BR112020005038A2 - moduladores de expressão de enac - Google Patents

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BR112020005038A2
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BR112020005038-5A
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Jeffrey R. Crosby
Shuling Guo
Huynh-Hoa Bui
Andrew T. Watt
Susan M. Freier
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Ionis Pharmaceuticals, Inc.
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Abstract

As presentes modalidades fornecem métodos, compostos e composições úteis para inibir a expressão de ENaC, que podem ser úteis para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associada ao ENaC.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para "MODULA- DORES DE EXPRESSÃO DE ENAC". Listagem de Sequência
[001] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado BIOL0315WOSEQ. txt criado em 10 de outubro de 2018 com 484 kb de tamanho. As informações no formato ele- trônico da listagem de sequência são incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Campo
[002] As presentes modalidades fornecem métodos, compostos e composições úteis para inibir a expressão de ENaC, que podem ser úteis para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associada ao ENaC. Antecedentes
[003] O canal de sódio epitelial (ENaC) é um canal composto por três subunidades (tipicamente α-ENaC, β-ENaC e -ENaC; ou SCNN1A, SCNN1B e SCNN1G, respectivamente) que é expresso em vários tecidos, incluindo os pulmões. Permite a passagem de íons de sódio através da membrana celular epitelial e é regulado negativamente pelos íons de cloreto. Em pacientes com fibrose cística, a inibição de ENaC é reduzida devido à função diminuída do transportador de cloreto, CFTR. Sumário
[004] Certas modalidades no presente documento fornecidas são di- recionadas a compostos e composições potentes e toleráveis úteis para inibir a expressão de ENaC, que podem ser úteis para tratar, prevenir, melhorar ou retardar a progressão de distúrbios pulmonares, por exemplo, fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), bronquite crônica e asma. Certas modalidades no presente documento fornecidas compreendem oli- gonucleotídeos modificados complementares a um ácido nucleico α-ENaC que reduz potentemente a expressão de α-ENaC em animais.
Descrição Detalhada
[005] Deve ser compreendido que tanto a descrição geral anterior quanto a descrição detalhada seguinte são exemplares e explicativas ape- nas e não são restritivas das modalidades, conforme reivindicado. No pre- sente documento, o uso do singular inclui o plural, salvo quando houver outra especificação. Conforme usado neste documento, o uso de "ou" significa "e/ou", salvo quando houver outra especificação. Além disso, o uso do termo "incluindo", bem como outras formas, como "que inclui" ou "incluído", não é limitativo.
[006] Os títulos das seções usados no presente documento são para fins organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitadores do objeto descrito. Todos os documentos, ou partes dos documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não se limitando a, patentes, pedidos de pa- tente, artigos, livros, tratados, e registros de sequência de referência Gen- Bank e NCBI são expressamente incorporados por meio deste para as partes do documento discutidas neste documento, bem como em sua totalidade.
[007] Entende-se que a sequência estabelecida em cada SEQ ID NO contida neste documento é independente de qualquer modificação de uma porção de açúcar, uma ligação internucleosídica ou uma nucleobase. Como tal, os compostos definidos por uma SEQ ID NO podem compreender, in- dependentemente, uma ou mais modificações a uma porção de açúcar, uma ligação internucleosídica ou uma nucleobase.
[008] Conforme usado neste documento, "2'-desoxinucleosídeo" signi- fica um nucleosídeo compreendendo a porção de açúcar 2'-H(H) ribosila, como encontrado nos ácidos desoxirribonucleicos (DNA) de ocorrência na- tural. Em determinadas modalidades, um 2-desoxinucleosídeo pode com- preender uma nucleobase modificada ou pode compreender uma nucleo- base de RNA (por exemplo, uracilacila).
[009] Conforme usado neste documento, "nucleosídeo 2'-substituído" ou "nucleosídeo 2-modificado" significa um nucleosídeo compreendendo uma porção de açúcar 2'-substituída ou 2'-modificada. Conforme usado neste documento, "2'-substituído" ou "2-modificado" em referência a uma porção de açúcar furanosila significa uma porção de açúcar compreendendo pelo menos um grupo substituinte 2' diferente de H ou OH.
[0010] Conforme usado neste documento, "administração" ou "adminis- trar" refere-se a vias de introdução de um composto ou composição no presente documento fornecidos a um indivíduo para desempenhar sua função pretendida. Um exemplo de uma via de administração que pode ser usada inclui, mas não está limitado a, administração por inalação.
[0011] Conforme usado neste documento, "administrado concomitan- temente" ou "coadministração" significa administração de dois ou mais compostos de qualquer maneira em que os efeitos farmacológicos de ambos sejam manifestados no paciente. A administração concomitante não exige que ambos os compostos sejam administrados em uma única composição farmacêutica, na mesma forma de dosagem, pela mesma via de adminis- tração ou ao mesmo tempo. Os efeitos de ambos os compostos não preci- sam se manifestar ao mesmo tempo. Os efeitos precisam somente de se sobrepor por um período de tempo e não precisam ser coextensivos. A ad- ministração ou coadministração concomitante abrange a administração em paralelo ou sequencialmente.
[0012] Conforme usado neste documento, "animal" refere-se a um hu- mano ou animal não humano, incluindo, mas não limitado a, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não-humanos, incluindo, mas não se limitando a, macacos e chimpanzés.
[0013] Conforme usado neste documento, "atividade antissentido" se refere a qualquer atividade detectável e/ou mudança mensurável atribuível à hibridização de um composto antissentido para seu ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a atividade antissentido é uma diminuição na quanti- dade ou expressão de um ácido nucleico ou proteína alvo codificada por esse ácido nucleico alvo em comparação com os níveis alvo de ácido nu-
cleico ou níveis de proteína alvo na ausência do composto antissentido.
[0014] Conforme usado neste documento, "composto antissentido" sig- nifica um composto compreendendo um oligonucleotídeo antissentido e op- cionalmente uma ou mais características adicionais, como um grupo con- jugado ou grupo terminal.
[0015] Conforme usado neste documento, "oligonucleotídeo antissenti- do" significa um oligonucleotídeo com uma sequência de nucleobases que é pelo menos parcialmente complementar a um ácido nucleico alvo.
[0016] Conforme usado neste documento, "melhorar" em referência a um tratamento significa melhoria em pelo menos um sintoma em relação ao mesmo sintoma na ausência do tratamento. Em certas modalidades, a me- lhoria é a redução na gravidade ou frequência de um sintoma ou o início retardado ou a desaceleração da progressão na gravidade ou frequência de um sintoma.
[0017] Conforme usado neste documento, "nucleosídeo bicíclico" ou "BNA" se refere a um nucleosídeo que consiste em uma porção de açúcar bicíclico. Conforme usado neste documento, "açúcar bicíclico" ou "porção de açúcar bicíclico" significa uma porção de açúcar modificada compreendendo dois anéis, em que o segundo anel é formado através de uma ponte que conecta dois dos átomos no primeiro anel, formando assim uma estrutura bicíclica. Em certas modalidades, o primeiro anel da porção de açúcar bicí- clico é uma fração furanosila. Em certas modalidades, a porção de açúcar bicíclico não compreende uma fração furanosila.
[0018] Conforme usado neste documento, "cEt" ou "etila restrito" signi- fica uma porção de açúcar bicíclico, em que o primeiro anel da porção de açúcar bicíclico é uma porção de açúcar ribosila, o segundo anel do açúcar bicíclico é formado através de uma ponte que conecta o 4'-carbono e 2'-carbono, a ponte tem a fórmula 4'-CH(CH3)-O-2', e o grupo metila da ponte está na configuração S. Uma porção de açúcar cEt bicíclico está na confi- guração β-D.
[0019] Conforme usado neste documento, "população quiralmente en- riquecida" significa uma pluralidade de moléculas de fórmula molecular idêntica, em que o número ou porcentagem de moléculas na população que contêm uma configuração estereoquímica específica em um centro quiral específico é maior que o número ou porcentagem de moléculas esperadas para conter a mesma configuração estereoquímica específica no mesmo centro quiral específico dentro da população, se o centro quiral específico fosse estéreo-aleatório. Populações de moléculas enriquecidas quiralmente que têm múltiplos centros quirais dentro de cada molécula podem conter um ou mais centros quirais estéreo-aleatórios. Em certas modalidades, as mo- léculas são oligonucleotídeos modificados. Em certas modalidades, as mo- léculas são compostos compreendendo oligonucleotídeos modificados.
[0020] Conforme usado neste documento, "complementar" em referên- cia a um oligonucleotídeo significa que pelo menos 70% das nucleobases desse oligonucleotídeo ou uma ou mais regiões do mesmo e as nucleobases de outro ácido nucleico ou uma ou mais regiões do mesmo são capazes de se ligar ao hidrogênio com um outro quando a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo e o outro ácido nucleico estão alinhados em direções opostas. Nucleobases complementares são pares de nucleobases capazes de formar ligações de hidrogênio entre si. Pares de nucleobases comple- mentares incluem adenina (A) e timina (T), adenina (A) e uracila (U), citosina (C) e guanina (G), 5-metila citosina (mC) e guanina (G). Os oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos complementares não precisam ter complementaridade de nucleobases em cada nucleosídeo. Pelo contrário, algumas incompatibi- lidades são toleradas. Conforme usado neste documento, "totalmente com- plementar" ou "100% complementar" em referência a oligonucleotídeos sig- nifica que esses oligonucleotídeos são complementares a outro oligonucle- otídeo ou ácido nucleico em cada nucleosídeo do oligonucleotídeo.
[0021] Conforme usado neste documento, "grupo conjugado" significa um grupo de átomos que está direta ou indiretamente ligado a um oligonu-
cleotídeo. Grupos conjugados incluem uma fração conjugada e um ligante conjugado que liga a fração conjugada ao oligonucleotídeo.
[0022] Conforme usado neste documento, "ligante conjugado" significa um grupo de átomos compreendendo pelo menos uma ligação que conecta uma fração conjugada a um oligonucleotídeo.
[0023] Conforme usado neste documento, "porção conjugada" significa um grupo de átomos que está ligado a um oligonucleotídeo por meio de um ligante conjugado.
[0024] Conforme usado neste documento, "contíguo" no contexto de um oligonucleotídeo refere-se a nucleosídeos, nucleobases, porções de açúcar ou ligações internucleosídicas que são imediatamente adjacentes umas às outras. Por exemplo, "nucleobases contíguas" significa nucleobases que são imediatamente adjacentes umas às outras em uma sequência.
[0025] Conforme usado neste documento, "composto antissentido de fita dupla" significa um composto antissentido que compreende dois compostos oligoméricos que são complementares entre si e formam um duplex, e em que um dos dois referidos compostos oligoméricos compreende um oligo- nucleotídeo antissentido.
[0026] Conforme usado neste documento, "quantidade eficaz" significa a quantidade de composto suficiente para efetivar um resultado fisiológico desejado em um indivíduo em necessidade do composto. A quantidade eficaz pode variar entre os indivíduos dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, a formulação da composição, a avaliação da condição médica do indivíduo, e outros fatores relevantes.
[0027] Conforme usado neste documento, "eficácia" significa a capaci- dade de produzir um efeito desejado.
[0028] Conforme usado neste documento, "ENaC" significa qualquer ácido nucleico ou proteína ENaC (canal de sódio epitelial). "Ácido nucleico ENaC" significa qualquer ácido nucleico que codifica uma subunidade ENaC.
Por exemplo, em certas modalidades, um ácido nucleico ENaC inclui uma região cromossômica de DNA que codifica ENaC, um RNA transcrito a partir do DNA que codificaENaC (por exemplo, um transcrito de pré-mRNA) e um transcrito de mRNA que codifica ENaC. Em certas modalidades, um ácido nucleico ou proteína ENaC é um ácido nucleico ou proteína α-ENaC ou SCNN1A (subunidade 1 alfa epitelial do canal de sódio). No presente do- cumento, α-ENaC e SCNN1A são usados de forma intercambiável e têm o mesmo significado.
[0029] Conforme usado neste documento, "expressão" inclui todas as funções pelas quais a informação codificada de um gene é convertida em estruturas presentes e operando em uma célula. Tais estruturas incluem, mas não estão limitadas a, produtos de transcrição e tradução.
[0030] Conforme usado neste documento, "gapmer" significa um oligo- nucleotídeo, como um oligonucleotídeo antissentido, compreendendo um segmento interno com uma pluralidade de nucleosídeos que suportam a clivagem da RNase H posicionada entre segmentos externos, cada um tendo um ou mais nucleosídeos, em que os nucleosídeos que compreendem o segmento interno são quimicamente distintos do nucleosídeo ou nucleosí- deos imediatamente adjacentes que compreendem os segmentos externos. O segmento interno pode ser chamado de "lacuna" ou "segmento de lacuna" e os segmentos externos podem ser chamados de "asas" ou "segmentos de asa".
[0031] Conforme usado neste documento, "hibridação" significa o em- parelhamento ou recozimento de oligonucleotídeos e/ou ácidos nucleicos complementares. Enquanto não houver limitação a um mecanismo especí- fico, o mecanismo mais comum de hibridação envolve a ligação de hidro- gênio, que pode ser ligação de hidrogênio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa entre nucleobases complementares.
[0032] Conforme usado neste documento, "indivíduo" significa um ani- mal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0033] Conforme usado neste documento, "inibir a expressão ou ativi- dade" refere-se a uma redução ou bloqueio da expressão ou atividade em relação à expressão ou atividade em uma amostra não tratada ou controle e não indica necessariamente uma eliminação total da expressão ou atividade.
[0034] Conforme usado neste documento, os termos "ligação internu- cleosídica" significa um grupo ou ligação que forma uma ligação covalente entre nucleosídeos adjacentes em um oligonucleotídeo. Conforme usado neste documento, "ligação internucleosídica modificada" se refere a qualquer ligação de internucleosídica diferente da ligação internucleosídica de fosfato de ocorrência natural. As ligações não fosfato são no presente documento referidas como ligações internucleosídicas modificadas. "Ligação de fosfo- rotioato" significa uma ligação de fosfato modificada na qual um dos átomos de oxigênio sem ponte é substituído por um átomo de enxofre. Uma ligação internucleosídica de fosforotioato é uma ligação internucleosídica modifica- da. As ligações internucleosídicas modificadas incluem ligações que com- preendem nucleosídeos abásicos. Conforme usado neste documento, "nu- cleosídeo abásico" significa uma porção de açúcar em um oligonucleotídeo ou composto oligomérico que não está diretamente conectado a uma nu- cleobase. Em certas modalidades, um nucleosídeo abásico é adjacente a um ou dois nucleosídeos em um oligonucleotídeo.
[0035] Conforme usado neste documento, "ligante-nucleosídeo" significa um nucleosídeo que liga, direta ou indiretamente, um oligonucleotídeo a uma fração conjugada. Os ligantes-nucleosídeos estão localizados dentro do ligante conjugado de um composto oligomérico. Os ligantes-nucleosídeos não são considerados parte da porção oligonucleotídica de um composto oligomérico, mesmo que sejam contíguos ao oligonucleotídeo.
[0036] Conforme usado neste documento, "açúcar modificado não bicí- clico" ou "porção de açúcar modificado não bicíclico" significa uma porção de açúcar modificada que compreende uma modificação, como um substituto, que não forma uma ponte entre dois átomos do açúcar para formar uma segundo toque.
[0037] Conforme usado neste documento, os "nucleosídeos ligados" são nucleosídeos que estão conectados a uma sequência contínua (isto é, ne- nhum nucleosídeo adicional está presente entre aqueles que estão ligados).
[0038] Conforme usado neste documento, "incompatibilidade" ou "não complementar" significa uma nucleobase de um primeiro oligonucleotídeo que não é complementar com a nucleobase correspondente de um segundo oligonucleotídeo ou ácido nucleico alvo quando o primeiro e o segundo compostos oligoméricos estão alinhados.
[0039] Conforme usado neste documento, "modulação" refere-se à al- teração ou ajuste de uma característica em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Por exemplo, modular a expressão de ENaC pode significar aumentar ou diminuir o nível de um RNA de ENaC e/ou uma proteína de ENaC em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Um "modulador" afeta a alteração na célula, tecido, órgão ou organismo. Por exemplo, um composto que modula a expressão de ENaC pode ser um modulador que diminui a quantidade de um RNA de ENaC e/ou uma proteína de ENaC em uma célula, tecido, órgão ou organismo.
[0040] Conforme usado neste documento, "MOE" significa metoxietila. "2’-MOE" ou "2’-O-metoxietila" significa um grupo 2’-OCH2CH2OCH3 no lugar do grupo 2’-OH de um anel ribosila.
[0041] Conforme usado neste documento, "motivo" significa o padrão de porções de açúcar não modificado e/ou modificado, nucleobases e/ou liga- ções internucleosídicas, em um oligonucleotídeo.
[0042] Conforme usado neste documento, "ocorrência natural" significa encontrado na natureza.
[0043] Conforme usado neste documento, "nucleobase" significa uma nucleobase não modificada ou uma nucleobase modificada. Conforme usado neste documento, uma "nucleobase não modificada" é adenina (A), timina (T), citosina (C), uracila (U) e guanina (G). Conforme usado neste docu-
mento, uma nucleobase modificada é um grupo de átomos capazes de emparelhar com pelo menos uma nucleobase não modificada. Uma base universal é uma nucleobase que pode emparelhar com qualquer uma das cinco nucleobases não modificadas.
[0044] Conforme usado neste documento, "sequência de nucleobases" significa a ordem de nucleobases contíguas em um ácido nucleico ou oli- gonucleotídeo independente de qualquer modificação de ligação de açúcar ou internucleosídeo.
[0045] Conforme usado neste documento, o termo "nucleosídeo" se refere a um composto que compreende uma porção de nucleobase e uma porção de açúcar. A nucleobase e a porção de açúcar são, cada uma, in- dependentemente, não modificadas ou modificadas. Conforme usado neste documento, "nucleosídeo modificado" significa um nucleosídeo compreen- dendo uma nucleobase modificada e/ou uma porção de açúcar modificada.
[0046] Conforme usado neste documento, "composto oligomérico" sig- nifica um composto que consiste em um oligonucleotídeo e, opcionalmente, uma ou mais características adicionais, como um grupo conjugado ou grupo terminal.
[0047] Conforme usado neste documento, "oligonucleotídeo" significa uma cadeia de nucleosídeos ligados conectados via ligações internucleosí- dicas, em que cada ligação nucleosídica e internucleosídica pode ser modi- ficada ou não modificada. Salvo indicação em contrário, os oligonucleotídeos consistem em 8-50 nucleosídeos ligados. Conforme usado neste documento, "oligonucleotídeo modificado" significa um oligonucleotídeo, em que pelo menos uma ligação nucleosídica ou internucleosídica é modificada. Con- forme usado neste documento, "oligonucleotídeo não modificado" significa um oligonucleotídeo que não compreende nenhuma modificação de nu- cleosídeo ou modificação de internucleosídeos.
[0048] Conforme usado neste documento, "transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável" se refere a qualquer substância apropriada para uso na administração de um animal. Certos transportadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como, por exemplo, líquidos, pós ou suspensões que podem ser aerossolizadas ou de outro modo dispersas para inalação por um sujeito. Em certas modalidades, um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável é água estéril; solu- ção salina estéril; ou solução tampão estéril.
[0049] Conforme usado neste documento, "sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis de compostos, como composto oligomérico, isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto original e não conferem efeitos toxicológicos indesejados.
[0050] Conforme usado neste documento, "composição farmacêutica" significa uma mistura de substâncias adequadas para administração a um sujeito. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um composto antissentido e uma solução aquosa.
[0051] Conforme usado neste documento, "fração fósforo" significa um grupo de átomos compreendendo um átomo de fósforo. Em certas modali- dades, uma porção de fósforo compreende um mono-, di- ou tri-fosfato ou fosforotioato.
[0052] Conforme usado neste documento, "pró-droga" significa um agente terapêutico em uma forma fora do corpo que é convertida em uma forma diferente dentro do corpo ou células do mesmo. Normalmente, a conversão de uma pró-droga no corpo é facilaitada pela ação de enzimas (por exemplo, enzima endógena ou viral) ou produtos químicos presentes nas células ou tecidos e/ou por condições fisiológicas.
[0053] Conforme usado neste documento, "composto RNAi" significa um composto antissentido que atua, pelo menos em parte, através de RISC ou Ago2 para modular um ácido nucleico alvo e/ou proteína codificada por um ácido nucleico alvo. Os compostos de RNAi incluem, mas não estão limita- dos a, siRNA de fita dupla, RNA de fita simples (ssRNA) e microRNA, in-
cluindo imitações de microRNA. Em certas modalidades, um composto de RNAi modula a quantidade, atividade e/ou emendas de um ácido nucleico alvo. O termo composto RNAi exclui oligonucleotídeos antisense que atuam através da RNase H.
[0054] Conforme usado neste documento, o termo "fita simples" em re- ferência a um composto antissentido significa um composto que consiste em um composto oligomérico que não está emparelhado com um segundo composto oligomérico para formar um duplex. "Autocomplementar" em re- ferência a um oligonucleotídeo significa um oligonucleotídeo que pelo menos parcialmente hibrida com ele mesmo. Um composto que consiste em um composto oligomérico, em que o oligonucleotídeo do composto oligomérico é autocomplementar, é um composto de fita simples. Um composto antissen- tido ou oligomérico de fita simples pode ser capaz de se ligar a um composto oligomérico complementar para formar um duplex, caso em que o composto não seria mais de fita simples.
[0055] Conforme usado neste documento, "ensaio de célula padrão" significa o ensaio descrito no Exemplo 3 e variações razoáveis do mesmo.
[0056] Conforme usado neste documento, "experiência padrão in vivo" significa o procedimento descrito no Exemplo 4, 6 ou 7, e variações razoá- veis do mesmo.
[0057] Conforme usado neste documento, "centro quiral estereoquímico" no contexto de uma população de moléculas de fórmula molecular idêntica significa um centro quiral com uma configuração estereoquímica aleatória. Por exemplo, em uma população de moléculas que compreendem um centro quiral estéreo-aleatório, o número de moléculas com a configuração (S) do centro quiral estéreo-aleatório pode ser, mas não é necessariamente o mesmo que o número de moléculas com a configuração (R) do centro quiral estéreo-aleatório. A configuração estereoquímica de um centro quiral é considerada aleatória quando é o resultado de um método sintético que não é projetado para controlar a configuração estereoquímica. Em certas moda-
lidades, um centro quiral estereoquímico é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0058] Conforme usado neste documento, "porção de açúcar" significa uma porção de açúcar não modificado ou uma porção de açúcar modificada. Conforme usado neste documento, "porção de açúcar não modificado" sig- nifica uma porção de 2'-OH(H) ribosila, como encontrada no RNA (uma "porção de açúcar de RNA não modificado") ou uma porção de 2'-H(H), como encontrada no DNA (uma "porção de açúcar de DNA não modificado"). Conforme usado neste documento, "porção de açúcar modificado" ou "açúcar modificado" significa uma porção de açúcar furanosila modificado ou um substituto de açúcar. Conforme usado neste documento, porção de açúcar furanosila modificado significa um açúcar furanosila compreendendo um substituinte não hidrogênio no lugar de pelo menos um hidrogênio de uma porção de açúcar não modificado. Em certas modalidades, uma porção de açúcar furanosila modificado é uma porção de açúcar substituída em 2'. Tais porções de açúcar furanosila modificado incluem açúcares bicíclicos e açúcares não bicíclicos. Conforme usado neste documento, "substituto de açúcar" significa uma porção de açúcar modificada com outra porção de furanosila que pode ligar uma nucleobase a outro grupo, como uma ligação internucleosídica, grupo conjugado ou grupo terminal em um oligonucleotí- deo. Os nucleosídeos modificados compreendendo substitutos de açúcar podem ser incorporados em uma ou mais posições dentro de um oligonu- cleotídeo e esses oligonucleotídeos são capazes de hibridar com compostos oligoméricos ou ácidos nucleicos complementares.
[0059] Conforme usado neste documento, "ácido nucleico alvo", "RNA alvo", "transcrito de RNA alvo" e "ácido nucleico alvo" significam um ácido nucleico que um composto antissentido é projetado para afetar.
[0060] Conforme usado neste documento, "região alvo" significa uma porção de um ácido nucleico alvo ao qual um composto antissentido é pro- jetado para hibridar.
[0061] Conforme usado neste documento, "grupo terminal" significa um grupo químico ou grupo de átomos que está covalentemente ligado a um terminal de um oligonucleotídeo.
[0062] Conforme usado neste documento, "nucleosídeo da asa terminal" significa um nucleosídeo que está localizado no terminal de um segmento da asa de um gapmer. Qualquer segmento de asa que compreende ou consiste em pelo menos dois nucleosídeos tem dois terminais: um que é imediata- mente adjacente ao segmento de lacuna; e um que está na extremidade oposta ao segmento de lacuna. Assim, qualquer segmento de asa que compreende ou consiste em pelo menos dois nucleosídeos possui dois nu- cleosídeos terminais, um em cada terminal.
[0063] Conforme usado neste documento, "quantidade terapeutica- mente eficaz" significa uma quantidade de um composto, agente farmacêu- tico, ou composição que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.
[0064] Como usado neste documento, "tratar" refere-se à administração de um composto ou composição farmacêutica a um animal, a fim de efetuar uma alteração ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição no animal. Determinadas Modalidades
[0065] Determinadas modalidades fornecem métodos, compostos, e composições para inibir a expressão de ENaC.
[0066] Certas modalidades fornecem compostos que compreendem ou consistem em oligonucleotídeos complementares a um ácido nucleico α-ENaC ou SCNN1A. Em certas modalidades, o ácido nucleico α-ENaC ou SCNN1A tem a sequência estabelecida em RefSeq ou no No. de Acessão GenBank NM_001038.5 (divulgado no presente documento como SEQ ID NO:1), o complemento de NC_000012.12 truncado dos nucleosídeos 6343001 a 6380000 (divulgado no presente documento como SEQ ID NO:2), ou NG_011945.1 (divulgado no presente documento como SEQ ID NO:1957). Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla.
[0067] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nu- cleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0068] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nu- cleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6 a 1954. Por exemplo, a sequência de nucleobases do oli- gonucleotídeo modificado compreende ou consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs 6, 7, etc. ... ou 1954. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:167. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:244. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:399. Em certas moda- lidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado com- preende ou consiste em SEQ ID NO:428. Em certas modalidades, a se- quência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:431. Em certas modalidades, a sequência de nu- cleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:438. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligo- nucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:590. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modi-
ficado compreende ou consiste em SEQ ID NO:824. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:935. Em certas modalidades, a sequência de nu- cleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1049. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oli- gonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1114. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modi- ficado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1124. Em certas modalida- des, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compre- ende ou consiste em SEQ ID NO:1134. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1139. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1145. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1170. Em certas moda- lidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado com- preende ou consiste em SEQ ID NO:1530. Em certas modalidades, a se- quência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1532. Em certas modalidades, a sequência de nu- cleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1672. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oli- gonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1730. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modi- ficado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1802. Em certas modalida- des, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compre- ende ou consiste em SEQ ID NO:1832. Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido ou composto oligomérico.
Em certas modali- dades, o composto é de fita simples.
Em certas modalidades, o composto é de fita dupla.
Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
Em modalidades, o oligonucleo-
tídeo modificado tem uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de qualquer uma de SEQ ID Números de 6 a 1954.
[0069] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 10 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 10 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto é um com- posto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0070] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 11 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 11 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto é um com- posto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 11 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0071] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto é um com- posto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0072] Em determinadas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido ou com- posto oligomérico.
[0073] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas mo- dalidades, o composto é um composto antissentido ou composto oligomé- rico. Em certas modalidades, o composto é de fita simples. Em certas mo- dalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o oligonu- cleotídeo modificado tem 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0074] Certas modalidades fornecem um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modali- dades, o composto é de fita simples. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla.
[0075] Em certas modalidades, os compostos compreendem ou con- sistem em oligonucleotídeos modificados complementares a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, os oligonu- cleotídeos modificados são complementares ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalida- des, os oligonucleotídeos modificados são complementares a uma sequên- cia nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290; 16.559-17.759;
17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152; 25.252-25.445;
25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995; 31.052-31.198; ou
31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, os compostos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos com pelo menos uma porção de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 contígua, comple- mentar a uma porção de comprimento igual do íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalida- des, esses oligonucleotídeos têm pelo menos uma porção de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 contígua de nucleobase complementar a uma porção de comprimento igual dentro dos nucleotídeos 4.497-5.163;
5.634-16.290; 16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565;
24.730-25.152; 25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779;
30.838-30.995; 31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, esses compostos são compostos antissentido ou compostos oligoméricos. Os compostos compreendendo oligonucleotídeo modificado complementar a quase qualquer porção de certos íntrons de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC, por exemplo, íntron 4 de um pré-mRNA de α-ENaC, são geralmente especialmente potentes e toleráveis. Assim, esses certos íntrons podem ser considerados regiões de pontos quentes para direcionar um transcrito de ácido nucleico α-ENaC.
[0076] Em certas modalidades, os compostos compreendem ou con- sistem em oligonucleotídeos modificados complementares ao íntron 4 ou 3’-UTR de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados são complementares a uma sequência dentro dos nucleotídeos 17.951-24.120; ou 32.129-33.174 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, os compostos compreendem ou consistem em oli- gonucleotídeos com pelo menos uma porção de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 contígua, complementar a uma porção de comprimento igual do íntron 4 ou 3'-UTR de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, esses oligonucleotídeos têm pelo menos uma porção de nu- cleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 contígua, complementar a uma porção de comprimento igual dentro dos nucleotídeos 17.951-24.120; ou
32.129-33.174 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, esses compostos são compostos antissentido ou compostos oligoméricos.
[0077] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com pelo menos uma porção de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 contígua, complementar a uma porção de comprimento igual dentro dos nucleotídeos 19.022-19.037; 20.415-20,430; 21.750-21.766; 32.844-32.859; ou 32.989-33.004 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o oligonucleo- tídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0078] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e complementar dentro dos nucleotídeos 19.022-19.037; 20.415-20,430;
21.750-21.766; 32.844-32.859; ou 32.989-33.004 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0079] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos uma porção de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou nucleobase contígua da se- quência de nucleobase de qualquer um dos números de compostos 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392 (SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593). Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:239Em certas modalidades, a sequência de nu- cleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:426. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligo- nucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1541. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modi- ficado compreende ou consiste em SEQ ID NO:1812. Em certas modalida- des, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compre-
ende ou consiste em SEQ ID NO:1113. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado compreende ou consiste em SEQ ID NO:593.
[0080] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligadosde comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleoba- ses de qualquer um dos números de compostos 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392 (SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593). Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0081] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que possui uma sequência de nucleobases que con- siste na sequência de nucleobases de qualquer um dos números 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392 (SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593).
[0082] Em certas modalidades, um composto compreendendo ou que consiste em um oligonucleotídeo modificado complementar a α-ENaC é o composto de número 827359. Dos mais de 1.900 compostos que foram rastreados como descrito na seção Exemplos abaixo, os números de com- posto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 e 827392 emergiram como os principais compostos líderes. Em particular, o número de composto 827359 exibiu a melhor combinação de propriedades em termos de potência e tolerabilidade dentre mais de 1.900 compostos.
[0083] Qualquer um dos oligonucleotídeos precedentes é um oligonu- cleotídeo modificado compreendendo pelo menos uma ligação internucleo- sídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e/ou pelo menos uma nucleobase modificada.
[0084] Em certas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos mo- dificados precedentes compreende pelo menos um açúcar modificado. Em certas modalidades, pelo menos um açúcar modificado compreende uma modificação 2'-MOE. Em certas modalidades, pelo menos um açúcar modi- ficado é um açúcar bicíclico, tal como um açúcar bicíclico cEt, um açúcar bicíclico LNA ou um açúcar bicíclico ENA.
[0085] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compre- ende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, tal como uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0086] Em certas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos mo- dificados precedentes compreende pelo menos uma nucleobase modificada, como 5-metilcitosina.
[0087] Em certas modalidades, qualquer um dos oligonucleotídeos mo- dificados precedentes compreende: um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado. Em certas mo- dalidades, o oligonucleotídeo modificado é de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer uma das SEQ ID NO:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nu- cleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado tem 16 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases que consiste na sequência recitada em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593.
[0088] Em certas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 20-80 nucleobases ligadas de com-
primento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer uma de SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em dez 2'-desoxi- nucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; e um segmento de asa 3' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg- mento de asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil; em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado con- siste em 20-30 nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, o oligonucle- otídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados.
[0089] Em certas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 16-80 nucleobases ligadas de com- primento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência recitada em qualquer uma de SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em dez 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em três nucleosídeos liga- dos; e um segmento de asa 3' que consiste em três nucleosídeos liga- dos; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3'; em que os nucleosídeos do segmento de asa 5' compreendem cada um um açúcar bicíclico cEt; em que os nucleo-
sídeos do segmento de asa 3' compreendem cada um açúcar bicíclicocEt; em que cada ligação internucleosídica é uma ligação fosforotioato; e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleo- tídeo modificado tem 16-80 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem 16-30 nucleosídeos ligados de comprimento.
[0090] Em certas modalidades, um composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de acordo com uma das seguintes fór- mulas: mCks mCks mCks Gds Ads Tds Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds Tks Gks Tk (SEQ ID NO:1113); Aks Aks Gks Tds Ads Tds Gds Gds Tds Gds mCds Ads Ads mCks Aks Gk (SEQ ID NO:239); Aks mCks Gks Ads Tds Tds Ads mCds Ads Gds Gds Gds Ads Tks Tks mCk (SEQ ID NO:426); Tks Gks mCks Ads Tds Ads Gds Gds Ads Gds Tds Tds mCds Tks mCks Tk (SEQ ID NO:1541); Aks Gks Aks Gds Tds Ads Ads Tds Gds Ads Ads Ads mCds mCks mCks Ak (SEQ ID NO:1812); mCks Gks Aks Tds Tds Ads mCds Ads Gds Gds Gds Ads Tds Tks mCks Ak (SEQ ID NO:593); em que A = uma adenina, mC = uma 5-metilcitosina, G = uma guanina, T = uma timina, k = uma porção de açúcar cEt, d = uma fação de açúcar 2'-desoxirribosila e s = uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[0091] Em certas modalidades, um composto compreende ou consiste no composto 827359 ou sal do mesmo, um oligonucleotídeo modificado tendo a seguinte estrutura química:
[SEQ ID NO:1113]
[0092] Em certas modalidades, um composto compreende ou consiste no sal de sódio do composto 827359, tendo a seguinte estrutura química:
[SEQ ID NO:1113]
[0093] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto ou oligonucleotídeo pode ser pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementar a um ácido nucleico que codifica α-ENaC.
[0094] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples. Em certas modalidades, o composto compreende
2'-desoxirribonucleosídeos. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla. Em certas modalidades, o composto é de fita dupla e compreende ribonucleosídeos. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o com- posto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico.
[0095] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de 8 a 80, 10 a 30, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50 ou 20 a 30 nucleosídeos ligados de com- primento. Em certas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo.
[0096] Em certas modalidades, um composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado no presente documento descrito e um grupo conjugado. Em certas modalidades, o grupo conjugado está ligado ao oligonucleotídeo modificado na extremidade 5' do oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o grupo conjugado está ligado ao oligonucleotídeo modificado na extremidade 3' do oligonucleotídeo modificado.
[0097] Em determinadas modalidades, compostos ou composições fornecidos neste documento compreendem um sal do oligonucleotídeo mo- dificado. Em certas modalidades, o sal é um sal de sódio. Em certas moda- lidades, o sal é um sal de potássio.
[0098] Em certas modalidades, os compostos ou composições como no presente documento descritos são ativos em virtude de ter pelo menos um de um in vitro IC50 inferior a 250 nM, inferior a 200 nM, inferior a 150 nM, inferior a 100 nM, inferior a 90 nM, inferior a 80 nM, inferior a 70 nM, inferior a 65 nM, inferior a 60 nM, inferior a 55 nM, inferior a 50 nM, inferior a 45 nM, inferior a 40 nM, inferior a 35 nM, inferior a 30 nM, menor que 25 nM, menor que 20 nM ou menor que 15 nM em um teste de célula padrão.
[0099] Em certas modalidades, os compostos ou composições descritos no presente documento são altamente toleráveis, como demonstrado por ter pelo menos um de um aumento de um valor de alanina transaminase (ALT)
ou aspartato transaminase (AST) de não mais que 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes, ou 1,5 vezes em animais tratados com solução salina ou um aumento no peso do fígado, baço ou rim de não mais que 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% ou 2% em comparação aos animais tratados com controle. Em certas mo- dalidades, os compostos ou composições como no presente documento descritos são altamente toleráveis, como demonstrado por não haver au- mento de ALT ou AST em relação a animais tratados com controle. Em certas modalidades, os compostos ou composições como no presente do- cumento descritos são altamente toleráveis, como demonstrado por não haver aumento no peso do fígado, baço ou rim em relação em relação aos animais de controle.
[00100] Certas modalidades fornecem uma composição compreendendo o composto de qualquer uma das modalidades mencionadas acima ou sal das mesmas e pelo menos um de um transportador ou diluente farmaceu- ticamente aceitável. Em certas modalidades, a composição tem uma visco- sidade menor que cerca de 40 centipoise (cP), menor que cerca de 30 cP, menor que cerca de 20 cP, menor que cerca de 15 cP, menor que cerca de 10 cP, menor que cerca de 5 cP ou menor que cerca de 3 cP ou menor que cerca de 1,5 cP. Em certas modalidades, a composição com qualquer uma das viscosidades mencionadas acima compreende um composto no pre- sente documento fornecido a uma concentração de cerca de 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL ou cerca de 50 mg/mL. Em certas modalidades, a com- posição com qualquer uma das viscosidades e/ou concentrações de com- postos mencionadas acima tem uma temperatura da temperatura ambiente ou cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C ou cerca de 30°C.
[00101] Qualquer um dos compostos precedentes pode ser usado para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença associada à ENaC, como descrito no presente documento mais adiante.
Determinadas Indicações
[00102] Certas modalidades no presente documento fornecidas refe- rem-se a métodos de inibição da expressão de ENaC, que podem ser úteis para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associada a ENaC em um indivíduo, pela administração de um composto que tem como alvo α-ENaC. Em certas modalidades, o composto pode ser um inibidor de α-ENaC. Em certas modalidades, o composto pode ser um composto antissentido, com- posto oligomérico ou oligonucleotídeo complementar a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto pode ser qualquer um dos compostos no presente documento descritos.
[00103] Exemplos de doenças associadas à ENaC que são tratáveis, evitáveis e/ou melhoráveis com os métodos no presente documento forne- cidos incluem fibrose cística, COPD, asma e bronquite crônica.
[00104] Em certas modalidades, um método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença associada a α-ENaC em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo um composto compreendendo um inibidor de α-ENaC, tratando, prevenindo ou melhorando a doença. Em certas modali- dades, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleo- tídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é comple- mentar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290;
16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152;
25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995;
31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleo- sídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalida- des, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qual- quer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou
827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é administrado ao indiví- duo por inalação. Em certas modalidades, a administração do composto melhora ou preserva a espirometria ou a depuração mucociliar.
[00105] Em certas modalidades, um método de tratamento, prevenção ou melhoria da fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica compreende administrar ao indivíduo um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado complementar a um ácido nucleico α-ENaC, tratando, prevenindo ou melhorando assim fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, o composto é um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290;
16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152; 25.252-25.445;
25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995; 31.052-31.198; ou
31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nu- cleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um a oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreen- dendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qual- quer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou
827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é administrado ao indiví- duo por inalação. Em certas modalidades, a administração do composto melhora ou preserva a função pulmonar. Em certas modalidades, a espi- rometria ou a depuração mucociliar são melhoradas ou preservadas. Em certas modalidades, o volume expiratório forçado em um segundo (FEV1), FVC, ou FEF25-75 é aumentado. Em certas modalidades, exacerbações pulmonares, taxa ou frequência de hospitalização ou uso de antibióticos são diminuídos. Em certas modalidades, a qualidade de vida é melhorada, con- forme medido pelo questionário respiratório, CFQ-R. Em certas modalida- des, o indivíduo é identificado como tendo ou em risco de ter uma doença associada à ENaC.
[00106] Em certas modalidades, um método para inibir a expressão de α-ENaC em um indivíduo com ou em risco de ter uma doença associada a ENaC compreende administrar ao indivíduo um composto compreendendo um inibidor de α-ENaC, inibindo assim a expressão de α-ENaC no indivíduo. Em certas modalidades, a administração do composto inibe a expressão de α-ENaC no pulmão. Em certas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas moda- lidades, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleo- tídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é comple- mentar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290;
16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152;
25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995;
31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleo- sídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalida- des, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qual- quer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou
827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é administrado ao indiví-
duo por inalação. Em certas modalidades, a administração do composto melhora ou preserva a espirometria ou a depuração mucociliar. Em certas modalidades, o individual é identificado como tendo ou em risco de ter uma doença associada à ENaC.
[00107] Em certas modalidades, um método de inibição da expressão de α-ENaC em uma célula compreende o contato da célula com um composto compreendendo um inibidor de α-ENaC, inibindo assim a expressão de α-ENaC na célula. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula de pulmão. Em certas modalidades, a célula está no pulmão. Em certas moda- lidades, a célula está no pulmão de um indivíduo que tem ou corre risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalida- des, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleo- tídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é comple- mentar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290;
16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152;
25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995;
31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleo- sídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalida- des, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qual- quer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou
827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico.
[00108] Em certas modalidades, um método para aumentar ou melhorar a espirometria ou a depuração mucociliar no pulmão de um indivíduo que tem ou corre o risco de ter uma doença associada à ENaC compreende admi- nistrar ao indivíduo um composto que compreende um inibidor de α-ENaC, aumentando ou diminuindo melhorar a espirometria ou a depuração muco- ciliar no pulmão do indivíduo. Em certas modalidades, o volume expiratório forçado em um segundo (FEV1), FVC, ou FEF25-75 é aumentado. Em certas modalidades, exacerbações pulmonares, taxa ou frequência de hospitali- zação ou uso de antibióticos são diminuídos. Em certas modalidades, a qualidade de vida é melhorada, conforme medido pelo questionário respi- ratório, CFQ-R. Em certas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalida-
des, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleo- tídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é comple- mentar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290;
16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152;
25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995;
31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleo- sídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalida- des, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qual- quer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou
827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico. Em certas modalidades, o composto é administrado ao indiví- duo por inalação. Em certas modalidades, o individual é identificado como tendo ou em risco de ter uma doença associada à ENaC.
[00109] Certas modalidades são concebidas para um composto com- preendendo um inibidor de α-ENaC para uso no tratamento de uma doença associada a ENaC. Em certas modalidades, a doença é fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonu- cleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalida- des, o oligonucleotídeo modificado é complementar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290; 16.559-17.759; 17.951-24.120;
24.225-24.565; 24.730-25.152; 25.252-25.445; 25.564-30.595;
30.675-30.779; 30.838-30.995; 31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma se- quência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contí- guas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID
NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleoba- ses de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou
593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico.
[00110] Certas modalidades são concebidas para um composto com- preendendo um inibidor de α-ENaC para uso no aumento ou melhoria da espirometria ou depuração mucociliar de um indivíduo com ou em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, o composto compreende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas moda- lidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron
1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290; 16.559-17.759;
17.951-24.120; 24.225-24.565; 24.730-25.152; 25.252-25.445;
25.564-30.595; 30.675-30.779; 30.838-30.995; 31.052-31.198; ou
31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nu- cleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos liga- dos de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oli- gonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequên- cia de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades prece- dentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de com- posto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico.
[00111] Certas modalidades são concebidas para o uso de um composto compreendendo um inibidor de α-ENaC para a fabricação ou preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença associada à ENaC. Certas modalidades são concebidas para o uso de um composto compre- endendo um inibidor de α-ENaC para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença associada à ENaC. Em certas modalidades, a doença é fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, o composto compreende um composto antissentido direcio- nado a α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende um oli- gonucleotídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo mo- dificado complementar a um íntron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é comple- mentar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163;
5.634-16.290; 16.559-17.759; 17.951-24.120; 24.225-24.565;
24.730-25.152; 25.252-25.445; 25.564-30.595; 30.675-30.779;
30.838-30.995; 31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto com- preende um oligonucleotídeo modificado que consiste na sequência de nu- cleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalida-
des, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleo- tídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modali- dades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392. Em qualquer uma das modalidades preceden- tes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antis- sentido ou composto oligomérico.
[00112] Certas modalidades são concebidas para o uso de um composto compreendendo um inibidor de α-ENaC para a fabricação ou preparação de um medicamento para aumentar ou melhorar a espirometria ou depuração mucociliar em um indivíduo com ou em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, o composto compre- ende um composto antissentido direcionado a α-ENaC. Em certas modali- dades, o composto compreende um oligonucleotídeo complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucle- otídeo é um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o com- posto compreende um oligonucleotídeo modificado complementar a um ín- tron de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é complementar ao íntron 1, íntron 2, íntron 3, íntron 4, íntron 5, íntron 6, íntron 7, íntron 8, íntron 9, íntron 10, íntron 11 ou íntron 12 de um transcrito de ácido nucleico α-ENaC. Em certas modalida- des, o oligonucleotídeo modificado é complementar a uma sequência nos nucleotídeos 4.497-5.163; 5.634-16.290; 16.559-17.759; 17.951-24.120;
24.225-24.565; 24.730-25.152; 25.252-25.445; 25.564-30.595;
30.675-30.779; 30.838-30.995; 31.052-31.198; ou 31.275-31.747 da SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma se- quência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contí- guas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonu- cleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleoba- ses de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste na sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modifi- cado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou 593. Em certas modalidades, o composto compreende um oligonucleotídeo modificado tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 1541, 1812, 1113 ou
593. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleotídeo modificado pode ter 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o composto é o número de composto 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 ou 827392. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser de fita simples ou de fita dupla. Em qualquer uma das modalidades precedentes, o composto pode ser um composto antissentido ou composto oligomérico.
[00113] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode ser direcionado para α-ENaC. Em certas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado, por exemplo, um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento, 10 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento, 12 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento ou 20 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar a qualquer uma das sequências de nu- cleobases recitadas nas SEQ ID NOs:1, 2 ou 1957. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação inter- nucleosídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e pelo menos uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, a pelo menos uma ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica fosfo- rotioato, pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico ou um açúcar 2'-MOE, e a pelo menos uma nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados, em que o seg- mento de lacuna é posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3 'e em que cada nucleosídeo de asa terminal compreende um açúcar modificado.
[00114] Em qualquer uma das modalidades precedentes, o oligonucleo- tídeo modificado é 12 a 30, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 24, 16 a 24, 17 a 24, 18 a 24, 19 a 24, 20 a 24, 19 a 22, 20 a 22, 16 a 20 ou 17 ou 20 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modi- ficado é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar a qual- quer uma das sequências de nucleobases recitadas nas SEQ ID NOs:1, 2 ou
1957. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, pelo menos um açúcar modificado e pelo menos uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, a pelo menos uma ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica fosforotioato, pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico ou um açúcar 2'-MOE, e a pelo menos uma nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em
2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nu- cleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados, em que o segmento de lacuna é posicionado imediatamente adja- cente e entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3 'e em que cada nucleosídeo de asa terminal compreende um açúcar modificado.
[00115] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:6-1954, em que o oligonu- cleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleosídeo de cada segmento de asa compreende um açúcar modificado.
[00116] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 16 a 30 nucleosídeos ligados de comprimento e com uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:6-1954, em que o oligonu- cleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de asa terminal compreende um açúcar modificado.
[00117] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 20 nucleo- sídeos de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreen- dendo a sequência recitada em qualquer uma de SEQ ID NOs:6-1954, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em dez 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; e um segmento de asa 3' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg- mento de asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil; em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado con- siste em 20-30 nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, o oligonucle- otídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados.
[00118] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleobases ligadas de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo ou consistindo na sequência recitada em qualquer uma de SEQ ID NOs:6-1954, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em 10 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em 3 nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em 3 nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg- mento de asa compreende um açúcar cEt; em que cada ligação internu- cleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma
5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado con- siste em 16-30 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado consiste em 16 nucleosídeos ligados.
[00119] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleobases ligadas de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo ou consistindo na sequência recitada em qualquer uma de SEQ ID NOs:239, 426, 593, 1113, 1541 ou 1812, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em 10 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em 3 nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em 3 nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg- mento de asa compreende um açúcar cEt; em que cada ligação internu- cleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado con- siste em 16-30 nucleosídeos ligados. Em determinadas modalidades, o oli- gonucleotídeo modificado consiste em 16 nucleosídeos ligados.
[00120] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto tem a seguinte estrutura química:
[SEQ ID NO:1113]
[00121] Em qualquer um dos métodos ou usos precedentes, o composto pode ser administrado por inalação. Em certas modalidades, o composto de qualquer um dos métodos ou usos precedentes pode ser administrado por injeção ou infusão. Em certas modalidades, o composto de qualquer um dos métodos ou usos precedentes pode ser administrado via administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, admi- nistração intra-arterial, administração intraperitoneal ou administração intra- craniana, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular. Em certas modalidades, o composto de qualquer um dos métodos ou usos precedentes pode ser administrado sistemicamente. Em certas modalidades, o composto de qualquer um dos métodos ou usos precedentes pode ser administrado por via oral. Certas Combinações e Terapias de Combinação
[00122] Em certas modalidades, um agente primário que compreende o composto descrito neste documento é coadministrado com um ou mais agentes secundários. Em certas modalidades, tais agentes secundários são destinados a tratar a mesma doença, distúrbio, ou condição como o agente primário descrito neste documento. Em certas modalidades, tais agentes secundários são projetados para tratar uma doença, distúrbio, ou condição diferente como o agente primário descrito neste documento. Em certas modalidades, um agente primário é projetado para tratar um efeito colateral indesejado de um agente secundário. Em certas modalidades, os agentes secundários são coadministrados com o agente primário para tratar um efeito indesejado do agente primário. Em certas modalidades, esses agentes se- cundários são projetados para tratar um efeito colateral indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, os agentes secundários são coadministrados com o agente primário para produzir um efeito combinacional. Em certas modali- dades, os agentes secundários são coadministrados com o agente primário para produzir um efeito sinérgico. Em certas modalidades, a coadministração dos agentes primários e secundários permite o uso de dosagens mais baixas do que seria necessário para obter um efeito terapêutico ou profilático, se os agentes fossem administrados como terapia independente.
[00123] Em certas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos são co-administrados com um ou mais agentes secundários. Em certas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes se- cundários, são administrados em momentos diferentes. Em certas modali- dades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes secundários, são preparados juntos em uma única formulação. Em certas modalidades, um ou mais compostos ou composições no presente documento fornecidos e um ou mais agentes se- cundários, são preparados separadamente. Em certas modalidades, um agente secundário é um broncodilatador, um corticosteroide, um antibiótico, um segundo composto que compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado e/ou um modulador de canal de cloreto (CFTR). Em certas mo- dalidades, um agente secundário é selecionado de: solução salina hipertô- nica, dornase alfa, ivacaftor, tezacaftor e lumacaftor.
[00124] Certas modalidades são direcionadas ao uso de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado complementar a um trans- crito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento em combinação com um agente secundário. Em modalidades particulares, esse uso está em um método de tratamento de um paciente que sofre de fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica ou na preparação ou fabricação de um medicamento para tratamento de fibrose cística, COPD, asma ou bron- quite crônica. Em certas modalidades, um agente secundário é um bronco- dilatador, um corticosteroide, um antibiótico ou um modulador de canal de cloreto (CFTR). Em certas modalidades, um agente secundário é selecio- nado de: solução salina hipertônica, dornase alfa, ivacaftor, tezacaftor e lumacaftor.
[00125] Certas modalidades são direcionadas ao uso de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado complementar a um trans- crito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento em combinação com dois ou mais agentes secundários. Em modalidades par- ticulares, esse uso está em um método de tratamento de um paciente que sofre de fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica ou na preparação ou fabricação de um medicamento para tratamento de fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica. Em certas modalidades, dois ou mais agentes secundários são selecionados entre broncodilatadores, corticosteroides, antibióticos e moduladores do canal de cloreto (CFTR). Em certas modali- dades, dois ou mais agentes secundários são selecionados de: solução sa- lina hipertônica, dornase alfa, ivacaftor, tezacaftor e lumacaftor.
[00126] Certas modalidades são concebidas para uma combinação de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado comple- mentar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC, conforme descrito no presente documento e um agente secundário, como um agente secundário selecionado de: solução salina hipertônica, dornase alfa, ivacaftor, tezacaftor e lumacaftor. Em certas modalidades, essa combinação de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado complementar a um trans- crito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento e um agente secundário, como um agente secundário selecionado de: solução salina hipertônica, dornase alfa, ivacaftor, tezacaftor e lumacaftor é útil para melhorar ou preservar a espirometria ou a depuração mucociliar e/ou tratar a fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
[00127] Certas modalidades são concebidas para uma combinação de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado comple- mentar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC, conforme descrito no presente documento e dois ou mais agentes secundários, como agentes secundários selecionados de: solução salina hipertônica, dornase alfa, iva- caftor, tezacaftor e lumacaftor. Em certas modalidades, essa combinação de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado comple-
mentar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento e dois ou mais agentes secundários, como agentes secundários selecionados de: solução salina hipertônica, dornase alfa, ivacaftor, teza- caftor e lumacaftor é útil para melhorar ou preservar a espirometria ou a depuração mucociliar e/ou tratar a fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
[00128] Em certas modalidades, o composto compreendendo um oligo- nucleotídeo modificado complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento e o agente secundário são usados no tratamento combinado, administrando os dois agentes simulta- neamente, separadamente ou sequencialmente. Em certas modalidades, os dois agentes são formulados como um produto de combinação de dose fixa. Em outras modalidades, os dois agentes são fornecidos ao paciente como unidades separadas que podem ser tomadas simultaneamente ou em série (sequencialmente).
[00129] Em certas modalidades, o composto compreendendo um oligo- nucleotídeo modificado complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC como descrito no presente documento e dois ou mais agentes se- cundários são usados no tratamento combinado, administrando os três ou mais agentes simultaneamente, separadamente ou sequencialmente. Em certas modalidades, os três ou mais agentes são formulados como um produto de combinação de dose fixa. Em outras modalidades, os três ou mais agentes são fornecidos ao paciente como unidades separadas que podem ser tomadas simultaneamente ou em série (sequencialmente). Determinados Compostos
[00130] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos podem ser compostos antissentido. Em certas modalidades, o composto antissentido compreende ou consiste em um composto oligomé- rico. Em certas modalidades, o composto oligomérico compreende ou con- siste em um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o oligo-
nucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobases complementar à de um ácido nucleico alvo.
[00131] Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobases complementar à de um ácido nucleico alvo.
[00132] Em certas modalidades, um composto ou composto antissentido é de fita simples. Tal composto de fita simples ou composto antissentido compreende ou consiste em um composto oligomérico. Em certas modali- dades, esse composto oligomérico compreende ou consiste em um oligo- nucleotídeo e, opcionalmente, um grupo conjugado. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissentido. Em certas modali- dades, o oligonucleotídeo é modificado. Em certas modalidades, o oligonu- cleotídeo de um composto antissentido de fita simples ou composto oligo- mérico compreende uma sequência de nucleobases autocomplementar.
[00133] Em certas modalidades, um composto ou composto antissentido é de fita dupla. Tais compostos de fita dupla compreendem um primeiro composto oligomérico compreendendo ou que consiste em um primeiro oligonucleotídeo modificado com uma região complementar a um ácido nu- cleico alvo e um segundo composto oligomérico compreendendo ou que consiste em um segundo oligonucleotídeo com uma região complementar ao primeiro oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo é 100% complementar ao segundo oligonucleotídeo. Em certas modalidades, o primeiro e o segundo oligonucleotídeos incluem nu- cleosídeos pendentes não complementares. Em certas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo modificado compreende porções de açúcar ribosila não modificado como as encontradas no RNA. Em tais modalidades, as nu- cleobases de timina no primeiro e/ou no segundo oligonucleotídeo são substituídas por nucleobases de uracila. Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo composto oligomérico compreende um grupo conjugado. Em certas modalidades, o primeiro oligonucleotídeo modificado tem 12-30 nu- cleosídeos ligados de comprimento e o segundo oligonucleotídeo tem 12-30 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas modalidades, o segundo oligonucleotídeo é modificado. Em certas modalidades, o primeiro oligonu- cleotídeo modificado tem uma sequência de nucleobase compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de qualquer uma de SEQ ID NOs:6-1954.
[00134] Exemplos de compostos de fita simples e dupla incluem, mas não estão limitados a, oligonucleotídeos, siRNAs, oligonucleotídeos direcionados a microRNA e compostos de RNAi de fita simples, como RNAs em gancho (shRNAs), siRNAs de fita simples (ssRNAs) e microRNA imita.
[00135] Em certas modalidades, um composto descrito no presente do- cumento tem uma sequência de nucleobases que, quando escrita na direção 5' para 3', compreende o complemento inverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo ao qual este é direcionado.
[00136] Em certas modalidades, um composto descrito no presente do- cumento compreende um oligonucleotídeo com 10 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo de 12 a 30 subunidadesliga- dasde comprimento. Em certas modalidades, um composto descrito no presente documento compreende um oligonucleotídeo de 12 a 22 subuni- dades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, o composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo 14 a 30 su- bunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, o composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo 14 a 20 su- bunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 15 a 30 subunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 15 a 20 subunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 16 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 16 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 17 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 17 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 18 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 18 a 21 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo 18 a 20 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 20 a 30 subunidades ligadas de comprimento.
Em outras palavras, esses oligonu- cleotídeos são 12 a 30 subunidades ligadas, 14 a 30 subunidades ligadas, 14 a 20 subunidades, 15 a 30 subunidades, 15 a 20 subunidades, 16 a 30 su- bunidades, 16 a 20 subunidades, 17 a 30 subunidades, 17 a 20 subunidades, 18 a 30 subunidades, 18 a 20 subunidades, 18 a 21 subunidades, 20 a 30 subunidades ou 12 a 22 subunidades ligadas de comprimento, respectiva- mente.
Em certas modalidades, um composto no presente documento des- crito compreende um oligonucleotídeo de 14 subunidades ligadas de com- primento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 16 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 17 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, o composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 18 subunidades ligadas de comprimento.
Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 19 subunidades ligadas de comprimento. Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito compreende umoligonucleotídeo de 20 subunidades ligadas de comprimento. Em outras modalidades, um composto no presente documento descrito compreende um oligonucleotídeo de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 22, 18 a 24, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 22, 19 a 30, 19 a 50 ou 20 a 30 subu- nidades ligadas. Em certas modalidades, o composto no presente docu- mento descrito compreende um oligonucleotídeo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 subunidades ligadas de comprimento ou uma faixa definida por dois dos valores acima. Em algumas modalidades, as subunidades ligadas são nucleotídeos, nucleosídeos ou nucleobases.
[00137] Em certas modalidades, o composto pode ainda compreender características ou elementos adicionais, tais como um grupo conjugado, que estão ligados ao oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, tais compostos são compostos antissentido. Em certas modalidades, esses compostos são compostos oligoméricos. Nas modalidades em que um grupo conjugado compreende um nucleosídeo (isto é, um nucleosídeo que liga o grupo conjugado ao oligonucleotídeo), o nucleosídeo do grupo conjugado não é contado no comprimento do oligonucleotídeo.
[00138] Em certas modalidades, os compostos podem ser encurtados ou truncados. Por exemplo, uma única subunidade pode ser excluída da ex- tremidade 5'(truncamento 5') ou, alternativamente, da extremidade 3' (trun- camento 3'). Um composto encurtado ou truncado direcionado a um ácido nucleico α-ENaC pode ter duas subunidades excluídas da extremidade 5' ou, alternativamente, pode ter duas subunidades excluídas da extremidade 3' do composto. Alternativamente, os nucleósidos deletados podem ser dispersos por todo o composto.
[00139] Quando uma única subunidade adicional está presente em um composto alongado, a subunidade adicional pode estar localizada na ex- tremidade 5' ou 3' do composto. Quando duas ou mais subunidades adici- onais estão presentes, as subunidades adicionadas podem ser adjacentes umas às outras, por exemplo, em um composto com duas subunidades adi- cionadas à extremidade 5' (adição 5') ou, alternativamente, à extremidade 3' (adição 3'), do composto. Alternativamente, as subunidades adicionadas podem ser dispersas por todo o composto.
[00140] É possível aumentar ou diminuir o comprimento de umcomposto, como um oligonucleotídeo, e/ou introduzir bases de incompatibilidade sem eliminar a atividade (Woolf et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, 89:7305-7309; Gautschi; et al., J. Natl. Cancer Inst. March 2001, 93:463-471; Maher and Dolnick Nuc. Acid. Res. 1998, 16:3341-3358). Contudo, mu- danças aparentemente pequenas na sequência, na química e no motivo dos oligonucleotídeos podem fazer grandes diferenças em uma ou mais das muitas propriedades necessárias para o desenvolvimento clínico (Seth et al. J. Med. Chem. 2009, 52, 10; Egli et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16642).
[00141] Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento são compostos de RNA de intervenção (RNAi), que incluem compostos de RNA de fita supla (também referidos como RNA de interfe- rência breve ou siRNA) e compostos de RNAi de fita simples (ou ssRNA). Esses compostos funcionam, pelo menos em parte, através da via de RISC para degradar e/ou sequestrar um ácido nucleico alvo (e, assim, incluir compostos de microRNA/mímicos de microRNA). Conforme usado neste documento, o termo de siRNA pretende ser equivalente a outros termos usados para descrever moléculas de ácido nucleico que são capazes de mediar a sequência de RNAi específico, por exemplo interferência curta de RNA (siRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), micro-RNA (miRNA), RNA de hairpin curto (shRNA), oligonucleotídeo de interferência curta, ácido nucleico de interferência curta, oligonucleotídeo modificado de interferência curta,
quimicamente modificados siRNA, gene silenciamento pós-transcricional RNA (ptgsRNA), e outros. Além disso, conforme usado neste documento, o termo RNAi pretende ser equivalente a outros termos usados para descrever a sequência de RNA de interferência específica, tal como o silenciamento pós-transcricional de genes, a inibição de translação, ou epigenética.
[00142] Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito pode compreender qualquer uma das sequências oligonucleotídicas direcionadas a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC no presente docu- mento descrito. Em certas modalidades, o composto pode ser de fita dupla. Em certas modalidades, o composto compreende uma primeira fita com- preendendo pelo menos uma porção de nucleobase contígua 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 de qualquer uma das SEQ ID NOs :6-1954 e uma segunda fita. Em certas modalidades, o composto compreende uma primeira fita que compreende a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954 e uma segunda fita. Em certas modalidades, o composto compreende ribonucleotídeos nos quais a primeira fita possui uracila (U) no lugar de timina (T) em qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende (i) uma primeira fita com- preendendo uma sequência de nucleobases complementar ao local em um ácido nucleico α-ENaC ao qual qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954 é complementar e (ii) uma segunda fita. Em certas modalidades, o composto compreende um ou mais nucleotídeos modificados nos quais a posição 2' no açúcar contém um halogênio (como o grupo flúor; 2’-F) ou contém um grupo alcóxi (como um grupo metóxi; 2’-OMe). Em certas modalidades, o composto compreende pelo menos uma modificação de açúcar 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar 2'-OMe. Em certas modalidades, a pelo menos uma modificação de açúcar 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar 2'-OMe são dispostas em um padrão alternado por pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas ao longo de uma fita do composto dsRNA. Em certas modalidades, o composto compreende uma ou mais ligações entre nucleotídeos adjacentes que não uma ligação fosfodiéster de ocorrência natural. Exemplos de tais ligações incluem ligações fosforamida, fosforotioato e fosforoditioato. Os compostos também podem ser moléculas de ácidos nucleicos quimicamente modifica- das como ensinado na Patente US 6.673.661. Em outras modalidades, o composto contém uma ou duas fitas tampadas, como divulgado, por exem- plo, pelo documento WO 00/63364, depositado em 19 de abril de 2000.
[00143] Em certas modalidades, a primeira fita do composto é uma fita guia de siRNA e a segunda fita do composto é uma fita de passageiro siRNA. Em certas modalidades, a segunda fita do composto é complementar à primeira fita. Em certas modalidades, cada fita do composto tem 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleosídeos ligados de comprimento. Em certas mo- dalidades, a primeira ou a segunda fita do composto pode compreender um grupo conjugado.
[00144] Em certas modalidades, um composto no presente documento descrito pode compreender qualquer uma das sequências oligonucleotídicas direcionadas a um de ácido nucleico α-ENaC no presente documento des- crito. Em determinadas modalidades, o composto é de fita única. Em certas modalidades, esse composto é um composto de RNAi de fita simples (ssRNAi). Em certas modalidades, o composto compreende pelo menos uma porção de nucleobase contígua 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 de qualquer uma das SEQ ID NOs :6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende ri- bonucleotídeos nos quais o uracila (U) está no lugar de timina (T) em qual- quer uma das SEQ ID NOs:6-1954. Em certas modalidades, o composto compreende uma sequência de nucleobases complementar ao local em α-ENaC ao qual qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954 está direcionada. Em certas modalidades, o composto compreende um ou mais nucleotídeos modificados nos quais a posição 2' no açúcar contém um halogênio (como o grupo flúor; 2’-F) ou contém um grupo alcóxi (como um grupo metóxi; 2’-OMe). Em certas modalidades, o composto compreende pelo menos uma modificação de açúcar 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar 2'-OMe. Em certas modalidades, a pelo menos uma modificação de açúcar 2'-F e pelo menos uma modificação de açúcar 2'-OMe são dispostas em um padrão alternado por pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases contíguas ao longo de uma fita do com- posto. Em certas modalidades, o composto compreende uma ou mais liga- ções entre nucleotídeos adjacentes que não uma ligação fosfodiéster de ocorrência natural. Exemplos de tais ligações incluem ligações fosforamida, fosforotioato e fosforoditioato. Os compostos também podem ser moléculas de ácidos nucleicos quimicamente modificadas como ensinado na Patente US 6.673.661. Em outras modalidades, o composto contém uma fita cape- ada, como divulgado, por exemplo, por WO 00/63364, depositado em 19 de abril de 2000. Em certas modalidades, o composto consiste em 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, o com- posto pode compreender um grupo conjugado.
[00145] Certos compostos no presente documento descritos (por exem- plo, oligonucleotídeos modificados) têm um ou mais centros assimétricos e, assim, dão origem a enantiômeros, diastereômeros e outras configurações estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R) ou (S), como  ou , como para anômeros de açúcar, ou como (D) ou (L), como para aminoácidos, etc. Os compostos no presente documento fornecidos que são concebidos ou descritos como tendo certas configurações estereoisoméricas incluem apenas os compostos indicados. Os compostos no presente documento proporcionados que são concebidos ou descritos com estereoquímica indefinida incluem todos esses isômeros possíveis, incluindo suas formas estéreo-aleatórias e opticamente puras. Todas as formas tautoméricas dos compostos no presente documento for- necidos estão incluídas, salvo indicação em contrário.
[00146] Os compostos no presente documento descritos incluem varia- ções nas quais um ou mais átomos são substituídos por um isótopo não radioativo ou isótopo radioativo do elemento indicado. Por exemplo, os compostos no presente documento contidos que compreendem átomos de hidrogênio abrangem todas as substituições de deutério possíveis para cada um dos átomos de hidrogênio 1H. As substituições isotópicas abrangidas pelos compostos no presente documento incluídos incluem, mas não estão limitadas a:2H ou 3H no lugar de 1H, 13C ou 14C no lugar de 12C, 15N no lugar de 14N, 17O ou 18O no lugar de 16O, e 33S, 34S, 35S, ou 36S no lugar de 32S. Em certas modalidades, as substituições isotópicas não radioativas podem conferir novas propriedades ao composto oligomérico que são benéficas para uso como uma ferramenta terapêutica ou de pesquisa. Em certas mo- dalidades, as substituições isotópicas radioativas podem tornar o composto adequado para fins de pesquisa ou diagnóstico, como imagem. Certos Mecanismos
[00147] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos modificados. Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos são compostos antissentido. Em certas modalidades, os compostos compreen- dem compostos oligoméricos. Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos são capazes de hibridar com um ácido nu- cleico alvo α-ENaC, resultando em pelo menos uma atividade antissentido. Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos afetam seletivamente um ou mais ácidos nucleicos alvo. Tais compostos compreendem uma sequência de nucleobases que hibrida com um ou mais ácidos nucleicos alvo, resultando em uma ou mais atividades antissentido desejada e não hibrida com um ou mais ácidos nucleicos não alvo ou não hibrida com um ou mais ácidos nucleicos não alvo de tal maneira que resulte em uma atividade antissentido indesejada significativa.
[00148] Em certas atividades antissentido, a hibridação de um composto no presente documento descrito com um ácido nucleico alvo resulta no re- crutamento de uma proteína que cliva o ácido nucleico alvo. Por exemplo, certos compostos no presente documento descritos resultam na clivagem mediada por RNase H do ácido nucleico alvo. A RNase H é uma endonu- clease celular que cliva a fita de RNA de um duplex RNA:DNA. O DNA em um duplex RNA:DNA não precisa ser um DNA não modificado. Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos são suficien- temente "semelhantes ao DNA" para provocar a atividade da RNase H. Além disso, em certas modalidades, um ou mais nucleosídeos não semelhantes a DNA na lacuna de um gapmer são tolerados.
[00149] Em certas atividades antissentido, os compostos no presente documento descritos ou uma porção do composto são carregados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) resultando finalmente na clivagem do ácido nucleico alvo. Por exemplo, certos compostos no presente documento descritos resultam na clivagem do ácido nucleico alvo por Argonaute. Os compostos que são carregados no RISC são compostos de RNAi. Os compostos de RNAi podem ser de fita dupla (siRNA) ou de fita simples (ssRNA).
[00150] As atividades antissentido podem ser observadas direta ou indi- retamente. Em certas modalidades, a observação ou detecção de uma ati- vidade antissentido envolve a observação ou detecção de uma alteração em uma quantidade de um ácido nucleico ou proteína alvo codificada por esse ácido nucleico alvo, uma alteração na proporção de variantes de emenda de um ácido nucleico ou proteína, e/ou uma alteração fenotípica em uma célula ou animal. Ácidos Nucleicos Alvo, Regiões Alvo e Sequências Nucleotídicas
[00151] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em um oligonucleotídeo compreen- dendo uma região que é complementar a um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é uma molécula de RNA endógena. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico alvo codifica uma proteína. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é selecionado de: um mRNA e um pré-mRNA, incluindo regiões intrônicas, exônicas e não traduzidas. Em certas modalidades, o RNA alvo é um mRNA. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é um pré-mRNA. Em certas modalidades, um pré-mRNA e o mRNA correspondente são ambos ácidos nucleicos alvo de um único composto. Em certas modalidades, a região alvo está inteiramente dentro de um íntron de um pré-mRNA alvo. Em certas modalidades, a região alvo abrange uma junção íntron/éxon. Em certas modalidades, a região alvo está pelo menos 50% dentro de um íntron. As sequências alvo de ácido nucleico que codificam α-ENaC incluem, sem limitação, as seguintes: Nº de RefSEQ NM_001038.5; o complemento de NC_000012.12 truncado dos nucleosí- deos 6343001 a 6380000; e NG_011945.1 (SEQ ID Nos:1, 2 e 1957, res- pectivamente). Hibridação
[00152] Em algumas modalidades, a hibridação ocorre entre um com- posto divulgado neste documento e um ácido nucleico α-ENaC. O meca- nismo mais comum de hibridação envolve a ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertida) entre as nucleobases complementares das moléculas de ácido nucleico.
[00153] A hibridação pode ocorrer sob condições variáveis. As condições de hibridação são dependentes da sequência e são determinadas pela na- tureza e composição das moléculas de ácido nucleico a serem hibridizadas.
[00154] Os métodos para determinar se uma sequência é especifica- mente hibridável com um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na téc- nica. Em certas modalidades, os compostos no presente documento forne- cidos são especificamente hibridáveis com um ácido nucleico α-ENaC. Complementaridade
[00155] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos modificados. Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos são compostos antissentido. Em certas modalidades, os compostos compreen- dem compostos oligoméricos. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos complementares a um ácido nucleico α-ENaC compreendem nucleobase que são não complementares com o ácido nucleico α-ENaC, mas pode ser tolerado desde que o o composto permaneça capaz de hibridar especifica- mente com um ácido nucleico alvo. Além disso, um composto pode hibridar sobre um ou mais segmentos de um ácido nucleico α-ENaC, de modo que segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridação (por exemplo, uma estrutura de alça, incompatibilidade ou estrutura em gancho).
[00156] Em certas modalidades, os compostos no presente documento fornecidos, ou uma porção especificada, são, pelo menos, ou até 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementares a um ácido nucleico α-ENaC, uma região alvo, segmento alvo ou porção especificada do mesmo. Em certas modalidades, os compostos no presente documento fornecidos, ou uma porção especificada, são 70% a 75%, 75% a 80%, 80% a 85%, 85% a 90%, 90% a 95%, 95% a 100% ou qualquer número entre essas faixas, comple- mentares a um ácido nucleico α-ENaC, uma região alvo, segmento alvo ou uma porção especificada do mesmo. A complementaridade percentual de um composto antissentido com um ácido nucleico alvo pode ser determinada usando os métodos de rotina.
[00157] Por exemplo, um composto antissentido, no qual 18 de 20 nu- cleobases do composto antissentido são complementares para uma região alvo e, portanto, se hibridaria especificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, as nucleobases restantes não com- plementares podem ser agrupadas ou intercaladas com nucleobases com- plementares e não precisam ser contíguas umas às outras ou às nucleo-
bases complementares. Como tal, um composto com 18 nucleobases de comprimento tendo quatro nucleobases não complementares que são flan- queadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo teria 77,8% de complementaridade global com o ácido nucleico alvo. A complementaridade percentual de um composto com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada rotineiramente usando pro- gramas BLAST (ferramentas básicas de busca de alinhamento local) e pro- gramas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Homologia percentual, identidade de sequência ou complementaridade, podem ser determinados, por exemplo, por programa Gap (Wisconsin Se- quence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando as configurações padrão, que usa o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[00158] Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento, ou porções especificadas dos mesmos são totalmente com- plementares (isto é, 100% complementares) a um ácido nucleico alvo ou porções especificadas dos mesmos. Por exemplo, um composto pode ser 100% complementar a um ácido nucleico α-ENaC, ou a uma região alvo, ou a um segmento alvo ou sequência alvo do mesmo. Conforme usado neste documento, "totalmente complementar" significa que cada nucleobase de um composto é complementar à nucleobase correspondente de um ácido nu- cleico alvo. Por exemplo, um composto de 20 nucleobases é totalmente complementar para uma sequência alvo que tem 400 nucleobases de com- primento, desde que haja uma porção 20 de nucleobases correspondente do ácido nucleico alvo que seja totalmente complementar ao composto. To- talmente complementar também pode ser usado em referência a uma porção especificada do primeiro e/ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma porção de 20 nucleobases de um composto de 30 nucleobases pode ser
"totalmente complementar" a uma sequência alvo que tem 400 nucleobases de comprimento. A porção de 20 nucleobases do composto de 30 nucleo- bases é totalmente complementar à sequência alvo se a sequência alvo tiver uma porção correspondente de 20 nucleobases, em que cada nucleobase é complementar à porção de 20 nucleobases do composto. Ao mesmo tempo, o composto de 30 nucleobases inteiro pode ou não ser totalmente comple- mentar à sequência alvo, dependendo de se as 10 nucleobases restantes do composto também forem complementares à sequência alvo.
[00159] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem uma ou mais nucleobases incompatíveis em relação ao ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a atividade antissentido contra o alvo é reduzida por essa incompatibilidade, mas a atividade contra um não alvo é reduzida em uma quantidade maior. Assim, em certas moda- lidades, a seletividade do composto é melhorada. Em certas modalidades, a incompatibilidade é posicionada especificamente dentro de um oligonucleo- tídeo com um motivo gapmer. Em certas modalidades, a incompatibilidade está na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 a partir da extremidade 5' do segmento de lacuna. Em certas dessas modalidades, a incompatibilidade está na po- sição 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 a partir da extremidade 3' do segmento de folga. Em certas dessas modalidades, a incompatibilidade está na posição 1, 2, 3 ou 4 a partir da extremidade 5' do segmento de asa. Em certas dessas modalidades, a incompatibilidade está na posição 4, 3, 2 ou 1 da extremi- dade 3' do segmento de asa. Em certas modalidades, a incompatibilidade é posicionada especificamente dentro de um oligonucleotídeo sem um motivo gapmer. Em certas modalidades, a incompatibilidade está na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 a partir da extremidade 5' do oligonucleotídeo. Em certas dessas modalidades, a incompatibilidade está na posição 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 a partir da extremidade 3' do oligonucleotídeo.
[00160] A localização de uma nucleobase não complementar podem estar na extremidade 5' ou na extremidade 3' do composto. Alternativamente, a nucleobase ou nucleobases não complementar pode estar numa posição interna do composto. Quando duas ou mais nucleobases não complemen- tares estão presentes, elas podem ser contíguas (isto é, ligadas) ou não contíguas. Em uma modalidade, uma nucleobase não complementar está localizada no segmento de asa de um oligonucleotídeo de gapmer.
[00161] Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento que têm, ou têm até 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 ou não mais do que 1 nucleobase(s) não com- plementar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nu- cleico α-ENaC, ou porção especificada do mesmo.
[00162] Em certas modalidades, os compostos descritos no presente documento que têm, ou têm até 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais do que 6, não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2, ou não mais do que 1 nucleobase(s) não complemen- tar(es) em relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico de α-ENaC, ou porção especificada do mesmo.
[00163] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos também incluem aqueles que são complementares a uma porção (um número definido de nucleobases contíguas dentro de uma região ou segmento) de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 8 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 9 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 10 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 11 nucleo- bases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 12 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 13 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 14 nucleobases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 15 nucleo- bases de um segmento alvo. Em certas modalidades, os compostos são complementares a pelo menos uma porção de 16 nucleobases de um segmento alvo. Também são contemplados compostos que são comple- mentares a pelo menos uma porção de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleobases de um segmento alvo, ou uma faixa definida por quaisquer dois desses valores. Determinados Compostos
[00164] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos que consiste em nucleosídeos ligados. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos não modificados (RNA ou DNA) ou podem ser oligonucleotídeos modifica- dos. Os oligonucleotídeos modificados compreendem pelo menos uma mo- dificação em relação ao RNA ou DNA não modificado (isto é, compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado (compreendendo uma porção de açúcar modificado e/ou uma nucleobase modificada) e/ou pelo menos uma ligação internucleosídica modificada). I. Modificações A. Nucleosídeos Modificados
[00165] Os nucleosídeos modificados compreendem uma porção de açúcar modificado ou uma nucleobase modificada ou ambas uma porção de açúcar modificado e uma nucleobase modificada.
1. Porções de Açúcar Modificado
[00166] Em certas modalidades, as porções de açúcar são porções de açúcar modificado não bicíclico. Em certas modalidades, as porções de açúcar modificado são porções de açúcar bicíclico ou tricíclico. Em deter-
minadas modalidades, porções de açúcar modificado são substitutos do açúcar. Esses substitutos de açúcar podem compreender uma ou mais substituições correspondentes às de outros tipos de porções de açúcar mo- dificado.
[00167] Em certas modalidades, porções de açúcar modificado são por- ções de açúcar furanosila modificado não bicíclico compreendendo um ou mais substituintes acíclicos, incluindo, mas não se limitando a, substituintes nas posições 2', 4' e/ou 5'. Em certas modalidades, a porção de açúcar fu- ranosila é uma porção de açúcar ribosila. Em certas modalidades, um ou mais substituintes acíclicos de porções de açúcar modificado não bicíclico são ramificados. Exemplos de grupos substituintes 2' adequados para por- ções de açúcar modificado não bicíclico incluem, mas não estão limitados a:2’-F, 2'-OCH3 ("OMe" ou "O-metila"), e 2'-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). Em certas modalidades, grupos substituintes 2’ são selecionados de: halo, alil, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O-C1-C10 alcóxióxi, O-C1-C10 alcóxi subs- tituído, O-C1-C10alquila, O-C1-C10 alquila substituído, S-alquila, N(Rm)-alquila, O-alquenila, S-alquenila, N(Rm)-alquenila, O-alquinila, S-alquinila, N(Rm)-alquinila, O-alquilenil-O-alquila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila, O-aralquila, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn) ou OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H, um grupo protetor de amino ou substituído ou não substituído C1-C10 alquila e os grupos 2'-substituintes descritos em Cook et al., US 6,531,584; Cook et al., US 5.859.221; e Cook et al., US 6.005.087. Certas modalidades desses grupos substituintes 2' podem ser ainda substituídas por um ou mais grupos substituintes selecionados independentemente de: hidroxila, amino, alcóxióxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro (NO2), tiol, tioalcóxióxi, tioalquila, halogênio,alquila, arila, alquenila e alquinila. Exemplos de grupos substituintes 4' adequados para porções de açúcar modificadas não bicíclicas incluem, mas não estão limitados a, alcóxi (por exemplo, metóxi), alquila e aqueles descritos em Manoharan et al., WO 2015/106128. Exemplos de grupos substituintes 5' adequados para porções de açúcar modificado não bicíclico incluem, mas não estão limitados a:5'-metila (R ou S), 5'-vinila e 5'-metóxi. Em certas modalidades, açúcares modificados não bicíclicos compreendem mais de um substituinte de açúcar sem ponte, por exemplo, porções de açúcar 2'-F-5'-metila e porções de açúcar modificadas e nucleosídeos modificados descritos em Migawa et al., WO 2008/101157 e Rajeev et al., US2013/0203836.).
[00168] Em certas modalidades, um nucleosídeo 2’-substituído ou nu- cleosídeo 2’- não bicíclico modificado compreende uma porção de açúcar compreendendo um grupo substituinte 2' sem ponte selecionado de:F, NH2, N3, OCF3, OCH3, O(CH2)3NH2, CH2CH=CH2, OCH2CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, e acetamida N-substituída (OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn)), onde cada Rm e Rn é, independen- temente, H, um grupo protetor de amino ou C1-C10 alquila substituído ou não substituído.
[00169] Em certas modalidades, um nucleosídeo 2’-substituído ou nu- cleosídeo 2’- não bicílico modificado compreende uma porção de açúcar compreendendo um grupo substituinte 2' sem ponte selecionado de: F, OCF3, OCH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, e OCH2C(=O)-N(H)CH3 ("NMA").
[00170] Em certas modalidades, um nucleosídeo 2’-substituído ou nu- cleosídeo 2’- não bicílico modificado compreende uma porção de açúcar compreendendo um grupo substituinte 2' sem ponte selecionado de:F, OCH3, e OCH2CH2OCH3.
[00171] Os nucleosídeos compreendendo porções de açúcar modifica- das, tais como porções de açúcar modificado não bicíclico, podem ser refe- ridos pela(s) posição(ões) da(s) substituição(ões) na porção de açúcar do nucleosídeo. Por exemplo, nucleosídeos compreendendo porções de açúcar 2'-substituído ou 2-modificado são referidos como nucleosídeos 2'-substituídos ou nucleosídeos 2-modificados.
[00172] Certas porções de açúcar modificado compreendem um substi-
tuinte de açúcar de ponte que forma um segundo anel resultando em uma porção de açúcar bicíclico. Em algumas dessas modalidades, a porção de açúcar bicíclico compreende uma ponte entre os átomos do anel furanose 4' e 2'. Em certas modalidades, o anel furanose é um anel ribose. Exemplos desses substituintes de açúcar em ponte 4' a 2' incluem, entre ou- tros:4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2' ("LNA"), 4'-CH2-S-2', 4'-(CH2)2-O-2' ("ENA"), 4'-CH(CH3)-O-2' (referido "etila restrito" ou "cEt" quando na configuração S), 4’-CH2-O-CH2-2’, 4’-CH2-N(R)-2’, 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' ("MOE restrito" ou "cMOE") e análogos dos mesmos (ver, por exemplo, Seth et al., US 7.399.845, Bhat et al., US 7.569.686, Swayze et al., US 7.741.457, e Swayze et al., US 8.022.193), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' e análogos dos mesmos (ver, por exemplo,Seth et al., US 8.278.283), 4'-CH2-N(OCH3)-2' e análogos dos mesmos (ver, por exem- plo Prakash et al., US 8.278.425), 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver, por exemplo, Allerson et al., US 7.696.345 e Allerson et al., US 8.124.745), 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver, por exemplo, Zhou, et al., J. Org. Chem.,2009, 74, 118-134), 4'-CH2-C(=CH2)-2' e análogos dos mesmos (ver, por exemplo, Seth et al., US 8.278.426), 4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’, 4’-C(RaRb)-O-N(R)-2’, 4'-CH2-O-N(R)-2', e 4'-CH2-N(R)-O-2', em que cada R, Ra, e Rb é, indepen- dentemente, H, um grupo protetor, ou C1-C12 alquila (ver, por exemplo Ima- nishi et al., US 7.427.672).
[00173] Em certas modalidades, essas pontes 4' a 2' compreendem in- dependentemente de 1 a 4 grupos ligados independentemente selecionados de:-[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, e -N(Ra)-; em que: x é 0, 1 ou 2; n é 1, 2, 3 ou 4; cada Ra e Rb é, independentemente, H, um grupo protetor, hi- droxila, C1-C12alquila, C1-C12 alquila substituído, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituído, C2-C12 alquinila, C2-C12 alquinila substituído, C5-C20 arila, C5-C20 aril substituído, radical heterociclo, radical heterociclo substitu- ído, heteroarila, heteroaril substituído, C5-C7 radical alicíclico, C5-C7 radical alicíclico substituído, halogênio, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acila (C(=O)-H), acila substituído, CN, sulfonila (S(=O)2-J1), ou sulfoxila (S(=O)-J1); e cada J1 e J2 é, independentemente, H, C1-C12alquila, C1-C12 al- quila substituído, C2-C12 alquenila, C2-C12 alquenila substituído, C2-C12 al- quinila, C2-C12 alquinila substituído, C5-C20 arila, C5-C20 aril substituído, acila (C(=O)-H), acila substituído, um radical heterociclo, um radical heterociclo substituído, C1-C12 aminoalquila, C1-C12 aminoalquil substituído, ou um grupo protetor.
[00174] As porções de açúcar bicíclico adicionais são conhecidas na técnica, ver, por exemplo:Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740, Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 20017, 129, 8362-8379; Elayadi et al.,;Wengel et a., US
7.053.207; Imanishi et al., US 6.268.490; Imanishi et al. US 6.770.748; Ima- nishi et al., US RE44.779; Wengel et al., US 6.794.499; Wengel et al., US
6.670.461; Wengel et al., US 7.034.133; Wengel et al., US 8.080.644; Wengel et al., US 8.034.909; Wengel et al., US 8.153.365; Wengel et al., US
7.572.582; e Ramasamy et al., US 6.525.191; Torsten et al., WO 2004/106356; Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al., WO 2007/134181; Seth et al., US 7.547.684; Seth et al., US 7.666.854; Seth et al., US
8.088.746; Seth et al., US 7.750.131; Seth et al., US 8.030.467; Seth et al., US 8.268.980; Seth et al., US 8.546.556; Seth et al., US 8.530.640; Migawa et al., US 9.012.421; Seth et al., US 8.501.805; e Publicações de Patente US Allerson et al., US2008/0039618 e Migawa et al., US2015/0191727.
[00175] Em determinadas modalidades, as porções de açúcar bicíclico e os nucleosídeos que incorporam essas porções de açúcar bicíclico são de- finidas ainda pela configuração isomérica. Por exemplo, um nucleosídeo LNA (no presente documento descrito) pode estar na configuração α-L ou na configuração β-D.
LNA (configuração -D) -L-LNA (configuração -L) Ponte = 4’-CH2-O-2’ Ponte = 4’-CH2-O-2’ Os nucleosídeos bicíclicos α-L-metileno-óxi (4’-CH2-O-2’) ou α-L-LNA foram incorporados em oligonucleotídeos antissentido que mostraram atividade antissentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372). No presente documento, descrições gerais de nucleosídeos bicíclicos in- cluem ambas as configurações isoméricas. Quando as posições de nucleo- sídeos bicíclicos específicos (por exemplo, LNA) são identificadas nas mo- dalidades exemplificadas no presente documento, elas estão na configura- ção β-D, a menos que especificado de outra forma.
[00176] Em determinadas modalidades, as porções de açúcar modificado compreendem um ou mais substituintes de açúcar sem ponte e um ou mais substituinte de açúcar com ponte (por exemplo, açúcares com ponte subs- tituídos em 5' ou em 4'-2').
[00177] Em determinadas modalidades, porções de açúcar modificado são substitutos do açúcar. Em certas modalidades, o átomo de oxigênio da porção de açúcar é substituído, por exemplo, por um átomo de enxofre, carbono ou nitrogênio. Em certas modalidades, essas porções de açúcar modificado também compreendem substituintes em ponte e/ou não em ponte, como no presente documento descrito. Por exemplo, certos substi- tutos de açúcar compreendem um átomo de 4'-enxofre e uma substituição na posição 2' (ver, por exemplo, Bhat et al., US 7.875.733 e Bhat et al., US
7.939.677) e/ou a posição 5'.
[00178] Em determinadas modalidades, os substitutos de açúcar com- preendem anéis com mais de 5 átomos. Por exemplo, em certas modalida- des, um substituto de açúcar compreende um tetra-hidropirano de seis membros ("THP"). Esses tetra-hidropiranos podem ser adicionalmente mo- dificados ou substituídos. Os nucleosídeos compreendendo esses te- tra-hidropiranos modificados incluem, mas não estão limitados a, ácido nu- cleico hexitol ("HNA"), ácido nucleico anitol ("ANA"), ácido nucleico manitol ("MNA") (ver, por exemplo, Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. 2002, 10, 841-854), fluoro HNA: ("F-HNA", ver, por exemplo, Swayze et al., US 8. 088. 904; Swayze et al., US
8. 440. 803; Swayze et al., US 8. 796. 437; e Swayze et al., US 9. 005. 906; F-HNA também pode ser referido como um F-THP ou 3'-fluo- ro-tetra-hidropirano) e nucleosídeos compreendendo compostos THP modi- ficados adicionais com a fórmula: q1 q 2 T3 O q3
O q7 q4 q6 Bx O q5 R1 R2 T4 em que, independentemente, para cada um dos referidos nucleosídeos THP modificados: Bx é uma porção de nucleobase; T3 e T4 asão cada um, independentemente, um grupo de ligação internucleosídica que liga o nucleosídeo THP modificado ao restante de um oligonucleotídeo ou um de T3 e T4 é um grupo de ligação internucleosídica que liga o nucleosídeo THP modificado ao restante de um oligonucleotídeo e o outro de T3 e T4 é H, um grupo protetor de hidroxila, um grupo conjugado ligado ou um grupo terminal 5' ou 3'; q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um, independentemente, H, C1-C6alquila, C1-C6 alquila substituído, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquenila substituído, C2-C6 alquinila, ou C2-C6 alquinila substituído; e cada um de R1 e R2 é selecionado independentemente de: hi- drogênio, halogênio, alcóxi substituído ou não substituído, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 e CN, em que X é O, S ou NJ1 e J1, J2 e J3 são, independentemente, H ou alquila Ci-Ce.
[00179] Em certas modalidades, os nucleosídeos THP modificados são fornecidos em que q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 são cada um H. Em certas mo- dalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é diferente de H. Em certas modalidades, pelo menos um de q1, q2, q3, q4, q5, q6 e q7 é metila. Em certas modalidades, nucleosídeos THP modificados são fornecidos em que um de R1 e R2 é F. Em certas modalidades, R1 é F e R2 é H, em certas mo- dalidades, R1 é metóxi R2 é H, e em certas modalidades, R1 é metoxietoxi e R2 é H.
[00180] Em certas modalidades, os substitutos de açúcar compreendem anéis com mais de 5 átomos e mais de um heteroátomo. Por exemplo, foram relatados nucleosídeos compreendendo porções de açúcar morfolino e seu uso em oligonucleotídeos (ver, por exemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 e Summerton et al., US 5.698.685; Summerton et al., US 5.166.315; Summerton et al., US 5.185.444; e Summerton et al., US
5.034.506). Conforme usado neste documento, o termo "morfolino" se refere a um substituto de açúcar com a seguinte estrutura:
O O Bx
N . Em determinadas modalidades, os morfolinos podem ser modificados, por exemplo, pelo acréscimo ou alteração de vários grupos substituintes da es- trutura do morfolino acima. Esses substitutos do açúcar são mencionados neste documento como "morfolinos modificados"
[00181] Em certas modalidades, substitutos de açúcar compreendem frações acíclicas. Exemplos de nucleosídeos e oligonucleotídeos compre- endendo esses substitutos de açúcar acíclicos incluem, mas não estão li- mitados a: ácido nucleico peptídico ("PNA"), ácido nucleico butílico acíclico (ver, por exemplo, Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865) e nucleosídeos e oligonucleotídeos descritos em Manoharan et al., WO2011/133876.
[00182] Muitos outros sistemas bicíclicos e tricíclicos de açúcar e anéis substitutos de açúcar são conhecidos na técnica que podem ser usados em nucleosídeos modificados).
2. Nucleobases Modificadas
[00183] Em certas modalidades, nucleobases modificadas são selecio- nadas de:Pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas, pirimidinas substituí- das por alquila ou alquinila, purinas substituídas por alquila e purinas subs- tituídas por N-2, N-6 e O-6. Em certas modalidades, nucleobases modifica- das são selecionadas de:2-aminopropiladenina, 5-hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-N-metilguanina, 6-N-metiladenina, 2-propiladenina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitina, 5-propinil (-CC-CH3) uracila, 5-propinilcitosina, 6-azouracila, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-ribosiluracila (pseudouracilacila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila, 8-aza e outras purinas 8-substituídas, 5-halo, parti- cularmente 5-bromo, 5-trifluorometila, 5-halouracila e 5-halocitosina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2 -aminoadenina, 7-deaza- guanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina, 3-deaza-adenina, 6-N-benzoila- denina, 2-N-isobutirilguanina, 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracila, 5-metila 4-N- benzoilcitosina, 5-metila 4-N-benzoiluracila, bases universais, bases hidrofóbicas, bases promíscuas, bases de tamanho expandido e ba-
ses fluoradas. Outras nucleobases modificadas incluem pirimidinas tricícli- cas, como 1,3-diazafenoxazina-2-ona, 1,3-diazafenotiazina-2-ona e 9- (2-aminoetóxi) -1,3-diazafenoxazina-2-ona (pinça G)As nucleobases modi- ficadas também podem incluir aquelas em que a base purina ou pirimidina é substituída por outros heterocíclicos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Outras nucleobases in- cluem as divulgadas em Merigan et al., US 3.687.808, as divulgadas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; e os divulgados nos Capítulos 6 e 15, Antisense Drug Technology, Crooke S. T., Ed., CRC Press, 2008, 163-166 e 442-443.
[00184] As publicações que ensinam a preparação de algumas das nu- cleobases modificadas mencionadas acima, bem como outras nucleobases modificadas, incluem, sem limitação, Manohara et al., US2003/0158403; Manoharan et al., US2003/0175906 ;; Dinh et al., US 4.845.205; Spielvogel et al., US 5.130.302; Rogers et al., US 5.134.066; Bischofberger et al., US
5.175.273; Urdea et al., US 5.367.066; Benner et al., US 5.432.272; Mat- teucci et al., US 5.434.257; Gmeiner et al., US 5.457.187; ; Cook et al., US
5.459.255; Froehler et al., US 5.484.908; Matteucci et al., US 5.502.177; Hawkins et al., US 5.525.711; Haralambidis et al., US 5.552.540; Cook et al., US 5.587.469; Froehler et al., US 5.594.121; Switzer et al., US 5.596.091; Cook et al., US 5.614.617; Froehler et al., US 5.645.985; Cook et al., US
5.681.941; Cook et al., US 5.811.534; Cook et al., US 5.750.692; Cook et al., US 5.948.903; Cook et al., US 5.587.470; Cook et al., US 5.457.191; Mat- teucci et al., US 5.763.588; Froehler et al., US 5.830.653; Cook et al., US
5.808.027; Cook et al., 6.166.199; e Matteucci et al., US 6.005.096.
[00185] Em certas modalidades, os compostos compreendem ou con- sistem em um oligonucleotídeo modificado complementar a um ácido nu-
cleico α-ENaC compreendendo uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma 5-metilcitosina. B. Ligações Internucleosídicas Modificadas
[00186] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos com uma ou mais ligações internucleosídicas modificados são selecionados em relação aos compostos que possuem apenas ligações in- ternucleosídicas fosfodiéster devido a propriedades desejáveis, como, por exemplo, captação celular aprimorada, afinidade aprimorada por ácidos nu- cleicos alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.
[00187] Em certas modalidades, os compostos compreendem ou con- sistem em um oligonucleotídeo modificado complementar a um ácido nu- cleico a-ENaC compreendendo uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em certas modalidades, as ligações internucleosídicas modi- ficadas são ligações de fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação de internucleosídica de um composto antissentido é uma ligação internu- cleosídica de fosforotioato.
[00188] Em certas modalidades, nucleosídeos de oligonucleotídeos mo- dificados podem ser ligados entre si usando qualquer ligação internucleosí- dica. As duas classes principais dos grupos de ligação internucleosídica são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. As ligações internucleosídicas representativas contendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, fosfatos, que contêm uma ligação fosfodiéster ("P=O") (também conhecida como ligações não modificadas ou de ocorrência natural), fosfo- triésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos e fosforotioatos ("P=S") e fosfo- roditioatos ("HS-P=S"). Grupos de ligação internucleosídica que não contêm fósforo representativos incluem, mas não estão limitados a, metilenometili- mino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster, tionocarbamato (-O-C(=O)(NH)-S-); siloxano (-O-SiH2-O-); e N,N'-dimetil-hidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Li- gações internucleosídicas modificadas, em comparação com ligações fos-
fato de ocorrência natural, podem ser usadas para alterar, tipicamente au- mentar a resistência à nuclease do oligonucleotídeo. Os métodos de pre- paração das ligações internucleosídicas contendo fósforo e não fósforo são bem conhecidas pelos versados na técnica.
[00189] As ligações internucleosídicas representativas com um centro quiral incluem, mas não estão limitadas a,alquilfosfonatos e fosforotioatos. Os oligonucleotídeos modificados compreendendo ligações internucleotídi- cas com um centro quiral podem ser preparados como populações de oli- gonucleotídeos modificados compreendendo ligações estereoquímicas ale- atórias ou como populações de oligonucleotídeos modificados compreen- dendo ligações fosforotioato em configurações estereoquímicas particulares. Em certas modalidades, as populações de oligonucleotídeos modificados compreendem ligações internucleosídicas de fosforotioato em que todas as ligações internucleosídicas de fosforotioato são estéreo-aleatórias. Tais oligonucleotídeos modificados podem ser gerados usando métodos sintéti- cos que resultam na seleção aleatória da configuração estereoquímica de cada ligação de fosforotioato. No entanto, como é bem entendido pelos versados na técnica, cada fosforotioato individual de cada molécula de oli- gonucleotídeo individual tem uma estereoconfiguração definida. Em certas modalidades, as populações de oligonucleotídeos modificados são enrique- cidas para oligonucleotídeos modificados compreendendo uma ou mais li- gações internucleosídicas particulares de fosforotioato em uma configuração estereoquímica específica, independentemente. Em certas modalidades, a configuração particular da ligação fosforotioato específica está presente em pelo menos 65% das moléculas na população. Em certas modalidades, a configuração particular da ligação fosforotioato específica está presente em pelo menos 70% das moléculas na população. Em certas modalidades, a configuração particular da ligação fosforotioato específica está presente em pelo menos 80% das moléculas na população. Em certas modalidades, a configuração particular da ligação fosforotioato específica está presente em pelo menos 90% das moléculas na população. Em certas modalidades, a configuração particular da ligação fosforotioato específica está presente em pelo menos 99% das moléculas na população. Tais populações quiralmente enriquecidas de oligonucleotídeos modificados podem ser geradas usando métodos sintéticos conhecidos na técnica, por exemplo, métodos descritos em Oka et al., JACS 125, 8307 (2003), Wan et al. Nuc. Acid. Res. 42, 13456 (2014) e WO 2017/015555. Em certas modalidades, uma população de oli- gonucleotídeos modificados é enriquecida para oligonucleotídeos modifi- cados com pelo menos um fosforotioato indicado na configuração (Sp). Em certas modalidades, uma população de oligonucleotídeos modificados é enriquecida para oligonucleotídeos modificados com pelo menos um fosfo- rotioato na configuração (Rp). Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendendo fosforotioatos (Rp) e/ou (Sp) compreendem uma ou mais das seguintes fórmulas, respectivamente, em que "B" indica uma nucleobase: A menos que indicado de outro modo, as ligações internucleosídicas quirais de oligonucleotídeos modificados no presente documento descritos podem ser estéreo-aleatórias ou em uma configuração estereoquímica específica.
[00190] As ligações internucleosídicas neutras incluem, sem limitação, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amido-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amido-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), metoxipropila e tioformacetal (3'-S-CH2-O-5'). Outras liga- ções internucleosídicas neutras incluem ligações não iônicas, compreen-
dendo siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamidas, sulfeto, éster sulfonato e amidas (ver, por exemplo:Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi and P. D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65). Outras ligações internucleosídicas neutras incluem ligações não iônicas, compreendendo partes do compo- nente N, O, S e CH2 misturadas. II. Certos Motivos
[00191] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos. Os oligonucle- otídeos podem ter um motivo, por exemplo, um padrão de porções de açúcar não modificado e/ou modificado, nucleobases e/ou ligações internucleosí- dicas. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compre- endem um ou mais nucleosídeos modificados compreendendo um açúcar modificado. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem um ou mais nucleosídeos modificados compreendendo uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modi- ficados compreendem uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas. Em tais modalidades, as porções de açúcar modificado, não modificado e diferentemente modificado, nucleobases e/ou ligações internucleosídicas de um oligonucleotídeo modificado definem um padrão ou motivo. Em certas modalidades, os padrões ou motivos de porções de açúcar, nucleobases e ligações internucleosídicas são cada um independente um do outro. Assim, um oligonucleotídeo modificado pode ser descrito por seu motivo de açúcar, motivo de nucleobase e/ou motivo de ligação internucleosídica (como no presente documento usado, motivo de nucleobase descreve as modificações nas nucleobases independentemente da sequência de nucleobases). A. Certos Motivos de Açúcar
[00192] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem um ou mais tipos de açúcar modificado e/ou porção de açúcar não modificado dispostos ao longo do oligonucleotídeo ou região do mesmo em um padrão definido ou motivo de açúcar. Em certos casos, esses motivos de açúcar incluem mas não estão limitados a nenhuma das modificações de açúcar discutidas no presente documento.
[00193] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados com- preendem ou consistem em uma região com um motivo gapmer, que com- preende dois segmentos externos ou "asas" e um segmento central ou in- terno ou "lacuna". Os três segmentos de um motivo gapmer (a asa 5', a la- cuna e a asa 3') formam uma sequência contígua de nucleosídeos em que pelo menos algumas das porções de açúcar dos nucleosídeos de cada uma das asas diferem de pelo menos algumas das porções de açúcar dos nu- cleosídeos da lacuna. Especificamente, pelo menos as porções de açúcar dos nucleosídeos de cada asa que são imediatamente adjacentes ao espaço (o nucleosídeo da asa 3'-terminal da asa 5' e o nucleosídeo da asa 5'-terminal da asa 3') diferem da porção de açúcar dos nucleosídeo de lacuna adjacentes. Em determinadas modalidades, as porções de açúcar dentro da lacuna são as mesmas. Em determinadas modalidades, a lacuna inclui um ou mais nucleosídeos com uma porção de açúcar que difere da porção de açúcar de um ou mais nucleosídeos da lacuna. Em determinadas modali- dades, os motivos de açúcar das duas asas são os mesmos da outra (ga- pmer simétrico). Em determinadas modalidades, os motivos de açúcar de 5'-asa difere do motivo de açúcar de 3'-asa (gapmer assimétrico).
[00194] Em certas modalidades, as asas de um gapmer compreendem 1-5 nucleosídeos. Em certas modalidades, as asas de um gapmer compre- endem 2-5 nucleosídeos. Em certas modalidades, as asas de um gapmer compreendem 3-5 nucleosídeos. Em certas modalidades, os nucleosídeos das asas de um gapmer são todos nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, as porções de açúcar das asas de um gapmer são todas porções de açúcar modificado.
[00195] Em certas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 7-12 nucleosídeos. Em certas modalidades, a lacuna de um gapmer com- preende 7-10 nucleosídeos. Em certas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 8-10 nucleosídeos. Em certas modalidades, a lacuna de um gapmer compreende 10 nucleosídeos. Em determinadas modalidades, cada nucleosídeo da lacuna de um gapmer é um 2’-desoxinucleosídeo.
[00196] Em certas modalidades, o gapmer é um desóxi gapmer. Em tais modalidades, os nucleosídeos no lado da lacuna de cada junção de asa/ lacuna são 2'-desoxinucleosídeos e os nucleosídeos da asa terminal imedi- atamente adjacentes à lacuna compreendem porções de açúcar modificado. Em determinadas tais modalidades, cada nucleosídeo da lacuna é um 2’-desoxinucleosídeo. Em certas modalidades, cada nucleosídeo de cada asa compreende uma porção de açúcar modificado.
[00197] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo modificado tem um motivo de açúcar totalmente modificado, em que cada nucleosídeo do oli- gonucleotídeo modificado compreende uma porção de açúcar modificado. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem ou consistem em uma região com um motivo de açúcar totalmente modificado, em que cada nucleosídeo da região compreende uma porção de açúcar modificado. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem ou consistem em uma região com um motivo de açúcar to- talmente modificado, em que cada nucleosídeo dentro da região totalmente modificada compreende a mesma porção de açúcar modificada, no presente documento referida como um motivo de açúcar uniformemente modificado. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo totalmente modificado é um oligonucleotídeo uniformemente modificado. Em certas modalidades, cada nucleosídeo de um oligonucleotídeo uniformemente modificado compreende a mesma modificação 2'.
[00198] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo modificado pode compreender um motivo de açúcar descrito em Swayze et al.,
US2010/0197762; Freier et al., US2014/0107330; Freier et al., US2015/0184153; e Seth et al., US2015/0267195. B. Certos Motivos de Nucleobase
[00199] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem nucleobases modificadas e/ou não modificadas dispostas ao longo do oligonucleotídeo ou região do mesmo em um padrão ou motivo definido. Em certas modalidades, cada nucleobase é modificada. Em determinadas modalidades, nenhuma das nucleobases são modificadas. Em certas modalidades, cada purina ou cada pirimidina é modificada. Em certas modalidades, cada adenina é modificada. Em certas modalidades, cada guanina é modificada. Em certas modalidades, cada timina é modificada. Em certas modalidades, cada uracila é modificado. Em certas modalidades, cada citosina é modificada. Em certas modalidades, algumas ou todas as nucleobases da citosina em um oligonucleotídeo mo- dificado são 5-metilcitosinas.
[00200] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos modificados compreendem um bloco de nucleobases modificadas. Nestas determinadas modalidades, o bloco está na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em de- terminadas modalidades o bloco está dentro de 3 nucleosídeos da extre- midade 3’ do oligonucleotídeo. Em certas modalidades, o bloco está na ex- tremidade 5' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades o bloco está dentro de 3 nucleosídeos da extremidade 5’ do oligonucleotídeo.
[00201] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos com um motivo gapmer compreendem um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada está no espaço de um oligonucleotídeo com um mo- tivo gapmer. Em certas modalidades, a porção de açúcar do referido nu- cleosídeo é uma porção 2'-desoxirribosila. Em certas modalidades, a nu- cleobase modificada é selecionada de: uma 2-tiopirimidina e uma
5-propinopirimidina. C. Certos Motivos de Ligação Internucleosídica
[00202] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem ligações internucleosídi- cas modificadas e/ou não modificadas dispostas ao longo do oligonucleotí- deo ou região do mesmo em um padrão ou motivo definido. Em certas mo- dalidades, cada grupo de ligação internucleosídica é uma ligação internu- cleosídica fosfodiéster (P=O). Em certas modalidades, cada grupo de ligação internucleosídica de um oligonucleotídeo modificado é uma ligação internu- cleosídica fosforotioato (P=S). Em certas modalidades, cada ligação inter- nucleosídica de um oligonucleotídeo modificado é selecionada indepen- dentemente de uma ligação internucleosídica fosforotioato e ligação inter- nucleosídica fosfodiéster. Em certas modalidades, cada ligação internu- cleosídica de fosforotioato é selecionada independentemente de um fosfo- rotioato estereoquímico, um fosforotioato (Sp) e um fosforotioato (Rp). Em certas modalidades, o motivo de açúcar de um oligonucleotídeo modificado é um gapmer e as ligações internucleosídicas dentro da lacuna são todas modificadas. Em certas modalidades, algumas ou todas as ligações inter- nucleosídicas nas asas são ligações de fosfato não modificadas. Em certas modalidades, as ligações internucleosídicas terminais são modificadas. Em certas modalidades, o motivo de açúcar de um oligonucleotídeo modificado é um gapmer, e o motivo de ligação internucleosídica compreende pelo menos uma ligação internucleosídica osfodiéster em pelo menos uma asa, em que a pelo menos uma ligação fosfodiéster não é uma ligação terminal internu- cleosídica e as ligações internucleosídicas restantes são ligações internu- cleosídicas fosforotioato. Em certas modalidades, todas as ligações de fos- forotioato são estéreo-aleatórias. Em certas modalidades, todas as ligações de fosforotioato nas asas são fosforotioatos (Sp) e a lacuna compreende pelo menos um motivo Sp, Sp, Rp. Em certas modalidades, as populações de oligonucleotídeos modificados são enriquecidas para oligonucleotídeos mo- dificados compreendendo esses motivos de ligação internucleosídicas.
[00203] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compre- endem uma região com um motivo de ligação internucleosídica alternado. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma região de ligações internucleosídicas uniformemente modificadas. Em certas tais modalidades, as ligações internucleosídicas são ligações internucleosí- dicas fosforotioato. Em certas modalidades, todas as ligações internucleo- sídicas do oligonucleotídeo são ligações internucleosídicas fosforotioato. Em determinadas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleo- tídeo é selecionada de fosfodiéster ou fosfato e fosforotioato. Em determi- nadas modalidades, cada ligação internucleosídica do oligonucleotídeo é selecionada de fosfodiéster ou e fosforotioato e pelo menos uma ligação internucleosídica é fosforotioato.
[00204] Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 6 ligações internucleosídicas fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 8 ligações inter- nucleosídicas fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleo- tídeo compreende pelo menos 10 ligações internucleosídicas fosforotioato. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 6 ligações internucleosídicas fosforotioato con- secutivas. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 8 ligações internucleosídicas fosforo- tioato consecutivas. Em determinadas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos um bloco de, pelo menos, 10 ligações internucleo- sídicas fosforotioato consecutivas. Em determinadas modalidades, o oligo- nucleotídeo compreende pelo menos bloco de, pelo menos 12 ligações in- ternucleosídicas fosforotioato consecutivas. Nestas determinadas modali- dades, pelo menos um destes blocos está localizado na extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em determinadas modalidades, pelo menos um destes blocos está localizado em 3 nucleosídeos da extremidade 3' do oligonucleo- tídeo.
[00205] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem uma ou mais ligações de metilfosponato. Em certas modalidades, os oligonucle- otídeos que têm um motivo de nucleosídeo gapmer compreendem um motivo de ligação compreendendo todas as ligações de fosforotioato, exceto por uma ou duas ligações de metilfosponato. Em certas modalidades, uma li- gação de metilfosponato está na lacuna de um oligonucleotídeo que tem um motivo de açúcar mais espesso.
[00206] Em certas modalidades, é desejável organizar o número de li- gações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosfodiéster para manter a resistência à nuclease. Em certas modalidades, é desejável organizar o número e a posição das ligações internucleosídicas de fosforotioato e o número e a posição das ligações internucleosídicas de fosfodiéster para manter a resistência à nuclease. Em certas modalidades, o número de ligações internucleosídicas de fosforotioato pode ser diminuído e o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster pode ser aumen- tado. Em certas modalidades, o número de ligações internucleosídicas de fosforotioato pode ser diminuído e o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster pode ser aumentado, mantendo a resistência à nuclease. Em certas modalidades, é desejável diminuir o número de ligações internucleo- sídicas de fosforotioato, mantendo a resistência à nuclease. Em certas modalidades, é desejável aumentar o número de ligações internucleosídicas de fosfodiéster, mantendo a resistência à nuclease. III. Certos Oligonucleotídeos Modificados
[00207] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em oligonucleotídeos modificados. Em certas modalidades, as modificações acima (açúcar, nucleobase, ligação internucleosídica) são incorporadas em um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos modificados são caracterizados por suas modificações, motivos e comprimentos gerais.
Em determinadas modalidades, estes parâmetros são independentes um do outro.
Assim, salvo indicação em contrário, cada ligação internucleosídica de um oligonu- cleotídeo com um motivo de açúcar gapmer pode ser modificada ou não modificada e pode ou não seguir o padrão de modificação gapmer das mo- dificações de açúcar.
Da mesma forma, esses oligonucleotídeos de gapmer podem compreender uma ou mais nucleobases modificadas independentes do padrão gapmer das modificações de açúcar.
Além disso, em certos casos, um oligonucleotídeo é descrito por um comprimento ou faixa geral e por comprimentos ou faixas de comprimento de duas ou mais regiões (por exemplo, uma região de nucleosídeos que possui modificações de açúcar especificadas); em tais circunstâncias, pode ser possível selecionar números para cada intervalo que resulta em um oligonucleotídeo com um compri- mento total que fica fora da faixa especificada.
Em tais circunstâncias, ambos os elementos devem ser satisfeitos.
Por exemplo, em certas modalidades, um oligonucleotídeo modificado consiste em 15-20 nucleosídeos ligados e tem um motivo de açúcar que consiste em três regiões ou segmentos, A, B e C, em que a região ou segmento A consiste em 2-6 nucleosídeos ligados que têm um motivo, região ou segmento de açúcar especificado B consiste em 6 a 10 nucleosídeos ligados com um motivo de açúcar especificado e região ou segmento C consiste em 2 a 6 nucleosídeos ligados com um motivo de açúcar especificado.
Tais modalidades não incluem oligonucleotídeos modi- ficados em que A e C consistem em 6 nucleosídeos ligados e B consiste em 10 nucleosídeos ligados (mesmo que esse número de nucleosídeos seja permitido dentro dos requisitos de A, B e C) porque o comprimento total de tais oligonucleotídeos é 22, que excede o limite superior de 20 para o com- primento total do oligonucleotídeo modificado.
Salvo indicação em contrário, todas as modificações são independentes da sequência de nucleobases, exceto que a nucleobase modificada 5-metilcitosina é necessariamente um "C" em uma sequência de oligonucleotídeos.
[00208] Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos consistem em nucleosídeos ligados de X a Y, onde X representa o menor número de nucleosídeos na faixa e Y representa o maior número de nucleosídeos na faixa. Em certas dessas modalidades, X e Y são cada um independente- mente selecionados de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50; desde que X≤Y. Por exemplo, em certas moda- lidades, os oligonucleotídeos consistem em 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26, 13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 a 25, 14 a 26, 14 a 27, 14 a 28, 14 a 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19, 16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23, 16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17 a 22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 a 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, 18 a 20, 18 a 21, 18 a 22, 18 a 23, 18 a 24, 18 a 25, 18 a 26, 18 a 27, 18 a 28, 18 a 29, 18 a 30, 19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21, 20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 a 23, 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 23 a 29, 23 a 30, 24 a 25, 24 a 26, 24 a 27, 24 a 28, 24 a 29, 24 a 30, 25 a 26, 25 a 27, 25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, 27 a 28, 27 a 29, 27 a 30, 28 a 29, 28 a 30 ou 29 a 30 nucleosídeos ligados.
[00209] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos têm uma sequência de nucleobases que é complementar a um segundo oligonucleotídeo ou a um ácido nucleico de referência identificado, como um ácido nucleico alvo.
Em certas modalidades, uma região de um oligonucleotídeo possui uma sequência de nucleobases que é complementar a um segundo oligonucleo- tídeo ou a um ácido nucleico de referência identificado, como um ácido nu- cleico alvo. Em certas modalidades, a sequência de nucleobases de uma região ou comprimento inteiro de um oligonucleotídeo é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% complementar ao segundo oligonucleotídeo ou ácido nucleico, como um ácido nucleico alvo. IV. Certos Compostos Conjugados
[00210] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem ou consistem em um oligonucleotídeo (modificado ou não modificado) e, opcionalmente, um ou mais grupos conjugados e/ou grupos terminais. Grupos conjugados consistem em uma ou mais frações conjugadas e um ligante conjugado que liga a fração conjugada ao oligonu- cleotídeo. Grupos conjugados podem ser ligados a uma ou ambas as ex- tremidades de um oligonucleotídeo e/ou em qualquer posição interna. Em certas modalidades, grupos conjugados são ligados à posição 2' de um nu- cleosídeo de um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, grupos conjugados que estão ligados a uma ou ambas as extremidades de um oligonucleotídeo são grupos terminais. Em certas modalidades, grupos conjugados ou grupos terminais são ligados na extremidade 3' e/ou 5' dos oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os grupos conjugados (ou grupos terminais) são ligados na extremidade 3' dos oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os grupos conjugados são ligados perto da extremidade 3' dos oligonucleotídeos. Em certas modalidades, grupos conjugados (ou grupos terminais) são ligados na extremidade 5' dos oligonucleotídeos. Em certas modalidades, os grupos conjugados são ligados perto da extremidade 5' dos oligonucleotídeos.
[00211] Exemplos de grupos terminais incluem, mas não estão limitados a, grupos conjugados, grupos de capeamento, frações fosfato, grupos de proteção, nucleosídeos modificados ou não modificados e dois ou mais nu- cleosídeos que são modificados ou não modificados independentemente. A. Certos Grupos Conjugados
[00212] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos são covalente- mente ligados a um ou mais grupos conjugados. Em certas modalidades, os grupos conjugados modificam uma ou mais propriedades do oligonucleotí- deo anexado, incluindo, entre outros, farmacodinâmica, farmacocinética, estabilidade, ligação, absorção, distribuição de tecido, distribuição celular, captação celular, carga e liberaçãoEm certas modalidades, os grupos con- jugados conferem uma nova propriedade ao oligonucleotídeo ligado, por exemplo, fluoróforos ou grupos repórteres que permitem a detecção do oli- gonucleotídeo.
[00213] Certos grupos conjugados e frações conjugadas foram descritos anteriormente, por exemplo: porção de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), cholic acid (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), a thioether, por exmeplo, he- xil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1993, 3, 2765-2770), um tioco- lesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecil (Sai- son-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietil-amônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma cadeia de poliamina ou polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ou adamantano acético, uma fração palmitila (Mishra et al. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), uma fração octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, i, 923-937), um grupo de tocoferol
(Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; doi: 10. 1038/mtna. 2014. 72 e Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740) ou um agrupamento GalNAc (por exemplo, WO2014/179620).
1. Frações Conjugadas
[00214] As frações conjugadas incluem, sem limitação, intercaladores, moléculas repórteres, poliaminas, poliamidas, peptídeos, carboidratos (por exemplo, GalNAc), frações vitamínicas, polietileno glicóis, tioéteres, polié- teres, colesteróis, tiocolesteróis, porções de ácido cólico, folato, lipídeos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, fenantridina, antrno presente documento- nona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas, fluoró- foros e corantes.
[00215] Em certas modalidades, um fração conjugada compreende uma substância de droga ativa, por exemplo, aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, car- profeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico, fingolimod, ácido flu- fenâmico, ácido folínico, benzotiadiazida, clorotiazida, diazepina, indometi- cina, barbiturato, cefalosporina, uma droga sulfa, um antidiabético, um agente antibacteriano ou um antibiótico.
2. Ligantes conjugados
[00216] As frações conjugadas são ligadas a oligonucleotídeos através de ligantes conjugados. Em certos compostos, um grupo conjugado é uma li- gação química única (isto é, a fração conjugada é ligada a um oligonucleo- tídeo através de um ligante conjugado através de uma ligação única). Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende uma estrutura de ca- deia, como uma cadeia hidrocarbil, ou um oligômero de unidades de repe- tição, como etileno glicol, nucleosídeos ou unidades de aminoácidos.
[00217] Em certas modalidades, um ligante conjugado compreende um ou mais grupos selecionados dealquila, amino, oxo, amida, dissulfeto, polie- tileno glicol, éter, tioéter e hidroxilamino. Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende grupos selecionados a de gruposalquila, amino, oxo,
amida e éter. Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende grupos selecionados de grupos alquila e amida. Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende grupos selecionados de grupos alquila e éter. Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende pelo menos uma porção de fósforo. Em certas modalidades, o ligante conjugado compreende pelo menos um grupo fosfato. Em certas modalidades, o ligante conjugado inclui pelo menos um grupo de ligação neutra.
[00218] Em certas modalidades, os ligantes conjugados, incluindo os ligantes conjugados descritos acima, são porções de ligação bifuncional, por exemplo, aquelas conhecidas na técnica por serem úteis para ligar grupos conjugados a compostos parentais, como os oligonucleotídeos no presente documento fornecidos. Em geral, uma porção de ligação bifuncional com- preende pelo menos dois grupos funcionais. Um dos grupos funcionais é selecionado para se ligar a um sítio específico em um composto e o outro é selecionado para se ligar a um grupo conjugado. Exemplos de grupos fun- cionais usados em uma porção de ligação bifuncional incluem, mas não estão limitados a, eletrófilos para reagir com grupos nucleofílicos e nucleó- filos para reagir com grupos eletrofílicos. Em certas modalidades, as porções de ligação bifuncional compreendem um ou mais grupos selecionados de amino, hidroxila, ácido carboxílico, tiol,alquila, alquenila e alquinila.
[00219] Exemplos de ligantes conjugados incluem, entre outros, pirroli- dina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), succinimidil 4-(N-maleimi- dometila) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) e ácido 6-amino-hexanoico (AHEX ou AHA). Outros ligantes conjugados incluem, mas não estão limi- tados a C1-C10 alquila substituído ou não substituído, C2-C10 alquenila subs- tituído ou não substituído ou C2-C10 alquinila substituído ou não substituído, em que uma lista não limitativa de grupos substituintes preferidos inclui hi- droxila, amino, alcóxióxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxióxi, ha- logênio,alquila, arila, alquenila e alquinila.
[00220] Em certas modalidades, os ligantes conjugados compreendem
1-10 ligantes-nucleosídeos. Em certas modalidades, esses ligantes-nu- cleosídeos são nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, tais li- gantes-nucleosídeos compreendem uma porção de açúcar modificada. Em certas modalidades, os ligantes-nucleosídeos não são modificados. Em certas modalidades, os ligantes-nucleosídeos compreendem uma base he- terocíclica opcionalmente protegida selecionada de uma purina, purina substituída, pirimidina ou pirimidina substituída. Em determinadas modali- dades, uma fração clivável é um nucleosídeo selecionado de uracila, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina e 2-N-isobutirilguanina. É tipicamente desejável que os ligantes-nucleosídeos sejam clivados do composto depois de atingir um tecido alvo. Por conseguinte, os ligantes-nucleosídeos estão tipicamente ligados um ao outro e ao restante do composto através de li- gações cliváveis. Em certas modalidades, essas ligações cliváveis são li- gações fosfodiéster.
[00221] No presente documento, os ligantes-nucleosídeos não são con- siderados parte do oligonucleotídeo. Por conseguinte, em modalidades nas quais um composto compreende um oligonucleotídeo que consiste em um número ou faixa especificado de nucleosídeos ligados e/ou uma porcenta- gem complementar especificada com um ácido nucleico de referência e o composto também compreende um grupo conjugado compreendendo um ligante conjugado compreendendo ligantes-nucleosídeos, esses ligan- tes-nucleosídeos não são contados em relação ao comprimento do oligonu- cleotídeo e não são usados na determinação da complementaridade per- centual do oligonucleotídeo para o ácido nucleico de referência. Por exem- plo, um composto pode compreender (1) um oligonucleotídeo modificado que consiste em 8 a 30 nucleosídeos e (2) um grupo conjugado compreen- dendo 1-10 nucleotídeos de ligação que são contíguos aos nucleosídeos do oligonucleotídeo modificado. O número total de nucleosídeos ligados con- tíguos em tal composto é superior a 30. Alternativamente, um composto pode compreender um oligonucleotídeo modificado que consiste em 8 a 30 nu- cleosídeos e nenhum grupo conjugado. O número total de nucleosídeos ligados contíguos em tal composto não é superior a 30. A menos que os ligantes conjugados indicados de outro modo compreendam não mais do que 10 ligantes-nucleosídeos. Em certas modalidades, os ligantes conju- gados compreendem não mais que 5 ligantes-nucleosídeos. Em certas modalidades, os ligantes conjugados compreendem não mais que 3 ligan- tes-nucleosídeos. Em certas modalidades, os ligantes conjugados compre- endem não mais que 2 ligantes-nucleosídeos. Em certas modalidades, os ligantes conjugados compreendem não mais que 1 ligante-nucleosídeo.
[00222] Em certas modalidades, é desejável que um grupo conjugado seja clivado do oligonucleotídeo. Por exemplo, em certas circunstâncias, os compostos que compreendem uma porção de conjugado particular são melhor absorvidos por um tipo de célula específico, mas uma vez que o composto foi absorvido, é desejável que o grupo conjugado seja clivado para liberar o oligonucleotídeo não conjugado ou parental. Assim, certo conjugado pode compreender uma ou mais frações cliváveis, tipicamente dentro do ligante conjugado. Em determinadas modalidades, uma fração clivável é uma ligação clivável. Em certas modalidades, uma fração clivável é um grupo de átomos compreendendo pelo menos uma ligação clivável. Em determi- nadas modalidades, uma fração clivável compreende um grupo de átomos com um, dois, três, quatro ou mais de quatro ligações cliváveis. Em certas modalidades, uma fração clivável é clivada seletivamente dentro de uma célula ou compartimento subcelular, como um lisossomo. Em determinadas modalidades, uma fração clicável é seletivamente clivada por enzimas en- dógenas, como as nucleases.
[00223] Em determinadas modalidades, uma ligação clivável é selecio- nada de: uma amida, um éster, um éter, um ou ambos os ésteres de um fosfodiéster, um éster de fosfato, um carbamato ou um dissulfeto. Em certas modalidades, uma ligação clivável é um ou ambos os ésteres de um fosfo-
diéster. Em determinadas modalidades, uma fração compreende um fosfato ou fosfodiéster. Em certas modalidades, a fração clivável é uma ligação fosfato entre um oligonucleotídeo e uma fração conjugada ou grupo conju- gado.
[00224] Em certas modalidades, uma fração clivável compreende ou consiste em um ou mais nucleotídeos de ligação. Em certas modalidades, um ou mais ligantes-nucleosídeos estão ligados um ao outro e/ou ao restante do composto através de ligações cliváveis. Em certas modalidades, essas ligações cliváveis não modificadas são ligações fosfodiéster. Em certas modalidades, uma fração clivável é o nucleosídeo 2'-desóxi que está ligado ao nucleosídeo 3' ou 5'-terminal de um oligonucleotídeo por uma ligação internucleosídica de fosfato e covalentemente ligado ao restante do ligante conjugado ou fração conjugada por um ligação de fosfato ou fosforotioato. Em certas modalidades, a fração clivável é 2'-desoxiadenosina.
3. Certas Frações Conjugadas de Direcionamento Celular
[00225] Em certas modalidades, um grupo conjugado compreende uma fração conjugada de direcionamento celular. Em certas modalidades, um grupo conjugado tem a fórmula geral: Ligando - Amarração Grupo de ramificação Fração Clivável Ligante Conjugado Fração de Alvo de Célula em que n é de 1 a cerca de 3, m é 0 quando n é 1, m é 1 quando n é 2 ou maior, j é 1 ou 0 e k é 1 ou 0.
[00226] Em certas modalidades, n é 1, j é 1 e k é 0. Em certas modali- dades, n é 1, j é 0 e k é 1. Em certas modalidades, n é 1, j é 1 e k é 1. Em certas modalidades, n é 2, j é 1 e k é 0. Em certas modalidades, n é 2, j é 0 e k é 1. Em certas modalidades, n é 2, j é 1 e k é 1. Em certas modalidades, n é 3, j é 1 e k é 0. Em certas modalidades, n é 3, j é 0 e k é 1. Em certas mo- dalidades, n é 3, j é 1 e k é 1.
[00227] Em certas modalidades, os grupos conjugados compreendem porções de direcionamento celular que possuem pelo menos um ligante amarrado. Em certas modalidades, as porções de direcionamento celular compreendem dois ligandos amarrados covalentemente ligados a um grupo de ramificação. Em certas modalidades, porções de direcionamento celular compreendem três ligandos amarrados covalentemente ligados a um grupo de ramificação.
[00228] Em certas modalidades, a fração alvo da célula compreende um grupo de ramificação compreendendo um ou mais grupos selecionados de gruposalquila, amino, oxo, amida, dissulfeto, polietileno glicol, éter, tioéter e hidroxilamino. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação com- preende um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados dealquila, amino, oxo, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, grupos tioéter e hidroxilaamina. Em certas modalidades, o grupo alifático ramificado com- preende grupos selecionados de gruposalquila, amino, oxo, amida e éter. Em certas modalidades, o grupo alifático ramificado compreende grupos sele- cionados de gruposalquila, amino e éter. Em certas modalidades, o grupo alifático ramificado compreende grupos selecionados de grupos alquila e éter. Em determinadas modalidades, o grupo de ramificação compreende um sistema de anéis mono ou policíclicos.
[00229] Em certas modalidades, cada corrente de uma porção de célu- las-alvo compreende um ou mais grupos selecionados dealquila, alquila substituído, éter, tioéter, dissulfeto, amino, oxo, amida, fosfodiéster e polie- tileno glicol, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada cor- rente é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos sele- cionados dealquila, éter, tioéter, dissulfeto, amino, oxo, amida e polietileno glicol, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada corrente é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados de- alquila, fosfodiéster, éter, amino, oxo e amida, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada corrente é um grupo alifático linear compreen-
dendo um ou mais grupos selecionados dealquila, éter, amino, oxo e amida, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada corrente é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados dealquila, amino e oxo, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada cor- rente é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos sele- cionados de alquila e oxo, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada corrente é um grupo alifático linear compreendendo um ou mais grupos selecionados dealquila, e fosfodiéster, em qualquer combinação. Em certas modalidades, cada corrente compreende pelo menos um grupo de ligação fósforo ou grupo de ligação neutro. Em certas modalidades, cada corrente compreende uma cadeia de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de compri- mento. Em certas modalidades, cada corrente compreende uma cadeia de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de comprimento. Em determinadas mo- dalidades, cada corrente compreende de cerca de 10 átomos no compri- mento da cadeia.
[00230] Em certas modalidades, cada ligando de uma porção de direci- onamento celular tem uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula alvo. Em certas modalidades, cada ligando tem uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor na superfície de uma célula pulmonar de mamífero.
[00231] Em certas modalidades, cada ligando de uma porção de direci- onamento celular é um carboidrato, derivado de carboidrato, carboidrato modificado, polissacarídeo, polissacarídeo modificado ou derivado de po- lissacarídeo. Em certas modalidades, o grupo conjugado compreende um agrupamento de carboidratos (ver, por exemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Clus- ter for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, 14, 18-29, ou Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosa- mine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808, que são no presente documento incorporados por referência na sua totalidade). Em determinadas tais modalidades, cada ligando é um açúcar amino ou açúcar tio. Por exemplo, os açúcares amino podem ser selecionados de qualquer número de compostos conhecidos na técnica, como ácido siálico, α-D-galactosamina, ácido β-murâmico, 2-desóxi-2-metilamino-L-glicopi- ranose, 4,6-didesóxi-4-formamido-2,3-di-O-metil-D-manopiranose, 2-desó- xi-2-sulfoamino-D-glicopiranose e N-sulfo-D-glicosamina, e ácido N-gli- coloil-α-neuramínico. Por exemplo, açúcares tio podem ser selecionados de 5-tio-β-D-glicopiranose, metila 2,3,4-tri-O-acetil-1-tio-6-O-tritil-α-D-glico- piranosídeo, 4-tio-β-D-galactopiranose e etila 3,4,6,7-tetra-O-ace- til-2-desóxi-1,5-ditio-α-D-glico-heptopiranosídeo.
[00232] Em certas modalidades, os compostos no presente documento descritos compreendem um grupo conjugado encontrado em qualquer uma das seguintes referências:Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175;
van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; Pedidos Internacionais WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788; WO2004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131; WO2011/163121; WO2012/177947; WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185; WO2012/083046; WO2009/082607; WO2009/134487; WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563; WO2010/088537; WO2002/043771; WO2010/129709; WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757; WO2010/054406; WO2012/089352; WO2012/089602; WO2013/166121; WO2013/165816;Patentes US 4.751.219; 8.552.163;
6.908.903; 7.262.177; 5.994.517; 6.300.319; 8.106.022; 7.491.805;
7.491.805; 7.582.744; 8.137.695; 6.383.812; 6.525.031; 6.660.720;
7.723.509; 8.541.548; 8.344.125; 8.313.772; 8.349.308; 8.450.467;
8.501.930; 8.158.601; 7.262.177; 6.906.182; 6.620.916; 8.435.491;
8.404.862; 7.851.615; Publicações de Pedido de Patente US publicadas US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740; US2008/0281044; US2010/0240730; US2003/0119724; US2006/0183886; US2008/0206869; US2011/0269814; US2009/0286973; US2011/0207799; US2012/0136042; US2012/0165393; US2008/0281041; US2009/0203135; US2012/0035115; US2012/0095075; US2012/0101148; US2012/0128760; US2012/0157509; US2012/0230938; US2013/0109817; US2013/0121954; US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; e US2009/0203132. Composições e Métodos para a Formulação de Composições Farmacêuticas
[00233] Os compostos no presente documento descritos podem ser misturados com substâncias ativas ou inertes farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições farmacêuticas. As composições e mé- todos para a formulação de composições farmacêuticas são dependentes de uma série de critérios, incluindo, mas não limitado a, via de administração, extensão da doença, ou dose a ser administrada.
[00234] Certas modalidades fornecem composições farmacêuticas com- preendendo um ou mais compostos ou um sal dos mesmos. Em certas modalidades, esses compostos são compostos antissentido ou compostos oligoméricos. Em certas modalidades, os compostos compreendem ou con- sistem em um oligonucleotídeo modificado. Em determinadas tais modali- dades, a composição farmacêutica compreende um diluente ou transporta- dor farmaceuticamente aceitável adequado. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma solução salina estéril e um ou mais compostos. Em certas modalidades, essa composição farmacêutica compreende uma solução salina estéril e um ou mais compostos. Em de- terminadas modalidades, a solução salina é uma solução salina de qualidade farmacêutica. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende um ou mais compostos e água estéril. Em determinadas mo- dalidades, a composição farmacêutica consiste em um composto e em água estéril. Em determinadas modalidades, a água estéril é uma solução salina de qualidade farmacêutica. Em determinadas modalidades, uma composição farmacêutica compreende ou consiste em um ou mais compostos e solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica consiste em um ou mais compostos e em PBS estéril. Em determinadas modalidades, o PBS estéril é PBS de grau farma- cêutico. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas são dependentes de uma série de critérios, incluindo, mas não limitado a, via de administração, extensão da doença, ou dose a ser admi- nistrada.
[00235] Certas modalidades fornecem composições farmacêuticas ade- quadas para aerossolização e/ou dispersão por um nebulizador ou inalador. Tais dispositivos são bem conhecidos na técnica. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é um sólido compreendendo partículas de com- postos que são de tamanho respirável. Uma composição de particulado só- lido pode opcionalmente conter um dispersante que serve para facilaitar a formação de um aerossol, por exemplo, lactose. As composições farmacêu- ticas sólidas compreendendo um oligonucleotídeo também podem ser ae- rossolizadas usando qualquer gerador de aerossóis de medicamentos em particulado sólido conhecido na técnica, por exemplo, um inalador de pó seco. Em certas modalidades, o pó empregado no inalador consiste no composto que compreende o composto ativo ou em uma mistura de pó que compreende o composto ativo, um diluente de pó adequado e um surfactante opcional.
[00236] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido. Em certas modalidades, o líquido é administrado como um aerossol que é produzido por qualquer meio adequado, como um nebulizador ou inalador. Ver, por exemplo, Patente US 4.501.729. Nebulizadores são dispositivos que transformam soluções ou suspensões em uma névoa de aerossol e são bem conhecidos na técnica. Nebulizadores adequados incluem nebulizadores de jato, nebulizadores ultrassônicos, nebulizadores de malha eletrônica e ne- bulizadores de malha vibratória. Empresas como PARI e Vectura vendem alguns tipos de nebulizadores adequados. Em certas modalidades, o ae- rossol é produzido por um inalador de dose medida, que normalmente con- tém uma suspensão ou formulação de solução do composto ativo em um propulsor liquefeito. Os inaladores adequados para a distribuição de aerossol líquido também incluem certos inaladores vendidos pela Respimat (Ver, por exemplo, Anderson, Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 1, 251 (2006).)As composições farmacêuticas adequadas para aerossolização podem com- preender propulsores, surfactantes, cossolventes, dispersantes, conser-
vantes e/ou outros aditivos ou excipientes.
[00237] Um composto no presente documento descrito complementar a um ácido nucleico α-ENaC pode ser usado em composições farmacêuticas combinando o composto com um diluente ou transportador farmaceutica- mente aceitável adequado e/ou componentes adicionais de modo que a composição farmacêutica seja adequada para aerossolização por um nebu- lizador. Em certas modalidades, um diluente farmaceuticamente aceitável é solução salina tamponada com fosfato. Por conseguinte, em uma modali- dade, empregada nos métodos no presente documento descritos, é uma composição farmacêutica compreendendo um composto complementar a um ácido nucleico α-ENaC e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é solução salina tamponada com fosfato. Em certas modalidades, o composto compreende ou consiste em umoligonucleotídeo modificado no presente documento fornecido.
[00238] Composições farmacêuticas compreendendo compostos forne- cidos no presente documento englobam quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, ou sais desses ésteres, ou qualquer outro oligonucleo- tídeo que, após a administração para um animal, incluindo um ser humano, é capaz de fornecer (diretamente ou indiretamente) o metabólito biologica- mente ativo ou resíduo do mesmo. Em certas modalidades, esses compos- tos são compostos antissentido ou compostos oligoméricos. Em certas modalidades, o composto compreende ou consiste em um oligonucleotídeo modificado. Assim, por exemplo, a divulgação é concebida também para sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos, pró-drogas, sais farmaceuti- camente aceitáveis dessas pró-drogas e outros bioequivalentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não são limitados aos sais de sódio e de potássio.
[00239] Uma pró-droga pode incluir a incorporação de nucleosídeos adi- cionais em uma ou ambas as extremidades de um composto que é clivado por nucleases endógenas no corpo, para formar o composto ativo.
[00240] Em certas modalidades, os compostos ou composições ainda compreendem um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
EXEMPLOS
[00241] Os exemplos abaixo descrevem o processo de triagem usado para identificar compostos líderes direcionados a α-ENaC. Dos mais de
1.900 oligonucleotídeos que foram triados, muitos oligonucleotídeos poten- tes e toleráveis foram identificados e os compostos 797308, 797495, 826763, 827307, 827359 e 827392 emergiram como os principais compostos líderes. Em particular, o composto 827359 exibiu a melhor combinação de proprie- dades em termos de potência e tolerabilidade. Descrição não limitativa e incorporação por referência
[00242] Embora a listagem de sequências que acompanha este depósito identifique cada sequência como "RNA" ou "DNA" conforme necessário, na realidade, essas sequências podem ser modificadas com qualquer combi- nação de modificações químicas. Os versados na técnica apreciarão de imediato que essa designação como "RNA" ou "DNA" para descrever oli- gonucleotídeos modificados é, em certos casos, arbitrária. Por exemplo, um oligonucleotídeo compreendendo um nucleosídeo compreendendo uma porção de açúcar 2'-OH e uma nucleobase de timina pode ser descrita como um DNA com um açúcar de RNA ou como um RNA com uma nucleobase de DNA.
[00243] Por conseguinte, as sequências de ácido nucleico providas neste documento, incluindo, entre outras, aquelas na listagem de sequência, se destinam a englobar ácidos nucleicos com qualquer combinação de RNA e/ou DNA modificado ou não modificado, incluindo, mas não limitados a, esses ácidos nucleicos modificados com nucleobases modificadas. A título de exemplo e sem limitação, um oligonucleotídeo com uma sequência de nucleobases "ATCGATCG" engloba quaisquer oligonucleotídeos com essa sequência de nucleobases, modificada ou não modificada, incluindo, entre outros, esses compostos que compreendem bases do RNA, como aquelas com uma sequência "AUCGAUCG" e aquelas que possuem algumas bases de DNA e algumas bases de RNA, como "AUCGATCG" e compostos com outras nucleobases modificadas, como "ATmCGAUCG," em que mC indica uma base de citosina que compreende um grupo metila na posição 5.
[00244] Embora certos compostos, composições e métodos descritos neste documento tenham sido descritos com especificidade em conformi- dade com certas modalidades, os seguintes exemplos servem apenas para ilustrar os compostos descritos neste documento e não se destinam a limitar o mesmo. Cada uma das referências relatadas no presente pedido está in- corporada neste documento por referência em sua totalidade. Exemplo 1:Efeito de oligonucleotídeos modificados complementares de α-ENaC in vitro
[00245] Os oligonucleotídeos modificados complementares a um ou mais ácidos nucleicos α-ENaC humanos foram projetados e testados quanto ao seu efeito no mRNA de α-ENaC in vitro. Os oligonucleotídeos modificados foram testados em uma série de experimentos que tinham condições de cultura semelhantes.
[00246] As células Hep3B cultivadas a uma densidade de 20.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com 2.000 nM de oli- gonucleotídeo modificado ou sem oligonucleotídeo modificado para contro- les não tratados. Após aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis de mRNA de α-ENaC foram medidos por PCR quantitativo em tempo real. Conjunto de sonda de iniciador humano hSCNN1A_LTS01170 (sequência direta ACATCCCAGGAATGGGTCTTC, no presente documento designado como SEQ ID NO:3; sequência reversa ACTTTGGCCACTCCATTTCTCTT, no presente documento designada co- mo SEQ ID NO:4; sequência de sonda TGCTATCGCGACAGAACAATTA- CACCGTC, no presente documento designada como SEQ ID:5) foi usado para medir os níveis de mRNA. Os níveis de α-ENaC mRNA normalizados para o teor total de RNA, medido por RIBOGREEN®. Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como nível normalizado de mRNA de α-ENaC, em relação às células de controle não tratadas (essas condições descrevem um "Ensaio Padrão de Células").
[00247] Os oligonucleotídeos modificados nas tabelas abaixo têm um motivo 3-10-3 fosfotioriorato cEt gapmer. Os oligonucleotídeos modificados têm 16 nucleobases de comprimento, em que o segmento de lacuna central contém dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa nas extremidades 3' e 5', cada um contendo três nucleosídeos cEt. Todos os resíduos de citosina ao longo de cada oligonucleotídeo modificado são 5-metila citosinas. As ligações internucleosídicas são todas as ligações in- ternucleosídicas de fosforotioato.
[00248] Cada oligonucleotídeo modificado listado nas tabelas abaixo é 100% complementar à sequência de ácido nucleico α-ENaC humana do número GenBank NM_001038.5 (no presente documento designado como SEQ ID NO:1), o complemento do número GenBank NC_000012.12, trun- cado dos nucleosídeos 6343001 a 6380000 (no presente documento de- signado como SEQ ID NO:2) e/ou número do GenBank NG_011945.1 (no presente documento designado como SEQ ID NO:1957). "Sítio de início" indica o nucleosídeo mais 5' do ácido nucleico α-ENaC designado ao qual o oligonucleotídeo é complementar. "Sítio de parada" indica o maior nucleo- sídeo 3' do ácido nucleico α-ENaC humano ao qual o oligonucleotídeo é complementar. 'N/A' indica que o oligonucleotídeo modificado não é com- plementar a esse ácido nucleico em particular com 100% de complementa- ridade. Vários oligonucleotídeos correspondem a dois ou mais sítios no mRNA, como mostrado nas tabelas abaixo. Como mostrado abaixo, os oli- gonucleotídeos modificados complementares ao α-ENaC humano reduziram a quantidade de mRNA de α-ENaC humano in vitro.
Tabela 1:Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número SEQ ID:1 SEQ ID:1 Sequência α-ENaC SEQ ID:2 SEQ ID SEQ ID do com- Sítio de Sítio de (% controle) Sítio de 2:Sítio de NO posto Iniciação Parada Iniciação Parada 668181 523 538 CTTCATGCGGTTGTGC 37 5451 5466 6 668248 1240 1255 AGGCATGGAAGACATC 94 24196 24211 7 668279 1575 1590 ATGTAGGCACAGCCAC 30 25489 25504 8 668280 1580 1595 AGAAGATGTAGGCACA 27 25494 25509 9 668324 1930 1945 GCCCAGGTTGGACAGG 54 31759 31774 10 668325 1954 1969 GCCGAACCACAGGCTC 72 31783 31798 11 668358 2599 2614 TGTCAAAGCTCCAAGT 43 32428 32443 12 668364 2766 2781 ACCCAAGTTCAAGAGG 76 32595 32610 13 797074 4 19 TTAGACGCAGACAGGC 73 4265 4280 14 797075 30 45 GAGAAGGCGGACTCTG 88 4291 4306 15 797076 43 58 GAGTACTGGACCTGAG 64 4304 4319 16 797077 51 66 TGAACTGGGAGTACTG 71 4312 4327 17 797078 63 78 CCCGAGGGCAGGTGAA 97 4324 4339 18 797079 75 90 GGAAGGAGGGCTCCCG 98 4336 4351 19 797080 82 97 TTCCGAAGGAAGGAGG 123 4343 4358 20 797081 90 105 CGGGAGTTTTCCGAAG 135 4351 4366 21 797082 97 112 TCAGAGCCGGGAGTTT 64 4358 4373 22 797083 110 125 GGCTGAGGAGGAGTCA 86 4371 4386 23 797084 135 150 TAAAGGTGAGCAGGGC 107 4396 4411 24 797085 137 152 ATTAAAGGTGAGCAGG 96 4398 4413 25 797086 139 154 CAATTAAAGGTGAGCA 137 4400 4415 26 797087 141 156 CTCAATTAAAGGTGAG 150 4402 4417 27 797088 142 157 TCTCAATTAAAGGTGA 73 4403 4418 28 797089 147 162 TAGCATCTCAATTAAA 61 4408 4423 29 797090 151 166 TCATTAGCATCTCAAT 104 4412 4427 30 797091 158 173 AGGAATCTCATTAGCA 70 4419 4434 31 797092 168 183 TGGAAGCGACAGGAAT 94 4429 4444 32 797093 177 192 GGCCAGGGATGGAAGC 100 4438 4453 33 797094 213 228 GTGCAGCGGCCTGGCT 73 4474 4489 34 797095 221 236 CCTGACAGGTGCAGCG 71 4482 4497 35 797096 235 250 CTCCAGCTTGTTCCCC 41 5163 5178 36 295 310 5223 5238 797097 237 252 TCCTCCAGCTTGTTCC 49 5165 5180 37 297 312 5225 5240 797098 238 253 CTCCTCCAGCTTGTTC 58 5166 5181 38 298 313 5226 5241 797099 240 255 TGCTCCTCCAGCTTGT 26 5168 5183 39 300 315 5228 5243 797100 242 257 CCTGCTCCTCCAGCTT 19 5170 5185 40 302 317 5230 5245 797101 244 259 GTCCTGCTCCTCCAGC 21 5172 5187 41 304 319 5232 5247 797102 251 266 GTCTAGGGTCCTGCTC 41 5179 5194 42 797103 258 273 TGCAGAGGTCTAGGGT 27 5186 5201 43 797104 268 283 TGGTATGGGCTGCAGA 18 5196 5211 44 797105 277 292 CATGAGACCTGGTATG 85 5205 5220 45 797106 311 326 GGCTAGAGTCCTGCTC 78 5239 5254 46 797107 329 344 CTGGAGTGGACTGTGG 73 5257 5272 47 797108 403 418 CGCCGTGGGCTGCTGG 60 5331 5346 48 797109 424 439 CTCGATCAGGGCCTCC 33 5352 5367 49 797110 438 453 TAGGAGCGGTGGAACT 51 5366 5381 50 797111 440 455 GGTAGGAGCGGTGGAA 32 5368 5383 51 797112 447 462 AGCTCTCGGTAGGAGC 84 5375 5390 52 797113 454 469 CTCGAAGAGCTCTCGG 34 5382 5397 53 797114 462 477 CAGAAGAACTCGAAGA 48 5390 5405 54 797115 534 549 CAGAAGGCCGTCTTCA 30 5462 5477 55 797116 537 552 GCCCAGAAGGCCGTCT 41 5465 5480 56 797117 554 569 TGCAGAGCCACAGCAC 47 5482 5497 57 797118 561 576 CCAAAGGTGCAGAGCC 17 5489 5504 58 797119 568 583 CATCATGCCAAAGGTG 26 5496 5511 59 797120 576 591 TGCCAGTACATCATGC 45 5504 5519 60 797121 583 598 GCCGAATTGCCAGTAC 20 5511 5526 61 797122 592 607 GAAAAGCAGGCCGAAT 49 5520 5535 62 797123 604 619 GAAGTACTCTCCGAAA 36 5532 5547 63 797124 642 657 TCCGAGTTGAGGTTGA 25 5570 5585 64 797125 651 666 ACGAGCTTGTCCGAGT 23 5579 5594 65 797126 682 697 ATTGAGGGTGCAGATG 58 5610 5625 66 797127 704 719 TAATTTCCGGGTACCT 30 16289 16304 67 797128 736 751 TGTGATGCGGTCCAGC 24 16321 16336 68 797129 760 775 GTACAGGTCAAAGAGC 20 16345 16360 69 797130 765 780 TATTTGTACAGGTCAA 20 16350 16365 70 797131 767 782 TGTATTTGTACAGGTC 13 16352 16367 71 797132 778 793 GGTGAAGGAGCTGTAT 35 16363 16378 72
797133 785 800 CGAGAGTGGTGAAGGA 72 16370 16385 73 797134 793 808 GCCGGCCACGAGAGTG 101 16378 16393 74 797135 802 817 GCTGCGGGAGCCGGCC 59 16387 16402 75 797136 809 824 CGCGACGGCTGCGGGA 38 16394 16409 76 797137 817 832 CCGCAGGTCGCGACGG 74 16402 16417 77 797138 880 895 TCGACGGGCCCCGTGA 41 16465 16480 78 797139 890 905 CGCTACGGGCTCGACG 20 16475 16490 79 797140 901 916 GCTGGAGGCCACGCTA 21 16486 16501 80 797141 942 957 TTCCAGTCCTTCCAGT 45 16527 16542 81 797142 950 965 AGCCGATCTTCCAGTC 44 16535 16550 82 797143 961 976 GCACAGCTGGAAGCCG 30 N/A N/A 83 797144 977 992 CCGATTTGTTCTGGTT 19 17763 17778 84 797145 984 999 AAGCAGTCCGATTTGT 74 17770 17785 85 797146 1002 1017 GATGAGTATGTCTGGT 18 17788 17803 86 797147 1016 1031 CCGCATCCACCCCTGA 27 17802 17817 87 797148 1044 1059 ATGTAGTGGAAGCGGT 59 17830 17845 88 797149 1057 1072 CGACAGGATGTTGATG 45 17843 17858 89 797150 1066 1081 TGGCAGCCTCGACAGG 24 17852 17867 90 797151 1077 1092 GGCAGAGTCTCTGGCA 39 17863 17878 91 797152 1087 1102 CTCCAGGGATGGCAGA 60 17873 17888 92 797153 1111 1126 GATGAAGTTGCCCAGC 24 17897 17912 93 797154 1118 1133 AGGCGAAGATGAAGTT 51 17904 17919 94 797155 1128 1143 TTGAAGCGGCAGGCGA 48 17914 17929 95 797156 1143 1158 TTGCAGGAGACCTGGT 45 17929 17944 96 797157 1156 1171 GTAATTCGCCTGGTTG 102 N/A N/A 97 797158 1163 1178 AGTGAGAGTAATTCGC 53 N/A N/A 98 797159 1227 1242 ATCCAGAGGTTGGAGT 105 24183 24198 99 797160 1235 1250 TGGAAGACATCCAGAG 50 24191 24206 100 797161 1244 1259 TTCCAGGCATGGAAGA 68 24200 24215 101 797162 1256 1271 GACCGTTGTTGATTCC 28 N/A N/A 102 797163 1264 1279 CAGGGACAGACCGTTG 22 N/A N/A 103 797164 1272 1287 CGCAGCATCAGGGACA 14 24569 24584 104 797165 1289 1304 AGTCATTCTGCTCTGC 9 24586 24601 105 797166 1293 1308 ATGAAGTCATTCTGCT 27 24590 24605 106 797167 1297 1312 GGGAATGAAGTCATTC 37 24594 24609 107 797168 1315 1330 AGTCACTGTGGACAGC 20 24612 24627 108 797169 1330 1345 CATTACCCGGGCCCCA 53 24627 24642 109 797170 1355 1370 AGGCAGGTTCATCCTG 54 24652 24667 110 797171 1362 1377 TCCATAAAGGCAGGTT 48 24659 24674 111 797172 1370 1385 CACCATCATCCATAAA 48 24667 24682 112 797173 1373 1388 AGCCACCATCATCCAT 31 24670 24685 113 797174 1377 1392 TTAAAGCCACCATCAT 39 24674 24689 114 797175 1384 1399 CCGCAAGTTAAAGCCA 24 24681 24696 115 797176 1391 1406 CGCCAGGCCGCAAGTT 18 24688 24703 116 797177 1414 1429 CCTCATGCTGATGGAG 40 24711 24726 117 797178 1429 1444 GTCCAGGGTTTCCTTC 48 N/A N/A 118 797179 1439 1454 CCCCAAGTCTGTCCAG 49 25159 25174 119 797180 1449 1464 CCATAATCGCCCCCAA 15 25169 25184 120 797181 1465 1480 ATTCTTGGTGCAGTCG 18 25185 25200 121 797182 1475 1490 CATCACTGCCATTCTT 30 25195 25210 122 797183 1482 1497 ACAGGAACATCACTGC 22 25202 25217 123 797184 1495 1510 GTAAAGGTTCTCAACA 84 25215 25230 124 797185 1502 1517 TTGAAGGGTAAAGGTT 57 25222 25237 125 797186 1524 1539 ATACACACCTGCTGTG 87 N/A N/A 126 797187 1533 1548 CAGGAGTGAATACACA 65 25447 25462 127 797188 1552 1567 GATCATGCTCTCCTGG 13 25466 25481 128 797189 1563 1578 CCACACTCCTTGATCA 36 25477 25492 129 797190 1570 1585 GGCACAGCCACACTCC 29 25484 25499 130 797191 1573 1588 GTAGGCACAGCCACAC 18 25487 25502 131 797192 1578 1593 AAGATGTAGGCACAGC 17 25492 25507 132 797193 1586 1601 GCGGATAGAAGATGTA 20 25500 25515 133 797194 1613 1628 AGTCACAGTACTCCAC 40 25527 25542 134 797195 1623 1638 TGCTTTCTGTAGTCAC 39 25537 25552 135 797196 1631 1646 AGGAACTGTGCTTTCT 48 25545 25560 136 797197 1644 1659 TAGCAGTACCCCCAGG 51 N/A N/A 137 797198 1651 1666 CTTATAGTAGCAGTAC 42 30597 30612 138 797199 1663 1678 GTCAACCTGGAGCTTA 14 30609 30624 139 797200 1671 1686 GAGGAGAAGTCAACCT 66 30617 30632 140 797201 1684 1699 GCCCAGGTGGTCTGAG 43 30630 30645 141 797202 1692 1707 GTGAAACAGCCCAGGT 55 30638 30653 142 797203 1700 1715 GGCACTTGGTGAAACA 77 30646 30661 143 797204 1707 1722 GGCTTCCGGCACTTGG 22 30653 30668 144 797205 1715 1730 CGCTGCATGGCTTCCG 23 N/A N/A 145 797206 1731 1746 AGCTGGTAGCTGGTCA 49 30782 30797 146 797207 1739 1754 CAGCAGAGAGCTGGTA 52 30790 30805 147 797208 1746 1761 GAGTAACCAGCAGAGA 47 30797 30812 148 797218 1875 1890 TTGTAGTTCAGCTCCT 41 31231 31246 149 797219 1885 1900 AGAATTGGTTTTGTAG 55 31241 31256 150
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797495 N/A N/A ACGATTACAGGGATTC 9 21751 21766 426 797496 N/A N/A AGCTGTATTAGCTCAC 71 21771 21786 427 797497 N/A N/A GTTACTTACTTAATCT 17 21895 21910 428 797498 N/A N/A AACAAGTATTAGATGT 93 21923 21938 429 797499 N/A N/A GCACAGACTCCAGAAT 41 21970 21985 430 797500 N/A N/A CAGTATAATGTGATGG 5 22302 22317 431 797501 N/A N/A GAGATACACACTAAGC 5 22344 22359 432 797502 N/A N/A CAGCGGTGGAGAAACA 31 22750 22765 433 797503 N/A N/A ATGGAAAGCAGGCACA 8 22774 22789 434 797504 N/A N/A AAGTATAATGGTGGGT 32 22799 22814 435 797505 N/A N/A TAAAATGTAGGATGAT 86 23033 23048 436 797506 N/A N/A ACTAAAGAGAAGAGGG 68 23136 23151 437 797507 N/A N/A AGCAAATCACAGGTTC 5 23303 23318 438 797508 N/A N/A CAGTACCAAGTGTTTC 17 23442 23457 439 797509 N/A N/A AGGAGATAGAGGAGAT 39 23589 23604 440 797510 N/A N/A CTTAAACTCCTACAGG 59 24017 24032 441 797511 N/A N/A AGCTCAAGGTAAGTAC 98 24277 24292 442 797512 N/A N/A TCCCAGTCAGCATCCT 89 24733 24748 443 797513 N/A N/A CCCCAGGGTCCACCCT 75 24902 24917 444 797514 N/A N/A CTCACATACACAACCC 64 25321 25336 445 797515 N/A N/A CTGCAGGTTGTTTTTA 26 26098 26113 446 26434 26449 797516 N/A N/A AATGGATACAGTATGT 98 26688 26703 447 797517 N/A N/A AGTCAAAAGGAAAGAG 25 26848 26863 448 797518 N/A N/A CAAACAACTCAACTGT 24 26864 26879 449 797519 N/A N/A AGCATGAACTCCAGGA 11 26959 26974 450 797520 N/A N/A AAATGCAACAGACTGT 30 27542 27557 451 797521 N/A N/A ACCCAAATCCCTACCA 46 27624 27639 452 797522 N/A N/A GATATAAATTATCTCA 88 27780 27795 453 797523 N/A N/A GCTAATGAGTACAAGG 9 28243 28258 454 797524 N/A N/A ACCATACGGATGAACC 13 28742 28757 455 797525 N/A N/A TCAAAAAAGGTTAAAC 90 28996 29011 456 797526 N/A N/A ATGTACAATGGTGATG 34 29040 29055 457 797527 N/A N/A AAAGAAAAATGGGAAC 87 29535 29550 458 29852 29867 797528 N/A N/A TTATAATGATGCCTTA 78 30466 30481 459 797529 N/A N/A CCCAAGAGGTCTCCCA 58 30522 30537 460 797530 N/A N/A CATAATACCCAGAGAA 57 30895 30910 461 797531 N/A N/A CACTCATACACATAAT 68 30905 30920 462 797532 N/A N/A TGTCACCCAGAGAAAA 66 31564 31579 463 797533 N/A N/A AGGTACATTGACGATG 85 31720 31735 464
Tabela 2:Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número do SEQ ID:1 SEQ ID:1 Sequência α-ENaC SEQ ID:2 SEQ ID 2: SEQ ID composto Sítio de Sítio de (% controle) Sítio de Sítio de Pa- NO Iniciação Parada Inicia- rada ção 797192 1578 1593 AAGATGTAGGCACAGC 30 25492 25507 132 797235 2045 2060 GGCTTCGGAACCTTCG 18 31874 31889 166 797507 N/A N/A AGCAAATCACAGGTTC 20 23303 23318 438 826070 1 16 GACGCAGACAGGCAAG 76 4262 4277 465 826071 5 20 TTTAGACGCAGACAGG 67 4266 4281 466 826090 52 67 GTGAACTGGGAGTACT 91 4313 4328 467 826091 53 68 GGTGAACTGGGAGTAC 57 4314 4329 468 826110 145 160 GCATCTCAATTAAAGG 86 4406 4421 469 826111 163 178 GCGACAGGAATCTCAT 66 4424 4439 470 826130 195 210 GGAGCCCGCCCGCTGG 60 4456 4471 471 826131 216 231 CAGGTGCAGCGGCCTG 79 4477 4492 472 826150 282 297 CCCTCCATGAGACCTG 30 5210 5225 473 826151 283 298 CCCCTCCATGAGACCT 19 5211 5226 474 826170 354 369 TCACGCTTGTTCCCCT 25 5282 5297 475 826171 355 370 CTCACGCTTGTTCCCC 17 5283 5298 476 826190 439 454 GTAGGAGCGGTGGAAC 88 5367 5382 477 826191 441 456 CGGTAGGAGCGGTGGA 64 5369 5384 478 826209 565 580 CATGCCAAAGGTGCAG 43 5493 5508 479 826210 566 581 TCATGCCAAAGGTGCA 45 5494 5509 480 826229 606 621 CTGAAGTACTCTCCGA 23 5534 5549 481 826230 607 622 GCTGAAGTACTCTCCG 26 5535 5550 482 826249 702 717 ATTTCCGGGTACCTGT 33 N/A N/A 483 826250 703 718 AATTTCCGGGTACCTG 40 16288 16303 484 826267 791 806 CGGCCACGAGAGTGGT 62 16376 16391 485 826268 792 807 CCGGCCACGAGAGTGG 58 16377 16392 486 826287 828 843 GGCAGAGTCCCCCGCA 35 16413 16428 487 826288 830 845 GCGGCAGAGTCCCCCG 38 16415 16430 488 826307 914 929 TGTTGTCCCGCAAGCT 42 16499 16514 489
826308 916 931 GTTGTTGTCCCGCAAG 26 16501 16516 490 826325 979 994 GTCCGATTTGTTCTGG 31 17765 17780 491 826326 980 995 AGTCCGATTTGTTCTG 58 17766 17781 492 826345 1017 1032 ACCGCATCCACCCCTG 42 17803 17818 493 826346 1018 1033 CACCGCATCCACCCCT 41 17804 17819 494 826365 1113 1128 AAGATGAAGTTGCCCA 41 17899 17914 495 826366 1115 1130 CGAAGATGAAGTTGCC 55 17901 17916 496 826385 1162 1177 GTGAGAGTAATTCGCC 65 N/A N/A 497 826386 1164 1179 AAGTGAGAGTAATTCG 29 N/A N/A 498 826405 1281 1296 TGCTCTGCGCGCAGCA 62 24578 24593 499 826406 1282 1297 CTGCTCTGCGCGCAGC 58 24579 24594 500 826425 1354 1369 GGCAGGTTCATCCTGC 140 24651 24666 501 826426 1356 1371 AAGGCAGGTTCATCCT 63 24653 24668 502 826445 1405 1420 GATGGAGGTCTCCACG 67 24702 24717 503 826446 1416 1431 TTCCTCATGCTGATGG 24 24713 24728 504 826465 1497 1512 GGGTAAAGGTTCTCAA 25 25217 25232 505 826466 1500 1515 GAAGGGTAAAGGTTCT 63 25220 25235 506 826485 1579 1594 GAAGATGTAGGCACAG 32 25493 25508 507 826504 1656 1671 TGGAGCTTATAGTAGC 30 30602 30617 508 826505 1661 1676 CAACCTGGAGCTTATA 42 30607 30622 509 826524 1733 1748 AGAGCTGGTAGCTGGT 67 30784 30799 510 826525 1736 1751 CAGAGAGCTGGTAGCT 75 30787 30802 511 826564 1992 2007 ACGAGCTCAGCCATCT 57 31821 31836 512 826565 1993 2008 GACGAGCTCAGCCATC 16 31822 31837 513 826584 2046 2061 CGGCTTCGGAACCTTC 23 31875 31890 514 826603 2216 2231 CCAGGGTGGCATAGGC 28 32045 32060 515 826604 2217 2232 CCCAGGGTGGCATAGG 42 32046 32061 516 826623 2360 2375 CCTTCAATCTTGCCAG 31 32189 32204 517 826624 2390 2405 TGGGCGGCTCTGAGAG 49 32219 32234 518 826643 2464 2479 ATCAGCTACTGTTCTT 32 32293 32308 519 826644 2476 2491 CTGGGCAGCTTCATCA 33 32305 32320 520 826662 2575 2590 GCTGATCCAAGGGAAA 35 32404 32419 521 826681 2610 2625 GGAAAGTTCCTTGTCA 40 32439 32454 522 826682 2612 2627 TAGGAAAGTTCCTTGT 32 32441 32456 523 826701 2679 2694 GGCAGGAAACCCGTGC 74 32508 32523 524 826702 2681 2696 TGGGCAGGAAACCCGT 64 32510 32525 525 826721 2832 2847 AGCCCTCGGGAGTCAG 27 32661 32676 526 826722 2835 2850 CCTAGCCCTCGGGAGT 62 32664 32679 527 826741 2896 2911 GCACGGGTATGAGGCT 69 32725 32740 528 826742 2949 2964 TGTAGAGGTATGAAAG 31 32778 32793 529 826761 3012 3027 ATAGGAGTTCTCTGGC 16 32841 32856 530 826780 3101 3116 GAAGGCGGAGTGATCA 65 32930 32945 531 826781 3117 3132 CTACGGGAGCCCAGGA 22 32946 32961 532 826799 3143 3158 AACACTCCAGCAGATG 40 32972 32987 533 826800 3145 3160 GCAACACTCCAGCAGA 19 32974 32989 534 826817 3212 3227 GACCGCAAGGCACTTA 51 33041 33056 535 826818 3213 3228 TGACCGCAAGGCACTT 19 33042 33057 536 826836 3235 3250 TAAACGGGCAAGATTC 41 33064 33079 537 826837 3236 3251 ATAAACGGGCAAGATT 71 33065 33080 538 826856 N/A N/A TTGTCCTAATGAAGAA 95 2680 2695 539 826857 N/A N/A TCCCCTTGGAAGGGAC 66 2713 2728 540 826876 N/A N/A AGGATCTGTGTCTCAG 19 4815 4830 541 826877 N/A N/A GTCCTAGCACCTCCCT 15 4868 4883 542 826896 N/A N/A CCCTAGAACGGCCTCT 27 4920 4935 543 826897 N/A N/A CTTCCCTAGAACGGCC 19 4923 4938 544 826916 N/A N/A ACCCGAGTGAGGCTGC 13 5057 5072 545 826917 N/A N/A GAACCCGAGTGAGGCT 60 5059 5074 546 826936 N/A N/A CCACACAGAGCCCGTG 66 2463 2478 547 826937 N/A N/A AGCCGGGAAGGCCTCC 72 2486 2501 548 826956 N/A N/A CCCAAAAAGGGCTGGA 66 3294 3309 549 826957 N/A N/A GCCAAGTGGTGAGCAA 74 3338 3353 550 826976 N/A N/A GTTGAATCTGGCAGCC 64 4517 4532 551 826977 N/A N/A TGGGACTGGTTCCTTT 109 4536 4551 552 826996 N/A N/A TGGCAAAGAGCACCGA 51 6348 6363 553 826997 N/A N/A CCAGACCCAACATTGG 87 6361 6376 554 827016 N/A N/A GTCCGTAACGCACCTT 36 6807 6822 555 827017 N/A N/A CTTTCTTAGTCCGTAA 41 6815 6830 556 827036 N/A N/A GACTACAAGGTCAAGT 77 7660 7675 557 827056 N/A N/A ATTCACTGCGCTCCCG 44 8755 8770 558 827057 N/A N/A TCGGTAGGAGTCATTC 15 8767 8782 559 827076 N/A N/A ACAGAAGAGCCCATGC 55 9484 9499 560 827077 N/A N/A TCTTACCCCGGTGGCC 53 9507 9522 561 827096 N/A N/A CCCTACGCGCCTCCCT 92 10629 10644 562 827097 N/A N/A CTGCCACCCTACGCGC 53 10635 10650 563 827116 N/A N/A GCCTACCGCATGAAGC 42 11082 11097 564 827117 N/A N/A GGGCATAACACTAGAT 42 11100 11115 565 827136 N/A N/A TGGACAAGGTTTGACA 65 11623 11638 566 827137 N/A N/A GGTTACACCCCCGGCG 60 11650 11665 567
827156 N/A N/A GCTACATTAACCACCG 31 12134 12149 568 827157 N/A N/A TTGAAAGAGCCCCCAC 26 12166 12181 569 827176 N/A N/A CAGGAACTATGGTATT 18 12690 12705 570 827177 N/A N/A GCAATCATAGCTAGCA 116 12729 12744 571 827196 N/A N/A TTTATGAACAGACCTA 19 14134 14149 572 827197 N/A N/A GTAGGCACTTTATGAA 28 14142 14157 573 827215 N/A N/A GCATAGATGGTCAACT 43 14438 14453 574 827216 N/A N/A GGAGAGACAATAGATC 31 14488 14503 575 827235 N/A N/A GGCTTGAGTGCCGCTT 17 15852 15867 576 827236 N/A N/A CCGCAGGCGAGTGTCG 63 15878 15893 577 827255 N/A N/A ACTAATGGGAACTTCC 47 17363 17378 578 827256 N/A N/A CAAGAGATTTGTCCCA 39 17420 17435 579 827275 N/A N/A GAGCAGCAGGAGTTCG 45 18126 18141 580 827276 N/A N/A CCTCAGATCCAGCAGT 50 18147 18162 581 827294 N/A N/A ATACATCCAGAGTCAC 25 18724 18739 582 827295 N/A N/A GATACATCCAGAGTCA 31 18725 18740 583 827313 N/A N/A CTCCGGAAAATAAACG 25 19270 19285 584 827314 N/A N/A GGAGATGGCTCCGGAA 55 19278 19293 585 827333 N/A N/A ACCATGGACTTTCTGT 18 19686 19701 586 827334 N/A N/A AACCATGGACTTTCTG 42 19687 19702 587 827352 N/A N/A CTAACTGGAATAGTTA 89 19872 19887 588 827353 N/A N/A ACTAACTGGAATAGTT 60 19873 19888 589 827372 N/A N/A ATCATAGTATTCAGCC 18 21087 21102 590 827373 N/A N/A AAAAAGGTGGTGTATC 50 21111 21126 591 827391 N/A N/A ATTACAGGGATTCATT 26 21748 21763 592 827392 N/A N/A CGATTACAGGGATTCA 20 21750 21765 593 827409 N/A N/A GGCCAGTAAGAGTGAA 90 22013 22028 594 827410 N/A N/A GAATCAGTATAATGTG 11 22306 22321 595 827428 N/A N/A TGCCCCCATGGAAAGC 54 22781 22796 596 827429 N/A N/A CTGCCCCCATGGAAAG 32 22782 22797 597 827448 N/A N/A CTGCAGTAGGACTGCA 80 23326 23341 598 827467 N/A N/A AAGCAGGGAGCTTCTC 80 24227 24242 599 827468 N/A N/A CGCCATGGAGCAAGCA 95 24238 24253 600 827487 N/A N/A TGCAACACTGAGAGGG 45 26035 26050 601 827488 N/A N/A GGACAATTCCTTGACA 38 26078 26093 602 827507 N/A N/A GACAATCCGCTGCCTT 15 27116 27131 603 827508 N/A N/A AGGTAGGGATGGACGC 15 27147 27162 604 827527 N/A N/A GGGACTTGCTAATGAG 50 28250 28265 605 827528 N/A N/A TGGGACTTGCTAATGA 48 28251 28266 606 827546 N/A N/A GTCCACTAACTGATAA 52 28839 28854 607 827547 N/A N/A GGTGATGTCACTTCGG 12 29031 29046 608 827566 N/A N/A CACATAATACCCAGAG 61 30897 30912 609 827567 N/A N/A GGATAGGGTTGTGTCA 57 30925 30940 610
Tabela 3:Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número do SEQ ID:1 SEQ ID:1 Sequência α-ENaC SEQ ID:2 SEQ ID SEQ ID composto Sítio de Sítio de (% controle) Sítio de 2:Sítio de NO Iniciação Parada Iniciação Parada 797494 N/A N/A TTAAATGGTGTGACCA 12 21648 21663 425 797524 N/A N/A ACCATACGGATGAACC 37 28742 28757 455 826074 25 40 GGCGGACTCTGGGCAG 135 4286 4301 611 826075 28 43 GAAGGCGGACTCTGGG 121 4289 4304 612 826076 29 44 AGAAGGCGGACTCTGG 119 4290 4305 613 826077 31 46 TGAGAAGGCGGACTCT 75 4292 4307 614 826078 32 47 CTGAGAAGGCGGACTC 70 4293 4308 615 826079 33 48 CCTGAGAAGGCGGACT 163 4294 4309 616 826081 36 51 GGACCTGAGAAGGCGG 46 4297 4312 617 826094 73 88 AAGGAGGGCTCCCGAG 111 4334 4349 618 826095 74 89 GAAGGAGGGCTCCCGA 196 4335 4350 619 826096 81 96 TCCGAAGGAAGGAGGG 197 4342 4357 620 826097 83 98 TTTCCGAAGGAAGGAG 89 4344 4359 621 826098 85 100 GTTTTCCGAAGGAAGG 125 4346 4361 622 826099 88 103 GGAGTTTTCCGAAGGA 149 4349 4364 623 826100 91 106 CCGGGAGTTTTCCGAA 59 4352 4367 624 826101 92 107 GCCGGGAGTTTTCCGA 98 4353 4368 625 826114 167 182 GGAAGCGACAGGAATC 162 4428 4443 626 826115 169 184 ATGGAAGCGACAGGAA 118 4430 4445 627 826116 170 185 GATGGAAGCGACAGGA 145 4431 4446 628 826117 171 186 GGATGGAAGCGACAGG 143 4432 4447 629 826118 172 187 GGGATGGAAGCGACAG 82 4433 4448 630 826119 175 190 CCAGGGATGGAAGCGA 95 4436 4451 631
826120 176 191 GCCAGGGATGGAAGCG 54 4437 4452 632 826121 180 195 GCCGGCCAGGGATGGA 74 4441 4456 633 826134 226 241 GTTCCCCTGACAGGTG 74 N/A N/A 634 826135 228 243 TTGTTCCCCTGACAGG 68 N/A N/A 635 826136 229 244 CTTGTTCCCCTGACAG 102 N/A N/A 636 826137 230 245 GCTTGTTCCCCTGACA 15 N/A N/A 637 826138 232 247 CAGCTTGTTCCCCTGA 30 N/A N/A 638 826139 233 248 CCAGCTTGTTCCCCTG 77 N/A N/A 639 826140 249 264 CTAGGGTCCTGCTCCT 55 5177 5192 640 826141 254 269 GAGGTCTAGGGTCCTG 44 5182 5197 641 826154 292 307 CAGCTTGTTCCCCTCC 33 5220 5235 642 826155 310 325 GCTAGAGTCCTGCTCC 82 5238 5253 643 826156 312 327 GGGCTAGAGTCCTGCT 134 5240 5255 644 826157 315 330 GGAGGGCTAGAGTCCT 91 5243 5258 645 826158 320 335 ACTGTGGAGGGCTAGA 50 5248 5263 646 826159 321 336 GACTGTGGAGGGCTAG 59 5249 5264 647 826160 322 337 GGACTGTGGAGGGCTA 34 5250 5265 648 826161 331 346 CCCTGGAGTGGACTGT 50 5259 5274 649 826174 360 375 TGCTCCTCACGCTTGT 27 5288 5303 650 826175 362 377 CCTGCTCCTCACGCTT 33 5290 5305 651 826176 363 378 CCCTGCTCCTCACGCT 51 5291 5306 652 826177 386 401 GCGCCGCAGGTTCGGG 51 5314 5329 653 826178 405 420 TCCGCCGTGGGCTGCT 52 5333 5348 654 826179 407 422 CCTCCGCCGTGGGCTG 50 5335 5350 655 826180 411 426 TCCTCCTCCGCCGTGG 31 5339 5354 656 826181 422 437 CGATCAGGGCCTCCTC 33 5350 5365 657 826194 446 461 GCTCTCGGTAGGAGCG 44 5374 5389 658 826195 448 463 GAGCTCTCGGTAGGAG 94 5376 5391 659 826196 451 466 GAAGAGCTCTCGGTAG 114 5379 5394 660 826197 453 468 TCGAAGAGCTCTCGGT 41 5381 5396 661 826198 456 471 AACTCGAAGAGCTCTC 30 5384 5399 662 826199 457 472 GAACTCGAAGAGCTCT 95 5385 5400 663 826200 466 481 GTTGCAGAAGAACTCG 27 5394 5409 664 826201 467 482 TGTTGCAGAAGAACTC 44 5395 5410 665 826213 575 590 GCCAGTACATCATGCC 34 5503 5518 666 826214 577 592 TTGCCAGTACATCATG 58 5505 5520 667 826215 580 595 GAATTGCCAGTACATC 46 5508 5523 668 826216 581 596 CGAATTGCCAGTACAT 27 5509 5524 669 826217 582 597 CCGAATTGCCAGTACA 26 5510 5525 670 826218 585 600 AGGCCGAATTGCCAGT 102 5513 5528 671 826219 587 602 GCAGGCCGAATTGCCA 34 5515 5530 672 826220 589 604 AAGCAGGCCGAATTGC 51 5517 5532 673 826233 626 641 TGTTGAGGCTGACGGG 14 5554 5569 674 826234 628 643 GATGTTGAGGCTGACG 28 5556 5571 675 826235 639 654 GAGTTGAGGTTGATGT 64 5567 5582 676 826236 641 656 CCGAGTTGAGGTTGAT 32 5569 5584 677 826237 643 658 GTCCGAGTTGAGGTTG 28 5571 5586 678 826238 644 659 TGTCCGAGTTGAGGTT 65 5572 5587 679 826239 645 660 TTGTCCGAGTTGAGGT 40 5573 5588 680 826240 647 662 GCTTGTCCGAGTTGAG 19 5575 5590 681 826253 731 746 TGCGGTCCAGCTCCTC 42 16316 16331 682 826254 734 749 TGATGCGGTCCAGCTC 88 16319 16334 683 826255 737 752 CTGTGATGCGGTCCAG 38 16322 16337 684 826256 739 754 CTCTGTGATGCGGTCC 20 16324 16339 685 826257 740 755 GCTCTGTGATGCGGTC 43 16325 16340 686 826258 759 774 TACAGGTCAAAGAGCG 52 16344 16359 687 826259 761 776 TGTACAGGTCAAAGAG 18 16346 16361 688 826260 762 777 TTGTACAGGTCAAAGA 41 16347 16362 689 826271 798 813 CGGGAGCCGGCCACGA 55 16383 16398 690 826272 800 815 TGCGGGAGCCGGCCAC 23 16385 16400 691 826273 803 818 GGCTGCGGGAGCCGGC 147 16388 16403 692 826274 804 819 CGGCTGCGGGAGCCGG 70 16389 16404 693 826275 805 820 ACGGCTGCGGGAGCCG 104 16390 16405 694 826276 807 822 CGACGGCTGCGGGAGC 101 16392 16407 695 826277 808 823 GCGACGGCTGCGGGAG 52 16393 16408 696 826278 810 825 TCGCGACGGCTGCGGG 52 16395 16410 697 826291 834 849 GGGTGCGGCAGAGTCC 46 16419 16434 698 826292 858 873 GGCGGGACCCTCAGGC 37 16443 16458 699 826293 877 892 ACGGGCCCCGTGAGGC 85 16462 16477 700
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827515 N/A N/A GGGAAGTAAGCCCTAG 47 27559 27574 1176 827516 N/A N/A GGCTGGAGATCTTTAG 34 27607 27622 1177 827517 N/A N/A CCCAAATCCCTACCAG 61 27623 27638 1178 827518 N/A N/A GTCATTATTGCTACTT 17 27675 27690 1179 827531 N/A N/A CAGAATAGCCGGGCGC 46 28650 28665 1180 827532 N/A N/A GGCAGACACGAGGGTC 40 28699 28714 1181 827533 N/A N/A CCATACGGATGAACCT 35 28741 28756 1182 827534 N/A N/A TACCATACGGATGAAC 20 28743 28758 1183 827535 N/A N/A CTACCATACGGATGAA 49 28744 28759 1184 827536 N/A N/A GCTACCATACGGATGA 23 28745 28760 1185 827537 N/A N/A TGCTACCATACGGATG 59 28746 28761 1186 827550 N/A N/A AGGGAATTAAGCCACA 13 29501 29516 1187 827551 N/A N/A GGATACACCAGTGTAA 32 29904 29919 1188 827552 N/A N/A AGCTAAGTCAGGCGAA 67 29930 29945 1189 827553 N/A N/A TATGAGTGTGCCTTTG 25 30329 30344 1190 827554 N/A N/A TTCAAGGTTGCAAGTG 41 30348 30363 1191 827555 N/A N/A AGCTAAGCCAGGGACA 67 30416 30431 1192 827556 N/A N/A GCCTTATGAGTGGCAG 54 30456 30471 1193 827557 N/A N/A CCACTTTACAAGAGCA 22 30492 30507 1194 827570 N/A N/A ATCAAGGTCACTCCCA 48 30959 30974 1195 827571 N/A N/A GAAGACCCATTCCTAG 78 30992 31007 1196 827572 N/A N/A CCATATCGATCCCTCT 132 31115 31130 1197 827573 N/A N/A GAATTTCCTGGACCTT 84 31142 31157 1198 827574 N/A N/A GAAATGGTAGAGGATG 46 31157 31172 1199 827575 N/A N/A AGGCACGACCTACCGT 139 31272 31287 1200 827576 N/A N/A CTCCATCCAGGCACGA 55 31280 31295 1201 827577 N/A N/A AAGTAAGACCCCCAGA 79 31306 31321 1202
Tabela 4:Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número do SEQ ID:1 SEQ ID:1 Sequência α-ENaC SEQ ID:2 SEQ ID SEQ composto Sítio de Sítio de (% controle) Sítio de 2:Sítio de ID Iniciação Parada Iniciação Parada NO 668182 535 550 CCAGAAGGCCGTCTTC 34 5463 5478 1203 668208 764 779 ATTTGTACAGGTCAAA 35 16349 16364 1204 668218 974 989 ATTTGTTCTGGTTGCA 19 17760 17775 1205 826072 7 22 GCTTTAGACGCAGACA 102 4268 4283 1206 826073 9 24 GGGCTTTAGACGCAGA 68 4270 4285 1207 826082 37 52 TGGACCTGAGAAGGCG 58 4298 4313 1208 826083 40 55 TACTGGACCTGAGAAG 66 4301 4316 1209 826084 42 57 AGTACTGGACCTGAGA 55 4303 4318 1210 826085 44 59 GGAGTACTGGACCTGA 55 4305 4320 1211 826086 45 60 GGGAGTACTGGACCTG 62 4306 4321 1212 826087 46 61 TGGGAGTACTGGACCT 81 4307 4322 1213 826088 47 62 CTGGGAGTACTGGACC 59 4308 4323 1214 826089 50 65 GAACTGGGAGTACTGG 81 4311 4326 1215 826092 62 77 CCGAGGGCAGGTGAAC 99 4323 4338 1216 826093 72 87 AGGAGGGCTCCCGAGG 81 4333 4348 1217 826102 94 109 GAGCCGGGAGTTTTCC 45 4355 4370 1218 826103 95 110 AGAGCCGGGAGTTTTC 71 4356 4371 1219 826104 98 113 GTCAGAGCCGGGAGTT 73 4359 4374 1220 826105 99 114 AGTCAGAGCCGGGAGT 73 4360 4375 1221 826106 100 115 GAGTCAGAGCCGGGAG 51 4361 4376 1222 826107 101 116 GGAGTCAGAGCCGGGA 53 4362 4377 1223 826108 138 153 AATTAAAGGTGAGCAG 67 4399 4414 1224 826109 143 158 ATCTCAATTAAAGGTG 91 4404 4419 1225 826112 164 179 AGCGACAGGAATCTCA 79 4425 4440 1226 826113 166 181 GAAGCGACAGGAATCT 68 4427 4442 1227 826122 181 196 GGCCGGCCAGGGATGG 41 4442 4457 1228 826123 182 197 TGGCCGGCCAGGGATG 55 4443 4458 1229 826124 183 198 CTGGCCGGCCAGGGAT 69 4444 4459 1230 826125 187 202 CCCGCTGGCCGGCCAG 32 4448 4463 1231 826126 188 203 GCCCGCTGGCCGGCCA 90 4449 4464 1232 826127 190 205 CCGCCCGCTGGCCGGC 58 4451 4466 1233 826128 192 207 GCCCGCCCGCTGGCCG 81 4453 4468 1234 826129 194 209 GAGCCCGCCCGCTGGC 57 4455 4470 1235 826132 217 232 ACAGGTGCAGCGGCCT 76 4478 4493 1236
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827384 N/A N/A GGATTCATTAAGATGG 23 21741 21756 1850 827385 N/A N/A GGGATTCATTAAGATG 31 21742 21757 1851 827386 N/A N/A AGGGATTCATTAAGAT 14 21743 21758 1852 827387 N/A N/A CAGGGATTCATTAAGA 30 21744 21759 1853 827388 N/A N/A ACAGGGATTCATTAAG 38 21745 21760 1854 827389 N/A N/A TACAGGGATTCATTAA 42 21746 21761 1855 827390 N/A N/A TTACAGGGATTCATTA 55 21747 21762 1856 827393 N/A N/A TACGATTACAGGGATT 11 21752 21767 1857 827402 N/A N/A GCTCACTAGTACGATT 43 21761 21776 1858 827403 N/A N/A AGCTCACTAGTACGAT 46 21762 21777 1859 827404 N/A N/A GCCTTAGTAAGAGCTG 29 21782 21797 1860 827405 N/A N/A AGTTACTTACTTAATC 28 21896 21911 1861 827406 N/A N/A GACCAAACAAGTTACT 21 21905 21920 1862 827407 N/A N/A GGACCAAACAAGTTAC 27 21906 21921 1863 827408 N/A N/A ATTAGATGTGGGACCA 17 21916 21931 1864 827411 N/A N/A TATGAGAATCAGTATA 56 22311 22326 1865 827412 N/A N/A CTATGAGAATCAGTAT 44 22312 22327 1866 827420 N/A N/A GGAGAAACACGGATGG 10 22743 22758 1867 827421 N/A N/A TTCCATCAGCGGTGGA 52 22756 22771 1868 827422 N/A N/A GGCACAAGTTCCATCA 23 22764 22779 1869 827423 N/A N/A AGGCACAAGTTCCATC 34 22765 22780 1870 827424 N/A N/A CAGGCACAAGTTCCAT 32 22766 22781 1871 827425 N/A N/A GCAGGCACAAGTTCCA 19 22767 22782 1872 827426 N/A N/A AGCAGGCACAAGTTCC 14 22768 22783 1873 827427 N/A N/A AAGCAGGCACAAGTTC 44 22769 22784 1874 827430 N/A N/A GTGCTGCCCCCATGGA 37 22785 22800 1875 827431 N/A N/A GGGACAAGTATAATGG 58 22804 22819 1876 827440 N/A N/A AAGCAGGTCATTGTTT 28 23071 23086 1877 827441 N/A N/A TGGTTGTACGGTCTCA 19 23086 23101 1878 827442 N/A N/A GCAAAGACGGAAAGGG 34 23180 23195 1879 827443 N/A N/A GCGACGGGAGCCAGGC 36 23194 23209 1880 827444 N/A N/A CTTGGAGCTAGCGACG 20 23204 23219 1881 827445 N/A N/A TGCTACCCTGCCATCT 24 23218 23233 1882 827446 N/A N/A TGCCACACGGCACAGA 64 23248 23263 1883 827447 N/A N/A GCAAATCACAGGTTCC 19 23302 23317 1884 827449 N/A N/A CATCAGTATGTCTCAG 18 23412 23427 1885 827450 N/A N/A GAGGAAGATCAGTACC 39 23451 23466 1886 827459 N/A N/A CCCTAACTGCCCATGC 20 23711 23726 1887 827460 N/A N/A CGGCATTGACTTCCGT 48 23775 23790 1888 827461 N/A N/A TCACACATCTACCTTC 34 23828 23843 1889 827462 N/A N/A TTTACTCACACTCCCT 24 23936 23951 1890 827463 N/A N/A CCTACAGGACTTGTGC 26 24009 24024 1891 827464 N/A N/A AGAGAGAGTAGGGTCA 64 24094 24109 1892 827465 N/A N/A TGAGAGTAATTCCTTA 50 24117 24132 1893 827466 N/A N/A CACCGTTGTTGATTCC 39 24212 24227 1894 827469 N/A N/A GCTCAAGGTAAGTACA 55 24276 24291 1895 827470 N/A N/A GCTCTAGGAGGTGAGC 83 24290 24305 1896 827479 N/A N/A TCCTACTGGCCTCGCC 49 25036 25051 1897 827480 N/A N/A TTCCAGGTTGTATCTC 53 25067 25082 1898 827481 N/A N/A ACATACACCAAGAGAT 16 25127 25142 1899 827482 N/A N/A CCTATGAACCCACATA 107 25138 25153 1900 827483 N/A N/A GGCTGCCACGGAATCA 50 25265 25280 1901 827484 N/A N/A ATACACAACCCCTCCA 104 25316 25331 1902 827485 N/A N/A GTGAATACACACCTGG 48 25442 25457 1903 827486 N/A N/A CCTCAGTGAGTACTGG 52 25602 25617 1904 827489 N/A N/A GCCTGCAGGTTGTTTT 56 26100 26115 1905 827490 N/A N/A TGAGGAACCGCTGGAG 41 26479 26494 1906 827499 N/A N/A TCCAAACTTTACTGAT 41 26787 26802 1907 827500 N/A N/A TAAGGAGGAGATTCCA 38 26809 26824 1908 827501 N/A N/A GTCCTATACCAGGATA 47 26823 26838 1909 827502 N/A N/A AGAGATTTGTCTAGTC 12 26836 26851 1910 827503 N/A N/A ACTCAACTGTAGTCAA 36 26858 26873 1911 827504 N/A N/A TGGCACACGACTTCCC 28 26883 26898 1912 827505 N/A N/A TGCAAACCCTTGCAGC 80 26942 26957 1913 827506 N/A N/A CACTACCATGTCCCCT 60 27075 27090 1914 827509 N/A N/A TGCGGAGCCAGCCCAG 43 27202 27217 1915 827510 N/A N/A CACGACTGGAAAGTCC 42 27232 27247 1916 827519 N/A N/A TAATGGAACTGTAGAT 31 27734 27749 1917 827520 N/A N/A TATATGATGATTGCAC 35 27883 27898 1918
827521 N/A N/A TGCCTGGCTTGAGTGA 47 27944 27959 1919 827522 N/A N/A GAGTACAAGGTTTATT 22 28237 28252 1920 827523 N/A N/A TGAGTACAAGGTTTAT 26 28238 28253 1921 827524 N/A N/A ATGAGTACAAGGTTTA 7 28239 28254 1922 827525 N/A N/A GACTTGCTAATGAGTA 36 28248 28263 1923 827526 N/A N/A GGACTTGCTAATGAGT 58 28249 28264 1924 827529 N/A N/A TTGGGACTTGCTAATG 53 28252 28267 1925 827530 N/A N/A GCTTGGGACTTGCTAA 43 28254 28269 1926 827538 N/A N/A TTGCTACCATACGGAT 23 28747 28762 1927 827539 N/A N/A ATTGCTACCATACGGA 38 28748 28763 1928 827540 N/A N/A TATTGCTACCATACGG 31 28749 28764 1929 827541 N/A N/A CTATTGCTACCATACG 17 28750 28765 1930 827542 N/A N/A GCTATTGCTACCATAC 31 28751 28766 1931 827543 N/A N/A CTGCTATTGCTACCAT 25 28753 28768 1932 827544 N/A N/A AGGCACTGCTATTGCT 42 28758 28773 1933 827545 N/A N/A CCATACAAGGGAGTGT 66 28799 28814 1934 827548 N/A N/A TGCTGCTAGGGATGTA 45 29051 29066 1935 827549 N/A N/A ACCCATTAAGATGTGT 92 29468 29483 1936 827558 N/A N/A CCACACCCAAGAGGTC 42 30527 30542 1937 827559 N/A N/A TCCTAGGGCACCTCAG 100 30554 30569 1938 827560 N/A N/A TAGCAGTACCCTGTGG 56 30590 30605 1939 827561 N/A N/A GGACACTAACCTGCAT 47 30669 30684 1940 827562 N/A N/A ACCCAACCTGTACCCG 57 30692 30707 1941 827563 N/A N/A GGCTCGGTAACCTGTA 56 30712 30727 1942 827564 N/A N/A TCCCAAATGCTTGGCT 58 30724 30739 1943 827565 N/A N/A GGCCACAGCATTACAT 100 30879 30894 1944 827568 N/A N/A GGCTTACAGGGATAGG 61 30934 30949 1945 827569 N/A N/A CCCATATGCTTCAGGC 61 30947 30962 1946 827578 N/A N/A CCGACAGCCGCCCTGC 43 31323 31338 1947 827579 N/A N/A GGCCGAGCTCCTTCTT 71 31435 31450 1948 827580 N/A N/A ACCTTATGCCCCGGCC 56 31447 31462 1949 827581 N/A N/A CCCCAGAGACCTTATG 69 31455 31470 1950 827582 N/A N/A ACTGATAACTGGCCCA 58 31549 31564 1951 827583 N/A N/A CACCAAGCTGTCTCCC 50 31655 31670 1952 827584 N/A N/A GACGATGGGACAGAGG 76 31711 31726 1953 827585 N/A N/A GAGGAGAGGTACATTG 60 31726 31741 1954
Tabela 5:Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número do SEQ ID:1 SEQ ID:1 Sequência α-ENaC SEQ ID:2 SEQ ID SEQ ID composto Sítio de Sítio de (% controle) Sítio de 2:Sítio de NO Iniciação Parada Iniciação Parada 797469 N/A N/A GGATGATGTGATACAT 5 18734 18749 400 797524 N/A N/A ACCATACGGATGAACC 23 28742 28757 455 826071 5 20 TTTAGACGCAGACAGG 85 4266 4281 466 826074 25 40 GGCGGACTCTGGGCAG 74 4286 4301 611 826075 28 43 GAAGGCGGACTCTGGG 81 4289 4304 612 826076 29 44 AGAAGGCGGACTCTGG 82 4290 4305 613 826077 31 46 TGAGAAGGCGGACTCT 85 4292 4307 614 826078 32 47 CTGAGAAGGCGGACTC 70 4293 4308 615 826079 33 48 CCTGAGAAGGCGGACT 79 4294 4309 616 826091 53 68 GGTGAACTGGGAGTAC 111 4314 4329 468 826094 73 88 AAGGAGGGCTCCCGAG 66 4334 4349 618 826095 74 89 GAAGGAGGGCTCCCGA 90 4335 4350 619 826096 81 96 TCCGAAGGAAGGAGGG 81 4342 4357 620 826097 83 98 TTTCCGAAGGAAGGAG 95 4344 4359 621 826098 85 100 GTTTTCCGAAGGAAGG 69 4346 4361 622 826099 88 103 GGAGTTTTCCGAAGGA 105 4349 4364 623 826111 163 178 GCGACAGGAATCTCAT 90 4424 4439 470 826114 167 182 GGAAGCGACAGGAATC 60 4428 4443 626 826115 169 184 ATGGAAGCGACAGGAA 63 4430 4445 627 826116 170 185 GATGGAAGCGACAGGA 53 4431 4446 628 826117 171 186 GGATGGAAGCGACAGG 78 4432 4447 629 826118 172 187 GGGATGGAAGCGACAG 38 4433 4448 630 826119 175 190 CCAGGGATGGAAGCGA 56 4436 4451 631 826131 216 231 CAGGTGCAGCGGCCTG 116 4477 4492 472 826134 226 241 GTTCCCCTGACAGGTG 84 N/A N/A 634
826135 228 243 TTGTTCCCCTGACAGG 70 N/A N/A 635 826136 229 244 CTTGTTCCCCTGACAG 60 N/A N/A 636 826137 230 245 GCTTGTTCCCCTGACA 16 N/A N/A 637 826138 232 247 CAGCTTGTTCCCCTGA 52 N/A N/A 638 826139 233 248 CCAGCTTGTTCCCCTG 61 N/A N/A 639 826151 283 298 CCCCTCCATGAGACCT 26 5211 5226 474 826154 292 307 CAGCTTGTTCCCCTCC 14 5220 5235 642 826155 310 325 GCTAGAGTCCTGCTCC 43 5238 5253 643 826156 312 327 GGGCTAGAGTCCTGCT 78 5240 5255 644 826157 315 330 GGAGGGCTAGAGTCCT 94 5243 5258 645 826158 320 335 ACTGTGGAGGGCTAGA 67 5248 5263 646 826159 321 336 GACTGTGGAGGGCTAG 92 5249 5264 647 826171 355 370 CTCACGCTTGTTCCCC 34 5283 5298 476 826174 360 375 TGCTCCTCACGCTTGT 13 5288 5303 650 826175 362 377 CCTGCTCCTCACGCTT 40 5290 5305 651 826176 363 378 CCCTGCTCCTCACGCT 20 5291 5306 652 826177 386 401 GCGCCGCAGGTTCGGG 49 5314 5329 653 826178 405 420 TCCGCCGTGGGCTGCT 44 5333 5348 654 826179 407 422 CCTCCGCCGTGGGCTG 36 5335 5350 655 826191 441 456 CGGTAGGAGCGGTGGA 55 5369 5384 478 826194 446 461 GCTCTCGGTAGGAGCG 60 5374 5389 658 826195 448 463 GAGCTCTCGGTAGGAG 61 5376 5391 959 826196 451 466 GAAGAGCTCTCGGTAG 48 5379 5394 660 826197 453 468 TCGAAGAGCTCTCGGT 36 5381 5396 661 826198 456 471 AACTCGAAGAGCTCTC 36 5384 5399 662 826199 457 472 GAACTCGAAGAGCTCT 49 5385 5400 663 826210 566 581 TCATGCCAAAGGTGCA 27 5494 5509 480 826213 575 590 GCCAGTACATCATGCC 9 5503 5518 666 826214 577 592 TTGCCAGTACATCATG 40 5505 5520 667 826215 580 595 GAATTGCCAGTACATC 36 5508 5523 668 826216 581 596 CGAATTGCCAGTACAT 26 5509 5524 669 826217 582 597 CCGAATTGCCAGTACA 24 5510 5525 670 826218 585 600 AGGCCGAATTGCCAGT 54 5513 5528 671 826230 607 622 GCTGAAGTACTCTCCG 47 5535 5550 482 826233 626 641 TGTTGAGGCTGACGGG 5 5554 5569 674 826234 628 643 GATGTTGAGGCTGACG 31 5556 5571 675 826235 639 654 GAGTTGAGGTTGATGT 34 5567 5582 676 826236 641 656 CCGAGTTGAGGTTGAT 22 5569 5584 677 826237 643 658 GTCCGAGTTGAGGTTG 30 5571 5586 678 826238 644 659 TGTCCGAGTTGAGGTT 35 5572 5587 679 826250 703 718 AATTTCCGGGTACCTG 29 16288 16303 484 826253 731 746 TGCGGTCCAGCTCCTC 17 16316 16331 682 826254 734 749 TGATGCGGTCCAGCTC 41 16319 16334 683 826255 737 752 CTGTGATGCGGTCCAG 49 16322 16337 684 826256 739 754 CTCTGTGATGCGGTCC 21 16324 16339 685 826257 740 755 GCTCTGTGATGCGGTC 26 16325 16340 686 826258 759 774 TACAGGTCAAAGAGCG 24 16344 16359 687 826268 792 807 CCGGCCACGAGAGTGG 93 16377 16392 486 826271 798 813 CGGGAGCCGGCCACGA 36 16383 16398 690 826272 800 815 TGCGGGAGCCGGCCAC 39 16385 16400 691 826273 803 818 GGCTGCGGGAGCCGGC 61 16388 16403 692 826274 804 819 CGGCTGCGGGAGCCGG 71 16389 16404 693 826275 805 820 ACGGCTGCGGGAGCCG 90 16390 16405 694 826276 807 822 CGACGGCTGCGGGAGC 68 16392 16407 695 826288 830 845 GCGGCAGAGTCCCCCG 62 16415 16430 488 826291 834 849 GGGTGCGGCAGAGTCC 22 16419 16434 698 826292 858 873 GGCGGGACCCTCAGGC 38 16443 16458 699 826293 877 892 ACGGGCCCCGTGAGGC 46 16462 16477 700 826294 879 894 CGACGGGCCCCGTGAG 54 16464 16479 701 826295 882 897 GCTCGACGGGCCCCGT 37 16467 16482 702 826296 883 898 GGCTCGACGGGCCCCG 46 16468 16483 703 826308 916 931 GTTGTTGTCCCGCAAG 24 16501 16516 490 826311 952 967 GAAGCCGATCTTCCAG 22 16537 16552 706 826312 953 968 GGAAGCCGATCTTCCA 72 16538 16553 707 826313 954 969 TGGAAGCCGATCTTCC 71 16539 16554 708 826314 956 971 GCTGGAAGCCGATCTT 37 16541 16556 709 826315 958 973 CAGCTGGAAGCCGATC 59 16543 16558 710 826316 968 983 TCTGGTTGCACAGCTG 30 N/A N/A 711 826326 980 995 AGTCCGATTTGTTCTG 36 17766 17781 492
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827137 N/A N/A GGTTACACCCCCGGCG 44 11650 11665 567 827140 N/A N/A CCCACAGAAAACGGAA 74 11690 11705 1025 827141 N/A N/A GGCTGCTGCATGATTC 33 11738 11753 1026 827142 N/A N/A ACCAGAATAGATTCAC 63 11766 11781 1027 827143 N/A N/A TCGAATCGAGTGCCCC 40 11791 11806 1028 827144 N/A N/A AACAATGAACCTCGAA 51 11802 11817 1029 827145 N/A N/A TGGTATTAGAATGTAC 19 11881 11896 1030 827157 N/A N/A TTGAAAGAGCCCCCAC 65 12166 12181 569 827160 N/A N/A GTGCAGGGTCTTACTT 19 12230 12245 1033 827161 N/A N/A AAATACCAGTGCAGGG 41 12238 12253 1034 827162 N/A N/A GTACATCAATTATGCC 36 12268 12283 1035 827163 N/A N/A GGGCACTCAAGATTTG 62 12295 12310 1036 827164 N/A N/A CAAACCTGAGTGGGCA 36 12306 12321 1037 827165 N/A N/A CTCGACTGTCAAACCT 30 12315 12330 1038 827177 N/A N/A GCAATCATAGCTAGCA 57 12729 12744 571 827180 N/A N/A GTTGAAGGTGTGTGTT 35 13095 13110 1041 827181 N/A N/A AGCAACTCAAAGGTGT 22 13111 13126 1042 827182 N/A N/A AGATTTGTACATGAGG 30 13481 13496 1043 827183 N/A N/A ACCCGAAACACATTAG 61 13504 13519 1044 827184 N/A N/A GTTTAGGCCGCACCCG 36 13515 13530 1045 827185 N/A N/A ATTTACGGTGTTTAGG 42 13524 13539 1046 827197 N/A N/A GTAGGCACTTTATGAA 68 14142 14157 573 827200 N/A N/A AACCGTATGTAGTAGG 18 14153 14168 1049 827201 N/A N/A CAACCGTATGTAGTAG 25 14154 14169 1050 827202 N/A N/A ACAACCGTATGTAGTA 40 14155 14170 1051 827203 N/A N/A AACAACCGTATGTAGT 36 14156 14171 1052 827204 N/A N/A GAACAACCGTATGTAG 39 14157 14172 1053 827216 N/A N/A GGAGAGACAATAGATC 50 14488 14503 575 827219 N/A N/A TGACATACTGCTTCTA 33 14642 14657 1056 827220 N/A N/A CCCCAGCAGGTATTTT 98 14667 14682 1057 827221 N/A N/A CCCAAGCAATCACCAG 61 14737 14752 1058 827222 N/A N/A GACCAAAAGTGTGCCA 54 14831 14846 1059 827223 N/A N/A GACACAATCGCCGCTC 64 14905 14920 1060 827224 N/A N/A GAATAAGTGGAGATAT 84 15017 15032 1061 827236 N/A N/A CCGCAGGCGAGTGTCG 61 15878 15893 577 827239 N/A N/A CCGGACCTAGAAGGGA 89 15987 16002 1064 827240 N/A N/A GGCCACGGCGAGCCCA 82 16080 16095 1065 827241 N/A N/A GTAAACAGGTGTGTCC 48 16110 16125 1066 827242 N/A N/A CTGGAGCGAGTGTCTG 93 16238 16253 1067 827243 N/A N/A GCGGAGCCCATGGGTG 52 16616 16631 1068 827244 N/A N/A TGTCACTGGGCTGCGC 41 16650 16665 1069 827256 N/A N/A CAAGAGATTTGTCCCA 67 17420 17435 579 827259 N/A N/A ATTTATACCTCCCCTG 60 17495 17510 1072 827260 N/A N/A CACACACGGTTTTGGT 26 17513 17528 1073 827261 N/A N/A GACCAGTAGCTGCACA 34 17527 17542 1074 827262 N/A N/A ATTAAGGGAGTTGCAG 61 17555 17570 1075 827263 N/A N/A CCCTAGGAGCATGGAC 47 17585 17600 1076 827264 N/A N/A GCAGAAGTCCCTAGGA 61 17593 17608 1077 827276 N/A N/A CCTCAGATCCAGCAGT 49 18147 18162 581 827279 N/A N/A AGATCCATGCTTCCAG 11 18216 18231 1080 827280 N/A N/A AAGATCCATGCTTCCA 17 18217 18232 1081 827281 N/A N/A CCAAGATCCATGCTTC 20 18219 18234 1082 827282 N/A N/A ACCAAGATCCATGCTT 35 18220 18235 1083 827283 N/A N/A GACCAAGATCCATGCT 13 18221 18236 1084 827295 N/A N/A GATACATCCAGAGTCA 36 18725 18740 583 827298 N/A N/A AGGATGATGTGATACA 24 18735 18750 1087 827299 N/A N/A AAGGATGATGTGATAC 36 18736 18751 1088 827300 N/A N/A ATCTAAGAAATAGGCT 29 18755 18770 1089 827301 N/A N/A CACATAGCCCAGATAG 21 18834 18849 1090 827302 N/A N/A TGCCAAAGGAGCATGG 52 18901 18916 1091 827314 N/A N/A GGAGATGGCTCCGGAA 63 19278 19293 585 827317 N/A N/A GGTAAGAAGTGACACC 62 19364 19379 1094 827318 N/A N/A GTGTACTGGGCAGAGT 16 19390 19405 1095 827319 N/A N/A TGCTACCATCTTACTT 26 19463 19478 1096 827320 N/A N/A GGCTTAGGTGTTGCTA 28 19474 19489 1097 827321 N/A N/A GCGGACTCAGGCTTAG 50 19483 19498 1098 827322 N/A N/A TGACAGGTGTGGGCGG 46 19495 19510 1099 827334 N/A N/A AACCATGGACTTTCTG 46 19687 19702 587 827337 N/A N/A CCCAGGCGAGCAATGA 49 19746 19761 1102
827338 N/A N/A GGTATAACAACCCAGG 34 19756 19771 1103 827339 N/A N/A CAGTAGGGTGGAGTGG 41 19774 19789 1104 827340 N/A N/A GTACAAAGGTTCCTGT 48 19829 19844 1105 827341 N/A N/A CGTGAAGTAAGGTTGA 25 19846 19861 1106 827342 N/A N/A GTTACATGTGGTGACG 43 19860 19875 1107 827353 N/A N/A ACTAACTGGAATAGTT 99 19873 19888 589 827356 N/A N/A AGGACTAACTGGAATA 15 19876 19891 1110 827357 N/A N/A CAGGACTAACTGGAAT 31 19877 19892 1111 827358 N/A N/A GCCCGGTGAGATATTC 55 19923 19938 1112 827359 N/A N/A CCCGATAGCTGGTTGT 11 20415 20430 1113 827360 N/A N/A TTAATTAGTTCACCCG 4 20427 20442 1114 827361 N/A N/A AGTGAATCCTCACACT 88 20444 20459 1115 827373 N/A N/A AAAAAGGTGGTGTATC 80 21111 21126 591 827376 N/A N/A TCATAGGTAAACACCC 14 21565 21580 1118 827377 N/A N/A GAAAAGTCTGGTAGCT 23 21628 21643 1119 827378 N/A N/A TGGTGTGACCATTTGG 9 21643 21658 1120 827379 N/A N/A ATGGTGTGACCATTTG 15 21644 21659 1121 827380 N/A N/A AAATGGTGTGACCATT 46 21646 21661 1122 827381 N/A N/A TAAATGGTGTGACCAT 25 21647 21662 1123 827392 N/A N/A CGATTACAGGGATTCA 15 21750 21765 593 827394 N/A N/A GTACGATTACAGGGAT 11 21753 21768 1125 827395 N/A N/A AGTACGATTACAGGGA 8 21754 21769 1126 827396 N/A N/A TAGTACGATTACAGGG 29 21755 21770 1127 827397 N/A N/A CTAGTACGATTACAGG 23 21756 21771 1128 827398 N/A N/A ACTAGTACGATTACAG 15 21757 21772 1129 827399 N/A N/A CACTAGTACGATTACA 39 21758 21773 1130 827410 N/A N/A GAATCAGTATAATGTG 16 22306 22321 595 827413 N/A N/A CCTATGAGAATCAGTA 14 22313 22328 1133 827414 N/A N/A GCCTATGAGAATCAGT 13 22314 22329 1134 827415 N/A N/A CTATAGTGGCCTATGA 33 22322 22337 1135 827416 N/A N/A GATACACACTAAGCAC 22 22342 22357 1136 827417 N/A N/A AGATACACACTAAGCA 29 22343 22358 1137 827429 N/A N/A CTGCCCCCATGGAAAG 70 22782 22797 597 827432 N/A N/A GGTGAGCCCTTCGCAC 3 22828 22843 1140 827433 N/A N/A TGAAGGAGAGGCTACA 45 22866 22881 1141 827434 N/A N/A ATTCTAGGATGTACTG 36 22926 22941 1142 827435 N/A N/A GTGACATACTGGTGCA 3 22943 22958 1143 827436 N/A N/A GGGATATTCCACTGGC 29 22983 22998 1144 827437 N/A N/A AACTAGGTGATCCGGG 11 22996 23011 1145 827448 N/A N/A CTGCAGTAGGACTGCA 111 23326 23341 598 827451 N/A N/A GGTGAGCACGGAGCTG 14 23471 23486 1148 827452 N/A N/A GGAGAAAGTGTGACCA 56 23489 23504 1149 827453 N/A N/A GAGCAGGGTTAAAGGA 49 23502 23517 1150 827454 N/A N/A TGTCATCTAGGAGATA 70 23597 23612 1151 827455 N/A N/A TTGCATAGATCCTGTC 35 23609 23624 1152 827456 N/A N/A CTTGATGACAGGAGCC 38 23660 23675 1153 827468 N/A N/A CGCCATGGAGCAAGCA 67 24238 24253 600 827471 N/A N/A GGACTATGTGGCACCT 47 24342 24357 1156 827472 N/A N/A TGGCAACCCCTGAGCT 59 24412 24427 1157 827473 N/A N/A GTTCAGGAAGACCCGC 65 24437 24452 1158 827474 N/A N/A GCAGAGGCGGGAATCC 49 24524 24539 1159 827475 N/A N/A CATCAGGGACAGACCT 43 24564 24579 1160 827476 N/A N/A CTGCAATCTGAGGCGC 58 24761 24776 1161 827488 N/A N/A GGACAATTCCTTGACA 36 26078 26093 602 827491 N/A N/A ACCTTAGGAGCCATTG 18 26493 26508 1164 827492 N/A N/A ACCCATGTATCTTCTA 44 26627 26642 1165 827493 N/A N/A AATGAGACAGACCCAT 42 26637 26652 1166 827494 N/A N/A GGATACAGTATGTCCA 52 26685 26700 1167 827495 N/A N/A CTCTACTATTGAATGG 45 26699 26714 1168 827496 N/A N/A ATTATATACCTCTACT 58 26708 26723 1169 827508 N/A N/A AGGTAGGGATGGACGC 38 27147 27162 604 827511 N/A N/A CCAGGAGGCCACGACT 32 27241 27256 1172 827512 N/A N/A TACAATCCTCTAAGGT 47 27271 27286 1173 827513 N/A N/A CTGTATACCCTGGGAC 41 27378 27393 1174 827514 N/A N/A TCTCAGCAATCAATAT 75 27490 27505 1175 827515 N/A N/A GGGAAGTAAGCCCTAG 22 27559 27574 1176 827516 N/A N/A GGCTGGAGATCTTTAG 36 27607 27622 1177 827528 N/A N/A TGGGACTTGCTAATGA 42 28251 28266 606 827531 N/A N/A CAGAATAGCCGGGCGC 36 28650 28665 1180
827532 N/A N/A GGCAGACACGAGGGTC 31 28699 28714 1181 827533 N/A N/A CCATACGGATGAACCT 24 28741 28756 1182 827534 N/A N/A TACCATACGGATGAAC 31 28743 28758 1183 827535 N/A N/A CTACCATACGGATGAA 38 28744 28759 1184 827547 N/A N/A GGTGATGTCACTTCGG 8 29031 29046 608 827550 N/A N/A AGGGAATTAAGCCACA 8 29501 29516 1187 827551 N/A N/A GGATACACCAGTGTAA 43 29904 29919 1188 827552 N/A N/A AGCTAAGTCAGGCGAA 38 29930 29945 1189 827553 N/A N/A TATGAGTGTGCCTTTG 42 30329 30344 1190 827554 N/A N/A TTCAAGGTTGCAAGTG 24 30348 30363 1191 827555 N/A N/A AGCTAAGCCAGGGACA 59 30416 30431 1192 827567 N/A N/A GGATAGGGTTGTGTCA 96 30925 30940 610 827570 N/A N/A ATCAAGGTCACTCCCA 65 30959 30974 1195 827571 N/A N/A GAAGACCCATTCCTAG 69 30992 31007 1196 827572 N/A N/A CCATATCGATCCCTCT 67 31115 31130 1197 827573 N/A N/A GAATTTCCTGGACCTT 64 31142 31157 1198 827574 N/A N/A GAAATGGTAGAGGATG 82 31157 31172 1199 827575 N/A N/A AGGCACGACCTACCGT 124 31272 31287 1200 Exemplo 2: Efeito de oligonucleotídeos modificados complementares a α-ENaC em células Hep3B em várias doses
[00249] Os oligonucleotídeos selecionados listados no Exemplo 1 foram testados em várias doses em células Hep3B. As células foram plaqueadas a uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletro- poração com 148, 444, 1. 333 ou 4. 000 nM de oligonucleotídeo modificado, conforme especificado nas tabelas abaixo. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA total foi isolado e analisado como descrito no Exemplo 1. Como ilustrado nas tabelas abaixo, os níveis de mRNA de α-ENaC foram reduzidos de maneira dependente da dose em células tratadas com um oligonucleotídeo modificado complementar a um ácido nucleico de α-ENaC. Tabela 6: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano Número do composto Expressão de α-ENaC (% controle) 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM 797192 39 30 13 8 797235 68 13 6 5 797294 41 25 13 5 797495 16 17 23 12 797501 34 21 20 3 797507 25 14 5 8 826229 74 17 8 4 826249 86 24 8 6 826683 80 64 40 15 826761 53 11 9 5 826799 40 26 12 7
Tabela 7: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797469 78 49 24 16 797501 46 29 40 20 826232 40 43 16 7 826233 74 49 19 28 826626 70 51 38 9 826743 75 43 25 12 826763 65 25 24 7 826764 58 43 34 25 826784 81 50 16 15 826819 42 26 15 3 826821 73 51 29 10 826878 38 32 22 2 826880 35 30 11 17 827179 50 28 8 5 827199 39 14 18 9 827278 33 22 10 9 827393 48 23 9 6 827432 59 49 18 7 827550 77 53 38 14
Tabela 8: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797501 27 17 10 5 826213 35 23 16 9 826411 57 30 23 7 826451 80 59 30 27 826508 55 42 25 11 826668 34 27 13 16 826687 69 34 29 6 826688 43 22 6 4 826746 34 21 21 9 826785 39 23 9 4 827042 57 30 18 15 827081 37 11 6 3 827200 35 19 11 7 827280 19 15 7 4 827318 51 21 11 11 827378 44 29 8 12 827395 44 22 19 4 827414 54 27 15 14 827435 28 19 7 3
Tabela 9: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797309 53 15 12 8 797501 24 20 16 11 826334 65 43 26 23 826392 46 26 25 5 826393 57 12 12 7 826394 51 32 16 17 826591 44 14 13 6 826631 22 10 9 2 826632 38 22 13 14 826689 54 33 17 10 826809 21 12 10 2 826825 41 23 18 3
Tabela 10: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797304 55 31 17 7 797308 28 19 7 14 797494 44 35 14 11 797501 56 26 12 17 826259 79 40 19 8 826514 54 53 32 25 826655 65 46 32 18 826711 51 28 30 12 826828 57 35 18 4 826906 72 20 22 24 827148 74 47 34 23 827284 34 22 13 5 827382 53 31 27 18 827383 69 60 37 23 827419 33 18 13 5 827420 71 34 20 12 827497 46 14 11 9 827498 56 34 24 13 827518 65 33 15 14
Tabela 11: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797501 44 33 16 6 826183 57 38 13 10 826202 77 35 25 5 826241 43 36 25 18
Tabela 12: Nível percentual de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797131 55 27 15 7 797497 56 31 28 13 797501 34 23 24 5 826659 50 40 13 5 826678 44 25 23 9 826776 71 34 24 9 826794 52 25 18 9 826891 50 32 18 9 827131 100 63 44 10 827151 32 29 12 10 827270 54 33 23 11 827288 42 35 20 5 827289 65 33 21 7 827309 79 45 30 7 827348 69 54 33 10 827368 63 35 22 7 827386 85 46 19 6 827502 55 21 12 11 827524 78 39 26 14
Tabela 13: Nível percentual de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM
797264 59 30 28 5 797312 63 44 28 11 797501 47 12 6 3 826168 87 58 16 11 826169 65 29 15 13 826403 66 35 18 13 826484 65 46 23 11 826660 60 53 22 7 826679 60 46 35 14 826718 68 51 40 6 826796 66 61 36 9 826816 104 53 26 10 827035 57 28 25 9 827134 112 57 31 33 827175 43 39 13 7 827254 53 36 24 6 827408 53 28 21 15 827426 79 34 23 9 827447 35 18 13 10
Tabela 14: Nível percentual de α-ENaC humano
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM 797469 81 55 24 17 797501 26 25 41 21 826232 39 32 14 5 826233 88 58 23 29 826626 59 53 39 8 826743 83 47 23 10 826763 77 24 20 9 826764 33 45 37 26 826784 44 47 16 15 826819 40 24 10 2 826821 81 52 31 11
Tabela 15: Nível percentual de α-ENaC humano Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM 797131 58 28 16 7 797497 61 34 30 14 797501 37 24 26 5 826659 54 42 14 5 826678 47 26 25 9 826776 76 36 26 10 826794 57 28 19 10 826891 54 34 19 10 827131 109 69 48 10 827151 34 32 13 11 827270 57 35 25 11 827288 45 37 21 6 827289 71 36 23 8 827309 84 48 32 8 827348 73 58 35 11 827368 67 38 23 7 827386 92 50 21 7 827502 60 24 13 12 827524 83 41 28 15 Exemplo 3: Efeito de várias doses de oligonucleotídeos modificados complementares ao α-ENaC humano in vitro via absorção livre
[00250] Os oligonucleotídeos selecionados foram testados em várias doses em células A431 por absorção livre. As células foram plaqueadas a uma densidade de 10. 000 células por poço com 16, 49, 148, 1.333 ou 4.000 nM de oligonucleotídeo modificado, conforme especificado nas tabelas abaixo.
Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA total foi isolado e analisado como no Exemplo 1. Como ilustrado nas tabelas abaixo, os níveis de mRNA de α-ENaC foram reduzidos de maneira dependente da dose em células tratadas com um oligonucleotídeo modifi- cado complementar a um ácido nucleico de α-ENaC.
Tabela 16: Nível de mRNA α-ENaC em células A431
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 16 nM 49 nM 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM IC50 (µM)
797236 129 92 50 31 18 6 0,23 797308 89 66 27 13 9 4 0,08 797313 94 82 47 25 15 9 0,17 797468 90 77 55 30 19 11 0,19 797495 50 26 11 3 8 7 0,01 826632 76 75 61 28 22 11 0,22 826743 85 81 57 28 23 19 0,22 826763 73 55 35 16 14 8 0,06 826819 85 87 73 58 44 38 1,06 826906 85 75 52 30 17 9 0,16
Tabela 17: Nível de mRNA α-ENaC em células A431
Expressão de α-ENaC (% controle) Número do composto 16 nM 49 nM 148 nM 444 nM 1.333 nM 4.000 nM IC50 (µM)
827030 109 98 78 55 41 35 0,97 827200 100 85 79 55 50 38 1,23 827288 85 71 53 33 13 21 0,16 827307 68 58 33 14 5 2 0,06 827347 66 47 18 5 2 1 0,04 827359 56 45 27 11 6 4 0,03 827372 47 22 7 3 1 1 0,01 827392 76 44 18 7 4 3 0,04 827414 79 60 38 17 8 5 0,08 827497 64 49 24 8 6 5 0,04
Exemplo 4: Tolerabilidade de oligonucleotídeos modificados comple- mentares ao α-ENaC humano em camundongos CD1 após adminis-
tração sistêmica
[00251] Camundongos CD1® (Charles River, MA) são um modelo de camundongos multiuso, frequentemente usados para teste de segurança e eficácia. Os camundongos foram tratados com oligonucleotídeos modifica- dos selecionados a partir de estudos acima descritos e avaliados para alte- rações nos níveis de vários marcadores químicos do plasma. Tratamento
[00252] Grupos de camundongos CD1 machos com 6-8 semanas de idade foram injetados subcutaneamente uma vez por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de um oligonucleotídeo modificado listado nas ta- belas abaixo (dose de 50 mg/kg/semana). Cada grupo continha 4 camun- dongos. Um grupo de camundongos CD1 machos de idade foi injetado por via subcutânea uma vez por semana durante 6 semanas com PBS. Os ca- mundongos foram sacrificados 48 horas após a última dose, e órgãos e plasma foram colhidos para análise adicional. Marcadores químicos do plasma
[00253] Para avaliar o efeito dos oligonucleotídeos modificados na função hepática e renal, os níveis plasmáticos das transaminases, albumina, BUN e bilirrubina foram medidos, usando um analisador de química clínica auto- matizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados nas tabelas abaixo mostram que a maioria dos oligonucleotídeos modificados testados foram bem tolerados quando administrados sistemicamente, com níveis de ALT e AST abaixo de aproximadamente 200 IU/L e albumina, BUN, creatina e bilirrubina total dentro de limites aceitáveis. Tabela 18: Níveis de marcadores químicos no plasma No de Composto ALT (IU/L) AST (IU/L) Albumina BUN Creatina T. Bil. PBS 34,8 39,8 2,83 25,0 ,065 ,195 797131 167,8 162,0 2,39 21,6 ,055 ,188 797236 70,5 93,8 2,78 24,8 ,057 ,183 797258 1061,3 1077,8 2,91 25,8 ,060 ,250 797262 244,5 324,0 2,54 27,9 ,045 ,165 797264 484,0 247,3 2,92 26,1 ;080 ,178 797266 641,3 330,3 3,05 24,7 ;070 ,180 797289 218,8 175,5 2,66 21,8 ;065 ,148
797293 921,5 638,5 2,85 27,1 ;080 ,208 797294 248,5 226,0 2,99 23,1 ;043 ,268 797295 1262,8 954,3 3,01 22,7 ;063 ,408 797304 252,3 208,8 2,70 23,0 ;060 ,208 797307 151,3 123,8 2,97 25,6 ;093 ,198 797308 65,8 114,3 2,71 22,8 ;070 ,158 797312 1630,5 862,8 3,40 25,2 ;135 ,315 797313 46,3 77,0 3,15 23,4 ;140 ,203 797340 558,3 316,0 3,26 28,6 ;143 ,263 797444 224,0 285,8 2,23 27,6 ;048 ,205 797466 433,5 446,3 2,79 22,4 ;093 ,138 797468 87,0 101,8 2,94 23,4 ;120 ,145 797495 45,8 121,8 3,62 24,0 ;148 ,263 797497 61,0 78,0 2,95 24,3 ;125 ,148 797500 43,8 59,3 3,11 24,2 ;118 ,193 797501 546,0 500,8 2,82 25,6 ;115 ,303 797507 65,5 89,8 3,03 22,8 ;090 ,168 797508 120,5 188,3 2,41 23,9 ;055 ,155 797523 237,3 168,8 3,48 25,4 ;110 ,170
Tabela 19:Níveis de marcadores químicos no plasma No de Composto ALT AST Albumina BUN Creatina T.
Bil. (IU/L) (IU/L) PBS 54,0 59,5 2,81 25,8 ,080 ,193 797192 2079,8 889,5 3,26 25,2 ,125 ,793 797309 112,5 91,5 2,91 22,5 ,078 ,165 797469 3698,3 3053,3 3,80 20,1 ,148 ,188 826183 n. d. n. d. n. d. n. d. n.d. n.d. 826262 236,8 196,8 2,45 21,9 ,058 ,195 826393 116,8 89,8 2,85 20,5 ,070 ,168 826394 466,0 196,3 2,81 23,1 ,068 ,218 826558 126,8 117,3 2,97 21,6 ,080 ,155 826631 1073,5 1267,0 2,61 19,0 ,040 ,275 826632 113,3 129,5 2,94 22,4 ,085 ,173 826655 1349,8 754,5 3,13 21,1 .123 6,315 826687 1174,0 647,0 2,85 20,0 ,075 ,178 826688 430,0 362,0 3,38 22,5 ,100 ,215 826743 115,0 111,8 2,94 21,6 ,085 ,160 826753 58,0 70,0 2,68 24,5 ,070 ,138 826763 77,0 89,3 2,97 22,9 ,083 ,203 826776 1685,8 1027,0 2,55 20,7 ,058 .248 826793 1306,3 563,5 2,85 18,8 ,065 ,250 826796 1552,5 740,8 3,29 19,5 ,088 ,453 826811 439,3 347,5 3,00 19,5 ,085 ,438 826819 297,0 146,8 2,88 26,6 ,125 ,163 826828 559,0 314,0 2,71 17,4 ,060 ,170 826906 41,0 56,5 2,98 22,5 ,093 ,163 827030 44,0 55,8 3,04 20,0 ,093 ,180 827035 n. d. n. d. n. d. n. d. n.d. n.d.
Tabela 20:Níveis de marcadores químicos no plasma No deComposto ALT (IU/L) AST (IU/L) Albumina BUN Creatina T. Bil.
PBS 45,0 53,0 2,80 25,5 ,065 ,255 827148 33,5 52,3 2,63 23,8 ,080 ,223 827150 n. d. n. d. n. d. n. d. n.d. n.d. 827175 123,8 246,8 2,50 26,1 ,078 ,218 827200 61,5 51,0 2,79 27,1 ,058 ,195 827254 155,3 161,5 2,77 26,9 ,068 ,265 827288 65,8 59,5 2,77 22,5 ,068 ,280 827307 55,5 61,0 2,70 26,3 ,053 ,203 827347 52,5 60,0 2,72 25,9 ,063 ,140 827348 284,5 197,5 2,99 21,9 ,070 ,330 827359 65,8 72,8 2,60 22,7 ,063 ,210 827360 45,8 52,8 2,68 24,1 ,088 ,188 827372 49,0 51,5 2,73 24,7 ,053 ,213 827382 33,3 45,8 2,69 22,0 ,048 ,183 827392 39,5 57,0 2,77 21,3 ,063 ,163 827393 207,5 118,8 2,82 24,2 ,050 ,220 827398 121,3 181,3 2,66 22,8 ,045 ,178 827408 339,8 292,5 2,53 28,0 ,048 ,143 827410 205,8 436,8 2,66 19,7 ,040 ,163 827414 145,8 123,0 2,59 23,2 ,055 ,148 827419 62,0 73,3 2,68 27,5 ,065 ,178 827437 63,8 103,8 2,56 19,5 ,050 ,243 827449 300,0 211,3 2,49 22,0 ,040 ,168 827497 100,5 112,8 2,19 22,0 ,043 ,170 827502 126,3 106,3 2,36 22,9 ,043 ,108 Pesos dos órgãos
[00254] Os pesos dos órgãos foram medidos no final do estudo, e os pesos dos rins, fígado e baço são apresentados na tabela abaixo. Os re- sultados fornecem evidências adicionais de que a maioria dos oligonucleo- tídeos modificados foram bem tolerados quando fornecidos sistemicamente.
Tabela 21: Pesos dos órgãos
No de Composto Rim (g) Fígado (g) Baço (g)
PBS 0,678 2,542 0,133 797131 0,598 2,263 0,151 797236 0,621 2,281 0,195 797258 0,719 3,663 0,212 797262 0,625 3,214 0,127 797264 0,496 2,485 0,169 797266 0,547 2,633 0,169 797289 0,618 3,064 0,165 797293 0,647 2,197 0,200 797294 0,566 1,675 0,154 797295 0,558 2,147 0,170 797304 0,691 3,263 0,173 797307 0,607 2,546 0,203 797308 0,616 2,113 0,143 797312 0,562 2,941 0,123 797313 0,536 2,236 0,138 797340 0,529 2,325 0,144 797444 0,580 6,846 0,551 797466 0,491 2,289 0,222 797468 0,617 2,275 0,145 797495 0,602 2,300 0,128 797497 0,651 2,483 0,151 797500 0,563 2,031 0,119 797501 0,479 2,978 0,140 797507 0,551 2,359 0,115 797508 0,469 1,322 0,148 797523 0,560 2,614 0,172
Tabela 22: Pesos dos órgãos No de Composto Rim (g) Fígado (g) Baço (g) PBS 0,610 2,212 0,138 797192 0,530 4,632 0,157 797309 0,586 2,160 0,115 797469 0,633 4,636 0,238 826183 n. d. n. d. n. d. 826262 0,609 2,197 0,227 826393 0,508 3,084 0,210 826394 0,530 2,914 0,206 826558 0,567 2,048 0,149 826631 0,587 2,361 0,169
826632 0,595 2,442 0,136 826655 0,588 3,511 0,113 826687 0,619 2,750 0,261 826688 0,546 2,418 0,214 826743 0,608 2,162 0,110 826753 0,538 2,364 0,140 826763 0,542 2,478 0,144 826776 0,574 4,112 0,386 826793 0,555 2,295 0,173 826796 0,605 2,566 0,151 826811 0,557 2,085 0,133 826819 0,517 2,559 0,144 826828 0,590 2,046 0,191 826906 0,561 2,121 0,123 827030 0,564 1,974 0,114 827035 n. d. n. d. n. d.
Tabela 23: Pesos dos órgãos No de Composto Rim (g) Fígado (g) Baço (g) PBS 0,615 2,172 0,108 827148 0,623 2,413 0,142 827150 n. d. n. d. n. d. 827175 0,683 2,521 0,139 827200 0,640 2,682 0,127 827254 0,631 2,589 0,139 827288 0,579 2,341 0,138 827307 0,614 2,391 0,133 827347 0,596 2,235 0,152 827348 0,678 2,832 0,251 827359 0,647 2,316 0,146 827360 0,517 2,098 0,147 827372 0,657 2,120 0,140 827382 0,574 2,089 0,142 827392 0,595 2,208 0,124 827393 0,603 2,307 0,137 827398 0,590 2,249 0,141 827408 0,751 2,399 0,290 827410 0,653 3,247 0,174 827414 0,663 2,787 0,185 827419 0,682 2,327 0,150 827437 0,674 2,523 0,544 827449 0,619 2,798 0,155 827497 0,630 2,368 0,189 827502 0,674 3,082 0,183 Exemplo 5: Estabelecimento de uma linhagem de camundongo trans- gênica que expressa α-ENaC humano
[00255] Um camundongo transgênico foi desenvolvido para analisar o knockdown de α-ENaC humano em um modelo de camundongo. Uma por- ção de 41.279 pb do gene para α-ENaC ABC14-50929300K14 humano (digerido com NotI) foi microinjetada em embriões de camundongos C57BL/6 WT. Foram obtidos cinco filhotes de camundongo F0 positivos ao transgene e um fundador foi usado para gerar uma linhagem de camundongo C57BL/6 hα-ENaC. A linhagem foi avaliada quanto à expressão de hα-ENaC na lín- gua, cérebro, coração, cólon, traqueia, pâncreas, rim, fígado, baço, músculo esquelético, gordura, útero e frações totais de pulmão e pulmão. O modelo de camundongo exibe expressão de hα-ENaC em uma variedade de tecidos e, principalmente, altos níveis de expressão em todas as frações do pulmão. Exemplo 6: Efeito de oligonucleotídeos modificados na expressão de α-ENaC humano em camundongos transgênicos Tratamento
[00256] Os camundongos transgênicos foram mantidos em um ciclo cla- ro/escuro de 12 horas e foram alimentados com dieta normal ad libitum. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias na instalação de pesquisa antes do início do experimento. Oligonucleotídeos modificados foram pre- parados em solução salina tamponada (PBS) e esterilizados por filtração através de um filtro de 0,2 mícron. Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em 0,9% PBS para injeção.
[00257] Os camundongos C57Bl/6-TG (hα-ENaC) pesando ~ 20 g foram divididos em grupos de 2-4 camundongos. Grupos de camundongos foram administrados 2,5 mg/kg de oligonucleotídeo modificado duas vezes por semana durante duas semanas (5 mg/kg/semana) via aspiração orofaríngea. Um grupo controle de 6 camundongos recebeu PBS duas vezes por semana durante duas semanas. O grupo PBS serviu como grupo controle ao qual os animais dosados com oligonucleotídeo modificado foram comparados. Os camundongos foram sacrificados 48 horas após a última dose e os órgãos foram colhidos para análise adicional.
Níveis de expressão de α-ENaC humano
[00258] O RNA total foi isolado do pulmão inteiro e os níveis de mRNA de α-ENaC humano foram medidos como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na tabela abaixo como redução percentual da quantidade de mRNA de α-ENaC em relação ao controle não tratado. Como ilustrado na tabela abaixo, os níveis de mRNA de α-ENaC foram reduzidos no pulmão de animais tratados com oligonucleotídeo modificado. Tabela 24: Nível percentual de mRNA de α-ENaC humano No de Composto Tecido Pulmão Fígado Cólon Rim 797236 41 62 85 87 797308* 36 41 99 87 797313 41 54 87 89 797468 45 64 77 102 797495 27 30 69 66 826632** 40 81 77 87 826743 46 73 106 101 826763 32 51 94 96 826819 45 50 93 86 826906 42 64 107 101 827030 45 59 90 73 827200 51 72 101 129 827288 54 66 105 75 827307 34 68 85 91 827347 28 66 97 103 827359* 34 37 82 90 827372 21 29 50 70 827392 28 50 73 72 827414 36 45 84 93 827497 34 61 90 86 *O grupo continha 3 camundongos **O grupo continha 2 camundongos Todos os outros grupos continham 4 camundongos Exemplo 7: Resposta à dose do Composto 827359 na expressão de α-ENaC humana em camundongos transgênicos Tratamento
[00259] Os camundongos transgênicos foram mantidos em um ciclo cla-
ro/escuro de 12 horas e foram alimentados com dieta normal ad libitum. Os animais foram aclimatados por pelo menos 7 dias na instalação de pesquisa antes do início do experimento. Oligonucleotídeos modificados foram pre- parados em solução salina tamponada (PBS) e esterilizados por filtração através de um filtro de 0,2 mícron. Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em 0,9% PBS.
[00260] Os camundongos C57Bl/6-TG (hα-ENaC) pesando ~ 20 g foram divididos em grupos de 12 camundongos. Grupos de 12 camundongos foram administrados 0,033, 0,1, 0,33 ou 1,0 mg/kg de oligonucleotídeo modificado duas vezes por semana durante três semanas (5 mg/kg/semana) via dosagem de aerossol. Um grupo controle de 12 camundongos recebeu soro fisiológico em aerossol duas vezes por semana durante 3 semanas. O grupo PBS serviu como grupo controle ao qual os animais dosados com oligonucleotídeo modi- ficado foram comparados. Os camundongos foram sacrificados 3 dias após a última dose e os órgãos foram colhidos para análise adicional. Níveis de expressão de α-ENaC humano
[00261] O RNA total foi isolado do pulmão inteiro e os níveis de mRNA de α-ENaC humano foram medidos por PCR quantitativa em tempo real como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na tabela abaixo como redução percentual da quantidade de mRNA de α-ENaC em relação ao controle não tratado. Como ilustrado na tabela abaixo, os níveis de mRNA de α-ENaC foram reduzidos de um maneira dependente da dose em animais tratados com oligonucleotídeo modificado. Tabela 25: Resposta à dose de 827359 em camundongos transgênicos Conc. 827359 (mg/kg/dose) % Controle 0 [Solução salina] 100,0 0,033 73,4 0,100 50,4 0,330 38,1 1,000 33,3
Exemplo 8: Ensaio de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano (hPBMC)
[00262] O ensaio de hPBMC foi realizado usando o método dos tubos CPT BD Vacutainer. Uma amostra de todo o sangue de doadores voluntários com consentimento informado na clínica US HealthWorks (Faraday & El Camino Real, Carlsbad) foi obtida e recolhida em tubos 4-15 BD Vacutainer CPT 8 ml (VWR Cat. NºBD362753). O volume de sangue total inicial apro- ximado de sangue total nos tubos CPT para cada doador foi registrado usando a ficha de dados de ensaio PBMC.
[00263] A amostra de sangue foi misturada novamente imediatamente antes da centrifugação, invertendo suavemente os tubos de 8-10 vezes. Tubos CPT foram centrifugados à temperatura ambiente (18-25 oC) em um rotor horizontal (swing-out) por 30 min. em 1500-1800 RCF com pausa (2. 700 RPM Beckman Allegra 6R). As células foram recuperadas a partir da interface buffy coat (entre Ficoll e camadas de gel de polímero); transferidas para um tubo cônico estéril de 50 ml e reunidas em tubos 5 CPT/50 ml tu- bo/doador cônico. As células foram então lavadas duas vezes com PBS (Ca++, Mg++ livre; GIBCO). Os tubos foram enchidos até 50 ml e misturados pela inversão diversas vezes. A amostra foi então centrifugada em 330 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente (1. 215 RPM, em Beckman Al- legra 6R) e foram aspirados sobrenadantes tanto quanto possíveis, sem perturbar o sedimento. O pelete celular foi desalojado por agitação suave do tubo e as células foram ressuspensas em RPMI+10% FBS+pen/strep (~1 ml/10 ml volume de sangue total inicial). Uma amostra de 60 µl foi pipetada em um frasco de amostras (Beckman Coulter) com 600 µl de reagente VersaLyse (Beckman Coulter Nº Cat A09777) e foi suavemente agitada por 10-15 s. Foi permitido que a amostra fosse incubada por 10 min. à tempe- ratura ambiente, sendo novamente misturada antes da contagem. A sus- pensão de células foi contada no analisador de viabilidade celular Vicell XR (Beckman Coulter), usando o tipo de célula PBMC (fator de diluição de 1:11 foi armazenado com outros parâmetros). Foi registrada a célula viva/ml e a viabilidade. A suspensão de células foi diluída para 1 x 107 PBMC vivo/ml em RPMI+ 10% FBS+pen/strep.
[00264] As células foram plaqueadas a 5 x 105 em 50 µl/poço placa de cultura do tecido de 96 poços (Falcon Microtest).50 µl/poço de 2x concen- tração de oligos/controles diluídos em RPMI+10% FBS+pen/strep foram adicionados conforme modelo experimental (100 µl/poço total). As placas foram colocadas no agitador e foram deixadas para misturar por aprox. 1 min. Após serem incubadas por 24 horas a 37 oC; 5% de CO2, as placas foram centrifugadas a 400 x g por 10 minutos antes da remoção do sobre- nadante para o ensaio de citocina MSD (isto é, IL-6, IL-10, e TNF-α).
[00265] O composto 353512 é um padrão interno conhecido por res- ponder muito bem à liberação de IL-6 no ensaio, enquanto o composto 104838 é um controle negativo. As hPBMCs foram isoladas de doadores voluntários novos e foram tratadas com oligonucleotídeo modificado nas concentrações de 0,064, 0,32 e 1,6 200 µM. Após um tratamento de 24 ho- ras, os níveis de citocinas foram medidos e em média em dois doadores. Os resultados apresentados na tabela abaixo mostram que os oligonucleotídeos modificados selecionados que direcionam α-ENaC humano têm baixas respostas pró-inflamatórias em células sanguíneas mononucleares perifé- ricas humanas. Tabela 26: Oligonucleotídeos modificados testados como controles no ensaio hPBMC No de Composto Sequência (5' a 3') Alvo SEQ ID No. GesmCesTesGesAesTdsTdsAdsGdsAdsGds 104838 TNF 1955 AdsGdsAdsGdsGesTesmCesmCesmCe TesmCesmCesmCdsAdsTdsTdsTdsmCdsAdsGds 353512 CRP 1956 GdsAdsGdsAdsmCdsmCdsTesGesGe
Tabela 27: Resultados do ensaio de hPBMC para oligonucleotídeos modificados selecionados No de Composto Dose IL-10 (pg/mL) IL-6 (pg/mL) TNF-α (pg/mL) 104838 0,064 7,4 63,4 10,5 (- controle) 0,32 8,9 75,2 11,6 1,6 12,7 118,9 19,2 353512 0,064 26,7 130,0 14,6 (+ controle) 0,32 39,9 199,9 17,0 1,6 33,0 230,4 27,7 797236 0,064 9,4 59,2 10,4 0,32 20,1 105,5 13,4 1,6 27,3 173,1 19,5 797308 0,064 5,6 55,9 9,3 0,32 7,6 60,7 10,8 1,6 9,5 83,6 13,4 797313 0,064 4,6 56,0 8,8 0,32 8,9 55,5 10,7 1,6 14,2 95,8 14,7 797468 0,064 7,1 94,0 9,9 0,32 6,7 53,4 9,7 1,6 11,8 103,5 15,0 797495 0,064 5,5 63,1 9,6 0,32 8,5 58,9 10,8 1,6 8,9 83,1 15,2 826262 0,064 6,1 50,8 9,7 0,32 13,0 81,5 12,2 1,6 10,4 98,2 14,2 826632 0,064 4,1 55,0 9,4 0,32 6,6 65,8 10,8 1,6 7,5 111,3 15,5 826743 0,064 4,4 60,1 9,2 0,32 7,7 63,8 11,1 1,6 6,0 81,8 16,1 826763 0,064 4,5 58,2 9,6 0,32 8,9 63,1 10,8 1,6 11,6 116,7 20,9 826819 0,064 4,7 51,6 8,2 0,32 4,3 52,5 7,9 1,6 7,3 62,8 11,3 826906 0,064 4,4 48,3 7,6 0,32 4,8 68,9 9,2 1,6 6,3 60,4 13,9 827030 0,064 3,7 40,8 7,9 0,32 5,4 42,4 7,5 1,6 4,5 54,1 8,4 827200 0,064 4,2 49,4 8,9 0,32 5,3 67,6 9,5 1,6 5,4 55,2 9,5
827288 0,064 4,5 44,1 7,7 0,32 6,0 50,2 8,7 1,6 7,6 76,3 14,9 827307 0,064 4,6 62,2 9,9 0,32 5,3 52,3 9,0 1,6 5,0 54,1 10,6 827347 0,064 8,3 53,6 10,9 0,32 20,7 115,2 12,8 1,6 33,9 163,3 21,1 827359 0,064 5,8 61,8 9,4 0,32 6,2 52,7 10,3 1,6 11,0 75,2 11,8 827372 0,064 4,7 56,5 8,8 0,32 7,3 65,4 9,6 1,6 13,1 81,3 13,1 827392 0,064 4,5 45,5 7,7 0,32 5,1 48,0 8,8 1,6 5,4 50,9 9,9 827414 0,064 5,5 51,6 8,7 0,32 7,6 58,1 10,3 1,6 16,6 102,4 16,3 827419 0,064 4,2 52,5 7,9 0,32 7,5 62,0 11,2 1,6 8,0 93,8 16,5 827497 0,064 4,5 50,5 8,3 0,32 5,1 56,9 9,5 1,6 5,8 73,7 13,0 Exemplo 9: Efeitos de um oligonucleotídeo modificado complementar ao α-ENaC em um modelo de fibrose cística em camundongo
[00266] Um oligonucleotídeo modificado complementar ao α-ENaC de camundongo foi testado quanto a seus efeitos na prevenção e tratamento de restrição de vias aéreas em um modelo de fibrose cística em camundongo. O tratamento de camundongos do tipo selvagem com um oligonucleotídeo modificado complementar ao Nedd4L induziu um fenótipo do tipo fibrose cística (ver Crosby et al. J. of Cystic Fibrosis, 2017). O composto 668395 tem um motivo 3-10-3 fosfotioriorato cEt gapmer. Têm 16 nucleobases de com- primento, em que o segmento de lacuna central contém dez 2'-desoxinucleosídeos e é flanqueado por segmentos de asa nas extremi- dades 3' e 5', cada um contendo três nucleosídeos cEt. Todos os resíduos de citosina ao longo do oligonucleotídeo modificado são 5-metila citosinas. As ligações internucleosídicas são todas as ligações internucleosídicas de fosforotioato. A sequência é GAGCATCTAATACAGC (SEQ ID NO:1958), que é 100% complementar ao α-ENaC de camundongo.
[00267] Os camundongos adultos foram tratados duas vezes por semana durante 2 semanas com o composto 668395 ou veículo (controle) a 0,33 mg/kg/dose via dosagem de aerossol. Em seguida, os camundongos foram tratados com um oligonucleotídeo antissentido que reduz o Nedd4L (Nedd 4L ASO) via dosagem orofaríngea a 10 mg/kg/dose, uma vez por semana, du- rante 6 semanas. Após 8 semanas, a restrição das vias aéreas foi testada com um desafio com metacolina. A função pulmonar foi mensurada pela pontuação de Penh, obtida por pletismografia não restrita. Uma pontuação Penh mais alta indica mais constrição pulmonar. Cada grupo continha 8 camundongos. Os resultados, mostrados na tabela abaixo, indicam que o pré-tratamento com um oligonucleotídeo modificado complementar ao α-ENaC impediu a diminuição da função pulmonar observada no modelo de camundongo com fibrose cística. Tabela 28: Pontuações Penh Tratamento Metacolina (mg/mL) 0 3 6 12 25 Pontuação Penh Naïve (solução salina) 0,7 0,9 1,1 1,3 1,7 Veículo + Nedd4L ASO 1,2 1,7 2,1 3,7 5,4 Composto No. 668395 + Nedd4L ASO 0,9 0,8 1,0 1,2 2,1
[00268] A fim de testar o efeito de um oligonucleotídeo modificado com- plementar ao α-ENaC de camundongo na reversão da restrição de vias aé- reas em um modelo de fibrose cística, camundongos adultos foram tratados com Nedd4L ASO via dosagem orofaríngea a 10 mg/kg/dose uma vez por semana durante um total de 9 semanas; e o composto 668395 não foi ad- ministrado até a semana 6. A partir de 6 semanas, os camundongos rece- beram o composto 668395, veículo ou um oligonucleotídeo modificado com 3-10-3 cEt de controle (composto de controle) via aerossol, três vezes por semana, durante três semanas. A função pulmonar foi testada com um de- safio com metacolina antes do primeiro tratamento em 6 e 9 semanas, e as pontuações de Penh foram obtidos por pletismografia não restrita. Cada grupo continha 12 camundongos. Os resultados, mostrados nas tabelas abaixo, indicam que o tratamento com um oligonucleotídeo modificado complementar à α-ENaC restaurou a função pulmonar em um modelo de camundongo de fibrose cística. Tabela 29: Pontuações de Penh em 6 semanas Metacolina (mg/mL) Tratamento 0 3 6 12 25 Pontuação Penh Naïve (sem tratamento) 0,7 0,8 0,9 1,3 2,4 Nedd4L ASO (pontuações da linha de base para o grupo de 0,9 1,3 1,7 3,1 4,5 veículos) Nedd4L ASO (pontuações de linha de base para o grupo 0,8 1,2 1,6 2,5 4,7 composto 668395) Nedd4L ASO (pontuações de linha de base para o grupo 1,0 1,3 1,8 2,9 5,1 composto de controle) Tabela 30:Pontuações de Penh em 9 semanas Metacolina (mg/mL) Tratamento 0 3 6 12 25 Pontuação Penh Naïve (solução salina) 0,7 0,9 0,9 1,0 1,8 Nedd4L ASO + veículo 1,1 1,2 1,5 2,3 4,0 Nedd4L ASO + composto 668395 0,9 1,0 1,1 1,3 1,9 Nedd4L ASO + composto de controle 1,1 1,1 1,6 2,4 4,2 Exemplo 10: Efeito de oligonucleotídeos modificados complementares ao α-ENaC humano em células epiteliais brônquicas humanas primá- rias derivadas de pacientes com fibrose cística
[00269] As células epiteliais brônquicas humanas primárias de pacientes com fibrose cística foram obtidas no Epithelix. As células foram cultivadas em uma interface Air-Liquid (ALI) em inserções de membrana transwell (Cor- ning®) com meio PneumaCult™-ALI (StemCell Technologies) no lado ba-
solateral da membrana. 6 semanas após a semeadura, as células foram tratadas com ION No. 827359 ou com ION No. 549148 (gapmer 3-10-3 cET, GGCTACTACGCCGTCA, no presente documento designado como SEQ ID NO:1959), que serviu como um controle negativo que não direciona α-ENaC. Ambos os oligonucleotídeos modificados foram tratados usando absorção livre a uma concentração de 1 µM no lado basolateral. As células foram li- sadas 72 horas após o tratamento. Níveis de expressão de α-ENaC humano
[00270] O RNA total foi isolado das células 72 horas após o tratamento. Os níveis de mRNA de α-ENaC foram medidos usando o conjunto de sonda de iniciador humano hSCNN1A_LTS01170. Os níveis de mRNA de α-ENaC foram normalizados para ciclofilina A. A ciclofilina A foi amplificada usando o conjunto de sonda de iniciador HTS3936 (sequência direta, GCCATGGA- GCGCTTTGG, no presente documento designada como SEQ ID NO:1960; sequência reversa, TCCACAGTCAGCAATGGTGATC, no presente docu- mento designada como SEQ ID NO:1961; sequência de sonda, TCCAG- GAATGGCAAGACCAGCAAGA, no presente documento designada como SEQ ID NO:1962). Os resultados são apresentados nas tabelas abaixo como controle percentual da quantidade de mRNA de α-ENaC em relação às cé- lulas de controle (% controle). Tabela 31 Inibição do mRNA α-ENaC por células epiteliais brônquicas humanas pri- márias derivadas de pacientes com fibrose cística ION % de No. controle 549148 100 827359 7 Medição da corrente sensível à amilorida
[00271] 72 horas após o tratamento com oligonucleotídeo modificado, os insertos transwell foram montados em câmaras Ussing (Physiologic Instru-
ments, San Diego, CA). A corrente de curto-circuito (Isc) foi medida. Os dados foram analisados usando o ACQUIRE & ANALYZE 2. 3 (Physiologic Ins- truments). A solução basolateral continha (em mM) 145 NaCl, 3,3 K2HPO4, 0,8 KH2PO4, 1,2 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10 glicose, 10 Hepes (ajustado a pH 7,35 com NaOH) e a solução apical continha (em mM) 145 gluconato de sódio, 3,3 K2HPO4, 0,8 KH2PO4, 1,2 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10 glicose, 10 Hepes (ajustado a pH 7,35 com NaOH). Adicionou-se amilorida ao lado apical a 100 µM. As correntes sensíveis à amilorida foram medidas para avaliar a atividade funcional da ENaC. Tabela 32 Resposta da amilorida em células epiteliais brônquicas humanas primárias derivadas de pacientes com fibrose cística ION ΔIsc No. (µA/cm2) 549148 -26 827359 -9 Medição do líquido de superfície das vias aéreas (ASL)
[00272] 72 horas após o início do tratamento, foi medido o efeito do oli- gonucleotídeo modificado no Airway Surface Liquid (ASL). Imediatamente antes da medição do ASL, as culturas foram lavadas três vezes com PBS para remover o excesso de muco. 150µL de KBR buffer (89 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 1 mM Hepes, 16 mM Na-gluconate, 10 mM glicose) foi adicionado à superfície apical das células como o volume de absorção. O volume ASL foi então medido 24 horas, 48 horas e 72 horas após a adição de tampão KBR.
Tabela 33 Volume de ASL em células epiteliais brônquicas humanas primárias deri- vadas de pacientes com fibrose cística Tempo Volume de ASL (horas) (µL) 549148 827359 0 150 150 24h 62 84 48h 20 67 72h 18 38 Exemplo 11: Efeito do tratamento combinado de oligonucleotídeos modificados com VX-661 (Tezacaftor) e VX-770 (Ivacaftor)
[00273] As células epiteliais brônquicas humanas primárias de pacientes com fibrose cística foram obtidas no Epithelix. As células foram cultivadas em uma interface Air-Liquid (ALI) em inserções de membrana transwell (Cor- ning®) com meio PneumaCult™-ALI (Stemcell Technologies) no lado ba- solateral da membrana por 6 semanas antes do tratamento. No dia 0, dia 4 e dia 8 do tratamento, as células foram tratadas com ION Nos. 827359 ou 549148 a 10 µM no lado basolateral da membrana (um total de 3 doses de cada ASO). Um conjunto de células foi deixado sem tratamento com oligo- nucleotídeo modificado. No dia 11, VX-661 (Tezacaftor) (Medchem Express) foi adicionado a 18 µM ao poço não tratado anteriormente e a um dos poços tratados com ION No. 827359. No dia 14, VX-770 (Ivacaftor) (Medchem Express) foi adicionado a 10 µM às células previamente tratadas com VX-661. No mesmo dia (Dia 14), as culturasforam lavadas três vezes no lado apical com PBS para remover o excesso de muco. 150 µL de PBS (volume de absorção) foram adicionados à superfície apical das células. O volume de ASL foi medido no dia seguinte (Dia 15). Foi descoberto que o tratamento combinado aumenta ainda mais o volume de ASL comparado ao controle.
Tabela 34 Volume de ASL em células epiteliais brônquicas humanas primárias deri- vadas de pacientes com fibrose cística Tratamento Volume de ASL (µL) 549148 23 Vx-661 + Vx-770 38 827359 59 Vx-661 + Vx-770 + 827359 66

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nu- cleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954.
    2. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 9 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 9 nu- cleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954.
    3. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 10 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 10 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954.
    4. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 11 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 11 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954.
    5. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 12 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14 ou pelo menos 15 nucleobases contíguas de qualquer uma das sequências de nucleobases das SEQ ID NOs:6-1954.
    6. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo a sequência de nucleobases de qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954.
    7. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado com uma sequência de nucleobases que con- siste em qualquer uma das SEQ ID NOs:6-1954.
    8. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento complementar às nucleobases 17.951-24.120 da SEQ ID NO:2, em que o referido oligonucleotídeo modificado é pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% complementar à SEQ ID NO:2.
    9. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo uma porção de pelo menos 8 nucleobases contíguas 100% complementares a uma porção de comprimento igual das nucleobases 17.951-24.120 da SEQ ID NO:2, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado tem pelo menos 85%, 90%, 95%, ou 100% complementar para SEQ ID NO:2.
    10. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento complementar às nucleobases 32,129-33,174 da SEQ ID NO:2, em que o referido oligonucleotídeo modificado é pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% complementar à SEQ ID NO:2.
    11. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado complementar ao íntron 4 de um pré-mRNA de α-ENaC.
    12. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado complementar ao 3'-UTR de um ácido nucleico α-ENaC.
    13. Composto, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado é complementar nas nu- cleobases 17.951-24.120 de um ácido nucleico α-ENaC com a sequência de nucleobases da SEQ ID NO:2.
    14. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases compreendendo uma porção de pelo menos 8 nucleobases contíguas complementares a uma porção de com- primento igual das nucleobases 19.022-19.037; 20.415-20.430;
    21.750-21.766; 32.844-32.859; ou 32.989-33.004 de um ácido nucleico α-ENaC com a sequência de nucleobases da SEQ ID NO:2, em que a se- quência de nucleobase do oligonucleotídeo modificado é complementar para SEQ ID NO: 2.
    15. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 8 a 50 nucleosídeos ligados de comprimento complementar dentro das nucleobases 19.022-19.037; 20.415-20.430;
    21.750-21.766; 32.844-32.859; ou 32.989-33.004 da SEQ ID NO:2.
    16. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 593, 1113, 1541 ou 1812.
    17. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado com uma sequência de nucleobases que con- siste em qualquer uma de SEQ ID NOs:239, 426, 593, 1113, 1541 ou 1812.
    18. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 a 50 nucleosídeos ligados de compri- mento, tendo uma sequência de nucleobases compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:239, 426, 593, 1113, 1541, ou 1812, em que o oligonucle- otídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados; em que o segmento de lacuna está posicionado imediatamente entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3' e em que cada nucleo- sídeo de asa terminal compreende um açúcar modificado.
    19. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 20 nucleosídeos ligados de comprimento compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO:239, 426, 593, 1113, 1541, ou 1812, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em dez 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; e um segmento de asa 3' que consiste em cinco nucleosídeos li- gados; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg- mento de asa compreende uma porção de açúcar 2'-O-metoxietil; em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
    20. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de 16 nucleosídeos ligados de comprimento tendo uma sequência de nucleobases que consiste em qualquer uma das sequências citadas na SEQ ID NO:239, 426, 593, 1113, 1541, ou 1812, em que o oligonucleotídeo modificado compreende um segmento de lacuna que consiste em dez 2'-desoxinu- cleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em três nucleosídeos liga- dos; e um segmento de asa 3' que consiste em três nucleosídeos liga- dos; em que o segmento de lacuna está posicionado entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada seg-
    mento de asa compreende uma porção de açúcar cEt; em que cada ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
    21. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% complementar a qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 2 ou 1957.
    22. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado com- preende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada.
    23. Composto, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação internucleosídica modificada é uma ligação internucleosídica fosforotioato.
    24. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos um açúcar bicíclico.
    25. Composto, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar bicíclico é selecionado do grupo que consiste em LNA, ENA e cEt.
    26. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou 21 a 25, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos uma porção de açúcar modificado com 2'-O-metoxietila ou 2'-O-metila.
    27. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado com- preende pelo menos uma 5-metilcitosina.
    28. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou 21 a 27, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de lacuna que consiste em 2'-desoxinucleosídeos ligados; um segmento de asa 5' que consiste em nucleosídeos ligados; e um segmento de asa 3' que consiste em nucleosídeos ligados; em que o segmento gap é posicionado imediatamente adjacente a e entre o segmento wing 5' e o segmento wing 3' e em que cada nucleo- sídeo de cada segmento wing compreende uma porção de açúcar modifi- cado.
    29. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o composto é de cadeia simples.
    30. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o composto é de fita dupla.
    31. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o composto compreende pelo menos uma porção de açúcar ribosila não modificada.
    32. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o composto compreende pelo menos uma porção de açúcar desoxirribosila não modificada.
    33. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste em 10 a 30 nucleosídeos ligados.
    34. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados.
    35. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste em 15 a 30 nucleosídeos ligados.
    36. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado consiste em 16 a 20 nucleosídeos ligados.
    37. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de acordo com a seguinte fórmula: mCks mCks mCks Gds Ads Tds Anúncios Gds mCds Tds Gds Gds Tds Tks Gks Tk; em que, A = uma adenina, mC = uma 5-metilcitosina G = a guanina, T = a timina, k = uma porção de açúcar cEt, d = uma porção de açúcar 2'-desoxirribosila, e s = uma ligação internucleosídica fosforotioato.
    38. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende um grupo conjugado.
    39. Composto, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o composto consiste no oligonucleotídeo modificado e no grupo conjugado.
    40. Composto, caracterizado pelo fato de que é de acordo com a seguinte fórmula:
    [SEQ ID NO:1113] ou um sal do mesmo.
    41. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29 ou 31 a 37, caracterizado pelo fato de que o composto consiste no oligonucleotídeo modificado.
    42. Composto, caracterizado pelo fato de que consiste em uma forma de sal farmaceuticamente aceitável como definido em qualquer um dos compostos das reivindicações 1 a 41.
    43. Composto, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de sódio.
    44. Composto, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de potássio.
    45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44 e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
    46. População enriquecida quiralmente dos compostos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida para oligonucleotídeos modificados compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de forforotioato particular que possui uma configuração estereoquímica específica.
    47. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 46, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de forforotioato particular tendo a configuração (Sp).
    48. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 46, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de forforotioato particular tendo a configuração (Rp).
    49. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 46, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados com uma configuração estereo- química específica e independentemente selecionada em cada ligação in- ternucleosídica de fosforotioato
    50. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 49, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados com a configuração (Sp) em cada ligação internucleosídica de fosforotioato.
    51. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 49, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados com a configuração (Rp) em cada ligação internucleosídica de fosforotioato.
    52. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 49, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida por oligonucleotídeos modificados com a configuração (Rp) em uma ligação internucleosídica fosforotioato específica e a configuração (Sp) em cada uma das ligações internucleosídicas de fosforotioato restantes.
    53. População enriquecida quiralmente, de acordo com a reivin- dicação 46 ou 49, caracterizada pelo fato de que a população é enriquecida para oligonucleotídeos modificados com pelo menos 3 ligações internucleo- sídicas fosforotioato contíguas nas configurações Sp, Sp, e Rp na direção 5' para 3'.
    54. População enriquecida quiralmente dos compostos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizada pelo fato de que todas as ligações internucleosídicas de fosforotioato do oligonucleo- tídeo modificado são estereoquímicas.
    55. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a população de compostos como definida em qualquer uma das reivindicações 46 a 54 e pelo menos um diluente ou transportador farma- ceuticamente aceitável.
    56. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, uma composição farmacêutica compreendendo o composto como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44 e pelo menos um trans- portador ou diluente farmaceuticamente aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo a população de compostos como definida qualquer uma das reivindicações 46 a 54 e pelo menos um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
    57. Composto ou composição, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento, prevenção ou melhoria da fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
    58. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56, caracterizada pelo fato de que a composição é uma solução adequada para administração a um indivíduo através da via pulmonar usando um nebulizador.
    59. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56, caracterizada pelo fato de que a composição é uma solução adequada para administração a um indivíduo através da via pulmonar usando um inalador.
    60. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56, caracterizada pelo fato de que a composição é um pó ade- quado para administração a um indivíduo através da via pulmonar usando um inalador.
    61. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um dispositivo e a composição farmacêutica como definidos em qualquer uma das reivin- dicações 45, 55 ou 56.
    62. Kit, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é adequado para administração das composições a um indivíduo por inalação.
    63. Kit, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é adequado para administração das composições a um indivíduo por via pulmonar.
    64. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um nebulizador.
    65. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é um líquido.
    66. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 65, caracterizado pelo fato de que o transportador ou diluente farmaceutica- mente aceitável é solução salina tamponada com fosfato.
    67. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizado pelo fato de que o nebulizador é um nebulizador de malha.
    68. Kit, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o nebulizador de malha é um nebulizador de malha vibratória.
    69. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizado pelo fato de que o nebulizador é um nebulizador de jato.
    70. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizado pelo fato de que o nebulizador é um nebulizador ultrassônico.
    71. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 63, 65 ou 66, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um inalador.
    72. Kit, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é um sólido.
    73. Kit, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o inalador é um inalador de partículas em pó seco.
    74. Kit, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o inalador é um inalador de dose medida.
    75. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 74, caracterizado pelo fato de que pelo menos um veículo ou diluente farma- ceuticamente aceitável é um antioxidante, um sal, solução salina hipertônica ou caprato de sódio (C10).
    76. Recipiente vedado, caracterizado pelo fato de que contém a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindica- ções 45, 55 ou 56.
    77. Recipiente, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a composição é uma solução adequada para administração a um indivíduo através da via pulmonar usando um nebulizador.
    78. Recipiente, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um frasco adequado para uso em um nebu- lizador.
    79. Recipiente, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a composição é um pó adequado para administração a um indivíduo através da via pulmonar usando um inalador.
    80. Recipiente, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um recipiente adequado para uso em um inalador.
    81. Nebulizador, caracterizado pelo fato de que contém a com- posição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56.
    82. Inalador, caracterizado pelo fato de que contém a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56.
    83. Método para tratar, prevenir ou melhorar uma doença asso- ciada a α-ENaC em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compre- ende administrar ao indivíduo um composto compreendendo um oligonu- cleotídeo modificado 100% complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC, tratando, prevenindo ou melhorando a doença.
    84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o composto é de fita simples.
    85. Método, de acordo com a reivindicação 83 ou 84, caracteri- zado pelo fato de que o transcrito de ácido nucleico α-ENaC é um pré-mRNA.
    86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 85, caracterizado pelo fato de que a doença é fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
    87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 86, caracterizado pelo fato de que a administração melhora a espirometria ou a depuração mucociliar.
    88. Método para inibir a expressão de α-ENaC em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula com um com- posto de fita simples compreendendo um oligonucleotídeo modificado 100% complementar a um transcrito de ácido nucleico de α-ENaC, inibindo assim a expressão de α-ENaC na célula.
    89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a a célula está no pulmão de um indivíduo.
    90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou está em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
    91. Método para melhorar a espirometria ou a depuração muco- ciliar em um indivíduo com, ou em risco de ter, uma doença associada a α-ENaC, caracterizado pelo fato de compreender administrar um composto de fita simples compreendendo um oligonucleotídeo modificado 100% com- plementar a um transcrito de ácido nucleico a-ENaC ao indivíduo, melho- rando assim a espirometria ou a depuração mucociliar no indivíduo.
    92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou está em risco de ter fibrose cística, COPD, asma ou bronquite crônica.
    93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 92, caracterizado pelo fato de que o composto é o composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
    94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 92, caracterizado pelo fato de que o composto é um membro da população quiralmente enriquecida como definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 54.
    95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 92, caracterizado pelo fato de que o composto é um componente da com- posição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 45, 55 ou 56.
    96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 94, caracterizado pelo fato de que o composto é um componente do kit como definido em qualquer uma das reivindicações 61 a 75.
    97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87 ou 89 a 96, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado ao indivíduo por inalação.
    98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado como um aerossol.
    99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o aerossol é produzido por um nebulizador.
    100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87 ou 89 a 96, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado ao indivíduo sistemicamente.
    101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado via administração subcutânea.
    102. Uso de um composto de fita simples, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado 100% complementar a um transcrito de ácido nucleico α-ENaC para tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença associada a α-ENaC.
    103. Uso, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a doença fibrose cística, COPD, asma e bronquite crônica.
    104. Uso do composto como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 44, composição como definida na reivindicação 56, kit como definido em qualquer uma das reivindicações 61 a 75, ou recipiente como definido em qualquer uma das reivindicações 76 a 80, caracterizado pelo fato de que é para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associado a α-ENaC.
    105. Uso do composto como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 44 ou composição como definida na reivindicação 56, ca- racterizada pelo fato de ser usada na fabricação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associada ao α-ENaC.
    106. Uso, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracteri- zado pelo fato de que a doença fibrose cística, COPD, asma e bronquite crônica.
    107. Uso do composto como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 44 ou composição como definida na reivindicação 56, ca- racterizada pelo fato de ser usada na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma doença associada ao α-ENaC.
    108. Uso, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que a doença fibrose cística, COPD, asma e bronquite crônica.
    109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87 ou 89 a 101, caracterizado pelo fato de que compreender administrar pelo menos um agente secundário ao indivíduo.
    110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente secundário é Tezacaftor.
    111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente secundário é Ivacaftor.
    112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 111, caracterizado pelo fato de que o composto é coadministrado com pelo menos um agente secundário.
    113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 114, caracterizado pelo fato de que compreende administrar dois agentes secundários ao indivíduo.
    114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que os dois agentes secundários são Tezacaftor e Ivacaftor.
    115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, carac- terizado pelo fato de que o composto e os dois agentes secundários são coadministrados.
    116. Uso, como definido em qualquer uma das reivindicações 102 a 108, caracterizado pelo fato de que o composto é usado em combinação com pelo menos um agente secundário.
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