BR112020015110A2

BR112020015110A2 - Método para preparar cristais de l-cisteína naturais por cromatografia contínua

Info

Publication number: BR112020015110A2
Application number: BR112020015110-6A
Authority: BR
Inventors: Jun-Woo Kim; Jung Min Lee; Se-Hee Jo; Il Chul Kim; In Sung Lee; Jun Young JUNG
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2021-01-05
Also published as: ZA202004019B; JP7100138B2; KR20190092951A; MY197843A; US11708591B2; WO2019151770A1; CA3088488A1; MX2020007764A; PH12020551074A1; EP3713914A4; EP3713914B1; BR112020015110B1; CA3088488C; US20210054424A1; CN111670179A; EP3713914A1; AU2019216085B2; CN111670179B; JP2021511307A; AU2019216085A1

Abstract

método para preparar cristais de l-cisteína naturais por cromatografia contínua a presente revelação refere-se a um método para preparar cristais de l-cisteína e a cristais de l-cisteína preparados pelo método. através do método para preparar cristais de l- cisteína da presente revelação, cristais de l-cisteína podem ser obtidos de um caldo de fermentação de l-cisteína natural com uma taxa de recuperação e/ou pureza alta sem uma reação química ou o uso de um composto sintético artificial.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA PREPARAR CRISTAIS DE L-CISTEÍNA NATURAIS POR CROMATOGRAFIA CONTÍNUA”

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um método para preparar cristais de L-cisteína e a cristais de L-cisteína preparados pelo método.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] L- Cisteína é produzida geralmente por decomposição de L-cistina de origem animal, que usa penas de pato ou cabelo humano como uma fonte de material de, ou derivado de fermentação de L-cistina, que usa um líquido de metabolismo microbiano como uma fonte de material, em L- cisteína por uma reação de redução eletroquímica. Por outro lado, como métodos para produzir L-cisteína com o uso de microrganismos, foi revelado um processo para produzir L- cisteína natural por fermentação com o uso de uma cepa que tem uma O-acetil-transferase modificada em um meio contendo sulfureto (US8802399B, US6946268B), e um processo para produzir L-cisteína natural misturando-se O-fosfo-homoserina produzida por um método de cultura microbiana com sulfureto e induzir uma reação catalítica de enzima com o uso de O- fosfoserina sulfidrilase (WO2013/089478, WO2012/053794).

[003] Embora tenha sido revelado que a L-cisteína produzida pelo método de cultura microbiana pode ser separada por cromatografia de troca iônica e outros métodos conhecidos, nenhuma informação é dada sobre o procedimento específico, rendimento, pureza, etc. (EP1645623A1, EP1298200B1, US20050221453A1, EP1234874A1, EP1571223A2 e EP1650296A).

[004] Por exemplo, foi revelado um processo para a purificação de L-cisteína com um rendimento de 90% ou mais por redução do pH de um caldo de fermentação contendo L-cisteína para um pH de 5 ou inferior e, em seguida, colocando-o em contato com um trocador catiônico ácido ou fortemente ácido de modo que a L-cisteína se ligue ao trocador de íons, e eluindo- se a L-cisteína ligada com uma solução aquosa de ácido clorídrico (US8088949B).

[005] Além disso, foi revelado um processo para purificar L-cisteína com um rendimento de 85% ou mais, colocando-se um caldo de fermentação contendo L-cisteína que tem um pH de 6 a 9 em contato com uma trocador aniônico básico, de modo que a L-cisteína se ligue ao trocador aniônico, eluindo-se a L-cisteína ligada com uma solução aquosa de ácido clorídrico, em seguida, colocando o eluato em contato com um trocador catiônico ácido a um pH de 4 ou abaixo, de modo que a L cisteína se ligue ao trocador catiônico, e eluindo a L-cisteína ligada com uma solução aquosa de ácido clorídrico (US9120729B).

[006] No entanto, os processos descritos acima têm desvantagens pelo fato de que os mesmos envolvem uma reação química uma vez que os mesmos são realizados através de etapas de troca de íons repetidas, que os mesmos exigem uma grande quantidade de água de processo, uma vez que uma grande quantidade de eluente é utilizada como uma etapa subsequente do processo de adsorção de íons e que uma etapa de purificação adicional deve ser realizada.

[007] Entretanto, foi revelada uma purificação de L- cisteína por um método químico com o uso de um solvente fortemente ácido (chinês Publicação de Patente Submetida a Inspeção Pública no CHN 105274554), mas um solvente fortemente ácido deve ser usado em uma grande quantidade e um solvente fortemente básico devem também ser usado em uma grande quantidade para neutralização do mesmo, o que provoca problemas ambientais.

[008] Assim, existe uma necessidade de um método para isolar L-cisteína com um rendimento e pureza superiores.

[009] Sob essas circunstâncias, os presentes inventores fizeram grandes esforços para aumentar a pureza e rendimento de cristais de L-cisteína e concluíram um método de purificação incluindo as vantagens de ter produtividade efetiva aumentada e consumo de água reduzido, como bem como alto rendimento e pureza.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[010] Um objetivo da a presente revelação é fornecer um método para preparar cristais de L-cisteína.

[011] Outro objetivo da presente revelação é fornecer cristais de L-cisteína preparados pelo método para preparar cristais de L-cisteína.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[012] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes.

[013] Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[014] Além disso, as pessoas versadas na técnica podem reconhecer e identificar inúmeros equivalentes para as modalidades específicas da invenção revelada no presente documento com o uso de não mais do que experimentação de rotina, e acredita-se que todos esses equivalentes estejam dentro do escopo da invenção.

[015] Em um aspecto da presente revelação para suprir os objetivos acima, é fornecido um método para preparar cristais de L-cisteína, que compreende: (a) obter um líquido separado após introduzir um caldo de fermentação em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 que contém L- cisteína em um aparelho de cromatografia contínua que tem uma resina de troca catiônica fortemente ácida como uma fase estacionária; (b) concentrar o líquido separado; e (c) recuperar os cristais de L-cisteína do concentrado.

[016] Como usado no presente documento, o termo “L- cisteína” é um dos aminoácidos constituintes e é o único aminoácido que contém enxofre que tem um grupo tiol (R-SH) entre L-aminoácidos. L- Cisteína pode ser aquela obtida por síntese química, ou preparação biológica através de fermentação microbiana, etc., mas não se limita a isso.

Especificamente, na presente revelação, de L-cisteína pode ser L-cisteína produzida biologicamente através de fermentação microbiana, ou pode ser L-cisteína natural obtida induzindo-se uma reação catalítica de enzima de O -fosfo-homoserina, que é um precursor preparado através de fermentação microbiana, com um sulfureto na presença de fosfosserina sulfidrilase. Em termos do processo de preparação, a L-cisteína natural pode ser L-cisteína obtida sem ser através de uma reação química, adsorção química, ou eluição.

[017] Como usado no presente documento, o termo “natural” indica que algo não depende de uma reação química.

De acordo com o Regulamentação de Aromas da UE 1334/2008, apenas substâncias obtidas por um processo físico, enzimático ou microbiano são definidas como agentes aromatizantes “naturais”. Do ponto de vista acima, independentemente de se a mesma é derivada de um animal ou fermentação microbiana, a L- cisteína produzida por uma reação de redução eletroquímica de L-cistina pode não ser chamada inteiramente natural.

[018] Como usado no presente documento, o termo “caldo de fermentação” se refere a um meio de cultura obtido por cultura de microrganismos que produzem L-cisteína, uma cultura contendo os micro-organismos cultivados em conjunto com a meio de cultura, ou uma solução de conversão de enzima contendo um precursor capaz de produzir L-cisteína e uma enzima.

Especificamente, o caldo de fermentação contendo L-cisteína pode ser um meio de cultura ou uma solução de conversão de enzima contendo L-cisteína natural. Mais especificamente, o mesmo pode ser uma cultura de L-cisteína ou meio de cultura preparado biologicamente por fermentação de micro-organismos que têm uma capacidade de produzir L-cisteína, ou uma solução de conversão de enzima L-cisteína natural obtida induzindo-se uma reação catalítica de enzima de O-fosfo-homoserina, que é um precursor preparado através de fermentação microbiana, com um sulfureto na presença de fosfosserina sulfidrilase.

Cristais de L-Cisteína preparados com o uso do caldo de fermentação como um líquido de origem não dependem de uma reação química e, portanto, podem ser denominados como L- cisteína natura.

[019] Na presente revelação, o caldo de fermentação pode ser usado como um líquido de origem para um processo de cromatografia contínua. Isto é, o mesmo pode ser introduzido dentro do aparelho de cromatografia contínua da etapa (a).

[020] O pH do caldo de fermentação a ser introduzido no aparelho de cromatografia contínua pode variar dependendo do método de preparação, mas pode ser na faixa de 2,5 a 10,0, de 2,5 a 9,5, 3,0 a 9,0, 3,5 a 8,5, 3,5 a 7,5, 4,5 a 7,0 ou 5,0 a 6,0. O próprio caldo de fermentação pode ser usado como um líquido de origem para a cromatografia contínua e uma etapa de ajustar o caldo de fermentação contendo L-cisteína para um pH de 2,5 a 9,5, especificamente 3,0 a 9,0, mais especificamente 3,5 a 8,5, adicionalmente mais especificamente 3,5 a 7,5, 4,5 a 7,0 ou 5,0 a 6,0 pode ser adicionalmente incluído, mas não é limitado a isso. Por exemplo, o pH pode ser ajustado por adição de um ácido tal como ácido sulfúrico ou ácido clorídrico, ou uma base tal como hidróxido de sódio (soda cáustica), amônia, hidróxido de lítio ou hidróxido de potássio, etc., mas não se limita a isso. O agente de ajuste de pH pode ser selecionado e usado adequadamente por as pessoas versadas na técnica desde que os cristais de L- cisteína possam ser obtidos sem afetar a estrutura de L- cisteína.

[021] À medida que o pH do caldo de fermentação de L- cisteína é reduzido, há uma forte tendência para que a L-

cisteína cationize. Como a fase estacionária da cromatografia contínua usada no presente documento é uma resina de troca catiônica fortemente ácida, a mesma tende a adsorver cátions, de modo que, quando a L-cisteína é cationizada, a mesma pode ser parcialmente adsorvida sobre a fase estacionária, reduzindo desse modo a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Além disso, a L-cisteína tem uma forte tendência a ser oxidada e convertida em L-cistina em pH mais elevado, o que pode reduzir a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Assim, o caldo de fermentação contendo L-cisteína pode ser um caldo de fermentação com um pH de 2,5 a 9,5, especificamente 3,0 a 9,0, mais especificamente 3,5 a 8,5, ainda mais especificamente 3,5 a 7,5, 4,5 a 7,0 ou 5,0 a 6,0.

[022] No entanto, como a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua pode ser afetada por vários parâmetros de processo, tais como a vazão entre torres de resina do processo de cromatografia contínua, a temperatura do processo, a composição da fase móvel, a sequência de cromatografia contínua, etc., a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua não é um fator que é limitado apenas pelo pH do líquido de origem para a cromatografia contínua.

[023] Na presente revelação, o método pode adicionalmente incluir uma etapa de diluir ou concentrar o caldo de fermentação contendo L-cisteína antes da etapa (a). A etapa pode ser realizada antes ou após a etapa de ajuste do pH descrita acima.

[024] A concentração pode ser realizada em um evaporador convencional (por exemplo, um evaporador de circulação forçada, um evaporador de filme fino ou um evaporador rotativo, etc.).

[025] A concentração de L-cisteína no caldo de fermentação diluído ou concentrado pode ser ajustada para 10 g/l a 180 g/l, especificamente, 10 g/l a 150 g/l, mas que não é um fator de que muito afeta a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua e a qualidade do líquido separado (especificamente, o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo umidade no líquido separado) obtido através de do processo de cromatografia contínua. Assim, ajustar a concentração do caldo de fermentação contendo L-cisteína usado como um líquido de origem para o processo de cromatografia contínua não é um processo essencial para a separação e purificação de L-cisteína. No entanto, quando a concentração é ajustada para 180 g/l ou mais, a concentração de L-cisteína é mais elevada do que a solubilidade da L-cisteína, de modo que cristais de L-cisteína de baixa qualidade são produzidos, os quais são inadequados para recuperação, resultando na deterioração da taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua. Quando a concentração do líquido de origem para o processo de cromatografia contínua é alta, a quantidade de água usada no processo de cromatografia contínua pode ser reduzida em relação à quantidade de L-cisteína usada para o tratamento. Essa característica não pode ser encontrada em um processo de troca iônica em que a quantidade de água usada é determinada pela quantidade de adsorção máxima de L- cisteína e uma resina de troca iônica.

[026] Como usado no presente documento, o termo “cromatografia contínua” se refere a um processo pelo qual um processo de cromatografia em lote convencional é realizado continuamente. Especificamente, uma fase sólida e uma fase líquida podem ser fornecidas continuamente para o aparelho de cromatografia, e a fase sólida e a fase líquida se movem em direções opostas entre si para provocar o contato de contracorrente, permitindo desse modo a separação de substâncias mais eficientemente. Na presente revelação, a cromatografia contínua pode ser usada no sentido de que a mesma inclui tanto cromatografia de leito em movimento verdadeira (TMB) quanto cromatografia de leito em movimento simulada (SMB). Além disso, uma vez que a cromatografia de leito em movimento verdadeira e a cromatografia de leito em movimento simulada empregam os mesmos princípios, as mesmas podem ser selecionadas adequadamente e usadas pelas pessoas versadas na técnica em consideração da produtividade e outras matérias.

[027] Quando o processo de cromatografia contínua é empregado na presente revelação, um processo de adsorção/eluição não é necessário, e assim, o mesmo tem as vantagens de ter uma alta produtividade por hora comparado a um de processo troca iônica e reduzir a quantidade de água usada no processo. Além disso, a fim de obter um produto em pó de L-cisteína a partir de um processo de líquido contendo L- cisteína obtida por um processo de troca iônica ou processo de cromatografia comum com um alto rendimento, uma grande quantidade de energia é exigida em uma concentração de processo de cristalização. A esse respeito, o custo de energia pode ser reduzido de acordo com o método da presente revelação.

[028] Em uma modalidade da presente revelação, um aparelho de cromatografia de SMB pode ser usado, e um diagrama esquemático do aparelho de cromatografia de SMB é mostrado na Figura 2. Os parâmetros de processo tais como o número de torres de resina, o volume das torres de resina, a capacidade de preenchimento de resina, a vazão de cada seção, a presença ou ausência de instalação de tanque de tampão, o tempo de movimento das torres de resina, etc. podem variar, e não estão limitados às condições fixas especificadas acima.

[029] A fase estacionária do aparelho de cromatografia contínua pode ser uma resina de troca iônica, e especificamente, a mesma pode ser uma resina de troca catiônica fortemente ácida. O grupo funcional da resina de troca catiônica fortemente ácida pode ser um grupo sulfato, mas não se limita a isso. Além disso, o composto precursor da resina de troca catiônica fortemente ácida usada no presente documento não é limitado desde que um grupo funcional fortemente ácido possa ser ligado ao mesmo. Por exemplo, um copolímero de estireno-divinilbenzeno pode ser usado, mas não se limita a isso. Em um exemplo específico, a resina de troca catiônica fortemente ácida pode ser um copolímero de ácido estireno-divinilbenzeno sulfúrico, mas não se limita a isso.

[030] Quando copolímeros de estireno-divinilbenzeno que não tem grupo funcional, resinas de troca que não tem grupo funcional, tais como polímeros metacrilato que não tem grupo funcional; resinas de troca aniônica fortemente básicas tais como copolímeros de trimetilamina estireno- divinilbenzeno; resinas de troca aniônica fracamente básicas, tais como copolímeros de estireno-divinilbenzeno amina terciários; resinas de troca catiônica fracamente básicas, tais como polímeros metacrilato carboxilo, etc., são usadas na presente revelação como outros tipos de fases estacionárias usadas comumente na separação e purificação de aminoácidos na técnica, é difícil purificar L-cisteína em um conteúdo sólido de 50% (p/p) ou mais excluindo umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia contínua.

Entretanto, quando uma resina de troca catiônica fortemente ácida, tal como um copolímero ácido estireno-divinilbenzeno sulfúrico é usado, é possível purificar L-cisteína em um conteúdo sólido de 80% (p/p) ou mais excluindo umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia contínua, especificamente 90% (p/p) ou mais.

[031] No aparelho de cromatografia, água à qual nenhum composto químico (tal como um solvente orgânico, tal como metanol, álcool isopropílico, acetonitrilo, etc.) é adicionado, uma solução de soda cáustica diluída, uma solução de ácido sulfúrico diluído, uma solução de ácido fosfórico diluído, uma solução de ácido clorídrico diluído, uma solução de hidróxido de potássio diluído ou uma mistura das mesmas podem ser usadas como um dispositivo de fase móvel, mas não se limita a isso. Em um exemplo específico, pode ser usada água como uma fase móvel para a cromatografia contínua. Quando uma fase móvel contendo um composto químico é usada, o composto químico pode permanecer no produto final, de modo que pode não ser possível vender o produto uma vez que o mesmo pode ter excedido o limite de resíduo padrão para o composto químico, ou pode ser impossível distribuir o produto como um produto natural. Além disso, uma vez que nenhuma substância química além de água é adicionada à água do processo, um efeito de redução de custos de produção pode ser esperado. No processo de troca iônica, a fim de eluir a L-cisteína ligada, um solvente tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico é usado essencialmente como um eluente e, por conseguinte, o seu uso é acompanhado inevitavelmente por um aumento no custo de produto associado com o uso e descarte das substâncias químicas.

[032] Quando o caldo de fermentação contendo L- cisteína é introduzido no aparelho de cromatografia contínua na etapa (a), um líquido separado contendo L-cisteína pode ser obtido à medida que a L-cisteína é separada de acordo com a cromatografia contínua. Como usado no presente documento, o líquido separado contendo a L-cisteína separada pode ser brevemente denominado como um “líquido separado”, um “líquido separado de cromatografia” ou um “líquido do processo”.

[033] A qualidade do líquido separado pode ser avaliada pelo conteúdo de L-cisteína no sólido excluindo a umidade no líquido separado. O líquido separado da presente revelação pode ter um conteúdo sólido de L-cisteína, excluindo a umidade, de 80% (p/p), especificamente 85% (p/p), mais especificamente de 90% (p/p) ou mais. Cristais de L-Cisteína que têm uma pureza de 90% ou mais podem ser preparados quando o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado é de 80% ou mais. Especificamente, os cristais de L- cisteína que têm uma pureza de 98 % ou mais podem ser preparados quando o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no separado líquido é de 90% ou mais.

[034] No entanto, uma vez que a pureza dos cristais de L-cisteína pode ser afetada por outras condições de processos tais como concentração, cristalização, separação de cristal, etc., a pureza dos cristais de L-cisteína não é um fator que é limitado apenas pelo conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido do processo produzido pela cromatografia contínua.

[035] Na presente revelação, a etapa (a) pode ser denominada como um “processo de cromatografia contínua”. O termo “a taxa de recuperação do processo de cromatografia contínua” se refere à taxa de recuperação de L-cistina no líquido separado obtido, em relação ao caldo de fermentação introduzido na etapa (a), e é usado para avaliar a eficiência do processo. A taxa de recuperação da cromatografia contínua na presente revelação pode ser de 50% (p/p), especificamente 60% (p/p), mais especificamente de 70% (p/p), e mais especificamente de 80% (p/p) ou mais, mas não é limitado a isso.

[036] A etapa (b) é uma etapa para concentrar o líquido separado para cristalização. Na etapa (b), um concentrado pode ser obtido concentrando-se o líquido separado. A concentração pode ser realizada em um evaporador convencional (por exemplo, um evaporador de circulação forçada, um evaporador de filme fino, ou um evaporador rotativo, etc.) pelas pessoas versadas na técnica através de uma seleção apropriada. A concentração de L-cisteína no concentrado da etapa (b) pode ser na faixa de 100 g/l a menos do que 800 g/l, especificamente 200 g/l a menos do que 800 g/l, 300 g/l a menos do que 800 g/l, mais especificamente menos de 300 g/l a 500 g/l, mas não é limitado a isso.

[037] Quando a concentração de L-cisteína no concentrado é baixa, cristalização não ocorre durante a concentração devido à falta de supersaturação exigida para nucleação e crescimento de cristal, e a cristalização pode ser alcançada durante a refrigeração, ou a cristalização pode ser realizada através de um processo adicional. No entanto, a taxa de recuperação pode ser baixa ou o tempo de cristalização pode ser prolongado. Quando a concentração de L-cisteína no concentrado é de 300 g/l ou mais, núcleos de cristal de L- cisteína podem ser formados durante o processo de concentração. Além disso, quando a pasta fluida de L-cisteína concentrada a 300 g/l ou mais é resfriada, a taxa de recuperação do processo de cristalização para a L-cisteína pode aumentar. Quando a concentração de L-cisteína no concentrado é 800 g/l, a solidificação pode ocorrer devido à formação de uma grande quantidade de cristais de partículas, e consequentemente, a agitação da pasta fluida de cristais e a separação de cristal pode não ser possível. A concentração de L-cisteína no líquido separado pode ser ajustada apropriadamente dentro da faixa de 100 g/l a menos do que 800 g/l, especificamente 200 g/l a menos do que 800 g/l, mais especificamente de 300 g/l a menos do que 800 g/l ou 300 g/l a

500 g/l. Quando a cristalização de resfriamento é realizada com o líquido separado que tem a concentração dentro da faixa acima, a pureza dos cristais de L-cisteína podem ser 98% ou mais. No entanto, uma vez que a pureza dos cristais de L- cisteína pode ser afetada por outras condições de processo tais como concentração, cristalização, separação de cristal, etc., a pureza dos cristais de L-cisteína pode não ser um fator de que é limitado apenas pela concentração de L-cisteína no concentrado obtido por concentrar o líquido do processo produzido por cromatografia de SMB.

[038] A cristalização de L-cisteína pode ocorrer durante a concentração de acordo com a etapa (b). Como usado no presente documento, o termo "cristalização" se refere a um fenômeno pelo qual um líquido ou um sólido em estado amorfo forma um cristal e é acompanhado por dois fenômenos chamados nucleação e crescimento de cristal.

[039] O concentrado pode formar e/ou aumentar núcleos de cristal através de resfriamento e/ou envelhecimento antes da recuperação. Além disso, mesmo quando os cristais de L- cisteína são não precipitados do concentrado, os cristais podem ser formados durante o resfriamento ou envelhecimento do concentrado.

[040] A etapa de resfriamento pode se referir especificamente ao resfriamento para uma temperatura de -10 °C a 55 °C durante um período de 2 horas a 6 horas, resfriamento especificamente para uma temperatura de 0 °C a 45 °C durante um período de 2 horas a 6 horas, mais especificamente de resfriamento para uma temperatura de 0 °C a 30 °C, e ainda mais especificamente de resfriamento para uma temperatura de 0 °C a 15 °C ao longo de um período de 2 horas a 6 horas.

[041] A etapa de envelhecimento pode se referir a permitir permanecer sem alterar a temperatura. Na presente revelação, a mesma pode se referir a manter constante a temperatura resfriada, ou pode se referir a manter constante a temperatura do concentrado mesmo quando o mesmo não está resfriado. Especificamente, o envelhecimento pode ser alcançado durante um período de 1 hora a 3 horas.

[042] A etapa (b) na presente revelação pode ser denominada como um “processo de cristalização”. A “taxa de recuperação do processo de cristalização” se refere à taxa de recuperação de L-cisteína dos cristais de L-cisteína obtidos em relação à L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia contínua, e é usada para avaliar a eficiência do processo de cristalização. A taxa de recuperação da recuperação do processo de cromatografia contínua pode ser de 50% (p/p), especificamente 60% (p/p), mais especificamente de 70% (p/p), ainda mais especificamente 80% (p/p) ou mais.

[043] NA etapa (c), os cristais de L-cisteína precipitados a partir do concentrado podem ser recuperados.

Especificamente, os cristais de L-cisteína podem ser recuperados da pasta fluida por submetendo-se o concentrado a uma separação sólido-líquido. Isso pode ser realizado com o uso de uma separador sólido-líquido, tal como um aparelho de filtração por membrana de pressão reduzida, um aparelho de filtração por membrana de pressão, um aparelho de separação centrífuga, etc., mas não se limita a isso. A pasta fluida e/ou cristais de cisteína precipitados podem ser submetidos a lavagem ou secagem adicional.

[044] Na presente revelação, o filtrado obtido pela recuperação dos cristais de L-cisteína na etapa (c) é um líquido precursor que tem L-cisteína residual, e pode ser total ou parcialmente adicionado ao caldo de fermentação da etapa (a) ou ao líquido separado da etapa (b), a fim de melhorar a taxa de recuperação durante a purificação final de L-cisteína, mas não se limita a isso.

[045] A pureza dos cristais de L-cisteína preparados de acordo com a método de preparação da presente revelação pode ser de 95% (p/p) ou mais, especificamente 98% (p/p), mais especificamente de 99% (p/p).

[046] Em outro aspecto da presente revelação para suprir os objetivos acima, são fornecidos cristais de L- cisteína preparados pelo método para preparar cristais de L- cisteína descrito acima.

[047] Os cristais de L-cisteína e o método de preparação dos mesmos são como descritos acima.

EFEITOS VANTAJOSOS

[048] O método para preparar cristais de L-cisteína da presente revelação é capaz de separar e purificar o caldo de fermentação de L-cisteína como o mesmo está em seu estado natural sem uma reação química ou o uso de compostos sintéticos artificiais, e obter cristais de L-cisteína com uma alta taxa de recuperação e/ou pureza ao mesmo tempo. Além disso, o método de preparação da presente revelação mostra produtividade eficiente e, em particular, o consumo de água pode ser significativamente reduzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[049] A Figura mostra uma ilustração representativa de um processo para preparar cristais de L-cisteína por cromatografia contínua a partir de L-cisteína natural contida em um caldo de fermentação.

[050] A Figura mostra o arranjo de torres de resina e a vazão para cada seção de cromatografia de SMB usada em uma modalidade da presente revelação.

MODO PARA A INVENÇÃO

[051] Doravante, a presente revelação será descrita em mais detalhes por meio de Exemplos. No entanto, esses exemplos são dados apenas para fins ilustrativos, e o escopo da invenção não é deve ser limitado por esses Exemplos.

MÉTODOS DE TESTE

[052] Métodos analíticos comuns usados nos Exemplos da presente revelação são como se segue: (1) HPLC PARA ANÁLISE QUANTITATIVA DE L-CISTEÍNA

[053] As condições para a análise de HPLC para analisar a pureza e concentração de L-cisteína na presente revelação são como se segue: Aparelho: HPLC 1260 Infinity System (Agilent Technology Inc.) Coluna: HP C18 (150 mm × 3,9 mm; 5 μm) Fase móvel: Acetonitrila/Água/Ácido heptafluorobutírico (8/92/0,1) Vazão: 0,425 ml/min Temperatura: 30°C Detecção: UV a 220 nm Volume de amostra introduzida: 2 µl (2) MÉTODO PARA MEDIR A PUREZA DOS CRISTAIS DE L-CISTEÍNA

[054] Na presente revelação, a qualidade de cristais de L-cisteína é avaliada com base na pureza de L-cisteína, e o procedimento da mesma é como segue: (a) Colocar os cristais de L-cisteína em um secador a vácuo contendo sílica gel por 24 horas sob um vácuo de 20 mmHg ou abaixo para remover a umidade residual e resfriar a temperatura dos cristais dride de L-cisteína à temperatura ambiente; (b) Preparar uma amostra de 0,5000 g/l por medindo-se quantitativamente 0,5000 g de cristais de L-cisteína resfriados para temperatura ambiente, colocando a mesma em um balão volumétrico de 1 l, e diluindo a mesma com uma solução de HCl 0,2 N; (c) Preparar uma amostra de 0,5000 g/l medindo-se quantitativamente 0,5000 g dos cristais de L-cisteína, colocando a mesma em um balão volumétrico de 1 l, e diluindo a mesma com uma solução HCl 0,2 N, após tratar os cristais padrão de L-cisteína (≥99,0%) da mesma maneira que na etapa (a), subsequentemente, determinar a pureza de um produto padrão através do certificado do fabricante de reagente padrão, e, em seguida, converter a concentração de L-cisteína na amostra (convertida [concentração de L-cisteína] é 0,5000 g/l × [pureza do produto padrão ]); e (d) Analisar a pureza dos cristais de L-cisteína usados na etapa (a) com o uso da amostra preparada na etapa (c) como um externo padrão e analisar a amostra preparada na etapa (b) por HPLC.

(3) MÉTODO PARA ANALISAR O CONTEÚDO DE L-CISTEÍNA COM BASE

EM SÓLIDOS NO CALDO DE FERMENTAÇÃO OU NO LÍQUIDO SEPARADO DE ACORDO COM O PROCESSO DE CROMATOGRAFIA

[055] Na presente revelação, a qualidade do caldo de fermentação ou do líquido separado de acordo com o processo de cromatografia é avaliada com base no teor de L-cisteína nos sólidos obtidos por remoção de umidade da solução, e o procedimento desses é como se segue:

(a) Desodorizar um recipiente de porcelana com cerca de 5 g de areia do mar (10 a 20 mesh; Daejung Chemicals) e remover a umidade residual colocando-se o mesmo em um forno de circulação forçada a 105 °C durante 3 horas, e, em seguida,

resfriar o mesmo para temperatura ambiente colocando-o em um secador a vácuo contendo sílica gel por 1 hora;

(b) Adicionar a solução a ser analisada ao recipiente da etapa (a), e quantificar a [massa de solução] com o uso da diferença de peso antes e após a adição;

(c) Remover a umidade residual colocando-se o recipiente em um forno de circulação forçada a 105 °C durante 3 horas, e,

em seguida, resfriar o mesmo para temperatura ambiente colocando-o em um secador a vácuo contendo sílica gel por 1 hora, subsequentemente, quantificar a quantidade de umidade removida com o uso da diferença de peso, e converter o conteúdo sólido em massa da solução a ser medido com o uso do mesmo ([conteúdo sólido em massa] é ([massa da solução] -

[massa de umidade removida]) / [massa da solução]);

(d) Medir a densidade da solução a ser analisada com o uso de um analisador de gravidade específico;

(e) Medir a concentração de L-cisteína na solução a ser analisada por HPLC; e

(f) Converter o conteúdo de L-cisteína no sólido excluindo a umidade na solução a ser analisada com o uso do conteúdo sólido em massa da solução, densidade e a concentração de L-

cisteína ([teor de L-cisteína no sólido excluindo umidade na solução] é [concentração de L-cisteína]/[densidade da solução]/[conteúdo sólido em massa da solução]).

EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 1) PREPARAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO CONTENDO L-CISTEÍNA

[056] Após obter um caldo de fermentação de O- fosfoserina cultivando-se um microrganismo capaz de produzir O-fosfoserina em um meio de fermentação, o caldo de fermentação foi submetido a uma reação de conversão enzimática com um sulfureto com o uso de O-fosfoserina sulfidrase (OPS sulfidrase) para obter um caldo de fermentação contendo L- cisteína.

[057] Especificamente, a cepa KCCM 11103P (CA07- 0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC; Patente no KR 10-1381048), que é uma cepa E. coli W3110 modificada em que SerB é removida e SerA* mutante é introduzida para ter uma capacidade de produzir OPS, foi cultivada em uma de placa ágar MMYE a 33 °C durante 24 horas e 1/10 das células sobre a placa foram raspadas de uma placa e inoculadas em um balão de semente médio (10 g/l de glicose, 0,5 g/l de sulfato de magnésio, 3 g/l de di-hidrogenofosfato de potássio, 10 g/l de extrato de levedura, 0,5 g/l de cloreto de sódio, 1,5 g/l de cloreto de amônio, 12,8 g/l pirofosfato de sódio, 1 g/l de glicina) em um frasco de defletor para realizar uma cultura de semente a 200 rpm a 30 °C durante 6 horas. Depois da cultura da semente ser concluída, o meio de cultura de semente com um volume correspondente a 16% do volume do meio de cultura principal foi inoculado em um fermentador de tamanho pequeno de 1 l preenchido com 300 ml do meio de cultura principal, e a cultura foi realizada a 33 °C em pH 7,0 para obter um caldo de fermentação de OPS. O caldo de fermentação de OPS 50 mM foi reagido com 50 mg/ml da enzima Msm-T derivada de Mycobacterium tuberculosis H37Rv sob uma condição de Na 2S 100 mM e 5′-fosfato de piridoxal 0,2 mM (PLP) para obter um caldo de fermentação contendo L-cisteína (Patente no KR 10-1381048).

[058] O pH do caldo de fermentação de L-cisteína foi de 9,3 e a concentração de L-cisteína foi 26 g/l. O conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no caldo de fermentação L-cisteína foi de 26,7%. O pH do caldo de fermentação foi ajustado por abaixando-se para um pH de 5,5 com o uso de ácido sulfúrico a 98%. O caldo de fermentação foi concentrado com o uso de um evaporador de filme fino para preparar um caldo de fermentação de L-cisteína que tem uma concentração de L-cisteína de 120 g/l como um líquido de origem para cromatografia de SMB. As condições de concentração são as seguintes: Pressão interna: 80 mmHg Pressão de vapor: 2 bar Quantidade máxima de injeção: 100 l Vazão de circulação forçada de líquido do processo: 10 l/min Taxa de evaporação: cerca de 25 l/h (2) OBTENÇÃO DE LÍQUIDO SEPARADO NO QUAL A L-CISTEÍNA É

SEPARADA COM O USO DE APARELHO DE CROMATOGRAFIA CONTÍNUA

[059] A fim de obter um líquido separado em que a L- cisteína foi separada, foi usado um aparelho de cromatografia de SMB. Um diagrama esquemático do aparelho de cromatografia de SMB é mostrado na Figura 2.

[060] Especificamente, conforme mostrado na Figura 2, o aparelho era composto por um total de 15 torres de resina. O volume de cada torre era de 1,5 l e a resina foi preenchida até 95% do volume da torre. O líquido de origem de SMB foi introduzido na torre resina 8 a uma vazão de 15 ml/min. A fase móvel foi introduzida na torre de resina 1 a uma vazão de 95 ml/min. O líquido do processo de produção de SMB (líquido separado) foi descarregado da torre de resina 3 a uma vazão de 50 ml/min. O líquido residual do processo de SMB foi descarregado da torre de resina 12 a uma vazão de 60 ml/min. O líquido descarregado da torre de resina 15 foi misturado com a fase móvel a uma vazão de 65 ml/min e, em seguida, a mistura foi introduzida na torre de resina 1 a uma vazão total de 160 ml/min. Um tanque de tampão de 1 l foi instalado entre as torres de resina 7 e 8 para permitir o controle automático, controlando-se o nível de água, de modo que o líquido de origem para a cromatografia de SMB pudesse fluir para as torres de resina a uma taxa de fluxo constante. As torres de resina foram movidas no sentido de diminuir o número a cada 8 minutos, mas as mesmas foram conduzidas de uma maneira circulante de modo que a torre de resina 1 foi movida para torre de resina 15.

[061] No Exemplo de Preparação, cada uma das resinas TRILITE® MCK32L, PUROLITE® PCR642, o r Diaion® UBK555, que são resinas de copolímero de estireno-divinilbenzeno que têm um grupo sulfato ácido forte como um grupo funcional, foi carregada para a torre de resina do aparelho de cromatografia, e 0,1 kl ou mais do líquido de origem para cromatografia de SMB foi introduzido na mesma. Em seguida, o aparelho foi operado para obter um líquido de processo de produção de SMB (líquido separado). Os líquidos separados tinham um pH de 6,1, 6,3 e 5,9, respectivamente, e a concentração de L-cisteína era de 35,1 g/l, 34,8 g/l e 33,9 g/l, respectivamente.

(3) CONCENTRAÇÃO

[062] O líquido separado foi concentrado conectando-se linearmente um tubo de concentração de filme fino e um tubo de concentração do tipo de circulação forçada até que a concentração de L-cisteína alcançasse 400 g/l. Os cristais de L-cisteína foram precipitados durante a concentração, e a temperatura da pasta fluida de cristais de L-cisteína era de 55 °C imediatamente após a concentração. As condições de concentração são as seguintes:

Pressão interna: 80 mmHg Pressão de vapor: 2 bar Quantidade máxima de injeção: 100 l Vazão de circulação forçada de líquido do processo: 10 l/min Taxa de evaporação: cerca de 10 l/h (4) ARREFECIMENTO E RECUPERAÇÃO DE CRISTAIS DE L-CISTEÍNA

[063] A pasta fluida de cristais de L-cisteína foi resfriada em um tanque revestido a 15 °C durante 4 horas em uma taxa de resfriamento constante, em agitação, e agitada durante 2 horas à mesma temperatura que a temperatura na conclusão do resfriamento. Depois disso, os cristais de L- cisteína foram submetidos a uma separação sólido-líquido a partir da pasta fluida de cristais de L-cisteína com o uso de um separador de cesto centrífugo. As condições de separação do separador de cesto são como se segue: Equipamento: Separador de cesto de 4.5 l (H-122; Kokusan) Líquido de lavagem: água triplamente destilada Tipo de filtro: Pano de filtro de fibra multifilamento de poliamida Permeabilidade ao ar do filtro: 250 l/m 2/s (a 2 mbar) Velocidade de rotação da bacia: 3.000 rpm Tempo de rotação da bacia: 20 min

[064] Durante a separação, o líquido de lavagem foi adicionado 20% do volume da pasta fluida de cristais de L-

cisteína. Após a separação, o resultante foi seco a 75 °C por 2 horas ou mais, com o uso de um secador de leito fluidizado para diminuir a umidade residual para 12,0% ou menos e, finalmente, foram preparados cristais de L-cisteína.

[065] Então, o rendimento do processo de cromatografia de SMB, o conteúdo sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia de SMB e a pureza dos cristais de L-cisteína foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia de SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação com o caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia de SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 1 juntamente com os resultados obtidos no Exemplo de Preparação. Quando uma resina de copolímero de estireno- divinilbenzeno que tem um grupo sulfato como um grupo funcional foi usada como uma fase estacionária, todos os resultados experimentais mostraram que o rendimento do processo de cromatografia de SMB foi mais do que 90%, que o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado obtido através do processo de cromatografia de SMB foi de 92,5% ou mais e que a pureza dos cristais de L-cisteína era de 98,6 % ou mais.

[066] Com base nisso, pode ser confirmado que quando a cromatografia contínua é realizada empregando-se uma resina de fase estacionária que tem um grupo funcional fortemente ácido,

podem ser obtidos cristais de L-cisteína com um alto rendimento e pureza.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 1 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM OS TIPOS

DE RESINAS DE TROCA IÔNICA

[067] No Exemplo de preparação, cristais de L-cisteína foram preparados apenas variando-se as resinas de fase estacionária carregadas no aparelho de cromatografia de SMB.

Especificamente, foram selecionadas como resinas usadas como a fase estacionária, aquelas que podem ser usadas industrialmente sem dificuldade e que podem ser produzidas por produção em massa. As resinas foram selecionadas com base nos grupos funcionais, de modo que os mesmos contenham um grupo carboxilo fracamente ácido, um grupo trimetilamino fortemente básico, um grupo amino terciário básico fraco e grupo não funcional.

[068] Então, o rendimento do processo de cromatografia de SMB, o conteúdo sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia de SMB e a pureza dos cristais de L-cisteína finalmente recuperados foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia de SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação com o caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia de SMB.

Os resultados são mostrados na Tabela 1 juntamente com os resultados obtidos no Exemplo de Preparação.

TABELA 1 Rendim ento Pureza Tipo de da dos Grupo Conteúdo de fase cromat cristai Componente funcio L-cisteína estacioná ografi s de L- nal (%) ria a de cisteín SMB a (%) (%) Copolímero de Grupo TRILITE® estireno- sulfat 92,4 93,2 99,2 MCK32L divinilben o zeno Copolímero de Grupo PUROLITE® estireno- sulfat 90,8 92,9 98,6 PCR642 divinilben o zeno Copolímero de Grupo DIAION® estireno- sulfat 91,4 92,5 99,3 UBK555 divinilben o zeno Copolímero de Sem DIAION® estireno- Nenhum 22,6 37,5 cristal SP850 divinilben ização zeno Copolímero de Sem MACRONET® estireno- Nenhum 25,4 44,5 cristal MN202 divinilben ização zeno Copolímero de Sem

AMBERLITE estireno- Nenhum 25,8 31,8 cristal ®XA1600 divinilben ização zeno Polímero Sem DIAION® metacrilat Nenhum 16,2 39,1 cristal HP2MGL o ização Copolímero de Grupo Sem DIAION® metacrilat carbox 15,4 32,7 cristal WK10 o- ila ização divinilben zeno

Rendim ento Pureza Tipo de da dos Grupo Conteúdo de fase cromat cristai Componente funcio L-cisteína estacioná ografi s de L- nal (%) ria a de cisteín SMB a (%) (%) Copolímero Grupo de Sem TRILITE® trimet estireno- 13,5 38,9 cristal AMP16 ilamin divinilben ização o zeno Copolímero Grupo de Sem TRILITE® amino estireno- 14,2 32,2 cristal AW90 terciá divinilben ização rio zeno

[069] Quando a resina de copolímero de estireno- divinilbenzeno que tem um grupo sulfato como um grupo funcional foi usada como uma fase estacionária, todos os resultados experimentais mostraram que o rendimento do processo de cromatografia de SMB foi mais do que 90%, que o conteúdo de L-cisteína foi de 92,5% ou mais e que a pureza dos cristais de L-cisteína foi de 98,6 % ou mais. Por outro lado, quando os cristais foram obtidos empregando-se as resinas que têm um grupo carboxilo fracamente ácido, um grupo trimetilamino básico forte, um grupo amino terciário básico fraco ou grupo não funcional, o rendimento do processo de cromatografia de SMB foi de 13,5 % a 25,8 % e o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado foi de 31,8 % a 44,5%. Ou seja, o rendimento e o conteúdo foram reduzidos em 50% ou mais em comparação com o rendimento e o conteúdo obtidos quando um grupo funcional fortemente ácido foi usado como uma fase estacionária.

[070] Com base nisso, foi confirmado que no caso em que a resina que tem um grupo funcional fortemente ácido foi usada como uma fase estacionária quando o caldo de fermentação de L-cisteína foi separado e cristalizado pela cromatografia contínua, puderam ser obtidos cristais de L-cisteína com um rendimento, concentração e pureza altos.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 2 - AVALIAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO CONTENDO L-CISTEÍNA DE ACORDO COM O PH

[071] No Exemplo de Preparação (usado TRILITE® MCK32L), cristais de L-cisteína foram preparados apenas variando o pH do caldo de fermentação contendo L-cisteína.

Especificamente, após obter o caldo de fermentação contendo L- cisteína da mesma maneira que no Exemplo de Preparação, o pH do caldo de fermentação foi variado de 2,5 a 9,5 com o uso de ácido sulfúrico a 98% ou uma solução de soda cáustica a 50%

[072] Então, o rendimento do processo de cromatografia de SMB, o conteúdo sólido de L-cisteína (%) no líquido separado obtido através do processo de cromatografia de SMB e a pureza dos cristais de L-cisteína finalmente recuperados foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cromatografia de SMB foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína no líquido separado em comparação com o caldo de fermentação introduzido no aparelho de cromatografia de SMB.

Os resultados são mostrados na Tabela 2.

TABELA 2 Taxa de Pureza dos pH do caldo recuperação Teor de L- cristais de de de cisteína (%) L-cisteína fermentação cromatografia (%) SMB (%) 2,5 30,1 81,3 90,2 3,0 59,4 85,4 93,2 3,5 68,2 90,1 98,1 4,0 76,5 91,2 98,7 4,5 88,2 93,7 99,5 5,0 90,2 94,5 99,6 5,5 92,4 93,2 99,2 6,0 91,8 92,1 98,7 6,5 89,4 92,7 98,7 7,0 86,1 92,2 98,6 7,5 69,2 90,3 98,3 8,0 60,3 88,4 91,1 8,5 58,2 87,9 94,5 9,0 50,4 85,7 92,7 9,5 22,7 58,2 65,3

[073] Foi constatado que o rendimento do processo de cromatografia de SMB foi encontrado é de 50% ou mais em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0, 85% ou mais em uma faixa de pH de 4,5 a 7,0 e 90% em uma faixa de pH de 5,0 a 6,0. O conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade no líquido separado obtido através de do processo de cromatografia de SMB foi 85% ou mais em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 e 90% ou mais em uma faixa de pH de 3,5 a 7,5.

[074] Além disso, foi constatado que a pureza dos cristais de L-cisteína é de 90% ou mais em uma faixa de pH de 2,5 a 9,0 e 91% ou mais em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0. Em particular, a pureza foi de 98% ou mais em um intervalo de pH de 3,5 a 7,5.

[075] Mesmo quando o pH do caldo de fermentação foi menor do que 3,0 ou 9,0 ou mais, foi possível realizar a cromatografia de SMB com o uso do caldo de fermentação de L- cisteína, e cristais de L-cisteína com uma concentração e pureza altas puderam ser obtidos. No entanto, foi confirmado que o processo pode ser realizado de uma maneira mais eficaz industrialmente quando o pH do caldo de fermentação é de 3,0 a 9,0.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 3 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A

CONCENTRAR DE CONCENTRADO

[076] No Exemplo de Preparação (TRILITE® MCK32L usado), cristais de L-cisteína foram preparados apenas variando a concentração do concentrado obtido concentrando-se o líquido separado de 100 g/l a 800 g/l.

[077] Especificamente, a concentração de L-cisteína no líquido separado foi de 35,1 g/l, e um total de 8 experimentos foram conduzidos concentrando-se o líquido separado e variando a concentração de L-cisteína de 100 g/l a 800 g/l.

[078] Então, o tempo em que a nucleação ocorreu, a pureza dos cristais de L-cisteína finalmente recuperados e a taxa de recuperação do processo de cristalização foram medidos. A taxa de recuperação do processo de cristalização foi calculada como a taxa de recuperação de L-cisteína nos cristais de L-cisteína obtidos em relação à L-cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia de SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3 Taxa de Tempo em que Pureza dos recuperação do Concentração a nucleação cristais de L- processo de (g/l) ocorreu cisteína (%) recuperação (%) Sem formação Sem formação 100 0 de cristal de cristal Durante 16,7 200 99,7 resfriamento Durante 50,4 300 99,6 concentração Durante 58,6 400 99,2 concentração Durante 65,8 500 98,3 concentração Durante 70,3 600 95,1 concentração Durante 75,2 700 91,4 concentração Nenhuma Nenhuma separação de separação de Durante 800 cristal devido cristal devido concentração à à solidificação solidificação

[079] A nucleação de L-cisteína ocorreu quando a concentração foi de 200 g/l ou mais, mas a nucleação ocorreu durante a concentração quando a concentração foi de 300 g/l ou mais, e foi possível realizar uma cristalização rápida.

[080] A pureza dos cristais de L-cisteína foi de 91 % ou mais em uma faixa de concentração de 200 g/l a 600 g/l, 95% ou mais em uma faixa de concentração de 200 g/l a 600 g/l e 98% ou mais em uma faixa de concentração de 200 g/l a 500 g/l.

A taxa de recuperação do processo de cristalização aumentou proporcionalmente à concentração. No entanto, quando a concentração foi de 700 g/l, cristais de L-cisteína puderam ser obtidos com uma pureza elevada e uma taxa de recuperação elevada, enquanto que, quando a concentração foi de 800 g/l, ocorreu solidificação da pasta fluida de cristais de L- cisteína, e consequentemente, foi impossível a agitação e separação dos cristais. Assim, é esperado que os cristais de L-cisteína possam ser obtidos com uma pureza alta e uma taxa de recuperação alta em uma concentração de menos do que 800 g/l.

[081] Com base nesses resultados, foi confirmado que, quando a concentração do líquido separado para a cromatografia de SMB foi de 200 g/l ou mais a menos do que 800 g/l, os cristais de L-cisteína foram obtidos facilmente. Em particular, foi confirmado que, quando a concentração foi na faixa de 300 g/l a 700 g/l, os cristais puderam ser obtidos com um processo de cristalização mais rápido, em uma pureza alta e uma taxa de recuperação alta.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 4 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A MUDANÇA

DE CONDIÇÃO DE RESFRIAMENTO EM BAIXA CONCENTRAÇÃO

[082] O concentrado, do qual nenhum cristal de L- cisteína foi formado, mesmo quando resfriado a 15 °C, quando a concentração do líquido separado para a cromatografia de SMB foi de 100 g/l no Exemplo 3, foi resfriado para -10 °C a uma taxa de resfriamento constante durante 2 horas e 30 minutos em um tanque revestido juntamente com agitação, e, em seguida, agitado à mesma temperatura que a temperatura à conclusão de resfriamento por 12 horas. Como um resultado, cristais de L- cisteína foram formados. Os cristais foram submetidos a uma separação sólido-líquido com o uso de um aparelho de filtração de membrana de pressão reduzida, adicionado com 100 ml de um líquido de lavagem, e secos em um secador de forno a 35 °C durante 12 horas para reduzir a umidade residual para 12,0% ou menos. Finalmente, os cristais de L-cisteína foram preparados.

A pureza dos cristais de L-cisteína foi de 99,7 %, e foi constatada a taxa de recuperação do processo de cristalização de 4,2 %.

[083] Com base nisso, foi confirmado que, mesmo quando a concentração do líquido separado para a cromatografia de SMB foi menor do que 200 g/l, os cristais de L-cisteína puderam ser obtidos controlando-se a temperatura de resfriamento. No entanto, a taxa de recuperação do processo de cristalização foi muito baixa para ser aplicada industrialmente. Além disso, houve desvantagens pelo fato de que o processo de cristalização por resfriamento tem que ser realizado até mesmo sob uma condição de temperatura rigorosa abaixo de zero e que o tempo de cristalização é longo.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 5 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM

TEMPERATURA DE RESFRIAMENTO

[084] No Exemplo de Preparação, cristais de L-cisteína foram preparados apenas variando a temperatura de resfriamento da pasta fluida de cristais de L-cisteína. Especificamente, um total de 5 experimentos de cristalização foram realizados incluindo agitação da pasta fluida de cristais de L-cisteína a 55 °C durante 2 horas sem resfriamento, e resfriamento da pasta fluida de cristais de L-cisteína para uma faixa de temperatura de 0 °C a 45 °C com uma taxa de resfriamento de 10 °C/h em agitação. O volume inicial da pasta fluida de L- cisteína usada em cada experiência foi 1 l.

[085] Assim, a pureza dos cristais de L-cisteína e a taxa de recuperação do processo de cristalização são mostrados na Tabela 4. A taxa de recuperação do processo de cristalização foi calculada como a taxa de recuperação de L- cisteína nos cristais de L-cisteína obtidos em relação à L- cisteína no líquido separado de acordo com o processo de cromatografia de SMB. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

TABELA 4 Taxa de Pureza dos Temperatura de recuperação do cristais de L- resfriamento (°C) processo de cisteína (%) cristalização (%) 0 98,9 68,2 15 99,2 58,6 30 99,4 45,1 45 99,5 38,3 55 (Sem 99,5 34,2 cristalização)

[086] A pureza dos cristais de L-cisteína foi de 98 %

ou mais em todos os casos. A taxa de recuperação do processo de cristalização aumentou em proporção inversa à temperatura de resfriamento. Ou seja, a taxa de recuperação do processo de cristalização aumentou à medida que a temperatura de resfriamento foi reduzida. Além disso, foi constatada a taxa de recuperação do processo de 45 % ou mais a uma temperatura de 30 °C ou abaixo, e esperava-se que a taxa de recuperação do processo seria de 50 % ou mais a uma temperatura abaixo de 25 °C.

E XAMPLO 6 - AVALIAÇÃO DE ACORDO COM A CONCENTRAÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO CONTENDO L-CISTEÍNA UTILIZADA COMO

MATERIAL DE ORIGEM PARA CROMATOGRAFIA DE SMB

[087] No Exemplo de Preparação, cristais de L-cisteína foram preparados apenas variando a concentração do caldo de fermentação (pH 5,5) contendo L-cisteína usado como um material de origem para cromatografia de SMB. Especificamente, um total de 6 experimentos foram realizados incluindo o uso do caldo de fermentação de L-cisteína com uma concentração de 26 g/l obtido no Exemplo de Preparação como um líquido de origem para cromatografia de SMB, o uso de um caldo de fermentação com uma concentração de L-cisteína de 10 g/l, como um líquido de origem para cromatografia de SMB por diluição com água e o uso de um caldo de fermentação com uma concentração de L- cisteína de 60 g/l a 150 g/l como um líquido de origem para cromatografia de SMB por concentração com o uso de um evaporador de filme fino. Quando a concentração de L-cisteína foi aumentada para 180 g/l, o processo de cromatografia de SMB não foi realizado, pois os cristais de L-cisteína foram precipitados. Uma vez que os cristais de L-cisteína precipitados foram precipitados como cristais finos, foi difícil separar os cristais, e também a pureza foi de 50% ou abaixo, o que foi muito baixo.

[088] O volume do líquido de origem usado em cada experiência foi de 0,1 kl ou mais. O rendimento do processo de cromatografia de SMB e o conteúdo sólido de L-cisteína excluindo a umidade, no líquido do processo produzido por cromatografia de SMB são mostrados na Tabela 5.

TABELA 5 Concentração de L- cisteína no Rendimento do líquido de origem processo de Conteúdo sólido de para a cromatografia de L-cisteína (%) cromatografia de SMB (%) SMB (g/l) 10 90,3 94,2 26 91,5 93,0 60 90,9 93,4 90 91,8 92,8 120 92,4 93,2 150 92,0 93,2

[089] O rendimento do processo de cromatografia de SMB foi de 90% ou mais em todas as seções e o conteúdo sólido de L-cisteína, excluindo a umidade, no líquido do processo produzido por cromatografia de SMB foi de 90% ou mais em todas as seções. De acordo com os resultados anteriores, pode ser interpretado que o método para purificar L-cisteína por cromatografia de SMB da presente revelação é muito eficaz para purificar e cristalizar o caldo de fermentação contendo L- cisteína, independentemente da concentração de L-cisteína no líquido de origem.

[090] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica à qual a presente revelação pertence que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste do espírito técnico ou características essenciais da presente revelação. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente revelação é definido pelas reivindicações anexas ao invés da descrição detalhada, e deve ser compreendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente revelação e equivalentes da mesma são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar cristais de L-cisteína, caracterizado por compreender: (a) obter um líquido separado após introduzir um caldo de fermentação em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 que contém L- cisteína em um aparelho de cromatografia contínua que tem uma resina de troca catiônica fortemente ácida como uma fase estacionária; (b) concentrar o líquido separado; e (c) recuperar os cristais de L-cisteína do concentrado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente ajustar o caldo de fermentação contendo L-cisteína para um pH de 3,5 a 7,5 antes da etapa (a).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender adicionalmente concentrar o caldo de fermentação em uma faixa de pH de 3,0 a 9,0 contendo L-cisteína antes da etapa (a).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a resina de troca catiônica fortemente ácida na etapa (a) ter um grupo funcional de ácido sulfúrico.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a resina de troca catiônica fortemente ácida na etapa (a) ser um copolímero de estireno- divinilbenzeno que tem um grupo funcional de ácido sulfúrico.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o aparelho de cromatografia contínua na etapa (a) ser um aparelho de cromatografia com leito de movimento simulado (SMB).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a separação de líquido na etapa (a) ter um conteúdo sólido de L-cisteína, com exclusão de umidade, de 85% (p/p) ou mais.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o rendimento de cromatografia contínua na etapa (a), como uma razão da L-cisteína no líquido separado obtido em relação ao caldo de fermentação introduzido, ser de 50% (p/p).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a etapa (b) ser realizada de modo que a concentração de L-cisteína no líquido separado seja de 200 g/l a menos do que 800 g/l.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a etapa (b) ser realizada de modo que a concentração de L-cisteína no líquido separado seja de 300 g/l a menos do que 700 g/l.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente resfriar o concentrado antes da etapa (c).

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,

caracterizado por o concentrado ser resfriado para uma temperatura de 0 °C a 30 °C.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender adicionar um filtrado obtido pela recuperação dos cristais na etapa (c) ao caldo de fermentação da etapa (a) ou ao líquido separado da etapa (b).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a pureza dos cristais de L-cisteína preparados ser de 98% (p/p) ou mais.

15. Cristais de L-Cisteína caracterizados por serem preparados de acordo com o método de preparação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.