BR112020019205A2 - Células efetoras imunes geneticamente modificadas e uso das mesmas - Google Patents

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Ryam Bjordahl
Jode GOODRIDGE
Tom Tong Lee
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Abstract

são fornecidos métodos e composições para obtenção de células efetoras derivadas funcionalmente intensificadas, obtidas a partir da diferenciação direcionada de ipscs modificadas genomicamente. as células derivativas fornecidas neste documento têm edição estável e funcional do genoma que entrega efeitos terapêuticos aprimorados ou intensificados. também são fornecidas composições terapêuticas e usos das mesmas, que compreendem as células efetoras derivadas funcionalmente intensificadas isoladas ou com anticorpos ou inibidores de ponto de verificação em terapias de combinação.

Description

“CÉLULAS EFETORAS IMUNES GENETICAMENTE MODIFICADAS E USO DAS MESMAS” PEDIDO RELACIONADO
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório No. de Série US 62/649.781, depositado em 29 de março de 2018, Pedido Provisório No. de Série US 62/774.052, depositado em 30 de novembro de 2018, e Pedido Internacional No. PCT/US18/67289, depositado em 21 de dezembro de 2018, cujas divulgações são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE
[0002] Este pedido incorpora a título de referência um Formulário Legível por Computador (CRF) de uma Listagem de Sequências no formato de texto ASCII enviado com este pedido, intitulado 13601-204- 228_SEQ_LISTING.txt, que foi criado em 28 de março de 2018 e tem 45.867 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação está amplamente relacionada ao campo de produtos imunocelulares prontos para uso. Mais particularmente, a presente divulgação está relacionada às estratégias para o desenvolvimento de células efetoras multifuncionais capazes de entregar propriedades terapeuticamente relevantes in vivo. Os produtos celulares desenvolvidos sob a presente divulgação abordam limitações críticas das terapias celulares originadas pelo paciente.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] Atualmente, o campo da terapia celular adotiva está focado no uso de células originadas de pacientes e doadores, o que torna particularmente difícil alcançar a fabricação consistente de imunoterapias contra o câncer e entregar terapias a todos os pacientes que podem se beneficiar. Há também a necessidade de aprimorar a eficácia e a persistência de linfócitos transferidos de maneira adotiva para promover um resultado favorável ao paciente. Linfócitos, tais como células T e células exterminadoras naturais (NK), são efetores antitumorais potentes que desempenham um papel importante na imunidade inata e adaptativa. No entanto, o uso dessas células imunes para terapias celulares adotivas permanece desafiador e tem necessidades não atendidas de aprimoramento. Portanto, ainda existem oportunidades significativas de aproveitar todo o potencial das células T e NK ou outros linfócitos na imunoterapia adotiva.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] Há uma necessidade de células efetoras funcionalmente aprimoradas que abordem questões que variam de taxa de resposta, exaustão celular, perda de células transfundidas (sobrevivência e/ou persistência), escape de tumor por perda de alvo ou troca de linhagem, precisão de alvejamento de tumor, toxicidade fora do alvo, efeito fora do tumor, até eficácia contra tumores sólidos, isto é, microambiente tumoral e supressão imune relacionada, recrutamento, diapedese e infiltração.
[0006] É um objetivo da presente invenção fornecer métodos e composições para gerar células não pluripotentes derivativas diferenciadas de uma linhagem clonal de iPSC (célula-tronco pluripotente induzida) derivada de célula única, cuja linhagem de iPSC compreende uma ou várias modificações genéticas em seu genoma. A dita uma ou várias modificações genéticas incluem inserção, deleção e substituição de DNA, e cujas modificações são retidas e permanecem funcionais nas células derivadas subsequentemente após a diferenciação, expansão, passagem e/ou transplante.
[0007] As células não pluripotentes derivadas de iPSC do presente pedido incluem, mas sem limitação, células CD34, células endoteliais hemogênicas, HSCs (células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras), células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, progenitores de células T, progenitores de células NK, células T, células NKT, células NK e células B. As células não pluripotentes derivadas de iPSC do presente pedido compreendem uma ou várias modificações genéticas em seu genoma através da diferenciação de uma iPSC que compreende as mesmas modificações genéticas. A estratégia de diferenciação de iPSC clonal geneticamente modificada para obter células derivadas geneticamente modificadas exige que o potencial de desenvolvimento da iPSC em uma diferenciação direcionada não seja impactado adversamente pela modalidade geneticamente modificada na iPSC, e também que a modalidade geneticamente modificada funcione como pretendido na célula derivada. Além disso, essa estratégia supera a barreira atual na modificação genética de linfócitos primários, tais como células T ou células NK obtidas de sangue periférico, visto que essas células são difíceis de modificar geneticamente, com a modificação genética de tais células muitas vezes sem reprodutibilidade e uniformidade, resultando em células que exibem persistência pobre de células com alta morte celular e baixa expansão celular. Além disso, esta estratégia evita a produção de uma população de células efetoras heterogêneas obtida, de outra forma, com o uso de fontes celulares primárias que são heterogêneas inicialmente.
[0008] Alguns aspectos da presente invenção fornecem iPSCs modificadas genomicamente, obtidas com o uso de um método que compreende (I), (II) ou (III), refletindo uma estratégia de modificação genômica subsequentemente, simultaneamente e antes do processo de reprogramação, respectivamente:
[0009] (I): modificar geneticamente iPSCs por um dentre (i) e (ii) ou ambos, em qualquer ordem: (i) introduzir em iPSCs um ou mais construtos para permitir a integração de alvejamento em sítio selecionado (ou sítios selecionados); (ii) (a) introduzir em iPSCs uma ou mais quebras de cadeia dupla no sítio selecionado (ou sítios selecionados) com o uso de uma ou mais endonucleases com capacidade de reconhecimento de sítio selecionado; e (b) cultivar as iPSCs da etapa (I)(ii)(a) para permitir que o reparo de DNA endógeno gere in/dels de alvejamento no sítio selecionado (ou sítios selecionados); obtendo, assim, as iPSCs com modificação genômica com capacidade para diferenciação em células parcial ou totalmente diferenciadas.
[00010] (II): modificar geneticamente células não pluripotentes de reprogramação para obter as iPSCs com modificação genômica que compreendem: (i) colocar células não pluripotentes em contato com um ou mais fatores de reprogramação e, opcionalmente, uma composição de molécula pequena que compreende um receptor de TGFβ/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e/ou um inibidor de ROCK para iniciar a reprogramação das células não pluripotentes; e (ii) introduzir, nas células não pluripotentes de reprogramação da etapa (II) (i), um dentre (a) e (b) ou ambos, em qualquer ordem: (a) um ou mais construtos para permitir a integração de alvejamento no sítio selecionado (ou sítios selecionados); (b) uma ou mais quebras de cadeia dupla em um sítio selecionado, utilizando pelo menos uma endonuclease com capacidade para reconhecimento de sítio selecionado, em seguida, as células da etapa (II) (ii) (b) são cultivadas para permitir que o reparo de DNA endógeno gere in/dels de alvejamento no sítio selecionado (ou sítios selecionados); sendo assim, as iPSCs com modificação genômica obtidas compreendem pelo menos uma edição genômica de alvejamento funcional e as ditas iPSCs com modificação genômica têm capacidade para diferenciação em células parcial ou totalmente diferenciadas.
[00011] (III): modificar geneticamente células não pluripotentes para reprogramação para obter iPSCs com modificação genômica que compreendem (i) e (ii): (i) introduzir em células não pluripotentes um dentre (a) e (b) ou ambos, em qualquer ordem: (a) um ou mais construtos para permitir a integração de alvejamento no sítio selecionado (ou sítios selecionados); (b) uma ou mais quebras de cadeia dupla em um sítio selecionado com o uso de pelo menos uma endonuclease com capacidade para reconhecimento de sítio selecionado, em que as células da etapa (III)(i)(b) são cultivadas para permitir que o reparo de DNA endógeno gere in/dels de alvejamento nos sítios selecionados; e (ii) colocar as células da etapa (III)(i) em contato com um ou mais fatores de reprogramação e, opcionalmente, uma composição de molécula pequena que compreende um receptor de TGFβ/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e/ou um inibidor de ROCK, para obter iPSCs com modificação genômica, que compreendem edição de alvejamento em sítios selecionados; obtendo, desse modo, iPSCs com modificação genômica que compreendem pelo menos uma edição genômica de alvejamento funcional e as ditas iPSCs com modificação genômica têm capacidade para serem diferenciadas em células parcialmente diferenciadas ou células totalmente diferenciadas.
[00012] Em uma modalidade do método acima, a pelo menos uma edição genômica de alvejamento em um ou mais sítios selecionados compreende a inserção de um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam proteínas de comutação de segurança, modalidades de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos ou proteínas que promovam enxerto, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência das iPSCs com modificação genômica ou células derivativas das mesmas. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos exógenos para inserção estão operacionalmente ligados a (1) um ou mais promotores exógenos que compreendem CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC ou outros promotores constitutivos, induzíveis específicos temporais, de tecido ou de tipo de célula; ou (2) um ou mais promotores endógenos compreendidos nos sítios selecionados que compreendem AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outro lócus que atenda aos critérios de um porto seguro de genoma. Em algumas modalidades, as iPSCs com modificação genômica geradas com o uso do método acima compreendem um ou mais polinucleotídeos exógenos diferentes que codificam proteína que compreende caspase, timidina-quinase, citosina-desaminase, EGFR modificado ou CD20 de célula B, em que quando as iPSCs com modificação genômica compreendem dois ou mais genes suicidas, os genes suicidas são integrados em diferentes lócus de porto seguro que compreendem AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno codifica um peptídeo parcial ou total de IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 e/ou os respectivos receptores dos mesmos. Em algumas modalidades, o peptídeo parcial ou total de IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 e/ou os respectivos receptores dos mesmos codificados pelo polinucleotídeo exógeno está sob uma forma de proteína de fusão.
[00013] Em algumas outras modalidades, as iPSCs com modificação genômica geradas com o uso do método fornecido no presente documento compreendem in/del em um ou mais genes endógenos associados à modalidade de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, candidatos a alvos de fármacos, regulação e modulação de resposta imune ou proteínas que suprimem enxerto, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência das iPSCs ou células derivativas das mesmas. Em algumas modalidades, o gene endógeno para interrupção compreende pelo menos um dentre B2M, TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21.
[00014] Em ainda algumas outras modalidades, as iPSCs modificadas genomicamente geradas com o uso do método fornecido neste documento compreendem um polinucleotídeo exógeno que codifica caspase no lócus AAVS1 e uma timidina-quinase que codifica polinucleotídeo exógeno no lócus H11.
[00015] Em ainda algumas outras modalidades, a abordagem (I), (II) e/ou (III) compreende ainda: o contato das iPSCs com modificação genômica com uma composição de molécula pequena que compreende um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK, para manter a pluripotência das iPSCs com modificação genômica. Em uma modalidade, as iPSCs com modificação genômica obtidas que compreendem pelo menos uma edição genômica de alvejamento são funcionais, são potentes para diferenciação e têm capacidade para diferenciação em células não pluripotentes que compreendem a mesma edição genômica funcional.
[00016] A presente invenção também fornece os seguintes itens.
[00017] Um aspecto do presente pedido fornece uma célula ou uma população da mesma, em que a célula é uma célula pluripotente induzida (iPSC), uma iPSC clonal ou uma célula de linha celular de iPS, ou uma célula derivativa obtida a partir da diferenciação de qualquer uma das ditas iPSCs acima mencionadas; e em que qualquer uma das ditas células acima compreende pelo menos um knockout de CD38 ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα sem um domínio intracelular (IL15Δ). Em algumas modalidades da célula derivativa obtida a partir da diferenciação de iPSC, a célula derivativa é uma célula hematopoiética, incluindo, mas sem limitação, células CD34, células endoteliais hemogênicas, HSCs (células-tronco e progenitoras hematopoiéticas), células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, progenitores de células T, progenitores de células NK, células T, células NKT, células NK e células B; cuja célula hematopoiética (isto é, célula CD34 derivativa, células endoteliais hemogênicas derivativas, células-tronco e progenitora hematopoiética derivativas, célula progenitora multipotente hematopoiética derivativa, progenitor de células T derivativas, progenitor de células NK derivativas, célula T derivativa, célula NKT derivativa, célula NK derivada ou célula B derivativa) compreende telômeros mais longos em comparação com sua célula nativa equivalente, obtida a partir de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador.
[00018] Em algumas modalidades da dita iPSC e sua célula derivativa que compreende um knockout de CD38 ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα sem um domínio intracelular (IL15∆), a célula compreende adicionalmente uma ou mais dentre as seguintes edições genômicas: (i) teor nulo ou baixo de B2M; (ii) teor nulo ou baixo de CIITA; (iii) expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável; (iv) um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo; (v) um receptor de antígeno quimérico (CAR), (vi) um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; (vii) pelo menos um dos genótipos listados na Tabela 1; (viii) deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; e (ix) expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador, e um receptor de disparo de superfície para acoplar ao engajador bi- ou multiespecífico ou universal.
[00019] Em algumas modalidades da dita iPSC e sua célula derivativa que compreende pelo menos um knockout de CD38 ou um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα sem um domínio intracelular (IL15∆) e edição genômica adicional opcional, conforme descrito acima e ao longo deste pedido, a célula pode compreender (i) um ou mais polinucleotídeos exógenos integrados em um lócus de porto seguro; ou (ii) mais de dois polinucleotídeos exógenos integrados em diferentes locais seguros; ou (iii) um polinucleotídeo que codifica uma IL15∆ que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 17, 19 ou 21. Em algumas modalidades, o lócus de porto seguro compreende pelo menos um dentre AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1. Em uma modalidade específica, o lócus de porto seguro de TCR é uma região constante de TCR-alfa.
[00020] Em algumas modalidades da célula ou população da mesma, em que a célula compreende pelo menos um knockout de CD38 ou uma IL15∆ e uma ou mais das edições genômicas adicionais acima são uma célula NK derivativa ou uma célula T derivativa e a célula NK derivativa ou uma célula T derivativa tem pelo menos uma das seguintes características, incluindo, mas sem limitação: (i) persistência e/ou sobrevivência aprimoradas; (ii) resistência aumentada às células imunes nativas; (iii) citotoxicidade aumentada; (iv) penetração tumoral aprimorada; (v) ADCC intensificada ou adquirida; (vi) capacidade intensificada em migração e/ou ativação ou recrutamento de células imunes espectadoras, para sítios tumorais; (vii) capacidade intensificada para reduzir a imunossupressão de tumores; (viii) capacidade aprimorada em resgatar o escape de antígeno tumoral; e (ix) fratricídio reduzido, quando comparado à célula NK ou T equivalente nativa obtida a partir de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador.
[00021] Em uma modalidade da célula ou população da mesma, a célula que compreende um knockout de CD38 ou uma IL15∆ compreende ainda um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo. Algumas modalidades do CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo compreendem pelo menos qualquer um dos seguintes: (a) F176V e S197P no domínio ectodomínio de CD16; (b) um ectodomínio total ou parcial originado a partir de CD64; (c) um domínio transmembranar não nativo (ou não CD16); (d) um domínio intracelular não nativo (ou não CD16); (e) um domínio de sinalização não nativo (ou não CD16); (f) um domínio estimulador não nativo; e (g) domínios transmembranares, de sinalização e estimuladores que não são originados a partir de CD16, e são originados a partir de um polipeptídeo igual ou diferente. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar não nativo é derivado de polipeptídeo de CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D ou receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, o domínio estimulador não nativo é derivado de polipeptídeo de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 ou NKG2D. Em algumas outras modalidades, o domínio de sinalização não nativo é derivado de polipeptídeo de CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C ou NKG2D. Em algumas modalidades específicas de uma variante de hnCD16, o domínio transmembranar não nativo é derivado de NKG2D, o domínio estimulador não nativo é derivado de 2B4 e o domínio de sinalização não nativo é derivado de CD3ζ.
[00022] Em uma modalidade da célula ou população da mesma, a célula que compreende um knockout de CD38 ou uma IL15∆ compreende ainda um receptor de antígeno quimérico (CAR), e em que o CAR pode ser qualquer um ou mais dos seguintes itens: (i) específico para células T ou específico para células NK; (ii) CAR de aglutinação ao antígeno biespecífico; (iii) um CAR comutável; (iv) um CAR dimerizado; (v) um CAR de divisão; (vi) um CAR de múltiplas cadeias; (vii) um CAR induzível; (viii) coexpresso com outro CAR; (ix) coexpresso com um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma, opcionalmente em construtos separados ou em um construto bicistrônico; (xi) coexpresso com um inibidor de ponto de verificação, opcionalmente em construtos separados ou em um construto bicistrônico; (xii) é específico para CD19 ou BCMA; e/ou (xiii) é específico para qualquer um dentre ADGRE2, anidrase carbônica IX (CAlX), CCRI, CCR4, antígeno carcinoembriônico (CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, um antígeno de uma célula infectada por citomegalovírus (CMV), glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial-40 (EGP-40), molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), EGFRvIII, proteínas tirosina-quinases de receptor erb- B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, proteína de ligação ao folato ERBB (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor-a de folato, Gangliosídeo G2 (GD2), Gangliosídeo G3 (GD3), Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico humano 2 (HER-2), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), ICAM-1, Integrina B7, subunidade alfa-2 de receptor de Interleucina-13 (IL- 13Rα2), cadeia leve de κ, receptor de domínio de inserto de quinase (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), LILRB2, família de antígeno de melanoma A 1 (MAGE-A1), MICA/B, Mucina 1 (Muc-1), Mucina 16 (Muc-16), Mesotelina (MSLN), NKCSI, ligantes de NKG2D, c-Met, antígeno de câncer/testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), PRAME, antígeno de células-tronco de próstata (PSCA), antígeno de membrana específica de próstata PRAME (PSMA), glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, fator de crescimento endotelial vascular R2 (VEGF- R2), proteína de tumor de Wilms (WT-1), e um antígeno de patógeno.
[00023] Em algumas das modalidades, nas quais um inibidor de ponto de verificação é coexpresso com um CAR, o inibidor de ponto de verificação é um antagonista de uma ou mais moléculas de ponto de verificação que compreende PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara (receptor-alfa de ácido retinoico), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E ou KIR inibitório. O inibidor de ponto de verificação coexpresso com o CAR pode ser um anticorpo, ou variantes ou fragmentos humanizados ou modificados por Fc e equivalentes funcionais e biossimilares dos mesmos, específicos para qualquer uma das moléculas de ponto de verificação acima. Em algumas modalidades, o CAR de qualquer um de (i) a (ix) pode ser inserido no lócus do TRAC. Em algumas modalidades, o CAR de qualquer um de (i) a (ix) inserido no lócus do TRAC pode ser acionado por um promotor endógeno de TCR. Em algumas modalidades, a inserção do CAR de qualquer um dentre (i) a (ix) no lócus de TRAC leva ao knockout de TCR.
[00024] Em uma modalidade da célula ou população da mesma, a célula que compreende um knockout de CD38 compreende ainda um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma e em que a citocina exógena ou um receptor da mesma pode compreender pelo menos uma das IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 e o respectivo receptor das mesmas; ou pode compreender pelo menos um dentre: (i) coexpressão de IL15 e IL15Rα utilizando-se um peptídeo de autoclivagem; (ii) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rα; (iii) uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα com domínio intracelular de IL15Rα truncada; (iv) uma proteína de fusão de IL15 e o domínio Sushi ligado à membrana de IL15Rα; (v) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rβ; (vi) uma proteína de fusão de IL15 e receptor comum yC, em que o receptor comum yC é nativo ou modificado; e (vii) um homodímero de IL15Rβ; em que qualquer um de (i) a (vii) pode ser coexpresso com um CAR em construtos separados ou em um construto bicistrônico. Em algumas modalidades, o peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena de superfície celular ou um receptor é transitoriamente expresso na célula fornecida no presente documento.
[00025] Em outra modalidade da célula ou população da mesma, a célula compreende um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa em uma superfície celular ou um receptor, em que a citocina pode compreender pelo menos uma dentre IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 e respectivo receptor das mesmas. Em uma modalidade da célula ou população da mesma que compreende citocina ou receptor de IL15, a célula pode compreender pelo menos um dentre: (i) coexpressão de IL15 e IL15Rα utilizando-se um peptídeo de autoclivagem; (ii) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rα; (iii) uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα com domínio intracelular de IL15Rα truncada; (iv) uma proteína de fusão de IL15 e o domínio Sushi ligado à membrana de IL15Rα; (v) uma proteína de fusão de
IL15 e IL15Rβ; (vi) uma proteína de fusão de IL15 e receptor comum yC, em que o receptor comum yC é nativo ou modificado; e (vii) um homodímero de IL15Rβ; em que qualquer um de (i) a (vii) pode ser coexpresso com um CAR em construtos separados ou em um construto bicistrônico. Em algumas modalidades, o peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena de superfície celular ou um receptor é transitoriamente expresso na célula fornecida no presente documento. Em uma modalidade, a célula ou população da mesma compreende um polinucleotídeo que codifica uma IL15∆ que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17, 19 ou 21. Em uma modalidade da célula ou população da mesma, a célula que compreende uma IL15∆ pode compreender ainda um ou mais dentre teor baixo ou nulo de B2M; teor baixo ou nulo de CIITA; expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável; um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo; um receptor de antígeno quimérico (CAR), um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma, em que a citocina não é IL15; pelo menos um dos genótipos listados na Tabela 1; deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; e expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplar aos engajadores bi-, ou multiespecíficos ou universais. Em uma modalidade de uma célula ou população da mesma que compreende tanto uma IL15∆ quanto um CAR, a IL15∆ pode ser coexpressa com um CAR em construtos separados ou em um construto bicistrônico.
[00026] Em uma modalidade da célula ou população da mesma, a célula que compreende um knockout de CD38 ou uma IL15∆ é uma célula NK derivativa ou uma célula T derivativa, em que a célula NK derivativa tem capacidade para recrutamento e/ou migração de células T para sítios de tumor, e em que a célula NK derivativa ou a célula T derivativa tem capacidade para reduzir a imunossupressão tumoral na presença de um ou mais inibidores de ponto de verificação. Em algumas modalidades, os inibidores de ponto de verificação são antagonistas de uma ou mais moléculas de ponto de verificação que compreendem PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara (receptor-alfa de ácido retinoico), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E ou KIR inibitório. Em algumas outras modalidades, os inibidores de ponto de verificação compreendem (a) um ou mais dentre atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, ipilimumabe, IPH4102, IPH43, IPH33, lirimumabe, monalizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe e seus derivativos ou equivalentes funcionais; ou (b) pelo menos um dentre atezolizumabe, nivolumabe e pembrolizumabe.
[00027] Outro aspecto do presente pedido fornece uma composição que compreende qualquer uma das células ou populações das mesmas, conforme descrito acima, e ao longo deste pedido. Em algumas modalidades, as células derivadas (células derivativas) de iPSC ou iPSC podem compreender qualquer um dos genótipos listados na Tabela 1 deste pedido. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende knockout de CD38 (CD38-/-). Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende uma IL15∆. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16 e knockout de CD38. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16 e uma IL15∆. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16, knockout de CD38 e uma IL15∆. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16, CD38-/- e um CAR. Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16, IL15∆ e um CAR.
Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16, IL15∆, CD38-/- e um CAR.
Em algumas modalidades, a iPSC ou célula derivativa da mesma compreende hnCD16, CD38-/-, um CAR e um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma, conforme fornecido acima e ao longo deste pedido.
Em algumas modalidades de células que compreendem hnCD16, CD38-/- e um CAR, o CAR é específico para CD19. Em algumas modalidades de células que compreendem hnCD16, IL15∆ e um CAR, o CAR é específico para CD19. Em algumas modalidades de células que compreendem hnCD16, IL15∆, CD38-/- e um CAR, o CAR é específico para CD19. Em algumas outras modalidades de células que compreendem hnCD16, CD38-/- e um CAR, o CAR é específico para CD269 (BCMA). Em algumas outras modalidades de células que compreendem hnCD16, IL15∆ e um CAR, o CAR é específico para CD269 (BCMA). Em algumas outras modalidades de células que compreendem hnCD16, IL15∆, CD38-/- e um CAR, o CAR é específico para CD269 (BCMA). Em ainda algumas outras modalidades, o CAR é específico para qualquer um dentre ADGRE2, anidrase carbônica IX (CAlX), CCRI, CCR4, antígeno carcinoembriônico (CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, um antígeno de uma célula infectada por citomegalovírus (CMV) (por exemplo, um antígeno de superfície celular), glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial-40 (EGP-40), molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), EGFRvIII, proteína tirosina-quinases de receptor erb- B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, proteína de aglutinação ao folato de ERBB (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor-a de folato, Gangliosídeo G2 (GD2), Gangliosídeo G3 (GD3), Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico humano 2 (HER-2), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), ICAM-1, Integrina B7, subunidade alfa-2 de receptor de Interleucina-13 (IL-13Rα2), cadeia leve de κ, receptor de domínio de inserto de quinase (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adesão celular L1 (L1-CAM), LILRB2, família de antígeno de melanoma A 1 (MAGE-A1), MICA/B, Mucina 1 (Muc-1), Mucina 16 (Muc-16), Mesotelina (MSLN), NKCSI, ligantes de NKG2D, c-Met, antígeno de câncer/testículo NY- ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), PRAME, antígeno de células-tronco de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico para próstata PRAME (PSMA), glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, fator de crescimento endotelial vascular R2 (VEGF- R2), proteína de tumor de Wilms (WT-1) e vários antígenos de patógeno conhecidos na técnica.
[00028] Por conseguinte, um aspecto adicional do presente pedido fornece uma composição para uso terapêutico, que compreende, além de qualquer uma das células derivadas conforme fornecido neste documento, um ou mais agentes terapêuticos. Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, os agentes terapêuticos compreendem um peptídeo, uma citocina, um inibidor de ponto de verificação, um mitógeno, um fator de crescimento, um pequeno RNA, um dsRNA (RNA de cadeia dupla), células sanguíneas mononucleares, células alimentadoras, componentes de célula alimentadora ou fatores de substituição dos mesmos, um vetor que compreende um ou mais ácidos polinucleicos de interesse, um anticorpo, um agente quimioterapêutico ou uma porção química radioativa ou um fármaco imunomodulador (IMiD). Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, o inibidor de ponto de verificação usado com as células fornecidas compreende uma ou mais moléculas de ponto de verificação de antagonistas que compreendem PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4- 1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39, CD47, CD73, CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2, Rara (receptor-alfa de ácido retinoico), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, ou KIR inibitório. Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, o inibidor de ponto de verificação usado com as células fornecidas compreende um ou mais dentre atezolizumabe,
avelumabe, durvalumabe, ipilimumabe, IPH4102, IPH43, IPH33, lirimumabe, monalizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe e seus derivativos ou equivalentes funcionais. Em algumas outras modalidades da composição para uso terapêutico, o inibidor de ponto de verificação usado com as células fornecidas compreende pelo menos um dentre atezolizumabe, nivolumabe e pembrolizumabe. Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, os agentes terapêuticos compreendem um ou mais dentre venetoclax, azacitidina e pomalidomida.
[00029] Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, o anticorpo usado com as células fornecidas compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-EGFR, anti- CD123, anti-GD2, anti-PDL1 e/ou anti-CD38. Em algumas modalidades da composição para uso terapêutico, o anticorpo usado com as células fornecidas compreende um ou mais dentre rituximabe, veltuzumabe, ofatumumabe, ublituximabe, ocaratuzumabe, obinutuzumabe, trastuzumabe, pertuzumabe, alemtuzumabe, certuximabe, dinutuximabe, avelumabe, daratumumabe, isatuximabe, MOR202, 7G3, CSL362, elotuzumabe e suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas ou fragmentos e seus equivalentes funcionais e biossimilares. Em ainda algumas outras modalidades da composição para uso terapêutico, o anticorpo usado com as células fornecidas compreende daratumumabe.
[00030] O presente pedido também fornece o usoterapêutico da célula ou composição terapêutica, conforme descrito neste documento, introduzindo a composição a um sujeito adequado para a terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, o sujeito adequado para a, e que necessita de, terapia celular adotiva tem um distúrbio autoimune; uma malignidade hematológica; um tumor sólido; câncer ou uma infecção por vírus.
[00031] Um aspecto adicional do presente pedido fornece um método para fabricar as células derivativas, conforme descrito no presente documento, e o método compreende a diferenciação de uma iPSC que compreende knockout de CD38 ou uma IL15Δ, e, opcionalmente, um ou mais dentre: (i) teor baixo ou nulo de B2M; (ii) teor baixo ou nulo de CIITA; (iii) expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável; (iv) um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo; (v) um receptor de antígeno quimérico (CAR); (vi) um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; e (vii) pelo menos um dos genótipos listados na Tabela 1; (viii) deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; e (ix) expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplar aos engajadores bi- ou multiespecíficos ou universais.
[00032] Em algumas modalidades do método de fabricação, o método compreende ainda modificar genomicamente uma iPSC clonal para knockout de CD38 ou para knock in de uma IL15∆, e opcionalmente para knockout de B2M e CIITA, ou para introduzir a expressão de HLA-G ou HLA-G não clivável, um CD16 não clivável de alta afinidade ou uma variante do mesmo, um CAR e/ou um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; e o CAR e o peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma são coexpressos em construtos separados ou em um construto bicistrônico. Em algumas modalidades do método de fabricação, a modificação genômica de uma iPSC compreende edição de alvejamento. Em algumas modalidades, a edição de alvejamento compreende exclusão, inserção ou in/del. Em algumas modalidades, a edição de alvejamento é realizada por CRISPR, ZFN, TALEN, nuclease de homing, recombinação de homologia ou qualquer outra variação funcional desses métodos.
[00033] O presente pedido fornece ainda edição mediada por CRISPR de iPSCs clonais, assim, produzindo iPSCs clonais editadas que compreendem knockout de CD38 ou knockin de IL15∆, ou pelo menos um dos genótipos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades da edição mediada por CRISPR, o knockout de CD38 obtido é bialélico. Em algumas modalidades da edição mediada por CRISPR, o knockout de CD38 é uma clivagem de ácido nucleico entre uma primeira e uma segunda sequências-alvo, e em que as sequências de alvejamento compreendem SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente. Em algumas modalidades da edição mediada por CRISPR, o knockin de IL15∆ obtido compreende um polinucleotídeo que codifica uma IL15∆ que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade para SEQ ID NO: 17, 19 ou 21. Em algumas modalidades da edição mediada por CRISPR acima, a edição compreende ainda uma inserção de um CAR no lócus de TRAC e/ou em que o CAR é acionado por um promotor endógeno de TCR e/ou em que o TCR é submetido a knockout pela inserção de CAR.
[00034] Aspectos adicionais do presente pedido fornecem um método para aprimorar o tratamento com anticorpo anti-CD38 que compreende administrar a um sujeito em tratamento as células efetoras sem expressão de CD38. Em algumas modalidades do tratamento com anticorpo anti-CD38, o anticorpo anti-CD38 pode ser daratumumabe, isatuximabe ou MOR202, ou qualquer uma de suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas ou fragmentos, equivalentes funcionais e biossimilares dos mesmos. As células efetoras fornecidas para um método para aprimorar o tratamento com anticorpo anti-CD38, em algumas modalidades, compreendem células hematopoiéticas derivativas que compreendem células NK derivativas ou células T derivativas; e as células NK derivativas ou células T derivativas compreendem um knockout de CD38, um CD16 não clivável de alta afinidade ou uma variante do mesmo e, opcionalmente, compreendem (i) knockout de B2M e CIITA; (ii) expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável,
um CAR e/ou um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; em que o CAR e um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma são coexpressos em construtos separados ou em um construto bicistrônico; e/ou (iii) pelo menos um dos genótipos listados na Tabela
1. Em algumas modalidades do método que aprimora um tratamento com anticorpo anti-CD38, o método reduz a redução de células efetoras induzidas por anticorpo anti-CD38 no sujeito sob tal tratamento.
[00035] Ainda, outro aspecto do presente pedido fornece um método para reduzir ou prevenir a alorrejeição contra células efetoras alogênicas com o uso de um antagonista específico para CD38, em que as células efetoras alogênicas compreendem o knockout de CD38 e em que o antagonista específico para CD38 tem capacidade para suprimir células T e B ativadas em um receptor das células efetoras alogênicas. Em algumas modalidades, o antagonista específico para CD38 é um anticorpo anti-CD38, um agente específico para CD38 ou um receptor de antígeno quimérico de CD38 (CAR). Em alguma outra modalidade, o anticorpo anti-CD38 é daratumumabe, isatuximabe ou MOR202, ou qualquer uma das variantes modificadas por Fc ou humanizadas ou fragmentos, equivalentes funcionais e biossimilares dos mesmos. Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-CD38 é daratumumabe e o método fornecido neste documento confere um uso inovador do daratumumabe.
[00036] Um outro aspecto do presente pedido fornece um construto para modificar geneticamente uma célula para obter uma célula genomicamente editada, que compreende: (i) um braço de homologia esquerdo e um braço de homologia direito que alvejam CD38 em uma posição selecionada no lócus de CD38 (LHA/CD38, RHA/CD38) no genoma celular, operacionalmente ligado a (ii) uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas; em que a célula genomicamente editada é uma célula pluripotente induzida (iPSC), uma iPSC clonal ou uma célula de linhagem celular iPS; em que a célula genomicamente editada compreende uma integração alvejada da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas na posição selecionada no lócus de CD38 e knockout de CD38; e em que a célula genomicamente editada é uma iPSC capaz de se diferenciar em uma célula hematopoiética derivada de iPSC. Em uma modalidade do construto, a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas estão operativamente ligadas a, e são acionadas por, um promotor endógeno de CD38 após integração; ou em que a posição selecionada no lócus de CD38 está em um éxon de CD38.
[00037] Em algumas modalidades do construto, a uma ou mais proteínas exógenas compreendem pelo menos um ou ambos dentre: (i) um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo; e (ii) uma proteína de fusão exógena do receptor IL15/IL15 expressa na superfície celular (IL15RF) ou uma variante da mesma; e, como tal, a célula genomicamente editada e a célula hematopoiética derivada da mesma compreendem a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam hnCD16 e IL15RF, ou variantes das mesmas. Em algumas modalidades do construto, o hnCD16 ou uma variante do mesmo compreende pelo menos um dentre: (a) F176V e S197P no domínio ectodomínio de CD16; (b) um ectodomínio total ou parcial originado a partir de CD64; (c) um domínio transmembranar não nativo (ou não CD16); (d) um domínio intracelular não nativo (ou não CD16); (e) um domínio de sinalização não nativo (ou não CD16); (f) um domínio estimulador não nativo; e (g) domínios transmembranares, de sinalização e estimuladores que não são originados a partir de CD16, e são originados a partir de um mesmo polipeptídeo ou de um diferente. Em algumas outras modalidades do construto, o IL15RF ou uma variante do mesmo compreende pelo menos um dentre: (a) IL15 e IL15Rα coexpressos utilizando- se um peptídeo de autoclivagem; (b) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rα; (c) uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα com domínio intracelular de IL15Rα truncada; (d) uma proteína de fusão de IL15 e o domínio Sushi aglutinado à membrana de IL15Rα; (e) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rβ; (f) uma proteína de fusão de IL15 e receptor comum yC, em que o receptor comum yC é nativo ou modificado; (g) um homodímero de IL15Rβ; e (h) um polinucleotídeo que codifica um IL15RF que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17, 19 ou 21. Em algumas modalidades do CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo compreendida no construto, o hnCD16 compreende um ou um ou mais dentre: (i) um domínio transmembranar não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4- 1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D ou receptor de célula T (TCR); (ii) um domínio estimulador não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 ou NKG2D; (iii) um domínio de sinalização não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C ou NKG2D; ou (iv) um domínio transmembranar não nativo é derivado a partir de NKG2D, o domínio estimulador não nativo é derivado a partir de 2B4 e o domínio de sinalização não nativo é derivado a partir de CD3ζ.
[00038] Em algumas modalidades, a célula genomicamente editada e a célula hematopoiética derivada da mesma obtida a partir do uso do construto conforme fornecido compreendem, ainda, um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR tem pelo menos uma das seguintes características: (i) específico para células T ou específico para células NK; (ii) CAR de aglutinação ao antígeno biespecífico; (iii) um CAR comutável; (iv) um CAR dimerizado; (v) um CAR dividido; (vi) um CAR de múltiplas cadeias; (vii) um CAR induzível; (viii) coexpresso com outro CAR; (ix) coexpresso com um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; (xi) coexpresso com um inibidor de ponto de verificação; (xii) codificado por um ácido nucleico adicionalmente compreendido no construto, conforme fornecido, e o CAR é inserido na posição selecionada no lócus de CD38; (xiii) inserido no lócus TRAC e/ou acionado por um promotor endógeno de TCR e/ou é realizado knockout do TCR pela inserção de CAR; (xiii) específico para CD19 ou BCMA; e/ou (xiv) específico para qualquer um de ADGRE2, anidrase carbônica IX (CAlX), CCRI, CCR4, antígeno carcinoembriônico (CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, um antígeno de uma célula infectada por citomegalovírus (CMV), glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial 40 (EGP-40), molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM), EGFRvIII, r proteína tirosina-quinases de receptor erb B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB proteína de aglutinação ao folato (FBP), receptor fetal de acetilcolina (AChR), receptor de folato-a, Gangliósido G2 (GD2), Gangliósido G3 (GD3), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), ICAM-1, Integrina B7, subunidade alfa-2 do receptor de interleucina-13 (IL- 13Rα2), cadeia leve κ, receptor de domínio de inserção de quinase (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), LILRB2, família de antígeno de melanoma A 1 (MAGE-A1), MICA/B, Mucina 1 (Muc-1), Mucina 16 (Muc-16), mesotelina (MSLN), NKCSI, ligantes de NKG2D, c-Met, antígeno de câncer/testículo NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), PRAME, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), PRAME antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), glicoproteína associada a tumor 72 (TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, fator de crescimento endotelial vascular R2 (VEGF R2), proteína tumoral de Wilms (WT-1) e um antígeno de patógeno.
[00039] Em outra modalidade do construto, o construto compreende ainda um ou mais dentre: (i) um promotor exógeno que aciona a expressão da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas, em que o promotor exógeno é constitutivo, induzível, específico temporal, de tecido e/ou de tipo de célula específico; (ii) uma sequência ligante inserida entre duas sequências de ácido nucleico que codificam proteínas exógenas; (iii) um isolador na extremidade 3’ de LHA/CD38 e um isolador na extremidade 5’ de RHA/CD38; e (iv) um sinal poliA. Em algumas modalidades do construto, o promotor exógeno pode ser qualquer um dentre CMV, EF1α, PGK, CAG ou UBC; ou a sequência ligante é uma sequência 2A que codifica um peptídeo 2A autoclivável; ou a sequência ligante é uma Sequência de Entrada Interna de Ribossoma (IRES).
[00040] Em algumas modalidades do construto, a célula genomicamente editada resultante que é uma iPSC ou a célula hematopoiética derivada de iPSC tem um ou mais dos seguintes fenótipos: (i) compreendendo telômeros mais longos em comparação com sua célula de contraparte nativa obtida a partir de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador; (ii) CD38-/- CD16; (iiii) CD38-/- IL15; e/ou (iv) CD38-/- CD16 IL15. Em algumas modalidades do construto, a célula genomicamente editada resultante que é uma iPSC ou a célula hematopoiética derivada de iPSC compreende, ainda, um ou mais de: (i) B2M nula ou baixa; (ii) CIITA nulo ou baixo; (iii) expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável; (iv) deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21; e (v) expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, receptor Fc, um engajador e um receptor de disparo de superfície para acoplamento com engajadores bi ou multiespecífico ou universais.
[00041] Em algumas modalidades do construto, as células hematopoiéticas derivadas a partir da diferenciação da iPSC genomicamente editada resultante compreendem célula CD34 derivada, célula- tronco e progenitora hematopoiética derivada, célula progenitora multipotente hematopoiética derivada, progenitor de célula T derivada, progenitor de célula NK derivada, célula T derivada, célula NKT derivada, célula NK derivada ou célula B derivada. Em uma modalidade, as células hematopoiéticas derivadas a partir da diferenciação da iPSC genomicamente editada resultante compreendem uma célula NK derivada ou T derivada, e tem pelo menos uma das seguintes características, que compreendem: (i) persistência e/ou sobrevivência aprimoradas; (ii) resistência aumentada às células imunes nativas; (iii) citotoxicidade aumentada; (iv) penetração tumoral aprimorada; (v) ADCC intensificada ou adquirida; (vi) capacidade intensificada em migração e/ou ativação ou recrutamento de células imunes espectadoras, para sítios tumorais; (vii) capacidade intensificada de reduzir a imunossupressão de tumores; (viii) capacidade aprimorada de resgatar o escape de antígeno tumoral; e (ix) fratricídio reduzido na presença de anticorpos anti-CD38 ou CD38 CAR, em comparação com sua célula de contraparte nativa obtida de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou quaisquer outros tecidos doadores. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 é daratumumabe, isatuximabe ou MOR202, ou qualquer uma das variantes ou fragmentos modificados por Fc ou humanizados, equivalentes funcionais e biossimilares dos mesmos.
[00042] Também é fornecido neste pedido um vetor de expressão que compreende um construto conforme descrito neste documento. É fornecida ainda, consequentemente, uma célula hospedeira que compreende o construto, ou o vetor de expressão conforme descrito. Além disso, é fornecida uma composição para a fabricação de uma iPSC genomicamente editada ou célula hematopoiética derivada diferenciada a partir da mesma, e a composição compreende um construto ou um vetor de expressão conforme descrito neste documento. Além disso, um kit é fornecido neste documento, e o kit compreende um construto, um vetor de expressão ou uma célula hospedeira, conforme descrito neste documento, e um ou mais meios para cultura, manutenção ou diferenciação de iPSC. O fornecimento adicional inclui o construto, vetor de expressão e a célula hospedeira para uso de um medicamento.
[00043] Um aspecto adicional do pedido fornece um método de produção de uma iPSC genomicamente editada ou célula hematopoiética derivada da mesma com uso do dito construto conforme descrito, e o método compreende: (i) introduzir o construto em uma iPSC, e (ii) incubar a iPSC por um período de tempo suficiente para permitir a integração alvejada de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas no lócus de CD38 e, consequentemente, realizar knockout na expressão de CD38 da iPSC, obtendo assim uma iPSC genomicamente editada. Em algumas modalidades, o método pode compreender, ainda, direcionar a diferenciação da iPSC genomicamente editada resultante para a célula hematopoiética que compreende a mesma integração alvejada de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas no lócus de CD38 e knockout de CD38 como a iPSC genomicamente editada. Em algumas modalidades do método, o método compreende, ainda, a introdução de um CRISPR-cas/gNA (ácido nucleico guia), uma ZFN, uma TALEN, uma nuclease de homing ou qualquer outra variação funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, a iPSC genomicamente editada obtida com uso do dito método aprimorou a estabilidade genômica do que a iPSC em integração e knockout em eventos de edição separados e por etapas.
[00044] Vários objetivos e vantagens das composições e métodos conforme fornecidos se tornarão evidentes a partir da descrição a seguir, obtida em conjunto com os desenhos anexos, em que são apresentadas, a título de ilustração e exemplo, certas modalidades desta invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00045] A Figura 1 é uma representação gráfica de vários projetos de construto para citocina expressa na superfície celular em células derivadas de iPSC. A IL15 é usada como um exemplo ilustrativo, que pode ser substituído por outras citocinas desejáveis.
[00046] A Figura 2 mostra o perfil de fenótipo com o uso de citometria de fluxo de células NK derivativas de CD38 -/- obtidas de cada um dos três clones de iPSC de CD38-/-.
[00047] A Figura 3 mostra que as células NK derivadas de iPSC de CD38-/- têm o mesmo potencial de citotoxicidade celular que as células NK derivadas de iPSC do tipo selvagem.
[00048] A Figura 4 é uma representação gráfica de citometria de fluxo de células NK maduras derivadas de iPSC que demonstra a modificação genética passo a passo de expressão de hnCD16, knockout de B2M (perda de expressão de HLA-A2), expressão de HLA-G e expressão de construto de IL-15/IL-15ra (LNGFR).
[00049] A Figura 5 é uma representação gráfica de comprimento de telômero determinado por citometria de fluxo, e as células NK derivativas maduras de iPSC mantêm telômeros mais longos em comparação com as células NK de sangue periférico adulto.
[00050] A Figura 6 demonstra que as células NK derivadas de iPSC de CD38-/-mantiveram a função de ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) quando estimuladas pela linhagem celular tumoral RPMI-8266 na presença de um anticorpo de CD38, daratumumabe.
[00051] A Figura 7 demonstra que, em comparação com células NK derivadas de iPSC que expressam CD38 (A), a viabilidade de células NK derivadas de iPSC de CD38-/- (B) é mantida em cultura com a presença de um anticorpo de CD38, daratumumabe, por pelo menos cerca de 48 h.
[00052] A Figura 7 demonstra que as células NK derivadas de iPSC de CD38-/- (painel inferior) não mostram desgranulação e têm menos produção de citocinas do que as células iNK que expressam CD38
(painel superior) quando estimuladas na presença de um anticorpo de CD38, daratumumabe.
[00053] A Figura 7 mostra a introdução de hnCD16 em células NK derivadas de iPSC (A) e células NK derivadas de iPSC que possuem tanto knockout de CD38 quanto de hnCD16 exógeno (B).
[00054] A Figura 10 mostra análises de fenótipo e função de células NK derivativas de hnCD16-CD38-/- em comparação com células NK derivativas de hnCD16: (A) expressão de NKG2A por citometria de fluxo; (B) expressão de NKp46 por citometria de fluxo; (C) expressão de KIR2DL2/3 por citometria de fluxo; (D) fluxo de cálcio por fluxo; (E) ADCC contra a linhagem celular ovariana que expressa HER2 SKOV3 por imaginologia de células vivas IncucyteTM.
[00055] A Figura 11 mostra o fratricídio de células NK mediado por daratumumabe em células NK derivativas com ou sem knockout de CD38 em comparação com células NK de sangue periférico. A citotoxicidade específica de daratumumabe contra diferentes populações de células NK foi medida após uma incubação de 4 horas das células iNK indicadas na presença de daratumumabe com aumento de concentração.
[00056] A Figura 12 mostra atividade antimieloma de daratumumabe intensificada mediada por células NK derivativas de hnCD16 com teor nulo de CD38. As células iNK indicadas foram incubadas com células- alvo de mieloma MM.1S por 18 horas, após o que a viabilidade de células tumorais foi avaliada pela anexina V e um marcador de viabilidade vivo/morto por citometria de fluxo.
[00057] A Figura 13 mostra que as células iNK de hnCD16 CD38-/- exibem atividade antimieloma intensificada a longo prazo e persistência com daratumumabe. (A) a depuração de células tumorais medida pelo número de células-alvo restantes no final de um ensaio de citotoxicidade de 7 dias durante um ensaio de citotoxicidade de 7 dias contra esferoides tumorais RMPI-8226; (B) a ausência de fratricídio de células NK aprimorou a sobrevivência de iNK de hnCD16 CD38-/- durante o ensaio de citotoxicidade de 7 dias.
[00058] A Figura 14 mostra que as células iNK sem CD38 possuem ADCC mais durável com maior potencial de exterminação em série na presença de daratumumabe.
[00059] A Figura 15 mostra que as células iNK transduzidas com o construto de fusão de IL15/IL15Rα de comprimento total (círculos preenchidos; controle positivo) ou um construto de fusão de IL15/IL15Rα truncado sem domínio de sinalização citoplasmático (círculos abertos) tiveram uma vantagem de sobrevivência em comparação com as células transduzidas por GFP ou não transduzidas nas mesmas culturas, independentemente de IL2 solúvel exógena. A: na presença de IL2 exógena; B: sem a presença de IL2 exógena.
[00060] As Figuras 16A a 16D ilustram várias composições de um construto knockin transgene que alveja CD38 que tem um ou mais transgenes (A e B vs. C e D), acionados por um promotor exógeno ou por promotor endógeno CD38 (B e D vs. A e C) para gerar células-tronco pluripotentes CD38-/-Transgene+ e células efetoras derivadas das mesmas.
[00061] A Figura 17 mostra a sequência nucleica exemplificativa compreendida em um construto knockin de IL15/IL15ra-2A- hnCD16 que alveja CD38 que tem transgenes acionados por um promotor exógeno para gerar células efetoras CD38-/-CD16 IL15 derivadas a partir de células-tronco pluripotentes geneticamente modificadas com uso do construto e variantes do mesmo.
[00062] A Figura 18 mostra a sequência nucleica exemplificativa compreendida em um construto knockin de IL15/IL15ra-2A- hnCD16 que alveja CD38 que tem transgenes acionados pelo promotor endógeno CD38 para gerar células efetoras CD38-/-CD16+IL15+ derivadas a partir de células-tronco pluripotentes geneticamente modificadas com uso do construto e variantes do mesmo.
[00063] A Figura 19 mostra fenotipagem de citometria de fluxo de células iNK não geneticamente modificadas ou CD38-/-CD16 IL15 iNK geneticamente modificadas com construto knockin de IL15/IL15ra-2A- hnCD16 que alveja CD38.
[00064] A Figura 20 mostra que as células CD38-/- CD16 IL15 iNK derivadas a partir de iPSC modificada geneticamente com o construto knockin de IL15/IL15ra-2A-hnCD16 que alveja CD38 aprimoraram a persistência in vitro em comparação com iNK não geneticamente modificada (FTi250). As células foram cultivadas na ausência de IL-2 ou IL-15 por 4 dias, e a porcentagem de células de entrada foi medida nos dias 2 e 4.
[00065] A Figura 21 mostra que as células CD38-/- CD16 IL15 iNK derivadas de iPSC geneticamente modificada com o construto knockin de IL15/IL15ra-2A-hnCD16 que alveja CD38 escaparam do fratricídio induzido por daratumumabe em contraste com iNK não modificada geneticamente. O rituximabe foi usado como um anticorpo de controle.
[00066] A Figura 22 mostra que as células CD38-/- CD16 IL15 iNK derivadas a partir de iPSC geneticamente modificada com o construto knockin de IL15/IL15ra-2A-hnCD16 que alveja CD38 têm ADCC superior contra células Raji em combinação com anticorpo daratumumab.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00067] A modificação genômica de iPSCs (células- tronco pluripotentes induzidas) inclui inserção, deleção e substituição de polinucleotídeos. A expressão gênica exógena em iPSCs modificadas genomicamente geralmente encontra problemas como silenciamento gênico ou expressão gênica reduzida após expansão clonal prolongada das iPSCs modificadas genomicamente originais, após diferenciação celular e em tipos de células desdiferenciadas das células derivadas das iPSCs modificadas genomicamente. Por outro lado, a modificação genética direta de células imunes primárias, tais como células T ou NK, é um desafio e apresenta um obstáculo quanto à preparação e à entrega de células imunes geneticamente modificadas para terapia celular adotiva. A presente invenção fornece uma abordagem eficiente, confiável e de alvejamento para integrar de maneira estável um ou mais genes exógenos, incluindo genes suicidas e outras modalidades funcionais, que fornecem propriedades terapêuticas aprimoradas relacionadas a enxerto, diapedese, homing, migração, citotoxicidade, viabilidade, manutenção, expansão, longevidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência, em células derivativas de iPSC, incluindo, mas sem limitação, HSCs (células progenitoras e células-tronco hematopoiéticas), células progenitoras de células T, células progenitoras de células NK, células T, células NKT e células NK.
DEFINIÇÕES
[00068] A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido terão os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.
[00069] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos, etc., descritos neste documento e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definido apenas pelas reivindicações.
[00070] Conforme usado neste documento, os artigos “um”, “uma” e “o” e “a” são usados neste documento para se referir a um ou mais (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[00071] O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas, ou qualquer combinação dos mesmos, das alternativas.
[00072] O termo “e/ou” deve ser entendido como significando uma ou ambas as alternativas.
[00073] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” refere-se a uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varia em até 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% em comparação com uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência. Em uma modalidade, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” refere-se a uma faixa de quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% ou ± 1% sobre uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.
[00074] Conforme usado neste documento, o termo “substancialmente” ou “essencialmente” refere-se a uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que é de cerca de 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou superior em comparação com uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência. Em uma modalidade, os termos “essencialmente iguais” ou “substancialmente iguais” referem-se a uma faixa de quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que é aproximadamente o mesmo que uma quantia, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.
[00075] Conforme usado neste documento, os termos “substancialmente livre de” e “essencialmente livre de” são usados de forma intercambiável e, quando usados para descrever uma composição, como uma população de células ou meio de cultura, referem-se a uma composição livre de uma substância especificada ou de sua fonte, tal como 95% livre, 96% livre, 97% livre, 98% livre, 99% livre da substância especificada ou de sua fonte, ou é indetectável conforme medido por meios convencionais. O termo “livre de” ou “essencialmente livre de” um determinado ingrediente ou substância em uma composição também significa que esse ingrediente ou substância não é (1) incluído na composição em qualquer concentração ou (2) incluído na composição funcionalmente inerte, mas em baixa concentração. Um significado semelhante pode ser aplicado ao termo “ausência de”, quando se refere à ausência de uma substância específica ou a sua fonte de uma composição.
[00076] Em todo este relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreender”, “compreende” e “compreendendo” serão entendidas como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos declarado, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Em modalidades particulares, os termos “inclui”, “tem”, “contém” e “compreende” são usados como sinônimos.
[00077] Por “consistindo em” entende-se incluir e limitar-se a qualquer coisa que segue a frase “consistindo em”. Assim, a frase “consistindo em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente.
[00078] Por “consistindo essencialmente em” entende-se incluir quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na divulgação para os elementos listados. Assim, a frase “consistindo essencialmente em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios, mas que nenhum outro elemento é opcional e pode ou não estar presente, dependendo de afetar ou não a atividade ou a ação dos elementos listados.
[00079] A referência ao longo deste relatório desritivo a “uma (1) modalidade”, “uma modalidade”, “uma modalidade específica”, “uma modalidade relacionada”, “uma certa modalidade”, “uma modalidade adicional” ou “outra modalidade” ou combinações dos mesmos significa que um recurso, estrutura ou característica particular descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, os aparecimentos das frases anteriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não estão necessariamente todos se referindo à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinadas de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.
[00080] O termo “ex vivo” refere-se geralmente a atividades que ocorrem fora de um organismo, como experimentação ou medições feitas em ou sobre tecido vivo em um ambiente artificial fora do organismo, preferencialmente com alteração mínima das condições naturais. Em modalidades particulares, os procedimentos “ex vivo” envolvem células ou tecidos vivos retirados de um organismo e cultivados em um aparelho de laboratório, geralmente em condições estéreis, e tipicamente por algumas horas ou até cerca de 24 horas, mas incluindo até 48 ou 72 horas ou mais, dependendo das circunstâncias. Em certas modalidades, esses tecidos ou células podem ser coletados e congelados e posteriormente descongelados para tratamento ex vivo. Experimentos ou procedimentos de cultura de tecidos que duram mais de alguns dias com o uso de células ou tecidos vivos são tipicamente considerados “in vitro”, embora em certas modalidades, esse termo possa ser usado de forma intercambiável com ex vivo.
[00081] O termo "in vivo" refere-se geralmente a atividades que ocorrem dentro de um organismo.
[00082] Conforme usado neste documento, os termos "reprogramação" ou "desdiferenciação" ou "aumento da potência celular" ou "aumento da potência de desenvolvimento" referem-se a um método para aumentar a potência de uma célula ou desdiferenciar a célula para um estado menos diferenciado. Por exemplo, uma célula que tem uma potência celular aumentada tem mais plasticidade de desenvolvimento (isto é, pode se diferenciar em mais tipos de células) em comparação com a mesma célula no estado não reprogramado. Em outras palavras, uma célula reprogramada é aquela que está em um estado menos diferenciado do que a mesma célula em um estado não reprogramado.
[00083] Conforme usado neste documento, o termo "diferenciação" é o processo pelo qual uma célula não especializada ("não comprometida") ou menos especializada adquire os recursos de uma célula especializada, como, por exemplo, uma célula sanguínea ou uma célula muscular. Uma célula diferenciada ou induzida pela diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada ("comprometida") dentro da linhagem de uma célula. O termo “comprometido", quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que prosseguiu na via da diferenciação até um ponto em que, em circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo de célula ou subconjunto de tipos de células específico, e não pode, em circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado. Conforme usado neste documento, o termo “pluripotente” refere-se à capacidade de uma célula formar todas as linhagens do corpo ou soma (isto é, o próprio embrião). Por exemplo, células-tronco embrionárias são um tipo de células-tronco pluripotentes que são capazes de formar células de cada uma das três camadas germinativas, o ectoderma, o mesoderma e o endoderma. A pluripotência é um continuum de potências de desenvolvimento que variam desde a célula incompleta ou parcialmente pluripotente (por exemplo, uma célula-tronco epiblástica ou EpiSC), que é incapaz de dar origem a um organismo completo à célula mais primitiva e mais pluripotente, capaz de dar origem a um organismo completo (por exemplo, uma célula-tronco embrionária).
[00084] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco pluripotentes induzidas" ou, iPSCs, significa que as células- tronco são produzidas a partir de células adultas, neonatais ou fetais diferenciadas que foram induzidas ou alteradas, isto é, reprogramadas em células capazes de se diferenciar em tecidos de todas as três camadas germinativas ou dérmicas: mesoderma, endoderma e ectoderma. As iPSCs produzidas não se referem às células como são encontradas na natureza.
[00085] Conforme usado neste documento, o termo "célula-tronco embrionária" refere-se a células-tronco pluripotentes de ocorrência natural da massa celular interna do blastocisto embrionário. As células-tronco embrionárias são pluripotentes e dão origem, durante o desenvolvimento, a todos os derivados das três camadas germinativas primárias: ectoderma, endoderma e mesoderma. Eles não contribuem para as membranas extraembrionárias ou para a placenta, isto é, não são totipotentes.
[00086] Conforme usado neste documento, o termo "célula-tronco multipotente" refere-se a uma célula que tem o potencial de desenvolvimento para se diferenciar em células de uma ou mais camadas germinativas (ectoderma, mesoderma e endoderma), mas não as três. Assim, uma célula multipotente também pode ser denominada "célula parcialmente diferenciada". As células multipotentes são bem conhecidas na técnica e exemplos de células multipotentes incluem células-tronco adultas, como por exemplo, células-tronco hematopoiéticas e células-tronco neurais. "Multipotente" indica que uma célula pode formar muitos tipos de células em uma determinada linhagem, mas não células de outras linhagens. Por exemplo, uma célula hematopoiética multipotente pode formar os muitos tipos diferentes de células sanguíneas (vermelhas, brancas, plaquetas etc.), mas não pode formar neurônios. Por conseguinte, o termo "multipotência" refere-se a um estado de uma célula com um grau de potencial de desenvolvimento que é menor que totipotente e pluripotente.
[00087] A pluripotência pode ser determinada, em parte, avaliando as características de pluripotência das células. As características da pluripotência incluem, mas não estão limitadas a: (i) morfologia de células-tronco pluripotentes; (ii) o potencial de autorrenovação ilimitada; (iii) expressão de marcadores de células-tronco pluripotentes,
incluindo, mas não limitado a, SSEA1 (somente camundongo), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/prominina, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 e/ou CD50; (iv) capacidade de se diferenciar nas três linhagens somáticas (ectoderma, mesoderma e endoderma); (v) formação de teratoma constituída pelas três linhagens somáticas; e (vi) formação de corpos embrioides consistindo em células das três linhagens somáticas.
[00088] Dois tipos de pluripotência foram descritos anteriormente: o estado de pluripotência “iniciado” ou “metaestável”, semelhante às células-tronco epiblásticas (EpiSC) do blastocisto tardio, e o estado “Naïve” ou “Ground” da pluripotência, semelhante à massa celular interna do blastocisto precoce/pré-implantação. Enquanto ambos os estados pluripotentes exibem as características descritas acima, o estado naïve ou ground exibe ainda: (i) pré-inativação ou reativação do cromossomo X nas células femininas; (ii) clonalidade e sobrevivência aprimoradas durante a cultura de células únicas; (iii) redução global na metilação do DNA; (iv) redução da deposição de marca de cromatina repressiva H3K27me3 em promotores de genes reguladores do desenvolvimento; e (v) expressão reduzida de marcadores de diferenciação em relação às células pluripotentes no estado iniciado. Metodologias padrão de reprogramação celular nas quais os genes de pluripotência exógenos são introduzidos em uma célula somática, expressos e, em seguida, silenciados ou removidos das células pluripotentes resultantes, geralmente são vistos como tendo características do estado iniciado da pluripotência. Sob condições de cultura de células pluripotentes padrão, essas células permanecem no estado iniciado, a menos que a expressão do transgene exógeno seja mantida, em que são observadas características do estado ground.
[00089] Conforme usado neste documento, o termo "morfologia de células-tronco pluripotentes" refere-se aos recursos morfológicos clássicos de uma célula-tronco embrionária. A morfologia normal das células-tronco embrionárias é caracterizada por sua forma redonda e pequena, com uma alta relação núcleo-citoplasma, presença notável de nucléolos e espaçamento intercelular típico.
[00090] Conforme usado neste documento, o termo "sujeito" refere-se a qualquer animal, de preferência um paciente humano, gado ou outro animal doméstico.
[00091] Um "fator de pluripotência" ou "fator de reprogramação" refere-se a um agente capaz de aumentar a potência de desenvolvimento de uma célula, isoladamente ou em combinação com outros agentes. Os fatores de pluripotência incluem, sem limitação, polinucleotídeos, polipeptídeos e pequenas moléculas capazes de aumentar a potência de desenvolvimento de uma célula. Fatores de pluripotência exemplificativos incluem, por exemplo, fatores de transcrição e agentes de reprogramação de pequenas moléculas.
[00092] "Cultura" ou "cultura de células" refere-se à manutenção, crescimento e/ou diferenciação de células em um ambiente in vitro. "Meios de cultura celular", "meios de cultura" ("meio" singular em cada caso), "suplemento" e "suplemento aos meios" referem-se a composições nutritivas que cultivam culturas celulares.
[00093] "Cultivar" ou "manter" refere-se à sustentação, propagação (crescimento) e/ou diferenciação de células fora do tecido ou do corpo, por exemplo, em uma placa ou frasco de cultura celular de plástico estéril (ou plástico revestido). O "cultivo" ou "manutenção" pode utilizar um meio de cultura como fonte de nutrientes, hormônios e/ou outros fatores úteis para propagar e/ou sustentar as células.
[00094] Conforme usado neste documento, o termo "mesoderma" refere-se a uma das três camadas germinais que aparece durante a embriogênese inicial e que dá origem a vários tipos de células especializadas, incluindo células sanguíneas do sistema circulatório, músculos, coração, derme, esqueleto e outros tecidos conjuntivos e de suporte.
[00095] Conforme usado neste documento, o termo "endotélio hemogênico definitivo" (HE) ou "endotélio hemogênico definitivo derivado de célula-tronco pluripotente" (iHE) refere-se a um subconjunto de células endoteliais que dão origem a células-tronco e células progenitoras hematopoiéticas em um processo chamado transição endotelial para hematopoiética. O desenvolvimento de células hematopoiéticas no embrião procede sequencialmente do mesoderma da placa lateral, através do hemangioblasto, até o endotélio hemogênico definitivo e progenitores hematopoiéticos.
[00096] O termo "células-tronco e progenitoras hematopoiéticas", "células-tronco hematopoiéticas", "células progenitoras hematopoiéticas" ou "células precursoras hematopoiéticas" refere-se a células comprometidas com uma linhagem hematopoiética, mas são capazes de diferenciação hematopoiética adicional e incluem células-tronco hematopoiéticas multipotentes (hematoblastos), progenitores mieloides, progenitores megacariócitos, progenitores eritrocitários e progenitores linfoides. As células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSCs) são células-tronco multipotentes que dão origem a todos os tipos de células sanguíneas, incluindo linhagens mieloides (monócitos e macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrócitos, megacariócitos/plaquetas, células dendríticas) e linfoides (células T, células B, células NK). O termo "célula-tronco hematopoiética definitiva", conforme usado neste documento, refere-se a células hematopoiéticas CD34+ capazes de dar origem a tipos de células mieloides e linfoides maduras, incluindo células T, células NK e células B. As células hematopoiéticas também incluem diversos subconjuntos de células hematopoiéticas primitivas que dão origem a eritrócitos, megacarócitos e macrófagos primitivos.
[00097] Conforme usado neste documento, os termos "linfócito T" e "célula T" são usados de forma intercambiável e referem-se a um tipo principal de glóbulo branco que completa a maturação no timo e que tem vários papéis no sistema imunológico, incluindo a identificação de antígenos estranhos específicos no corpo e a ativação e desativação de outras células imunes. Uma célula T pode ser qualquer célula T, como uma célula T cultivada, por exemplo, uma célula T primária ou uma célula T de uma linhagem de células T cultivada, por exemplo, Jurkat, SupT1, etc., ou uma célula T obtida de um mamífero. A célula T pode ser células CD3+. A célula T pode ser qualquer tipo de célula T e pode estar em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando a, células T duplas positivas CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+ (por exemplo, células Th1 e Th2), células T CD8+ (por exemplo, células T citotóxicas), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos do sangue periférico (PBLs), linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), células T de memória, células T naïve, células T reguladoras, células T gama delta (células T γδ) e similar. Tipos adicionais de células T auxiliares incluem células como as células Th3 (Treg), Th17, Th9 ou Tfh. Tipos adicionais de células T de memória incluem células como células T de memória central (células Tcm), células T de memória efetora (células Tem e células TEMRA). A célula T também pode se referir a uma célula T modificada geneticamente, como uma célula T modificada para expressar um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). A célula T também pode ser diferenciada de uma célula-tronco ou célula progenitora.
[00098] "Células T CD4+" refere-se a um subconjunto de células T que expressam CD4 em sua superfície e estão associadas à resposta imune mediada por células. Elas são caracterizadas pelos perfis de secreção após estimulação, que podem incluir secreção de citocinas como IFN- gama, TNF-alfa, IL2, IL4 e IL10. "CD4" são glicoproteínas de 55 kD definidas originalmente como antígenos de diferenciação nos linfócitos T, mas também encontradas em outras células, incluindo monócitos/macrófagos. Os antígenos CD4 são membros da família de supergene de imunoglobulina e estão implicados como elementos de reconhecimento associativo nas respostas imunes restritas à classe II do MHC (complexo de histocompatibilidade principal). Nos linfócitos T, eles definem o subconjunto auxiliar/indutor.
[00099] "Células T CD8+" refere-se a um subconjunto de células T que expressam CD8 em sua superfície, são restritas ao MHC classe I e funcionam como células T citotóxicas. As moléculas "CD8" são antígenos de diferenciação encontrados nos timócitos e nos linfócitos T citotóxicos e supressores. Os antígenos CD8 são membros da família de supergene de imunoglobulina e são elementos de reconhecimento associativo nas principais interações restritas à classe I do complexo de histocompatibilidade principal.
[000100] Conforme usado no presente documento, o termo “célula NK” ou “célula Exterminadora Natural” se refere a um subconjunto de linfócitos de sangue periférico definido pela expressão de CD56 ou CD16 e a ausência do receptor de célula T (CD3). Conforme usado no presente documento, os termos “célula NK adaptativa” e “célula NK de memória” são intercambiáveis e se referem a um subconjunto de células NK que são fenotipicamente CD3- e CD56+, expressando pelo menos um dentre NKG2C e CD57 e, opcionalmente, CD16, mas sem a expressão de um ou mais dos seguintes itens: PLZF, SYK, FceRɣ e EAT-2. Em algumas modalidades, subpopulações isoladas de células NK de CD56+ compreendem expressão de CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, ligantes de NCR, NKp30, NKp40, NKp46, KIRs ativadores e inibitórios, NKG2A e/ou DNAM-1. CD56+ pode ser uma expressão fraca ou brilhante.
[000101] Conforme usado no presente documento, o termo "células NKT" ou "células T exterminadoras naturais" refere-se a células T restritas a CD1d, que expressam um receptor de célula T (TCR). Ao contrário das células T convencionais que detectam antígenos peptídicos apresentados por moléculas convencionais de histocompatibilidade principal (MHC), as células NKT reconhecem antígenos lipídicos apresentados por CD1d, uma molécula de MHC não clássica. Dois tipos de células NKT são reconhecidos.
As células NKT invariantes ou do tipo I expressam um repertório muito limitado de TCR - uma cadeia α canônica (Vα24-Jα18 em humanos) associada a um espectro limitado de cadeias β (Vβ11 em humanos). A segunda população de células NKT, chamadas células NKT do tipo II não clássicas ou não invariantes, exibe um uso mais heterogêneo de TCR αβ. As células NKT tipo I são consideradas adequadas para imunoterapia. As células NKT adaptativas ou invariantes (tipo I) podem ser identificadas com a expressão de pelo menos um ou mais dos seguintes marcadores: TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 e CD56.
[000102] Conforme usado no presente documento, o termo “isolada” ou similares se refere a uma célula, ou uma população de células, que foi separada de seu ambiente original, isto é, o ambiente das células isoladas é substancialmente livre de pelo menos um componente, conforme encontrado no ambiente em que há células de referência “não isoladas”. O termo inclui uma célula que é removida de alguns ou de todos os componentes, como é encontrada em seu ambiente natural, por exemplo, isolada de uma amostra de tecido ou biópsia. O termo também inclui uma célula que é removida de pelo menos um, alguns ou todos os componentes, como a célula é encontrada em ambientes de ocorrência não natural, por exemplo, isoladas de uma cultura de células ou suspensão de células. Portanto, uma célula isolada é parcial ou completamente separada de pelo menos um componente, incluindo outras substâncias, células ou populações de células, como é encontrada na natureza ou como é cultivada, armazenada ou subsistida em ambientes de ocorrência não natural. Exemplos específicos de células isoladas incluem composições de células parcialmente puras, composições de células substancialmente puras e células cultivadas em um meio que não ocorre naturalmente. As células isoladas podem ser obtidas separando as células desejadas, ou populações das mesmas, de outras substâncias ou células no ambiente, ou pela remoção de uma ou mais outras populações ou subpopulações de células do ambiente.
[000103] Conforme usado neste documento, o termo "purificar" ou semelhante refere-se ao aumento da pureza. Por exemplo, a pureza pode ser aumentada para pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.
[000104] Conforme usado neste documento, o termo "codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes da mesma. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução do mRNA correspondente a esse gene produzirem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, cuja sequência nucleotídica é idêntica à sequência de mRNA e geralmente é fornecida nas listagens de sequências, e a cadeia não codificante, usada como modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser denominadas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.
[000105] Um “construto" refere-se a uma macromolécula ou complexo de moléculas que compreende um polinucleotídeo a ser entregue a uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo. Um "vetor", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer construto de ácido nucleico capaz de direcionar a entrega ou transferência de um material genético estranho para as células alvo, onde pode ser replicado e/ou expresso. O termo "vetor", conforme usado neste documento, compreende o construto a ser entregue. Um vetor pode ser uma molécula linear ou circular. Um vetor pode ser integrante ou não integrante. Os principais tipos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetor epissomal, vetores virais, cosmídeos e cromossomos artificiais. Os vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetor de adenovírus, vetor de vírus adenoassociado, vetor de retrovírus, vetor de lentivírus, vetor de vírus Sendai e similares.
[000106] Por “integração” entende-se que um ou mais nucleotídeos de um construto são inseridos de forma estável no genoma celular, isto é, ligados de forma covalente à sequência de ácido nucleico no DNA cromossômico da célula. Por “integração de alvejamento”, entende-se que o nucleotídeo (ou os nucleotídeos) de um construto é inserido no DNA cromossômico ou mitocondrial da célula em um sítio pré-selecionado ou “sítio de integração”. O termo “integração”, conforme usado no presente documento, se refere ainda a um processo que envolve a inserção de uma ou mais sequências ou nucleotídeos exógenos do construto, com ou sem deleção de uma sequência ou nucleotídeo endógeno no sítio de integração. No caso, em que há uma deleção no sítio de inserção, a “integração” pode compreender ainda a substituição da sequência endógena ou de um nucleotídeo que é deletado pelo um ou mais nucleotídeos inseridos.
[000107] Conforme usado no presente documento, o termo “exógeno” significa que a molécula referida ou a atividade referida é introduzida na, ou não nativa à, célula hospedeira. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, pela introdução de um ácido nucleico codificador no material genético do hospedeiro, como por integração em um cromossomo hospedeiro ou como material genético não cromossômico, como um plasmídeo. Por conseguinte, o termo, tal como é utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificador, refere-se à introdução do ácido nucleico codificador em uma forma expressável na célula. O termo "endógeno" refere-se a uma molécula ou atividade referenciada que está presente na célula hospedeira. Do mesmo modo, o termo, quando utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante, refere-se à expressão de um ácido nucleico codificante contido na célula e não introduzido exogenamente.
[000108] Conforme usado neste documento, um "gene de interesse" ou "uma sequência polinucleotídica de interesse" é uma sequência de DNA que é transcrita em RNA e, em alguns casos, traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Um gene ou polinucleotídeo de interesse pode incluir, mas não está limitado a, sequências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, mamífero) e sequências de DNA sintéticas. Por exemplo, um gene de interesse pode codificar um miRNA, um shRNA, um polipeptídeo nativo (isto é, um polipeptídeo encontrado na natureza) ou um fragmento do mesmo; um polipeptídeo variante (isto é, um mutante do polipeptídeo nativo com menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo nativo) ou um fragmento do mesmo; um fragmento de peptídeo ou polipeptídeo geneticamente modificado, um peptídeo ou polipeptídeo terapêutico, um marcador de imaginologia, um marcador selecionável e similares.
[000109] Conforme usado neste documento, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. A sequência de um polinucleotídeo é composta de quatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Um polinucleotídeo pode incluir um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, etiqueta EST ou SAGE), éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácidos nucleicos. Polinucleotídeo também se refere a moléculas de cadeia dupla e única.
[000110] Conforme usado neste documento, o termo "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável e referem-se a uma molécula com resíduos de aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas. Um polipeptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos de um polipeptídeo. Conforme usado neste documento, os termos se referem tanto às cadeias curtas, que também são comumente denominadas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, quanto às cadeias mais longas, que geralmente são denominadas na técnica como polipeptídeos ou proteínas. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Os polipeptídeos incluem polipeptídeos naturais, polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos sintéticos ou uma combinação dos mesmos.
[000111] "Ligado operacionalmente" refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação ou RNA funcional quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação ou RNA funcional (isto é, a sequência de codificação ou RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras na orientação de senso ou antissenso.
[000112] Conforme usado neste documento, o termo "impressão genética" refere-se a informações genéticas ou epigenéticas que contribuem para atributos terapêuticos preferenciais em uma célula de origem ou em uma iPSC e são retidas nas iPSCs derivadas da célula de origem e/ou nas células da linhagem hematopoiética derivadas de iPSC. Conforme usado neste documento, "uma célula de origem" é uma célula não pluripotente que pode ser usada para gerar iPSCs por meio de reprogramação, e as iPSCs derivadas da célula de origem podem ser ainda mais diferenciadas para tipos de células específicos, incluindo quaisquer células de linhagem hematopoiética. As iPSCs derivadas das células de origem e as células diferenciadas das mesmas às vezes são chamadas coletivamente de células "derivadas" ou “derivativas", dependendo do contexto.
Por exemplo, células efetoras derivativas, ou células NK derivativas ou células T derivativas, como usadas ao longo de todo o pedido, são células diferenciadas de uma iPSC, em comparação com sua contraparte primária obtida de fontes naturais/nativas, tais como sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou outros tecidos doadores.
Conforme usado neste documento, a impressão genética que confere (ou as impressões genéticas que conferem) um atributo terapêutico preferencial é incorporada (ou são incorporadas) nas iPSCs através da reprogramação de uma célula de origem selecionada que é específica para doadores, doenças ou respostas ao tratamento ou através da introdução de modalidades geneticamente modificadas na iPSC com o uso de edição genômica.
No aspecto de uma célula de origem obtida a partir de um doador, doença ou contexto de tratamento especificamente selecionado, a impressão genética que contribui para atributos terapêuticos preferenciais pode incluir quaisquer modificações genéticas ou epigenéticas específicas do contexto que manifestam um fenótipo retido, isto é, um atributo terapêutico preferencial, que é transmitido para células derivadas da célula de origem selecionada, independentemente de os eventos moleculares subjacentes serem identificados ou não.
As células-fonte específicas do doador, da doença ou da resposta ao tratamento podem compreender impressões genéticas que são retidas em iPSCs e células de linhagem hematopoiética derivadas, impressões genéticas as quais incluem, mas não estão limitadas a, TCR monoespecífico pré-arranjado, por exemplo, de uma célula T específica viral ou célula T exterminadora natural invariante (iNKT); polimorfismos genéticos rastreáveis e desejáveis, por exemplo, homozigotos para uma mutação pontual que codifica para o receptor CD16 de alta afinidade em doadores selecionados; e requisitos predeterminados de HLA, isto é, células doadoras selecionadas compatíveis com HLA exibindo um haplótipo com aumento da população.
Conforme usado neste documento, os atributos terapêuticos preferenciais incluem enxerto aprimorado, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação e modulação da resposta imune, sobrevivência e citotoxicidade de uma célula derivada. Um atributo terapêutico preferencial também pode estar relacionado à expressão do receptor de alvejamento de antígeno; apresentação de HLA ou falta da mesma; resistência ao microambiente tumoral; indução de células imunes espectadoras e modulações imunes; especificidade aprimorada no alvo com efeito fora do tumor reduzido; resistência ao tratamento, como quimioterapia.
[000113] O termo "propriedade terapêutica intensificada", conforme usado neste documento, refere-se a uma propriedade terapêutica de uma célula que é intensificada em comparação com uma célula imune típica do mesmo tipo de célula geral. Por exemplo, uma célula NK com uma "propriedade terapêutica intensificada" possuirá uma propriedade terapêutica intensificada, aprimorada e/ou aumentada em comparação com uma célula NK típica, não modificada e/ou de ocorrência natural. Propriedades terapêuticas de uma célula imune podem incluir, mas não estão limitadas a, enxerto de célula, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação e modulação da resposta imune, sobrevivência e citotoxicidade. Propriedades terapêuticas de uma célula imune também são manifestadas pela expressão do receptor de alvejamento de antígeno; apresentação de HLA ou falta da mesma; resistência ao microambiente tumoral; indução de células imunes espectadoras e modulações imunes; especificidade aprimorada no alvo com efeito fora do tumor reduzido; resistência ao tratamento, como quimioterapia.
[000114] Conforme usado neste documento, o termo “engajador” refere-se a uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo de fusão, que é capaz de formar uma ligação entre uma célula imune, por exemplo, uma célula T, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula B, um macrófago, um neutrófilo e uma célula tumoral; e ativar a célula imune. Exemplos de engajadores incluem, mas não estão limitados a, engajadores de células T biespecíficos (BiTEs), engajadores de células exterminadoras biespecíficos (BiKEs), engajadores de células exterminadoras triespecíficos ou engajadores de células exterminadoras multiespecíficos ou engajadores universais compatíveis com vários tipos de células imunes.
[000115] Como usado neste documento, o termo "receptor de disparo de superfície" refere-se a um receptor capaz de disparar ou iniciar uma resposta imune, por exemplo, uma resposta citotóxica. Os receptores de disparo de superfície podem ser geneticamente modificados e podem ser expressos em células efetoras, por exemplo, uma célula T, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula B, um macrófago, um neutrófilo. Em algumas modalidades, o receptor de disparo de superfície facilita o engate bi ou multiespecífico de anticorpos entre as células efetoras e a célula alvo específica, por exemplo, uma célula tumoral, independente dos receptores naturais e tipos de células da célula efetora. Com o uso desta abordagem, pode-se gerar iPSCs que compreendem um receptor universal de disparo de superfície e depois diferenciá-las em populações de vários tipos de células efetoras que expressam o receptor universal de disparo de superfície.Por "universal" entende-se que o receptor de disparo de superfície pode ser expresso em, e ativar, quaisquer células efetoras, independentemente do tipo de célula, e todas as células efetoras que expressam o receptor universal podem ser acopladas ou ligadas aos engajadores que têm o mesmo epítopo reconhecível pelo receptor de disparo de superfície, independentemente das especificidades de aglutinação do engajador ao tumor. Em algumas modalidades, os engajadores com a mesma especificidade de alvejamento de tumor são usados para acoplar-se ao receptor de disparo de superfície universal. Em algumas modalidades, os engajadores com especificidade diferente de alvejamento de tumor são usados para acoplar-se ao receptor de disparo de superfície universal. Como tal, um ou vários tipos de células efetoras podem ser engatados para exterminar um tipo específico de células tumorais em alguns casos e para exterminar dois ou mais tipos de tumores em alguns outros casos. Um receptor de disparo de superfície geralmente compreende um domínio coestimulador para ativação de células efetoras e um antiepítopo que é específico ao epítopo de um engajador. Um engajador biespecífico é específico ao antiepítopo de um receptor de disparo de superfície em uma extremidade e é específico a um antígeno tumoral na outra extremidade.
[000116] Tal como usado neste documento, o termo “proteína de comutação de segurança” refere-se a uma proteína geneticamente modificada projetada para prevenir a toxicidade potencial ou efeitos de outra forma adversos de uma terapia celular. Em alguns casos, a expressão de proteína de comutação de segurança é condicionalmente controlada para abordar questões de segurança para células geneticamente modificadas transplantadas que tenham incorporado permanentemente o gene que codifica a proteína de comutação de segurança no seu genoma. Essa regulação condicional pode ser variável e pode incluir controle por meio de uma ativação pós-tradução mediada por pequenas moléculas e regulação transcricional específica de tecido e/ou temporal. A comutação de segurança pode mediar a indução de apoptose, inibição da síntese de proteínas, replicação de DNA, parada do crescimento, regulação genética transcricional e pós-transcricional e/ou depleção mediada por anticorpos.Em alguns casos, a proteína da comutação de segurança é ativada por uma molécula exógena, por exemplo, um pró-fármaco que, quando ativada, dispara apoptose e/ou morte celular de uma célula terapêutica. Exemplos de proteínas da comutação de segurança incluem, mas não estão limitados a, genes suicidas, tais como caspase 9 (ou caspase 3 ou 7), timidina-quinase, citosina-desaminase, células-B CD20, EGFR modificado e qualquer combinação dos mesmos. Nesta estratégia, um pró-fármaco que é administrado em caso de um evento adverso é ativado pelo produto do gene suicida e extermina a célula transduzida.
[000117] Conforme usado neste documento, o termo "proteínas ou peptídeos farmaceuticamente ativos" refere-se a proteínas ou peptídeos que são capazes de alcançar um efeito biológico e/ou farmacêutico em um organismo. Uma proteína farmaceuticamente ativa tem propriedades curativas ou paliativas de cura contra uma doença e pode ser administrada para melhorar, atenuar, aliviar, reverter ou diminuir a gravidade de uma doença. Uma proteína farmaceuticamente ativa também tem propriedades profiláticas e é usada para impedir o aparecimento de uma doença ou diminuir a gravidade de tal doença ou afecção patológica quando ela surge. As proteínas farmaceuticamente ativas incluem uma proteína ou peptídeo inteiro ou fragmentos farmaceuticamente ativos do mesmo. As mesmas também incluem análogos farmaceuticamente ativos da proteína ou peptídeo ou análogos de fragmentos da proteína ou peptídeo. O termo proteína farmaceuticamente ativa também se refere a uma pluralidade de proteínas ou peptídeos que agem de forma cooperativa ou sinérgica para fornecer um benefício terapêutico. Exemplos de proteínas ou peptídeos farmaceuticamente ativos incluem, mas não estão limitados a, receptores, proteínas de aglutinação, fatores de transcrição e tradução, proteínas supressoras de crescimento de tumores, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, fatores de crescimento e/ou citocinas.
[000118] Conforme usado neste documento, o termo "molécula de sinalização" refere-se a qualquer molécula que modula, participa, inibe, ativa, reduz ou aumenta a transdução de sinal celular. A transdução de sinal refere-se à transmissão de um sinal molecular na forma de modificação química pelo recrutamento de complexos de proteínas ao longo de uma via que finalmente dispara um evento bioquímico na célula. As vias de transdução de sinal são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, sinalização de receptor acoplada à proteína G, sinalização de receptor de tirosina quinase, sinalização de integrina, sinalização de pedágio, sinalização de canal iônico fechado por ligante, via de sinalização ERK/MAPK, via de sinalização Wnt, via dependente de cAMP e via de sinalização IP3/DAG.
[000119] Conforme usado neste documento, o termo "modalidade de alvejamento" refere-se a uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo, que é geneticamente incorporado em uma célula para promover a especificidade do antígeno e/ou epítopo que inclui, mas não se limita a: i) especificidade do antígeno relacionado a um receptor de antígeno quimérico (CAR) único ou receptor de célula T (TCR), ii) especificidade do engajador relacionado a anticorpos monoclonais ou engajador biespecífico, iii) alvejamento da célula transformada; iv) alvejamento da célula-tronco cancerígena; v) outras estratégias de alvejamento na ausência de um antígeno específico ou molécula de superfície.
[000120] Conforme usado neste documento, o termo "específico" ou "especificidade" pode ser usado para se referir à capacidade de uma molécula, por exemplo, um receptor ou um engajador, de se aglutinar seletivamente a uma molécula alvo, em contraste com uma aglutinação não específica ou não seletiva.
[000121] O termo "terapia celular adotiva", conforme usado neste documento, refere-se a uma imunoterapia baseada em células que, conforme usada neste documento, se refere à transfusão de linfócitos autólogos ou alogênicos, identificados como células T ou B, geneticamente modificadas ou não, que foram expandidas ex vivo antes da dita transfusão.
[000122] Uma "quantidade terapeuticamente suficiente", conforme usado neste documento, inclui dentro do seu significado uma quantidade não tóxica, mas suficiente e/ou eficaz da composição terapêutica e/ou farmacêutica específica à qual se refere para fornecer um efeito terapêutico desejado. A quantidade exata necessária varia de sujeito para sujeito, dependendo de fatores como a saúde geral do paciente, a idade do paciente, o estágio e a gravidade da afecção. Em modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente suficiente é suficiente e/ou eficaz para melhorar, reduzir e/ou aprimorar pelo menos um sintoma associado a uma doença ou afecção do sujeito sendo tratado.
[000123] A diferenciação de células-tronco pluripotentes requer uma mudança no sistema de cultura, como a alteração dos agentes de estímulo no meio de cultura ou no estado físico das células.
A estratégia mais convencional utiliza a formação de corpos embrionários (EBs) como um intermediário comum e crítico para iniciar a diferenciação específica da linhagem.
Os “corpos embrionários” são aglomerados tridimensionais que demonstram imitar o desenvolvimento embrionário, pois dão origem a numerosas linhagens em sua área tridimensional.
Através do processo de diferenciação, geralmente de poucas horas a dias, EBs simples (por exemplo, células-tronco pluripotentes agregadas induzidas a diferenciar) continuam a maturação e desenvolvem-se em um EB cístico, quando, tipicamente dias a algumas semanas, são processados para continuar a diferenciação.
A formação de EB é iniciada aproximando células-tronco pluripotentes em agrupamentos tridimensionais multicamadas de células, normalmente isso é alcançado por um de vários métodos, incluindo permitir que células pluripotentes sedimentem em gotículas líquidas, sedimentando células para o placas de poço de fundo em “U” ou por agitação mecânica.
Para promover o desenvolvimento de EB, os agregados de células-tronco pluripotentes requerem indicações adicionais de diferenciação, pois os agregados mantidos no meio de manutenção da cultura pluripotente não formam EBs adequados.
Como tal, os agregados de células-tronco pluripotentes precisam ser transferidos para um meio de diferenciação que forneça indicações para a linhagem de escolha.
A cultura baseada em EB de células-tronco pluripotentes normalmente resulta na geração de populações celulares diferenciadas (camadas de ectoderma, mesoderma e endoderma) com proliferação modesta dentro do agrupamento de células EB.
Embora comprovadamente facilite a diferenciação celular, os EBs, no entanto, dão origem a células heterogêneas no estado de diferenciação variável, devido à exposição inconsistente das células na estrutura tridimensional a indicações de diferenciação do ambiente.
Além disso, os EBs são trabalhosos para criar e manter.
Além disso, a diferenciação celular através do EB é acompanhada de expansão celular modesta, o que também contribui para a baixa eficiência de diferenciação.
[000124] Em comparação, a "formação de agregados", distinta da "formação de EB", pode ser usada para expandir as populações de células derivadas de células-tronco pluripotentes. Por exemplo, durante a expansão de células-tronco pluripotentes baseadas em agregados, os meios de cultura são selecionados para manter a proliferação e a pluripotência. A proliferação de células geralmente aumenta o tamanho dos agregados com a formação de agregados maiores, esses agregados podem ser rotineiramente dissociados mecanica ou enzimaticamente em agregados menores para manter a proliferação celular dentro da cultura e aumentar o número de células. Diferentemente da cultura EB, as células cultivadas em agregados na cultura de manutenção mantêm marcadores de pluripotência. Os agregados de células-tronco pluripotentes requerem indicações adicionais de diferenciação para induzir diferenciação.
[000125] Conforme usado neste documento, "diferenciação de monocamada" é um termo que se refere a um método de diferenciação distinto da diferenciação através de agrupamentos tridimensionais multicamadas de células, isto é, "formação de EB". A diferenciação de monocamada, entre outras vantagens divulgadas neste documento, evita a necessidade de formação de EB para o início da diferenciação. Como a cultura em monocamada não imita o desenvolvimento embrionário, como a formação de EB, a diferenciação em linhagens específicas é considerada mínima, em comparação com a diferenciação de todas as três camadas germinativas em EB.
[000126] Conforme usado neste documento, uma célula "dissociada" refere-se a uma célula que foi substancialmente separada ou purificada para longe de outras células ou de uma superfície (por exemplo, uma superfície da placa de cultura). Por exemplo, as células podem ser dissociadas de um animal ou tecido por métodos mecânicos ou enzimáticos. Alternativamente, as células que se agregam in vitro podem ser dissociadas umas das outras, como por dissociação em uma suspensão de agrupamentos,
células únicas ou uma mistura de células únicas e agrupamentos, enzimática ou mecanicamente. Ainda em outra modalidade alternativa, as células aderentes são dissociadas de uma placa de cultura ou outra superfície. Assim, a dissociação pode envolver a quebra das interações celulares com a matriz extracelular (ECM) e substratos (por exemplo, superfícies de cultura) ou a quebra da ECM entre as células.
[000127] Conforme usado neste documento, “células alimentadoras” ou “alimentadores” são termos que descrevem células de um tipo que são cocultivadas com células de um segundo tipo para fornecer um ambiente no qual as células do segundo tipo podem crescer, expandir ou diferenciar, já que as células alimentadoras fornecem estimulação, fatores de crescimento e nutrientes para o suporte do segundo tipo de célula. As células alimentadoras são opcionalmente de uma espécie diferente das células que estão suportando. Por exemplo, certos tipos de células humanas, incluindo células-tronco, podem ser suportadas por culturas primárias de fibroblastos embrionários de camundongo ou fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados. Em outro exemplo, células derivadas de sangue periférico ou células de leucemia transformadas suportam a expansão e maturação de células exterminadoras naturais. As células alimentadoras podem tipicamente ser inativadas quando cocultivadas com outras células por irradiação ou tratamento com um agente antimitótico, como a mitomicina, para impedir que elas cresçam mais que as células que estão suportando. As células alimentadoras podem incluir células endoteliais, células estromais (por exemplo, células epiteliais ou fibroblastos) e células de leucemia. Sem limitar o precedente, um tipo específico de célula alimentadora pode ser um alimentador humano, como um fibroblasto da pele humana. Outro tipo de célula alimentadora pode ser fibroblastos embrionários de camundongo (MEF). Em geral, várias células alimentadoras podem ser usadas em parte para manter a pluripotência, diferenciação direta em relação a uma determinada linhagem,
intensificar a capacidade de proliferação e promover a maturação para um tipo de célula especializado, como uma célula efetora.
[000128] Conforme usado neste documento, um ambiente "livre de alimentador" (FF) refere-se a um ambiente como uma condição de cultura, cultura de células ou meio de cultura que é essencialmente livre de células alimentadoras ou estromais e/ou que não foi pré-condicionado pelo cultivo de células alimentadoras. O meio "pré- condicionado" refere-se a um meio colhido após as células alimentadoras terem sido cultivadas no meio por um período de tempo, como por pelo menos um dia. O meio pré-condicionado contém muitas substâncias mediadoras, incluindo fatores de crescimento e citocinas secretadas pelas células alimentadoras cultivadas no meio. Em algumas modalidades, um ambiente livre de alimentador está livre de células alimentadoras ou estromais e também não é pré-condicionado pelo cultivo de células alimentadoras.
[000129] “Funcional”, conforme usado no contexto da edição ou modificação genômica de iPSC e células não pluripotentes derivadas diferenciadas a partir delas, ou edição ou modificação genômica de células não pluripotentes e iPSCs derivadas reprogramadas a partir delas, refere-se a (1) no nível do gene - expressão gênica submetida a knockin, knockout e knockdown bem-sucedida, expressão gênica transgênica ou controlada, como expressão induzível ou temporal em um estágio desejado de desenvolvimento celular, que é alcançado através da edição ou modificação genômica direta, ou através da “passagem” por meio de diferenciação ou reprogramação de uma célula inicial que é inicialmente genomicamente modificada; ou (2) no nível da célula—remoção, adição ou alteração bem-sucedida de uma função/características da célula por meio de (i) modificação da expressão gênica obtida na dita célula por meio de edição genômica direta, (ii) modificação da expressão gênica mantida na dita célula por “passagem” através da diferenciação ou reprogramação de uma célula inicial que é genomicamente modificada inicialmente; (iii) regulação gênica a jusante na dita célula como resultado de modificação da expressão gênica que só aparece em um estágio de desenvolvimento anterior da dita célula, ou aparece apenas na célula inicial que dá origem à dita célula por diferenciação ou reprogramação; ou (iv) função ou atributo celular intensificado ou recém-atingido exibido no produto celular maduro, inicialmente derivado da edição ou modificação genômica realizada na iPSC, progenitor ou origem celular desdiferenciada.
[000130] "Deficiente em HLA", incluindo deficiente em HLA classe I ou deficiente em HLA classe II, ou ambos, refere-se a células que carecem ou não mantêm mais ou têm nível reduzido de expressão superficial de um complexo MHC completo que compreende um heterodímero de proteína HLA classe I e/ou um heterodímero HLA classe II, de modo que o nível diminuído ou reduzido seja menor que o nível naturalmente detectável por outras células ou por métodos sintéticos.
[000131] “iPSC deficiente em HLA modificada", conforme usado neste documento, refere-se a iPSC deficiente em HLA que é posteriormente modificado pela introdução de genes que expressam proteínas relacionadas, mas não limitadas a um potencial de diferenciação aprimorado, alvejamento de antígeno, apresentação de antígeno, reconhecimento de anticorpos, persistência, evasão imunológica, resistência à supressão, proliferação, coestimulação, estimulação de citocinas, produção de citocinas (autócrinas ou parácrinas), quimiotaxia e citotoxicidade celular, como proteínas HLA classe I não clássicas (por exemplo, HLA-E e HLA-G), receptor de antígeno quimérico (CAR), receptor de células T (TCR), receptor de CD16 Fc, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113 e PDL1. As células que são "deficientes em HLA modificado" também incluem células que não são iPSCs.
[000132] "Receptores Fc", FcR abreviado, são classificados com base no tipo de anticorpo que eles reconhecem. Por exemplo, aqueles que se aglutinam à classe mais comum de anticorpos, IgG, são chamados receptores Fc-gama (FcγR), aqueles que se aglutinam a IgA são chamados receptores Fc-alfa (FcαR) e aqueles que se aglutinam a IgE são chamados receptores Fc-épsilon (FcεR). As classes de FcR também são distinguidas pelas células que as expressam (macrófagos, granulócitos, células exterminadoras naturais, células T e B) e pelas propriedades de sinalização de cada receptor. Os receptores Fc-gama (FcγR) incluem vários membros, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), que diferem em suas afinidades de anticorpos devido à sua estrutura molecular diferente.
[000133] “Receptor Fc quimérico”, abreviado como CFcR, são termos usados para descrever receptores Fc geneticamente modificados que têm seus domínios transmembranares nativos e/ou de sinalização intracelular modificados ou substituídos por domínios transmembranares não nativos e/ou de sinalização intracelular. Em algumas modalidades do receptor Fc quimérico, além de ter um, ou ambos, domínios transmembranar e de sinalização sendo não nativos, um ou mais domínios estimuladores podem ser introduzidos na porção intracelular do receptor Fc modificado para intensificar a ativação, expansão e função celulares após o disparo do receptor. Ao contrário do receptor de antígeno quimérico (CAR), que contém o domínio de aglutinação ao antígeno para alvejar o antígeno, o receptor Fc quimérico se aglutina a um fragmento Fc, ou à região Fc de um anticorpo ou à região Fc compreendida em um engajador ou molécula de aglutinação e ativa a função celular com ou sem aproximação da célula alvo. Por exemplo, um receptor Fcy pode ser modificado para compreender domínios transmembranares, estimuladores e/ou de sinalização selecionados na região intracelular que respondem à aglutinação de IgG no domínio extracelular, gerando assim um CFcR. Em um exemplo, um CFcR é produzido pela modificação genética de CD16, um receptor Fcγ, substituindo seu domínio transmembranar e/ou domínio intracelular. Para aprimorar ainda mais a afinidade de aglutinação do CFcR baseado em CD16, o domínio extracelular de CD64 ou as variantes de alta afinidade de CD16 (F176V, por exemplo)
podem ser incorporadas. Em algumas modalidades do CFcR, em que o domínio extracelular CD16 de alta afinidade está envolvido, o sítio de clivagem proteolítica que compreende uma serina na posição 197 é eliminado ou substituído, no domínio extracelular do receptor, não é clivável, isto é, não está sujeito a desprendimento, obtendo-se assim um CFcR baseado em hnCD16.
[000134] CD16, um receptor FcγR, foi identificado como tendo duas isoformas, receptores Fc FcγRIIIa (CD16a) e FcγRIIIb (CD16b). CD16a é uma proteína transmembranar expressa por células NK, que se aglutina a IgG monomérica anexada às células alvo para ativar células NK e facilitar a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). "CD16 de alta afinidade", "CD16 não clivável" ou "CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16)", conforme usado neste documento, refere-se a uma variante natural ou não natural de CD16. O CD16 do tipo selvagem tem baixa afinidade e está sujeito ao desprendimento de extodomínio, um processo de clivagem proteolítica que regula a densidade da superfície das células de diversas moléculas da superfície das células nos leucócitos após a ativação das células NK. F176V e F158V são variantes polimórficas exemplificativas de CD16 com alta afinidade. Uma variante CD16 com o sítio de clivagem (posição 195 a 198) na região proximal da membrana (posição 189 a 212) alterada ou eliminada não está sujeita a desprendimento. O sítio de clivagem e a região proximal da membrana são descritos em detalhes no documento WO2015148926, cujas divulgações completas são incorporadas neste documento a título de referência. A variante CD16 S197P é uma versão não clivável geneticamente modificada do CD16. Uma variante CD16 que compreende F158V e S197P tem alta afinidade e é não clivável. Outra variante exemplificativa de CD16 (hnCD16) não clivável e de alta afinidade é um CD16 modificado que compreende um ectodomínio originado de um ou mais dos 3 éxons do ectodomínio CD64. I. CÉLULAS E COMPOSIÇÕES ÚTEIS PARA TERAPIAS
CELULARES ADOTIVAS COM PROPRIEDADES INTENSIFICADAS
[000135] É fornecida neste documento uma estratégia para modificar sistematicamente o circuito regulador de uma iPSC clonal sem afetar a potência de diferenciação da iPSC e a biologia de desenvolvimento celular da iPSC e de suas células derivadas, enquanto intensifica as propriedades terapêuticas das células derivativas. As células derivadas são funcionalmente aprimoradas e adequadas para terapias celulares adotivas após uma combinação de modalidades seletivas sendo introduzidas nas células no nível de iPSC por modificação genômica. Não era claro, antes desta invenção, se as iPSCs alteradas que compreendem uma ou mais edições genéticas fornecidas ainda têm a capacidade de entrar no desenvolvimento celular e/ou amadurecer e gerar células funcionais diferenciadas enquanto retêm atividades moduladas. Falhas imprevistas durante a diferenciação celular direcionada de iPSCs foram atribuídas a aspectos que incluem, mas não se limitam a, expressão gênica específica do estágio de desenvolvimento ou a falta da mesma, requisitos para apresentação de complexo de HLA, desprendimento de proteínas das modalidades de expressão de superfície introduzidas e necessidade de reconfiguração de protocolos de diferenciação que possibilitam alteração fenotípica e/ou funcional na célula. O presente pedido mostrou que as uma ou mais modificações genômicas selecionadas, conforme fornecido no presente documento, não afetam negativamente a potência de diferenciação de iPSC, e as células efetoras funcionais derivadas da iPSC geneticamente modificada têm propriedades terapêuticas intensificadas e/ou adquiridas atribuíveis às modificações genômicas individuais ou combinadas retidas nas células efetoras após a diferenciação de iPSC.
1. KNOCKOUT DE CD38
[000136] A molécula de superfície celular CD38 é altamente regulada positivamente em várias malignidades hematológicas derivadas de linhagens de linfoides e mieloides, incluindo mieloma múltiplo e uma malignidade de células B negativa para CD20, o que a torna um alvo atrativo para que a terapêutica de anticorpos realizedepleção de células cancerígenas. A depleção de células cancerígenas mediada por anticorpos é geralmente atribuída a uma combinação de indução direta de apoptose celular e ativação de mecanismos efetores imunes, tal como a ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos). Além da ADCC, os mecanismos efetores do sistema imunológico em conjunto com o anticorpo terapêutico também podem incluir fagocitose (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[000137] Além de ser altamente expressa em células malignas, o CD38 também é expresso em células plasmáticas, bem como em células NK e células T e B ativadas. Durante a hematopoiese, o CD38 é expresso em células-tronco CD34+ e progenitores comprometidos com linhagem de linfoides, eritroides e mieloides, e durante os estágios finais de maturação que continuam através do estágio de células plasmáticas. Como uma glicoproteína transmembranar do tipo II, a CD38 desempenha funções celulares como um receptor e uma enzima multifuncional envolvidos na produção de metabólitos de nucleotídeos. Como uma enzima, o CD38 catalisa a síntese e a hidrólise da reação de NAD + para ADP-ribose, produzindo mensageiros secundários CADPR e NAADP que estimulam a liberação de cálcio do retículo endoplasmático e dos lisossomos, críticos para o processo de adesão celular, cujo processo é dependente de cálcio. Como um receptor, o CD38 reconhece CD31 e regula a liberação de citocinas e citotoxicidade em células NK ativadas. Ademais, relata-se que o CD38 se associa a proteínas de superfície celular em balsas lipídicas, para regular o fluxo citoplasmático de Ca2+ e para mediar a transdução de sinal em células linfoides e mieloides.
[000138] No tratamento de malignidade, foi demonstrado que o uso sistêmico de células T transduzidas pelo receptor de aglutinação ao antígeno de CD38 realiza a lise das frações de CD38+ de células progenitoras hematopoiéticas CD34+, monócitos, células NK, células T e células B, levando a respostas incompletas ao tratamento e eficácia reduzida ou eliminada, devido à função prejudicada das células efetoras imunes receptoras.
Além disso, em pacientes com mieloma múltiplo tratados com daratumumabe, um anticorpo específico para CD38, observou-se redução de células NK na medula óssea e no sangue periférico, embora outros tipos de células imunes, tais como células T e células B, não tenham sido afetados, apesar da expressão de CD38 nos mesmos (Casneuf et al., Blood Advances. 2017; 1(23): 2.105 a 2.114). Sem se limitar a teorias, o presente pedido fornece uma estratégia para alavancar todo o potencial de tratamento contra o câncer com alvejamento de CD38, superando a redução ou depleção de células efetoras induzidas pelo domínio de aglutinação ao antígeno de CD38 e/ou anticorpo específico de CD38 por meio de fratricídio.
Além disso, uma vez que a CD38 é regulada de modo crescente em linfócitos ativados, tais como células T ou B, suprimindo-se a ativação desses linfócitos com o uso do anticorpo específico para CD38, tal como daratumumabe, no receptor de células efetoras alogênicas, a alorrejeição contra essas células efetoras é reduzida e/ou impedida aumentando, assim, a sobrevivência e a persistência de células efetoras.
Sendo assim, o presente pedido também fornece uma estratégia para intensificar a persistência e/ou a sobrevivência de células efetoras, reduzindo ou impedindo a alorrejeição com o uso de anticorpo específico para CD38, um agente específico para CD38 secretado ou um CAR de CD38 (receptor de antígeno quimérico) contra a ativação de células T e B receptoras.
Especificamente, as estratégias fornecidas incluem a geração de uma linhagem de iPSC de knockout de CD38 e a obtenção de células efetoras derivadas com teor nulo de CD38 (CD38-/-) através da diferenciação direcionada da linhagem de iPSC geneticamente modificada.
Antes deste pedido, não se sabia se a interrupção de CD38 em iPSC perturbaria qualquer um dos aspectos, incluindo diferenciação de iPSC, fenótipo celular derivativo e função celular efetora, considerando que a CD38 desempenha muitos papéis-chave na biologia de desenvolvimento celular e na função celular, conforme descrito acima.
[000139] Em uma modalidade, conforme fornecido no presente documento, o knockout de CD38 em uma linhagem de iPSC é um knockout bialélico. Conforme divulgado no presente documento, a linhagem de iPSC com teor nulo de CD38 fornecida tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivativas funcionais, incluindo, mas sem limitação, células mesodérmicas com potencial endotelial hemogênico (HE) definitivo, HE definitivo, células hematopoiéticas CD34, células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, progenitores multipotentes hematopoiéticos (MPP), progenitores de células T, progenitores de células NK, células mieloides, progenitores de neutrófilos, células T, células NKT, células NK, células B, neutrófilos, células dendríticas e macrófagos. Em algumas modalidades, quando um anticorpo anti-CD38 é usado para induzir ADCC ou um CAR anti-CD38 é usado para exterminação de células de alvejamento, a iPSC CD38-/- e/ou células efetoras derivativas da mesma não são eliminadas pelo anticorpo anti-CD38 ou pelo CAR anti-CD38, assim, aumentando a iPSC e sua persistência e/ou sobrevivência de células efetoras na presença de tais agentes terapêuticos e/ou após a exposição aos mesmos. Em algumas modalidades, a célula efetora aumentou a persistência e/ou a sobrevivência in vivo na presença desses agentes terapêuticos e/ou após a exposição aos mesmos. Em algumas modalidades, as células efetoras com teor nulo de CD38 são células NK derivadas de iPSCs. Em algumas modalidades, as células efetoras com teor nulo de CD38 são células T derivadas de iPSCs. Em algumas modalidades, a iPSC com teor nulo de CD38 e as células derivativas compreendem uma ou mais edições genômicas adicionais, conforme descrito no presente documento, incluindo, mas sem limitação, expressão de hnCD16, expressão de CAR, expressão de receptor de citocina/citocina, knockout de HLA I e/ou HLAII e modalidades adicionais, conforme fornecido.
2. KNOCKIN DE hnCD16
[000140] CD16 foi identificado como duas isoformas, receptores Fc FcγRIIIa (CD16a; NM_000569.6) e FcγRIIIb (CD16b;
NM_000570.4). CD16a é uma proteína transmembranar expressa por células NK, que se aglutina a IgG monomérica anexada às células alvo para ativar células NK e facilitar a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). CD16b é expresso exclusivamente por neutrófilos humanos. "CD16 de alta afinidade", "CD16 não clivável" ou "CD16 não clivável de alta afinidade", conforme usado neste documento, refere-se a várias variantes de CD16. O CD16 do tipo selvagem tem baixa afinidade e está sujeito ao desprendimento de ectodomínio, um processo de clivagem proteolítica que regula a densidade superficial das células de várias moléculas da superfície celular nos leucócitos após a ativação das células NK. F176V (também chamado F158V em algumas publicações) é uma variante polimórfica CD16 exemplificativa com alta afinidade; enquanto a variante S197P é um exemplo de versão não clivável geneticamente modificada de CD16. Uma variante de CD16 geneticamente modificada que compreende F176V e S197P tem alta afinidade e não é clivável, que foi descrita em mais detalhes no documento WO2015/148926, e cuja divulgação completa é incorporada ao presente documento a título de referência. Além disso, um receptor de CD16 quimérico com o ectodomínio de CD16 essencialmente substituído por pelo menos uma porção de ectodomínio de CD64 também pode alcançar os recursos de alta afinidade e não cliváveis desejados de um receptor de CD16 com capacidade para realizar ADCC. Em algumas modalidades, o ectodomínio de substituição de um CD16 quimérico compreende um ou mais dos éxons EC1, EC2 e EC3 de CD64 (UniPRotKB_P12314 ou sua variante de isoforma ou polimórfica).
[000141] Como tal, um receptor CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16), em algumas modalidades, compreende F176V e S197P; e em algumas modalidades, compreende F176V e com a região de clivagem eliminada. Em algumas outras modalidades, um hnCD16 compreende uma sequência com identidade de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% ou qualquer porcentagem intermediária, quando comparada a qualquer uma das sequências exemplificativas, SEQ ID NOs. 7, 8 e 9, cada uma compreende pelo menos uma porção de ectodomínio de CD64. As SEQ ID NOs. 7, 8 e 9 são codificadas respectivamente, exemplificando-se SEQ ID NOs. 10 a 12. Conforme usado no presente documento e em todo o pedido, a porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = nº de posições idênticas/número total de posições x 100), levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático reconhecido na técnica. SEQ ID NO. 7:
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEET VTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLS GRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGK AFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNA SVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTA RREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVM
VLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK (340 a.a. Construção baseada em domínio CD64; CD16TM; CD16ICD) SEQ ID NO. 8
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEET VTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLS GRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGK AFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNA SVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTA RREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFA VDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336 a.a. Construção baseada em éxon CD64; CD16TM; CD16ICD) SEQ ID NO. 9
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEET VTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLS GRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGK AFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNA SVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTA RREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLFAV
DTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK (335 a.a. Construção baseada em éxon CD64; CD16TM; CD16ICD) SEQ ID NO. 10 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aa
SEQ ID NO. 11 cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg gagcttcaag tgcttggtttgttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa
SEQ ID NO. 12 atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa
[000142] Por conseguinte, são fornecidas neste documento iPSCs clonais geneticamente modificadas para compreender, entre outras edições, conforme contemplado e descrito neste documento, um receptor CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16), em que as iPSCs geneticamente modificadas são capazes de diferenciar em células efetoras que compreendem o hnCD16 introduzido às iPSCs. Em algumas modalidades, as células efetoras derivadas que compreendem hnCD16 são células NK. Em algumas modalidades, as células efetoras derivadas que compreendem hnCD16 são células T. O hnCD16 exógeno expresso em iPSC ou células derivativas da mesma têm alta afinidade na aglutinação não apenas a anticorpos de ADCC ou fragmentos dos mesmos, mas também a engajadores ou aglutinantes bi, tri- ou multiespecíficos que reconhecem os domínios de aglutinação extracelular à CD16 ou CD64 do dito hnCD16. Os engajadores ou aglutinantes bi, tri- ou multiespecíficos são descritos mais adiante neste pedido (consultar a seção I.7). Sendo assim, o presente pedido fornece uma célula efetora derivativa ou uma população celular da mesma, pré-carregada com um ou mais anticorpos de ADCC pré-selecionados por aglutinação de alta afinidade ao domínio extracelular do hnCD16 expresso na célula efetora derivativa, em uma quantidade suficiente para uso terapêutico em um tratamento de uma afecção, doença ou infecção, conforme detalhado em mais detalhes na seção V. abaixo, em que o dito hnCD16 compreende um domínio de aglutinação extracelular de CD64 ou CD16 que tem F176V e S197P.
[000143] Em algumas outras modalidades, o domínio nativo transmembranar e/ou intracelular de CD16 de um hnCD16 é ainda modificado ou substituído, de modo que um receptor Fc quimérico (CFcR) seja produzido para compreender um domínio transmembranar não nativo, um domínio estimulador não nativo e/ou um domínio de sinalização não nativo. O termo "não nativo" usado neste documento significa que o domínio transmembranar, estimulador ou de sinalização é derivado de um receptor diferente do receptor que fornece o domínio extracelular. Na ilustração neste documento, o CFcR baseado em CD16 ou variantes do mesmo não tem um domínio transmembranar, estimulador ou de sinalização que é derivado a partir de CD16. Em algumas modalidades, o CFcR exógeno baseado em hnCD16 compreende um domínio transmembranar não nativo derivado de CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, polipeptídeo de receptor de células T. Em algumas modalidades, o CFcR baseado em hnCD16 exógeno compreende um domínio estimulador/inibitório não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 ou NKG2D. Em algumas modalidades, o CFcR exógeno baseado em hnCD16 compreende um domínio de sinalização não nativo derivado de polipeptídeo de CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C ou NKG2D. Em uma modalidade de hnCD16, o receptor quimérico fornecido compreende um domínio transmembranar e um domínio de sinalização, ambos derivados de um dos polipeptídeos dentre IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C e NKG2D. Uma modalidade particular do receptor Fc quimérico baseado em hnCD16 compreende um domínio transmembranar de NKG2D, um domínio estimulador de 2B4 e um domínio de sinalização de CD3ζ; em que o domínio extracelular de hnCD16 é derivado de uma sequência completa ou parcial do domínio extracelular de CD64 ou CD16, em que o domínio extracelular de CD16 compreende F176V e S197P. Outra modalidade do receptor Fc quimérico baseado em hnCD16 compreende um domínio transmembranar e um domínio de sinalização de CD3ζ; em que o domínio extracelular do hnCD16 é derivado de uma sequência completa ou parcial do domínio extracelular de CD64 ou CD16, em que o domínio extracelular de CD16 compreende F176V e S197P.
[000144] As diversas modalidades do receptor Fc quimérico baseado em hnCD16, como descrito acima, são capazes de se aglutinar, com alta afinidade, à região Fc de um anticorpo ou fragmento do mesmo; ou à região Fc de um aglutinante ou engajador bi, tri ou multiespecífico. Após a aglutinação, os domínios estimuladores e/ou de sinalização do receptor quimérico permitem a ativação e a secreção de citocinas das células efetoras e a exterminação das células tumorais alvejadas pelo anticorpo, ou o dito engajador ou aglutinante bi, tri ou multiespecífico tendo um componente de aglutinação ao antígeno tumoral, bem como a região de Fc. Sem se limitar pela teoria, através dos domínios transmembranares, estimuladores e/ou de sinalização não nativos, ou através de um engajador aglutinado ao ectodomínio, do receptor Fc quimérico baseado em hnCD16, o CFcR pode contribuir para a capacidade de exterminar células efetoras ao mesmo tempo em que se aumenta o potencial de proliferação e/ou expansão das células efetoras. O anticorpo e o engajador podem levar células tumorais que expressam o antígeno e as células efetoras que expressam o CFcR a uma proximidade, o que também contribui para a exterminação intensificada das células tumorais. Exemplos de antígenos de tumor para aglutinantes ou engajadores bi, tri, multiespecíficos incluem, mas não estão limitados a, B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/B, PSMA, PAMA, P-caderina e ROR1. Alguns engajadores ou aglutinantes bi, tri, multiespecíficos exemplificativos não limitantes adequados para engajar células que expressam o CFcR baseado em hnCD16 em ataque de células tumorais incluem CD16 (ou CD64)-CD30, CD16 (ou CD64)-BCMA, CD16 (ou CD64)-IL15-EPCAM e CD16 (ou CD64)-IL15- CD33.
[000145] Ao contrário do receptor de CD16 endógeno expresso pelas células NK primárias que são clivadas a partir da superfície celular após a ativação de células NK, as várias versões não cliváveis de CD16 na NK derivada evitam o desprendimento de CD16 e mantêm expressão constante. Na célula NK derivativa, o CD16 não clivável aumenta a expressão de TNFα e CD107a, indicativo de funcionalidade celular aprimorada. O CD16 não clivável também intensifica a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpos (ADCC) e o engate de engajadores bi, tri ou multiespecíficos. A ADCC é um mecanismo de lise mediada por células NK através da aglutinação de CD16 a células alvo revestidas por anticorpos. As características adicionais de alta afinidade do hnCD16 introduzido na célula NK derivada também permitem o carregamento in vitro de anticorpo de ADCC à célula NK através do hnCD16 antes de administrar a célula a um sujeito que necessita de terapia celular. Conforme fornecido, o hnCD16 pode compreender F176V e S197P em algumas modalidades, ou pode compreender um ectodomínio total ou parcial originado a partir de CD64, conforme exemplificado pela SEQ ID NO: 7, 8 ou 9, ou pode compreender ainda pelo menos um dentre domínio transmembranar, domínio estimulador e domínio de sinalização não nativos. Conforme divulgado, o presente pedido também fornece uma célula NK derivativa ou uma população celular da mesma, pré-carregada com um ou mais anticorpos de ADCC pré-selecionados em uma quantidade suficiente para uso terapêutico em um tratamento de uma afecção, uma doença ou uma infecção, conforme detalhado adicionalmente na seção V. abaixo. Em algumas modalidades, as células NK derivadas que compreendem hnCD16 compreendem ainda knockout de CD38. Em algumas modalidades, as células NK derivadas que compreendem knockout de hnCD16 e CD38 são pré-carregadas com anticorpo anti-CD38. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 pré-carregado é daratumumabe.
[000146] Diferentemente das células NK primárias, as células T maduras de uma fonte primária (isto é, fontes naturais/nativas, tais como sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou outros tecidos doadores) não expressam CD16. Foi inesperado que a iPSC que compreende um CD16 não clivável exógeno expresso não prejudicasse a biologia do desenvolvimento de células T e fosse capaz de se diferenciar em células T derivadas funcionais que, não apenas expressam o CD16 exógeno, mas também são capazes de desempenhar funções através de um mecanismo de ADCC adquirida. Essa ADCC adquirida na célula T derivada pode adicionalmente ser usada como uma abordagem para alvejamento duplo e/ou para resgatar o escape de antígenos que geralmente ocorre com a terapia de células T-CAR, onde o tumor recai com expressão reduzida ou perdida de antígeno alvejado para CAR-T ou expressão de um antígeno mutado para evitar o reconhecimento pelo CAR (receptor quimérico do antígeno). Quando a dita célula T derivativa compreende ADCC adquirida através da expressão de CD16 exógeno, e quando um anticorpo alveja um antígeno tumoral diferente daquele alvejado pelo CAR, o anticorpo pode ser usado para resgatar o escape do antígeno CAR-T e reduzir ou impedir a recidiva ou recorrência do tumor alvo frequentemente observado no tratamento com CAR-T. Tal estratégia para reduzir e/ou impedir o escape de antígenos enquanto se alcança o duplo alvejamento é igualmente aplicável às células NK que expressam um ou mais CARs. Os vários CARs que podem ser usados nessa estratégia de prevenção e redução de escape de antígeno são detalhados mais adiante.
[000147] Sendo assim, a presente invenção fornece uma célula T derivativa que compreende um CD16 exógeno. Em uma modalidade adicional fornecida, a célula T derivativa obtida no presente documento compreende knockout de CD38 além da expressão de um hnCD16. Em algumas modalidades, o hnCD16 compreendido na célula T derivativa compreende F176V e S197P. Em algumas outras modalidades, o hnCD16 compreendido na célula T derivativa compreende um ectodomínio total ou parcial originado de CD64, conforme exemplificado pela SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; ou pode ainda compreender pelo menos um domínio transmembranar, domínio estimulador e domínio de sinalização não nativos. Como explicado, essas células T derivadas têm um mecanismo adquirido para alvejar tumores com um anticorpo monoclonal mediado por ADCC para intensificar o efeito terapêutico do anticorpo. Conforme divulgado, o presente pedido também fornece uma célula T derivada, ou uma população celular da mesma, pré-carregada com um ou mais anticorpos de ADCC pré-selecionados em uma quantidade suficiente para uso terapêutico em um tratamento de uma afecção, uma doença ou uma infecção, conforme detalhado na seção V. abaixo. Em algumas outras modalidades, as células T derivadas que expressam um hnCD16 também têm teor nulo de CD38, de modo que as células possam evitar ser eliminadas na presença de uma substância terapêutica que alveja a CD38 de antígeno tumoral. Em uma modalidade, a dita substância terapêutica que alveja a CD38 de antígeno tumoral é um anticorpo anti-CD38. Em outra modalidade, o dito terapêutico que alveja o CD38 de antígeno tumoral é um CAR que compreende uma região de aglutinação a CD38, por exemplo, um scFV anti-CD38.
3. EXPRESSÃO DE CAR
[000148] Aplicáveis à iPSC geneticamente modificada e às células efetoras derivadas da mesma podem ser qualquer projeto de CAR conhecido na técnica. O CAR, um receptor de antígeno quimérico, é uma proteína de fusão geralmente incluindo um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, um domínio transmembranar e um endodomínio. Em algumas modalidades, o ectodomínio pode ainda incluir um peptídeo de sinal ou sequência líder e/ou um espaçador. Em algumas modalidades, o endodomínio pode ainda compreender um peptídeo de sinalização que ativa a célula efetora que expressa o CAR. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de antígeno pode se aglutinar especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de reconhecimento de antígeno pode se aglutinar especificamente a um antígeno associado a uma doença ou patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença é um antígeno tumoral, em que o tumor pode ser um tumor líquido ou sólido. Em algumas modalidades, o CAR é adequado para ativar células T ou NK que expressam o dito CAR. Em algumas modalidades, o CAR é uma célula NK específica para compreender componentes de sinalização específicos de NK. Em certas modalidades, as ditas células T são derivadas de iPSCs que expressam CAR, e as células T derivadas podem compreender células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, células T reguladoras, células T exterminadoras naturais, células T αβ, células T γδ ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, as ditas células NK são derivadas de iPSCs que expressam CAR.
[000149] Em certas modalidades, a dita região de reconhecimento de antígeno compreende um anticorpo murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um Ig de camelo, um anticorpo somente para cadeia pesada de tubarão (VNAR), Ig NAR, um anticorpo quimérico, um anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo dos mesmos. Exemplos não limitativos de fragmento de anticorpo incluem Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, fragmento de aglutinação a antígeno de cadeia única (scFv), (scFv)2, Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), minicorpo, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, fragmentos de aglutinação a antígeno de domínio único (sdAb, Nanocorpo), anticorpo recombinante apenas de cadeia pesada (VHH) e outros fragmentos de anticorpo que mantêm a especificidade de aglutinação de todo o anticorpo. Exemplos não limitativos de antígeno que podem ser alvejados por um CAR incluem ADGRE2, anidrase carbônica IX (CAlX), CCRI, CCR4, antígeno carcinoembrionário (CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CD269 (BCMA), CDS, CLEC12A, um antígeno de uma célula infectada por citomegalovírus (CMV) (por exemplo, um antígeno de superfície celular), glicoproteína epitelial2 (EGP 2), glicoproteína epitelial 40 (EGP-40), molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), EGFRvIII, proteína tirosina-quinases de receptor erb B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, proteína de aglutinação ao folato de ERBB (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor de folato-a, Gangliosídeo G2 (GD2), Gangliosídeo G3 (GD3), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER-2), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), ICAM-1, Integrina B7, subunidade alfa-2 do receptor da Interleucina-13 (IL-13Rα2), κ-cadeia leve, receptor do domínio de inserção de quinase (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), LILRB2, família de antígenos de melanoma A 1 (MAGE-A1), MICA/B, Mucina 1 (Muc-1), Mucina 16 (Muc-16), Mesotelina (MSLN), ligantes de NKCSI, NKG2D, c-Met, antígeno de câncer/testículo NY- ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), PRAME, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) PRAME, glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, fator de crescimento endotelial vascular R2 (VEGF- R2), proteína tumoral de Wilms (WT-1) e diversos antígenos patógenos conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de patógenos incluem vírus, bactérias, fungos, parasitas e protozoários capazes de causar doenças.
[000150] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar de um CAR compreende um comprimento total ou, pelo menos, uma porção da região transmembranar nativa ou modificada de polipeptídeo de CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, receptor de células T.
[000151] Em algumas modalidades, o peptídeo de sinalização do endodomínio (ou domínio intracelular) compreende um comprimento total ou pelo menos uma porção de um polipeptídeo de CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C ou NKG2D. Em uma modalidade, o peptídeo de sinalização de um CAR compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade com pelo menos um ITAM (motivo de ativação à base de tirosina imunoreceptora) de CD3ζ.
[000152] Em certas modalidades, o dito endodomínio compreende, ainda, pelo menos uma região de sinalização coestimuladora. A dita região de sinalização coestimuladora pode compreender um comprimento total ou pelo menos uma porção de um polipeptídeo de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 ou NKG2D ou qualquer combinação dos mesmos.
[000153] Em uma modalidade, o CAR aplicável às células fornecidas neste pedido compreende um domínio coestimulador derivado de CD28 e um domínio de sinalização que compreende o ITAM1 nativo ou modificado de CD3ζ, representado por uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade adicional, o CAR que compreende um domínio coestimulador derivado a partir de CD28 e um ITAM1 nativo ou modificado de CD3ζ também compreende um domínio de articulação e um domínio transmembranar derivados a partir de CD28, em que um scFv pode ser conectado ao domínio transmembranar através da articulação, e o CAR compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 13
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA AYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE
RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR (153 a.a. de Coestimulador de CD28 + CD3ζITAM) SEQ ID NO: 14
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPF WVLVVVGGVLACYSLLVTVA FIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSE IGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPP
R (219 a.a. de Articulação de CD28 + CD28 TM + coestimulador CD28 + CD3 ζITAM)
[000154] Em outra modalidade, o CAR aplicável às células fornecidas neste pedido compreende um domínio transmembranar derivado a partir de NKG2D, um domínio coestimulador derivado de 2B4 e um domínio de sinalização que compreende o CD3ζ nativo ou modificado, representado por uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 15. O dito CAR que compreende um domínio transmembranar derivado a partir de NKG2D, um domínio coestimulador derivado a partir de 2B4 e um domínio de sinalização que compreende o CD3ζ nativo ou modificado pode compreender, ainda, uma articulação de CD8, em que a sequência de aminoácidos de tal estrutura tem pelo menos cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 15
SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQ SETSPKEFLTIYEDVKDLKT RRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLY SLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNS TIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSA DAPAYKQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL
YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (263 a.a. de NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
SEQ ID NO: 16
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACD SNLFVASWIAVMIIF RIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYED VKDLKTRRNHEQEQTFPGGGS TIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNH SPSFNSTIYEVIGKSQPKAQN PARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR (308 a.a de articulação de CD8 + NKG2D TM + 2B4 + CD3ζ)
[000155] As estratégias de CAR não limitantes incluem ainda CAR heterodimérico condicionalmente ativado através da dimerização de um par de domínio intracelular (consultar, por exemplo, Patente US nº 9587020); CAR dividido, em que a recombinação homóloga de domínios de aglutinação ao antígeno, articulação e endodomínios para gerar um CAR (consultar, por exemplo, Publicação US nº 20170183407); CAR de múltiplas cadeias que permite a ligação não covalente entre dois domínios transmembranares conectados a um domínio de aglutinação ao antígeno e um domínio de sinalização, respectivamente (consultar, por exemplo, Publicação No. US 20140134142); CARs com domínio de aglutinação a antígenos biespecíficos (consultar, por exemplo, Patente US nº 9447194) ou que tem um par de domínios de aglutinação a antígeno que reconhecem antígenos ou epítopos iguais ou diferentes (consultar, por exemplo, Patente US nº 8409577) ou um CAR em tandem (consultar, por exemplo, Hegde et al., J Clin Invest. 2016; 126(8):3.036 a 3.052); CAR induzível (consultar, por exemplo, Publicação Nos. US 20160046700, 20160058857, 20170166877); CAR comutável
(consultar, por exemplo, Publicação No. US 20140219975); e quaisquer outros projetos conhecidos na técnica.
[000156] Portanto, quanto ao que é fornecido no presente documento, são incluídas células derivativas obtidas a partir de diferenciação de iPSCs modificadas genomicamente, em que tanto as iPSCs quanto as células derivativas compreendem um ou mais CARs juntamente com modalidades adicionais modificadas, incluindo, mas sem limitação, knockout de CD38 e/ou hnCD16. Em uma modalidade específica, a iPSC e suas células derivativas compreendem o knockout de CD38, hnCD16 e um CAR que alvejam um antígeno viral ou tumoral selecionado, em que as células derivativas são células NK ou T e em que as células derivativas podem ser usadas com, através de aglutinação a hnCD16, um ou mais anticorpos de ADCC ou um engajador bi, tri ou multiespecífico que alveje um antígeno tumoral diferente daquele alvejado pelo CAR para evitar ou reduzir o escape de antígeno tumoral ao atingir o alvejamento duplo do mesmo tumor. Em uma modalidade adicional, a iPSC e suas células T derivativas que compreendem um CAR têm o CAR inserido em uma região constante de TCR, levando ao knockout de TCR e colocando a expressão de CAR sob o controle do promotor de TCR endógeno. Em algumas modalidades, a célula T-CAR derivativa com TCR nulo derivado de iPSCs geneticamente modificadas compreende ainda hnCD16 com um ectodomínio nativo ao CD16 (F176V e/ou S197P) ou derivado de CD64 e domínios transmembranares, estimuladores e de sinalização nativos ou não nativos. Em outra modalidade, a iPSC e suas células NK derivativas que compreendem um CAR têm o CAR inserido no lócus de NKG2A ou lócus de NKG2D, levando ao knockout de NKG2A ou NKG2D, e colocando a expressão do CAR sob o controle do promotor endógeno NKG2A ou NKG2D.
4. CITOCINA E/OU SINALIZAÇÃO DE CITOCINA
INTRODUZIDAS EXOGENAMENTE
[000157] Ao evitar a administração sistêmica de altas doses de citocinas clinicamente relevantes, o risco de toxicidade limitante da dose devido a essa prática é reduzido enquanto a autonomia celular mediada por citocinas é estabelecida. Para alcançar a autonomia de linfócitos sem a necessidade de administrar adicionalmente citocinas solúveis, um peptídeo parcial ou total de uma ou mais de IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 e/ou seu respectivo receptor é introduzido na célula para permitir a sinalização de citocinas com ou sem a expressão da própria citocina, mantendo ou aprimorando, desse modo, o crescimento, proliferação, expansão e/ou função efetora celulares com risco reduzido de toxicidade de citocinas. Em algumas modalidades, a citocina introduzida e/ou seu respectivo receptor nativo ou modificado para sinalização de citocina são expressos na superfície celular. Em algumas modalidades, a sinalização de citocinas é constitutivamente ativada. Em algumas modalidades, a ativação da sinalização de citocinas é induzível. Em algumas modalidades, a ativação da sinalização de citocinas é transitória e/ou temporal.
[000158] A Figura 1 apresenta diversos projetos de construto com o uso de IL15 como um exemplo ilustrativo. O domínio transmembranar (TM) de qualquer um dos projetos da Figura 1 pode ser nativo para o receptor de IL15 ou pode ser modificado ou substituído pelo domínio transmembranar de qualquer outra proteína aglutinada à membrana.
[000159] Projeto 1: IL15 e IL15Rα são coexpressas com o uso de um peptídeo autoclivável, reproduzindo a apresentação trans de IL15, sem eliminar a apresentação cis de IL15.
[000160] Projeto 2: a IL15Rα é fundida com IL15 no terminal C através de um ligante, reproduzindo a apresentação trans sem eliminar a apresentação cis de IL15, bem como garantindo a aglutinação de membrana à IL15.
[000161] Projeto 3: a IL15Rα com domínio intracelular truncado é fundida com IL15 no terminal C através de um ligante, reproduzindo a apresentação trans de IL15, mantendo a IL15 aglutinada à membrana e eliminando adicionalmente a apresentação cis e/ou quaisquer outras vias potenciais de transdução de sinal mediadas por uma IL15R normal através de seu domínio intracelular. O domínio intracelular de IL15Rα foi considerado crítico para o receptor se expressar nas células respondedoras à IL15 e para as células respondedoras se expandirem e funcionarem. Tal construto truncado compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17, que pode ser codificada por uma sequência de ácido nucleicos exemplificativa representada por SEQ ID NO: 18. Em uma modalidade da IL15/IL15Rα truncada, o construto não compreende os últimos 4 aminoácidos “KSRQ” da SEQ ID NO: 17 e compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 17
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANW VNVISDLKKIEDLIQSMHIDA TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTV ENLIILANNSLSSNGNVTES GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGSLQITC PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSL TECVLNKATNVAHWTTPSLKC IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAAS SPSSNNTAATTAAIVPGSQLM PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASH QPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYLKSRQ (379 a.a.; os peptídeos de sinal e de ligante estão sublinhados) SEQ ID NO: 18
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCT GCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCC TAAGACCGAGGCCAACTGGGTA AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTAT ACAAAGCATGCACATTGATGCT ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCA AAGTGACGGCCATGAAATGTTTC CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCG ACGCGTCCATCCACGACACGGTC GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTC AAATGGTAACGTAACCGAGTCA GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACA TAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCG GCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGG CGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGG TAAAATCCTATAGCTTGTACAGC CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGG AAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCAC TGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC ATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCC CCTCCAAGCACAGTGACAACAGCT GGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCT GGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGC CCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCC ATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATG CCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATC AGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGC ACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTG ACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCT CCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACA GTGGCCATCAGCACCTCCACCGTG CTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCC
TGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA (1.140 n.a.) SEQ ID NO: 21
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANW VNVISDLKKIEDLIQSMHIDA TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTV ENLIILANNSLSSNGNVTES GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGSLQITC PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSL TECVLNKATNVAHWTTPSLKC IRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAAS SPSSNNTAATTAAIVPGSQLM PSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASH QPPGVYPQGHSDTTVAISTSTV
LLCGLSAVSLLACYL (375 a.a.; os peptídeos de sinal e de ligante estão sublinhados)
[000162] Um versado na técnica observa que as sequências de peptídeo de sinal e ligantes acima são ilustrativas e de modo algum limitam suas variações adequadas para uso como um peptídeo de sinal ou ligante. Existem muitas sequências peptídicas de sinal ou ligantes adequadas conhecidas e disponíveis para os versados na técnica. O versado na técnica entende que as sequências peptídicas de sinal e/ou de ligantes podem ser substituídas por outra sequência sem alterar a atividade do peptídeo funcional liderada pelo peptídeo de sinal ou ligado pelo ligante.
[000163] Projeto 4: uma vez que o construto de Projeto 3 demonstrou ser funcional na promoção da sobrevivência e expansão de células efetoras, demonstrando que o domínio citoplasmático de IL15Rα pode ser omitido sem afetar negativamente o recurso autônomo da célula efetora equipada com IL15 nesse projeto, o Projeto 4 é um construto que fornece outra alternativa de trabalho de Projeto 3, a partir da qual essencialmente toda a IL15Rα é removida, com exceção do domínio de Sushi fundido com IL15 em uma extremidade e um domínio transmembranar na outra (mb-Sushi), opcionalmente, com um ligante entre o domínio de Sushi e o domínio transmembranar. O IL15/mb-Sushi fundido é expresso na superfície celular através do domínio transmembranar de qualquer proteína aglutinada à membrana. Com um construto, tal como o Projeto 4, a sinalização desnecessária através da IL15Rα, incluindo apresentação cis, é eliminada quando apenas a apresentação trans desejável de IL15 é retida. Em algumas modalidades, o componente que compreende IL15 fundida com o domínio de Sushi compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 19, que pode ser codificada por uma sequência de ácido nucleicos exemplificativa representada pela SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 19
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANW VNVISDLKKIEDLIQSMHIDA TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTV ENLIILANNSLSSNGNVTES GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGG GSGGGGSGGGGSGGGSLQITC PPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSL TECVLNKATNVAHWTTPSLKC
IR (242 a.a.; os peptídeos de sinal e de ligante estão sublinhados) SEQ ID NO: 20
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCT GCAACGCGAGTCCATAGCGGTATC CATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCC TAAGACCGAGGCCAACTGGGTA AATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTAT ACAAAGCATGCACATTGATGCT ACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCA AAGTGACGGCCATGAAATGTTTC CTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCG ACGCGTCCATCCACGACACGGTC GAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTC AAATGGTAACGTAACCGAGTCA GGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACA TAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTC GTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCG GCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGA AGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGG CGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGT CCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGG TAAAATCCTATAGCTTGTACAGC CGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGG AAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACC GAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCAC TGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGC
ATCAGA (726 n.a.)
[000164] Um versado na técnica observa que as sequências de peptídeo de sinal e ligantes acima são ilustrativas e de modo algum limitam suas variações adequadas para uso como um peptídeo de sinal ou ligante. Existem muitas sequências peptídicas de sinal ou ligantes adequadas conhecidas e disponíveis para os versados na técnica. O versado na técnica entende que as sequências peptídicas de sinal e/ou de ligantes podem ser substituídas por outra sequência sem alterar a atividade do peptídeo funcional liderada pelo peptídeo de sinal ou ligado pelo ligante.
[000165] Projeto 5: Uma IL15Rβ nativa ou modificada é fundida a IL15 no terminal C através de um ligante, permitindo sinalização constitutiva e mantendo a IL15 aglutinada à membrana e representação trans.
[000166] Projeto 6: Um receptor comum nativo ou modificado γC é fundido com IL15 no terminal C através de um ligante para sinalização constitutiva e apresentação trans aglutinada à membrana da citocina. O receptor comum γC também é chamado de cadeia gama comum ou CD132, também conhecido como subunidade gama de receptor de IL2 ou IL2RG. γC é uma subunidade de receptor de citocina que é comum aos complexos receptores de muitos receptores de interleucina, incluindo, mas não se limitando a, receptores de IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 e IL21.
[000167] Projeto 7: IL15Rβ geneticamente modificada que forma homodímero na ausência de IL15 é útil para produzir sinalização constitutiva da citocina.
[000168] Em algumas modalidades, uma ou mais das citocinas IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 e IL21 e/ou receptores das mesmas, podem ser introduzidas na iPSC com o uso de um ou mais dos projetos na Figura 1, e às suas células derivativas mediante diferenciação de iPSC. Em algumas modalidades, a expressão e a sinalização de superfície celular de IL2 ou IL15 são realizadas através do construto ilustrado em qualquer um dos Projetos 1 a 7. Em algumas modalidades, a expressão e a sinalização de superfície celular de IL4, IL7, IL9 ou IL21 são realizadas através do construto ilustrado no Projeto 5, 6 ou 7, com o uso de um receptor comum ou um receptor específico para citocina. Em algumas modalidades, a expressão e a sinalização de superfície de IL7 é realizada através do construto ilustrado no Projeto 5, 6 ou 7, com o uso de um receptor comum ou um receptor específico para citocina, tal como um receptor de IL4. O domínio transmembranar (TM) de qualquer um dos projetos na Figura 1 pode ser nativo para o respectivo receptor de citocina ou pode ser modificado ou substituído pelo domínio transmembranar de qualquer outra proteína aglutinada à membrana.
[000169] Nas iPSCs e células derivativas das mesmas que compreendem tanto CAR quanto sinalização de receptores de citocina e/ou citocinas exógenas, o CAR e a IL podem ser expressos em construtos separados, ou podem ser coexpressos em um construto bicistrônico que compreende CAR e IL. Em algumas modalidades adicionais, a IL15 em uma forma representada por qualquer um dos projetos de construto da Figura 1 pode ser ligada à extremidade 5’ ou 3’ de um construto de expressão de CAR através de uma sequência de codificação 2A autoclivável, ilustrada como, por exemplo, CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR. Sendo assim, a IL15 e o CAR estão em um único quadro de leitura aberto (ORF). Em uma modalidade, o construto de CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR compreende IL15 no Projeto 3 da Figura 1. Em outra modalidade, o construto de CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR compreende IL15 no Projeto 3 da Figura 1. Em ainda outra modalidade, o construto de CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR compreende IL15 no Projeto 7 da Figura 1. Quando CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR é expressa, o peptídeo 2A autoclivável permite que o CAR e a IL15 se dissociem, e a IL15 dissociada pode, então, ser apresentada na superfície celular. O projeto bicistrônico de CAR-2A-IL15 ou IL15-2A-CAR permite uma expressão coordenada de CAR e IL15 tanto em tempo quanto em quantidade e sob o mesmo mecanismo de controle que pode ser escolhido para incorporar, por exemplo, um promotor induzível para o expressão do único ORF. Os peptídeos autoclivantes são encontrados em membros da família do vírus Picornaviridae, incluindo aftovírus, tal como o vírus da doença de mão-pé-boca (FMDV), vírus da rinite equina A (ERAV), vírus Thosea asigna (TaV) e vírus do tescho porcino-1 (PTV-I) (Donnelly, ML, et al., J. Gen. Virol, 82, 1.027 a 1.101 (2001); Ryan, MD, et al., J. Gen. Virol., 72, 2.727 a 2.732 (2001)) e cardiovírus como o Theilovírus (por exemplo, encefalomielite murina de Theiler) e vírus da encefalomiocardite. Os peptídeos 2 A derivados a partir de FMDV, ERAV, PTV-I e TaV, por vezes, também são chamados de "F2A", "E2A", "P2A" e "T2A", respectivamente.
[000170] A modalidade de CAR-2A-IL15 ou IL15-2A- CAR bicistrônico, conforme divulgada neste documento para IL15, também é contemplada para expressão de qualquer outra citocina fornecida neste documento, por exemplo, IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL18 e IL21. Em algumas modalidades, a expressão e sinalização da superfície celular de IL2 é realizada através do construto ilustrado em qualquer um dos Projetos 1 a
7. Em algumas outras modalidades, a expressão e sinalização da superfície celular de IL4, IL7, IL9 ou IL21 são através do construto ilustrado nos Projetos 5, 6 ou 7, com o uso de um receptor comum e/ou um receptor específico de citocina.
5. DEFICIÊNCIA DE HLA-I E HLA-II
[000171] Múltiplas proteínas HLA classe I e classe II devem ser correspondidas para histocompatibilidade em receptores alogênicos para evitar problemas de rejeição alogênica. É fornecida neste documento uma linhagem celular de iPSC com expressão eliminada ou substancialmente reduzida de proteínas HLA de classe I e HLA de classe II. A deficiência de HLA de classe I pode ser alcançada pela deleção funcional de qualquer região do lócus de HLA de classe I (cromossomo 6p21) ou deleção ou redução do nível de expressão dos genes associados ao HLA de classe I, incluindo, sem limitação, o gene de microglobulina beta-2 (B2M), gene de TAP 1, gene de TAP 2 e Tapasina. Por exemplo, o gene de B2M codifica uma subunidade comum essencial para a expressão da superfície celular de todos os heterodímeros
HLA de classe I. As células nulas B2M são deficientes em HLA-I. A deficiência de HLA de classe II pode ser alcançada por deleção funcional ou redução de genes associados a HLA-II, incluindo, sem limitação, RFXANK, CIITA, RFX5 e RFXAP. O CIITA é um coativador de transcrição, que funciona através da ativação do fator de transcrição RFX5 necessário para a expressão da proteína de classe II. As células nulas CIITA são deficientes em HLA-II. É fornecida neste documento uma linhagem de iPSC e suas células derivadas com B2M e CIITA submetidos a knockout, em que as células efetoras derivadas obtidas permitem terapias celulares alogênicas, eliminando a necessidade de correspondência com MHC (complexo de histocompatibilidade principal) e evitam o reconhecimento e a exterminação pelas células T hospedeiras (alogênicas).
[000172] Para alguns tipos de células, a falta de expressão de classe I leva à lise pelas células NK. Para superar essa resposta de “autoausência”, o HLA-G pode ser opcionalmente submetido a knockout para evitar o reconhecimento de células NK e a exterminação das células efetoras deficientes em HLA-I e HLA-II derivadas de uma iPSC modificada geneticamente. Em uma modalidade, a iPSC deficiente em HLA-I e HLA-II e suas células derivativas compreendem ainda o knockout de CD38 e, opcionalmente, um ou mais de hnCD16, CAR e IL, sem impactar adversamente o potencial de diferenciação da iPSC e a função das células efetoras derivadas, incluindo células T e NK derivativas.
6. LINHAGEM DE iPSC GENETICAMENTE MODIFICADA
E CÉLULAS DERIVATIVAS FORNECIDAS NO PRESENTE DOCUMENTO
[000173] À luz do conteúdo acima, o presente pedido fornece uma iPSC de CD38-/- (também denominada “com teor nulo de CD38” ou knockout de CD38 no presente documento), célula de linhagem celular ou uma população da mesma e células derivativas funcionais derivadas que compreendem knockout de CD38 obtido a partir de diferenciação da iPSC de CD38-/-. Em algumas modalidades, as células derivativas funcionais são células hematopoiéticas que incluem, mas sem limitação, células mesodérmicas com potencial de endotélio hemogênico (HE) definitivo, HE definitivo, células hematopoiéticas CD34, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, progenitores multipotentes hematopoiéticos (MPP), progenitores de células T, progenitores de células NK, células mieloides, progenitores de neutrófilos, células T, células NKT, células NK, células B, neutrófilos, células dendríticas e macrófagos. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas derivativas funcionais compreendem células efetoras, tais como células T, NK e reguladoras.
[000174] É ainda fornecida no presente documento uma iPSC que compreende um knockout de CD38 e um polinucleotídeo que codifica um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16), em que a iPSC tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivativas funcionais. Em algumas modalidades, quando um anticorpo anti-CD38 é usado para induzir a ADCC intensificada mediada por hnCD16, a iPSC e/ou suas células efetoras derivativas podem alvejar as células que expressam CD38 (tumor) sem causar eliminação de células efetoras, isto é, redução ou depleção de células efetoras que expressam CD38, assim, aumentando a persistência e/ou sobrevivência de iSPC ou suas células efetoras. Em algumas modalidades, a célula efetora aumentou a persistência e/ou a sobrevivência in vivo na presença de agentes terapêuticos anti-CD38, que podem ser um anticorpo anti-CD38 ou uma CD38 de aglutinação ao CAR. Em algumas modalidades, as células efetoras compreendem células T. As células T derivadas de iPSC que compreendem hnCD16 e com teor nulo de CD38 experimentam redução de depleção celular na presença de anticorpos anti-CD38 ou CARs anti-CD38; adquiriram a ADCC, fornecendo um mecanismo adicional para a exterminação de tumores mediada por células T. Em algumas modalidades, as células efetoras compreendem células NK. As células NK derivadas de iPSC que compreendem hnCD16 e com teor nulo de CD38 têm citotoxicidade intensificada e têm fratricídio reduzido de células NK na presença de anticorpos anti-CD38 ou CARs anti-CD38.
[000175] Uma iPSC que compreende um knockout de CD38 e um polinucleotídeo que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) de alvo específico é fornecida no presente documento, em que a iPSC tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células efetoras derivativas funcionais. Em uma modalidade, o CAR compreendido na iPSC e suas células efetoras derivativas que compreendem knockout de CD38 alveja CD38 de proteína de superfície celular tumoral, no entanto, o CD38-CAR não leva à eliminação de iPSCs e/ou de suas células efetoras derivativas com CD38 submetida a knockout. Em algumas modalidades, o CAR compreendido na iPSC e em suas células efetoras derivativas que compreendem knockout de CD38 não alvejam CD38. Em algumas modalidades, as células efetoras derivativas com teor nulo de CD38 que expressam CAR podem ser usadas com um anticorpo anti-CD38 para induzir ADCC sem causar a eliminação de células efetoras, aumentando assim a persistência e/ou a sobrevivência de iPSC e suas células efetoras. Em algumas modalidades, a célula efetora aumentou a persistência e/ou a sobrevivência in vivo em um tratamento combinatório.
[000176] Adicionalmente, é fornecida uma iPSC que compreende um knockout de CD38 e um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma citocina exógena e/ou seu receptor (IL) para permitir a sinalização de citocinas que contribui para a sobrevivência, persistência e/ou expansão celular, em que a linhagem de iPSC tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivadas funcionais com sobrevivência, persistência, expansão e função celular efetora aprimoradas. A sinalização (ou sinalizações) de citocina introduzida exogenamente compreende a sinalização de qualquer uma ou duas ou mais dentre IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 e IL21. Em algumas modalidades, o peptídeo parcial ou total introduzido de citocina e/ou seu respectivo receptor para sinalização de citocina são expressos na superfície celular. Em algumas modalidades, a sinalização de citocinas é constitutivamente ativada. Em algumas modalidades, a ativação da sinalização de citocinas é induzível. Em algumas modalidades, a ativação da sinalização de citocinas é transitória e/ou temporal. Em algumas modalidades, a expressão transitória/temporal de um receptor de citocina/citocina na superfície celular é através de um retrovírus, vírus Sendai, um adenovírus, epissoma, minicírculo ou RNAs incluindo mRNA. Em algumas modalidades, o receptor e/ou citocina de superfície celular exógena compreendido na iPSC de CD38 -/- ou células derivativas do mesmo permite a sinalização de IL7. Em algumas modalidades, o receptor e/ou citocina de superfície celular exógena compreendido na iPSC de CD38 -/- ou células derivativas do mesmo permite a sinalização de IL10. Em algumas modalidades, o receptor e/ou citocina de superfície celular exógena compreendido na iPSC de CD38-/- ou células derivativas do mesmo permite a sinalização de IL15. Em algumas modalidades da dita iPSC de CD38 -/-, a expressão de IL15 é através do construto 3 de Figura 1. Em algumas modalidades da dita iPSC de CD38-/-, a expressão de IL15 é através do construto 4 de Figura 1. A dita iPSC de IL de CD38-/- e suas células derivativas das modalidades acima têm capacidade para manter ou aprimorar o crescimento, proliferação, expansão e/ou função efetora celular de forma autônoma, sem entrar em contato com citocinas solúveis adicionalmente fornecidas in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, a iPSC de IL de CD38-/- e suas células efetoras derivativas podem ser usadas com um anticorpo anti- CD38 para induzir ADCC sem causar eliminação de células efetoras, desse modo aumentando sinergicamente a persistência e/ou sobrevivência de iPSC e de suas células efetoras.
[000177] Também é fornecida uma iPSC que compreende um knockout de CD38, um knockout de B2M e um knockout de CIITA e, opcionalmente, um polinucleotídeo que codifica HLA-G, em que a iPSC tem capacidade de diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivativas funcionais. A dita iPSC de CD38-/- B2M-/- CIITA-/- e suas células efetoras derivativas são deficientes de HLA-I e HLA-II, e podem ser usadas com um anticorpo anti-CD38 para induzir ADCC sem causar a eliminação de células efetoras, assim aumentando a persistência e/ou a sobrevivência de iPSC e de suas células efetoras. Em algumas modalidades, a célula efetora aumentou a persistência e/ou a sobrevivência in vivo.
[000178] Tendo em vista o conteúdo acima, é fornecida no presente documento uma iPSC que compreende um knockout de CD38 e, opcionalmente, um, dois, três ou todos os quatro dentre: hnCD16, CAR, uma citocina/receptor exógeno e knockout de B2M/CIITA; em que quando B2M é submetida a knockout, um polinucleotídeo que codifica HLA-G é opcionalmente introduzido e em que a iPSC tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivativas funcionais. Também incluídas neste pedido estão as células hematopoiéticas derivativas de iPSC funcionais que compreendem um knockout de CD38 e, opcionalmente, um, dois, três ou todos os quatro dentre: hnCD16, knockout de B2M/CIITA, CAR e uma citocina/receptor exógeno; em que quando B2M é submetida a knockout, um polinucleotídeo que codifica HLA-G é opcionalmente introduzido e em que as células hematopoiéticas derivativas incluem, mas sem limitação, células mesodérmicas com potencial de endotélio hemogênico (HE) definitivo, HE definitivo, células hematopoiéticas CD34, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, progenitores multipotentes hematopoiéticos (MPP), progenitores de células T, progenitores de células NK, células mieloides, progenitores de neutrófilos, células T, células NKT, células NK, células B, neutrófilos, células dendríticas e macrófagos.
[000179] Outro aspecto fornecido no presente documento inclui uma célula derivada de iPSC ou iPSC que compreende uma proteína de fusão truncada de IL15 e IL15Rα, em que a proteína de fusão não compreende um domínio intracelular. Mostradas como “fusão de IL15Rα(ΔICD)” e “IL5/mb-Sushi” na Figura 1, essas modalidades são ainda coletivamente abreviadas como IL15Δ na Tabela 1 e ao longo deste pedido. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada sem domínio intracelular compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17, 19 ou 21. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada que não possui domínio intracelular compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada que não possui domínio intracelular compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada que não possui domínio intracelular compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Em ainda algumas outras modalidades, a iPSC ou células derivadas de iPSC que compreendem uma proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada sem domínio intracelular (IL15Δ) compreendem ainda um ou mais dentre: knockout de CD38, hnCD16, CAR, uma citocina/receptor exógeno e knockout de B2M/CIITA; em que quando B2M é submetida a knockout, um polinucleotídeo que codifica HLA-G é opcionalmente introduzido e em que a iPSC tem capacidade para diferenciação direcionada para produzir células hematopoiéticas derivativas funcionais e em que as células hematopoiéticas derivativas incluem, mas sem limitação, células mesodérmicas com potencial de endotélio hemogênico (HE) definitivo, HE definitivo, células hematopoiéticas CD34, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, progenitores multipotentes hematopoiéticos (MPP), progenitores de células T, progenitores de células NK, células mieloides, progenitores de neutrófilos, células T, células NKT, células NK, células B, neutrófilos, células dendríticas e macrófagos.
[000180] Sendo assim, o presente pedido fornece iPSCs e suas células hematopoiéticas derivativas funcionais, que compreendem qualquer um dos seguintes genótipos na Tabela 1. A menos que especificada como IL15Δ, que é detalhada acima como uma proteína de fusão truncada de IL15 e IL15Rα, mas sem um domínio intracelular, “IL”, conforme fornecido na Tabela 1, representa uma dentre as IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18 e IL21, dependendo de qual expressão específica de citocina/receptor é selecionada.
Além disso, quando as iPSCs e suas células hematopoiéticas derivativas funcionais têm um genótipo que compreende CAR e IL, o CAR e a IL são compreendidos em um cassete de expressão bicistrônico que compreende uma sequência 2A.
Como comparação, em algumas outras modalidades, CAR e IL estão em cassetes de expressão separados compreendidos em iPSCs e suas células hematopoiéticas derivativas funcionais.
Em uma modalidade específica, uma IL15 em um construto 3 ou 4 da Figura 1 é compreendida nas iPSCs e em suas células efetoras derivativas funcionais que expressam CAR e IL, em que o construto de IL15 é compreendido em um cassete de expressão com CAR ou separado do mesmo.
TABELA 1: GENÓTIPOS APLICÁVEIS DAS CÉLULAS FORNECIDAS: 1 CD38-/- 25 IL15Δ 2 CD38-/- hnCD16 26 IL15Δ hnCD16 3 CD38-/- CAR 27 IL15Δ CAR 4 CD38-/- IL 28 IL15Δ hnCD16 CAR 5 CD38-/- CAR IL 29 IL15Δ hnCD16 6 CD38-/- hnCD16 CAR 30 IL15Δ hnCD16 CAR 7 CD38-/- hnCD16 IL 31 IL15Δ B2M-/-CIITA-/- 8 CD38-/- hnCD16 CAR IL 32 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- HLA-G 9 CD38-/- B2M-/-CIITA-/- 33 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 10 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- HLA-G 34 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/-HLA-G 11 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 35 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- CAR 12 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 36 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- HLA-G CAR HLA-G 13 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- CAR 37 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- 14 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- HLA-G 38 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- HLA-G
CAR 15 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- IL 39 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/-CAR 16 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- HLA-G IL 40 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/-HLA-G
CAR 17 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 41 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/-
CAR 18 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 42 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/- HLA-G HLA-G CAR 19 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 43 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- CAR
IL 20 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- 44 IL15Δ B2M-/- CIITA-/- HLA-G CAR HLA-G IL 21 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- CAR IL 45 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/- CAR 22 CD38-/- B2M-/- CIITA-/- HLA-G 46 IL15Δ hnCD16 B2M-/- CIITA-/- HLA-G
CAR IL CAR 23 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/-
CAR IL 24 CD38-/- hnCD16 B2M-/- CIITA-/- HLA-G CAR IL
7. MODIFICAÇÕES ADICIONAIS
[000181] Em algumas modalidades, a iPSC e suas células efetoras derivadas que compreendem qualquer um dos genótipos na
Tabela 1 podem compreender adicionalmente deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21; ou expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A 2AR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplamento com engajadores bi, multiespecíficos ou universais.
[000182] Os engajadores bi ou multiespecíficos são proteínas de fusão que consistem em dois ou mais fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) de diferentes anticorpos, com pelo menos um scFv que se liga a uma molécula de superfície celular efetiva e pelo menos outro que se liga a uma célula tumoral através de um molécula de superfície específica do tumor. As moléculas de superfície celular efetoras exemplificativas, ou receptor de disparo de superfície, que podem ser usadas para reconhecimento ou acoplamento de engajador bi ou multiespecífico, incluem, mas sem limitação, CD3, CD28, CD5, CD16, NKG2D, CD64, CD32, CD89, NKG2C e um receptor Fc quimérico, conforme divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, o CD16 expresso na superfície de células efetoras para reconhecimento de engajador é um hnCD16 que compreende o domínio extracelular de CD16 (que contém F176V e opcionalmente S197P) ou CD64 e domínios transmembranares, estimuladores e/ou sinalizadores nativos ou não nativos, conforme descrito na seção I.2. Em algumas modalidades, o CD16 expresso na superfície das células efetoras para reconhecimento do engajador é um receptor Fc quimérico (CFcR) baseado em hnCD16. Em algumas modalidades, o CFcR baseado em hnCD16 compreende um domínio transmembranar de NKG2D, um domínio estimulador de 2B4 e um domínio de sinalização de CD3ζ; em que o domínio extracelular do hnCD16 é derivado de uma sequência completa ou parcial do domínio extracelular de CD64 ou CD16; e em que o domínio extracelular de CD16 compreende F176V e opcionalmente S197P. As moléculas de superfície de células tumorais exemplificativas para reconhecimento do engajador bi ou multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, B7H3, BCMA, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD179b, CEA, CLEC12A, CS-1, DLL3, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, FLT-3, FOLR1, FOLR3, GD2, gpA33, HER2, HM1.24, LGR5, MSLN, MCSP, MICA/BICA, PSMA, PAMA, P-caderina, ROR1. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é CD3-CD19. Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico é CD16-CD30 ou CD64-CD30. Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico é CD16-BCMA ou CD64-BCMA. Ainda em outra modalidade, o anticorpo biespecífico é CD3-CD33. Ainda em outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende ainda um ligante entre os domínios de aglutinação ao antígeno de célula efetora e da célula tumoral, por exemplo, uma IL15 modificada como um ligante para células NK efetoras para facilitar a expansão da célula efetora (chamada TriKE, ou Engajador Exterminador Triespecífico, em algumas publicações). Em uma modalidade, o TriKE é CD16-IL15-EPCAM ou CD64-IL15-EPCAM. Em outra modalidade, o TriKE é CD16-IL15-CD33 ou CD64-IL15-CD33. Ainda em outra modalidade, o TriKE é NKG2C-IL15-CD33.
[000183] Em algumas modalidades, o receptor de disparo de superfície para o engajador bi ou multiespecífico pode ser endógeno para as células efetoras, às vezes dependendo dos tipos de células. Em algumas outras modalidades, um ou mais receptores exógenos de disparo de superfície podem ser introduzidos nas células efetoras com o uso dos métodos e composições fornecidos neste documento, isto é, através de modificação adicional de uma iPSC que compreende um genótipo listado na Tabela 1, então, direcionando a diferenciação da iPSC a T, NK ou quaisquer outras células efetoras que compreendem o mesmo genótipo e o receptor de disparo de superfície que a iPSC de origem.
8. ANTICORPOS PARA IMUNOTERAPIA
[000184] Em algumas modalidades, além das células efetoras modificadas genomicamente, conforme fornecidas neste documento,
um agente terapêutico adicional que compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que tem como alvo um antígeno associado a uma afecção, doença ou indicação pode ser usado com essas células efetoras em uma terapia combinacional. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno viral. Em outras modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o tumor ou antígeno viral específico ativa as células efetoras derivadas de iPSC administradas para intensificar sua capacidade de exterminação. Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para tratamento combinatório como um agente terapêutico com a iPSC administrada derivada de células efetoras incluem, mas sem limitação, anti-CD20 (rituximabe, veltuzumabe, ofatumumabe, ublituximabe, ocaratuzumabe, obinutuzumabe), anti-HER2 (trastuzumabe, pertuzumabe), anti-CD52 (alentuzumabe), anti-EGFR (certuximabe), anti-GD2 (dinutuximabe), anti-PDL1 (avelumabe), anti-CD38 (daratumumabe, isatuximabe, MOR202), anti-CD123 (7G3, CSL362), anti-SLAMF7 (elotuzumabe), e suas variantes ou fragmentos modificados por Fc ou humanizados ou seus equivalentes funcionais e biossimilares. Em algumas modalidades, as células efetoras derivadas de iPSC compreendem células de linhagem hematopoiética que compreendem um genótipo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, as células efetoras derivadas de iPSC compreendem células NK que compreendem um genótipo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, as células efetoras derivadas de iPSC compreendem células T que compreendem um genótipo listado na Tabela
1. Em algumas modalidades de uma combinação útil para tratar tumores líquidos ou sólidos, a combinação compreende células T ou NK derivadas de iPSC que compreendem pelo menos teor nulo de CD38, e um anticorpo anti- CD38. Em uma modalidade, a combinação compreende células NK derivadas de iPSC que compreendem teor nulo de CD38 e hnCD16; e um dos anticorpos anti-CD38, daratumumabe, isatuximabe e MOR202. Em uma modalidade, a combinação compreende células NK derivadas de iPSC que compreendem teor nulo de CD38 e hnCD16 e daratumumabe. Em algumas modalidades adicionais, as células NK derivadas de iPSC na combinação com daratumumabe compreendem teor nulo de CD38, hnCD16, IL15, e um CAR que alveja CD38 ou um dentre CD19, BCMA, CD20, CD22, CD123, HER2, CD52, EGFR, GD2 e PDL1; em que a IL15 é co- ou separadamente expressa com o CAR; e a IL15 está sob qualquer uma das formas apresentadas em construtos 1 a 7 de Figura 1. Em algumas modalidades específicas, a IL15 está sob a forma de construto 3, 4 ou 7 quando é expressa em conjunto ou separadamente com o CAR.
9. INIBIDORES DE PONTO DE VERIFICAÇÃO
[000185] Os pontos de verificação são moléculas celulares, geralmente moléculas de superfície celular, com capacidade para suprimir ou regular negativamente as respostas imunes quando não inibidas. Agora está claro que os tumores co-optam certas vias de ponto de verificação imune como um importante mecanismo de resistência imune, particularmente contra células T que são específicas para antígenos tumorais. Os inibidores de ponto de verificação (CI) são antagonistas com capacidade para reduzir a expressão gênica ou produtos gênicos de ponto de verificação ou com capacidade para diminuir a atividade de moléculas de ponto de verificação, assim, bloqueando os pontos de verificação inibitórios, restaurando a função do sistema imunológico. O desenvolvimento de inibidores de ponto de verificação que alvejam PD1/PDL1 ou CTLA4 transformou o cenário oncológico, com esses agentes fornecendo remissões a longo prazo em várias indicações. No entanto, muitos subtipos de tumor são resistentes à terapia de bloqueio de ponto de verificação e a recidiva continua sendo uma preocupação significativa. Um aspecto do presente pedido fornece uma abordagem terapêutica para superar a resistência ao CI, incluindo células derivativas funcionais genomicamente modificadas, conforme fornecidas em uma terapia de combinação com CI. Em uma modalidade da terapia de combinação, as células derivativas são células NK. Em outra modalidade da terapia de combinação, as células derivativas são células T. Além de exibir capacidade antitumoral direta, foi demonstrado que as células NK derivadas fornecidas neste documento resistem à inibição mediada por PDL1-PD1 e têm a capacidade de intensificar a migração de células T, recrutar células T para o microambiente tumoral e aumentar a ativação de célula T no sítio do tumor. Portanto, a infiltração tumoral de células T facilitada pelas células NK derivativas modificadas genomicamente funcionalmente potentes, indica que as ditas células NK têm capacidade para sinergizar com imunoterapias de alvejamento de células T, incluindo os inibidores de ponto de verificação, para aliviar a imunossupressão local e reduzir a carga tumoral.
[000186] Em uma modalidade, a célula NK derivada para terapia de combinação de inibidor de ponto de verificação compreende um knockout de CD38 e, opcionalmente, um, dois, três ou todos os quatro dentre: expressão de hnCD16, knockout de B2M/CIITA, expressão de CAR e uma expressão de receptor e/ou citocina de superfície celular exógena; em que quando B2M é submetida a knockout, um polinucleotídeo que codifica HLA-G é opcionalmente incluído. Em algumas modalidades, a célula NK derivativa compreende qualquer um dos genótipos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, a célula NK derivativa acima compreende adicionalmente deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; ou expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplar a engajadores bi, multiespecíficos ou universais.
[000187] Em outra modalidade, a célula T derivada para terapia de combinação de inibidor de ponto de verificação compreende um knockout de CD38 e, opcionalmente, um, dois, três ou todos os quatro dentre: expressão de hnCD16, knockout de B2M/CIITA, expressão de CAR e uma expressão de receptor e/ou citocina de superfície celular exógena; em que quando B2M é submetida a knockout, um polinucleotídeo que codifica HLA-G é opcionalmente incluído. Em algumas modalidades, a célula T derivativa compreende qualquer um dos genótipos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, a célula T derivativa acima compreende adicionalmente deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; ou expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplar a engajadores bi, multiespecíficos ou universais.
[000188] A célula T ou NK derivativa dita acima é obtida a partir da diferenciação de uma linhagem clonal de iPSC que compreende um knockout de CD38 e, opcionalmente, um, dois, três ou todos os quatro dentre: expressão de hnCD16, knockout de B2M/CIITA, expressão de CAR e uma expressão de citocina de superfície celular exógena; em que quando B2M é submetida a knockout, opcionalmente é introduzido um polinucleotídeo que codifica HLA-G. Em algumas modalidades, a linhagem clonal de iPSC dita acima compreende ainda a deleção ou expressão reduzida em pelo menos um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, RFX5, RFXAP, e qualquer gene na região de cromossomo 6p21; ou expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A 2AR, CAR, TCR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplar a engajadores bi, multiespecíficos ou universais.
[000189] Os inibidores de ponto de verificação adequados para terapia de combinação com as células NK ou T derivadas, conforme fornecidos neste documento, incluem, mas não se limitam a, antagonistas de PD-1 (Pdcdl, CD279), PDL-1 (CD274), TIM-3 (Havcr2), TIGIT (WUCAM e Vstm3), LAG-3 (Lag3, CD223), CTLA-4 (Ctla4, CD152), 2B4 (CD244), 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39 (Entpdl), CD47, CD73 (NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2 (Pou2f2), receptor alfa de ácido retinoico (Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E e KIR inibidor (por exemplo, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1 e 3DL2).
[000190] Em algumas modalidades, o antagonista que inibe qualquer uma das moléculas de ponto de verificação acima é um anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos inibidores do ponto de verificação podem ser anticorpos de murinos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, um Ig de camelo, um anticorpo apenas para cadeia pesada de tubarão (VNAR), Ig NAR, anticorpos quiméricos, anticorpos recombinantes ou fragmentos de anticorpos dos mesmos. Exemplos não limitantes de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, fragmentos de aglutinação ao antígeno de cadeia única (scFv), (scFv)2, Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), minicorpo, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, fragmentos de aglutinação ao antígeno de domínio único (sdAb, Nanocorpo), anticorpo recombinante apenas de cadeia pesada (VHH) e outros fragmentos de anticorpo que mantêm a especificidade de aglutinação de todo o anticorpo, o que pode ser mais econômico para produzir, mais facilmente usado ou mais sensível do que todo o anticorpo. Em algumas modalidades, o um, ou dois, ou três ou mais inibidores de ponto de verificação compreendem pelo menos um dentreatezolizumabe (mAb anti-PDL1), avelumabe (mAb anti-PDL1), durvalumabe (mAb anti-PDL1), tremelimumabe (anti-CTLA-4 mAb), ipilimumabe (mAb anti-CTLA-4), IPH4102 (anti-KIR), IPH43 (anti-MICA), IPH33
(anti-TLR3), lirimumabe (anti-KIR), monalizumabe (anti-NKG2A), nivolumabe (mAb anti-PD1), pembrolizumabe (mAb anti-PD1) e quaisquer derivados, equivalentes funcionais ou biossimilares dos mesmos.
[000191] Em algumas modalidades, o antagonista que inibe qualquer uma das moléculas de ponto de verificação acima é baseado em microRNA, pois muitos miRNAs são encontrados como reguladores que controlam a expressão de pontos de verificação imunes (Dragomir et al., Cancer Biol Med. 2018, 15 (2): 103 a 115). Em algumas modalidades, os miRNAs antagônicos do ponto de verificação incluem, mas não estão limitados a, miR-28, miR-15/16, miR-138, miR-342, miR-20b, miR-21, miR-130b, miR- 34a, miR-197, miR-200c, miR-200, miR-17-5p, miR-570, miR-424, miR-155, miR-574-3p, miR-513 e miR-29c.
[000192] Algumas modalidades da terapia de combinação com as células NK ou T derivadas fornecidas compreendem pelo menos um inibidor de ponto de verificação para alvejar pelo menos uma molécula de ponto de verificação; em que as células derivativas têm um genótipo listado na Tabela 1. Algumas outras modalidades da terapia de combinação com as células NK ou T derivativas fornecidas compreendem dois, três ou mais inibidores de ponto de verificação, de modo que duas, três ou mais moléculas de ponto de verificação sejam alvejadas. Em algumas modalidades da terapia de combinação compreendendo pelo menos um inibidor de ponto de verificação e as células derivadas com um genótipo listado na Tabela 1, o dito inibidor de ponto de verificação é um anticorpo, ou uma variante ou fragmento humanizado ou modificado por Fc, ou um equivalente funcional ou biossimilar do mesmo, e o dito inibidor do ponto de verificação é produzido pelas células derivadas expressando uma sequência polinucleotídica exógena que codifica o dito anticorpo, ou um fragmento ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica exógena que codifica o anticorpo, ou um fragmento ou uma variante do mesmo que inibe um ponto de verificação, é coexpressa com um CAR, em construtos separados ou em um construto bicistrônico que compreende CAR e a sequência que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo.
Em algumas modalidades adicionais, a sequência que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser ligada à extremidade 5’ ou 3’ de um construto de expressão de CAR através de uma sequência de codificação 2A autoclivável, ilustrada como, por exemplo, CAR- 2A-CI ou CI-2A-CAR.
Como tal, as sequências de codificação do inibidor do ponto de verificação e o CAR estão em um único quadro de leitura aberta (ORF). Quando o inibidor do ponto de verificação é entregue, expresso e secretado como uma carga útil pelas células efetoras derivativas capazes de se infiltrar no microambiente do tumor (TME), ele neutraliza a molécula de ponto de verificação inibitória ao engatar no TME, permitindo a ativação das células efetoras, ativando modalidades como CAR ou receptores de ativação.
Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação coexpresso com CAR inibe pelo menos uma das moléculas de ponto de verificação: PD-1, PDL-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, CTLA-4, 2B4, 4-1BB, 4-1BBL, A2aR, BATE, BTLA, CD39 (Entpdl), CD47, CD73 (NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2 (Pou2f2), receptor-alfa de ácido retinoico (Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E e KIR inibitório.
Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação coexpresso com CAR em uma célula derivativa que tem um genótipo listado na Tabela 1 é selecionado a partir do grupo que compreende atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, tremelimumabe, ipilimumabe, IPH4102, IPH43, IPH33, lirimumabe, monalizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, e suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas, fragmentos e seus equivalentes funcionais ou biossimilares.
Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação coexpresso com CAR é atezolizumabe, ou suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas, fragmentos ou seus equivalentes funcionais ou biossimilares.
Em algumas outras modalidades, o inibidor de ponto de verificação coexpresso com CAR é nivolumabe, ou suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas, fragmentos ou seus equivalentes funcionais ou biossimilares. Em algumas outras modalidades, o inibidor de ponto de verificação coexpresso com CAR é pembrolizumabe, ou suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas, fragmentos ou seus equivalentes funcionais ou biossimilares.
[000193] Em algumas outras modalidades da terapia de combinação que compreende as células derivativas fornecidas no presente documento e pelo menos um anticorpo que inibe uma molécula de ponto de verificação, o dito anticorpo não é produzido pelas células derivativas, ou nas células derivativas, e é adicionalmente administrado antes, com ou após a administração das células derivativas com um genótipo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, a administração de um, dois, três ou mais inibidores de ponto de verificação em uma terapia de combinação com as células NK ou T derivativas fornecidas é simultânea ou sequencial. Em uma modalidade do tratamento de combinação que compreende células NK ou células T derivadas que têm um genótipo listado na Tabela 1, o inibidor de ponto de verificação incluído no tratamento é um ou mais dentre atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, tremelimumabe, ipilimumabe, IPH4102, IPH43, IPH33, lirimumabe, monalizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, e suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas e seus equivalentes funcionais ou biossimilares. Em algumas modalidades do tratamento de combinação que compreende células NK ou células T derivadas que têm um genótipo listado na Tabela 1, o inibidor de ponto de verificação incluído no tratamento é atezolizumabe, ou sua variante modificada por Fc ou humanizada, fragmento e seu equivalente funcional ou biossimilar. Em algumas modalidades do tratamento de combinação que compreende células NK ou células T derivadas que têm um genótipo listado na Tabela 1, o inibidor de ponto de verificação no tratamento é nivolumabe, ou sua variante modificada por Fc ou humanizada, fragmento ou seu equivalente funcional ou biossimilar. Em algumas modalidades do tratamento de combinação que compreende células NK ou células T derivadas que têm um genótipo listado na Tabela 1, o inibidor de ponto de verificação incluído no tratamento é pembrolizumabe, ou sua variante modificada por Fc ou humanizada, fragmento ou seu equivalente funcional ou biossimilar. II. MÉTODOS PARA EDIÇÃO DE GENOMA ALVEJADA NO LÓCUS SELECIONADO EM iPSCS
[000194] A edição de genoma, ou edição genômica, ou edição genética, conforme utilizado no presente documento de forma intercambiável, é um tipo de modificação genética na qual o DNA é inserido, deletado e/ou substituído no genoma de uma célula-alvo. A edição alvejada de genoma (intercambiável com “edição genômica alvejada” ou “edição genética alvejada”) permite a inserção, deleção e/ou substituição em sítios pré- selecionados no genoma. Quando uma sequência endógena é deletada no sítio de inserção durante a edição alvejada, um gene endógeno que compreende a sequência afetada pode ser submetido a knockout ou submetido a knockdown devido à deleção de sequência. Portanto, a edição alvejada também pode ser usada para interromper a expressão de genes endógenos com precisão. Similarmente usado neste documento é o termo "integração alvejada", referindo-se a um processo que envolve a inserção de uma ou mais sequências exógenas, com ou sem deleção de uma sequência endógena no sítio de inserção. Em comparação, genes aleatoriamente integrados estão sujeitos a efeitos de posição e silenciamento, tornando sua expressão não confiável e imprevisível. Por exemplo, centrômeros e regiões subteloméricas são particularmente propensas ao silenciamento de transgene. Reciprocamente, genes recém-integrados podem afetar os genes endógenos e a cromatina circundantes, potencialmente alterando o comportamento celular ou favorecendo a transformação celular. Portanto, a inserção de DNA exógeno em um lócus pré-selecionado, como um lócus de porto seguro ou porto seguro genômico (GSH), é importante para segurança, eficiência, controle de número de cópias e para o controle confiável de resposta de genes.
[000195] A edição alvejada pode ser alcançada por uma abordagem independente de nuclease ou por uma abordagem dependente de nuclease. Na abordagem de edição alvejada independente de nuclease, a recombinação homóloga é guiada por sequências homólogas que flanqueiam um polinucleotídeo exógeno a ser inserido, através da maquinaria enzimática da célula hospedeira.
[000196] Como alternativa, a edição alvejada pode ser alcançada com maior frequência através da introdução específica de quebras de cadeia dupla (DSBs) por endonucleases de corte raro específicas. Essa edição alvejada dependente de nuclease utiliza mecanismos de reparo de DNA, incluindo junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que ocorre em resposta às DSBs. Sem um vetor doador contendo material genético exógeno, a NHEJ frequentemente leva a inserções ou deleções (in/dels) aleatórias de um pequeno número de nucleotídeos endógenos. Em comparação, quando um vetor doador contendo material genético exógeno flanqueado por um par de braços de homologia está presente, o material genético exógeno pode ser introduzido no genoma durante o reparo direcionado à homologia (HDR) por recombinação homóloga, resultando em uma “integração alvejada”.
[000197] As endonucleases disponíveis capazes de introduzir DSBs específicas e alvejadas incluem, porém sem limitação, nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN), sistemas de CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) guiados por RNA. Além disso, o sistema DICE (troca de cassetes de integrase dupla) utilizando integrase phiC31 e Bxb1 também é uma ferramenta promissora para integração alvejada.
[000198] As ZFNs são nucleases alvejadas que compreendem uma nuclease fundida com um domínio de aglutinação ao DNA do dedo de zinco. Por um "domínio de aglutinação ao DNA do dedo de zinco" ou "ZFBD", entende-se um domínio polipeptídico que aglutina o DNA de uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco. Um dedo de zinco é um domínio de cerca de 30 aminoácidos no domínio de aglutinação do dedo de zinco cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. Exemplos de dedos de zinco incluem, mas não se limitando a, C2H2 dedos de zinco, C3H dedos de zinco, e C4 dedos de zinco. Um domínio de dedo de zinco "projetado" é um domínio que não ocorre na natureza, cujo projeto/composição resulta principalmente de critérios racionais, por exemplo, aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP e dados de aglutinação existentes. Consultar, por exemplo, Patente US Nº s 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; consultar também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. Um domínio de dedo de zinco "selecionado" é um domínio não encontrado na natureza cuja produção resulta principalmente de um processo empírico, como exibição de fagos, interceptação de interação ou seleção híbrida. As ZFNs são descritas em mais detalhes na Patente US Nº
7.888.121 e Patente US nº 7.972.854, cujas divulgações completas são incorporadas neste documento a título de referência. O exemplo mais reconhecido de uma ZFN na técnica é uma fusão da nuclease FokI com um domínio de aglutinação ao DNA do dedo de zinco.
[000199] Uma TALEN é uma nuclease alvejada que compreende uma nuclease fundida com um domínio de aglutinação ao DNA efetor de TAL. Por "domínio de aglutinação ao DNA efetor do tipo ativador da transcrição", "domínio de aglutinação ao DNA efetor da TAL" ou "domínio de aglutinação ao DNA de TALE" entende-se o domínio polipeptídico das proteínas efetoras da TAL que é responsável pela aglutinação da proteína efetiva de TAL ao DNA. As proteínas efetoras de TAL são secretadas por patógenos vegetais do gênero Xanthomonas durante a infecção. Essas proteínas entram no núcleo da célula da planta, aglutinam-se a sequências de DNA específicas do efetor através de seu domínio de aglutinação a DNA e ativam a transcrição de genes nessas sequências por meio de seus domínios de transativação. A especificidade do domínio de aglutinação ao DNA efetor de TAL depende de um número variável de efetores de repetições imperfeitas de 34 aminoácidos, que compreendem polimorfismos em posições de repetição selecionadas, chamadas de repetições de dirresíduos variáveis (RVD). As TALENs são descritas em mais detalhes no Pedido de Patente US No. 2011/0145940, que é incorporado neste documento a título de referência. O exemplo mais reconhecido de uma TALEN na técnica é um polipeptídeo de fusão da nuclease FokI com um domínio de aglutinação ao DNA efetor de TAL.
[000200] Outro exemplo de uma nuclease alvejada que encontra uso nos métodos em questão é uma nuclease Spo11 alvejada, um polipeptídeo que compreende um polipeptídeo Spo11 com atividade de nuclease fundida com um domínio de aglutinação a DNA, por exemplo, um domínio de aglutinação a DNA de dedo de zinco, um domínio de aglutinação a DNA efetor de TAL, etc. que tenha especificidade para uma sequência de DNA de interesse. Consultar, por exemplo, o Pedido US nº 61/555.857, cuja divulgação é incorporada ao presente documento a título de referência.
[000201] Exemplos adicionais de nucleases alvejadas específicas que sejam adequadas para a presente invenção incluem, mas não se limitando a Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 e Wβ/SPBC/TP901-1, sejam utilizadas individualmente ou em combinação.
[000202] Outros exemplos não limitantes de nucleases alvejadas incluem nucleases de ocorrência natural e recombinantes; nucleases relacionadas a CRISPR de famílias incluindo cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm e cmr; endonucleases de restrição; meganucleases; endonucleases de homing e similares.
[000203] Como um exemplo exemplificativo, CRISPR/Cas9 requer dois componentes principais: (1) uma endonuclease Cas9 e (2) o complexo crRNA-tracrRNA. Quando coexpressos, os dois componentes formam um complexo que é recrutado para uma sequência de DNA alvo que compreende PAM e uma região de semeadura próxima a PAM.
O crRNA e o tracrRNA podem ser combinados para formar um RNA guia quimérico (gRNA) para guiar Cas9 para alvejar as sequências selecionadas. Estes dois componentes podem, então, ser entregues às células de mamíferos por transfecção ou transdução.
[000204] A inserção mediada por DICE usa um par de recombinases, por exemplo, phiC31 e Bxb1, para fornecer integração unidirecional de um DNA exógeno que é fortemente restrito aos próprios sítios de reconhecimento de attB e attP pequenos de cada enzima. Como esses sítios alvo att não estão naturalmente presentes nos genomas de mamíferos, eles devem ser introduzidos primeiro no genoma, no sítio de integração desejado. Consultar, por exemplo, a Publicação de Pedido US Nº 2015/0140665, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência.
[000205] Um aspecto da presente invenção fornece um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos para integração do genoma alvejada. Em uma modalidade, o construto compreende ainda um par de braços homólogos específicos para um sítio de integração desejado, e o método de integração alvejada compreende a introdução do construto nas células para permitir a recombinação homóloga específica de sítio pelas máquinas enzimáticas de hospedeiro celular. Em outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um cassete de expressão de ZFN que compreende um domínio de aglutinação ao DNA específico para um sítio de integração desejado à célula para permitir uma inserção mediada por ZFN. Em ainda outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um cassete de expressão de TALEN que compreende um domínio de aglutinação ao DNA específico para um sítio de integração desejado à célula para permitir uma inserção mediada por TALEN.
Em outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula, a introdução de um cassete de expressão de Cas9 e um gRNA que compreende uma sequência-guia específica para um sítio de integração desejado na célula para permitir uma inserção mediada por Cas9. Em ainda outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais sítios de att de um par de recombinases DICE para um sítio de integração desejado na célula, a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um cassete de expressão para recombinases DICE, para permitir a integração de alvejamento mediada por DICE.
[000206] Sítios promissores para integração alvejada incluem, mas sem limitação, lócus de porto seguros ou porto seguro genômico (GSH), que são regiões intragênicas ou extragênicas do genoma humano que, teoricamente, têm capacidade para acomodar a expressão previsível de DNA recém-integrado sem efeitos adversos na célula ou organismo hospedeiro. Um porto seguro útil deve permitir a expressão de transgene suficiente para produzir os níveis desejados da proteína codificada por vetor ou RNA não codificante. Um porto seguro também não deve predispor as células à transformação maligna nem alterar as funções celulares. Para que um sítio de integração seja um potencial lócus de porto seguro, é ideal que ele atenda a critérios, incluindo, mas não limitados a: ausência de interrupção de elementos ou genes reguladores, conforme julgado pela anotação de sequência; seja uma região intergênica em uma área densa de genes ou um local na convergência entre dois genes transcritos em direções opostas; mantenha distância para minimizar a possibilidade de interações de longo alcance entre ativadores da transcrição codificados por vetor e os promotores de genes adjacentes, particularmente genes relacionados ao câncer e microRNA; e possua atividade transcricional aparentemente onipresente, como refletido por amplos padrões de expressão de etiqueta de sequência expressa espacial e temporal (EST), indicando atividade transcricional onipresente. Esse último recurso é especialmente importante em células-tronco, em que durante a diferenciação, a remodelação de cromatina normalmente leva ao silenciamento de alguns locais e à ativação potencial de outros. Dentro da região adequada para inserção exógena, um lócus preciso escolhido para inserção deve ser desprovido de elementos repetitivos e sequências conservadas e para os quais os iniciadores para amplificação dos braços de homologia possam ser facilmente projetados.
[000207] Sítios apropriados para a edição do genoma humano, ou especificamente, a integração alvejada, incluem, mas não estão limitados ao sítio de vírus adenoassociados 1 (AAVS1), o lócus do gene do receptor 5 da quimiocina (motivo CC) (CCR5) e o ortólogo humano do lócus ROSA26 de camundongo. Além disso, o ortólogo humano do lócus H11 de camundongo também pode ser um sítio adequado para inserção usando a composição e o método de integração alvejada divulgados neste documento. Além disso, os lócus de genes de colágeno e HTRP também podem ser usados como porto seguro para a integração alvejada. No entanto, a validação de cada sítio selecionado demonstrou ser necessária, especialmente em células-tronco para eventos específicos de integração, e a otimização da estratégia de inserção, incluindo eleição do promotor, sequência e arranjo de genes exógenos e projeto de construto são frequentemente necessários.
[000208] Para in/dels alvejadas, o sítio de edição é geralmente compreendido em um gene endógeno cuja expressão e/ou função se destina a ser interrompida. Em uma modalidade, o gene endógeno que compreende uma inserção/deleção alvejada está associado à regulação e modulação da resposta imune. Em algumas outras modalidades, o gene endógeno que compreende uma inserção/deleção alvejada está associado à modalidade de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, candidatos a alvos de fármacos, regulação e modulação da resposta imune ou proteínas que suprimem o enxerto, diapedese, homing, a viabilidade, a autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência de células- tronco e/ou células progenitoras e células derivadas das mesmas.
[000209] Como tal, um aspecto da presente invenção fornece um método de integração alvejada em um lócus selecionado, que inclui porto seguro do genoma ou um lócus pré-selecionado conhecido ou comprovadamente seguro e bem regulado para a expressão gênica contínua ou temporal, como o lócus de B2M, TAP1, TAP2 ou tapasina, conforme fornecido neste documento. Em uma modalidade, o porto seguro do genoma para o método de integração alvejada compreende um ou mais sítios de integração desejados que compreendem AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma. Em uma modalidade, o método de integração alvejada em uma célula que compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um construto que compreende um par de braços homólogos específico a um sítio de integração desejado e uma ou mais sequências exógenas, para ativar a recombinação homóloga específica do sítio pela maquinaria enzimática do hospedeiro celular, em que o sítio de integração desejado compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma.
[000210] Em outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um cassete de expressão de ZFN que compreende um domínio de aglutinação ao DNA específico a um sítio de integração desejado à célula para permitir uma inserção mediada por ZFN, em que o sítio de integração desejado compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma. Em ainda outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e a introdução de um cassete de expressão de TALEN que compreende um domínio de aglutinação ao DNA específico a um sítio de integração desejado na célula para permitir uma inserção mediada por TALEN, em que o sítio de integração desejado compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma. Em outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula, a introdução de um cassete de expressão de Cas9 e um gRNA que compreende uma sequência guia específica para um sítio de integração desejado na célula para permitir uma inserção mediada por Cas9, em que o sítio de integração desejado compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma. Em ainda outra modalidade, o método de integração alvejada em uma célula compreende a introdução de um construto que compreende um ou mais sítios att de um par de DICE recombinases a um sítio de integração desejado na célula, a introdução de um construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos à célula e introdução de um cassete de expressão para DICE recombinases, para permitir a integração alvejada mediada por DICE, em que o sítio de integração desejado compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma.
[000211] Além disso, conforme fornecido neste documento, o método acima para integração alvejada em um porto seguro é usado para inserir qualquer polinucleotídeo de interesse, por exemplo, polinucleotídeos que codificam proteínas de comutação de segurança, modalidade de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos e proteínas que promovem enxerto, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência de células-tronco e/ou células progenitoras. Em algumas outras modalidades, o construto que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos compreende ainda um ou mais genes marcadores. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno em um construto da invenção é um gene suicida que codifica a proteína de comutação de segurança. Os sistemas de genes suicidas adequados para a morte celular induzida incluem, mas não se limitam à Caspase 9 (ou caspase 3 ou 7) e AP1903; timidina cinase (TK) e ganciclovir (GCV); citosina desaminase (CD) e 5-fluorocitosina (5-FC). Além disso, alguns sistemas genéticos suicidas são específicos do tipo celular, por exemplo, a modificação genética de linfócitos T com a molécula de célula B CD20 permite sua eliminação após a administração de mAb Rituximabe. Além disso, o epítopo que contém EGFR modificado reconhecido pelo cetuximabe pode ser usado para depletar células geneticamente modificadas quando as células são expostas ao cetuximabe. Como tal, um aspecto da invenção fornece um método de integração alvejada de um ou mais genes suicidas que codificam proteínas de comutação de segurança selecionadas a partir de caspase 9 (caspase 3 ou 7), timidina cinase, citosina desaminase, EGFR modificado e CD20 de células B.
[000212] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos exógenos integrados pelo método no presente documento são conduzidos por promotores exógenos ligados operacionalmente compreendidos no construto para integração alvejada. Os promotores podem ser induzíveis ou construtivos e podem ser específicos temporal, tecidular ou de tipo celular. Os promotores construtivos adequados para os métodos da invenção incluem, mas não se limitam a, citomegalovírus (CMV), fator de alongamento 1α (EF1α), fosfoglicerato quinase (PGK), intensificador híbrido de CMV/β-actina de frango (CAG) e promotores de ubiquitina C (UBC). Em uma modalidade, o promotor exógeno é CAG.
[000213] Os polinucleotídeos exógenos integrados pelo método descrito neste documento podem ser acionados por promotores endógenos no genoma do hospedeiro, no sítio de integração. Em uma modalidade, o método da invenção é usado para integração alvejada de um ou mais polinucleotídeos exógenos no lócus AAVS1 no genoma de uma célula. Em uma modalidade, pelo menos um polinucleotídeo integrado é acionado pelo promotor de AAVS1 endógeno. Em outra modalidade, o método da invenção é usado para integração alvejada no lócus ROSA26 no genoma de uma célula. Em uma modalidade, pelo menos um polinucleotídeo integrado é acionado pelo promotor de ROSA26 endógeno. Ainda em outra modalidade, o método da invenção é usado para integração alvejada no lócus H11 no genoma de uma célula. Em uma modalidade, pelo menos um polinucleotídeo integrado é acionado pelo promotor de H11 endógeno. Em outra modalidade, o método da invenção é utilizado para integração alvejada no lócus do colágeno no genoma de uma célula. Em uma modalidade, pelo menos um polinucleotídeo integrado é acionado pelo promotor de colágeno endógeno. Ainda em outra modalidade, o método da invenção é usado para integração alvejada no lócus HTRP no genoma de uma célula. Em uma modalidade, pelo menos um polinucleotídeo integrado é acionado pelo promotor de HTRP endógeno. Teoricamente, apenas inserções corretas no local desejado permitiriam a expressão gênica de um gene exógeno acionado por um promotor endógeno.
[000214] Em algumas modalidades, o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendidos no construto para os métodos de integração alvejada são acionados por um promotor. Em algumas modalidades, o construto compreende uma ou mais sequências de ligante entre dois polinucleotídeos adjacentes acionados pelo mesmo promotor para fornecer maior separação física entre as porções e maximizar a acessibilidade à maquinaria enzimática. O peptídeo ligante das sequências de ligantes pode consistir em aminoácidos selecionados para fazer a separação física entre as porções (polinucleotídeos exógenos e/ou a proteína ou peptídeo codificado a partir do mesmo) mais flexíveis ou mais rígidas, dependendo da função relevante.
A sequência do ligante pode ser clivável por uma protease ou quimicamente clivável para produzir porções separadas.
Exemplos de sítios de clivagem enzimática no ligante incluem sítios de clivagem por uma enzima proteolítica, como enterocinase, fator Xa, tripsina, colagenase e trombina.
Em algumas modalidades, a protease é uma que é produzida naturalmente pelo hospedeiro ou é introduzida exogenamente.
Alternativamente, o sítio de clivagem no ligante pode ser um sítio capaz de ser clivado após exposição a um produto químico selecionado, por exemplo, brometo de cianogênio, hidroxilamina ou pH baixo.
A sequência do ligante opcional pode servir a um propósito diferente do fornecimento de um sítio de clivagem.
A sequência do ligante deve permitir o posicionamento eficaz da porção química em relação a outra porção química adjacente para que as porções químicas funcionem adequadamente.
O ligante também pode ser uma sequência simples de aminoácidos com um comprimento suficiente para impedir qualquer impedimento estérico entre as porções.
Além disso, a sequência do ligante pode fornecer modificação pós-tradução, que inclui, mas não se limita a, por exemplo, sítios de fosforilação, sítios de biotinilação, sítios de sulfatação, sítios de γ-carboxilação e similares.
Em algumas modalidades, a sequência do ligante é flexível, de modo a não reter o peptídeo biologicamente ativo em uma única conformação indesejada.
O ligante pode ser predominantemente composto de aminoácidos com pequenas cadeias laterais, como glicina, alanina e serina, para fornecer flexibilidade.
Em algumas modalidades, cerca de 80 ou 90% ou mais da sequência ligante compreende resíduos de glicina, alanina ou serina, particularmente resíduos de glicina e serina.
Em várias modalidades, um peptídeo ligante G4S separa os domínios de processamento final e endonuclease da proteína de fusão.
Em outras modalidades, uma sequência ligante 2A permite que duas proteínas separadas sejam produzidas a partir de uma única tradução.
Sequências de ligantes adequadas podem ser prontamente identificadas empiricamente.
Além disso, o tamanho e as sequências adequados das sequências de ligante também podem ser determinados por técnicas convencionais de modelagem por computador. Em uma modalidade, a sequência ligante codifica um peptídeo de autoclivagem. Em uma modalidade, o peptídeo de autoclivagem é 2A. Em algumas outras modalidades, a sequência do ligante fornece uma Sequência Interna de Entrada de Ribossomo (IRES). Em algumas modalidades, quaisquer duas sequências de ligantes consecutivas são diferentes.
[000215] O método de introdução nas células de um construto que compreende polinucleotídeos exógenos para integração alvejada pode ser alcançado com o uso de um método de transferência de genes para células conhecido per se. Em uma modalidade, o construto compreende estrutura principal de vetores virais, como vetor de adenovírus, vetor de vírus adenoassociado, vetor de retrovírus, vetor de lentivírus, vetor de vírus Sendai. Em algumas modalidades, os vetores plasmídicos são usados para entregar e/ou expressar os polinucleotídeos exógenos nas células alvo (por exemplo, pAl-11, pXTl, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) e similares. Em algumas outras modalidades, o vetor epissomal é usado para entregar o polinucleotídeo exógeno às células alvo. Em algumas modalidades, os vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) podem ser usados para modificação genética para introduzir inserções, deleções ou substituições por meio de recombinações homólogas. Ao contrário dos lentivírus, os rAAVs não se integram ao genoma do hospedeiro. Além disso, os vetores rAAV epissomais medeiam o alvejamento de genes direcionados à homologia a taxas muito mais altas em comparação com a transfecção de plasmídeos de alvejamento convencionais. Em algumas modalidades, um vetor AAV6 ou AAV2 é usado para introduzir inserções, deleções ou substituições em um sítio alvo no genoma de iPSCs. Em algumas modalidades, as iPSCs genomicamente modificadas e suas células derivativas obtidas com o uso dos métodos e composição do presente documento compreendem pelo menos um genótipo listado na Tabela 1.
III. MÉTODO DE OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DE iPSCS GENOMICAMENTE MODIFICADAS
[000216] A presente invenção fornece um método para obter e manter iPSCs genomicamente modificadas, que compreendem uma ou mais edições alvejadas em um ou mais sítios desejados, em que a edição alvejada permanece intacta e funcional em iPSCs genomicamente modificadas expandidas ou nas células não pluripotentes derivadas de iPSCs no respectivo sítio de edição selecionado. A edição alvejada introduz no genoma iPSC e células derivadas da mesma, inserções, deleções e/ou substituições, isto é, integração alvejada e/ou in/dels nos sítios selecionados. Em comparação com as células efetoras primárias originadas por sangue periférico, originadas pelo paciente, de modificação direta, os muitos benefícios de obter células derivadas modificadas genomicamente por meio da edição e diferenciação da iPSC conforme fornecidas neste documento incluem, mas não estão limitados a: fonte ilimitada para células efetoras modificadas; não há necessidade de manipulação repetida das células efetoras, especialmente quando várias modalidades modificadas estão envolvidas; as células efetoras obtidas são rejuvenescidas por terem telômeros alongados e experimentarem menos exaustão; a população de células efetoras é homogênea em termos de sítio de edição, número de cópias e ausência de variação alélica, mutações aleatórias e variegação de expressão, em grande parte devido à seleção clonal permitida em iPSCs modificadas, conforme fornecido neste documento.
[000217] Em modalidades particulares, as iPSCs modificadas genomicamente que compreendem uma ou mais edições alvejadas em um ou mais sítios selecionados são mantidas, passadas e expandidas como células únicas por um período prolongado no meio de cultura de células mostrado na Tabela 2 como Meio de Manutenção do Destino (FMM), em que as iPSCs retêm a edição alvejada e a modificação funcional no sítio (ou sítios) selecionado. Os componentes do meio podem estar presentes no meio em quantidades dentro de uma faixa ideal mostrada na Tabela 2. Demonstrou-
se que as iPSCs cultivadas no FMM continuam mantendo seu perfil indiferenciado, ground ou naïve; estabilidade genômica sem a necessidade de limpeza ou seleção de cultura; e devem dar facilmente origem às três linhagens somáticas, diferenciação in vitro via corpos embrioides ou monocamada (sem formação de corpos embrioides); e diferenciação in vivo por formação de teratoma.
Consultar, por exemplo, o Pedido US nº 61/947.979, cuja divulgação é incorporada ao presente documento a título de referência.
TABELA 2: MEIOS EXEMPLIFICATIVOS PARA REPROGRAMAÇÃO E MANUTENÇÃO DE iPSC Meio de hESC Meio de Reprogramação Meio de Manutenção de Convencional (Conv.) de Destino (FRM) Destino (FMM) DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12 Substituição de Soro de Substituição de Soro de Substituição de Soro de Knockout (20%) Knockout (20%) Knockout (20%) N2 B27 Glutamina Glutamina Glutamina (1x) Aminoácidos Não Aminoácidos Não Aminoácidos Não Essenciais (1x) Essenciais (1x) Essenciais (1x) β-mercaptoetanol β-mercaptoetanol β-mercaptoetanol (100 µM) (100 µM) (100 µM) bFGF (0,2 a 50 ng/ml) bFGF (2 a 500 ng/ml) bFGF (2 a 500 ng/ml) LIF (0,2 a 50 ng/ml) LIF (0,2 a 50 ng/ml) Tiazovivina (0,1 a 25 µM) Tiazovivina (0,1 a 25 µM) PD0325901 PD0325901 (0,005 a 2 µM) (0,005 a 2 µM) CHIR99021 (0,02 a 5 µM) CHIR99021 (0,02 a 5 µM) SB431542 (0,04 a 10 µM) Em combinação com Sem alimentador, em combinação com Matrigel™ células alimentadoras de ou Vitronectina
MEF
[000218] Em algumas modalidades, as iPSCs genomicamente modificadas que compreendem uma ou mais in/dels e/ou integrações alvejadas são mantidas, passadas e expandidas em um meio que compreende um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK e livre de, ou essencialmente livre de, inibidores de receptor de TGFβ/ALK5,
em que as iPSCs retêm a edição alvejada intacta e funcional nos sítios selecionados.
[000219] Outro aspecto da invenção fornece um método para gerar iPSCs genomicamente modificadas através da edição alvejada de iPSCs; ou através, primeiro, da primeira geração de células não pluripotentes genomicamente modificadas por edição alvejada e, em seguida, pela reprogramação das células não pluripotentes genomicamente modificadas selecionadas/isoladas para obter iPSCs que compreendem a mesma edição alvejada das células não pluripotentes. Um aspecto adicional da invenção fornece células não pluripotentes com modificação genômica que estão passando por reprogramação ao introduzir in/dels alvejadas e/ou integração alvejada para as células, em que as células não pluripotentes contatadas estão sob condições suficientes para reprogramação e em que as condições para reprogramação compreendem o contato de células não pluripotentes com um ou mais fatores de reprogramação e moléculas pequenas. Em várias modalidades do método para modificação de genoma e reprogramação simultâneas, a in/dels de alvejamento e/ou integrações de alvejamento podem ser introduzidas nas células não pluripotentes antes ou, essencialmente, simultaneamente com o início da reprogramação colocando-se as células não pluripotentes em contato com um ou mais fatores de reprogramação e, opcionalmente, moléculas pequenas.
[000220] Em algumas modalidades, para modificar o genoma e reprogramar simultaneamente células não pluripotentes, a integração e/ou in/dels alvejadas também podem ser introduzidas nas células não pluripotentes depois que o processo de reprogramação de vários dias é iniciado, colocando as células não pluripotentes em contato com um ou mais fatores de reprogramação e moléculas pequenas, e em que os vetores que transportam os construtos são introduzidos antes de as células de reprogramação apresentarem expressão estável de um ou mais genes pluripotentes endógenos, incluindo, mas não limitados a, SSEA4, Tra181 e CD30.
[000221] Em algumas modalidades, a reprogramação é iniciada colocando-se as células não pluripotentes em contato com pelo menos um fator de reprogramação e, opcionalmente, uma combinação de um receptor de TGFβ/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK (FRM; Tabela 2). Em algumas modalidades, as iPSCs modificadas genomicamente através de qualquer método acima são ainda mantidas e expandidas com o uso de uma mistura que compreende uma combinação de um inibidor da MEK, um inibidor da GSK3 e um inibidor da ROCK (FMM; Tabela 2).
[000222] Em algumas modalidades do método de geração de iPSCs modificadas genomicamente, o método compreende: modificação genômica de uma iPSC introduzindo uma ou mais integraçõese/ou in/dels alvejadas em iPSCs para obter iPSCs genomicamente modificadas com pelo menos um genótipo listado na Tabela 1. Alternativamente, o método de gerar iPSCs genomicamente modificadas compreende: (a) introduzir uma ou mais edições alvejadas em células não pluripotentes para obter células não pluripotentes genomicamente modificadas que compreendem integração e/ou in/dels alvejada em sítios selecionados, e (b) colocar as células não pluripotentes genomicamente modificadas em contato com um ou mais fatores de reprogramação e, opcionalmente, uma composição de molécula pequena que compreende um receptor de TGFβ/inibidor da ALK, um inibidor da MEK, um inibidor da GSK3 e/ou um inibidor da ROCK, para obter iPSCs genomicamente modificadas que incluem integração e/ou in/dels avejada em sítios selecionados. Alternativamente, o método para gerar iPSCs genomicamente modificadas compreende: (a) colocar células não pluripotentes em contato com um ou mais fatores de reprogramação e, opcionalmente, uma composição de molécula pequena que compreende um receptor de TGFβ/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e/ou um inibidor de ROCK para iniciar a reprogramação das células não pluripotentes; (b) introduzir uma ou mais dentre integração e/ou in/dels alvejadas nas células não pluripotentes de reprogramação para modificação de genoma; e (c) obter iPSCs genomicamente modificadas clonal que compreende integração e/ou in/dels alvejadas em sítios selecionados.
[000223] Os fatores de reprogramação são selecionados a partir do grupo que consiste em OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, SV40LT, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3, L1TD1 e quaisquer combinações dos mesmos, conforme divulgado nos documentos PCT/US2015/018801 e PCT/US16/57136, cujas divulgações são incorporadas ao presente documento a título de referência. O um ou mais fatores de reprogramação podem estar sob a forma de polipeptídeo. Os fatores de reprogramação também podem estar na forma de polinucleotídeos e, assim, são introduzidos nas células não pluripotentes por vetores como retrovírus, vírus Sendai, adenovírus, epissoma, plasmídeo e minicírculo. Em modalidades particulares, os um ou mais polinucleotídeos que codificam pelo menos um fator de reprogramação são introduzidos por um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, os um ou mais polinucleotídeos introduzidos por um vetor epissomal. Em várias outras modalidades, os um ou mais polinucleotídeos são introduzidos por um vetor viral de Sendai. Em algumas modalidades, os um ou mais polinucleotídeos introduzidos por uma combinação de plasmídeos. Consultar, por exemplo, o Pedido US Nº 62/571.105, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência.
[000224] Em algumas modalidades, as células não pluripotentes são transferidas com múltiplos construtos que compreendem diferentes polinucleotídeos exógenos e/ou diferentes promotores por vários vetores para integração alvejada no mesmo ou em diferentes sítios selecionados. Esses polinucleotídeos exógenos podem compreender um gene suicida, ou um gene que codifica modalidade de alvejamento, receptores,
moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos ou um gene que codifica uma proteína que promove enxerto, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência das iPSCs ou células derivadas das mesmas.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos exógenos codificam RNA, incluindo, mas não se limitando a siRNA, shRNA, miRNA e ácidos nucleicos antissenso.
Esses polinucleotídeos exógenos podem ser acionados por um ou mais promotores selecionados do grupo que consiste em promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores específicos temporal e promotores específicos do tipo de tecido ou célula.
Por conseguinte, os polinucleotídeos são expressáveis quando sob condições que ativam o promotor, por exemplo, na presença de um agente indutor ou em um tipo específico de célula diferenciada.
Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são expressos em iPSCs e/ou em células diferenciadas das iPSCs.
Em uma modalidade, um ou mais genes suicidas são acionados por um promotor constitutivo, por exemplo Capase-9 acionado por CAG.
Estes construtos que compreendem diferentes polinucleotídeos exógenos e/ou diferentes promotores podem ser transferidos para células não pluripotentes simultaneamente ou consecutivamente.
As células não pluripotentes sujeitas à integração alvejada de múltiplos construtos podem entrar em contato simultaneamente com um ou mais fatores de reprogramação para iniciar a reprogramação simultaneamente com a modificação genômica, obtendo assim iPSCs modificadas genomicamente, que compreendem integração alvejada múltipla no mesmo pool de células.
Como tal, esse método robusto permite que uma estratégia de reprogramação e modificação simultânea derive um hiPSC clonal genomicamente modificado com várias modalidades integradas a um ou mais sítios alvos selecionados.
Em algumas modalidades, as iPSCs genomicamente modificadas e suas células derivativas obtidas com o uso dos métodos e composição do presente documento compreendem pelo menos um genótipo listado na Tabela 1.
IV. UM MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS EFETORAS GENETICAMENTE MODIFICADAS, DIFERENCIANDO iPSC
GENOMICAMENTE MODIFICADA
[000225] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um método de diferenciação in vivo de iPSC modificada genomicamente por formação de teratoma, em que as células diferenciadas derivadas in vivo a partir das iPSC genomicamente modificada retêm a edição alvejada intacta e funcional, incluindo integração e/ou in/dels alvejadas no sítio desejado (ou sítios desejados). Em algumas modalidades, as células diferenciadas derivadas in vivo a partir das iPSCs genomicamente modificadas por meio de um teratoma compreendem um ou genes suicidas mais induzíveis integrados em um ou mais sítios desejados que compreendem AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP H11, beta-2 microglobulina, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendam aos critérios de um porto seguro do genoma. Em algumas outras modalidades, as células diferenciadas derivadas in vivo das iPSCs genomicamente modificadas através de teratoma compreendem polinucleotídeos que codificam a modalidade de alvejamento ou que codificam proteínas que promovem diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência de células-tronco e/ou células progenitoras. Em algumas modalidades, as células diferenciadas derivadas in vivo das iPSCs genomicamente modificadas por meio de um teratoma compreendem um ou mais genes suicidas induzíveis compreendem ainda uma ou mais in/dels em genes endógenos associados à regulação e mediação da resposta imune. Em algumas modalidades, a inserção/deleção é compreendida em um ou mais genes de ponto de verificação endógenos. Em algumas modalidades, a inserção/deleção é compreendida em um ou mais genes receptores de células T endógenos. Em algumas modalidades, a inserção/deleção é compreendida em um ou mais genes supressores endógenos de MHC de classe I. Em algumas modalidades, a inserção/deleção é compreendida em um ou mais genes endógenos associados ao complexo principal de histocompatibilidade. Em algumas modalidades, a inserção/deleção é compreendida em um ou mais genes endógenos, incluindo, mas não limitado a, genes de B2M, PD1, TAP1, TAP2, Tapasina, TCR. Em uma modalidade, a iPSC modificada genomicamente que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos em sítio selcionado (ou sítios selecionados) compreende ainda uma edição alvejada no gene codificador de B2M (beta-2- microglobulina).
[000226] Em modalidades particulares, as iPSCs com genoma modificado que compreendem uma ou mais modificações genéticas conforme fornecidas neste documento são usadas para derivar linhagens celulares hematopoiéticas ou quaisquer outros tipos de células específicos in vitro, em que as células não pluripotentes derivadas retêm as modificações genéticas funcionais, incluindo edição alvejada no sítio selecionado (ou nos sítios selecionados). Em uma modalidade, as células derivadas de iPSC genomicamente modificada, que incluem, mas sem limitação, células mesodérmicas com potencial definitivo de endotélio hemogênico (HE), HE definitivo, células hematopoiéticas definitivas de CD34, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, progenitores hematopoiéticos multipotentes (MPP), progenitores de células T, progenitores de células NK, células mieloides, progenitores de neutrófilos, células T, células NKT, células NK, células B, células B, neutrófilos, células dendríticas e macrófagos, em que essas células derivadas de iPSCs modificadas genomicamente retém modificações genéticas funcionais que incluem edição alvejada no sítio desejado (ou nos sítios desejados).
[000227] Os métodos e composições de diferenciação aplicáveis para a obtenção de linhagens de células hematopoiéticas derivadas de iPSC incluem aqueles representados, por exemplo, no Pedido Internacional Nº PCT/US2016/044122, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência. Conforme fornecido, os métodos e as composições para gerar linhagens de células hematopoiéticas são por meio de endotélio hemogênico (HE) definitivo derivado de células-tronco pluripotentes, incluindo hiPSCs, sob condições sem soro, sem alimentador e/ou sem estroma e em uma plataforma de cultura monocamada e escalável sem a necessidade de formação de EB. As células que podem ser diferenciadas de acordo com os métodos fornecidos variam de células-tronco pluripotentes, para células progenitoras que são comprometidas com células terminalmente diferenciadas e células transdiferenciadas, e células de várias linhagens diretamente transferidas para o destino hematopoiético sem passar por um intermediário pluripotente. Da mesma forma, as células produzidas pela diferenciação de células-tronco variam de células-tronco multipotentes ou progenitoras, células terminalmente diferenciadas e todas as linhagens de células hematopoiéticas intervenientes.
[000228] Os métodos para diferenciar e expandir células da linhagem hematopoiética de células-tronco pluripotentes em cultura de monocamada compreendem o contato das células-tronco pluripotentes com um ativador da via BMP e, opcionalmente, bFGF. Como fornecido, as células mesodérmicas derivadas de células-tronco pluripotentes são obtidas e expandidas sem formar corpos embrionários a partir de células-tronco pluripotentes. As células mesodérmicas são então submetidas a contato com um ativador da via BMP, bFGF e um ativador da via WNT para obter células mesodérmicas expandidas com potencial definitivo de endotélio hemogênico (HE) sem formar corpos embrióides a partir das células-tronco pluripotentes. Por contato subsequente com bFGF e, opcionalmente, um inibidor de ROCK e/ou um ativador da via WNT, as células mesodérmicas com potencial HE definitivo são diferenciadas em células HE definitivas, que também são expandidas durante a diferenciação.
[000229] Os métodos fornecidos neste documento para obter células da linhagem hematopoiética são superiores à diferenciação de células-tronco pluripotentes mediada por EB, porque a formação de EB leva a uma expansão celular modesta a mínima e não permite a cultura de monocamada, que é importante para muitas aplicações que requerem expansão homogênea e diferenciação homogênea das células em uma população, e é trabalhoso e de baixa eficiência.
[000230] A plataforma de diferenciação de monocamada fornecida facilita a diferenciação em relação ao endotélio hemogênico definitivo, o que resulta na derivação de células-tronco hematopoiéticas e progênie diferenciada, como células T, B, NKT e NK. A estratégia de diferenciação de monocamada combina eficiência de diferenciação intensificada com expansão em larga escala, o que permite a entrega de um número terapeuticamente relevante de células hematopoiéticas derivadas de células-tronco pluripotentes para várias aplicações terapêuticas. Além disso, a cultura de monocamada com o uso dos métodos fornecidos neste documento leva a células de linhagem hematopoiética funcionais que permitem uma faixa completa de diferenciação in vitro, modulação ex vivo e autorrenovação, reconstituição e enxerto hematopoiético de longo prazo in vivo. Conforme fornecido, as células da linhagem hematopoiética derivadas da iPSC incluem, mas não se limitam a, endotélio hemogênico definitivo, células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras de células T, células progenitoras de células NK, células T, células NK, células NKT, células B, macrófagos e neutrófilos.
[000231] O método para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética definitiva, em que o método compreende: (i) entrar em contato com células- tronco pluripotentes com uma composição que compreende um ativador de BMP e, opcionalmente bFGF, para iniciar a diferenciação e expansão de células mesodérmicas das células-tronco pluripotentes; (ii) entrar em contato com as células mesodérmicas com uma composição que compreende um ativador de BMP, bFGF e um inibidor de GSK3, em que a composição é opcionalmente livre de receptor de TGFβ/inibidor de ALK, para iniciar a diferenciação e expansão de células mesodérmicas com potencial HE definitivo a partir de células mesodérmicas; (iii) entrar em contato com as células mesodérmicas com potencial HE definitivo com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 e IL11; e, opcionalmente, um ativador da via Wnt, em que a composição é opcionalmente livre de receptor de TGFβ/inibidor da ALK, para iniciar a diferenciação e expansão do endotélio hemogênico definitivo a partir de células mesodérmicas derivadas de células-tronco pluripotentes com potencial endotélio hemogênico definitivo.
[000232] Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato de células-tronco pluripotentes com uma composição que compreende um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK, em que a composição está livre de inibidores de receptor de TGFβ/ALK, para semear e expandir as células-tronco pluripotentes. Em algumas modalidades, as células-tronco pluripotentes são iPSCs, ou iPSCs naïve, ou iPSCs que compreendem uma ou mais impressões genéticas; e as uma ou mais impressões genéticas compreendidas na iPSC são retidas nas células hematopoiéticas diferenciadas das mesmas. Em algumas modalidades do método para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética, a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células de linhagem hematopoiética é nula para geração de corpos embrionários e está sob uma forma de cultura monocamada.
[000233] Em algumas modalidades do método acima, as células de endotélio hemogênico definitivo derivadas de células-tronco pluripotentes obtidas são CD34+. Em algumas modalidades, as células endotélio hemogênicas definitivas obtidas são CD34+CD43-. Em algumas modalidades, as células endotélio hemogênicas definitivas são CD34+CD43- CXCR4-CD73-. Em algumas modalidades, as células endotélio hemogênicas definitivas são CD34+ CXCR4-CD73-. Em algumas modalidades, as células endotélio hemogênicas definitivas são CD34+CD43-CD93-. Em algumas modalidades, as células endotélio hemogênicas definitivas são CD34+ CD93-.
[000234] Em algumas modalidades do método acima, o método compreende ainda (i) entrar em contato com o endotélio hemogênico definitivo derivado de célula-tronco pluripotente com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO e IL7; e opcionalmente um ativador de BMP; iniciar a diferenciação do endotélio hemogênico definitivo em progenitores pré-células T; e, opcionalmente, (ii) entrar em contato com os progenitores de células pré-T com uma composição que compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L e IL7, mas livre de um ou mais ativadores de VEGF, bFGF, TPO, BMP e inibidores de ROCK, para iniciar a diferenciação dos progenitores pré-células T em progenitores de células T ou células T. Em algumas modalidades do método, os progenitores de células T derivadas de células-tronco pluripotentes são CD34+CD45+CD7+. Em algumas modalidades do método, os progenitores de células T derivadas de células-tronco pluripotentes são CD45+CD7+.
[000235] Ainda em algumas modalidades do método acima para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética, o método compreende ainda: (i) contatar o endotélio hemogênico definitivo derivado de células-tronco pluripotentes com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 e IL15; e opcionalmente, um ativador de BMP, para iniciar a diferenciação do endotélio hemogênico definitivo em progenitor de células pré-NK; e, opcionalmente, (ii) entrar em contato com progenitores de células pré-NK derivadas de células-tronco pluripotentes com uma composição que compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L,
IL3, IL7 e IL15, em que o meio está livre de um ou mais ativadores de VEGF, bFGF, TPO, BMP e inibidores de ROCK, para iniciar a diferenciação dos progenitores de células pré-NK para progenitores de células NK ou células NK. Em algumas modalidades, os progenitores NK derivados de células-tronco pluripotentes são CD3-CD45+CD56+CD7+. Em algumas modalidades, as células NK derivadas de células-tronco pluripotentes são CD3-CD45+CD56+, e, opcionalmente, ainda definidas por NKp46+, CD57+ e CD16+.
[000236] Portanto, com o uso de métodos de diferenciação acima, pode-se obter uma ou mais populações de células hematopoiéticas derivadas de iPSC (i) células CD34+ HE (iCD34), uso de um ou mais meios de cultura selecionados de iMPP-A, iTC-A2, iTC -B2, iNK-A2 e iNK-B2; (ii) endotélio hemogênico definitivo (iHE), com o uso de um ou mais meios de cultura selecionados dentre iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 e iNK- B2; (iii) HSCs definitivos, com o uso de um ou mais meios de cultura selecionados de iMPP-A, iTC-A2, iTC-B2, iNK-A2 e iNK-B2; (iv) células progenitoras multipotentes (iMPP), com o uso de iMPP-A; (v) progenitores de células T (ipro-T), com o uso de um ou mais meios de cultura selecionados de iTC-A2 e iTC-B2; (vi) células T (iTC), com o uso de iTC-B2; (vii) progenitores de células NK (ipro-NK), com o uso de um ou mais meios de cultura selecionados entre iNK-A2 e iNK-B2; e/ou (viii) células NK (iNK) e iNK-B2. Em algumas modalidades, o meio:
[000237] a. iCD34-C compreende um inibidor de ROCK, um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em bFGF, VEGF, SCF, IL6, IL11, IGF e EPO e, opcionalmente, um ativador da via Wnt; e está livre de receptor de TGFβ/inibidor de ALK;
[000238] b. O iMPP-A compreende um ativador de BMP, um inibidor de ROCK e um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em TPO, IL3, GMCSF, EPO, bFGF, VEGF, SCF, IL6, Flt3L e IL11;
[000239] c. iTC-A2 compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L, TPO e IL7; e opcionalmente, um ativador de BMP;
[000240] d. iTC-B2 compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L e IL7;
[000241] e. iNK-A2 compreende um inibidor de ROCK e um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7 e IL15; e, opcionalmente, um ativador de BMP e
[000242] f. iNK-B2 compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, Flt3L, IL7 e IL15.
[000243] Em algumas modalidades, as células derivadas de iPSC modificada genomicamente obtidas a partir dos métodos acima compreendem um ou mais genes suicidas induzíveis integrados em um ou mais sítios de integração desejados, que compreende AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 ou outros lócus que atendem aos critérios de um porto seguro do genoma. Em algumas outras modalidades, as células derivadas de iPSC modificada genomicamente compreendem polinucleotídeos que codificam proteínas de comutação de segurança, modalidade de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos ou proteínas que promovem diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência de células-tronco e/ou células progenitoras. Em algumas modalidades, as células derivadas de iPSC modificada genomicamente que compreende um ou mais genes suicidas compreendem ainda uma ou mais in/del compreendidas em um ou mais genes endógenos associados à regulação e mediação da resposta imune, incluindo, mas não limitado a, ponto de verificação genes endógenos de receptores de células T e genes supressores de MHC de classe I. Em uma modalidade, as células derivadas de iPSC modificada genomicamente que compreende um ou mais genes suicidas compreendem ainda uma inserção/deleção em gene de B2M, em que a B2M é submetida a knockout.
[000244] Além disso, os métodos e composições de desdiferenciação aplicáveis para obtenção de células hematopoiéticas modificadas genomicamente de um primeiro destino para células hematopoiéticas modificadas genomicamente de um segundo destino incluem aqueles representados, por exemplo, na Publicação Internacional Nº WO2011/159726, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência. O método e a composição fornecidos neste documento permitem reprogramar parcialmente uma célula não pluripotente inicial para uma célula intermediária não pluripotente, limitando a expressão do gene Nanog endógeno durante a reprogramação; e sujeitar a célula intermediária não pluripotente a condições para diferenciar a célula intermediária em um tipo de célula desejado. Em algumas modalidades, as iPSCs genomicamente modificadas e suas células derivativas obtidas com o uso dos métodos e composição do presente documento compreendem pelo menos um genótipo listado na Tabela
1. V. USO TERAPÊUTICO DE CÉLULAS IMUNES
DERIVATIVAS COM MODALIDADES FUNCIONAIS DIFERENCIADAS DE iPSCS GENETICAMENTE MODIFICADAS
[000245] A presente invenção fornece, em algumas modalidades, uma composição que compreende uma população ou subpopulação isolada de células imunes derivativas funcionalmente intensificadas que foram diferenciadas de iPSCs geneticamente modificadas utilizando-se os métodos e as composições, conforme divulgado. Em algumas modalidades, as iPSCs compreendem uma ou mais edições genéticas alvejadas que são retidas nas células imunes derivadas de iPSC, em que as iPSCs geneticamente modificadas e as células derivativas das mesmas são adequadas para terapias adotivas baseadas em células.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células CD34 derivadas de iPSC.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células HSC derivadas de iPSC.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células proT ou T derivadas de iPSC.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células proNK ou NK derivadas de iPSC.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células reguladoras imunes derivadas de iPSC ou células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs). Em algumas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas derivadas da iPSC são ainda moduladas ex vivo para potencial terapêutico aprimorado.
Em uma modalidade, uma população ou subpopulação isolada de células imunes geneticamente modificadas que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células T naïve, células T de memória de células-tronco e/ou células T de memória central.
Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes geneticamente modificadas que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células NKT tipo I.
Em outra modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes geneticamente modificadas que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células NK adaptativas.
Em algumas modalidades, a população ou subpopulação isolada de células CD34 geneticamente modificadas, células HSC, células T, células NK ou células supressoras derivadas de mieloides derivadas de iPSC são alogênicas.
Em algumas outras modalidades, a população ou subpopulação isolada de células CD34 geneticamente modificadas, células HSC, células T, células NK ou MDSC derivadas de iPSC são autogênicas.
[000246] Em algumas modalidades, a iPSC para diferenciação compreende impressões genéticas selecionadas para transmitir atributos terapêuticos desejáveis em células efetoras, desde que a biologia do desenvolvimento celular durante a diferenciação não seja interrompida e desde que as impressões genéticas sejam retidas e funcionais nas células hematopoiéticas diferenciadas derivadas das ditas iPSC.
[000247] Em algumas modalidades, as impressões genéticas das células-tronco pluripotentes compreendem (i) uma ou mais modalidades geneticamente modificadas obtidas por inserção, deleção ou substituição genômica no genoma das células pluripotentes durante ou após a reprogramação de uma célula não pluripotente para a iPSC; ou (ii) um ou mais atributos terapêuticos retidos de uma célula imune específica da fonte que é específica para resposta ao doador, doença ou tratamento e em que as células pluripotentes são reprogramadas a partir da célula imune específica da fonte, em que a iPSC retém os atributos terapêuticos de origem, que também estão compreendidos nas células da linhagem hematopoiética derivadas da iPSC.
[000248] Em algumas modalidades, as modalidades geneticamente modificadas compreendem uma ou mais dentre: proteínas de comutação de segurança, modalidades de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos; ou proteínas que promovem enxerto, diapedese, homing, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação e modulação da resposta imune e/ou sobrevivência das iPSCs ou células derivadas das mesmas. Em algumas modalidades, a iPSC geneticamente modificada e as células derivadas da mesma compreendem um genótipo listado na Tabela 1. Em algumas outras modalidades, a iPSC geneticamente modificada e as células derivadas da mesma que compreendem um genótipo listado na Tabela 1 compreendem ainda modalidades adicionais geneticamente modificadas que compreendem (1) uma ou mais deleção ou expressão reduzida de TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5 ou RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21; e (2) expressão introduzida ou aumentada de HLA-E, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR, receptor Fc ou receptores de disparo de superfície para acoplamento com engajadores bi-, multiespecíficos ou universais.
[000249] Ainda em algumas outras modalidades, as células da linhagem hematopoiética compreendem os atributos terapêuticos da célula imune específica da fonte, relacionados a uma combinação de pelo menos dois dos seguintes itens: (i) uma ou mais expressão do receptor que alveja antígeno; (ii) HLA modificado; (iii) resistência ao microambiente tumoral; (iv) recrutamento de células imunes e modulações imunes espectadoras; (iv) especificidade aprimorada no alvo com efeito fora do tumor reduzido; e (v) homing, persistência, citotoxicidade ou resgate de escape de antígeno aprimorados.
[000250] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas derivativas de iPSC compreendem um genótipo listado na Tabela 1, e as ditas células expressam pelo menos uma citocina e/ou o seu receptor que compreende IL2, IL4, IL6, IL7, IL9, IL10, IL11, IL12, IL15, IL18, IL21 ou, ou qualquer proteína modificada da mesma e expressam pelo menos um CAR. Em algumas modalidades, a expressão geneticamente modificada da citocina (ou citocinas) e do CAR (ou CARs) é específica da célula NK. Em algumas outras modalidades, a expressão geneticamente modificada da citocina (ou citocinas) e do CAR (ou CARs) é específica para célula T. Em uma modalidade, o CAR compreende um domínio de aglutinação a CD38. Em algumas modalidades, as células efetoras hematopoiéticas derivativas de iPSC são específicas para antígeno. Em algumas modalidades, as células efetoras derivativas específicas para antígeno alvejam um tumor líquido. Em algumas modalidades, as células efetoras derivativas específicas para antígeno alvejam um tumor sólido. Em algumas modalidades, as células efetoras hematopoiéticas derivativas de iPSC específicas para antígeno têm capacidade para resgatar o escape de antígeno tumoral.
[000251] Uma variedade de doenças podem ser amenizadas através da introdução das células imunes da invenção a um sujeito adequado para terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas derivativas de iPSC, conforme fornecidas, são para terapias celulares adotivas alogênicas. Além disso, a presente invenção fornece, em algumas modalidades, uso terapêutico das composições terapêuticas acima, com a administração da composição em um sujeito adequado para terapia celular adotiva, em que o sujeito tem um distúrbio autoimune; uma malignidade hematológica; um tumor sólido; ou uma infecção associada ao poliomavírus HIV, RSV, EBV, CMV, adenovírus ou BK. Exemplos de neoplasias hematológicas incluem, mas não estão limitadas a, leucemias agudas e crônicas (leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC), linfomas, linfoma não Hodgkin (NHL), doença de Hodgkin, mieloma múltiplo e síndromes mielodisplásicas. Exemplos de cânceres sólidos incluem, mas não estão limitados a, câncer do cérebro, próstata, mama, pulmão, cólon, útero, pele, fígado, osso, pâncreas, ovário, testículos, bexiga, rim, cabeça, pescoço, estômago, colo do útero, reto, laringe e esôfago. Exemplos de vários distúrbios autoimunes incluem, mas sem limitação, alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes (tipo 1), algumas formas de artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia gravis, algumas formas de miocardite, esclerose múltipla, pênfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatoide, escleroderma/esclerose sistêmica, síndrome de Sjögren, lúpus sistêmico, eritematoso, algumas formas de tireoidite, algumas formas de uveíte, vitiligo, granulomatose com poliangiite (Wegener). Exemplos de infecções virais incluem, mas não estão limitados a, HIV (vírus da imunodeficiência humana), HSV (vírus de herpes simples), KSHV- (herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi), RSV- (vírus sincicial respiratório), EBV- (vírus de Epstein-Barr), CMV- (citomegalovírus), VZV (vírus varicela-zóster), adenovírus-, um lentivírus, distúrbios associados ao poliomavírus BK.
[000252] O tratamento que utiliza as células de linhagem hematopoiética derivadas de modalidades divulgadas no presente documento pode ser realizado mediante sintoma ou para prevenção de recidivas. Os termos “tratando”, “tratamento” e similares são usados neste documentopara geralmente significar a obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. O “tratamento”, conforme usado neste documento, abrange qualquer intervenção de uma doença em um sujeito e inclui: impedir que a doença ocorra em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; ou aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença. O agente ou composição terapêutica pode ser administrado antes, durante ou após o início de uma doença ou lesão. O tratamento da doença em andamento, em que o tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, também é de particular interesse. Em modalidades particulares, o sujeito que precisa de um tratamento tem uma doença, uma afecção e/ou uma lesão que pode ser contida, melhorada e/ou aprimorada em pelo menos um sintoma associado por uma terapia celular. Determinadas modalidades contemplam que um sujeito em necessidade de terapia celular inclua, mas sem limitação, um candidato para transplante de medula óssea ou de células-tronco, um sujeito que recebeu quimioterapia ou terapia de irradiação, um sujeito que tem ou corre o risco de ter um distúrbio hiperproliferativo ou um câncer, por exemplo, um distúrbio hiperproliferativo ou um câncer de sistema hematopoiético, um sujeito com ou em risco de desenvolver um tumor, por exemplo, um tumor sólido, um sujeito que tem ou corre o risco de ter uma infecção viral ou um doença associada a uma infecção viral.
[000253] Ao avaliar a responsividade ao tratamento que compreende as células de linhagem hematopoiética derivadas das modalidades divulgadas neste documento, a resposta pode ser medida por critérios que incluem pelo menos um dentre: taxa de benefício clínico, sobrevivência até a mortalidade, resposta patológica completa, medidas semi- quantitativas da resposta patológica, remissão clínica completa, remissão parcial clínica, doença estável clínica, sobrevida livre de recidiva, sobrevida livre de metástase, sobrevida livre de doença, diminuição de células tumorais circulantes, resposta de marcador circulante e critérios RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors, em português Critérios de Avaliação de resposta em tumores sólidos).
[000254] A composição terapêutica que compreende células de linhagem hematopoiética derivadas, conforme divulgado, pode ser administrada em um sujeito antes, durante e/ou após outros tratamentos. Como tal, o método de uma terapia combinacional pode envolver a administração ou preparação de células imunes derivadas de iPSC antes, durante e/ou após o uso de um agente terapêutico adicional. Como fornecido acima, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais compreendem um peptídeo, uma citocina, um inibidor de ponto de verificação, um mitogênio, um fator de crescimento, um pequeno RNA, um dsRNA (RNA de cadeia dupla), células sanguíneas mononucleares, células alimentadoras, componentes de célula alimentadora ou fatores de substituição dos mesmos, um vetor que compreende um ou mais ácidos polinucleicos de interesse, um anticorpo, um agente quimioterapêutico ou uma porção química radioativa ou um fármaco imunomodulador (IMiD). A administração das células imunes derivadas de iPSC pode ser separada, no tempo, da administração de um agente terapêutico adicional por horas, dias ou até semanas. Adicionalmente, ou alternativamente, a administração pode ser combinada com outros agentes ou modalidades biologicamente ativos, tais como, mas sem limitação, um agente antineoplásico, uma terapia não farmacológica, tal como cirurgia.
[000255] Em algumas modalidades de uma terapia celular combinatória, a combinação terapêutica compreende as células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC fornecidas no presente documento e um agente terapêutico adicional que é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno viral. Em outras modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno específico viral ou tumoral ativa as células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC administradas para intensificar sua capacidade de exterminação. Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para o tratamento combinatório como um agente terapêutico adicional para as células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC administradas incluem, mas sem limitação, anti-CD20 (por exemplo, rituximabe, veltuzumabe, ofatumumabe, ublituximabe, ocaratuzumabe, obinutuzumabe), anti-HER2 (por exemplo, trastuzumabe, pertuzumabe), anti- CD52 (por exemplo, alemtuzumabe), anti-EGFR (por exemplo, certuximabe), anti-GD2 (por exemplo, dinutuximabe), anti-PDL1 (por exemplo, avelumabe), anti-CD38 (por exemplo, daratumumabe, isatuximabe, MOR202), anti-CD123 (por exemplo, 7G3, CSL362), anti-SLAMF7 (elotuzumabe) e suas variantes modificadas por Fc ou humanizadas ou fragmentos ou seus equivalentes funcionais ou biossimilares.
[000256] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional compreende um ou mais inibidores de ponto de verificação. Os pontos de verificação são referidos às moléculas celulares,
geralmente moléculas da superfície celular, capazes de suprimir ou regular de forma decrescente as respostas imunes quando não inibidas. Os inibidores de ponto de verificação são antagonistas com capacidade para reduzir a expressão gênica de ponto de verificação ou produtos gênicos ou a atividade de morte de moléculas de ponto de verificação. Os inibidores de ponto de verificação adequados para terapia de combinação com as células efetoras derivativas, incluindo células NK ou T, conforme fornecidos neste documento, incluem, mas não se limitam a, antagonistas de PD-1 (Pdcdl, CD279), PDL-1 (CD274), TIM-3 (Havcr2), TIGIT (WUCAM e Vstm3), LAG-3 (Lag3, CD223), CTLA-4 (Ctla4, CD152), 2B4 (CD244), 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), A2aR, BATE, BTLA, CD39 (Entpdl), CD47, CD73 (NT5E), CD94, CD96, CD160, CD200, CD200R, CD274, CEACAM1, CSF-1R, Foxpl, GARP, HVEM, IDO, EDO, TDO, LAIR-1, MICA/B, NR4A2, MAFB, OCT-2 (Pou2f2), receptor alfa de ácido retinoico (Rara), TLR3, VISTA, NKG2A/HLA-E, e KIR inibidor (por exemplo, 2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1, e 3DL2).
[000257] Algumas modalidades da terapia de combinação que compreendem as células efetoras derivativas fornecidas compreendem ainda pelo menos um inibidor que alveja uma molécula de ponto de verificação. Algumas outras modalidades da terapia de combinação com as células efetoras derivadas fornecidas compreendem dois, três ou mais inibidores, de modo que duas, três ou mais moléculas de ponto de verificação sejam alvejadas. Em algumas modalidades, as células efetoras para terapia de combinação conforme descritas neste documento são células NK derivativas, conforme fornecido. Em algumas modalidades, as células efetoras para terapia de combinação conforme descritas neste documento são células T derivativas. Em algumas modalidades, as células NK ou T derivativas para terapias de combinação são funcionalmente intensificadas conforme fornecido neste documento. Em algumas modalidades, os dois, três ou mais inibidores de ponto de verificação podem ser administrados em uma terapia de combinação com, antes ou após a administração das células efetoras derivativas. Em algumas modalidades, os dois ou mais inibidores de ponto de verificação são administrados ao mesmo tempo ou um de cada vez (sequencial).
[000258] Em algumas modalidades, o antagonista que inibe qualquer uma das moléculas de ponto de verificação acima é um anticorpo. Em algumas modalidades, os anticorpos inibidores do ponto de verificação podem ser anticorpos de murinos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, um Ig de camelo, um anticorpo apenas para cadeia pesada de tubarão (VNAR), Ig NAR, anticorpos quiméricos, anticorpos recombinantes ou fragmentos de anticorpos dos mesmos. Exemplos não limitantes de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab′, F(ab)′2, F(ab)′3, Fv, fragmentos de aglutinação ao antígeno de cadeia única (scFv), (scFv)2, Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), minicorpo, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, fragmentos de aglutinação ao antígeno de domínio único (sdAb, Nanocorpo), anticorpo recombinante apenas de cadeia pesada (VHH) e outros fragmentos de anticorpo que mantêm a especificidade de aglutinação de todo o anticorpo, o que pode ser mais econômico para produzir, mais facilmente usado ou mais sensível do que todo o anticorpo. Em algumas modalidades, o um, ou dois, ou três ou mais inibidores de ponto de verificação compreendem pelo menos um dentre atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, ipilimumabe, IPH4102, IPH43, IPH33, lirimumabe, monalizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, e seus derivados ou equivalentes funcionais.
[000259] As terapias de combinação que compreendem as células efetoras derivativas e um ou mais inibidores de ponto de verificação são aplicáveis ao tratamento de cânceres líquidos e sólidos, incluindo, mas sem limitação, linfoma cutâneo de células T, linfoma não- Hodgkin (NHL), micose fungoide, reticulose pagetoide, síndrome de Sézary, pele elástica granulomatosa, Papulose linfomatoide, Pitiríase liquenoide crônica, Pitiríase liquenoide e varioliforme aguda, linfoma cutâneo de células T CD30+, linfoma cutâneo secundário de células grandes CD30+, linfoma de células T grandes CD30 cutâneo fungoide não micótico, linfoma de células T pleomórfico, linfoma de Lennert, linfoma de células T subcutâneo, linfoma angiocêntrico, linfoma de células NK blásticas, linfomas de células B, linfoma de Hodgkin (HL), tumor de cabeça e pescoço; carcinoma de células escamosas, rabdomiocarcoma, carcinoma pulmonar de Lewis (LLC), câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas de esôfago, adenocarcinoma de esôfago, carcinoma de células renais (RCC), câncer colorretal (CRC), leucemia mieloide aguda (LMA), câncer de mama, câncer gástrico, carcinoma neuroendócrino de células pequenas de próstata (SCNC), câncer de fígado, glioblastoma, câncer de fígado, carcinoma epidermoide oral, câncer de pâncreas, câncer papilar de tireoide, carcinoma colangiocelular intra-hepático, carcinoma hepatocelular, câncer ósseo, metástase e carcinoma nasofaríngeo.
[000260] Em algumas modalidades, além das células efetoras derivativas conforme fornecidas neste documento, uma combinação para uso terapêutico compreende um ou mais agentes terapêuticos adicionais que compreendem um agente quimioterapêutico ou uma porção química radioativa. Agente quimioterapêutico refere-se a agentes antineoplásicos citotóxicos, ou seja, agentes químicos que exterminam preferencialmente células neoplásicas ou interrompem o ciclo celular de células em rápida proliferação ou que erradicam células-tronco cancerígenas e que são utilizadas terapeuticamente para impedir ou reduzir o crescimento de células neoplásicas. Os agentes quimioterapêuticos também são algumas vezes denominados fármacos ou agentes antineoplásicos ou citotóxicos, e são bem conhecidos na técnica.
[000261] Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico compreende uma antraciclina, um agente alquilante, um sulfonato de alquila, uma aziridina, uma etilenimina, uma metilmelamina, uma mostarda de nitrogênio, uma nitrosoureia, um antibiótico, um antimetabolito, um análogo do ácido fólico, um análogo da purina, um análogo da pirimidina, uma enzima, uma podofilotoxina, um agente contendo platina, um interferon e uma interleucina.
Agentes quimioterapêuticos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes (ciclofosfamida, mecloretamina, mefalina, clorambucila, hetiletilmelamina, tiotepa, bussulfano, carmustina, lomustina, semustina), animetabólitos (metotrexato, fluorouracila, floxuridina, citarabina, 6- mercaptopurina, tioguanina, pentostatina), alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, vindesina), epipodofilotoxinas (etoposídeo, etoposídeo ortoquinona e teniposídeo), antibióticos (daunorrubicina, doxorrubicina, mitoxantrona, bisantireno, actinomicina D, plicamicina, puromicina e gramicidina D), paclitaxel, colchicina, amitocalacina, citochalasina B, emetina, maitansina e amsacrina.
Agentes adicionais incluem aminglutetimida, cisplatina, carboplatina, mitomicina, altretamina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), carmustina (BCNU), irinotecano (CPT-11), alemtuzamabe, altretamina, anastrozol, L-asparaginase, azacitidina, bevacizumabe, bexaroteno, bleomicina, bortezomibe, bussulfano, calusterona, capecitabina, celecoxibe, cetuximabe, cladribina, clofurabina, citarabina, dacarbazina, denileucina diftitox, dietilstilbestrol, docetaxel, dromostanolona, epirubicina, erlotiniba, estramustina, etoposídeo, etinilestradiol, exemestano, floxuridina, 5-flourouracil, fludarabina, flutamida, fulvestrant, gefitinibe, gencitabina, goserelina, hidroxiureia, ibritumomabe, idarubicina, ifosfamida, imatinibe, interferon alfa (2a, 2b), irinotecano, letrozol, leucovorina, leuprolide, levamisol, mecloretamina, megestrol, melfalina, mercaptopurina, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nandrolona, nofetumomabe, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato, pemetrexedo, pegademase, pegasparagase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, polifeprosan, porfímero, procarbazina, quinacrina, rituximabe, sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, teniposídeo, testolactona, tioguanina, tiotepa, topetecano, toremifeno, tositumomabe, trastuzumabe, tretinoína, mostarda uracil, valrubicina, vinorelbina e zoledronato.
Outros agentes adequados são aqueles que são aprovados para uso humano, incluindo aqueles que serão aprovados, como quimioterapêuticos ou radioterapêuticos, e conhecidos na técnica.
Esses agentes podem ser mencionados através de várias referências médicas padrão de médicos e oncologistas (por exemplo, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman & Gilman, Nona Edição, McGraw-Hill, NY, 1995) ou através do site da web do National Cancer Institute (fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm), ambos atualizados de tempos em tempos.
[000262] Fármacos imunomoduladores (IMiDs), como a talidomida, a lenalidomida e a pomalidomida, estimulam as células NK e as células T. Conforme fornecido neste documento, os IMiDs podem ser usados com as células imunológicas terapêuticas derivadas de iPSC para tratamentos de câncer.
[000263] Além de uma população isolada de células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC incluídas nas composições terapêuticas, as composições adequadas para administração a um paciente podem incluir ainda um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes (por exemplo, meio farmaceuticamente aceitável, por exemplo, meio de cultura celular) ou outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Os carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição terapêutica. Deste modo, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições terapêuticas da presente invenção (consultar, por exemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. 1985, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade).
[000264] Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende as células T derivadas de células pluripotentes feitas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende as células NK derivadas de células pluripotentes produzidas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende as células CD34+ HE derivadas de células pluripotentes produzidas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende os HSCs derivados de células pluripotentes feitos pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende o MDSC derivado de célula pluripotente feito pelos métodos e composição divulgados neste documento. Uma composição terapêutica que compreende uma população de células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC, conforme divulgado neste documento, pode ser administrada separadamente por métodos de administração intravenosa, intraperitoneal, entérica ou traqueal ou em combinação com outros compostos adequados para afetar os objetivos de tratamento desejados.
[000265] Esses carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis podem estar presentes em quantidades suficientes para manter um pH da composição terapêutica entre cerca de 3 e cerca de 10. Como tal, o agente tamponante pode ser de até cerca de 5% em peso a peso da composição total. Eletrólitos tais como, mas não limitados a, cloreto de sódio e cloreto de potássio também podem ser incluídos na composição terapêutica. Em um aspecto, o pH da composição terapêutica está na faixa de cerca de 4 a cerca de 10. Alternativamente, o pH da composição terapêutica está na faixa de cerca de 5 a cerca de 9, de cerca de 6 a cerca de 9 ou de cerca de 6,5 a cerca de 8. Em outra modalidade, a composição terapêutica inclui um tampão com um pH em uma das ditas faixas de pH. Em outra modalidade, a composição terapêutica tem um pH de cerca de 7. Alternativamente, a composição terapêutica tem um pH na faixa de cerca de 6,8 a cerca de 7,4. Ainda em outra modalidade, a composição terapêutica tem um pH de cerca de 7,4.
[000266] A invenção também fornece, em parte, o uso de um meio de cultura de células aceitável sob o ponto de vista farmacêutico em composições particulares e/ou culturas da presente invenção. Tais composições são adequadas para administração a sujeitos humanos. De um modo geral, qualquer meio que suporte a manutenção, crescimento e/ou saúde das células imunes derivadas de iPSC de acordo com modalidades da invenção é adequado para uso como meio de cultura de células farmacêuticas. Em modalidades particulares, o meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável é um meio isento de soro e/ou isento de alimentador. Em várias modalidades, o meio isento de soro é isento de animais e pode opcionalmente ser isento de proteínas. Opcionalmente, o meio pode conter proteínas recombinantes biofarmaceuticamente aceitáveis. Meio isento de animais refere- se ao meio em que os componentes são derivados de fontes não animais. As proteínas recombinantes substituem as proteínas animais nativas em meio isento de animais e os nutrientes são obtidos de fontes sintéticas, vegetais ou microbianas. O meio isento de proteínas, em contraste, é definido como substancialmente isento de proteínas. Uma pessoa versada na técnica apreciaria que os exemplos acima de meios são ilustrativos e de forma alguma limitam a formulação de meios adequados para uso na presente invenção e que existem muitos meios adequados conhecidos e disponíveis para aqueles na técnica.
[000267] As células da linhagem hematopoiética derivadas de células-tronco pluripotentes isoladas podem ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de células T, células NK, células NKT, células proT, proNK células, células CD34+ HE, HSCs, células B, células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras ou células estromais mesenquimais. Em algumas modalidades, as células da linhagem hematopoiética derivadas de células- tronco pluripotentes isoladas têm cerca de 95% a cerca de 100% de células T, células NK, células proT, células proNK, células proNK, células CD34+ HE ou células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições terapêuticas que têm células T ou NK purificadas, tal como uma composição que tem uma população isolada de cerca de 95% de células T, células NK, células proT, células proNK, células CD34+ HE ou células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) para tratar um sujeito em necessidade da terapia celular.
[000268] Em uma modalidade, a terapia celular combinatória compreende uma proteína ou peptídeo terapêutico anti-CD38 e uma população de células NK derivadas de iPSCs modificadas genomicamente que compreendem um genótipo listado na Tabela 1, em que as células NK derivadas compreendem teor nulo de CD38. Em outra modalidade, a terapia celular combinatória compreende uma proteína ou peptídeo terapêutico anti- CD38 e uma população de células T derivadas de iPSCs modificadas genomicamente que compreendem um genótipo listado na Tabela 1, em que as células T derivadas compreendem teor nulo de CD38. Em algumas modalidades, a terapia celular combinatória compreende daratumumabe, isatuximabe ou MOR202, e uma população de células NK ou T derivadas a partir de iPSCs genomicamente modificadas que compreendem um genótipo listado na Tabela 1, em que as células NK ou T derivadas compreendem teor nulo de CD38 e hnCD16. Em ainda algumas outras modalidades, a terapia celular combinatória compreende daratumumabe, e uma população de células NK ou T derivadas de iPSCs modificadas genomicamente que compreendem um genótipo listado na Tabela 1, em que as células NK ou T derivadas compreendem teor nulo de CD38, hnCD16, e um CAR que alveja CD19, BCMA, CD38, CD20, CD22 ou CD123. Em ainda algumas modalidades adicionais, a terapia celular combinatória compreende daratumumabe, isatuximabe ou MOR202 e uma população de células NK ou T derivadas a partir de iPSCs genomicamente modificadas que compreendem um genótipo listado na Tabela 1, em que as células NK ou T derivadas compreendem teor nulo de CD38, hnCD16, um CAR e uma ou mais citocinas exógenas.
[000269] Como um versado na técnica entende, células de linhagem hematopoiética autólogas e alogênicas derivadas de iPSC com base nos métodos e na composição apresentados no presente documento podem ser usadas em terapias celulares, conforme descrito acima. Para transplante autólogo, a população isolada de células da linhagem hematopoiética derivadas é compatível com HLA completa ou parcial com o paciente. Em outra modalidade, as células da linhagem hematopoiética derivadas não são compatíveis com HLA para o sujeito, em que as células da linhagem hematopoiética derivadas são células NK ou células T com HLA I e HLA II nulos.
[000270] Em algumas modalidades, o número de células de linhagem hematopoiética derivadas na composição terapêutica é de pelo menos 0,1 x 105 células, de pelo menos 1 x 105 células, pelo menos 5 x 105 células, de pelo menos 1 x 106 células, pelo menos 5 x 106 células, pelo menos, 1 x 107 células, de pelo menos 5 x 107 células, de pelo menos 1 x 108 células, pelo menos 5 x 108 células, pelo menos 1 x 109 células, ou pelo menos 5 x 109 células, por dose. Em algumas modalidades, o número de células de linhagem hematopoiética derivadas na composição terapêutica é de cerca de 0,1 x 105 células a cerca de 1 x 106 células, por dose; cerca de 0,5 x 10 6 células a cerca de 1 x 107 células, por dose; cerca de 0,5 x 107 células a cerca de 1 x 108 células, por dose; cerca de 0,5 x 108 células a cerca de 1 x 109 células, por dose; cerca de 1 x 109 células a cerca de 5 x 109 células, por dose; cerca de 0,5 x 109 células a cerca de 8 x 109 células, por dose; cerca de 3 x 109 células a cerca de 3 x 1010 células, por dose ou qualquer faixa intermediária. Geralmente, 1 x 108 células/dose traduz a 1,67 x 106 células/kg para um paciente de 60 kg.
[000271] Em uma modalidade, o número de células de linhagem hematopoiética derivadas na composição terapêutica é o número de células imunes em um cordão parcial ou única de sangue, ou é, pelo menos, 0,1 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 105 células/kg de peso corporal, de pelo menos 1 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 105 células/kg de peso corporal, de pelo menos 10 x 10 5 células/kg de peso corporal, de pelo menos 0,75 x 106 células/kg de peso corporal, de pelo menos
1,25 x 106 células/kg de peso corporal, de pelo menos 1,5 x 10 6 células/kg de peso corporal, de pelo menos 1,75 x 10 6 células/kg de peso corporal, pelo menos 2 x 106 células/kg de peso corporal, de pelo menos 2,5 x 10 6 células/kg de peso corporal, pelo menos 3 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 4 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 10 6 células/kg de peso corporal, pelo menos 10 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 15 x 10 6 células/kg de peso corporal, pelo menos 20 x 10 6 células/kg de peso corporal, pelo menos 25 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 30 x 10 6 células/kg de peso corporal, 1 x 108 células/kg de peso corporal, 5 x 108 células/kg de peso corporal ou 1 x 109 células/kg de peso corporal.
[000272] Em uma modalidade, uma dose de células da linhagem hematopoiética derivada é administrada a um sujeito. Em uma modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecida a um sujeito é de pelo menos 2 x 106 células/kg, pelo menos 3 x 106 células/kg, pelo menos 4 x 106 células/kg, pelo menos 5 x 106 células/kg, pelo menos 6 x 106 células/kg, pelo menos 7 x 106 células/kg, pelo menos 8 x 106 células/kg, pelo menos 9 x 106 células/kg, ou pelo menos 10 x 106 células/kg, ou mais células/kg, o que inclui todas as doses intermediárias de células.
[000273] Em outra modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecida a um sujeito é de cerca de 2 x 10 6 células/kg, cerca de 3 x 106 células/kg, cerca de 4 x 106 células/kg, cerca de 5 x 106 células/kg, cerca de 6 x 106 células/kg, cerca de 7 x 106 células/kg, cerca de 8 x 106 células/kg, cerca de 9 x 106 células/kg ou cerca de 10 x 106 células/kg, ou mais células/kg, o que inclui todas as doses intermediárias de células.
[000274] Em outra modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecidas a um sujeito é de cerca de 2 x 10 6 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 3 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 4 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 5 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 4 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg ou 6 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, o que inclui todas as doses intermediárias de células.
[000275] Em algumas modalidades, o uso terapêutico de células da linhagem hematopoiética derivadas é um tratamento de dose única. Em algumas modalidades, o uso terapêutico de células da linhagem hematopoiética derivadas é um tratamento de doses múltiplas. Em algumas modalidades, o tratamento com múltiplas doses é uma dose todos os dias, a cada 3 dias, a cada 7 dias, a cada 10 dias, a cada 15 dias, a cada 20 dias, a cada 25 dias, a cada 30 dias, a cada 35 dias, a cada 40 dias, a cada 45 dias ou a cada 50 dias ou a qualquer número de dias intermediários.
[000276] As composições que compreendem uma população de células de linhagem hematopoiética derivadas da invenção podem ser estéreis e podem ser adequadas e prontas para administração (isto é, podem ser administradas sem qualquer processamento adicional) a pacientes humanos. Uma composição baseada em células que está pronta para administração significa que a composição não requer nenhum processamento ou modificação adicional antes do transplante ou administração a um sujeito. Em outras modalidades, a invenção fornece uma população isolada de células da linhagem hematopoiética derivadas que são expandidas e/ou moduladas antes da administração com um ou mais agentes. Para células de linhagem hematopoiética derivadas que modificaram geneticamente para expressar TCR ou CAR recombinante, as células podem ser ativadas e expandidas com o uso dos métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. 6.352.694.
[000277] Em certas modalidades, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para as células da linhagem hematopoiética derivadas podem ser fornecidos por diferentes protocolos. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados à mesma superfície (isto é, na formação "cis") ou a superfícies separadas (isto é, na formação "trans"). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em uma modalidade, o agente que fornece o sinal coestimulador pode ser ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certas modalidades, ambos os agentes podem estar em solução. Em outra modalidade, os agentes podem estar na forma solúvel e, em seguida, reticulados a uma superfície, como uma célula que expressa receptores Fc ou um anticorpo ou outro agente de aglutinação que se aglutinará aos agentes, como divulgado nas Publicações de Pedido de Patente US Nos 20040101519 e 20060034810 para células apresentadoras de antígeno artificial (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de linfócitos T em modalidades da presente invenção.
[000278] Alguma variação na dosagem, frequência e protocolo ocorrerá necessariamente, dependendo da afecção do sujeito a ser tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose, frequência e protocolo apropriados para o sujeito.
EXEMPLOS
[000279] Os exemplos a seguir são oferecidos como ilustração e não como limitação. EXEMPLO 1 - MATERIAIS E MÉTODOS
[000280] Para selecionar e testar efetivamente os sistemas suicidas sob o controle de vários promotores, em combinação com diferentes estratégias de integração de locais de porto seguro, foi utilizada uma plataforma hiPSC proprietária do requerente, que permite a passagem de células únicas e o fluxo baseado em placa de 96 poços de alto rendimento classificação por citometria, para permitir a derivação de hiPSCs clonais com modulações genéticas únicas ou múltiplas.
[000281] Manutenção da hiPSC na cultura de pequenas moléculas: as hiPSCs eram rotineiramente passadas como células únicas quando a confluência da cultura atingia 75% a 90%. Para dissociação de célula única, as hiPSCs foram lavadas uma vez com PBS (Mediatech) e tratados com Accutase (Millipore) por 3 a 5 minutos a 37°C, seguido de pipetagem para garantir a dissociação de célula única. A suspensão de célula única foi então misturada em volume igual com o meio convencional, centrifugada a 225 × g por 4 min, ressuspensa em FMM e plaqueada em superfície revestida com Matrigel. As passagens eram tipicamente 1:6 a 1:8, placas de cultura de tecidos transferidos previamente revestidas com Matrigel por 2 a 4 horas a 37°C e alimentadas a cada 2 a 3 dias com FMM. As culturas celulares foram mantidas em uma incubadora umidificada a 37°C e 5% de CO2.
[000282] Modificação de iPSC humana com ZFN, CRISPR para edição alvejada de modalidades de interesse: Com o uso da inserção alvejada ROSA26 como exemplo, para edição do genoma mediada por ZFN, 2 milhões de iPSCs foram transfectadas com mistura de 2,5ug ZFN-L (FTV893), 2,5ug ZFN-R (FTV894) e construtor doador de 5ug, para inserção alvejada AAVS1. Para edição do genoma mediada por CRISPR, 2 milhões de iPSCs foram transfectadas com mistura de 5ug ROSA26-gRNA/Cas9 (FTV922) e construto doador de 5ug, para inserção alvejada ROSA26. A transfecção foi realizada com o uso do sistema de transfecção Neon (Life Technologies), usando os parâmetros 1500V, 10ms, 3 pulsos. No dia 2 ou 3 após a transfecção, a eficiência da transfecção foi medida com o uso de citometria de fluxo se os plasmídeos contiverem GFP-promotor-driver artificial e/ou cassete de expressão de RFP. No dia 4 após a transfecção, foi adicionada puromicina ao meio na concentração de 0,1 µg/ml nos primeiros 7 dias e 0,2 µg/ml após 7 dias para selecionar as células alvo. Durante a seleção de puromicina, as células foram passadas para poços frescos revestidos com matrigel no dia 10. No dia 16 ou posterior da seleção de puromicina, as células sobreviventes foram analisadas por citometria de fluxo quanto à porcentagem de células GFP + iPS.
[000283] Ordenação a granel e ordenação clonal de iPSCs editadas genomicamente: iPSCs com edição genômica alvejada com o uso de ZFN ou CRISPR-Cas9 foram classificadas em massa e ordenadas clonalmente por iPSCs GFP+SSEA4+TRA181+ após 20 dias de seleção de puromicina. Pools de iPSC alvejados dissociados por célula única foram ressuspensos em tampão de coloração resfriado contendo a Solução Salina Equilibrada de Hanks (MediaTech), soro fetal bovino a 4% (Invitrogen), 1x penicilina/estreptomicina (Mediatech) e Hepes 10 mM (Mediatech); fresco para um desempenho ideal. Anticorpos primários conjugados, incluindo SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647 (BD Biosciences), foram adicionados à solução celular e incubados em gelo por 15 minutos. Todos os anticorpos foram utilizados a 7 μl em 100 μl de tampão de coloração por milhão de células. A solução foi lavada uma vez em tampão de coloração, centrifugada a 225 g por 4 minutos e ressuspensa em tampão de coloração contendo 10 μM de Thiazovivn e mantida em gelo para ordenação por citometria de fluxo. A classificação por citometria de fluxo foi realizada em FACS Aria II (BD Biosciences). Para classificação a granel, as células GFP+SSEA4+TRA181+ foram fechadas e classificadas em tubos canônicos de 15 ml preenchidos com 7 ml de FMM. Para classificação clonal, as células classificadas foram ejetadas diretamente em placas de 96 poços com o uso do bico de 100 μM, em concentrações de 3 eventos por poço. Cada poço foi pré-preenchido com 200 μl de FMM suplementado com 5 μg/ml de fibronectina e 1x penicilina/estreptomicina (Mediatech) e previamente revestido durante a noite com 5x Matrigel. O pré-revestimento de 5x Matrigel inclui a adição de uma alíquota de Matrigel em 5 ml de DMEM/F12, incubada durante a noite a 4 °C para permitir ressuspensão adequada e finalmente adicionada a placas de 96 poços a 50 μl por poço seguida de incubação durante a noite a 37 °C.
O Matrigel 5x é aspirado imediatamente antes da adição de meio a cada poço.
Após a conclusão da ordenação, as placas de 96 poços foram centrifugadas por 1 a 2 minutos a 225 g antes da incubação.
As placas foram deixadas intactas por sete dias.
No sétimo dia, 150 μl de meio foram removidos de cada poço e substituídos por 100 μl de FMM.
Os poços foram realimentados com um FMM adicional de 100 μl no dia 10 após a ordenação.
A formação de colônias foi detectada logo no dia 2 e a maioria das colônias foi expandida entre os dias 7 e 10 após a ordenação.
Na primeira passagem, os poços foram lavados com PBS e dissociados com 30 ml de Accutase por aproximadamente 10 minutos a 37 °C.
A necessidade de tratamento prolongado com Accutase reflete a compactação de colônias que ficaram ociosas na cultura por um período prolongado.
Depois que as células são dissociadas, 200 μl de FMM são adicionados a cada poço e pipetados por diversas vezes para quebrar a colônia.
A colônia dissociada é transferida para outro poço de uma placa de 96 poços previamente revestida com 5x Matrigel e depois centrifugada por 2 min a 225 g antes da incubação.
Esta passagem 1:1 é conduzida para espalhar a colônia anterior antes da expansão.
Passagens subsequentes foram feitas rotineiramente com tratamento Accutase por 3 a 5 min e expansão de 1:4 a 1:8 após confluência de 75 a 90% em poços maiores previamente revestidos com 1x Matrigel em FMM.
Cada linhagem celular clonal foi analisada quanto ao nível de fluorescência de GFP e nível de expressão de TRA1-81. Linhagens clonais com cerca de 100% de GFP+ e TRA1-81+ foram selecionadas para rastreio posterior e análise de PCR.
A análise por citometria de fluxo foi realizada em Guava EasyCyte 8 HT (Millipore) e analisada com o uso de Flowjo (FlowJo, LLC). EXEMPLO 2 - KNOCKOUT DE CD38 EM iPSC COM O USO DE EDIÇÃO DE GENOMA MEDIADA POR CRISPR/CAS9
[000284] Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase 3NLS, 100 µg e Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA foram adquiridos junto à IDT (Coralville, Iowa) e usados para edição de alvejamento de iPSC. Para conduzir o knockout bialélico de CD38 em iPSC com o uso de Cas9 nickase, pares de sequência de alvejamento triados e identificados (1A e 1B, 2A e 2B, 3A e 3B) para projeto de gNA (isto é, gD/RNA ou polinucleotídeo guia) são listados na Tabela 3: TABELA 3: SEQUÊNCIA DE ALVEJAMENTO ESPECÍFICA PARA LÓCUS DE CD38 PARA EDIÇÃO GENÔMICA DE CRISPR/CAS9:
[000285] As iPSCs modificadas genomicamente foram subsequentemente caracterizadas e o knockout bialélico de CD38 foi confirmado. EXEMPLO 3 - VALIDAÇÃO DE iPSC DE CD38-/- E
CÉLULAS DERIVATIVAS
[000286] Sabe-se que a CD38 se expressa em estágios celulares específicos e desempenha papéis importantes nas células efetoras. Durante a hematopoiese, a CD38 é expressa em células-tronco CD34+ e progenitores comprometidos por linhagem de linfoides, eritroides e mieloides, e também durante os estágios finais de maturação de células efetoras, tais como células T e células NK. Portanto, não se sabia e havia uma preocupação, antes do presente pedido, sobre se as iPSCs que compreendem knockout de CD38 se desenvolveriam adequadamente quando submetidas a condições de diferenciação direcionadas e se as células efetoras geradas seriam funcionais, considerando o perfil e a funcionalidade de expressão de
CD38. A iPSC com teor nulo de CD38 que compreende um knockout bialélico de CD38 surpreendentemente manteve sua capacidade de se diferenciar em células derivativas. Em uma das ilustrações, três clones de iPSC geneticamente modificados que são editados geneticamente para ter a interrupção bialélica do gene de CD38 e hnCD16 foram diferenciados quanto a células NK derivativas e analisados quanto a seus fenótipos. Os perfis de fluxo na Figura 2 mostram que cada clone é CD56+ enquanto é negativo para CD38.
[000287] Para determinar se a citotoxicidade celular das células NK derivadas de iPSC é retida quando a expressão de CD38 é submetida a knockout, os clones de iPSC do tipo selvagem e três clones de iPSC geneticamente modificados que são editados geneticamente para ter a interrupção bialélica do gene de CD38 foram diferenciados quanto a células NK e comparados por sua capacidade de alvejamento e exterminação de linhagem celular tumoral RPMI-8266. Conforme mostrado pelo ensaio de exterminação a longo prazo na Figura 3, durante um período de 48 horas, as células NK CD38 - /- geneticamente modificadas eliminaram a célula-alvo de maneira semelhante ao seu controle de tipo selvagem, demonstrando que CD38 é dispensável durante o reconhecimento e a exterminação de célula-alvo. Portanto, foi mostrado no presente documento que a perda completa de CD38 em iPSC não afeta a derivação de células hematopoiéticas ou a citotoxicidade das células efetoras derivativas.
[000288] O daratumumabe (Darzalex) é um fármaco anticâncer. O mesmo se liga a CD38, que é superexpressa em várias células de mieloma. A exterminação de células de mieloma múltiplo mediada por daratumumabe é em parte dependente de ADCC e depende fortemente de células efetoras NK. No entanto, a CD38 também é expressa nas células NK, resultando em ADCC induzida por daratumumabe (fratricídio) em relação às células NK, reduzindo potencialmente significativamente a eficácia de daratumumabe. Neste documento, na Figura 6, é mostrado que as células NK derivadas de iPSC de CD38-/- mantiveram a função de ADCC quando estimuladas pela linhagem celular tumoral RPMI-8266 na presença de daratumumabe. É adicionalmente mostrado na Figura 7 que a viabilidade de células NK derivadas de iPSC de CD38 -/- (Figura 7B) é mantida em cultura com a presença de daratumumabe por pelo menos cerca de 48 horas em comparação com células NK derivadas de iPSC que expressam CD38 (Figura 7A). Além disso, células NK derivadas de iPSC de CD38 -/-, conforme mostrado na Figura 7, não mostram desgranulação e apresentam menor produção de citocinas do que as células iNK que expressam CD38 quando estimuladas na presença de daratumumabe.
[000289] Além disso, células-tronco pluripotentes induzidas com teor nulo de CD38 também foram geneticamente modificadas em série para obter expressão de CD16 não clivável de alta afinidade, perda de HLA-I ao realizar knockout de gene B2M, perda de HLA-II ao realizar knockout de CIITA, superexpressão de HLA-G de molécula de HLA não clássico e expressão de um construto de receptor-alfa de IL15/IL15 ligado. Após cada etapa de modificação genética, as iPSCs foram classificadas quanto ao fenótipo desejado antes da próxima etapa de modificação genética. As iPSCs geneticamente modificadas podem ser mantidas in vitro ou para geração de células derivativas. A Figura 4 mostrou a expressão de hnCD16, knockout de B2M, expressão de HLA-G e expressão de IL15/IL15Rα nas célula NK derivada de iPSC. A Figura 7 mostra a introdução de hnCD16 em combinação de knockout de CD38 nas células NK derivadas de iPSC. Esses dados demonstram que essas modalidades geneticamente modificadas são mantidas durante a diferenciação hematopoiética sem perturbar o desenvolvimento direcionado in vitro da célula para um destino celular desejado.
[000290] O encurtamento dos telômeros ocorre com o envelhecimento celular e está associado à disfunção de células-tronco e senescência celular. É mostrado neste documento que as células iNK maduras mantêm telômeros mais longos em comparação com as células NK em negrito periféricas adultas. O comprimento de telômeros foi determinado por citometria de fluxo para iPSC, células NK de sangue periférico adulto e células NK derivadas de iPSC com o uso da linhagem de leucemia de células T 1301 como controle (100%) com correção para o índice de DNA de células G 0/1. Conforme mostrado na Figura 5, as células NK derivadas de iPSC mantêm um comprimento de telômero significativamente maior quando comparadas às células NK de sangue periférico adulto (p = 0,105, ANOVA), representando maior potencial de proliferação, sobrevivência e persistência nas células NK derivadas de iPSC. EXEMPLO 4 - PERFIL DE FUNÇÃO DE CÉLULAS NK DERIVATIVAS COM TEOR NULO DE CD38
[000291] O fenótipo de células hnCD16 CD38-/- iNK, incluindo a expressão de NKG2A, NKp46 e KIR2DL2/3 e o fluxo de cálcio, foi avaliado, e o fenótipo de hnCD16 iNK é mantido após o knockout de CD38 (Figura 10A a 10D). A função de ADCC de hnCD16 iNK com knockout de CD38 foi examinada contra a linhagem celular ovariana que expressa HER2, SKOV3, por imagens de células vivas Incucyte, e o knockout de CD38 não afeta a função de ADCC de hnCD16 iNK (Figura 10E). Em seguida, a citotoxicidade específica de daratumumabe contra diferentes populações de células NK, incluindo: células NK de sangue periférico (com desprendimento de CD16), células hnCD16 iNK (com alta afinidade e CD16 não clivável), células iNK não modificadas (com baixa expressão de CD16) e células hnCD16 CD38-/- iNK, foi medida após uma incubação de 4 horas da respectiva população de células com daratumumabe em diferentes concentrações. Conforme mostrado na Figura 11, a deficiência de CD38 protegeu as células hnCD16 CD38-/- iNK de fratricídio mediado pelo aumento de concentrações de daratumumabe em comparação com as outras populações celulares sem knockout de CD38. Assim, a perda de CD38 impede o fratricídio de células NK mediado por daratumumabe na presença de anticorpo específico para CD38.
[000292] Para avaliar a citotoxicidade de células hnCD16 CD38-/- iNK em comparação com as células hnCD16 iNK, cada população de células foi incubada com células-alvo de mieloma MM.1S por 18 horas, e após o que a viabilidade de células tumorais foi avaliada por anexina V e um marcador de viabilidade vivo/morto por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 12, a atividade antimieloma robusta mediada por célula hnCD16 iNK com daratumumabe é ainda aumentada pela perda de CD38. Além disso, ao longo de um ensaio de citotoxicidade de 7 dias contra esferoides tumorais RMPI-8226, as células hnCD16 CD38-/- iNK demonstraram uma depuração superior das células tumorais com a presença de anticorpo específico para CD38, conforme medido pelo número de células-alvo restantes no final do ensaio, e em comparação com células hnCD16 iNK e iNK não modificadas sob a mesma condição (Figura 13A). Além disso, a falta de fratricídio de células NK aprimorou a sobrevivência de células hnCD16 CD38-/- iNK, conforme mostrado pela persistência aprimorada dessas células ao longo do ensaio de citotoxicidade de 7 dias demonstrado na Figura 13B. Portanto, as células hnCD16 CD38-/- iNK exibem persistência e atividade antimieloma de longo prazo intensificada com anticorpo específico para CD38, tal como daratumumabe. As células hND16 iNK sem CD38 também demonstram ADCC mais durável com maior potencial de morte em série na presença de anticorpo específico para CD38, conforme mostrado na Figura 14. Nesse ensaio, as células hnCD16 ou hnCD16 CD38-/- iNK foram incubadas com células-alvo de mieloma MM.1S com daratumumabe por 48 horas (Rodada de Estimulação 1), e o número de células MM.1S foi quantificado por imaginologia Incucyte TM. Após 48 horas, as células efetoras foram removidas e transferidas para novas células-alvo para uma segunda rodada de estimulação e exterminação de células-alvo com daratumumabe (Rodada de Estimulação 2). (Figura 14)
[000293] À luz do exposto, descobriu-se que o knockout alvejado de CD38 não afeta o fenótipo de células NK derivativas nem a função celular geral, e as células NK derivativas deficientes em CD38 resultantes são protegidas contra anticorpo específico para CD38, daratumumabe, por exemplo, fratricídio mediado. A sinergia entre hnCD16 e
CD38-/- fornece a atividade antimieloide intensificada de células NK derivativas e ADCC durável em combinação com antagonista específico para CD38, incluindo anticorpo monoclonal, tal como daratumumabe. Com base nessas constatações, é proposta uma estratégia clínica para a combinação de células hnCD16CD38-/- iNK prontas para uso com daratumumabe para superar os efeitos de esgotamento de células NK de agentes de alvejamento de CD38 e aprimorar o resultado de paciente com mieloma. EXEMPLO 5 - USO DE ANTAGONISTA ESPECÍFICO PARA CD38 PARA PROTEGER CÉLULAS EFETORAS ALOGÊNICAS
CONTRA ALORREJEIÇÃO
[000294] As células iNK modificadas geneticamente com eficácia intensificada de CD16 e CD38 removido são resistentes ao fratricídio induzido por anticorpo de alvejamento de CD38 e medeiam de forma mais potente a atividade antimieloma em combinação com daratumumabe. É ainda fornecido no presente documento que, devido ao fato de que o CD38 é suprarregulado em linfócitos ativados, tais como células T ou B, suprimindo-se a ativação desses linfócitos com o uso de antagonista específico para CD38, incluindo anticorpos monoclonais, no receptor de células efetoras alogênicas deficientes em CD38, a alorrejeição contra essas células efetoras é reduzida e/ou impedida, aumentando assim a sobrevivência e a persistência de células efetoras. Para mostrar a viabilidade dessa estratégia, uma Reação Mista de Linfócitos (MLR, isto é, coincubação de produtos de células efetoras e PBMC alogênica) é realizada para testar a longevidade de células efetoras derivativas desta invenção em um ambiente alogênico no contexto de knockout de CD38 e na presença ou na ausência de anticorpo monoclonal anti-CD38 (por exemplo, daratumumabe).
[000295] As populações de células hnCD16+ iNK (com e sem CD38KO) são marcadas com um corante intracelular (Celltrace Violet TM ou reagente compatível com IncucyteTM similar) imediatamente antes do ensaio. Diferentes concentrações de células hnCD16+ e hnCD16 CD38-/- iNK são incubadas com um número fixo de PBMC de doadores saudáveis aleatórios (n = 3 a 4, não agrupados), na presença ou na ausência de daratumumabe (em concentração efetiva, titulada antes do ensaio). A sobrevivência de células iNK em cada população é monitorada por Incucyte TM ao longo do tempo em cultura a longo prazo. A sobrevivência também é monitorada por citometria de fluxo, em que um painel de coloração é empregado para rastrear adicionalmente a regulação positiva de CD38 em subpopulações de PBMC e a depuração de subpopulações de PBMC por células iNK com base em ADCC mediada por daratumumabe. A depuração total de células iNK como controle é alcançada com o uso de Venetoclax (inibidor de MCL-1, para remoção específica de células NK).
[000296] Um aumento de longevidade de células hnCD16 CD38KO iNK versus células hnCD16 iNK do tipo selvagem na presença de anti-CD38, e depuração associada de subpopulações de CD38+ (células NK periféricas, células T e células B ativadas) das amostras de PBMC indicam a capacidade de antagonista específico para CD38 em suprimir as células T ou B periféricas ativadas alvejando-se CD38 regulada positivamente, reduzindo assim a alorrejeição contra as células efetoras alogênicas por essas células T ou B periféricas ativadas no receptor das células efetoras que compreendem hnCD16 e CD38-/-, conforme fornecido no presente documento. O antagonista específico para CD38 é um anticorpo específico para CD38, um agente específico para CD38 ou um receptor de antígeno quimérico de CD38 (CAR).
[000297] Além disso, a expressão de proteína de fusão de IL15/IL15Rα truncada exógena sem o domínio intracelular de IL15Rα demonstrou suportar a sobrevivência de células NK derivadas de iPSC in vitro, independentemente de adição de IL2 exógena solúvel. A IL15Rα sem o seu domínio intracelular foi fundida com IL15 no terminal C através de um ligante para gerar um construto de fusão de IL15/IL15Ra truncado sem domínio de sinalização (ou denominado “IL15∆” neste pedido). O IL15∆ exemplificativo conforme fornecido no presente documento inclui aqueles que têm uma estrutura como o Projeto 3 ou 4 da Figura 1. Conforme mostrado na Figura 15, as células iNK foram transduzidas com vetores de superexpressão lentiviral que expressam GFP (quadrados; controle negativo), construto de fusão de IL15/IL15Ra de comprimento total (círculos preenchidos; controle positivo; Projeto 2 da Figura 1) ou um construto de fusão de IL15/IL15Ra truncado (círculos abertos; Projeto 3 da Figura 1). Nenhum dos construtos de IL15 nem a GFP mostraram enriquecimento na presença de IL2 exógena (Figura 15A), indicando que as células transduzidas sobreviveram a taxas comparáveis às de células não transduzidas.
Na ausência de IL2 exógena, as células transduzidas com o construto de fusão de IL15/IL15Ra foram enriquecidas ao longo do tempo, enquanto as células transduzidas GFP não foram, indicando que sem IL2, as células transduzidas com o construto de IL15/IL15Ra tinham uma vantagem de sobrevivência em comparação com as células não transduzidas nas mesmas culturas (Figura 15B). Além disso, uma vez que o domínio intracelular de IL15Rα foi considerado crítico para o receptor expressar nas células respondedoras à IL15 e para que as células se expandam e funcionem em resposta, é surpreendente que o domínio intracelular truncado no construto de fusão de IL15/IL15Ra não seja apenas expresso de maneira estável na célula iNK transduzida, mas também suporte a célula iNK a uma taxa de expansão mais alta do que o construto de fusão de IL15/IL15Ra de comprimento total, conforme mostrado na Figura 15B.
Sendo assim, o IL15∆, tal como fornecido no presente documento, tem capacidade para expressar e manter IL15 em uma forma ligada à membrana e pode substituir uma proteína de fusão de IL15/IL15Ra de comprimento total para fornecer a apresentação trans de IL15 em uma célula.
Sem entender completamente o mecanismo subjacente, a remoção do domínio intracelular de IL15R parece ter dado às células respondedoras vigor adicional, adequação ou determinada vantagem em sobrevivência, expansão e persistência, possivelmente eliminando completamente a apresentação cis e/ou quaisquer outras vias de transdução de sinal potenciais mediadas por uma IL15R normal através de seu domínio intracelular. EXEMPLO 6 - CONSTRUTO DE KNOCKIN TRANSGENE QUE ALVEJA CD38 QUE CONSEQUENTEMENTE REALIZA KNOCKOUT DE CD38 E DAS CÉLULAS MODIFICADAS GENETICAMENTE OBTIDAS A
PARTIR DELE
[000298] A inserção de um ou mais transgenes em uma posição selecionada no CD38 para realizar knockout de CD38 ao mesmo tempo foi alcançada por projetos de construto exemplificados na Figura 16. Com os respectivos braços de homologia de alvejamento de CD38 para inserção seletiva de posição, os construtos fornecidos neste documento permitem que o transgene se expresse (ou os transgenes se expressem) sob o promotor endógeno CD38 ou sob um promotor exógeno compreendido no construto (compare Figuras 16 A com B, e C com D). A posição de inserção/knockout seletiva dentro do lócus de CD38 é compatível com as sequências do braço de homologia direito e esquerdo de flanqueamento (LHA/CD38 e RHA/CD38) compreendidas no construto. LHA/CD38 e RHA/CD38 podem ter comprimento e sequência variáveis, dependendo do sítio de alvejamento pré-selecionado dentro do lócus de CD38. Em algumas modalidades, o sítio de alvejamento pré-selecionado está dentro de um éxon de CD38. Quando dois ou mais transgenes devem ser inseridos em um local selecionado no lócus de CD38, uma sequência ligante, por exemplo, um ligante 2A ou IRES, é colocada entre quaisquer dois transgenes. O ligante 2A codifica um peptídeo autoclivante derivado a partir de FMDV, ERAV, PTV-I e TaV (denominados "F2A", "E2A", "P2A" e "T2A", respectivamente), que permite que proteínas separadas sejam produzidas a partir de uma tradução única. Em algumas modalidades, os isoladores são incluídos no construto para reduzir o risco de silenciamento do transgene e/ou do promotor exógeno. O promotor exógeno pode ser CAG, ou outros promotores constitutivos, induzíveis,
temporais, de tecido ou específico de tipo de célula, incluindo, mas não se limitando a CMV, EF1α, PGK e UBC.
[000299] Como uma ilustração neste exemplo, o um ou mais transgene que foi incluído no construto knockin/knockout (KI/KO) que alveja CD38 compreende um ou ambos de hnCD16 e proteína de fusão IL15/IL15R (IL15RF). Em algumas modalidades, conforme fornecido na Seção I (2), o hnCD16 compreende um CD16 que compreende F176V e S197P; ou um CD16 que compreende F176V, mas sem nenhum domínio de clivagem; ou um CD16 que compreende pelo menos uma porção do ectodomínio de CD64. Em algumas modalidades, conforme fornecido na Seção I (4), a IL15RF compreende uma proteína de fusão IL15/IL15Rα com ou sem truncamento do domínio citoplasmático.
[000300] Como tal, é fornecido neste documento um construto para knockin e knockout que alvejam CD38, em que o construto compreende um LHA/CD38, um primeiro transgene e um RHA/CD38, em que o construto insere o primeiro transgene em CD38 em uma posição selecionada enquanto realiza knockout da expressão de CD38, e opcionalmente em que o primeiro transgene é acionado por um promotor endógeno de CD38 ao ser operativamente ligado ao promotor endógeno de CD38 após a integração. Em algumas modalidades, o construto que compreende um LHA/CD38, um primeiro transgene e um RHA/CD38, compreende, ainda, um segundo transgene e um ligante entre o primeiro e o segundo transgene. Em algumas modalidades, o construto que compreende um LHA/CD38, um ou mais transgenes e um RHA/CD38, compreende, ainda, um promotor exógeno, em que o construto insere o um ou mais transgenes na posição selecionada em CD38 enquanto realiza knockout da expressão de CD38, e em que o um ou mais transgenes são acionados pelo promotor exógeno. Em uma modalidade do construto que compreende um LHA/CD38, um ou mais transgenes e um RHA/CD38, os transgenes expressam uma ou ambas as proteínas hnCD16 e IL15RF, cada uma descrita em detalhes na Figura 1 e na Seção I (2) e I (4). A
Figura 17 e a Figura 18 demonstram sequências exemplificativas para construtos projetados para inserir em uma posição selecionada no lócus de CD38 hnCD16 e IL15RF (IL15RF truncada neste exemplo particular), acionado pelo promotor CAG (Figura 17), ou acionado por promotor CD38 endógeno (Figura 18), enquanto realiza knockout da expressão de CD38. Conforme fornecido nas figuras e entendido por um versado na técnica, alguns dos componentes compreendidos no construto ilustrado na Figura 17 e Figura 18 não são necessários de modo que sejam opcionais, e as sequências de ácido nucleico para alguns componentes incluídos podem variar e podem ter menos de cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, mas mais de 50% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico exemplificativa de cada componente ou o construto inteiro, conforme fornecido nas figuras.
[000301] Construto que tem (i) LHA/CD38, hnCD16 e RHA/CD38; ou (2) LHA/CD38, IL15RF hnCD16 e RHA/CD38; ou (3) LHA/CD38, IL15RF, hnCD16 e RHA/CD38, cada um foi tranduzido para modificar geneticamente células-tronco pluripotentes induzidas com uso da ferramenta de edição CRISPR, por exemplo, Cas9 ou Cpf1, conforme descrito neste pedido. Foi descoberto que a eficiência da inserção bialélica alvejada junto com o knockout bialélico é de cerca de 2 a 3% nas células que são inicialmente classificadas por IL15 ou CD16. Notavelmente, entre a integração alvejada monoalélica (cerca de 5%), a eficiência de knockout bialélico é maior. Como tal, a integração alvejada bialélica com knockout bialélico simultâneo parece ser um evento raro, especialmente quando comparada àquela de knockout de CD38 que ocorre sequencialmente (ou por etapas) (que poderia ser de 30% a 70% nesta etapa) e, em seguida, a inserção na célula de CD38 nulo para obter CD38-/- iPSCs que contêm o transgene (geralmente 25% a 80%, dependendo do vetor usado). No entanto, este método de knockout de CD38 com uso de integração de transgene que alveja CD38 reduz surpreendentemente a ocorrência de anormalidade do cariótipo durante a passagem e manutenção de longo prazo das iPSCs geneticamente modificadas resultantes em comparação com iPSCs sujeitas a eventos múltiplos e sequenciais de modificação genomas. Sem se ater à teoria, essa estabilidade genômica inesperada, entre outras razões desconhecidas, poderia ser atribuída a menos fatores de estresse associados à quantidade reduzida de manipulação de iPSCs de múltiplas rodadas de distúrbio genômico, incluindo única seleção de célula.
[000302] Após a seleção clonal da iPSC geneticamente modificada, verificação do vetor doador, depuração do vetor, confirmação de sequenciamento de inserção e knockout, citometria de fluxo para marcadores iPSC e fenótipos de transgene, verificação do número de cópias de transgene e verificação de cariótipo, as iPSCs clonais genomicamente editadas foram diferenciadas de acordo com os métodos fornecidos neste documento para células efetoras, tais como células iNK neste exemplo. Dependendo do construto usado, as células NK derivadas de iPSC obtidas têm pelo menos um dos seguintes genótipos: CD38-/-CD16; CD38-/- IL15; e CD38-/- CD16 IL15, nenhum dos quais existe na célula NK de contraparte natural/nativa obtida a partir de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador. A fenotipagem de citometria de fluxo de células CD38-/- CD16 IL15 iNK geneticamente modificadas com o construto de knockin de IL15/IL15ra-2A-hnCD16 que alveja CD38 em comparação com iNK não geneticamente modificada é mostrada na Figura 19. As células CD38-/- CD16 IL15 iNK exibiram persistência in vitro aprimorada quando cultivadas na ausência de IL-2 ou IL-15 por 4 dias em comparação com iNK não geneticamente modificado (FTi250) tratado de forma semelhante (consultar Figura 20). Além disso, a indução de fratricídio por daratumumabe ou rituximabe foi testada em células iNK não modificadas geneticamente ou CD38 - /- CD16 IL15 iNK e, conforme mostrado na Figura 21, apenas as células CD38 -/- CD16 IL15 iNK, mas não as células iNK não geneticamente modificadas, foram capazes de escapar do fratricídio induzido pelo anticorpo específico para CD38, tal como daratumumabe. Além disso, a citotoxicidade direta e ADCC foram testadas nas células CD38-/- CD16 IL15 iNK com uso de células Raji como alvo em combinação com anticorpo daratumumabe. Conforme mostrado na Figura 22, as células CD38-/- CD16 IL15 iNK demonstraram ADCC superior em comparação com células iNK não modificadas e intensificaram de maneira significativa a exterminação direcionada de anticorpo daratumumabe das células Raji que expressam CD38.
[000303] Uma pessoa versada na técnica observará prontamente que os métodos, composições e produtos descritos neste documento são representativos de modalidades exemplificativas, e não pretendem ser limitações no escopo da invenção. Será facilmente evidente para uma pessoa versada na técnica que várias substituições e modificações podem ser feitas na presente divulgação divulgada neste documento sem se afastar do escopo e da essência da invenção.
[000304] Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis das pessoas versadas na técnica à qual a presente divulgação se refere. Todas as patentes e publicações são incorporadas neste documento a título de referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada como incorporada a título de referência.
[000305] A presente divulgação ilustrativa descrita neste documento pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não sejam especificamente divulgados neste documento. Assim, por exemplo, em cada caso neste documento, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que, no uso de tais termos e expressões, exclua quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da presente divulgação reivindicada.
Assim, deve ser entendido que, embora a presente divulgação tenha sido especificamente divulgada por modalidades preferenciais e recursos opcionais, a modificação e a variação dos conceitos divulgados neste documento podem ser recorridas pelos versados na técnica, e que essas modificações e variações são consideradas como dentro do escopo desta invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto para modificar geneticamente uma célula para obter uma célula genomicamente editada, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um braço de homologia esquerdo e um braço de homologia direito que alvejam CD38 em uma posição selecionada no lócus de CD38 (LHA/CD38, RHA/CD38) no genoma da célula, operacionalmente ligado a (ii) uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas; em que a célula genomicamente editada é uma célula pluripotente induzida (iPSC), uma iPSC clonal ou uma célula de linhagem celular iPS; em que a célula genomicamente editada compreende uma integração alvejada da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas na posição selecionada no lócus de CD38 e knockout CD38; e em que a célula genomicamente editada é uma iPSC capaz de se diferenciar em uma célula hematopoiética derivada de iPSC.
2. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas estão operativamente ligadas a, e são acionadas por, um promotor endógeno de CD38 após integração; ou em que a posição selecionada no lócus de CD38 está em um éxon de CD38.
3. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas exógenas compreendem pelo menos um ou ambos dentre: (i) um CD16 não clivável de alta afinidade (hnCD16) ou uma variante do mesmo; e (ii) uma proteína exógena de fusão do receptor IL15/IL15 expressa na superfície celular (IL15RF) ou uma variante da mesma; e em que a célula genomicamente editada e a célula hematopoiética derivada da mesma compreendem a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam hnCD16 e IL15RF, ou variantes das mesmas.
4. Construto, de acordo com a reivindicação 3, (i) caracterizado pelo fato de que o hnCD16 ou uma variante do mesmo compreende pelo menos um dentre: (a) F176V e S197P no domínio ectodomínio de CD16; (b) um ectodomínio completo ou parcial originado a partir de CD64; (c) um domínio transmembranar não nativo (ou não CD16); (d) um domínio intracelular não nativo (ou não CD16); (e) um domínio de sinalização não nativo (ou não CD16); (f) um domínio estimulador não nativo; e (g) domínios transmembranar, de sinalização e estimulador que não são originados a partir de CD16 e são originados de um mesmo polipeptídeo ou de um diferente; ou (ii) em que a IL15RF ou uma variante da mesma compreende pelo menos um dentre: (a) IL-15 e IL15Rα coexpressas usando um peptídeo de autoclivagem; (b) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rα; (c) uma proteína de fusão IL15/IL15Rα com domínio intracelular de IL15Rα truncada; (d) uma proteína de fusão de IL15 e domínio Sushi aglutinado à membrana de IL15Rα; (e) uma proteína de fusão de IL15 e IL15Rβ; (f) uma proteína de fusão de IL15 e receptor comum γC, em que o receptor comum γC é nativo ou modificado; (g) um homodímero de IL15Rβ; e
(h) um polinucleotídeo que codifica uma IL15RF que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17, 19 ou 21.
5. Construto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o hnCD16 ou uma vriante do mesmo compreende um ou mais dentre: (i) um domínio transmembranar não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD3D, CD3E, CD3G, CD3ζ, CD4, CD8, CD8a, CD8b, CD27, CD28, CD40, CD84, CD166, 4-1BB, OX40, ICOS, ICAM-1, CTLA-4, PD- 1, LAG-3, 2B4, BTLA, CD16, IL7, IL12, IL15, KIR2DL4, KIR2DS1, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D ou receptor de células T (TCR); (ii) um domínio estimulador não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA, DAP10, DAP12, CTLA-4 ou NKG2D; (iii) um domínio de sinalização não nativo derivado a partir de polipeptídeo de CD3ζ, 2B4, DAP10, DAP12, DNAM1, CD137 (41BB), IL21, IL7, IL12, IL15, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C ou NKG2D; ou (iv) um domínio transmembranar não nativo é derivado a partir de NKG2D, o domínio estimulador não nativo é derivado a partir de 2B4 e o domínio de sinalização não nativo é derivado a partir de CD3ζ.
6. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula genomicamente editada e a célula hematopoiética derivada da mesma compreendem, ainda, um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR tem pelo menos uma das seguintes características: (i) específico de células T ou específico de células NK; (ii) CAR de aglutinação biespecífica ao antígeno; (iii) um CAR comutável; (iv) um CAR dimerizado; (v) um CAR dividido;
(vi) um CAR multicadeia; (vii) um CAR induzível; (viii) coexpresso com outro CAR; (ix) coexpresso com um peptídeo parcial ou total de uma citocina exógena expressa na superfície celular ou um receptor da mesma; (xi) coexpresso com um inibidor de ponto de verificação; (xii) codificado por um ácido nucleico adicionalmente compreendido no construto, em que o CAR é inserido na posição selecionada no lócus de CD38; (xiii) inserido no lócus de TRAC e/ou é acionado por um promotor endógeno de TCR e/ou o TCR é submetido a knockout pela inserção de CAR; (xiii) específico para CD19 ou BCMA; e/ou (xiv) específico para qualquer um dentre ADGRE2, anidrase carbônica IX (CAlX), CCRI, CCR4, antígeno carcinoembrionário (CEA), CD3, CD5, CD7, CD8, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CDS, CLEC12A, um antígeno de uma célula infectada por citomegalovírus (CMV), glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial 40 (EGP-40), molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), EGFRvIII, proteína tirosina-quinases de receptor erb- B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, proteína de aglutinação ao folato do ERBB (FBP), receptor fetal de acetilcolina (AChR), receptor de folato-a, Gangliosídeo G2 (GD2), Gangliosídeo G3 (GD3), Receptor 2 do Fator de Crescimento Epidérmico Humano (HER-2), transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT), ICAM-1, Integrina B7, subunidade alfa-2 de receptor da Interleucina-13 (IL-13Rα2), κ-cadeia leve, receptor de domínio de inserção de quinase (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), LILRB2, família de antígenos de melanoma A 1 (MAGE-A1), MICA/B, Mucina 1 (Muc-1), Mucina 16 (Muc-16), Mesotelina
(MSLN), NKCSI, ligantes de NKG2D, c-Met, antígeno de câncer/testículo NY- ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), PRAME, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno da membrana específico da próstata (PSMA) PRAME, glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, fator de crescimento endotelial vascular R2 (VEGF- R2), proteína tumoral de Wilms (WT-1) e um antígeno patogênico.
7. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um ou mais dentre: (i) um promotor exógeno que aciona a expressão da uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas, em que o promotor exógeno é constitutivo, induzível, específico temporal, de tecido e/ou de tipo celular; (ii) uma sequência ligante inserida entre duas sequências de ácido nucleico que codificam proteínas exógenas; (iii) um isolador na extremidade 3’ de LHA/CD38 e um isolador na extremidade 5’ de RHA/CD38 ; e (iv) um sinal poliA.
8. Construto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que (i) o promotor exógeno é CMV, EF1α, PGK, CAG ou UBC; (ii) a sequência ligante é uma sequência 2A que codifica um peptídeo 2A autoclivável; e/ou (iii) a sequência ligante é uma Sequência de Entrada Interna do Ribossomo (IRES).
9. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula genomicamente editada que é uma iPSC ou a célula hematopoiética derivada de iPSC compreende um ou mais dos seguintes fenótipos:
(i) compreendendo telômeros mais longos em comparação com sua célula de contraparte nativa obtida de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador; (ii) CD38-/- CD16; (iiii) CD38-/- IL15; e/ou (iv) CD38-/- CD16 IL15.
10. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula genomicamente editada que é uma iPSC ou a célula hematopoiética derivada de iPSC compreende, ainda, um ou mais dentre: (i) B2M nulo ou baixo; (ii) teor nulo ou baixo de CIITA; (iii) expressão introduzida de HLA-G ou HLA-G não clivável; (iv) deleção ou expressão reduzida em, pelo menos, um dentre TAP1, TAP2, Tapasina, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21; e (v) expressão introduzida ou aumentada em pelo menos um dentre HLA-E, 41BBL, CD4, CD8, CD16, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, receptor Fc, um engajador e receptor de disparo de superfície para acoplamento com engajadores bi ou multiespecíficos ou universais.
11. Construto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula hematopoiética derivada de iPSC compreende célula CD34 derivada, célula progenitora e tronco hematopoiética derivadas, célula hematopoiética multipotente progenitora derivada, célula progenitora de célula T derivada, célula progenitora de célula NK derivada, célula T derivada, célula NKT derivada, célula NK derivada ou célula B derivada; ou em que a célula hematopoiética derivada de iPSC compreende uma célula NK derivada ou uma célula T derivada e tem pelo menos uma das seguintes características que compreendem: (i) persistência e/ou sobrevivência aprimoradas; (ii) resistência aumentada às células imunes nativas; (iii) citotoxicidade aumentada; (iv) penetração tumoral aprimorada; (v) ADCC intensificada ou adquirida; (vi) capacidade intensificada em migração e/ou ativação ou recrutamento de células imunes espectadoras para sítios tumorais; (vii) capacidade intensificada para reduzir a imunossupressão de tumores; (viii) capacidade aprimorada de resgate de escape de antígeno tumoral; e (ix) fratricídio reduzido na presença de anticorpos anti- CD38 ou CD38 CAR, em comparação com sua célula de contraparte nativa obtida de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido doador.
12. Construto, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 é daratumumabe, isatuximabe ou MOR202, ou qualquer um dos fragmentos ou variantes modificados por Fc ou humanizados, equivalentes funcionais e biossimilares dos mesmos.
13. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um construto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
12.
14. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende um construto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13.
15. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um construto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, para a fabricação de uma iPSC genomicamente editada ou célula hematopoiética derivada diferenciada da mesma.
16. Kit caracterizado pelo fato de que compreende um construto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14 e um ou mais meios para cultura ou diferenciação de iPSC.
17. Construto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é para uso de um medicamento.
18. Método de produção de uma iPSC genomicamente editada ou célula hematopoiética derivada da mesma usando um construto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) introduzir o construto a uma iPSC, (ii) incubar a iPSC por um período de tempo suficiente para permitir a integração alvejada de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas no lócus de CD38 e, consequentemente, realizar knockout na expressão de CD38 da iPSC, obtendo assim uma iPSC genomicamente editada.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (iii) direcionar a diferenciação da iPSC genomicamente editada da etapa (ii) para a célula hematopoiética que compreende a mesma integração alvejada de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas exógenas no lócus de CD38 e knockout de CD38 como a iPSC genomicamente editada.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a iPSC genomicamente editada aprimorou a estabilidade genômica do que a iPSC em integração e knockout em eventos de edição separados e por etapas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa de introdução compreende, ainda, a introdução de um CRISPR-cas/gNA (ácido nucleico guia), uma ZFN, uma TALEN, uma nuclease de homing ou qualquer outra variação funcional dos mesmos.
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