oral diária para Tk2-/- e controle correspondente à idade do tipo selvagem (Tk2+) usando uma dose de 520 mg/kg/dia, do dia 4 pós-natal a 29 dias. Aos 21 dias de idade pós-natal, os camundongos são separados da mãe e o tratamento foi continuado pela administração de dC e dT na água potável, presumindo um consumo de água de 4 ml/dia/camundongo. Um grupo de controle negativo de camundongos mutantes Tk2 não tratados e do tipo selvagem foi pesado e observado de perto para comparação.
[309] Monofosfato de desoxicitidina (dCMP) e monofosfato de desoxitimidina (TMP) (Hongene Biotech, Inc.) são administrados em 50 µl de fórmula de leite Esbilac para animais de estimação pequenos (Pet-Ag) por gavagem oral diária para camundongos com knock-in de Tk2 H126N (Tk2-/-) e controle correspondente à idade do tipo selvagem (Tk2 +) usando 2 doses, 200 mg/kg/dia e 400 mg/kg/dia, do dia 4 a 29 dias pós-natal. Aos 29 dias de idade, os camundongos são separados da mãe e o tratamento é continuado pela administração de dCMP e TMP na água potável usando uma dose de 400 mg/kg/dia.
Avaliação do fenótipo
[310] O peso corporal foi avaliado diariamente, uma vez que foi previamente observado que a incapacidade de ganhar peso é o primeiro sinal da doença (Akman, et al. 2008).
[311] Para definir o grau de segurança e eficácia da terapia gênica, tempo de sobrevida, idade no início da doença, tipo e gravidade dos sintomas, ocorrência de efeitos colaterais e proporção do término do tratamento devido a eventos adversos em camundongos Tk2 tratados e não tratados foram comparados. O comportamento geral, tempo de sobrevida e pesos corporais dos camundongos foram avaliados diariamente a partir do dia 4 pós-natal.
Medição da Enzima TK2
[312] A atividade da enzima TK2 foi medida conforme descrito anteriormente em Franzolin, et al. 2006.
Medição do Número de Cópias do mtDNA
[313] O número de cópias do mtDNA foi medido conforme descrito anteriormente em Spinazzola, et al. 2006/.
Atividades enzimáticas da cadeia respiratória mitocondrial
[314] A análise de enzimas mitocondriais RC foi realizada no tecido cerebral conforme descrito anteriormente (DiMauro, et al. 1987; Birch-Machin, et al. 1994; Quinzii, et al. 2013).
Métodos estatísticos
[315] Os dados são expressos como a média ± SD de pelo menos 3 experiências por grupo. O teste de Gehan-Breslow-Wilcoxon foi usado para comparar a razão de sobrevida de cada grupo de camundongos. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Exemplo 2 - A Administração de AAV9-hTK2 Resultou em Tempo de Vida Prolongado
[316] Os camundongos mutantes descritos no Exemplo 1 foram administrados com injeção retro-orbital por via IV no dia 1 pós-natal com construto AAV9-hTK2 (contendo cerca de 4,2 x 1011 ou 4,2 x 1010 cópias do vetor ou genoma) também descrito no Exemplo 1.
[317] O tratamento com AAV9-hTK2 resultou em uma resposta dependente da dose com administração de 4,2x1010 vc, prolongando o tempo de vida em até 3 vezes (média de 39 dias), semelhante a 520 mg/kg/dia de terapia com dC+dT. A administração de 4,2 x 1011 vc prolongou o tempo de vida em até 6 vezes (média de 89 dias) com um máximo de 129 dias. Ver a Figura 2.
Exemplo 3 - A Administração de AAV9-hTK2 Resultou em Aumento do Crescimento, Força e Função Motora em Camundongos Mutantes
[318] Os camundongos descritos no Exemplo 1 foram tratados conforme descrito no Exemplo 1 com o construto AAV9-hTK2, também descrito no Exemplo
1.
[319] Os camundongos Tk2-/- tratados com a dose mais baixa de AAV9- hTK2 (4,2 x 1010 vc) cresceram na mesma taxa que os camundongos Tk2-/- tratados com 520 mg/kg/dia de dC+dT. Eles também cresceram na mesma taxa que os camundongos Tk2+ até o dia 20 pós-natal, quando atingiram um platô.
[320] Os camundongos Tk2-/- tratados com a dose mais alta de AAV9-hTK2 (4,2 x 1011 vc) cresceram na mesma taxa que os camundongos Tk2+ até P30.
[321] Não foram encontradas diferenças entre Tk2+ e Tk2+ tratados com a dose mais alta de AAV9-hTK2 (4,2 x 1011 vc). Ver a Figura 3.
[322] Os camundongos Tk2-/- tratados com 4,2 x 1011 vc em P1 não apresentaram diferenças na força em comparação com camundongos do tipo selvagem não tratados ou tratados com AAV9-hTK2. A força foi normalizada em razão do peso e medida em P29 e P60. Ver a Figura 4.
[323] O teste de Rotarod, uma medida de resultado que se acredita que modele defeitos de comportamento motor, ou seja, fenótipos motores, observados em pacientes humanos para avaliar a função motora, foi realizado no dia 29 e 60 pós-natal, e não apresentou diferenças entre os camundongos mutantes tratados e camundongos do tipo selvagem tratados, apesar de dois mutantes, um macho e uma fêmea, não serem capazes de realizar o teste por fraqueza e falta de equilíbrio. Ver a Figura 5.
[324] Os camundongos do tipo selvagem tratados com AAV9-hTK2 não apresentaram efeitos colaterais adversos relacionados à terapia e eram saudáveis em geral.
[325] Os resultados relativos à força e à função motora parecem descartar miopatia em camundongos mutantes e sugerem que a redução do peso observada em Tk2-/- pode ser causada por uma condição de saúde não relacionada ao músculo.
Exemplo 4 - Tratamento com AAV9-Tk2 Restaurou a Atividade da Enzima TK2 na Maioria dos Tecidos
[326] Usando os métodos descritos no Exemplo 1, a atividade da enzima TK2 foi medida em P29 e mostrou ser restaurada em camundongos mutantes tratados com 4,2 x 1011 vc de AAV9-hTK2 em P1 no cérebro e fígado a níveis semelhantes aos encontrados em camundongos do tipo selvagem não tratados. No músculo, AAV9-hTK2 aumentou em 40 vezes a atividade de TK2 em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados. No entanto, a administração do AAV9-hTK2 apresentou pouca eficiência na restauração da atividade de TK2 no rim. Ver a Figura 6.
Exemplo 5 - O Tratamento com AAV9-hTk2 Aumentou a Expressão de hTK2 na Maioria dos Tecidos
[327] A TK2 humana foi medida como uma porcentagem em relação à expressão de mRNA de TK2 de camundongo como descrito no Exemplo 1 em camundongos do tipo selvagem tratados com AAV9-hTK2 (4 x 1011 vc) em 1 mês, 2 meses e 6 meses no cérebro, fígado, músculo e tecido renal.
[328] A TK2 humana foi expressa no cérebro, fígado e músculo acima de 100% da expressão de TK2 de camundongo no tecido alvo, mesmo em camundongos do tipo selvagem após 6 meses de tratamento. Por outro lado, a expressão de TK2 humana no rim é muito baixa 2 meses após o tratamento. Ver a Figura 7.
Exemplo 6 - Tratamento com AAV9-hTK2 Restaurou mtDNA na Maioria dos Tecidos
[329] O número de cópias do mtDNA foi medido conforme descrito no Exemplo 1. No dia 29 pós-natal, os camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 (4 x 1011 vc) no dia 1 pós-natal tinham sinais de depleção grave do mtDNA apenas no tecido renal e o mtDNA foi parcialmente resgatado no cérebro, coração, fígado, intestino e músculo (Figura 8).
[330] No dia 60 pós-natal, houve depleção muito leve do mtDNA (65-80% dos camundongos do tipo selvagem não tratados) no fígado, coração, músculo e tecido do intestino de camundongos mutantes tratados com AAV9-hTK. O mtDNA no tecido cerebral de camundongos mutantes tratados foi 87% do de camundongos do tipo selvagem não tratados. Isso mostrou um resgate de mtDNA na maioria dos tecidos de camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2. Houve depleção grave de mtDNA no tecido renal dos mesmos camundongos mutantes tratados. Ver a Figura 9.
Exemplo 7 - Tratamento com AAV9-hTK2 Aliviou as Anormalidades Bioquímicas no Cérebro
[331] As atividades da enzima da cadeia respiratória (RCE) e os níveis de proteína foram medidos conforme descrito no Exemplo 1.
[332] A atividade de RCE no cérebro no dia 29 pós-natal foi completamente restaurada nos cérebros de camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 (4 x 1011 vc) (Figura 10). Apenas uma leve redução na atividade do complexo III pode ser observada em camundongos Tk2-/- tratados com AAV9-hTK2 em comparação com camundongos do tipo selvagem não tratados (Figura 11).
Exemplo 8 - AAV9-hTK2 Não Resgata a Função Renal
[333] Usando os métodos do Exemplo 1, o tecido renal de camundongos mutantes tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc no momento da morte no dia 96 pós-natal foi corado com SDH e Cox. Tecido renal de camundongos de tipo selvagem de mesma idade tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc também foram corados. A coloração SDH (azul) não apresentou colocalização com coloração Cox (marrom) indicando deficiência de Cox no tecido renal dos camundongos mutantes e provável disfunção das mitocôndrias (Figura 12).
[334] O índice de nitrogênio ureico de creatinina e sangue (BUN) foi avaliado em ambos os camundongos mutantes tratados com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc e o tipo selvagem tratado com AAV9-hTK2 a 4,2 x 1011 vc, tanto na coorte de sobrevida quanto no dia 60 pós-natal. Tanto a creatinina quanto a BUN foram mais altas nos camundongos mutantes em ambas as coortes, sugerindo disfunção renal (Figura 13).
Exemplo 9 - A administração de AAV9-hTK2 em Combinação com AAV2- hTK2 Aumenta a Sobrevida em Relação ao Uso de AAV9-hTK2 Sozinho
[335] Camundongos mutantes, conforme descrito no Exemplo 1, foram administrados com AAV9-hTK2 a 2,1 x 1011 vc via injeção retro-orbital de um volume total de 35 µl, conforme também descrito no Exemplo 1 no dia 1 pós-natal. Camundongos do tipo selvagem também são tratados no dia 1 pós-natal.
[336] No dia 21 pós-natal, um terço desses camundongos mutantes e do tipo selvagem tratados foram suplementados com 520 mg/kg/dia de dC+dT oral (em água potável). No dia 29 pós-natal, dois terços dos camundongos (todos aqueles suplementados com dC+dT e metade dos camundongos restantes) recebem administração de AAV2-hTK (Exemplo 1) a 1,05 x 1011 vc, via injeção na veia da cauda em um volume total de 100 ul.
[337] Os camundongos mutantes tratados apenas com AAV9-hTK2 tiveram uma sobrevida média de 89 dias, de acordo com os resultados no Exemplo 2. Os camundongos mutantes que receberam AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 viveram significativamente mais, cerca de 120 dias (Figura 14). Apesar de ter uma dose geral mais baixa de cópias do vetor (3,15 x 1011 vc no total versus 4,2 x 1011 vc),
os camundongos mutantes tratados com ambos os construtos cresceram tanto quanto os camundongos mutantes tratados apenas com AAV9-hTK2 (Figuras 15 e 16) e apresentaram a mesma força e coordenação motora (Figuras 17, 18 e 19). No dia 60, os camundongos mutantes tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 apresentaram níveis ligeiramente mais elevados de mtDNA do que aqueles tratados apenas com AAV9-hTK2 (Figura 20). Os camundongos tratados com uma combinação de AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 também apresentaram uma diminuição no teor de proteína na urina (Figura 21) e níveis ligeiramente mais baixos do índice BUN (Figura 22) em comparação com os camundongos tratados apenas com AAV9-hTK2, bem como maior atividade de Tk2 no fígado (Figura 23).
[338] Os dados combinados sobre mtDNA, proteína na urina e BUN mostraram que a disfunção renal pode ser retardada em camundongos cotratados com AAV2 ou AAV2+dN, o que também aumenta o tempo de vida.
Exemplo 10 - A administração de Nucleosídeos Suplementares Potencializa os Efeitos da Terapia Gênica
[339] Metade dos camundongos mutantes e do tipo selvagem tratados com AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2 no Exemplo 9 receberam ainda administração oral de dC + dT a 520 mg/kg/dia em água potável conforme descrito no Exemplo 1. Presume-se que os camundongos ingerem 4 ml por dia por camundongo.
[340] Os camundongos mutantes que receberam os nucleosídeos suplementares tiveram uma sobrevida significativamente maior significativamente maior, de mais de 180 dias (Figura 14). Eles também tiveram crescimento aumentado (Figuras 15 e 16) e a mesma força e coordenação motora que os camundongos tratados com AAV9-hTK2 ou uma combinação de AAV9-hTK2 e AAV2-hTK2. Os camundongos tratados com a combinação de AAV9-hTK2 e AAV2- hTK2 e suplementados com dC+dT apresentaram níveis mais elevados de mtDNA no fígado.
Exemplo 11 - Administração de AAV9-hTK2 em Combinação com Aumento de dC+dT Sobrevida Durante o Uso de AAV9-hTK2 Sozinho
[341] Camundongos mutantes, conforme descrito no Exemplo 1, recebem administração por via oral de dC+dT (260 ou 520 mg/kg/dia cada no leite) a partir do dia 4 pós-natal). No dia 21 pós-natal, metade dos camundongos recebem administração de AAV9-hTK2 conforme descrito no Exemplo 1.
[342] Os camundongos mutantes que receberam apenas o tratamento com dC+dT tiveram uma sobrevida média de 31 e 40 dias com a dose de 260 e 520 mg/kg/dia, respectivamente. Os camundongos mutantes que receberam o AAV9- hTK2 subsequentemente tiveram uma sobrevida significativamente maior.
[343] Dos camundongos que receberam o AAV9-hTK2, metade foi administrada com AAV2-hTK2 no dia 30 pós-natal. Os camundongos que receberam dC+dT e o AAV9-hTK2 e o AAV2-hTK2 tiveram uma sobrevida significativamente maior do que os camundongos que receberam apenas dC+dT e AAV9-hTK2.
Exemplo 12 - Administração de AAV9-hTK2 em Combinação com Aumento de dCMP + TMP Sobrevida Durante o Uso de AAV9-hTK2 Sozinho
[344] Camundongos mutantes, conforme descrito no Exemplo 1, recebem administração de dCMP + TMP (200 mg/kg/dia ou 400 mg/kg/dia cada no leite) a partir do dia 4 pós-natal. No dia 21 pós-natal, metade dos camundongos recebem administração de AAV9-hTK2, conforme descrito no Exemplo 1.
[345] Os camundongos mutantes que receberam apenas o tratamento com dCMP + TMP tiveram uma sobrevida média de 35 e 44 dias com a dose de 200 e 400 mg/kg/dia, respectivamente. Os camundongos mutantes que receberam o AAV9-hTK2 subsequentemente tiveram uma sobrevida significativamente maior.
[346] Dos camundongos que receberam o AAV9-hTK2, metade foi administrada com AAV2-hTK2 no dia 30 pós-natal. Os camundongos que receberam dCMP +TMP e o AAV9-hTK2 e o AAV2-hTK2 tiveram uma sobrevida significativamente maior do que os camundongos que receberam apenas dC+dT e AAV9-hTK2.
REFERÊNCIAS
Akman, et al. (2008) Thymidine kinase 2 (H126N) knock in mice show the essential role of balanced deoxynucleotide pools for mitochondrial DNA maintenance.
Hum.
Mol.
Genet. 17:2433-2440 Béhin, et al. (2012) Adult cases of mitochondrial DNA depletion due to TK2 defect An expanding spectrum.
Neurology 78:644-648 Birch-Machin, et al. (1994) An evaluation of the measurement of the activities of complexes I-IV in the respiratory chain of human skeletal muscle mitochondria.
Biochem Med Metab Biol 51:35–42 Bourdon, et al. (2007) Mutation of RRM2B, encoding p53-controlled ribonucleotide reductase (p53R2), causes severe mitochondrial DNA depletion.
Nature Genetics 39:776-780 Chanprasert, et al. (2012) TK2-Related Mitochondrial DNA Depletion Syndrome, Myopathic Form.
GeneReviews® Internet, 6 de dezembro de 2012 Copeland (2008) Inherited mitochondrial diseases of DNA replication.
Ann.
Rev.
Med. 59:131-146 DiMauro, et al. (1987) Cytochrome c oxidase deficiency in Leigh syndrome.
Ann.
Neurol. 22:498-506 DiMauro, Schon. (2003) Mitochondrial respiratory-chain diseases.
New England Journal of Medicine 348:2656-2668 DiMauro, Hirano. (2005) Mitochondrial encephalomyopathies: an update.
Neuromuscul.
Disord. 15:276-286 Dorado, et al. (2011) Onset and organ specificity of Tk2 deficiency depends on Tk1 down-regulation and transcriptional compensation.
Hum.
Mol.
Genet. 20:155-64 Elpeleg, et al. (2005) Deficiency of the ADP-forming succinyl-CoA synthase activity is associated with encephalomyopathy and mitochondrial DNA depletion.
Am.
J.
Hum.
Genet. 76:1081-1086 Franzolin, et al. (2006) Bromovinyl-deoxyuridine: a selective substrate for mitochondrial thymidine kinase in cell extracts.
Biochem.
Biophy.
Res.
Commun. 344(1):30-6 Galbiati, et al. (2006) New mutations in TK2 gene associated with mitochondrial DNA depletion.
Pediatr.
Neurol. 34:177-185 Garone, et al. (2012). MPV17 Mutations Causing Adult-Onset Multisystemic
Disorder With Multiple Mitochondrial DNA Deletions.
Arch Neurol 69:1648-1651 Garone, et al. (2018) Retrospective Natural History of Thymidine Kinase 2 Deficiency.
J.
Med.
Genetics 55:515-21 Gotz, et al. (2008) Thymidine kinase 2 defects can cause multi-tissue mtDNA depletion syndrome.
Brain 131:2841-2850 Hirano, et al. (2001) Defects of intergenomic communication: autosomal disorders that cause multiple deletions and depletion of mitochondrial DNA.
Semin.
Cell.
Develop.
Biol. 12:417-427 Longley, et al. (2006). Mutant POLG2 disrupts DNA polymerase gamma subunits and causes progressive external ophthalmoplegia.
Am J Hum Genet. 78:1026-1034 Mandel, et al. (2001) The deoxyguanosine kinase gene is mutated in individuals with depleted hepatocerebral mitochondrial DNA.
Nature Genet. 29:337- 341 Naviaux, Nguyen. (2004) POLG mutations associated with Alpers' syndrome and mitochondrial DNA depletion.
Ann.
Neurol. 55:706-712 Nishino, et al. (1999). Thymidine phosphorylase gene mutations in MNGIE, a human mitochondrial disorder.
Science 283:689-692. Ostergaard, et al. (2007) Deficiency of the alpha subunit of succinate- coenzyme A ligase causes fatal infantile lactic acidosis with mitochondrial DNA depletion.
Am.
J.
Hum.
Genet. 81: 383-387 Paradas, et al. (2012) TK2 mutation presenting as indolent myopathy.
Neurology 29:504-506 Quinzii, et al. (2013) Tissue-specific oxidative stress and loss of mitochondria in CoQ-deficient Pdss2 mutant mice.
FASEB J. 27:612–621 Ronchi, et al. (2012). Next-generation sequencing reveals DGUOK mutations in adult patients with mitochondrial DNA multiple deletions.
Brain 135:3404-3415. Saada, et al. (2003) Mitochondrial deoxyribonucleoside triphosphate pools in thymidine kinase 2 deficiency.
Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 310:963-966 Sarzi, et al. (2007) Twinkle helicase (PEO1) gene mutation causes mitochondrial DNA depletion.
Ann.
Neurol. 62: 579-587 Spelbrink, et al. (2001). Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genet. 28:223-231 Spinazzola, et al. (2006) MPV17 encodes an inner mitochondrial membrane protein and is mutated in infantile hepatic mitochondrial DNA depletion. Nature Genet. 38:570-575 Tyynismaa, et al. (2012) Thymidine kinase 2 mutations in autosomal recessive progressive external ophthalmoplegia with multiple mitochondrial DNA deletions. Hum. Mol. Genet. 21:66-75 Tyynismaa, et al. (2009). A heterozygous truncating mutation in RRM2B causes autosomal-dominant progressive external ophthalmoplegia with multiple mtDNA deletions. Am. J. Hum. Genet. 85: 290-295 Van Goethem, et al. (2001) Mutation of POLG is associated with progressive external ophthalmoplegia characterized by mtDNA deletions. Nature Genet. 28:211-
212.

Claims (176)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento, prevenção e/ou cura de uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica timidina quinase 2 (TK2), desoxiguanosina quinase (dGK), timidina fosforilase (TP), subunidade pequena induzível por p53 da ribonucleotídeo redutase (p53R2), subunidade beta formadora de ADP da succinil-CoA ligase (SUCLA2), subunidade alfa formadora de GDP da succinil-CoA ligase (SUCLG1), proteína de membrana interna mitocondrial MPV17 (MPV17) e/ou subunidade gama da DNA polimerase (POLG).
2. Método de restauração da atividade enzimática em um sujeito com uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
3. Método de alívio de um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio caracterizado por pools de nucleotídeos em desequilíbrio em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença mitocondrial.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a doença mitocondrial é uma síndrome de depleção do DNA mitocondrial (MDS).
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a MDS é uma MDS miopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica TK2.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a MDS é uma forma encefalomiopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica SUCLA2.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a MDS é uma forma encefalomiopática neurogastrointestinal caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica TP.
9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a MDS é uma forma hepatopática caracterizada por uma ou mais mutações em um gene endógeno que codifica dGK, MPV17 e/ou POLG.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica TK2.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a TK2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-14, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
2.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica dGK.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a dGK compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a dGK compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a dGK compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dGK tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
4.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica TP.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a TP compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a TP compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a TP compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a TP tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-32, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 6.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
6.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica p53R2.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a p53R2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a p53R2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a p53R2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a p53R2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37-41, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 8.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
8.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica SUCLA2.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a SUCLA2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a SUCLA2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a SUCLA2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a SUCLA2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-50, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 10.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
10.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica SUCLG1.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a SUCLG1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a SUCLG1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a SUCLG1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a SUCLG1 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-59, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 12.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
12.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica MPV17.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a MPV17 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a MPV17 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a MPV17 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a MPV17 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64-68, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 14.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
14.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica POLG.
74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a POLG compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a POLG compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que a POLG compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a POLG tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 73-77, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 16.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
16.
82. Método de tratamento, prevenção e/ou cura da deficiência de TK2 em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica TK2.
83. Método de restauração da atividade da enzima TK2 em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica TK2.
84. Método de alívio de um ou mais sintomas associados a uma deficiência de TK2 em um sujeito em necessidade, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um transgene que codifica TK2.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82-84, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem ou está em risco de desenvolver uma MDS.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82-85,
caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a TK2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 82-89, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
2.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-93, caracterizado pelo fato de que a composição é um vetor.
95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em vírus adeno-
associado (AAV), adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia e um vírus sintético.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o vírus sintético é um vírus quimérico, vírus mosaico ou vírus pseudotipado, e/ou compreende uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o AAV é um sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh.8 ou AAVrh.10.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que o AAV é um AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9.
101. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV pseudotipado.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/9.
103. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/8.
104. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o AAV compreende uma proteína recombinante do capsídeo.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-93, caracterizado pelo fato de que a composição é um lipossoma, vesícula, vesícula sintética, exossomo, exossomo sintético, dendrímero ou nanopartícula.
106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-105, caracterizado pelo fato de que o transgene é operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor da beta actina de galinha, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor da distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B- cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina, ou promotor do fator natriurético atrial.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-107, caracterizado pelo fato de que o transgene é operacionalmente ligado a um potenciador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
109. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o potenciador é um potenciador de CMV, um potenciador do fator potenciador de miócitos 2 (MEF2) ou um potenciador de MyoD.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-109, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao sujeito assim que, ou imediatamente após, o sujeito ser diagnosticado como tendo uma deficiência em um gene endógeno que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG, opcionalmente em que a composição é administrada ao sujeito assim que, ou imediatamente após, o sujeito ser diagnosticado como tendo uma deficiência em um gene endógeno que codifica TK2.
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-110, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição compreendendo um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é um vetor.
113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo consistindo em vírus adeno- associado (AAV), adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia e um vírus sintético.
115. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o vírus sintético é um vírus quimérico, vírus mosaico ou vírus pseudotipado, e/ou compreende uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena.
116. Método, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV.
117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o AAV é um sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh.8 ou AAVrh.10.
118. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV pseudotipado.
119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/9.
120. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/8.
121. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que o AAV compreende uma proteína recombinante do capsídeo.
122. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é um lipossoma, vesícula, vesícula sintética, exossomo, exossomo sintético, dendrímero ou nanopartícula.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110- 121, caracterizado pelo fato de que o transgene contido na segunda composição é operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
124. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor da beta actina de galinha, promotor de CMV, promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor de distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B- cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina, ou promotor do fator natriurético atrial.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110- 124, caracterizado pelo fato de que o transgene contido na segunda composição é operacionalmente ligado a um potenciador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o potenciador é um potenciador de CMV, um potenciador de MEF2 ou um potenciador de MyoD.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110- 126, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é administrada ao sujeito após a administração da primeira composição ao sujeito.
128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é administrada ao sujeito dentro de um ou mais dias ou semanas da administração da primeira composição ao sujeito.
129. Método, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da primeira composição ao sujeito.
130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110- 129, caracterizado pelo fato de que a administração da primeira composição continua enquanto a segunda composição é administrada ao sujeito.
131. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-130, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração, ao sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terceira composição compreendendo um agente farmacológico.
132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico é selecionado do grupo consistindo em desoxicitidina (dC), desoxitimidina (dT), desoxiadenosina (dA), desoxiguanosina (dG), desoxicitidina monofosfato (dCMP), desoxitimidina monofosfato (TMP), desoxiadenosina monofosfato (dAMP), desoxiguanosina monofosfato (dGMP), e suas misturas.
133. Método, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o agente farmacológico é selecionado do grupo consistindo em dC, dT e uma mistura das mesmas.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 133, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito após a administração da primeira composição ao sujeito.
135. Método, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito dentro de um ou mais dias ou semanas da administração da primeira composição ao sujeito.
136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da primeira composição ao sujeito.
137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 136, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito após a administração da segunda composição ao sujeito.
138. Método, de acordo com a reivindicação 137, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito dentro de um ou mais dias ou semanas da administração da segunda composição ao sujeito.
139. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito pelo menos um mês após a administração da segunda composição ao sujeito.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 139, caracterizado pelo fato de que a administração da primeira composição e a administração da segunda composição continuam enquanto a terceira composição é administrada ao sujeito.
141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 140, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 100 mg/kg/dia a cerca de 1.000 mg/kg/dia.
142. Método, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 200 mg/kg/dia a cerca de 800 mg/kg/dia.
143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito em uma quantidade de cerca de 250 m/kg/dia a cerca de 400 mg/kg/dia.
144. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 143, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, ou seis vezes ao dia.
145. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131- 143, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito por via oral em mistura com leite de vaca, leite materno, fórmula infantil ou água.
146. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-145, caracterizado pelo fato de que a primeira composição é administrada ao sujeito por meio de administração intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, por inalação, por perfusão, lavagem e/ou oral.
147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-146, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é administrada ao sujeito por meio de administração intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, por inalação, por perfusão, lavagem e/ou oral.
148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-147, caracterizado pelo fato de que a terceira composição é administrada ao sujeito por meio de administração intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, parenteral, intramuscular, intranasal, subcutânea, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravascular, por inalação, por perfusão, lavagem e/ou oral.
149. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-148, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero.
150. Método, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
151. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um sujeito humano pediátrico.
152. Vetor viral recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um transgene que codifica TK2, dGK, TP, p53R2, SUCLA2, SUCLG1, MPV17 e/ou POLG.
153. Vetor, de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica TK2.
154. Vetor, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
155. Vetor, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
156. Vetor, de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que a TK2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
157. Vetor, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que a TK2 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
158. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 153-157,
caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
159. Vetor, de acordo com a reivindicação 158, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
160. Vetor, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o transgene tem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2.
161. Vetor, de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo fato de que o transgene tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:
2.
162. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152-161, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo consistindo em vírus adeno-associado (AAV), adenovírus, lentivírus, retrovírus, poxvírus, baculovírus, vírus herpes simplex, vírus vaccinia e um vírus sintético.
163. Vetor, de acordo com a reivindicação 162, caracterizado pelo fato de que o vírus sintético é um vírus quimérico, vírus mosaico ou vírus pseudotipado, e/ou compreende uma proteína estranha, polímero sintético, nanopartícula ou molécula pequena.
164. Vetor, de acordo com a reivindicação 163, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV.
165. Vetor, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que o AAV é um sorotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh74, AAVrh.8 ou AAVrh.10.
166. Vetor, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que o AAV é um AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9.
167. Vetor, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um AAV pseudotipado.
168. Vetor, de acordo com a reivindicação 167, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/9.
169. Vetor, de acordo com a reivindicação 167, caracterizado pelo fato de que o AAV pseudotipado é AAV2/8.
170. Vetor, de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que o AAV compreende uma proteína recombinante do capsídeo.
171. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152-170, caracterizado pelo fato de que o transgene é operacionalmente ligado a um promotor que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
172. Vetor, de acordo com a reivindicação 171, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor da beta actina de galinha, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da cadeia leve 2 de miosina, promotor da alfa actina, promotor de troponina 1, promotor do trocador de Na+/Ca2+, promotor da distrofina, promotor da creatina quinase, promotor da integrina alfa7, promotor do peptídeo natriurético cerebral, promotor de alfa B- cristalina/proteína de choque térmico pequena, promotor da cadeia pesada de alfa miosina, ou promotor do fator natriurético atrial.
173. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152-172, caracterizado pelo fato de que o transgene é operacionalmente ligado a um potenciador que induz a expressão do transgene em uma célula muscular.
174. Vetor, de acordo com a reivindicação 173, caracterizado pelo fato de que o potenciador é um potenciador de CMV, um potenciador do fator potenciador de miócitos 2 (MEF2) ou um potenciador de MyoD.
175. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 152-174, e uma bula instruindo um usuário do kit a administrar o vetor a um sujeito conforme o método de qualquer uma das reivindicações 1-158.
176. Kit, de acordo com a reivindicação 175, caracterizado pelo fato de que o kit compreende ainda um agente farmacológico selecionado do grupo consistindo em dC, dT, dA, dG, dCMP, TMP, dAMP, dGMP e suas misturas.
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 171/202 cDNA de TK2 Humana 1/31
Promotor de beta actina de galinha
Potenciador de CMV
Origem
Tempo (dias)
Leite
Porcentagem de sobrevida
Tempo (dias) Fêmeas
Peso (gr) Tempo (dias) Machos
Peso (gr)
Teste de barra/peso P29 Teste de grade/peso P29
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 174/202 Força (g) /unidade de peso (g) Força (g) /unidade de peso (g) Macho Fêmea Macho Fêmea 4/31
Teste de barra/peso P60 Teste de grade/peso P60 Força (g) /unidade de peso (g)
Força (g) /unidade de peso (g) Macho Fêmea Macho Fêmea
Tempo (s)
Tempo (s)
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 176/202 Atividade de Tk2 (proteína pmol/min/mg) Cérebro P29
Atividade de Tk2 (proteína pmol/min/mg) Fígado P29 6/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 177/202 Atividade de Tk2 (proteína pmol/min/mg) Músculo P29
Atividade de Tk2 (proteína pmol/min/mg) Rim P29 7/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 178/202 Expressão de h-TK2 mRNA Expressão de h-TK2 mRNA (como % de m-Tk2 mRNA) (como % de m-Tk2 mRNA) Cérebro
Músculo
Expressão de h-TK2 mRNA Expressão de h-TK2 mRNA (como % de m-Tk2 mRNA) (como % de m-Tk2 mRNA) Rim Fígado 8/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 179/202 mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA (% de Tk2+ não tratado) (% de Tk2+ não tratado) Coração Cérebro mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA (% de Tk2+ não tratado) (% de Tk2+ não tratado) Fígado
Músculo 9/31 mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 180/202 (% de Tk2+ não tratado) (% deTk2+ (%de tratado) nãotratado) Tk2+não 10/31
Rim Rim
Intestino Intestino
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 181/202 mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA (% de Tk2+ não tratado) (% de Tk2+ não tratado) Cérebro
Coração mtDNA/nDNA mtDNA/nDNA (% de Tk2+ não tratado) (% de Tk2+ não tratado) Fígado
Músculo 11/31
Rim
(% de Tk2+ não tratado) mtDNA/nDNA
Intestino (% de Tk2+ não tratado) mtDNA/nDNA
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 183/202 Atividade µmol produto/min/mg proteína CS/Proteína
Atividade Atividade µmol produto/min µmol produto/min/mg proteína CII/Proteína 13/31
CIV/Proteína µmol produto/min/mg proteína Atividade µmol produto/min Atividade
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 185/202 Níveis de proteína do estado estacionário CI/Vinculina
Níveis de proteína do estado estacionário CII/Vinculina
Níveis de proteína do estado estacionário CIII/Vinculina 15/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 186/202 Níveis de proteína do estado estacionário CIV/Vinculina
Níveis de proteína do estado estacionário CV/Vinculina 16/31
Correspondente à idade (P96) no momento da morte (P96)
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 188/202 Coorte de sobrevida Creatinina (mg/dL) Coorte de sobrevida Creatinina
Nitrogênio Ureico no Sangue (mg/dL) Coorte de sobrevida
BUN/Razão de creatinina Coorte de sobrevida BUN/Creatinina 18/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 189/202 Coorte P60 Creatinina (mg/dL) Coorte P60
Nitrogênio Ureico no Sangue (mg/dL) Coorte P60
BUC/Razão de creatinina Coorte P60 19/31
Tempo
Porcentagem de sobrevida de dia de Peso (machos)
Tempo (dias) Não tratado
Peso (gr)
de dia de Peso (fêmeas)
Tempo (dias) Não tratado
Peso (gr)
Teste de aderência (força) em P60
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 193/202 Teste de barra/peso P60 Teste de grade/peso P60 23/31
Força (g) /unidade de peso (g) Força (g) /unidade de peso (g)
Macho Fêmea Macho Fêmea
Teste de aderência (força) em P90
Macho Fêmea Macho Fêmea
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 194/202 Teste de barra/peso P90 Teste de grade/peso P90 24/31
Força (g) /unidade de peso (g)
Força (g) /unidade de peso (g) Macho Fêmea Macho Fêmea
Rotarod (função motora)
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 195/202 Tempo de rotarod P60
Tempo (s) Tempo (s) 25/31
Macho Fêmea
Macho Fêmea
Rim
(como % de peso) Número de cópias de mtDNA
Fígado
(como % de peso) Cérebro
(como % de peso)
Intestino delgado
(como % de peso) Músculo
(como % de peso) Coração
(como % de peso)
Comparação de diferentes momentos
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 198/202 28/31
Diminuição dos níveis de proteína na urina após o tratamento com AAV2-hTK2 em P29
Se não tratados com AAV2-hTK2, camundongos Tk2-/- continuaram a apresentar altos níveis de proteína na urina
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 199/202 Nitrogênio Ureico no Sangue (mg/dL) Coorte P60
Nitrogênio Ureico no Sangue(mg/dL) Níveis de BUN no plasma
Coorte de desfecho 29/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 200/202 Atividade (pmol/h/mg proteína) Cérebro
Atividade (pmol/h/mg proteína) Fígado 30/31
Petição 870200157230, de 15/12/2020, pág. 201/202 Atividade (pmol/h/mg proteína) Rim
Atividade (pmol/h/mg proteína) Músculo 31/31
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WO2021102104A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 University Of Massachusetts Aav-based delivery of thymine kinase 2
US11612574B2 (en) 2020-07-17 2023-03-28 Zogenix International Limited Method of treating patients infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
US20220096514A1 (en) * 2020-09-29 2022-03-31 Zogenix International Limited Methods of treating thymidine kinase 2 deficiency by administering deoxycytidine and deoxythymidine
JP2024515025A (ja) * 2021-03-26 2024-04-04 ゾジェニックス，インコーポレイテッド プリン及びピリミジンを含有する水性溶液及びその使用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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BRPI0710671B8 (pt) * 2006-04-07 2021-05-25 Univ Texas uso de um vetor de bacteriofágo viral adenoassociado (aavp) terapêutico para a fabricação de um medicamento para o tratamento e profilaxia de uma doença hiperproliferativa
US10292996B2 (en) * 2015-03-26 2019-05-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Deoxyribonucleoside monophospate bypass therapy for mitochondrial DNA depletion syndrome

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