BR112020001499A2

BR112020001499A2 - anticorpos anti-tigit

Info

Publication number: BR112020001499A2
Application number: BR112020001499-0A
Authority: BR
Inventors: Anthony Cooper; Christophe Queva; Sofie Denies; Catherine Hoofd; Julia Cuende; Gregory Driessens; Florence Lambolez
Original assignee: Iteos Therapeutics Sa
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2020-09-08
Also published as: KR20200100589A; US20190100591A1; SG11202000660QA; AU2018306463A1; JP2020528768A; US20230190931A1; US20230181731A1; IL272227A; US10329349B2; US20190315867A1; JP7366897B2; AR112768A1; US20200407445A1; MX2024000742A; JP2023153911A; ES2812236T3; CN110997720B; MX2020000960A; CN110997720A; EP3719040A1

Abstract

Anticorpos anti-TIGIT e seus fragmentos de ligação ao antígeno que inibem a sinalização mediada por TIGIT são fornecidos, juntamente com combinações compreendendo os referidos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno e métodos para a sua utilização.

Description

ANTICORPOS ANTI-TIGIT FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0001] A imunoterapia contra o câncer depende da modulação do sistema imunológico para aumentar o reconhecimento e a resposta contra as células tumorais. Essa modulação pode ser alcançada por múltiplos mecanismos, incluindo a ativação de moléculas coestimuladoras presentes nas células imunes ou através da inibição de receptores coinibidores. A ativação de uma resposta imune é um mecanismo complexo que envolve numerosas populações celulares, como células apresentadoras de antígenos, importantes para o início da resposta específica ao antígeno e células efetoras responsáveis pela destruição das células tumorais. Os mecanismos que modulam a atividade das células efetoras, como as células T citotóxicas, são numerosos e representam alvo de escolha no contexto da imunoterapia contra o câncer.

[0002] TIGIT (imunorreceptor de células T com domínios Ig e ITIM), também chamado de WUCAM, VSIG9 ou Vstm3, é um receptor coinibitório, de preferência expresso em células NK, CD8+ e CD4+, bem como em células T reguladoras (células Treg, ou simplesmente "Tregs"). TIGIT é uma proteína transmembranar contendo um domínio ITIM conhecido na sua porção intracelular, um domínio transmembranar e um domínio variável de imunoglobulina na parte extracelular do receptor. Vários ligantes foram descritos para se ligarem ao receptor TIGIT com CD155/PVR mostrando a melhor afinidade seguida por CD113/PVRL3 e CD112/PVRL2 (Yu et al. (2009) Nat. Immunol. 10:48.). DNAM/CD226, um receptor coestimulador conhecido também expresso em células NK e T compete com TIGIT pela ligação a CD155 e CD112, mas com uma afinidade mais baixa, o que sugere um controle rígido da ativação dessas células efetoras para evitar citotoxicidade descontrolada contra células normais expressando o ligante CD155.

[0003] A expressão TIGIT é aumentada nos linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) e em situações de doenças como a infecção pelo HIV. A expressão TIGIT marca as células T exaustas que têm função efetora mais baixa quando comparadas às contrapartes negativas do TIGIT (Kurtulus et al. (2015) J.Clin.Invest. 276:112; Chew et al. (2016) Plos Pathogens. 12). Por outro lado, as células Treg que expressam TIGIT mostram atividade imunossupressora aumentada em comparação com a população Treg negativa para TIGIT (Joller et al. (2014) Immunity. 40:569).

[0004] Similar a outros receptores coinibidores (PD1 ou CTLA4) expressos em células T que foram comprovadamente alvos relevantes para imunoterapia e para os quais foram aprovados anticorpos antagonistas para o tratamento de câncer humano, o desenvolvimento de anticorpos anti-TIGIT antagonistas pode ajudar para ativar o sistema imunológico e combater melhor as células cancerígenas. Foi sugerido que os anticorpos anti-TIGIT antagonistas em monoterapia ou em combinação com o anticorpo a-PD1 poderiam alcançar uma forte eficácia antitumoral em modelos pré-clínicos (Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1; WO2016/028656; US2016/0176963; US2016/0376365, todos os quais são aqui incorporados por referência).

[0005] Assim, anticorpos antagonistas específicos para TIGIT que podem inibir a atividade do receptor TIGIT representam uma oportunidade para diminuir o efeito imunossupressor associado aos microambientes tumorais e, assim, aumentar a resposta imune antitumoral contra células tumorais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção fornece anticorpos anti-TIGIT que podem diminuir o efeito imunossupressor da sinalização mediada por TIGIT. Em particular, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção podem inibir a imunossupressão mediada por TIGIT através da prevenção da ligação de ligantes em células T (células T αβ convencionais e células T γδ não convencionais) e células NK e/ou depleção de células Treg positivas para TIGIT e/ou por indução a internalização do receptor TIGIT.

[0007] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TIGIT humano e que compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1), uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) e uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) selecionado a partir das sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas na Figura 1 e que compreende ainda um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1), uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) selecionado a partir das sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostradas na Figura 2.

[0008] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a combinação é selecionada do grupo de combinações formadas pelos HCDRs de cada anticorpo na Figura 1 tirada com as LCDRs do anticorpo correspondente na Figura 2.

[0009] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção pode compreender um domínio variável da cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID Nos: 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 e 331 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às mesmas; e, opcionalmente, compreendem um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 e 332 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às mesmas.

[0010] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que a combinação é selecionada do grupo de combinações formadas pelo VH de cada anticorpo na Figura 5, ou uma sequência de aminoácido exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao mesmo, tirada com o VL do mesmo anticorpo na Figura 5 ou uma sequência de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao mesmo.

[0011] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno mais preferidos fornecidos neste documento são aqueles baseados nas CDRs ou domínios variáveis completos do anticorpo 31282 fornecido neste documento.

[0012] Conforme demonstrado neste documento, estes anticorpos anti- TIGIT preferenciais e fragmentos de ligação ao antígeno com base no anticorpo 31282 têm propriedades particularmente surpreendentes e vantajosas. Essas propriedades incluem: uma maior afinidade por TIGIT expressa em células CD8T

(de doadores saudáveis ou de pacientes com câncer) em comparação com cada anticorpo anti-TIGIT testado descrito anteriormente; um IC50 melhor para competição com CD155/PVR em comparação com cada anticorpo anti-TIGIT testado descrito anteriormente; um EC50 melhor em ensaios de ativação de células T em comparação com cada anticorpo anti-TIGIT testado descrito anteriormente; e potencialmente aumentando a atividade em células T do sangue periférico de pacientes com câncer e, principalmente, nos linfócitos infiltrantes de tumores. Além disso, é surpreendentemente mostrado neste documento que os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, especialmente aqueles baseados no anticorpo 31282, depletam preferencialmente células Treg. Ou seja, as células Treg que expressam TIGIT expostas aos anticorpos anti-TIGIT fornecidos sofrem lise em uma proporção maior em comparação com as células T CD4 e CD8 convencionais. Isso é surpreendente porque as células T CD4 e CD8 convencionais também expressam TIGIT, mas não sofrem lise celular na mesma extensão quando contatadas com os anticorpos. É ainda surpreendentemente mostrado que os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, especialmente aqueles baseados no anticorpo 31282, não apenas promovem a atividade pró-inflamatória das células T convencionais, mas também aumentam a atividade das células T γδ não convencionais.

[0013] Assim, em certas modalidades preferidas, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 em que: HCDR1 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH), HCDR2 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG), HCDR3 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV), LCDR1 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA), LCDR2 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 62 (GASSRAT) e LCDR3 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

[0014] Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 221 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%,

97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma, e o domínio variável da cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 222 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma.

[0015] Em certas modalidades preferidas, o anticorpo anti-TIGIT é o anticorpo 31282 descrito neste documento.

[0016] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compete cruzadamente pela ligação ao TIGIT humano com um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento.

[0017] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento.

[0018] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo do TIGIT humano compreendendo os resíduos Q56 e I109 de TIGIT, compreendendo opcionalmente os resíduos Q56, N58 e I109. Em modalidades preferidas é fornecido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um epítopo do TIGIT humano compreendendo os resíduos Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109 do TIGIT.

[0019] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo do TIGIT humano que consiste nos resíduos Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109 do TIGIT.

[0020] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TIGIT humano e que não compete com CD155 pela ligação ao TIGIT.

[0021] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao TIGIT humano e que não compete com CD155 pela ligação ao TIGIT compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 em que HCDR1 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 280, HCDR2 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 281, HCDR3 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 282 e LCDR1 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 292, LCDR2 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 293 e LCDR3 compreende ou consiste na SEQ ID NO:

294.

[0022] Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 333 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma, e o domínio variável da cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 334 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma.

[0023] Em certas modalidades preferidas, o anticorpo que se liga ao TIGIT humano e que não compete com o CD155 pela ligação ao TIGIT compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que o HCDR1 compreende a SEQ ID NO: 353, o HCDR2 compreende a SEQ ID NO: 354, HCDR3 compreende a SEQ ID NO: 355 e LCDR1 compreende a SEQ ID NO: 356, LCDR2 compreende a SEQ ID NO: 357 e LCDR3 compreende a SEQ ID NO:

358.

[0024] Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 367 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma e o domínio variável da cadeia leve pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 368 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma.

[0025] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo anti- TIGIT isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que depleta preferencialmente as células Treg que expressam TIGIT, opcionalmente em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com o primeiro aspecto do invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento.

[0026] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma variante de afinidade de um anticorpo de acordo com outros aspectos da invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento.

[0027] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer outro aspecto da invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento.

[0028] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio VH e/ou VL de um anticorpo anti-TIGIT, em que o polinucleotídeo compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 241-270, 335- 342 e 369-370.

[0029] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo ou combinação de polinucleotídeos de acordo com a invenção operacionalmente ligada a sequências reguladoras que permitem a expressão do polipeptídeo de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão sem células.

[0030] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma célula hospedeira ou sistema de expressão sem células contendo um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[0031] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método de produção de um anticorpo recombinante ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende a cultura de uma célula hospedeira ou sistema de expressão sem célula de acordo com a invenção sob condições que permitem a expressão do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno e a recuperação do anticorpo expresso ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0032] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção, por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0033] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso em terapia.

[0034] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção (por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento) ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso em um método de tratamento de câncer.

[0035] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção (por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento) ou composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso em um método de tratamento de infecção viral, opcionalmente infecção por CMV.

[0036] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método de tratamento de câncer em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção (por exemplo, um anticorpo exemplificado neste documento) ou composição farmacêutica de acordo com a invenção ao sujeito, tratando assim o câncer.

[0037] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento de infecção viral em um sujeito que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção ou composição farmacêutica de acordo com a invenção ao sujeito, tratando assim a infecção viral. Em formas de realização preferidas, a infecção viral é uma infecção por CMV.

[0038] Em um aspecto adicional é fornecido um método para promover a atividade das células T compreendendo o contato de uma população de células T com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção. Em certas modalidades, o método promove a atividade das células T αβ. Em certas modalidades, o método promove a atividade das células T γδ. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro. Em certas modalidades, o método é realizado in vivo, por exemplo, em um sujeito humano.

[0039] Em certas modalidades é fornecido um método de acordo com a invenção, ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ou composição farmacêutica para uso em um método de acordo com a invenção, em que o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em certas modalidades preferidas, o um ou mais agentes adicionais são selecionados dentre: um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

[0040] Em um aspecto adicional, é fornecida uma combinação compreendendo um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um ou mais de um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS. Em um outro aspecto, é fornecida uma combinação de acordo com a invenção para uso em terapia. Em um outro aspecto, é fornecida uma combinação de acordo com a invenção para uso em um método de tratamento de câncer ou para uso em um método de tratamento de infecção viral. Em um outro aspecto, é fornecida uma combinação de acordo com a invenção para uso em um método de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo da invenção ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0041] Em todos os aspectos relevantes, é preferível que qualquer sujeito a ser tratado seja um sujeito humano. Em todos os aspectos relevantes, é preferido que as células (por exemplo, células T) contatadas com anticorpos de acordo com a invenção sejam células humanas (por exemplo, células T humanas).

[0042] A menos que seja tecnicamente incompatível ou indicado em contrário, qualquer modalidade preferida descrita pode opcionalmente ser usada em combinação com uma ou mais de todas as outras modalidades preferidas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0043] Figura 1 Tabela fornecendo sequências de região determinante da complementaridade (CDR) do domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpos da invenção

[0044] Figura 2 Tabela fornecendo sequências de CDR do domínio variável da cadeia leve (VL) de anticorpos da invenção

[0045] Figura 3 Tabela fornecendo sequências de framework (FR) do domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpos da invenção

[0046] Figura 4 Tabela fornecendo sequências de framework (FR) do domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpos da invenção

[0047] Figura 5 Tabela fornecendo sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve (VL) e de domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpos da invenção

[0048] Figura 6 Tabela fornecendo sequências de polinucleotídeos que codificam os domínios VH e VL de anticorpos de acordo com a invenção

[0049] Figura 7 Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de competição entre hCD155 e anticorpo anti-TIGIT para ligação a Jurkat-hTIGIT

[0050] Figura 8 (A) Gráfico mostrando a proporção de células positivas para TIGIT dentro de populações específicas de células T de PBMC de 7 doadores humanos saudáveis. (B) Gráfico mostrando a proporção de células positivas para TIGIT dentro de diferentes populações imunes de PBMC de 7 doadores humanos saudáveis .

[0051] Figura 9 Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ligação do anticorpo anti-TIGIT em Jurkat-hTIGIT

[0052] Figura 10 (A e B) Gráficos mostrando os resultados de um ensaio de ligação do anticorpo anti-TIGIT em células T CD8+ primárias de PBMCs saudáveis humanos. (C) Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ligação de anticorpo anti-TIGIT em células T CD8+ de memória primária e Treg de PBMCs saudáveis humanos

[0053] Figura 11 Gráficos mostrando os resultados de um ensaio de ligação do anticorpo anti-TIGIT em células T CD8+ primárias de PBMCs saudáveis de macacos cinomolgos

[0054] Figura 12 Gráficos mostrando o efeito de anticorpos anti-TIGIT em um bioensaio CHO-TCR-CD155 e Jurkat-hTIGIT

[0055] Figura 13 Gráficos mostrando o efeito dos anticorpos anti-TIGIT no aumento da secreção de IFNg em um ensaio funcional em células T CD8 primárias humanas de doadores saudáveis ativados com células CHO-TCR-CD155

[0056] Figura 14 Gráficos de histograma mostrando o efeito do anticorpo anti-TIGIT no aumento da secreção de IFNg em um ensaio funcional em TILs CD8+ primárias humanas de ascites ovarianas ativadas com células CHO-TCR-CD155

[0057] Figura 15 (A) Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de competição entre a CD155 de camundongo e o anticorpo anti-TIGIT para ligação ao Jurkat-mTIGIT. (B) Gráfico mostrando o efeito do anticorpo anti-TIGIT no aumento da secreção de IFNg em um ensaio funcional em células T OT-1 de camundongo. (C) Gráfico mostrando o efeito do anticorpo anti-TIGIT no aumento da citotoxicidade em um ensaio funcional em células T OT-1 de camundongo.

[0058] Figura 16 (A) Gráfico mostrando a eficácia antitumoral do anticorpo anti-TIGIT em monoterapia em um modelo de tumor CT26. (B e C) Gráficos mostrando a eficácia antitumoral do anticorpo anti-TIGIT em combinação com anti-PD1 em um modelo de tumor CT26.

[0059] Figura 17 (A) Gráfico mostrando a eficácia antitumoral dependente de isotipo do anticorpo anti-TIGIT em monoterapia em um modelo de tumor CT26. (B) Gráfico mostrando a eficácia antitumoral dependente de isotipo do anticorpo anti-TIGIT em combinação com anti-PD1 em um modelo de tumor CT26.

[0060] Figura 18 (A e G) Gráficos mostrando a modulação da razão de células Treg na população total de células T CD4+ no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (B e H) Gráficos mostrando a modulação da razão de células T CD8+ na população total de CD45+ no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (C e I) Gráficos mostrando a modulação da razão de células T CD8+/Treg no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (D e J) Gráfico mostrando a modulação de células T CD4+ secretoras de IFNg no tumor CT26 tratadas com anticorpo anti- TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (E) Gráfico mostrando a modulação de células T CD8+ secretoras de IFNg no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT. (L e F) Gráficos mostrando a razão de células T CD4+ secretoras de IFNg/IL-10 no tumor CT26 tratadas com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (K) Gráfico mostrando a modulação de células T CD4+ secretoras de IL-10 no tumor CT26 tratadas por anticorpo anti-TIGIT em combinação com anticorpo anti-PD1.

[0061] Figura 19 (A) Gráfico de vulcão mostrando o efeito do tratamento com anticorpo anti-TIGIT para modular a expressão gênica no tumor CT26 e medido por análise NanoString. (B) Gráfico de caixa mostrando a modulação da pontuação citotóxica no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou combinação com anti-PD1. (C) Gráfico de caixa mostrando a modulação da pontuação de células T CD8+ no tumor CT26 tratado com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia ou em combinação com anti-PD1

[0062] Figura 20 (A) Gráficos de histograma mostrando a razão de populações de células T TIGIT + CD4+, CD8+ e Treg em PBMC de voluntários humanos saudáveis. (B) Gráfico mostrando o efeito da citotoxicidade in vitro do anticorpo anti-TIGIT nas populações convencionais de células T CD4+, CD8 + e Treg em PBMC de voluntários humanos saudáveis.

[0063] Figura 21 Gráfico mostrando o efeito da citotoxicidade ex vivo do anticorpo anti-TIGIT nas populações convencionais de células T CD4+, CD8+ e Treg no tumor CT26.

[0064] Figura 22 (A) Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ligação de clones de anticorpos anti-TIGIT em células Jurkat-hTIGIT. (B) Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ligação de clones de anticorpos anti- TIGIT em células T CD8+ primárias de PBMCs humanas saudáveis. (C) Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de ligação de clones de anticorpos anti- TIGIT em células T CD8+ primárias de PBMCs de pacientes com câncer.

[0065] Figura 23 Gráfico mostrando os resultados de um ensaio de competição entre CD155 humano e anti-clones de anticorpo TIGIT para ligação a Jurkat-hTIGIT

[0066] Figura 24 Gráfico mostrando a caracterização funcional de clones antagonistas a-TIGIT. (A) Gráficos mostrando o efeito de anticorpos anti-TIGIT em um ensaio funcional usando células efetoras Jurkat-hTIGIT (ensaio repórter da Luciferase). (B) Gráficos mostrando o efeito de anticorpos anti-TIGIT em um ensaio funcional que mede a secreção de IFNg pela célula T CD8+ primária humana de voluntários saudáveis. (C) Gráfico mostrando o efeito do clone de anticorpo anti- TIGIT 31282 no ensaio funcional que mede a secreção de IFNg pela célula T CD3+ de paciente com câncer de PBMC. (D) Gráfico mostrando o efeito do clone de anticorpo anti-TIGIT 31282 no ensaio funcional que mede a coloração intracelular de citocinas em TILs ou PBMCs de pacientes com câncer.

[0067] Figura 25 Atividade citotóxica do clone a-TIGIT 31282 nas populações de Treg e células T CD4+ ou CD8 + de memória total em PBMC de pacientes com câncer

[0068] Figura 26 Gráfico mostrando a caracterização da expressão TIGIT em populações imunes de pacientes com câncer. (A) Frequência da expressão TIGIT em populações imunes de PBMC e TILs de pacientes com câncer. (B) Quantificação absoluta da expressão de TIGIT em populações imunes de PBMC e TILs de pacientes com câncer.

[0069] Figura 27 (A) Estrutura do complexo Fab: TIGIT mostrado como gráfico de fita; (B) interface de ligação completa entre o clone 31282 e TIGIT; (C) Interface de ligação entre o clone 31282 e TIGIT mostrando resíduos contatados.

[0070] Figura 28 Ensaio de competição entre os clones anti-TIGIT 31282 e 32959.

[0071] Figura 29 Medida da concentração plasmática do clone anti-TIGIT 31282 após injeção intravenosa de uma dose única a 0,1 mg/kg (linha superior), 1 mg/kg (linha do meio) ou 10 mg/kg (linha inferior) em macaco cinomolgo. Coluna esquerda: 31282 IgG1; coluna direita 31282 IgG4.

[0072] Figura 30 Gráfico mostrando a caracterização da expressão de TIGIT nas populações de células T CD4+ malignas e normais de paciente com síndrome de Sézary. (A) Estratégia de separação para separar células T CD4+ malignas e normais. (B) MFI para coloração de TIGIT nas 2 populações distintas.

[0073] Figura 31 Gráfico mostrando a caracterização da expressão de TIGIT em populações de células B malignas e normais de paciente com LLC. (A) Estratégia de separação para separar células B malignas e normais. (B) MFI para coloração de TIGIT nas 2 populações distintas.

[0074] Figura 32 (A-C) Gráfico mostrando as curvas de crescimento do tumor em camundongos inoculados com tumores EL4-mTIGIT. (A) Curvas medianas de crescimento tumoral. (B) Curvas de crescimento tumoral individual em camundongos tratados com anticorpo de controle de isotipo hIgG1. (C) Curvas de crescimento tumoral individual em camundongos tratados com anticorpo antagonista a-TIGIT (hIgG1) de camundongo substituto. (D-F) Gráfico mostrando as curvas de crescimento do tumor em camundongos inoculados com tumores EL4- GFP. (D) Curvas medianas de crescimento tumoral. (E) Curvas de crescimento tumoral individual em camundongos tratados com anticorpo de controle de isotipo hIgG1. (F) Curvas de crescimento tumoral individual em camundongos tratados com antagonista a-TIGIT (hIgG1) substituto.

[0075] Figura 33 (A-D) Gráficos mostrando as curvas de crescimento do tumor em camundongos inoculados com tumores CT26. (A) Curvas de crescimento mediano e individual do tumor para camundongos tratados com anticorpos anti- TIGIT e anti-4-1BB. (B) Curvas de crescimento mediano e individual do tumor para camundongos tratados com anticorpos anti-TIGIT e anti-OX-40. (C) Curvas de crescimento mediano e individual do tumor para camundongos tratados com anticorpos anti-TIGIT e anti-GITR. (D) Curvas de crescimento mediano e individual do tumor para camundongos tratados com anticorpos anti-TIGIT e anti-ICOS.

[0076] Figura 34 Gráficos mostrando o efeito dos anticorpos anti-TIGIT nas gd células T. (A) Proporção mediana de células TIGIT positivas e sinal MFI TIGIT nas populações de células Vd2- gdT de PBMC de doadores humanos positivos e negativos para CMV. (B) Gráfico mostrando a atividade do anti-TIGIT Ab para aumentar a secreção de IFNg em um ensaio funcional em células T Vd1+ γδ humanas isoladas. (C) Gráfico mostrando a atividade do anti-TIGIT Ab para aumentar a secreção de IFNg em um ensaio funcional no PBMC total.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0077] Conforme utilizado neste documento, o termo "imunoglobulina" inclui um polipeptídeo que possui uma combinação de duas cadeias pesadas e duas leves, independentemente de possuir ou não alguma imunorreatividade específica relevante. "Anticorpos" refere-se a esses conjuntos que possuem significativa atividade imunorreativa específica conhecida a um antígeno de interesse (por exemplo, TIGIT). O termo "anticorpos TIGIT" ou "anticorpos anti-TIGIT" são usados neste documento para se referir a anticorpos que exibem especificidade imunológica para a proteína TIGIT. Os anticorpos e imunoglobulinas compreendem cadeias leves e pesadas, com ou sem uma ligação covalente intercadeias entre si. As estruturas básicas de imunoglobulina nos sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas.

[0078] O termo genérico "imunoglobulina" compreende cinco classes distintas de anticorpos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Todas as cinco classes de imunoglobulinas estão dento do escopo da presente invenção, a discussão seguinte será direcionada de forma geral para a classe IgG das moléculas de imunoglobulina. No que diz respeito à IgG, as imunoglobulinas compreendem duas cadeias polipeptídicas leves idênticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 Daltons e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53,000-70,000. As quatro cadeias são normalmente unidas por pontes dissulfeto em uma configuração em "Y", em que as cadeias leves suportam as cadeias pesadas, começando na boca do "Y" e continuando através da região variável.

[0079] As cadeias leves de um anticorpo são classificadas como kappa ou lambda (k, l). Cada classe de cadeia pesada pode estar ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas estão ligadas umas às outras de forma covalente, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não- covalentes, quando as imunoglobulinas são geradas por células B ou células hospedeiras manipuladas geneticamente. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm de um terminal N nas extremidades em forquilha da configuração em Y para o terminal C na parte inferior de cada cadeia. Aqueles versados na técnica irão apreciar que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (g, m, a, d, e) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, g1-g4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. estão bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são facilmente discerníveis para a pessoa versada na técnica, em vista da divulgação do momento e, nesse sentido, estão dentro do escopo da invenção do momento.

[0080] Conforme indicado acima, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e se ligue especificamente aos epítopos nos antígenos. Ou seja, o domínio VL e o domínio VH de um anticorpo combinam-se para formar a região variável que define um sítio de ligação ao antígeno tridimensional. Esta estrutura quaternária do anticorpo forma o sítio de ligação ao antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação ao antígeno é definido por três regiões determinantes de complementariedade (CDRs)

em cada uma das cadeias VH e VL.

[0081] Conforme utilizado aqui, os termos "proteína TIGIT" ou "antígeno TIGIT" ou "TIGIT" são usados de forma intercambiável e referem-se ao imunorreceptor de células T humanas (número de acesso ao GenBank: NM_173799) que liga o receptor de poliovírus (PVR - também conhecido como CD155). TIGIT também é conhecido como VSIG9, VSTM3 ou WUCAM. A referência a TIGIT inclui a proteína TIGIT humana nativa expressa naturalmente no hospedeiro humano e/ou na superfície das linhagens celulares cultivadas em humanos, bem como formas recombinantes e fragmentos das mesmas e também formas mutantes que ocorrem naturalmente.

[0082] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de ligação" compreende uma região de um polipeptídeo que é responsável pela ligação seletiva a um antígeno alvo de interesse (por exemplo, TIGIT). Os domínios de ligação compreendem pelo menos um sítio de ligação. Domínios de ligação exemplares incluem um domínio variável de anticorpo. As moléculas de anticorpo da invenção podem compreender um único sítio de ligação ou múltiplos (por exemplo, dois, três ou quatro) sítios de ligação.

[0083] Conforme utilizado neste documento, o termo "derivado de" uma proteína designada (por exemplo, um anticorpo TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) refere-se à origem do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou sequência de aminoácidos que é derivada de um polipeptídeo inicial particular é uma sequência de CDR ou sequência relacionada ao mesmo. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos que é derivada de um polipeptídeo inicial específico não é contígua. Por exemplo, em uma modalidade, um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs são derivados de um anticorpo inicial. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou sequência de aminoácido que é derivada de um polipeptídeo inicial ou uma sequência de aminoácidos particular possui uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica àquela da sequência inicial, ou uma porção da mesma em que a porção consiste de pelo menos 3-5 aminoácidos, pelo menos 5-10 aminoácidos, pelo menos 10-20 aminoácidos, pelo menos 20-30 aminoácidos, ou pelo menos 30-50 aminoácidos, ou em que é identificável de outra forma por uma pessoa versada na técnica como tendo origem na sequência inicial. Em uma modalidade, as uma ou mais sequências de CDR derivadas do anticorpo inicial são alteradas para produzir sequências variantes de CDR, por exemplo, variantes de afinidade, em que as sequências variantes de CDR mantêm a atividade de ligação a TIGIT.

[0084] Conforme usado neste documento, uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela cujo resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeia laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não-essencial em um polipeptídeo de imunoglobulina pode ser substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família da cadeia lateral. Em outra modalidade, uma sequência de aminoácidos pode ser substituída por uma sequência estruturalmente semelhante que difere em ordem e/ou composição dos membros da família da cadeia lateral.

[0085] Conforme utilizado neste documento, o termo "porção da cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivadas dos domínios constantes de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção da cadeia pesada compreende pelo menos um dos: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, mediana e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode compreender a porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, uma porção de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3). Em outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode não ter pelo menos uma porção de um domínio constante (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em certas modalidades, pelo menos um, e de preferência todos os domínios constantes, são derivados de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Por exemplo, em uma modalidade preferida, a porção de cadeia pesada compreende um domínio de dobradiça totalmente humano. Em outras modalidades preferidas, a porção da cadeia pesada compreende uma porção Fc totalmente humana (por exemplo, sequências de domínio de dobradiça, CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana).

[0086] Em certas modalidades, os domínios constantes constituintes da porção da cadeia pesada são de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3 ou IgG4. Em outras modalidades, os domínios constantes são domínios quiméricos compreendendo porções de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma dobradiça pode compreender uma primeira porção de uma molécula de IgG1 e uma segunda porção de uma molécula de IgG3 ou IgG4. Conforme estabelecido acima, será entendido por uma pessoa versada na técnica que os domínios constantes da porção da cadeia pesada podem ser modificados de modo que variem na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente (do tipo selvagem). Ou seja, os polipeptídeos da invenção divulgados neste documento podem compreender alterações ou modificações em um ou mais dos domínios constantes da cadeia pesada (CH1, dobradiça, CH2 ou CH3) e/ou no domínio da região constante da cadeia leve (CL). Modificações à região constante podem incluir adições, deleções ou substituições de um ou mais aminoácidos em um ou mais domínios.

[0087] Conforme utilizado neste documento, os termos "região variável" e "domínio variável" são usados de forma intercambiável e pretendem ter significado equivalente. O termo "variável" se refere ao fato de que determinadas porções dos domínios variáveis VH e VL diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno alvo. No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrado em três segmentos chamados "alças hipervariáveis" em cada domínio VL e domínio VH que fazem parte do sítio de ligação ao antígeno. As primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio da cadeia leve VLambda são referidas neste documento como L1(λ), L2(λ) e L3(λ) e podem ser definidas como compreendendo os resíduos 24-33 (L1(λ), consistindo de 9, 10 ou 11 resíduos de aminoácidos), 49- 53 (L2(λ), consistindo em 3 resíduos) e 90-96 (L3(λ), consistindo em 5 resíduos) no domínio VL (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). As primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio da cadeia leve VKappa são referidas neste documento como L1(κ), L2(κ) e L3(κ) e podem ser definidas como compreendendo os resíduos 25-33 (L1(κ), consistindo de 6, 7, 8, 11, 12 ou 13 resíduos), 49-53 (L2(κ), composto por 3 resíduos) e 90-97 (L3(κ), composto por 6 resíduos) no domínio VL (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). As primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio VH são referidas neste documento como H1, H2 e H3 e podem ser definidas como compreendendo os resíduos 25-33 (H1, consistindo em 7, 8 ou 9 resíduos), 52-56 (H2, consistindo em 3 ou 4 resíduos) e 91-105 (H3, comprimento altamente variável) no domínio VH (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000).

[0088] Salvo indicação em contrário, os termos L1, L2 e L3 referem-se, respectivamente, à primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis de um domínio VL e abrangem alças hipervariáveis obtidas a partir dos isotipos VKappa e VLambda. Os termos H1, H2 e H3 referem-se, respectivamente, à primeira, segunda e terceira alças hipervariáveis do domínio VH e abrangem alças hipervariáveis obtidos a partir de qualquer um dos isotipos de cadeia pesada conhecidos, incluindo γ, ε, δ, α ou μ.

[0089] As alças hipervariáveis L1, L2, L3, H1, H2 e H3 podem cada um compreender parte de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR", conforme definido abaixo. Os termos "alça hipervariável" e "região determinante da complementaridade" não são estritamente sinônimos, uma vez que as alças hipervariáveis (HVs) são definidas com base na estrutura, enquanto as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) são definidas com base na variabilidade da sequência (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991) e os limites das HVs e CDRs podem ser diferentes em alguns domínios VH e VL.

[0090] As CDRs dos domínios VL e VH podem tipicamente ser definidas como compreendendo os seguintes aminoácidos: resíduos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) no domínio variável da cadeia leve e resíduos 31 -35 ou 31-35b (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) no domínio variável da cadeia pesada; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Assim, as VHs podem estar compreendidas nas CDRs correspondentes e as referências neste documento às "alças hipervariáveis" dos domínios VH e VL devem ser interpretadas como também englobando as CDRs correspondentes e vice-versa, a menos que indicado de outra forma.

[0091] As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de região de fgramework (FR), conforme definido abaixo. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4, respectivamente), adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada pelas três alças hipervariáveis. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade estreita por FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos. A análise estrutural dos anticorpos revelou a relação entre a sequência e a forma do sítios de ligação formado pelas regiões determinantes da complementaridade (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215, 175-182, 1990). Apesar de sua alta variabilidade de sequência, cinco das seis alças adotam apenas um pequeno repertório de conformações da cadeia principal, chamadas "estruturas canônicas". Essas conformações são determinadas, em primeiro lugar, pelo comprimento das alças e, em segundo lugar, pela presença de resíduos-chave em determinadas posições nas alças e nas regiões de framwork que determinam a conformação através do seu empacotamento, ligação de hidrogênio ou a capacidade de assumir conformações incomuns da cadeia principal.

[0092] Conforme utilizado neste documento, o termo "CDR" ou "região determinante de complementaridade" significa os sítios de combinação de antígenos não contíguos encontrados na região variável dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Estas regiões particulares foram descritas por Kabat et al.,

J. Biol. Chem. 252, 6609-6616, 1977, por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD, 1991, por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987, e por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 732-745, 1996, onde as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos em comparação um com o outro. Os resíduos de aminoácidos que englobam as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima, são estabelecidos para comparação. De preferência, o termo "CDR" é um CDR conforme definido pela Kabat com base em comparações de sequência. Tabela 1: Definições de CDRs. Definições de CDR Kabat1 Chothia2 MacCallum3 VH CDR1 31-35 26-32 30-35 VH CDR2 50-65 53-55 47-58 VH CDR3 95-102 96-101 93-101 VL CDR1 24-34 26-32 30-36 VL CDR2 50-56 50-52 46-55 VL CDR3 89-97 91-96 89-96 1A numeração dos resíduos segue a nomenclatura de Kabat et al., supra 2A numeração de resíduos segue a nomenclatura de Chothia et al., supra 3A numeração dos resíduos segue a nomenclatura de MacCallum et al., supra

[0093] Conforme utilizado neste documento, o termo "região de framework" ou "região FR" inclui os resíduos de aminoácidos que fazem parte da região variável, mas não fazem parte das CDRs (por exemplo, usando a definição de CDRs de Kabat ou Chothia). Portanto, um framework de região variável tem entre cerca de 100-120 aminoácidos de comprimento, mas inclui apenas os aminoácidos fora das CDRs. Para o exemplo específico de um domínio variável da cadeia pesada e para as CDRs conforme definidas por Kabat et al., A região de framework 1 corresponde ao domínio da região variável que abrange os aminoácidos 1-30; a região de framework 2 corresponde ao domínio da região variável que abrange os aminoácidos 36-49; a região de framework 3 corresponde ao domínio da região variável que abrange os aminoácidos 66-94 e a região de framework 4 corresponde ao domínio da região variável dos aminoácidos 103 até o final da região variável. As regiões de framework da cadeia leve são similarmente separadas por cada uma das CDRs da região variável de cadeia leve. Da mesma forma, usando a definição de CDRs por Chothia et al. ou McCallum et al. os limites da região de framework são separados pelos respectivos terminais CDR, conforme descrito acima. Em modalidades preferidas, as CDRs são como definidas por Kabat.

[0094] Em anticorpos que ocorrem naturalmente, as seis CDRs presentes em cada anticorpo monomérico são sequências curtas e não contíguas de aminoácidos que são posicionadas especificamente para formar o sítio de ligação ao antígeno, pois o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos domínios variáveis pesados e leves mostra menor variabilidade inter-molecular na sequência de aminoácidos e são denominadas regiões de framework. As regiões de framework adotam largamente uma conformação de folha-β e as CDRs formam alças que se conectam, e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha-β. Assim, as regiões de framework agem para formar uma estrutura que fornece o posicionamento das seis CDRs na orientação correta por interações intercadeias, não-covalentes. O sítio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao epítopo do antígeno imunorreativo. A posição das CDRs pode ser facilmente identificada por uma pessoa versada na técnica.

[0095] Conforme usado neste documento, o termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpos compreendendo menos resíduos de aminoácidos do que um anticorpo ou cadeia de anticorpos intactos ou completos. O termo "fragmento de ligação ao antígeno" se refere a um fragmento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo ou que se liga a antígenos ou compete com anticorpos intactos (ou seja, com o anticorpo intacto do qual eles foram derivados) para ligação a antígeno (ou seja, ligação específica ao TIGIT). Conforme usado neste docuemnto, o termo "fragmento" de uma molécula de anticorpo inclui fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, por exemplo, um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo, um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab, um fragmento Fd, um fragmento Fv e um fragmento de anticorpo de domínio único (DAb). Fragmentos podem ser obtidos via tratamento químico ou enzimático de um anticorpo ou cadeia de anticorpo intactos ou completos ou por meios recombinantes.

[0096] Conforme utilizado neste documento, o termo "valência" refere-se ao número de potenciais sítios de ligação ao alvo em um polipeptídeo. Cada sítiode ligação ao alvo liga-se especificamente a uma molécula alvo ou sítio específico em uma molécula alvo. Quando um polipeptídeo compreende mais de um sítio de ligação ao alvo, cada sítio de ligação ao alvo pode se ligar especificamente à mesma molécula ou a diferentes moléculas (por exemplo, pode se ligar a diferentes ligantes ou antígenos diferentes ou diferentes epítopos no mesmo antígeno). As moléculas de ligação do sujeito têm pelo menos um sítio de ligação específico para TIGIT.

[0097] Conforme usado neste documento, o termo "especificidade" refere- se à capacidade de se ligar (por exemplo, imunorreagir com) um determinado alvo, por exemplo, TIGIT. Um polipeptídeo pode ser monoespecífico e conter um ou mais sítios de ligação que se ligam especificamente a um alvo ou um polipeptídeo pode ser multiespecífico e conter dois ou mais sítios de ligação que se ligam especificamente a alvos iguais ou diferentes. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é específico para mais de um alvo. Por exemplo, em uma modalidade, uma molécula de ligação multiespecífica da invenção liga TIGIT e uma segunda molécula alvo. Nesse contexto, a segunda molécula alvo é outra molécula que não o TIGIT.

[0098] Conforme usado neste documento, o termo "sintético" em relação aos polipeptídeos inclui polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente. Por exemplo, polipeptídeos de ocorrência não natural que são formas modificadas de polipeptídeos de ocorrência natural (por exemplo, compreendendo uma mutação como uma adição, substituição ou deleção) ou que compreendem uma primeira sequência de aminoácidos (que pode ou não estar ocorrendo naturalmente) que está ligado em uma sequência linear de aminoácidos a uma segunda sequência de aminoácidos (que pode ou não estar ocorrendo naturalmente) à qual não está naturalmente ligada na natureza.

[0099] Conforme utilizado neste documento, o termo "manipulado" inclui manipulação de moléculas de ácido nucleico ou de polipeptídeo por meios sintéticos (por exemplo por técnicas recombinantes, síntese peptídica in vitro, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação dessas técnicas). De preferência, os anticorpos da invenção foram manipulados para melhorar uma ou mais propriedades, tais como ligação ao antígeno, estabilidade/meia-vida ou função efetiva.

[0100] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo modificado" inclui formas sintéticas de anticorpos que são alterados de forma que não ocorram naturalmente, por exemplo, anticorpos que compreendem pelo menos duas porções da cadeia pesada, mas não duas cadeias pesadas completas (como anticorpos deletados no domínio ou minibodies); formas multiespecíficas de anticorpos (por exemplo, biespecíficas, triespecíficas, etc.) alteradas para se ligarem a dois ou mais antígenos diferentes ou a diferentes epítopos em um único antígeno; moléculas de cadeia pesada unidas a moléculas scFv e similares. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5,892,019. Além disso, o termo "anticorpo modificado" inclui formas multivalentes de anticorpos (por exemplo, trivalentes, tetravalentes, etc., anticorpos que se ligam a três ou mais cópias do mesmo antígeno). Em outra modalidade, um anticorpo modificado da invenção é uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma porção da cadeia pesada sem um domínio CH2 e compreendendo um domínio de ligação de um polipeptídeo compreendendo a porção de ligação de um membro de um par de ligantes do receptor.

[0101] O termo "anticorpo modificado" também pode ser usado neste documento para se referir a variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo TIGIT da invenção. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que um anticorpo TIGIT da invenção pode ser modificado para produzir um anticorpo TIGIT variante que varia na sequência de aminoácidos em comparação com o anticorpo TIGIT do qual foi derivado. Por exemplo, podem ser feitas substituições de nucleotídeos ou aminoácidos que levam a substituições conservativas ou alterações em resíduos de aminoácidos "não essenciais" (por exemplo, em CDR e/ou resíduos de framework). As substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de um ou mais aminoácidos por um aminoácido de ocorrência natural ou não natural.

[0102] "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a de ligação ao antígeno ou domínio variável da mesma. Exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno incluem Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv e Fab's bi-específicos, diacorpo, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, um fragmento variável de cadeia única (scFv) e anticorpos multiespecíficos formado a partir de fragmentos de anticorpos (ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-1136, 2005, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência).

[0103] Conforme usado neste documento, o termo "variante de afinidade" refere-se a um anticorpo variante que exibe uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos em comparação com um anticorpo TIGIT de referência da invenção, em que a variante de afinidade exibe uma afinidade alterada para TIGIT em comparação com o anticorpo de referência. Preferencialmente, a variante de afinidade exibirá afinidade aprimorada para TIGIT, em comparação com o anticorpo TIGIT de referência. A melhoria pode ser aparente como um KD mais baixo para o TIGIT ou uma taxa de dissociação mais lenta para o TIGIT. As variantes de afinidade exibem tipicamente uma ou mais alterações na sequência de aminoácidos nas CDRs, em comparação com o anticorpo de referência TIGIT. Tais substituições podem resultar na substituição do aminoácido original presente em uma determinada posição nas CDRs por um resíduo de aminoácido diferente, que pode ser um resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente ou um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente. As substituições de aminoácidos podem ser conservativas ou não conservativas.

[0104] Conforme usado neste documento, o termo "afinidade" ou "afinidade de ligação" deve ser entendido com base no significado usual na técnica no contexto da ligação de anticorpos e reflete a força e/ou estabilidade da ligação entre um antígeno e um sítio de ligação em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0105] Os anticorpos anti-TIGIT fornecidos neste documento são caracterizados por ligação de alta afinidade ao TIGIT humano. A afinidade de ligação para o TIGIT pode ser avaliada usando técnicas padrão conhecidas pelos versados na técnica.

[0106] A afinidade de ligação também pode ser expressa como a constante de dissociação para um anticorpo específico, ou KD. Quanto menor o valor de KD, maior a interação de ligação entre um anticorpo e seu antígeno alvo. Em uma modalidade, a afinidade de ligação de um clone Fab que compreende um emparelhamento VH/VL definido pode ser avaliada usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, pelo sistema ForteBio™, por titulação de equilíbrio da solução MSD (SET) ou por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando o sistema Biacore™, conforme descrito nos exemplos anexos. Os fragmentos Fab dos anticorpos de acordo com a invenção exibem tipicamente uma KD para TIGIT medido por ForteBio™ na faixa de 1x10-10 a 5x10-8 M, opcionalmente 7x10-10 a 4 x10-8 M. Uma KD dentro desta faixa pode ser entendida como uma indicação de que o Fab e um correspondente mAb bivalente exibem uma ligação de alta afinidade ao hTIGIT. Os mAbs bivalentes compreendendo dois Fabs que (individualmente) exibem KD para hTIGIT dentro das faixas indicadas também são entendidos como exibindo ligação de alta afinidade a hTIGIT. Uma MSD KD na faixa de 1 x10-11 a 5x10-9, opcionalmente 2 x 10-11 a 1x 10-9 pode ser entendida como uma indicação de ligação de alta afinidade ao hTIGIT. Os fragmentos Fab dos anticorpos de acordo com a invenção exibem tipicamente uma KD para TIGIT medido por Biacore™ na faixa de 1x10-10 M a 1x10-9 M, opcionalmente de 1x10-10 a 7x1010, opcionalmente 2 x10-10a 7x10-10 M. Uma KD dentro desta faixa pode ser entendida como uma indicação de que o Fab, e um mAb bivalente correspondente, exibem alta ligação de afinidade a hTIGIT.

[0107] A afinidade de ligação ao TIGIT humano também pode ser avaliada usando um sistema baseado em células, conforme descrito nos exemplos anexos, nos quais os mAbs são testados para ligação a células de mamíferos (linhagens celulares ou células ex vivo que expressam TIGIT), por exemplo, utilizando ELISA ou citometria de fluxo. A alta afinidade por TIGIT pode ser indicada, por exemplo, por uma EC50 de não mais que 0,5 nM por análise citométrica de fluxo (por exemplo, FACS), conforme a descrita no Exemplo 10. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção exibem uma EC50 de ligação celular não superior a 0,5 nM, opcionalmente não superior a 0,2 nM. A determinação de afinidade baseada em células, expressa como EC50, é preferencialmente determinada utilizando células Jurkat que expressam células hTIGIT ou T CD8 primárias de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs).

[0108] Conforme utilizado neste documento, "células Treg", ou simplesmente "Tregs", referem-se a células T CD4 + reguladoras - ou seja, células T que diminuem a(s) função(ões) efetora(s) de células T convencionais (células T CD8 ou CD4). Os Tregs podem ser identificados de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando citometria de fluxo para identificar células CD4 que expressam altos níveis de CD25 e baixos níveis ou ausência de CD127.

[0109] Conforme resumido acima, a invenção refere-se, pelo menos em parte, a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam ao TIGIT. As propriedades e características dos anticorpos TIGIT e fragmentos de anticorpos, de acordo com a invenção, serão agora descritas em mais detalhes. ANTICORPOS ANTI-TIGIT

[0110] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TIGIT humano e que compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1), uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) e uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) selecionado a partir das sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostradas na Figura 1 e que compreende ainda um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1), uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) selecionado a partir das sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostradas na Figura 2. Ou seja, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TIGIT humano e que compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (HCDR1), uma CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) e uma CDR3 da cadeia pesada (HCDR3), em que: (i) HCDR1 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 271, 274 e 277; (ii) HCDR2 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 272, 275 e 278;

(iii) HCDR3 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 273, 276 e 279; e que compreende ainda um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1), uma CDR2 da cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3), em que (iv) o LCDR1 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 283, 286 e 289; (v) LCDR2 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 284, 287 e 290; e (vi) LCDR3 é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 285, 288 e 291.

[0111] Qualquer anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo um domínio VH emparelhado com um domínio VL para formar um sítio de ligação ao antígeno (TIGIT humano) compreenderá uma combinação de 6 CDRs: CDR3 de cadeia pesada variável (HCDR3), cadeia pesada variável CDR2 (HCDR2), CDR1 de cadeia pesada variável (HCDR1), CDR3 de cadeia leve variável (LCDR3), CDR2 de cadeia leve variável (LCDR2) e CDR1 de cadeia leve variável (LCDR1). Embora muitas combinações diferentes de 6 CDRs selecionadas a partir dos grupos de sequências de CDRs listadas acima sejam permitidas, e dentro do escopo da invenção, certas combinações de 6 CDRs são particularmente preferidas; sendo estas as combinações "nativas" dentro de um único mAb, exibindo alta ligação de afinidade ao TIGIT humano. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a combinação é selecionada do grupo de combinações formadas pelos HCDRs de cada anticorpo na Figura 1 tirada com as LCDRs do anticorpo correspondente na Figura 2.

[0112] Ou seja, em certas modalidades o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a combinação é selecionada do grupo que consiste em: (i) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:1, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:2, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:3, LCDR1 compreendendo SEQ ID

NO:46, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:47 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:48; (ii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:4, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:5, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:6, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:49, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:50 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:51; (iii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:7, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:8, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:9, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:52, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:53 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:54; (iv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:10, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:11, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:12, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:55, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:56 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:57; (v) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:13, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:14, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:15, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:58, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:59 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:60; (vi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:16, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:17, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:18, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:61, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:62 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:63; (vii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:19, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:20, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:21, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:64, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:65 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:66; (viii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:22, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:23, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:24, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:67, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:68 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:69; (ix) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:25, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:26, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 27, LCDR1 compreendendo SEQ

ID NO:70, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:71 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:72; (x) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:28, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:29, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:30, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:73, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:74 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:75; (xi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:31, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:32, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:33, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:76, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:77 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:78; (xii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:34, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:35, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:36, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:79, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:80 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:81; (xiii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:37, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:38, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:39, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:82, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:83 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:84; (xiv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:40, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:41, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:42, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:85, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:86 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:87; (xv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:43, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:44, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:45, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:88, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:89 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:90; (xvi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:271, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:272, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:273, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:283, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:284 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:285; (xvii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:274, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:275, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:276, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:286, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:287 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:288; (xviii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO:277, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO:278, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO:279, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO:289, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO:290 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:291.

[0113] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID Nos: 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 e 331 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às mesmas; e, opcionalmente, compreendem um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 e 332 e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às mesmas.

[0114] Embora todos os pares possíveis de domínios VH e domínios VL selecionados a partir dos grupos de sequência de domínios VH e VL listados acima sejam permitidos, e dentro do escopo da invenção, certas combinações VH e VL são particularmente preferidas; sendo estas as combinações "nativas" dentro de um único mAb, exibindo alta ligação de afinidade ao TIGIT humano.

[0115] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que a combinação é selecionada do grupo de combinações formadas pelo VH de cada anticorpo na Figura 5, ou uma sequência de aminoácido exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao mesmo, tirada com o VL do mesmo anticorpo na Figura 5 ou uma sequência de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência ao mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que a combinação é selecionada do grupo que consiste em: (i) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212; (ii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 213 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 214; (iii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 215 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 216; (iv) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 217 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218; (v) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 220; (vi) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 221 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 222; (vii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 223 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 224; (viii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 225 e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 226; (ix) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 227 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 228; (x) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 230; (xi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 232; (xii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 233 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 234; (xiii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 236; (xiv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 237 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 238; (xv) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 239 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 240; (xvi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 327 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 328 ou uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a ela; (xvii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 329 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 330 ou uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a ela; e (xviii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 331 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 332 ou uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a ela.

[0116] Para cada uma das combinações específicas de VH/VL listadas acima, também é permitido, e dentro do escopo da invenção, combinar um domínio VH com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou

99% idêntico à sequência do domínio VH recitado com um domínio VL com uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% ou 99% idêntico à sequência do domínio VL recitado. Modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VH exibe menos de 100% de identidade de sequência com uma determinada sequência de VH de referência podem, no entanto, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da sequência de referência enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos dentro da regiões de framework. Da mesma forma, modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VL exibe menos de 100% de identidade de sequência com uma determinada sequência de referência podem, no entanto, compreender CDRs de cadeia leve que são idênticas a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da sequência de referência enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos dentro das regiões de framework.

[0117] No parágrafo anterior, e em outras partes deste documento, a estrutura dos fragmentos de ligação de anticorpos/antígeno é definida com base na% de identidade de sequência com uma sequência de referência recitada (com uma determinada SEQ ID NO). Nesse contexto, a % de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada comparando essas duas sequências alinhadas de maneira ideal e em que a sequência de aminoácidos a ser comparada pode compreender adições ou deleções em relação à sequência de referência para um alinhamento ideal entre essas duas sequências. A porcentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas para as quais o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, dividindo esse número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado obtido por 100 para obter a porcentagem de identidade entre essas duas sequências. Normalmente, a janela de comparação corresponde ao comprimento total da sequência que está sendo comparada. Por exemplo, é possível usar o programa BLAST, "sequências BLAST 2" (Tatusova et al, "sequências Blast 2 - uma nova ferramenta para comparar sequências de proteínas e nucleotídeos", FEMS Microbiol Lett. 174: 247- 250) disponíveis no site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, sendo os parâmetros utilizados por padrão (em particular para os parâmetros "penalidade de lacuna aberta": 5 e "penalidade de lacuna de extensão": 2; a matriz escolhida é, por exemplo, a matriz "BLOSUM 62" proposta pelo programa), sendo a porcentagem de identidade entre as duas sequências a serem comparadas calculada diretamente pelo programa. A determinação da identidade de sequência de uma sequência de consulta para uma sequência de referência está dentro da capacidade do versado na técnica e pode ser realizada usando um software de análise disponível comercialmente, como o BLASTTM.

[0118] Em certas modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61, LCDR2 compreende SEQ ID NO: 62 e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 63.

[0119] Em certas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 221 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma e o domínio variável de cadeia leve pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 222 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma. Em certas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são o domínio VH e VL do anticorpo 31282 fornecido neste documento.

[0120] O anticorpo 31282 fornecido neste documento é derivado do anticorpo 29489. O anticorpo 31282 foi produzido a partir de 29489 por uma substituição de MT no aminoácido 116 na região VH FR4. Entende-se por essa substituição remover um local potencial de oxidação do anticorpo e, assim, melhorar a estabilidade sem afetar a função. Os anticorpos 31282 e 29489 compartilham, portanto, sequências idênticas de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, diferindo apenas no framework.

[0121] Por conseguinte, em certas modalidades dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção, o domínio variável de cadeia pesada pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID

NO: 219 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, e o domínio variável de cadeia leve pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 220 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Em certas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são o domínio VH e VL do anticorpo 29489 fornecido neste documento.

[0122] Modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VH exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 221 ou 219 pode, no entanto, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da SEQ ID NO: 221 e 219 (SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework. Da mesma forma, modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VL exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 222 ou 220 pode, no entanto, compreender CDRs da cadeia leve que são idênticas a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da SEQ ID NO: 222 e 220 (SEQ ID NOs: 61, 62 e 63, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework.

[0123] Anticorpos TIGIT exemplares descritos neste documento e com as sequências estabelecidas na Figura 1-5 foram desenvolvidos a partir de 5 clones de anticorpos parentais. A Tabela 2 resume a linhagem dos anticorpos descritos neste documento. Anticorpos anti-TIGIT humanos parentais não expostos foram expressos em leveduras e os que exibiam alta atividade funcional contra TIGIT foram selecionados (linhas cinzas, denominadas 26... e submetidos à maturação por afinidade. Os anticorpos selecionados amadurecidos por afinidade foram então expressos em células de mamíferos (linhas brancas abaixo de cada parental, denominadas 29… ou 3…). Além disso, o anticorpo 31282 foi produzido a partir de 29489 por uma substituição de MT no aminoácido 116 na região VH FR4. Entende- se por essa substituição remover um local potencial de oxidação do anticorpo e, assim, melhorar a estabilidade sem afetar a função. Além disso, o anticorpo 31288 foi produzido a partir de 29494 por uma substituição de VL no aminoácido 2 na região VH FR1 e por uma substituição de MT no aminoácido 120 na região VH FR4.

Entende-se que a substituição de VL restaura a sequência da linha germinativa de VH4-39 e a substituição de M-T para remover um sítio de oxidação potencial do anticorpo e, assim, melhorar a estabilidade sem afetar a função. Tabela 2 Clone de Linhagem VH Método de Linhagem anticorpo CDR3 otimização germinativa VH 26518 26518 parental VH3-07 29478 26518 H1/H2/H3 VH3-30 26452 26452 parental VH1-46 29487 26452 H1/H2/H3 VH1-46 29489 26452 H1/H2/H3 VH1-46 31282 29489 Mutação de VH1-46 aminoácidos M116T 26486 26486 parental VH4-0B 29499 26486 H1/H2/H3 VH4-39 29494 26486 H1/H2/H3 VH4-39 31288 29494 Reversão da linha VH4-39 germinativa + mutação dos aminoácidos M116T 32919 31288 L1/L2/L3 VH4-39 32931 31288 L1/L2/L3 VH4-39 26521 26521 parental VH1-69 29513 26521 H1/H2/H3 VH1-69 26493 26493 parental VH3-09 29520 26493 H1/H2/H3 VH3-09 29523 26493 H1/H2/H3 VH3-33 29527 26493 H1/H2/H3 VH3-30 26432 26432 parental VH1-69 32959 26432 H1/H2/H3 VH1-69

[0124] Os anticorpos de segunda geração exibem maior afinidade que os respectivos anticorpos parentais.

[0125] Em certas modalidades, a invenção fornece anticorpos anti-TIGIT ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, em que o domínio VH é derivado de uma sequência de linha germinativa da região V humana selecionada dentre: VH3-07, VH3-30, VH1-46, VH4-0B, VH4- 39, VH1-69, VH3-09, VH3-33, VH3-30. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio VH derivado da linha germinativa da região V humana VH1-46.

[0126] Um domínio VH é "derivado" de uma sequência de linha germinativa da região V específica se a sequência da região variável de cadeia pesada for mais provavelmente derivada da linha germinativa especificada do que de qualquer outra.

EPÍTOPO TIGIT

[0127] A invenção também fornece um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao TIGIT humano em um epítopo compreendendo os resíduos Q56 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao TIGIT humano pelo menos nos resíduos Q56, N58 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao TIGIT humano em um epítopo compreendendo os resíduos Q56, N58 e I109 e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos E60, I68, L73 e H76. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao TIGIT humano em um epítopo compreendendo os resíduos Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109.

[0128] Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao TIGIT humano em um epítopo que consiste nos resíduos de TIGIT Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo

31282.

[0129] Quando o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo de TIGIT humano compreendendo os resíduos TIGIT indicados, o anticorpo se liga a cada um desses resíduos e, opcionalmente, a outros resíduos de TIGIT. Onde o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo do TIGIT humano que consiste nos resíduos Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109 do TIGIT, o anticorpo se liga a cada um desses resíduos e a nenhum outro resíduo do TIGIT.

[0130] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga ao TIGIT humano em um dado epítopo se entrar em contato com o (s) resíduo (s) de aminoácido indicado (s) quando ligado ao TIGIT. Como neste documento utilizado, um anticorpo entra em contato com um resíduo TIGIT se, quando no complexo proteico formado pela ligação anticorpo-TIGIT, o resíduo atender a cada um dos seguintes critérios: (i) possui uma contribuição calculada em energia livre de ligação maior que 0,3 kcal/mol, (ii) possui um fator B médio experimental inferior ao fator B médio de todos os resíduos na estrutura de raios-X, (iii) faz pelo menos 3 pares de contatos interatômicos de átomos pesados com átomos de anticorpo à distância menor ou igual a 4,0 Angstroms, (iv) não produz apenas ligações de hidrogênio expostas a solventes ou interações iônicas, (v) se for um resíduo polar não aromático (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, ou Arg), faz pelo menos uma ligação de hidrogênio ou interação iônica com o anticorpo. O cálculo da energia livre de ligação estaria dentro das habilidades do versado na técnica. De preferência, a energia livre de ligação é calculada utilizando um campo de força empírico, de preferência FoldX. O FoldX seria familiar para o versado na técnica e está disponível publicamente em http://foldxsuite.crg.eu/. O cálculo da energia livre de ligação usando o FoldX também é descrito em Guerois et al. J. Mol. Biol. 2002; 320 (2): 369-87, que é incorporado neste documento por referência. Como seria familiar para o versado na técnica, átomos pesados são todos átomos que não são hidrogênio (incluindo C, N, O, S).

[0131] Por conseguinte, a invenção também fornece um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que entra em contato com o TIGIT humano pelo menos nos resíduos Q56 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se contacta ao TIGIT humano pelo menos nos resíduos Q56, N58 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se contacta ao TIGIT humano em pelo menos os resíduos Q56, N58 e I109 e, opcionalmente, um ou mais dos resíduos E60, I68, L73 e H76. Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se contacta ao TIGIT humano pelo menos nos resíduos Q56, N58, E60, I68 L73, H76 e I109.

[0132] Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se contacta ao TIGIT humano somente nos resíduos Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109.

[0133] Os meios para determinar quais resíduos de TIGIT são contatados por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno são familiares do versado na técnica, incluindo a cristalografia de raios-X, como a descrita no Exemplo 23.

[0134] Também é fornecido um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno neste documento descrito.

SUBTIPOS DE ANTICORPOS

[0135] Os anticorpos TIGIT podem assumir várias modalidades diferentes nas quais um domínio VH e um domínio VL estão presentes. O termo "anticorpo" neste documento é usado no sentido mais amplo e abrange, mas não está limitado aos anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), desde que exibam a especificidade imunológica para uma proteína TIGIT humana. O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações possíveis de ocorrência natural, que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Ademais, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos) no antígeno, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante ou epítopo no antígeno.

[0136] Em modalidades não limitativas, os anticorpos TIGIT fornecidos neste documento podem compreender domínios CH1 e/ou domínios CL, cuja sequência de aminoácidos é total ou substancialmente humana. Se o anticorpo TIGIT se destina ao uso terapêutico humano, é típico que toda a região constante do anticorpo, ou pelo menos uma parte dele, tenha uma sequência de aminoácidos total ou substancialmente humana. Portanto, uma ou mais ou qualquer combinação do domínio CH1, região de dobradiça, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CL (e domínio CH4 se presente) pode ser total ou substancialmente humana em relação à sua sequência de aminoácidos. Tais anticorpos podem ser de qualquer isotipo humano, sendo particularmente preferido o IgG4 e o IgG1 humana.

[0137] Vantajosamente, o domínio CH1, região de dobradiça, domínio CH2, domínio CH3 e domínio CL (e domínio CH4 se presente) podem todos ter sequência de aminoácidos total ou substancialmente humana. No contexto da região constante de um anticorpo humanizado ou quimérico, ou de um fragmento de anticorpo, o termo "substancialmente humano" refere-se a uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 90% ou pelo menos 92% ou pelo menos 95%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 99% com uma região constante humana. O termo "sequência de aminoácidos humanos", neste contexto, refere-se a uma sequência de aminoácidos que é codificada por um gene de imunoglobulina humana, que inclui linha germinativa, genes reorganizados e somaticamente mutados. Tais anticorpos podem ser de qualquer isotipo humano, sendo particularmente preferido o IgG4 e o IgG1 humana.

[0138] Também são fornecidos anticorpos TIGIT que compreendem domínios constantes da sequência "humana" que foram alterados por uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos em relação à sequência humana.

[0139] Os anticorpos TIGIT fornecidos neste documento podem ser de qualquer isotipo. Os anticorpos destinados ao uso terapêutico humano serão tipicamente do tipo IgA, IgD, IgE IgG, IgM, geralmente do tipo IgG; nesse caso, eles podem pertencer a qualquer uma das quatro subclasses IgG1, IgG2a eb, IgG3 ou IgG4. Dentro de cada uma dessas subclasses, é permitido fazer uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos na porção Fc, ou fazer outras modificações estruturais, por exemplo, para aprimorar ou reduzir as funcionalidades dependentes de Fc.

[0140] Em certas modalidades referidas, os anticorpos TIGIT fornecidos neste documento são anticorpos IgG. Em certas modalidades, os anticorpos de acordo com a invenção são anticorpos IgG1. Em certas modalidades alternativas,

os anticorpos de acordo com a invenção são anticorpos IgG4.

[0141] Sabe-se que os anticorpos IgG4 sofrem troca de braço Fab (FAE), o que pode resultar em propriedades farmacodinâmicas imprevisíveis de um anticorpo IgG4. Demonstrou-se que o FAE é prevenido pela mutação S228P na região da dobradiça (Silva et al. J Biol Chem. 27 de fevereiro de 2015; 290 (9): 5462-5469). Portanto, em certas modalidades em que um anticorpo de acordo com a invenção é um anticorpo IgG4, o anticorpo compreende a mutação S228P - ou seja, uma mutação de serina para prolina na posição 228 (de acordo com a numeração da EU).

[0142] Em modalidades não limitativas, é contemplado que uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos possam ser feitas dentro da região constante de cadeia pesada e/ou leve, particularmente dentro da região Fc. As substituições de aminoácidos podem resultar na substituição do aminoácido substituído por um aminoácido de ocorrência natural diferente ou por um aminoácido não natural ou modificado. Outras modificações estruturais também são permitidas, como por exemplo mudanças no padrão de glicosilação (por exemplo, por adição ou deleção de sítio de glicosilação ligados a N ou O). Dependendo da utilização pretendida do anticorpo TIGIT, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção no que diz respeito às suas propriedades de ligação aos receptores Fc, por exemplo, para modular a função efetora.

[0143] Em certas modalidades, os anticorpos TIGIT podem compreender uma região Fc de um dado isotipo de anticorpo, por exemplo IgG1 humana, que é modificada para reduzir ou eliminar substancialmente uma ou mais funções efetoras de anticorpos naturalmente associadas a esse isotipo de anticorpo.

[0144] Como demonstrado neste documento, os anticorpos com funções efetoras líticas celulares podem ser eficazes na redução das populações de células Treg, mas, surpreendentemente, sem afetar adversamente as populações convencionais de células T efetoras. Esta seletividade pode permitir uma inibição mais potente do efeito regulador de Tregs, mantendo as células T efetoras antitumorais.

[0145] Portanto, em certas modalidades alternativas, os anticorpos TIGIT retêm uma ou mais das funções efetoras de anticorpos naturalmente associadas a esse isotipo de anticorpo. Por exemplo, os anticorpos TIGIT da invenção podem ser anticorpos IgG1 que retêm a funcionalidade ADCC. Em modalidades adicionais, os anticorpos TIGIT podem compreender uma região Fc de um dado isotipo de anticorpo, por exemplo IgG1 humana, que é modificada para potencializar uma ou mais funções efetoras de anticorpos naturalmente associadas a esse isotipo de anticorpo. Nesse contexto, "funções efetoras de anticorpos" incluem uma ou mais citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).

[0146] Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT é um anticorpo modificado.

[0147] Em certas modalidades é fornecido um anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro braço específico para TIGIT e um segundo braço específico para um segundo alvo. Em modalidades preferidas, o segundo alvo é uma molécula de ponto de verificação imune. Em certas modalidades, o segundo alvo é OX40. Em certas modalidades, o segundo alvo é ICOS. Em certas modalidades, o segundo alvo é GITR. Em certas modalidades, o segundo alvo é 4- 1BB. Em certas modalidades, o segundo alvo é PD-1. Em certas modalidades, o segundo alvo é PD-L1. Em certas modalidades, o primeiro braço específico de TIGIT compreende uma combinação de sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de um anticorpo de acordo com a invenção. Em certas modalidades, o primeiro braço compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61, o LCDR2 compreende a SEQ ID NO: 62 e o LCDR3 compreende a SEQ ID NO: 63.

[0148] Anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que "competem em cruz" com os anticorpos TIGIT divulgados neste documento são aqueles que se ligam ao TIGIT humano no (s) sítio (s) que são idênticos ou se sobrepõem aos sítios nos quais o presente TIGIT anticorpos se ligam. Os anticorpos monoclonais concorrentes ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser identificados, por exemplo, através de um ensaio de competição de anticorpos. Por exemplo, uma amostra de TIGIT humano purificado ou parcialmente purificado pode ser ligada a um suporte sólido. Então, um composto de anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, suspeito de ser capaz de competir com esse composto de anticorpo da invenção são adicionados. Uma das duas moléculas é rotulada. Se o composto marcado e o composto não marcado se ligarem aos sítios separados e discretos no TIGIT, o composto marcado se ligará ao mesmo nível, independentemente de o composto concorrente suspeito estar presente ou não. No entanto, se os sítios de interação forem idênticos ou se sobrepuserem, o composto não marcado competirá e a quantidade de composto marcado ligado ao antígeno será reduzida. Se o composto não marcado estiver presente em excesso, muito pouco ou nenhum composto marcado se ligará.

[0149] Para os fins da presente invenção, os anticorpos monoclonais concorrentes ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são aqueles que diminuem a ligação dos presentes compostos de anticorpo ao TIGIT em cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99%. Detalhes dos procedimentos para a realização de tais ensaios de competição são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow and Lane, Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1988, 567 -569, 1988, ISBN 0-87969-314-2. Tais ensaios podem ser feitos quantitativos usando anticorpos purificados. Uma curva padrão é estabelecida pela titulação de um anticorpo contra si próprio, ou seja, o mesmo anticorpo é usado tanto para o marcador quanto para o concorrente. A capacidade de um anticorpo monoclonal concorrente não marcado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de inibir a ligação da molécula marcada à placa é titulada. Os resultados são plotados e as concentrações necessárias para atingir o grau desejado de inibição de ligação são comparadas.

ANTICORPOS DA INVENÇÃO APRESENTAM ALTA AFINIDADE PARA TIGIT E COMPETIR COM CD155

[0150] Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção exibem alta afinidade pelo TIGIT humano. Em certas modalidades, os fragmentos Fab dos anticorpos de acordo com a invenção exibem um KD para TIGIT medido por ForteBio™ na faixa de 1x10-10 to 5x 10-8 M, opcionalmente 7 x10-10 to 4 x 10-8 M.

Em certas modalidades, os anticorpos de acordo com a invenção exibem MSD KD na faixa de 1 x 10-11 a 5 x 10-9 M, opcionalmente 2 x 10-11 a 1 x 10-9. Em certas modalidades, os fragmentos Fab dos anticorpos de acordo com a invenção exibem um KD para TIGIT medido por Biacore™ na faixa de 1x10-10 M a 1x 10-9 M, opcionalmente 1 x10-10 a 7x 10-10 M, opcionalmente 2 x10-10 a 7x 10-10 M.

Tabela 3 Clo ForteBi ForteBi ForteBi Fort MSD - Biacore Ligaç Ligaç ne o Fab o o eBio KD - KD ão ão KD Fab KD Fab KD IgG monov monov celul celul human Camun Cyno KD alente alente ar ar o dongo TIGIT- hum (M), (M), Jurka Jurka biotinil FcTIGIT Fc (M) ano TIGIT- TIGIT- t t ado -Fc (M) Monov TIGI His His Hum Mous TIGIT Monova alente T-Fc human human an e HIS (M) lente (M) o o TIGIT TIGIT Monov Avid FON FON alente (Fold (Fold Over Over Nega Nega tive) tive) 265 1.24E- NB 4.47E- 6.30 154 233 18 09 09 E-10 294 7.03E- 9.18E- 1.26E- 5.27 182 500 78 10 08 09 E-10 264 5.08E- NB NB 4.74 164 47 52 09 E-10 294 2.08E- NB 1.55E- 3.96 161 95 87 09 07 E-10 294 8.81E- NB 3.52E- 3.53 1.1E-10 2.48E- 162 187 89 10 08 E-10 10

312 1.34E- NB 3.77E- 2.94E- 82 09 08 10 264 2.19E- NB NB 5.89 143 199 86 08 E-10 294 1.66E- 2.55E- 1.45E- 3.19 1.9E-11 164 541 99 09 08 08 E-10 294 1.66E- 5.36E- 1.86E- 3.76 7.0E-11 2.70E- 164 511 94 09 08 08 E-10 10 312 2.09E- 2.51E- 1.92E- 88 09 08 10 329 1.42E- 6.57E- 680 19 09 09 329 1.18E- 1.97E- 741 31 09 09 294 1.66E- 2.55E- 1.45E- 3.19 1.9E-11 164 541 99 09 08 08 E-10 265 9.87E- NB 1.49E- 5.41 146 218 21 09 07 E-10 295 7.74E- 8.55E- 9.56E- 3.92 2.5E-11 156 406 13 10 08 09 E-10 264 4.06E- 2.67E- NB 1.49 80 463 93 08 08 E-09 295 1.31E- 1.95E- 2.68E- 3.84 2.1E-10 7.16E- 166 535 20 09 09 09 E-10 10 295 3.84E- 1.89E- 2.79E- 5.31 1.7E-09 150 502 23 09 08 08 E-10 295 1.33E- 2.02E- 1.76E- 3.50 6.4E-10 142 414 27 09 08 08 E-10 264 1.31E- NB NB 4,62 32 08 E-09

[0151] Como demonstrado nos Exemplos, o anticorpo 31282 exibe uma afinidade surpreendentemente alta para TIGIT expressa em células transgênicas.

Por conseguinte, em certas modalidades, um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido neste documento exibe uma ligação EC50 para o TIGIT humano inferior a 0,5 nM. Em tais modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma ligação EC50 de cerca de 0,05 a cerca de 0,4 nM, preferencialmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,3 nM, preferencialmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,2 nM, preferencialmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,15 nM. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma ligação EC50 para o TIGIT humano de cerca de 0,1 nM. Em modalidades preferidas, o anticorpo compreende as CDRs do anticorpo 31282. De preferência, a EC50 é determinada usando células Jurkat que expressam TIGIT humano, como descrito no Exemplo 18.Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção reagem de forma cruzada com o TIGIT de camundongo e/ou o TIGIT de cinomolgo.

[0152] Como os anticorpos de segunda geração "29..." são descendentes amadurecidos por afinidade dos anticorpos parentais altamente funcionais, espera- se que eles exibam pelo menos propriedades funcionais semelhantes ou equivalentes aos dos anticorpos parentais e vice-versa.

[0153] Como descrito neste documento, em certas modalidades, um fragmento de ligação a anticorpo ou antígeno da invenção possui afinidade equivalente a TIGIT expressa por células T CD8 e expressa por células Treg. Como usado neste documento, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno tem "afinidade equivalente" para células T CD8 e células Treg se a afinidade para células T CD8 estiver na faixa de 0,5 a 1,5 vezes a afinidade para células Treg. Por exemplo, um anticorpo com afinidade equivalente para células T CD8 e células Treg que exibe uma afinidade para células Treg de 0,03 nM exibirá uma afinidade para células T CD8 na faixa de 0,015-0,045nM.

[0154] A Tabela 3 fornece um resumo das propriedades de afinidade dos anticorpos anti-TIGIT da invenção, com células cinzas indicando clones de anticorpos parentais, com anticorpos de segunda e terceira geração de cada linhagem mostrados imediatamente abaixo do anticorpo progenitor respectivo (consulte também a Tabela 2).

[0155] Como demonstrado nos Exemplos, o anticorpo 31282 exibe uma afinidade surpreendentemente alta para TIGIT expressa em células T CD8+ humanas primárias. Por conseguinte, em certas modalidades, um anticorpo anti- TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido neste documento exibe uma ligação EC50 para o TIGIT humano inferior a 0,5 nM. Em tais modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma ligação EC50 de cerca de 0,05 a cerca de 0,4 nM, preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 nM. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma ligação EC50 para o TIGIT humano de cerca de 0,2 nM. Em modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as CDRs do anticorpo 31282. De preferência, a EC50 é determinada utilizando células T CD8+ de PBMCs humanas, preferencialmente de um indivíduo saudável, como descrito no Exemplo 18.

[0156] Como demonstrado nos exemplos anexos, em certas modalidades anticorpos ou fragmento de ligação a antígeno da invenção exibem alta afinidade para células T CD8 que expressam TIGIT e alta afinidade para células Treg que expressam TIGIT. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção exibem uma afinidade por células T CD8 que expressam TIGIT e células Treg que expressam TIGIT, caracterizadas por uma EC50 menor que 0,5 nM, preferencialmente menor que 0,3 nM, preferencialmente menor que 0,2 nM. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção exibem afinidade equivalente para células T CD8 que expressam TIGIT e para células Treg que expressam TIGIT.

[0157] Os anticorpos de acordo com a invenção (por exemplo, anticorpo 31282) exibem uma afinidade surpreendentemente alta para células T CD8+ de pacientes com câncer. Isto é particularmente vantajoso, uma vez que o aumento da atividade efetor das células T de pacientes com câncer por inibição da sinalização TIGIT pode levar a um controle mais eficaz do tumor. Por conseguinte, em certas modalidades, um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno fornecido neste documento exibe uma ligação EC50 inferior a 0,5 nM para TIGIT humano nas células T CD8+ humanas de pacientes com câncer. Em tais modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma ligação EC50 de cerca de 0,05 a cerca de 0,4 nM, preferencialmente de cerca de

0,1 a cerca de 0,3 nM. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma EC50 para o TIGIT humano de cerca de 0,1 nM a cerca de 0,2 nM. Em modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as CDRs do anticorpo 31282. De preferência, a EC50 é determinada utilizando células T CD8+ de PBMCs retiradas de um paciente com câncer, como descrito no Exemplo 18.

[0158] Como demonstrado nos Exemplos anexos, em certas modalidades anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção competem com CD155/PVR pela ligação a TIGIT. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção exibe competição com CD155 caracterizado por uma IC50 de 0,2nM ou menos, preferencialmente 0,1nM ou menos. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe competição com CD155 caracterizada por um IC50 de cerca de 0,05 nM ou menos. Em certas modalidades preferidas, o IC50 exibido é de cerca de 0,05 nM. Sem desejar ser limitado pela teoria, espera-se que a competição de anticorpos com CD155 pela ligação a TIGIT diminua os níveis de sinalização mediada por TIGIT induzida por CD155, aumentando assim os níveis de ativação de células T efetoras.

[0159] A invenção ainda fornece "variantes de afinidade" dos anticorpos descritos neste documento.

[0160] A invenção também fornece um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que compete em reticulação pela ligação ao TIGIT humano com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito neste documento.

ANTICORPOS DA INVENÇÃO PROMOVEM ATIVIDADE DE CÉLULAS T PRO-INFLAMATÓRIAS

[0161] Os anticorpos de acordo com a invenção (por exemplo, anticorpo 31282) são surpreendentemente eficazes para promover a atividade pró- inflamatória das células T CD8+. Como demonstrado nos Exemplos, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a invenção (especialmente 31282) são mais eficazes para promover a atividade das células T CD8+ pró- inflamatórias (indicada pela liberação de IFNg) do que os anticorpos anti-TIGIT comparadores (ver Figura 24). Esta eficácia aprimorada versus anticorpos comparadores foi demonstrada em células repórteres transgênicas Jurkat que expressam TIGIT e em células T CD8 primárias. Por conseguinte, em certas modalidades, um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido neste documento exibe uma ativação EC50 inferior a 5 nM para o TIGIT humano expresso por células repórteres Jurkat, como descrito no Exemplo 19. Em tais modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma EC50 de cerca de 1 nM a cerca de 4 nM, preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 4 nM.

[0162] Em certas modalidades, um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido neste documento exibe uma EC50 de ativação inferior a 0,4 nM para células T CD8 de indivíduos saudáveis, como descrito no Exemplo

19. A atividade das células T CD8 (ou seja, atividade pró-inflamatória) pode ser medida pela produção de citocinas inflamatórias (por exemplo, IFNg). Em tais modalidades preferidas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe uma EC50 de cerca de 0,05 nM a cerca de 0,4 nM, preferencialmente de cerca de 0,1 nM a cerca de 0,2 nM. De preferência, a EC50 é determinada utilizando células T CD8+ de PBMCs retiradas de um indivíduo saudável, como descrito no Exemplo

19.

[0163] É adicionalmente e surpreendentemente demonstrado nos Exemplos anexos que os anticorpos anti-TIGIT fornecidos são eficazes para aumentar a atividade de células T gama-delta (γδ ou g/d) (isto é, células T que expressam as subunidades γδ TCR, em oposição às subunidades αβ TCR convencionais). Tais células T γδ formam um componente distinto e importante do sistema imunológico e a capacidade dos anticorpos fornecidos neste documento para promover a atividade dessas células destaca a utilidade dos anticorpos.

[0164] Por conseguinte, também é fornecido neste documento um método para promover a atividade das células T γδ compreendendo o contato de uma população de células T γδ com um anticorpo anti-TIGIT. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro. Em certas modalidades, o método é realizado in vivo, em um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito humano tem câncer. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1,

LCDR2 e LCDR3 de um anticorpo de acordo com a invenção. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61, o LCDR2 compreende a SEQ ID NO: 62 e o LCDR3 compreende a SEQ ID NO: 63. EXPLICAÇÃO SELETIVA DE CÉLULAS T-REG

[0165] Como demonstrado neste documento, os anticorpos anti-TIGIT são capazes de esgotar seletivamente as células Treg que expressam TIGIT. Ou seja, os anticorpos anti-TIGIT reduzem a proporção de células Treg que expressam TIGIT em relação à população total de células T em maior extensão do que reduzem a proporção de células T CD4 ou CD8 efetoras ou de memória.

[0166] Em certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno esgota seletivamente as células Treg que expressam TIGIT.

[0167] Esta depleção seletiva de células Treg que expressam TIGIT pode ser mediada por lise seletiva dos Tregs que expressam TIGIT (por exemplo, por ADCC ou CDC (ver Figuras 20, 21 e 25). Os Tregs que expressam TIGIT são entendidos como as células reguladoras mais potentes do que os Tregs que não expressam TIGIT. Sem desejar ser limitado pela teoria, espera-se que a depleção seletiva pela lise das células Treg que expressam TIGIT aumente a função efetora das células T (por exemplo, citotoxicidade mediada por células T, liberação pró- inflamatória de citocinas) diminuindo o número total de células Treg, mas também esgotando as células Treg exibindo a função reguladora mais potente. Essa função efetora de células T aumentada é demonstrada na Figura 24.

[0168] Portanto, em certas modalidades, fragmentos de ligação aos anticorpos ou antígeno da invenção seletivamente lizam as células Treg que expressam TIGIT.

[0169] A depleção seletiva de células Treg que expressam TIGIT também pode ser mediada induzindo a internalização do receptor TIGIT, de modo que ele não seja mais expresso na membrana celular. Sem querer ser limitado pela teoria, induzindo a internalização TIGIT de modo que as células TIGIT+ Treg se tornem células TIGIT-Treg, espera-se que a função reguladora dessas células se torne menos potente (uma vez que as células TIGIT+ Tregs são células reguladoras mais potentes). Como resultado da internalização do receptor e subsequente queda na potência reguladora desses Tregs, espera-se que a função efetora das células T aumente. Portanto, em certas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção inibem a atividade supressora de células Treg que expressam TIGIT, preferencialmente induzindo a internalização de TIGIT por células Treg que expressam TIGIT.

[0170] É particularmente vantajoso que os anticorpos anti-TIGIT, de acordo com a invenção, exibam alta afinidade por células T CD8 e células Treg e também exibam depleção seletiva de células Treg, promovendo, assim, a função efetora de células T por meio de dois mecanismos. A retenção da função efetiva do anticorpo (por exemplo, ADCC, CDC) resulta na depleção eficaz dos Tregs e a seletividade significa que a função efetora do anticorpo não resulta na depleção indesejada das células T efetoras. A seletividade é particularmente surpreendente, uma vez que tentativas anteriores de produzir um anticorpo anti-TIGIT procuraram eliminar a função efetiva do anticorpo, a fim de evitar a lise das células T efetoras que expressam o TIGIT. Além disso, como os anticorpos TIGIT da invenção exibem afinidade por células T efetoras (por exemplo, células T CD8), a sinalização mediada por TIGIT nessas células pode ser inibida pela competição pela ligação a CD155 e/ou induzindo a internalização de TIGIT nas células T efetoras. Em combinação, estes efeitos dos anticorpos da invenção podem resultar em um aumento significativo da função efetora das células T.

[0171] Outras propriedades vantajosas surpreendentes exibidas por anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a invenção incluem o aumento da função efetora das células T (por exemplo, liberação de citocinas pró- inflamatórias) dos linfócitos infiltrantes de tumores (TILs). A exposição ao microambiente tumoral pode levar a TILs a exibir fenótipos anérgicos ou chamados “esgotados”, possivelmente devido à superexposição de antígenos e/ou microambiente tumoral imunossupressor. É desejável melhorar a função efetora dos TILs, pois são essas células que se infiltram no próprio tumor e, assim, posicionadas em um local mais adequado para reduzir o tamanho ou o crescimento do tumor; no entanto, devido ao fenótipo anérgico ou esgotado de muitos TILs,

espera-se que seja difícil potencializar sua função efetora. O aumento na resposta pró-inflamatória de TILs após a exposição a anticorpos da invenção é, portanto, surpreendente e indica que os anticorpos podem ser agentes terapêuticos particularmente eficazes.

[0172] Ainda outras propriedades vantajosas surpreendentes exibidas por anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno incluem a capacidade de aumentar a atividade pró-inflamatória das células T gama-delta (γδ). A capacidade de promover a atividade de células T não convencionais, como células T γδ, não havia sido relatada anteriormente para um anticorpo anti-TIGIT e oferece o potencial para tratar outras doenças além do câncer, nas quais as células T γδ são conhecidas por serem importantes. Por exemplo, foi relatado que as células T γδ estão envolvidas na resposta à infecção patogênica (bacteriana, viral (por exemplo, CMV), fúngica), bem como desempenham um papel na proteção contra doenças autoimunes. Além disso, a surpreendente capacidade de promover a atividade de células T não convencionais fornece maior potência aos efeitos antitumorais dos anticorpos.

[0173] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para esgotar seletivamente as células Treg de uma população de células T, compreendendo o contato da população de células T com um anticorpo anti-TIGIT ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pelo qual o anticorpo anti-TIGIT destrói seletivamente a população de Células Treg. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro. Em certas modalidades, o método é realizado in vivo, em um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito humano tem câncer. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de um anticorpo de acordo com a invenção. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61, o LCDR2 compreende a SEQ ID NO: 62 e o LCDR3 compreende a SEQ ID NO: 63.

[0174] Como demonstrado nos exemplos anexos, a presente invenção também fornece anticorpos anti-TIGIT que não competem com CD155/PVR pela ligação a TIGIT. Portanto, em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo TIGIT humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno que não compete com CD155/PVR pela ligação ao TIGIT humano. Em certas modalidades, os fragmentos Fab dos anticorpos anti-TIGIT não competitivos CD155 de acordo com a invenção exibem um KD para TIGIT medido por ForteBio™ na faixa de5x10-9 a 5x10-8 M, opcionalmente 1x10-8 a 3x10-8 M.

[0175] Em certas modalidades preferidas, o anticorpo pode compreender um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 280, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 281, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 282 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 292, LCDR2 compreende SEQ ID NO: 293 e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 294. Em certas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 333 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma e o domínio variável de cadeia leve pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 334 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma.

[0176] Modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VH exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 333 pode, no entanto, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da SEQ ID NO: 333 (SEQ ID NOs: 280, 281 e 282, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework. Da mesma forma, modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VL exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 334 pode, no entanto, compreender CDRs da cadeia leve que são idênticas a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da SEQ ID NO: 334 (SEQ ID NOs: 292, 293 e 294, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework.

[0177] Em certas modalidades preferidas, o anticorpo pode compreender um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 353, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 354, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 355 e LCDR1 compreende SEQ ID NO: 356, o LCDR2 compreende a SEQ ID NO: 357 e o LCDR3 compreende a SEQ ID NO:

358. Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 367 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma e o domínio variável da cadeia leve pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 368 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à mesma.

[0178] Modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VH exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 367 pode, no entanto, compreender CDRs de cadeia pesada que são idênticas a HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da SEQ ID NO: 367 (SEQ ID NOs: 353, 354 e 355, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework. Da mesma forma, modalidades em que a sequência de aminoácidos do domínio VL exibe menos de 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 368 pode, no entanto, compreender CDRs da cadeia leve que são idênticas a LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da SEQ ID NO: 368 (SEQ ID NOs: 356, 357 e 358, respectivamente) enquanto exibem variação da sequência de aminoácidos nas regiões de framework. POLINUCLEOTÍDEOS, VETORES E SISTEMAS DE EXPRESSÃO

[0179] A invenção também fornece moléculas polinucleotídicas que codificam os anticorpos TIGIT da invenção, também vetores de expressão contendo sequências nucleotídicas que codificam os anticorpos TIGIT da invenção operacionalmente ligados a sequências reguladoras que permitem a expressão do polipeptídeo de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou livre de células sistema de expressão e uma célula hospedeira ou sistema de expressão sem células que contém esse vetor de expressão.

[0180] As moléculas de polinucleotídeo que codificam os anticorpos TIGIT da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA recombinante. Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" ou "molécula de polinucleotídeo", conforme utilizados neste documento de forma intercambiável, referem-se a qualquer molécula de DNA ou RNA, de fita simples ou dupla e, se única, a molécula de sua sequência complementar. Ao discutir moléculas de ácido nucleico, uma sequência ou estrutura de uma molécula de ácido nucleico específica pode ser descrita neste documento de acordo com a convenção normal de fornecer a sequência na direção 5' para 3'. Em algumas modalidades da invenção, ácidos nucleicos ou polinucleotídeos são "isolados". Este termo, quando aplicado a uma molécula de ácido nucleico, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é separada das sequências com as quais é imediatamente contígua no genoma natural do organismo em que se originou. Por exemplo, um "ácido nucleico isolado" pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, como um vetor de plasmídeo ou vírus, ou integrada no DNA genômico de uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo hospedeiro não humano. Quando aplicado ao RNA, o termo "polinucleotídeo isolado" refere-se principalmente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada, como definido acima. Alternativamente, o termo pode se referir a uma molécula de RNA que foi purificada/separada de outros ácidos nucleicos com os quais estaria associada em seu estado natural (isto é, em células ou tecidos). Um polinucleotídeo isolado (DNA ou RNA) pode ainda representar uma molécula produzida diretamente por meios biológicos ou sintéticos e separada de outros componentes presentes durante sua produção.

[0181] Para a produção recombinante de um anticorpo TIGIT de acordo com a invenção, um polinucleotídeo recombinante que o codifica pode ser preparado (usando técnicas padrão de biologia molecular) e inserido em um vetor replicável para expressão em uma célula hospedeira escolhida ou em um sistema de expressão sem células. As células hospedeiras adequadas podem ser células procarióticas, leveduras ou eucarióticas superiores, especificamente células de mamífero. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59-74, 1977); células de rim de hamster recém-nascido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980; ou clones derivados de CHO como CHO-K1, ATCC CCL-61, Kao e Puck, Genetics of cellmatic mamífero cell, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells, Proc. Natl. Acad. Sci. 60: 1275-1281, 1968); células de Sertoli de camundongo (TM4; Mather, Biol. Reprod. 23: 243-252, 1980); células de mieloma de camundongo SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) ou NS0 (coleções de cultura HPA nº 85110503); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2), bem como a linha celular PERC-6 da DSM. Os vetores de expressão adequados para uso em cada uma dessas células hospedeiras também são geralmente conhecidos na técnica.

[0182] Deve-se notar que o termo "célula hospedeira" geralmente se refere a uma linha celular cultivada. Seres humanos inteiros nos quais um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo de ligação ao antígeno de acordo com a invenção foi introduzido são explicitamente excluídos da definição de uma "célula hospedeira".

[0183] Em um aspecto importante, a invenção também fornece um método de produção de um anticorpo TIGIT da invenção que compreende a cultura de uma célula hospedeira (ou sistema de expressão livre de células) contendo polinucleotídeo (por exemplo, um vetor de expressão) que codifica o anticorpo TIGIT sob condições que permitem a expressão do anticorpo TIGIT e recuperar o anticorpo TIGIT expresso. Este processo de expressão recombinante pode ser utilizado para produção em larga escala de anticorpos TIGIT de acordo com a invenção, incluindo anticorpos monoclonais destinados ao uso terapêutico humano. Vetores, linhas celulares e processos de produção adequados para a fabricação em larga escala de anticorpos recombinantes adequados para uso terapêutico in vivo estão geralmente disponíveis na técnica e serão bem conhecidos do versado na técnica.

[0184] Portanto, de acordo com a invenção é fornecido um polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a combinação é selecionada do grupo que consiste em: (i) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 61, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 63; (ii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 4, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 5, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 6, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 49, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 50 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 51; (iii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 9, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 52, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 53 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 54; (iv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 11, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 55, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 56 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 57; (v) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 15, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 58, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 59 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 60; (vi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 2, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 46, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 47 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 48; (vii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 19, HCDR2 compreendendo SEQ

ID NO: 20, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 64, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 65 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 66; (viii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 22, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 23, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 24, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 67, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 68 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 69; (ix) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 25, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 26, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 27, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 70, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 71 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 72; (x) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 28, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 29, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 30, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 73, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 74 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 75; (xi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 31, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 32, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 33, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 76, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 77 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 78; (xii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 34, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 35, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 36, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 79, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 80 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 81; (xiii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 38, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 39, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 82, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 83 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 84; (xiv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 40, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 41, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 42, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 85, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 86 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 87; (xv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 43, HCDR2 compreendendo SEQ

ID NO: 44, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 45, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 88, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 89 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 90; (xvi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 271, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 272, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 273, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 283, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 284 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 285; (xvii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 274, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 275, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 276, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 286, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 287 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 288; (xviii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 277, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 278, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 279, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 289, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 290 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 291.

[0185] Em certas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 em que: (i) HCDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 18, LCDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 61, LCDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 62 e LCDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 63.

[0186] Também de acordo com a invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito neste documento. Em certas modalidades é fornecido um anticorpo isolado de codificação de polinucleotídeo 31282 fornecido neste documento, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0187] Além disso, de acordo com a invenção é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio VH e/ou VL de um anticorpo anti- TIGIT, em que o polinucleotídeo compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 241-270, 335- 342 e 369-

370. Em certas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 251 e/ou uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 252. Em certas modalidades em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 251 e uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 252, as sequências são contíguas. Em certas modalidades em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 251 e uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 252, as sequências não são contíguas.

[0188] Também, de acordo com a invenção, é fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção operacionalmente ligado a sequências reguladoras que permitem a expressão do polipeptídeo de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão sem células.

[0189] Também, de acordo com a invenção, é fornecida uma célula hospedeira ou sistema de expressão sem células contendo um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[0190] Além disso, de acordo com a invenção, é fornecido um método de produção de um anticorpo recombinante ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que compreende a cultura da célula hospedeira ou sistema de expressão sem célula de acordo com a invenção sob condições que permitem a expressão do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno e a recuperação do anticorpo expresso ou fragmento de ligação ao antígeno.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0191] Também são fornecidas, neste documento, composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a invenção formulado com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos TIGIT. As técnicas para formular anticorpos para uso terapêutico humano são bem conhecidas na técnica e são revisadas, por exemplo, em Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.96, pp1-26, 2007.

[0192] Os anticorpos TIGIT e composições farmacêuticas fornecidos neste documento têm utilidade na terapia, em particular no tratamento terapêutico da doença, em condições particulares que se beneficiam da inibição da função TIGIT.

PRODUTOS COMBINADOS

[0193] Como demonstrado neste documento, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são particularmente eficazes quando administrados em combinação com inibidores do ponto de verificação imune - especificamente anticorpos antagonistas anti-ICOS ou anticorpos anti-PD-1 (ou seja, anticorpos antagonistas específicos para a molécula imunorreguladora humana PD-1). A administração de anticorpos anti-TIGIT em combinação com um anticorpo anti-ICOS ou anti-PD-1 resulta em uma redução sinérgica no crescimento do tumor em comparação com qualquer um dos anticorpos isoladamente. Espera- se que efeitos semelhantes sejam observados utilizando uma combinação de um anticorpo anti-TIGIT de acordo com a invenção e um anticorpo anti-PD-L1.

[0194] É ainda demonstrado neste documento que os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são particularmente eficazes quando administrados em combinação com um anticorpo agonista específico para uma molécula coestimuladora do ponto de verificação imune - especificamente anti- 4-1BB, anti-OX40 ou anti-GITR anticorpos agonistas. A administração de anticorpos anti-TIGIT em combinação com um anticorpo agonista anti-4-1BB, anti- OX40 ou anti-GITR resulta em uma redução sinérgica no crescimento do tumor em comparação com qualquer um dos anticorpos isoladamente.

[0195] Em um aspecto adicional, é fornecido um produto de combinação compreendendo um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um ou mais de um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno fornecido de acordo com a invenção. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH),

HCDR2 compreende a SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG), HCDR3 compreende a SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV), LCDR1 compreende a SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA), LCDR2 compreende SEQ ID NO: 62 (GASSRAT), e LCDR3 compreende a SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

[0196] Também é fornecida uma combinação como fornecida neste documento para uso em um método de tratamento de câncer ou infecção viral, opcionalmente em que a infecção viral é uma infecção por CMV. Além disso, é fornecida uma combinação como fornecida neste documento para uso em um método fornecido neste documento.

[0197] Conforme usado neste documento, onde dois ou mais agentes ativos são fornecidos como uma "combinação", "combinação terapêutica" ou "terapia de combinação" (os termos são usados de forma intercambiável), isso não requer ou exclui que os agentes ativos sejam formulados em uma única composição. Uma terapia de combinação recebe sua interpretação convencional de dois ou mais agentes ativos a serem administrados, de modo que o paciente possa obter um benefício de cada agente. A “terapia combinada” não requer coformulação, coadministração, administração simultânea ou formulação de dose fixa.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[0198] Os anticorpos TIGIT, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, e as composições farmacêuticas fornecidas neste documento podem ser utilizados para inibir o crescimento de células tumorais cancerígenas in vivo e, portanto, são úteis no tratamento de tumores.

[0199] Por conseguinte, outros aspectos da invenção se relacionam com métodos de inibição do crescimento de células tumorais em um paciente humano e também métodos de tratamento ou prevenção de câncer, que compreendem a administração a um paciente com necessidade de uma quantidade eficaz de um anticorpo TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno, como descrito neste documento, uma composição farmacêutica como descrita neste documento ou uma combinação como descrita neste documento.

[0200] Outro aspecto da invenção fornece um anticorpo TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito neste documento para uso na inibição do crescimento de células tumorais em um paciente humano. Ainda um outro aspecto da invenção fornece um anticorpo TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito neste documento para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um paciente humano.

[0201] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de depleção seletiva de células Treg em um paciente com câncer, o método compreendendo a administração de um anticorpo anti-TIGIT ou seu fragmento de ligação ao antígeno ao paciente. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT se liga a um epítopo no TIGIT humano compreendendo os resíduos Q56, N58, E60, I68 L73, H76 e I109, consistindo preferencialmente nos resíduos Q56, N58, E60, I68 L73, H76 e I109. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT é um anticorpo anti-TIGIT fornecido neste documento.

[0202] Em certas modalidades, o anticorpo anti-TIGIT compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: HCDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH), HCDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG), HCDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV), LCDR1 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA), LCDR2 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 62 (GASSRAT) e LCDR3 compreende ou consiste em SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

[0203] Em certas modalidades preferidas, o paciente a ser tratado tem um câncer selecionado entre: câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer de mama, tumores cerebrais, leucemias crônicas ou agudas, incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, crônica leucemia linfocítica, linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primário do SNC, linfoma de células B (por exemplo, LLC), linfoma de células T (por exemplo, síndrome de Sezary)), carcinomas nasofaríngeos, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático), câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer ósseo, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço (por exemplo, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC)), carcinoma cutâneo, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, uterino câncer,

câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer testicular, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, tumores sólidos na infância, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de pelve renal, neoplasia do sistema nervoso central (SNC), angiogênese tumoral, tumor no eixo espinhal, glioma do tronco encefálico, adenoma da hipófise, sarcoma de Kaposi, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, mesotelioma. Em certas modalidades, o câncer inibido é câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de rim (por exemplo, carcinoma renal), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, HNSCC) ou câncer de cólon (por exemplo, adenocarcinoma de cólon). Em certas modalidades, o câncer é câncer de cólon (por exemplo, adenocarcinoma do cólon) ou câncer de pulmão. Em certas modalidades, o câncer é um câncer de sangue. Em certas modalidades, o câncer é linfoma. Em certas modalidades, o câncer é linfoma de células T ou linfoma de células B.

[0204] Em certas modalidades, o método de tratamento de câncer compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente quimioterapêutico.

[0205] Como demonstrado neste documento, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são particularmente eficazes quando administrados em combinação com inibidores do ponto de verificação imune - especificamente anticorpos antagonistas anti-ICOS ou anticorpos anti-PD-1 (ou seja, anticorpos antagonistas específicos para a molécula imunorreguladora humana PD-1). A administração de anticorpos anti-TIGIT em combinação com um anticorpo anti-ICOS ou anti-PD-1 resulta em uma redução sinérgica no crescimento do tumor em comparação com qualquer um dos anticorpos isoladamente. Espera- se que efeitos semelhantes sejam observados utilizando uma combinação de um anticorpo anti-TIGIT de acordo com a invenção e um anticorpo anti-PD-L1.

[0206] É ainda demonstrado neste documento que os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são particularmente eficazes quando administrados em combinação com um anticorpo agonista específico para uma molécula coestimuladora do ponto de verificação imune - especificamente anti- 4-1BB, anti-OX40 ou anti-GITR anticorpos agonistas. A administração de anticorpos anti-TIGIT em combinação com um anticorpo agonista anti-4-1BB, anti- OX40 ou anti-GITR resulta em uma redução sinérgica no crescimento do tumor em comparação com qualquer um dos anticorpos isoladamente.

[0207] Portanto, também é fornecido neste documento um método de tratamento de câncer em um sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a invenção e também administrar uma quantidade eficaz de um anti- PD-1 anticorpo, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40 e anticorpo anti GITR ou um anticorpo anti-ICOS.

[0208] Além disso, os dados fornecidos neste documento demonstrando que os anticorpos anti-TIGIT podem aumentar a atividade das células γδ, bem como as células T convencionais, indicam que os anticorpos anti-TIGIT podem ser utilizados para tratar outras condições além do câncer. Em particular, sabe-se que as células T γδ são importantes na resposta à infecção, por exemplo, infecção bacteriana, fúngica ou viral. Como mostrado no Exemplo 29, quando contatadas com um anticorpo anti-TIGIT, as células T γδ de indivíduos soropositivos para CMV exibem ativação acentuadamente aumentada, caracterizada por um aumento na seção de IFNg. A capacidade de promover a ativação de células T γδ em pacientes com CMV dessa maneira indica que a administração de um anticorpo anti-TIGIT promoverá a atividade antiviral das células T γδ.

[0209] Por conseguinte, é proporcionado neste documento um método de tratamento de infecção viral em um sujeito compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-TIGIT ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Também é fornecido um método de tratamento de infecção viral em um sujeito que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação a antígeno ou uma composição farmacêutica fornecida neste documento ao sujeito, tratando assim a infecção viral. Em modalidades preferidas, a infecção viral é uma infecção por CMV.

[0210] Em certas modalidades, o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em certas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos são selecionados dentre: um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti GITR e um anti-ICOS anticorpo.

[0211] Como demonstrado nos Exemplos, os anticorpos anti-TIGIT divulgados neste documento são eficazes para promover a atividade das células T, especialmente a atividade das células T pró-inflamatórias. A atividade total pode ser medida por métodos familiares dos versados na técnica, por exemplo, medindo a produção de IFNg como descrito nos Exemplos.

[0212] Por conseguinte, também é fornecido neste documento um método para promover a atividade das células T compreendendo o contato de uma população de células T com um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como descrito neste documento.

[0213] Em certas modalidades, o método de promoção da atividade das células T é realizado in vitro. Em certas modalidades, o método de promoção da atividade das células T é realizado in vivo em um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito humano tem câncer. Em certas modalidades, o sujeito humano tem uma infecção viral, por exemplo, infecção por CMV.

[0214] Em certas modalidades, o método promove a atividade convencional das células T αβ. Em certas modalidades, o método promove a atividade das células T CD4. Em certas modalidades, o método promove a atividade das células T CD8. Em certas modalidades, o método promove a atividade das células T γδ (gama-delta).

[0215] É ainda demonstrado nos Exemplos que os anticorpos anti-TIGIT divulgados neste documento serão especialmente eficazes na promoção da atividade das células T quando utilizados em combinação com um anticorpo anti- PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR ou um anticorpo anti-ICOS. Significativamente, a combinação fornece um aumento sinérgico (isto é, maior que o aditivo) na atividade das células T.

[0216] Por conseguinte, em certas modalidades, o método de promover a atividade das células T compreende ainda o contato da população de células T com um ou mais dos seguintes: um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

[0217] As variantes e equivalentes das modalidades da invenção descritas neste documento, mas que não se afastam do espírito e escopo da invenção, serão familiares para o versado na técnica. A invenção será mais bem interpretada com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS Exemplo 1: Seleção de proteínas de ligação ao antígeno TIGIT

[0218] Os ABPs TIGIT foram selecionados a partir de uma biblioteca sintética de anticorpos humanos expressos e apresentados na superfície das células de levedura no formato IgG geralmente como descrito, por exemplo, no documento WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; e Xu et al., Protein Eng Des Sel., vol. 26 (10), pp. 663-670 (2013)) e, mais especificamente, conforme fornecido abaixo. As sequências e características dos ABPs isolados da biblioteca recombinante são fornecidas nas Figuras 1 a 6.

[0219] Oito bibliotecas de levedura sintética humana ingênua, cada uma com ~109 diversidade foram propagadas como descrito anteriormente (see, e.g.,: Xu et al, , 2013; WO2009036379; WO2010105256; and WO2012009568). Para as duas primeiras rodadas de seleção, foi realizada uma técnica de triagem de esferas magnéticas utilizando o sistema Miltenyi MACS, conforme descrito (see, e.g., Siegel et al., 2004). Resumidamente, células de levedura (~1010 células/biblioteca) foram incubadas com antígeno TIGIT-Fc biotinilado (Creative Biomart) em tampão de lavagem FACS (solução salina tamponada com fosfato (PBS)/albumina sérica bovina 0,1% (BSA)). Depois de lavar uma vez com 50 ml de tampão de lavagem gelado, o pelete celular foi ressuspenso em 40 ml de tampão de lavagem e foram adicionadas Streptavidin MicroBeads (500 ml) à levedura e incubadas durante 15 min a 4°C. Em seguida, as leveduras foram sedimentadas, ressuspensas em 5 ml de tampão de lavagem e carregadas numa coluna Miltenyi LS. Após os 5 mL terem sido carregados, a coluna foi lavada 3 vezes com 3 mL de tampão de lavagem FACS. A coluna foi então removida do campo magnético e a levedura foi eluída com 5 ml de meio de crescimento e depois cultivada durante a noite. Os seguintes ciclos de triagem foram realizados usando citometria de fluxo. Aproximadamente 1×108leveduras foram sedimentadas, lavadas três vezes com tampão de lavagem e incubadas com antígeno de fusão TIGIT-Fc biotinilado (10 nM) sob condições de equilíbrio à temperatura ambiente. A levedura foi então lavada duas vezes e corada com LC-FITC (diluído 1: 100) e com os reagentes secundários SA-633 (diluído 1: 500) ou EA-PE (diluído 1:50) durante 15 min a 4°C. Após lavagem duas vezes com tampão de lavagem gelado, os peletes de células foram ressuspensos em 0,4 ml de tampão de lavagem e transferidos para tubos de separação com filtro de filtro. A classificação foi realizada usando um classificador FACS ARIA (BD Biosciences) e as portas de classificação foram designadas para selecionar pastas específicas em relação a um controle de plano de fundo. Rodadas de seleção subsequentes foram empregadas para reduzir o número de ligantes não específicos utilizando proteínas de membrana solúveis de células CHO (ver, por exemplo, WO2014179363 e Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol. 26 (10), pp. 663-670 (2013)) e identifique ligantes com maior afinidade com o TIGIT usando o antígeno TIGIT- Fc. Após a rodada final de triagem, as leveduras foram plaqueadas e colônias individuais foram selecionadas para caracterização e para nomeação de clones para maturação por afinidade. 63 clones foram triados quanto a atividade funcional. A partir da triagem, os clones 26518, 26452, 26486, 26521 e 26493 apresentaram a melhor atividade funcional e foram selecionados para otimização adicional. Exemplo 2: Otimização de Anticorpo

[0220] A otimização de clones não expostos foi realizada utilizando três estratégias de maturação: diversificação da cadeia leve; diversificação de HCDR1 e HCDR2; e diversificação de HCDR3 dentro dos conjuntos de diversidade HCDR1 e HCDR2 selecionados.

[0221] Diversificação de cadeia leve: regiões variáveis de cadeias pesadas foram extraídas de produtos virgens (descritos acima) e transformados em uma biblioteca de cadeias leves com uma diversidade de 1 x 106. As seleções foram realizadas como descrito acima com uma rodada de classificação MACS e três rodadas de classificação FACS usando o antígeno TIGIT-HIS biotinilado 10 nM ou 1 nM (Creative Biomart) para as respectivas rodadas.

[0222] Seleção de HCDR1 e HCDR2: Os HCDR3s de clones selecionados a partir do procedimento de diversificação de cadeia leve foram recombinados em uma biblioteca pré-fabricada com variantes de HCDR1 e HCDR2 de uma diversidade de 1 x 108 e as seleções foram realizadas usando o antígeno HIS-TIGIT monomérico. As pressões de afinidade foram aplicadas usando concentrações decrescentes de antígeno HIS-TIGIT biotinilado (100 a 1 nM) sob condições de equilíbrio à temperatura ambiente.

[0223] Seleções de HCDR3/HCDR1/HCDR2: Oligos foram solicitados no IDT que compreendia o HCDR3, bem como uma região de flanco homóloga em ambos os lados do HCDR3. As posições de aminoácidos no HCDR3 foram variadas através da diversidade de NNK em duas posições por oligo em todo o HCHR3. Os oligos de HCDR3 foram de cadeia dupla usando primers que emparelharam a região flanqueadora do HCDR3. O restante FWR1 a FWR3 da região variável de cadeia pesada foi amplificado a partir de conjuntos de anticorpos com afinidade aprimorada que foram isolados das diversidades HCDR1 e HCDR2 selecionadas acima. A biblioteca foi então criada transformando o oligo HCDR3 de fita dupla, os fragmentos reunidos de FWR1 em FWR3 e o vetor de expressão da cadeia pesada em levedura já contendo a cadeia leve do parental original não exposto. As seleções foram realizadas como nos ciclos anteriores, usando a classificação FACS por quatro rodadas. Para cada rodada FACS, as bibliotecas foram avaliadas quanto à ligação de PSR, reatividade cruzada de espécies e pressão de afinidade, e a classificação foi realizada para obter populações com as características desejadas. As pressões de afinidade para essas seleções foram realizadas como descrito acima na seleção HCDR1 e HCDR2. Exemplo 3: Produção e Purificação de Anticorpo A. Produção em leveduras

[0224] De modo a produzir quantidades suficientes de anticorpos selecionados otimizados e não otimizados para caracterização adicional, os clones de levedura foram cultivados até à saturação e depois induzidos durante 48 h a 30°C com agitação. Após indução, as células de levedura foram peletizadas e os sobrenadantes foram coletados para purificação. As IgG foram purificadas utilizando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Os fragmentos Fab foram gerados por digestão com papaína e purificados em um processo de duas etapas sobre Proteína A (GE LifeSciences) e KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences). B. Produção em células de mamíferos

[0225] A fim de produzir quantidades suficientes de anticorpos selecionados otimizados e não otimizados para caracterização adicional, o vetor de DNA que codifica para clones de anticorpos específicos foi gerado e transduzido em células HEK. Fragmentos de DNA sintético otimizados para códon humano para domínios variáveis de anticorpos foram encomendados em Geneart. As sequências de domínio variável foram perfeitamente ligadas a vetores de expressão pUPE contendo a sequência de sinal IgKappa de camundongo e regiões constantes da respectiva classe de anticorpos. Os vetores de expressão foram verificados por análise de restrição e sequenciamento de DNA. Para transfecção transitória, foram produzidos maxipreps de DNA livre de endotoxina (Sigma) e os vetores de cadeia pesada e leve foram cotransfectados em células HEK293EBNA1, em meio Freestyle (ThermoFisherScientific), de acordo com os protocolos estabelecidos. Foi adicionado Primatone (volume final a 0,55%) 24 horas após a transfecção. O meio condicionado foi coletado 6 dias após a transfecção. Os anticorpos foram purificados em lotes por cromatografia de afinidade Mabselect sureLX (GE Healthcare). Os anticorpos ligados foram lavados em 2 etapas com PBS contendo NaCl 1M e PBS. Os anticorpos foram eluídos com Citrato a 20 mM, NaCl a 150 mM e pH 3 e foram neutralizados até aproximadamente pH 7 com 1/6 de volume de 1M de K2HPO4/KH2PO4 a pH 8.

[0226] Em seguida, os anticorpos foram ainda purificados por filtração em gel usando uma coluna Superdex200, equilibrada em PBS. As frações foram analisadas por NuPAGE e as frações contendo anticorpos foram reunidas. Os produtos finais foram esterilizados sobre um filtro de seringa a 0,22 µM. O produto foi analisado por NuPAGE e os níveis de endotoxina foram medidos por ensaio LAL. Exemplo 4: Determinação de afinidade para ligação de anticorpos anti- TIGIT à proteína TIGIT humana recombinante A. Medições ForteBio KD

[0227] As medições de afinidade ForteBio dos anticorpos selecionados foram realizadas geralmente como descrito anteriormente (ver, por exemplo, Estep et al., Mabs, Vol. 5 (2), pp. 270-278 (2013)). Resumidamente, as medições de afinidade de ForteBio foram realizadas carregando IgGs on-line nos sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados fora da linha em tampão de ensaio durante 30 min e depois monitorados em linha durante 60 segundos para o estabelecimento da linha de base. Os sensores com IgGs carregados foram expostos ao antígeno 100 nM (TIGIT-Fc humano, TIGIT-His humano ou cyno TIGIT-Fc) por 5 minutos, depois foram transferidos para o tampão de ensaio por 5 minutos para medição fora da taxa. A cinética foi analisada usando o modelo de ligação 1:1. Mais de 90 anticorpos foram testados quanto à afinidade por ForteBio e a Tabela 3 fornece dados para 15 anticorpos anti-TIGIT selecionados, demonstrando forte ligação à proteína TIGIT recombinante. B. Medições MSD-SET KD

[0228] As medições de afinidade de anticorpos selecionados foram realizadas geralmente como descrito anteriormente (Estep et al., Mabs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)). Resumidamente, as titulações em equilíbrio da solução (SET) foram realizadas em PBS + 0,1% IgG-Free BSA (PBSF) com antígeno (monômero TIGIT-His) mantido constante a 10-100 pM e incubado com diluições em série de 3 a 5 vezes Fab ou mAb a partir de 10 pM-10 nM. Anticorpos (20 nM em PBS) foram revestidos sobre placas de MSD-ECL de ligação padrão durante a noite a 4°C ou temperatura ambiente durante 30 minutos. As placas foram então bloqueadas por BSA durante 30 minutos com agitação a 700 rpm, seguido por três lavagens com tampão de lavagem (PBSF + Tween 20 a 0,05%). Amostras SET foram aplicadas e incubadas nas placas por 150 segundos com agitação a 700 rpm seguido de uma lavagem. O antígeno capturado numa placa foi detectado com 250 ng/mL de estreptavidina marcada com sulfotag em PBSF por incubação na placa durante 3 min. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e depois lidas no instrumento MSD Sector Imager 2400 utilizando 1x Read Buffer T com surfactante. O percentual de antígeno livre foi plotado em função do anticorpo titulado em Prism e ajustado a uma equação quadrática para extrair o KD. Para melhorar o rendimento, robôs de manuseio de líquidos foram utilizados em experimentos MSD- SET, incluindo preparação de amostras SET. Os anticorpos selecionados foram testados quanto à afinidade por MSD e a Tabela 4 fornece dados para 7 clones anti-TIGIT demonstrando forte ligação à proteína TIGIT recombinante. Tabela 4: Análise de afinidade MSD para anticorpos anti-TIGIT selecionados Clone Afinidade MSD TIGIT-His KD (M) humano monovalente 29489 1.1E-10 29494 7.0E-11 29499 1.9E-11 29513 2.5E-11 29520 2.1E-10 29523 1.7E-09 29527 6.4E-10 C. Medição Biacore

[0229] A análise do biossensor foi realizada a 25 °C em um sistema tampão HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante 0,05% P20) usando um biosensor óptico Biacore 8K encaixado com um chip sensor CM5 (GE Healthcare Marlboro, MA). O hotel de amostra foi mantido a 8 °C. O anticorpo de captura de IgG anti-humano de cabra (específico para o fragmento Fcγ, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; 109-005-098) foi imobilizado (11700 +/- 200 RU) nas duas células de fluxo do chip sensor usando a química padrão de acoplamento de amina. Este tipo de superfície forneceu um formato para captura reproduzível de anticorpos de análise frescos após cada etapa de regeneração. A célula de fluxo 2 foi usada para analisar o anticorpo capturado (60- 90 RU) enquanto a célula de fluxo 1 foi usada como uma célula de fluxo de referência. Concentrações de antígeno variando de 30 a 0,123 nM (diluições de 3 vezes) foram preparadas em tampão de execução. Cada uma das concentrações da amostra de antígeno foi realizada como uma única réplica. Também foram realizadas duas injeções em branco (tampão) e usadas para avaliar e subtrair artefatos do sistema. As fases de associação (300 s) e dissociação (600 s) para todas as concentrações de antígeno foram realizadas a uma taxa de fluxo de 30 uL/min. A superfície foi regenerada com três injeções sequenciais (15 s, 15 se 60 s) de glicina 10 mM, pH 1,5 a uma taxa de fluxo de 30 uL/min. Os dados foram alinhados, com dupla referência e ajustados ao modelo de ligação 1: 1 usando o Biacore 8K Evaluation Software, versão 1.0. Os anticorpos selecionados foram testados quanto à afinidade por Biacore e a Tabela 5 fornece dados para 5 clones anti-TIGIT demonstrando forte ligação à proteína TIGIT recombinante. Tabela 5: Análise de afinidade Biacore para anticorpos anti-TIGIT selecionados Clone Biacore: KD monovalente (M) (IgG no chip CM5, humano TIGIT-HIS em solução (concentração inicial de 25nM, diluição de 3x) 29489 2.48E-10 31282 2.94E-10 29494 2.70E-10 29520 7.16E-10 29527 1.20E-09 31288 1.92E-10 Exemplo 5: Ensaio de competição entre anticorpos antagonistas anti- TIGIT e ligantes naturais de TIGIT A. Octet Red384 Bloqueio de epítopo/bloqueio de ligante

[0230] O bloqueio do encapsulamento/ligante do epítopo de anticorpos selecionados foi realizado utilizando um ensaio de bloqueamento cruzado de formato sanduíche convencional. A IgG anti-alvo de controle foi carregada nos sensores AHQ e os sítios de ligação a Fc não ocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo IgG1 humano irrelevante. Os sensores foram então expostos ao antígeno alvo 100 nM (hTIGIT, Creative Biomart), seguido por um segundo anticorpo ou ligante anti-alvo (anticorpo anti-TIGIT e CD155 ou CD113 ou CD112). Os dados foram processados usando o Data Analysis Software 7.0 da ForteBio. A ligação adicional pelo segundo anticorpo ou ligante após a associação do antígeno indica um epítopo não ocupado (não competidor), enquanto nenhuma ligação indica o bloqueio do epítopo (competidor ou bloqueador de ligante). Os anticorpos parentais (antes da otimização) foram testados quanto à competição com ligantes naturais e a Tabela 6 resume os dados obtidos para competição contra CD155, CD112 e CD113. Verificou-se que o clone parental 26432 não competia com CD155 pela ligação a TIGIT. Todos os outros anticorpos anti-TIGIT selecionados competem com o ligante natural pela ligação à proteína TIGIT humana recombinante. Tabela 6: Análise de binning contra ligantes naturais TIGIT para anticorpos anti-TIGIT não otimizados Clone Competição CD155 Competição Competição CD112 CD113 26518 Sim Sim Sim 26452 Sim Sim Sim 26486 Sim Sim Sim 26521 Sim Sim Sim 26493 Sim Sim Sim 26432 Nº B. Competição de anticorpos antagonistas anti-TIGIT com CD155 em Jurkat-hTIGIT

[0231] As células Jurkat que superexpressam TIGIT humano (Jurkat- hTIGIT) foram coletadas e distribuídas em 105 células/poço e incubadas com anticorpos TIGIT anti-humanos nas seguintes concentrações: 166.6; 53.24; 17.01;

5.43; 1.73; 0.55; 0.17; 0.05; 0.01; 5.78x10-3 ; 1.85x10-3; 5.9x10-3 nM em meio completo durante 45 minutos a 37 °C. O excesso de anticorpo foi lavado e, em seguida, as células foram incubadas com CD155-His a 5 µg/ml (Creative Biomart, PVR-3141H) por 45 minutos a 37 °C. Em seguida, o CD155-His ligado foi detectado usando o anti-His tag-PE (Biolegend, 362603, a 2 µl por teste), incubado por 30 min a 4 °C. As células foram analisadas por FACS usando BD LSRFortessa e a meia concentração (IC50) que impede a ligação de CD155 foi calculado com base na fluorescência média geométrica.

[0232] Os resultados foram os seguintes: 0.101 nM para o clone 29489;

0.07nM para o clone 29494; 0.102 nM para o clone 29520 e 0.078 nM para o clone

29527, para os resultados ilustrados na Fig.7. Os valores de outros anticorpos testados estão resumidos na Tabela 7 abaixo. No geral, os resultados demonstram uma forte competição dos anticorpos anti-TIGIT antagonistas testados com CD155 pela ligação ao TIGIT expresso por membrana. Tabela 7: Dados do IC50 para a competição CD155 no TIGIT humano Clone Competição CD155 de IC50 para ligação a TIGIT (em nM) 29489 0,101 29494 0,070 29499 103 29513 0,094 29520 102 29523 0,079 29527 0,078 Exemplo 6: Caracterização da Cromatografia de Interação Hidrofóbica (MAbs. 2015 maio-junho; 7(3):553–561.)

[0233] As amostras de anticorpo anti-TIGIT IgG1 foram trocadas de tampão para sulfato de amônio 1 M e fosfato de sódio 0,1 M a pH 6,5 usando uma coluna de rotação Zeba 40 kDa 0,5 mL (Thermo Pierce, cat # 87766). Um gradiente de sal foi estabelecido em uma coluna Dionex ProPac HIC-10 a partir de sulfato de amônio 1,8 M, fosfato de sódio 0,1 M a pH 6,5 para a mesma condição sem sulfato de amônio. O gradiente funcionou por 17 min a uma taxa de fluxo de 0,75 ml/min. Uma etapa de lavagem com acetonitril foi adicionada no final da execução para remover qualquer proteína restante e a coluna foi reequilibrada ao longo de 7 volumes da coluna antes do próximo ciclo de injeção. Os tempos máximos de retenção foram monitorados na absorvância A280 e as concentrações de sulfato de amônio na eluição foram calculadas com base no gradiente e na taxa de fluxo. A Tabela 8 resume os resultados obtidos para 15 anticorpos anti-TIGIT selecionados. Tabela 8: Análise da cromatografia de interação hidrofóbica para anticorpos anti-TIGIT selecionados Clone Tempo de retenção da cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) (min) 26518 10,4 29478 12,7 26452 9,3 29487 9,9 29489 10,6 26486 11,0 29494 9,7 29499 9,1 26521 12,4 29513 12,5 26493 8,8 29520 9,6 29523 8,7 29527 8,6 26432 11,1 32919 9,0 32931 9,3 32959 12,0 Exemplo 7: Caracterização do reagente de poliespecificidade de preparação de PSR A. Preparação do reagente de poliespecificidade :

[0234] O reagente de poliespecificidade (PSR) foi preparado de acordo com Xu et.al, mAbs 2013. Em resumo, foram utilizadas células CHO-S de 2,5 litros como material de partida. As células foram sedimentadas a 2.400 xg por 5 min em frascos de 500 mL de centrífuga preenchidos com 400 mL. Os peletes de células foram combinados e depois ressuspensos em 25 ml de Tampão B e sedimentados a

2.400 xg por 3 min. O tampão foi decantado e a lavagem repetida uma vez. Os peletes de células foram ressuspensos em 3x o volume de pelete de Tampão B contendo 1 x inibidores de protease (Roche, complemento, isento de EDTA) usando um homogeneizador de politron com as células mantidas em gelo. O homogenato foi então centrifugado a 2.400 xg por 5 min e o sobrenadante retido e sedimentado mais uma vez (2.400 xg/5min) para garantir a remoção de células, fragmentos celulares e núcleos não quebrados; o sobrenadante resultante é a preparação total de proteínas. O sobrenadante foi então transferido para dois tubos de centrífuga Nalgene Oak Ridge de 45 mL e pelete a 40.000 xg por 40 minutos a 4 °C. Os sobrenadantes contendo as Proteínas Citossólicas Separadas (SCPs) foram então transferidos para tubos limpos de Oak Ridge e centrifugados a 40.000 xg mais uma vez. Paralelamente, os peletes contendo a fração de membrana (EMF) foram retidos e centrifugados a 40.000 por 20 min para remover o sobrenadante residual. Os peletes de EMF foram então lavados com Tampão B. Em seguida, foram adicionados 8 mL de Tampão B aos peletes de membrana para desalojar os peletes e transferir para um Homogeneizador Dounce. Após a homogeneização dos peletes, eles foram transferidos para um tubo cônico de 50 mL e representaram a preparação final de EMF.

[0235] Um bilhão de células de mamíferos (por exemplo, CHO, HEK293, Sf9) a ~106 – 107 células/mL foram transferidos do ambiente de cultura de tecidos para tubos cônicos de 4x 250 mL e sedimentados a 550 xg por 3 min. Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 4 °C ou no gelo com tampões gelados. As células foram lavadas com 100 mL de PBSF (1x PBS + 1 mg/mL de BSA) e combinadas em um tubo cônico. Após a remoção do sobrenadante, o pelete celular foi ressuspenso em 30 mL de Tampão B (HEPES 50 mM, NaCl 0,15 M, 2 mM de CaCl2, KCl 5 mM, 5 mM de MgCl2, 5 mM de MgCl2, glicerol a 10%, pH 7,2) e sedimentado a 550 xg por 3 min. O sobrenadante do Tampão B foi decantado e as células ressuspensas em 3x o volume de pelete de Tampão B mais 2,5x do inibidor da protease (Roche, cOmplete, livre de EDTA). Os inibidores de protease no Tampão B foram incluídos daqui em diante. As células foram homogeneizadas quatro vezes por pulsos de 30 segundos (homogeneizador Polyton, PT1200E) e a fração da membrana foi sedimentada a 40.000 xg por 1 hora a 4 C. O pelete é lavado com 1 mL de Tampão B; o sobrenadante é retido e representa o s. O pelete é transferido para um homogeneizador Dounce com 3 mL de tampão B e ressuspenso movendo o pilão lentamente para cima e para baixo por 30-35 movimentos. A fração de membrana enriquecida (EMF) é movida para um novo tubo de coleta, lavando o pilão para coletar todas as proteínas em potencial.

Determine a concentração de proteína do EMF purificado usando o kit de ensaio de proteína Dc (BioRad). Para solubilizar o EMF, transfira para o tampão de solubilização (HEPES 50 mM, 0,15 M de NaCl, 2 mM de CaCl2, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1% de n-dodecil-bD-maltopiranósido (DDM), 1x inibidor de protease, pH 7,2) para uma concentração final de 1 mg/mL. Gire a mistura durante a noite a rotação de 4 °C seguida por centrifugação em um tubo de Oak Ridge de 50 mL (Fisher Scientific, 050529-ID) a 40.000 xg por 1 hora. O sobrenadante, que representa as proteínas da membrana solúvel (SMPs), foi coletado e o rendimento da proteína quantificado como descrito acima.

[0236] Para biotinilação, prepare a solução-mãe NHS-LC-Biotina de acordo com o protocolo do fabricante (Pierce, Thermo Fisher). Em resumo, são adicionados 20 µL de reagente de biotina para cada 1 mg de amostra de CEM e incubados a 4 °C por 3 horas com agitação suave. Ajuste o volume para 25 mL com tampão B e transfira para um tubo de centrífuga Oak Ridge. pelete do EMF biotinilado (b-EMF) a 40.000 xg por 1 hora e enxágue duas vezes com 3 mL de tampão C (Tampão B menos o glicerol) sem perturbar o pelete. Retire a solução residual. O pelete foi ressuspenso com um homogeneizador Dounce em 3 mL de Tampão C, como descrito anteriormente. O pelete ressuspenso agora representa EMF biotinilado (b-EMF) e é solubilizado como descrito acima para preparar b- SMPs. B. Análises de ligação ao PSR

[0237] As análises de PSR foram realizadas geralmente como descrito em WO2014/179363. Resumidamente, para caracterizar o perfil de PSR dos anticorpos monoclonais apresentados na levedura, dois milhões de leveduras apresentadoras de IgG foram transferidas para uma placa de 96 poços e peletes a 3000 xg por 3 min para remover o sobrenadante. Ressuspenda o pelete em 50 ul de diluição 1:10 recém-preparada de b-PSRs e incubar em gelo por 20 minutos. Lave as células duas vezes com 200 ul de PBSF frio e o pelete ressuspenso em 50 ul da mistura de marcação secundária (Extravidin-R-PE, LC-FITC anti-humano e iodeto de propídio). Incube a mistura em gelo por 20 minutos, seguida de duas lavagens com 200 ul de PBSF gelado. Ressuspenda as células em 100 ul de PBSF gelado e execute a placa em um FACS Canto (BD Biosciences) usando o injetor de amostra HTS. Os dados de citometria de fluxo foram analisados quanto à intensidade média de fluorescência no canal de R-PE e normalizados para controles apropriados para avaliar a ligação não específica. A Tabela 9 resume os resultados da ligação do reagente de especificidade poli obtida para 15 anticorpos anti-TIGIT selecionados que confirmam uma pontuação baixa para a maioria dos clones. Tabela 9: Análise do reagente de poliespecificidade Clone Pontuação do Reagente de Poliespecificidade (PSR) (0-1) 26518 0,00 29478 0,01 26452 0,00 29487 0,01 29489 0,01 26486 0,00 29494 0,00 29499 0,10 26521 0,00 29513 0,01 26493 0,00 29520 032 29523 0,12 29527 0,12 26432 0,00 31288 0,00 32919 0,00 32931 0,00 32959 0,1 Exemplo 8: Caracterização da expressão de TIGIT em populações imunes de PBMC humano saudável A. Perfil de expressão TIGIT em subconjuntos de células T

[0238] Análises por citometria de fluxo foram realizadas para avaliar a expressão de TIGIT em subconjuntos de células imunes em PBMC recentemente isoladas de indivíduos saudáveis. Os anticorpos conjugados foram adquiridos da Ebioscience/Thermo Fisher Scientific, BioLegend ou BD Biosciences. As células foram coradas de acordo com as instruções do fabricante, usando tampão FACS filtrado (PBS + 2 mM de EDTA + 0,1% BSA) e tampão Brilliant Stain (BD # 563794). As células foram bloqueadas com FcBlock Humano apropriado (BD # 564220) antes da coloração e foram fixadas usando tampão de fixação IC (eBioscience # 00-8222-49) antes da aquisição. A aquisição foi realizada num FACS Fortessa (BD Biosciences) e analisada com o software FlowJo (FlowJo, LLC). As células viáveis foram separadas na dispersão Forward e Side. Vários subconjuntos de células imunes foram separados da seguinte forma: CD19+ (células B), CD3- CD19- CD14+ (Monócitos), CD3+ TCRab- (células T TCRgd), CD3+ TCRab+ (células T TCRab), CD3- CD19- CD14- HLA-DR- CD56baixo/alto (células NK), CD3- CD19- CD14- HLA-DR+ (Células dendríticas), CD3+ TCRab+ CD4+ CD127low CD25+ (células T reguladoras), CD3+ TCRab+ CD4+ or CD8+ CD45RO- CCR7+ (células T não expostas CD4 ou CD8), CD3+ TCRab+ CD4+ ou CD8+ CD45RO+ (células T de memória) e CD45RO- CD62L- (células T efetoras),

[0239] Como mostrado nas Figuras 8A e 8B, o TIGIT é expresso preferencialmente em células NK, células T reguladoras e células T de memória CD8. Está presente em menor grau em outros subconjuntos de células T com uma baixa proporção de células T não expostas mostrando expressão TIGIT. Além disso, o TIGIT não é expresso em monócitos, células dendríticas e células B (Fig.8B). Este conjunto de dados está de acordo com os dados publicados (Yu et al. NI 2008 e Wang et al. EJI 2015). Exemplo 9: Ligação celular de anticorpos antagonistas anti-TIGIT A. Ligação de anticorpos anti-TIGIT a Jurkat-hTIGIT e Jurkat-mTIGIT

[0240] A afinidade dos anticorpos anti-TIGIT humanos foi medida utilizando células Jurkat E6.1 transduzidas com TIGIT humano (Jurkat hTIGIT) ou camundongo TIGIT(Jurkat-mTIGIT). Para analisar a afinidade dos anticorpos selecionados para hTIGIT ou mTIGIT, 105 células foram distribuídas por poço e incubadas com anticorpo anti-TIGIT em uma dose única de 100nM (Tabela 3) ou com concentração decrescente (166.6; 53.24; 17.01; 5.43; 1,73; 0.55; 0.17; 0.05;

0.01; 5.78x10-3; 1.85x10-3; 5.9x10-3 nM) de anticorpos selecionados (Fig. 9). Os anticorpos foram incubados com as células por 20 min a 4°C em tampão FACS. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humana (Fc gama específica) - PE (eBioscience, 12-4998-82, a 2.5 µg/ml) por 20 minutos em gelo e lavadas duas vezes. A intensidade média geométrica da fluorecência foi analisada usando LSR BD Fortessa. A ligação celular foi registrada como a intensidade média de florescência de PE na linha transfectada em comparação com a linha não transfectada para cada anticorpo (Tabela 3). Para o cálculo da ligação de EC50, a concentração semi-máxima de ligação (EC50) a hTIGIT-Jurkat foi calculada usando uma equação de ajuste de curva de quatro variáveis em Prism, e os valores obtidos foram os seguintes: 0.082 nM para o clone 29489; 0.07 nM para o clone 29494;

0.119 nM para o clone 29520 e 0.05 nM para o clone 29527 para os dados ilustrados na Fig.9. Os resultados demonstram uma forte ligação à TIGIT humana expressa em membrana para os anticorpos anti-TIGIT testados. B. Ligação de anticorpos antagonistas anti-TIGIT a células T primárias humanas

[0241] As PBMCs humanas isoladas de voluntários saudáveis foram analisadas quanto à ligação por anticorpos antagonistas anti-TIGIT. As células foram distribuídas a 5x105 células por poço. As células foram incubadas com anti- CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) e CD64 (BD Bioscience 555525) à temperatura ambiente por 10 min, e os anticorpos TIGIT anti-humanos indicados foram diretamente adicionado a uma concentração final de: 12.65; 4; 1.26; 0.40; 0.126; 0.040; 0.12 e 4x10-3 nM em tampão FACS e incubados por 20 min a 4 °C. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humano (gama específico Fc)-PE (eBioscience, 12-4998-82, a 2.5 µg/ml) durante 20 minutos a 4 °C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com os seguintes anticorpos e mistura de LVD para obter os resultados das Fig. 10A e 10B: anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8- BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919) e LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). Para Fig 10C, as células foram lavadas e incubadas com os seguintes anticorpos e mistura de LVD : LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867- 14), ant-TCRab-PercP-Cy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510

(Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8-APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), anti-CD127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) e anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229).

[0242] O valor de EC50 para a ligação a células T primárias humanas CD8+ foi calculado usando a% de células coradas com TIGIT positivas nas células T LVD- CD8+ fechadas (Fig. 10A e 10B). O valor de EC50 para a ligação a células T CD8+ ou primárias de memória humana foi calculado usando a% de células coradas com TIGIT positivas nas células T fechadas LVD-TCRab+CD45RO+CD8+(para células T CD8+ de memória) ou nas células T fechadas LVD-TCRab+CD127loCD25hiCD4+ (para Tregs) e são ilustradas na Fig. 10C.

[0243] Como mostrado na Fig. 10A, o valor de EC50 para a ligação às células T CD8+ humanas totais é 0.123nM para o clone 29489; 0.181nM, para o clone 29520 e 0.253nM para o clone 29527. Foi realizada uma comparação direta entre 29489 e 31282 (o mutante 29489 com uma mutação M para T no resíduo 116) e o valor de EC50 foi 0.057 nM e 0.086 nM, respectivamente, demonstrando uma forte e semelhante eficácia de ligação a células T CD8+ humanas primárias para os 2 clones (Fig 10B). Os valores de EC50 obtidos para ligação às células T CD8+ e Treg de memória foram 0.039 nM e 0.03 nM, respectivamente, demonstrando uma afinidade forte e semelhante para as duas populações (Fig. 10C). C. Ligação de anticorpos antagonistas anti-TIGIT a células T primárias de Cinomolgos

[0244] PBMCs isoladas de Macaca fascicularis foram obtidas do BioPRIM. As células foram descongeladas e estimuladas usando o kit de ativação/expansão de células T para primatas não humanos (Miltenyi Biotec) a 1: 2 (grânulo: razão celular), seguindo as especificações do fabricante. No dia seguinte, as células foram coletadas, contadas e distribuídas a 5x104 células por poço. As células foram incubadas com anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) e CD64 (BD Bioscience 555525) à temperatura ambiente por 10 min e os anticorpos TIGIT anti-humanos selecionados foram adicionados diretamente numa concentração final de: 12.65; 4; 1.26; 0.40; 0.126; 0.040; 0.12 e

4x10-3 nM em tampão FACS e incubados por 20 min a 4 °C. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humano (gama específico de Fc)-PE (eBioscience, 12-4998-82, a 2.5 µg/ml) durante 20 minutos a 4 °C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com os seguintes anticorpos e mistura de LVD para os dados ilustrados nas Fig. 11A e 11B: anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8- BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919), CD69- APC-Cy7 (Clone FN50, BioLegend, 310914) e LVD efluor 520 (eBioscience 65- 0867-14). As células coradas foram analisadas por FACS usando BD LSR Fortessa. O valor de EC50 de ligação foi calculado usando a% de células coradas com TIGIT positivas separadas nas células T LVD-CD69+CD8+. Como mostrado na Fig. 11, os valores de EC50 para a ligação a células T CD8+ de cinomolgos foram

0.487 nM para o clone 29489, 1.73 nM para o clone 29520 e 0.378 nM para o clone

29527. Os clones 29489 e 31282 (o mutante 29489 com uma mutação M para T no resíduo 116) também foram comparados e os valores de EC50foram de 0.25 nM e

0.26 nM, respectivamente, para o exemplo mostrado na Figura 11B, demonstrando uma similar e forte afinidade por células T CD8+ primárias de cinomolgos para os 2 clones. Exemplo 10: Caracterização funcional in vitro da atividade anti-TIGIT antagonista A. Bioensaio TIGIT na cocultura CHO-TCR-CD155 e Jurkat-hTIGIT

[0245] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano, cocultivamos células Jurkat, que expressam o hTIGIT e um repórter da luciferase ativado após o engatamento de TCR (células Thaw-and-Use TIGIT Effector da Promega), com a linhagem celular CHO-K1 projetada para expressar ativador humano de CD155 e TCR (Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 da Promega). A ativação de células Jurkat com superexpressão de TIGIT pode ser induzida por contato com células CHO-K1 que expressam CD155 após o engatamento de TCR em células Jurkat e pode ser aumentada na presença de anticorpo antagonista anti-TIGIT. Para comparar a potência dos diferentes anticorpos para aumentar a ativação das células Jurkat, a experiência foi conduzida na presença de concentrações crescentes de anticorpos e os valores de EC50 foram calculados.

[0246] As células Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, 5% de CO2 na incubadora O/N. No dia seguinte, as células Thaw-and-Use TIGIT Effector (Promega, CS198811) foram adicionadas de acordo com as recomendações do fabricante às placas de células CD155 aAPC/CHO-K1 contendo meio fresco completo com anticorpo anti-TIGIT a 133 nM (Figura 12A) ou aumentando concentrações (0,22; 0,54; 1,36; 3,41; 8,53; 21,3; 53,3; 133,33; e 333 nM) de anticorpo anti-TIGIT (Figura 12B) e incubadas em 37°C, 5% de CO2 durante 6 horas.

[0247] Após as 6 horas de incubação, a ativação da célula TIGIT Effector foi avaliada medindo-se a atividade da luciferase usando o Bio-GloTM Luciferase Assay System (Promega, G7941).

[0248] A Figura 12A mostra o efeito da adição dos clones selecionados no sinal da Luciferase em comparação com o controle do isotipo. Os dados demonstram a atividade antagônica dos anticorpos que resultaram em uma ativação mais forte das células Jurkat-hTIGIT. A Tabela 10 resume a fold change na expressão de luciferase obtida para os diferentes anticorpos anti-TIGIT comparada ao clone de controle de isotipo (03847). Tabela 10: Indução de fold change comparada a controle de isotipo Nome de Indução comparada a Clone controle de isotipo (fold change) 26518 2,89 29478 3,57 26452 2,9 29487 3,22 29489 4,08 26486 1,9 29494 3,42 29499 3,68 26521 2,66 29513 3,26

26493 0,96 29520 2,52 29523 2,4 29527 2,96 03847 1

[0249] Como mostrado na Figura 12B, a ativação de células Jurkat-hTIGIT foi avaliada com anticorpo anti-TIGIT entre 0,22 nM e 333 nM e deu um valor EC50 de 3,0 nM para o clone 29489; 4,4 nM para o clone 29494; 2,3 nM para o clone 29520 e 32 nM para o clone 29527; 2,7 nM para o clone 32919 e 3,2 nM para o clone 32931 demonstrando uma forte atividade funcional consecutiva ao bloqueio da sinalização inibitória de TIGIT. Os clones 29489 e 31282 (o mutante 29489 com uma mutação M para T no resíduo 116) também foram comparados, e os valores de EC50 foram respectivamente de 4,3 nM e 8,1 nM para o exemplo mostrado na Fig. 12C, demonstrando uma atividade funcional semelhante para os 2 clones. B. Ensaio funcional baseado em células T CD8+ humanas

[0250] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano, cocultivamos células T CD8+ humanas primárias de PBMC de doadores humanos saudáveis com a linhagem celular CHO-K1 projetada para expressar CD155 humano e ativar células T humanas. Observamos que a liberação de IFNg pelas células T CD8+ na presença de células CHO-K1 expressando CD155 manipuladas poderia ser aumentada pelo bloqueio de hTIGIT com anticorpos antagonistas anti-TIGIT. Para comparar a potência desses anticorpos em aumentar a liberação de IFNg, a experiência foi conduzida na presença de concentrações crescentes de anticorpos e os valores de EC50 foram calculados.

[0251] As células Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas em placas de 96 poços de fundo em U de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, 5% de CO2 da incubadora O/N. No dia seguinte, as células T CD8+ foram purificadas de acordo com as recomendações do fabricante, usando um kit de seleção negativa (Stemcell Technologies, 17953) de células mononucleares do sangue periférico humano congeladas isoladas do sangue total de doadores saudáveis (Immunehealth). As células T CD8 purificadas foram então incubadas com concentrações crescentes

(0,11 nM, 0,33 nM, 1,06 nM, 3,3 nM, 10,6 nM, 33,3 nM, 105,5 nM e 333 nM) de anticorpos (100.000 células T CD8/100 µL de meio completo contendo anticorpo) durante 1 hora. Depois disso, a mistura anticorpo-CD8 foi adicionada às placas de células CD155 aAPC/CHO-K1 contendo 50 µl de meio completo fresco e incubada a 37°C, 5% de CO2 durante 5 dias. Finalmente, as concentrações de IFNg foram avaliadas no sobrenadante celular utilizando um ensaio ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) que foi executado de acordo com as recomendações do fabricante.

[0252] Como mostrado na Fig. 13A, todos os anticorpos anti-TIGIT aumentaram a secreção de IFNg comparados ao controle do isotipo. O aumento mais alto foi observado com o clone 29489 (6,4 vezes), seguido por 29494 (5,8 vezes), 29520 (5,4 vezes), 29499 (5,2 vezes), 29527 (4,5 vezes) e 29513 (3,2 vezes).

[0253] Também foi realizado um estudo de faixa de doses (entre 0,22 nM e 333 nM de anticorpo anti-TIGIT) para avaliar o valor de EC50 para aumento da secreção de IFNg pelas células T CD8 primárias humanas. Como mostrado na figura 13B, o anticorpo anti-TIGIT 29489 mostrou a melhor atividade com um EC50 de 3,5 nM, seguido pelo clone 29527 EC50 = 5,1 nM), pelo clone 29494 (EC50 = 6,1nM) e pelo clone 29520 (EC50 = 11,1 nM). Finalmente, o clone 29489 e seu mutante 31282 foram testados em paralelo e demonstraram uma atividade semelhante com um valor de EC50 respectivo de 0,49 nM e 0,50 nM (Fig. 13C). No total, esses dados demonstram uma forte atividade funcional de anticorpos anti- TIGIT antagonistas para bloquear o sinal inibitório de TIGIT nas células T humanas CD8+ e para aumentar as funções efetoras, caracterizadas por um forte aumento na produção de IFNg. C. Ensaio funcional humano de TIL

[0254] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano em linfócitos infiltrantes de tumor (TILS) de pacientes com câncer, cocultivamos células T CD8+ humanas primárias de TILs de pacientes com ascite ovariana com linhagem celular CHO-K1 manipulada para expressar CD155 humano e ativar células T humanas. Observamos que a liberação de IFNg pelas células T CD8+ na presença de células CHO-K1 expressando CD155 manipuladas pode ser aumentada pelo bloqueio de hTIGIT com anticorpos antagonistas anti- TIGIT.

[0255] As células Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas em placas de 96 poços de fundo em U de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, 5% de CO2 da incubadora O/N. No dia seguinte, as células T CD8 foram purificadas de acordo com as recomendações do fabricante, usando um kit de seleção negativa (Stemcell Technologies, 17953) de TILs humanos congelados isolados de ascites ovarianas (Immunehealth). As células T CD8+ purificadas foram então incubadas com o clone 26452 do anticorpo anti-TIGIT, o progenitor não otimizado dos clones 29489 e 31282 (100.000 células T CD8+/100 µl de meio completo contendo anticorpo) durante 1 hora. Depois disso, a mistura anticorpo-CD8 foi adicionada às placas de células CD155 aAPC/CHO-K1 contendo 50 µl de meio completo fresco e incubada a 37°C, 5% de CO2 durante 5 dias.

[0256] Finalmente, as concentrações de IFNg foram avaliadas no sobrenadante celular utilizando um ensaio ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316- 86) que foi executado de acordo com as recomendações do fabricante. Como visto na Figura 14, a secreção de IFNg foi aumentada em quase 2 vezes quando o anticorpo anti-TIGIT foi adicionado à cocultura. Estes dados demonstram uma forte atividade funcional de anticorpos anti-TIGIT antagonistas para bloquear o sinal inibitório de TIGIT em TILs CD8+ humanos e para aumentar as funções efetoras das células T em um cenário de tumor. Exemplo 11: Caracterização do anticorpo antagonista anti-TIGIT com atividade funcional em camundongos A. Ensaio de competição CD155 de camundongo para anticorpo antagonista anti-TIGIT substituto

[0257] Para este ensaio, foram utilizadas células Jurkat (clone E6-1, ATCC TIB-152) manipuladas para superexpressão de TIGIT de camundongo (Jurkat- mTIGIT). O anticorpo anti-TIGIT 26493 foi usado como substituto, pois este anticorpo mostrou reatividade cruzada para o TIGIT de camundongo, bem como a ligação ao TIGIT humano. As células foram pré-incubadas por 45 minutos a 37°C com diferentes concentrações do clone 26493 do anticorpo anti-TIGIT (0,03 a 10 µg/ml) em 25 µl de meio completo (RPMI + 10% FBS). As células foram lavadas uma vez e incubadas com 4 µg/ml de proteína tag CD155-His-Fc de camundongo (Thermo Fisher, 50259M03H50) em 50 µl de meio completo por 45 minutos na incubadora. As células foram lavadas uma vez e coradas com anticorpo anti-His- PE (Biolegend, 362603) durante 30 minutos a 4°C. A intensidade mediana de fluorescência (MFI) medida por FACS foi usada como uma medida de ligação de CD155 a Jurkat-mTIGIT. A Fig. 15A mostra a curva de dose-resposta do clone anti- TIGIT 26493 para a competição CD155, identificando 2,3 nM como IC50 (a linha tracejada superior representa o sinal do isotipo, a linha pontilhada inferior o sinal das células sem CD155). Esses resultados demonstram a eficácia funcional do anticorpo anti-TIGIT para competir com o ligante CD155 pelo TIGIT de camundongo. B. Ensaio funcional in vitro de camundongo: citotoxicidade específica do antígeno (OT-I)

[0258] Para avaliar a atividade citotóxica específica do antígeno das células T OT-I CD8+ em relação às células-alvo pulsadas por OVA e o efeito do anticorpo anti-TIGIT neste ensaio, as células OT1 foram isoladas dos baços de camundongos C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl (Charles River) por dissociação mecânica seguida de seleção negativa para células T de camundongo usando o kit de isolamento de células T de camundongo EasySep™ (Stemcell, # de Catálogo 19851). Como células apresentadoras de antígeno, as células cancerígenas PanO2 que expressam CD155 naturalmente foram tratadas com Mitomicina C (25 µg/ml) e subsequentemente pulsadas com peptídeo OVA (S7951-1MG, Sigma Aldrich, 1 µg/ml, 1 h a 37°C). As células T CD8+ e PanO2 foram cocultivadas por 3 dias na presença do clone anti-TIGIT 26493 ou controle de isotipo a 133nM. No dia 3, o sobrenadante foi coletado para detecção de IFNg por ELISA (Figura 15B) e células T para o ensaio de citotoxicidade (Figura 15C). Como células alvo, foram utilizados PanO2 pulsado por OVA. As células alvo e as células Pan02 não pulsadas (controle interno não alvo), 1x106 cada, foram marcadas com CFSE (C1157, ThermoFisher) e Kit de Proliferação de Células Vermelhas Far CellTrace™ (C34564, ThermoFisher), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. Estas células foram misturadas (proporção de 1: 1) e plaqueadas a 2x104 células por poço. As células T

OT-1 CD8+ estimuladas foram adicionadas a 1x105 células/poço (células efetoras), resultando na razão de efetor para alvo de 10:1 na presença do clone anti-TIGIT 26493 ou controle de isotipo a 133 nM. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS e levantadas por tripsinização. As células foram então coradas com o kit de coloração de células mortas violeta fixável viva/morta (Molecular Probes, L34955). A morte citotóxica das células alvo foi então medida através do monitoramento da mudança na razão de células alvo vivas para células não alvo por citometria de fluxo.

[0259] A Fig. 15B mostra que o anticorpo anti-TIGIT aumenta a produção de IFNg em quase 2 vezes, enquanto a Fig. 15C mostra um aumento da atividade citotóxica das células T OT-I CD8+ de camundongo de cerca de 60%. Em conjunto, estes resultados confirmam a atividade funcional do anticorpo anti-TIGIT para aumentar a função efetora da célula T CD8+ de camundongo. Exemplo 12: Atividade antitumoral do anticorpo antagonista anti-TIGIT em monoterapia e em combinação com anticorpos anti-PD1 no modelo de camundongo A. Atividade antitumoral in vivo do anticorpo antagonista anti-TIGIT em monoterapia

[0260] Para esta experiência, o clone 26493 anti-TIGIT foi produzido em células de mamífero em um isotipo IgG2a de camundongo. Camundongos fêmeas Balb/c de 8 semanas foram inoculados com 500.000 células de câncer de cólon CT26 (ATCC® CRL-2638™) por via subcutânea. No dia 9 após a inoculação, quando os volumes tumorais estavam em média em torno de 45mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento com igual volume tumoral (n = 8 por grupo). Os camundongos foram tratados com 200 µg de anti- TIGIT ou com controle de isotipo (mIgG2a, BioXcell) ou com 200 µg de anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) e 200 µg de controle de isotipo (mIgG2a, BioXcell) ou com 200 µg de anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) e diferentes concentrações de anti-TIGIT (200µg, 60µg, 20µg) por injeções intraperitoneais nos dias 9, 12 e 15. O crescimento do tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com pinças eletrônicas três vezes por semana, do dia 9 ao dia 36. Os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor excedeu 2000 mm3. As curvas de crescimento tumoral foram analisadas estatisticamente por um modelo linear misto. As diferenças entre os grupos de tratamento foram avaliadas testando a interação do grupo de tratamento*tempo. Para testar um efeito sinérgico entre anti-TIGIT e anti-PD-1, os grupos de tratamento foram recodificados por uma combinação de duas variáveis; anti-TIGIT (sim/não) e anti-PD-1 (sim/não). Um efeito sinérgico, além do efeito aditivo de cada tratamento (anti-TIGIT*tempo e anti-PD-1*tempo) foi avaliado testando o termo de interação anti-TIGIT*tempo anti-PD-1*tempo.

[0261] A Fig. 16A mostra curvas de crescimento mediano do tumor por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anticorpo anti-TIGIT em monoterapia. Enquanto, no grupo controle, nenhum camundongo teve regressão do tumor, 2/8 camundongos tratados com anti-TIGIT tiveram uma resposta completa. Nos camundongos restantes, houve um claro atraso no crescimento do tumor. No grupo controle, nenhum camundongo sobreviveu além de 30 dias, enquanto no grupo tratado, 7/8 camundongos sobreviveram além de 30 dias.

[0262] A Fig. 16B mostra curvas de crescimento mediano do tumor por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anti-PD1 em monoterapia ou em combinação com anti-TIGIT. Houve supressão significativa do crescimento do tumor em camundongos tratados com anti-TIGIT + anti-PD-1 em comparação à monoterapia com anti-PD-1 (p <0,0001). A combinação de anti-TIGIT + anti-PD-1 alcançou eficácia antitumoral sinérgica superior ao efeito aditivo de ambos os tratamentos em monoterapia (p = 0,02). A combinação de anticorpos anti-TIGIT (em 200ug) e anti-PD1 resultou em 7/8 camundongos mostrando uma resposta completa. A eficácia antitumoral foi mantida com a combinação de anti-PD1 e doses mais baixas de anti-TIGIT que alcançam resposta completa para 8/8 camundongos quando o anticorpo anti-TIGIT foi reduzido para 60 µg e 5/8 camundongos quando o anticorpo anti-TIGIT foi diminuído além de 20 µg (Fig. 16C). Estes dados demonstram a eficácia antitumoral significativa da terapia anti-TIGIT em monoterapia (p<0,0001) ou em combinação com um anticorpo anti-PD1 (p<0,0001) para o tratamento de tumores pré- estabelecidos. Exemplo 13: Atividade antitumoral dependente de isotipo do anticorpo antagonista anti-TIGIT em monoterapia e combinação com anticorpos anti-PD1 no modelo de camundongo.

[0263] Para esta experiência, o clone 26493 anti-TIGIT foi produzido em células de mamífero em um isotipo IgG2a e um isotipo lgG1 de camundongo. Camundongos fêmeas Balb/c de 8 semanas foram inoculados com 500.000 células de câncer de cólon CT26 (ATCC® CRL-2638™) por via subcutânea. No dia 10 após a inoculação, quando os volumes tumorais estavam em média em torno de 100mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento com igual volume tumoral (n = 10 por grupo). Para avaliação da monoterapia, os camundongos foram tratados com 200 µg de anti-TIGIT ou controle de isotipo (mIgG2a, BioXcell) por injeções intraperitoneais nos dias 10, 13 e 16. Para avaliação da combinação com anti-PD-1, os camundongos foram tratados com 200 µg de anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) e 200 µg de controle de isotipo (mIgG2a, BioXcell) ou pela combinação de 200 µg de anti-PD-1 (RMP1-14, BioXcell) e 200 µg de anti-TIGIT por injeções intraperitoneais no dia 10, dia 13 e dia 16. O crescimento do tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com pinças eletrônicas três vezes por semana, do dia 10 ao dia 33. Os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor excedeu 2000 mm3.

[0264] A Fig. 17A mostra curvas de crescimento mediano do tumor por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para monoterapia com anticorpo anti-TIGIT e Fig. 17B para terapia de combinação com anticorpos anti- TIGIT e anti-PD1. Tanto em monoterapia quanto em combinação com anti-PD-1, o tratamento com anticorpo anti-TIGIT resultou em eficácia antitumoral significativa quando administrado como um isotipo IgG2a de camundongo (p = 0,0001 e p = 0,009, respectivamente). No entanto, nenhuma eficácia antitumoral pode ser superada com anti-TIGIT como um isotipo IgG1 de camundongo, sugerindo que a interação do receptor Fc com mIgG2a é importante para a atividade antitumoral de anticorpos antagonistas anti-TIGIT no modelo murino CT26. Estes dados demonstram a eficácia antitumoral dependente de isotipo da terapia anti-TIGIT em monoterapia ou combinação para o tratamento de tumores preestabelecidos. Exemplo 14: Caracterização do mecanismo de ação da atividade antitumoral in vivo do anticorpo antagonista anti-TIGIT

A. Análise por citometria de fluxo do baço e tumor

[0265] Para investigar o modo de ação in vivo do anticorpo antagonista anti- TIGIT, os tumores foram analisados por citometria de fluxo para o infiltrado de células imunes após o tratamento com o anticorpo anti-TIGIT 26493 (IgG2a), em monoterapia e em combinação com anti-PD-1. Os camundongos foram inoculados e tratados como descrito no exemplo 12. Dois dias após o segundo tratamento, os camundongos (8 camundongos por grupo) foram sacrificados e os tumores, colhidos. Os tumores foram dissociados com um kit de dissociação de tumores (Miltenyi Biotec). Para a coloração ex vivo direta, as células foram coradas com anti-CD45, anti-CD4, anti-CD8 e anti-FoxP3 (todos da eBioscience) após a coloração com um corante de viabilidade (Molecular Probes, L34955) e bloco Fc. Para estimulação ex vivo, as células foram incubadas com coquetel de estimulação celular (eBioscience) e inibidor de transporte de proteínas (eBioscience) por 3 horas. Isto foi seguido por coloração com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 e bloco Fc. Após fixação e permeabilização com tampões comerciais (tampão de fixação IC e tampão de permeabilização), as células foram coradas com anti-IL-10 e anti- IFNg (todos da eBioscience). Em todas as figuras, a variação percentual comparada ao grupo controle relevante (controle isotípico para monoterapia, anti- PD-1 para combinação) é mostrada, com um valor negativo representando uma diminuição e um valor positivo um aumento em comparação com o grupo controle.

[0266] A Fig. 18A mostra que o tratamento in vivo do tumor com anticorpo anti-TIGIT mIgG2a resulta em uma diminuição na razão de células T reguladoras na população de TILs CD4+ de 28% em comparação com o grupo controle, o que não é observado após o tratamento com mIgG1 anti-TIGIT. Isso mostra que há uma depleção das células TIGIT+ Treg, possivelmente explicando a eficácia diferencial dos dois isotipos, conforme discutido no exemplo 14. A Fig. 18B mostra que não há depleção de TILs CD8+, mas um pequeno aumento é observado para os dois isotipos (um aumento de 17% em comparação ao controle para mIgG1 e 16% para mIgG2a). Esses achados juntos resultam em um aumento de mais de 50% da razão CD8/Treg no tumor tratado com mIgG2a anti-TIGIT (Fig. 18C). A funcionalidade das células T intratumorais também é melhorada para o grupo tratado com anticorpo mIgG2a anti-TIGIT, com um forte aumento na produção de IFNg de CD4+

(Fig. 18D) e TILs CD8+ (Fig. 18E). Isto resultou em um forte aumento da razão de células produtoras de IFN-g/células produtoras de IL-10 após estimulação ex vivo na população de TILs CD4+/CD8+ (Fig. 18F).

[0267] A Fig. 18G mostra que a combinação de mIgG2a anti-TIGIT com anti- PD-1 resulta em diminuição das células T reguladoras em 33% em comparação com a monoterapia com anti-PD-1. Novamente, para células T CD8+, o oposto é verdadeiro, com aumento de 22% e 28% na infiltração de células T CD8+, respectivamente para os isotipos mIgG1 e mIgG2a, em comparação com a monoterapia anti-PD-1 (Fig. 18H). Juntos, isso resulta em um aumento de mais de duas vezes na razão de TILs CD8+ Treg no tumor para a combinação com mIgG2a anti-TIGIT (Fig. 18I). Além disso, o tratamento com o anticorpo mIgG2a anti-TIGIT combinado com anti-PD-1 demonstra uma mudança no fenótipo Th1 versus Th2 para células T CD4+ intratumorais, com um aumento acentuado nas células CD4 produtoras de IFNg (Fig. 18J) e uma diminuição nas células CD4 produtoras de IL- 10 (Fig. 18K). Isso resultou em um forte aumento nas células produtoras de IFNg/IL- 10 após estimulação ex vivo na população de TILs CD4+ em comparação com camundongos tratados com anti-PD-1 em monoterapia (Fig. 18L). Tabela 11: Genes diferencialmente expressos entre mIgG2a anti-TIGIT e camundongos tratados com veículo Símbolo do Fold change de P-valor gene Log2 corrigido Ccr2 -1,29 0,0000668 Prf1 1,79 0,0000668 Ctsg 2,13 0,0000668 Ctla4 1,72 0,00309 Gzmb 1,51 0,00309 Ccl2 0,56 0,0174 Il2ra 1,61 0,0174 Cd55 1,64 0,0213 Il2rb 0,872 0,0379 Cd274 0,982 0,0385 Klrg1 1,3 0,0402

Icos 1,26 0,0402 Il1rn 0,87 0,0402 Cx3cr1 -0,82 0,0428 C1ra 0,896 0,0428 Cd33 -0,906 0,0479 Ccl4 0,886 0,0518 Tabela 12: Genes expressos diferencialmente entre camundongos tratados com anti-TIGIT mIgG2a + anti-PD-1 e anti-PD1 Símbolo do gene Fold change de P-valor Log2 corrigido Ctsg 2,34 0,0000375 Prf1 1,69 0,000255 Gzmb 1,71 0,000766 Cd55 2,08 0,00131 Entpd1 0,839 0,00131 Klrg1 1,76 0,00132 Itga1 0,874 0,0017 Ctla4 1,72 0,00173 Il2ra 1,82 0,00237 Itgb3 0,863 0,00237 Slc11a1 0,849 0,00329 Cd36 1,44 0,0049 Cd180 0,899 0,00602 Icam1 0,893 0,00802 Cd274 1,06 0,00993 Cd40 0,926 0,0113 Eomes 1,28 0,0113 Abcg1 0,869 0,0113 Ccr2 -0,781 0,0122 Thy1 0,868 0,0165 Ccl2 0,501 0,0203 Gbp5 1,12 0,0216

Icos 1,24 0,0263 Tgfbr2 0,458 0,0278 H2 K1 0,292 0,0307 Sh2d1a 0,999 0,0307 Il2rb 0,808 0,0307 Selplg 0,64 0,031 Bst1 0,702 0,0317 Cd247 1 0,032 Irf8 0,699 0,0365 Il21r 0,899 0,0392 Gbp2b 1,11 0,0392 Stat1 0,865 0,0427 C4b 0,922 0,0428 Abca1 0,537 0,044 Trem2 0,482 0,0454 B. Análise transcriptômica do tumor por NanoString

[0268] Para investigar o modo de ação in vivo do anticorpo anti-TIGIT, o infiltrado de células imunes dos tumores tratados com anti-TIGIT, em monoterapia e em combinação com anti-PD-1 foi analisado por análise transcriptômica (Nanostring). Os camundongos foram inoculados e tratados como descrito no exemplo 12. Dois dias após o terceiro tratamento com anticorpos anti-TIGIT e/ou anti-PD1, os camundongos foram sacrificados e os tumores coletados. O RNA foi extraído e a expressão de uma seleção de 770 genes envolvidos na imunologia do câncer foi quantificada diretamente com a tecnologia nCounter (painel PanCancer Immune Profiling, Nanostring; realizado por VIB Nucleomics Core). Os dados foram analisados com o software nSolver (Nanostring).

[0269] A Fig. 19A mostra um gráfico de vulcão dos genes que são regulados diferencialmente entre camundongos tratados com veículo e camundongos tratados com mIgG2a anti-TIGIT. Genes altamente estatisticamente significativos caem na parte superior do gráfico, e genes altamente diferencialmente expressos caem para ambos os lados (esquerda: regulada de forma negativa em camundongos tratados com anti-TIGIT, direita: regulada de maneira positiva em camundongos tratados com anti-TIGIT). Exemplos de genes regulados de maneira positiva incluem perforina, granzima B e CTLA-4. A linha sólida representa um p- valor não corrigido de 0,01, a linha pontilhada um p-valor corrigido de 0,05 (correção de Benjamini-Hochberg). A Tabela 11 e a Tabela 12 mostram os genes que foram expressos diferencialmente significativamente para mIgG2a anti-TIGIT em comparação com veículo e mIgG2a aPD-1 + anti-TIGIT versus anti-PD1, respectivamente. Quando vários genes foram resumidos em pontuações para subconjuntos funcionais de células imunes, o achado mais impressionante foi um aumento na pontuação de células citotóxicas e de células T CD8+ (Fig. 19B). As mesmas alterações estavam presentes em camundongos tratados com mIgG2a anti-TIGIT + anti-PD-1 em comparação com anti-PD-1 sozinho. Não foram observadas alterações em camundongos tratados com mIgG1 anti-TIGIT, em monoterapia ou em combinação com anti-PD-1.

[0270] Em conjunto, estes resultados demonstram que a eficácia antitumoral observada após tratamento in vivo com anticorpo anti-TIGIT é mediada por uma diminuição do infiltrado de Treg no tumor, enquanto a população de células T CD8+ efetoras é aumentada. Além disso, a função efetora de TILs CD4+ e CD8+ é aumentada, como mostra a maior razão de células produtoras de IFNg, a mudança para a resposta Th1 e o aumento da expressão de genes importantes para as funções citotóxicas das células T. Exemplo 15: Atividade de Toxicidade Celular Dependente de Anticorpo (ADCC) induzida por anticorpos antagonistas anti-TIGIT A. ADCC in vitro em PBMC humano de doadores saudáveis

[0271] PBMCs isoladas de doadores humanos saudáveis foram ressuspensas em meio RPMI completo (suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor + 50U de penicilina + 50U de estreptomicina e suplementado com 200 UI de IL-2/ml). Foram distribuídas 2,5x105 PBMCs humanas por poço em placa de 96U. O clone 26452 do anticorpo TIGIT anti-humano produzido em células de mamífero ou o controle do isotipo IgG1 (Biolegend, 403102) foram adicionados a uma concentração final de 66,6; 0,66 e 0,006 nM para cada poço correspondente. As células foram incubadas por 20 horas a 37°C com 5% de CO2. Em seguida, as células foram coletadas e coradas com o seguinte painel de anticorpos: LVD efluor

520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercP-Cy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8-APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), anti-CD127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) e anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229). Os resultados são apresentados em células vivas separadas. CD45+CD4+ ou CD45+CD8+ representam o total de células T+ ou CD8+. Células CD45+RO+CD4+ ou CD45+RO+CD8+ representam as células T CD4+ ou CD8+ de memória, enquanto CD25hiCD127lowCD4+ representam células Treg. A razão de células TIGIT+ em Tregs separados é maior do que nas células T CD8+ de memória separadas e nas células T CD4+, conforme mostrado na Fig. 20A.

[0272] A quantificação absoluta é feita usando as esferas AccuCheck Counting (Life Technologies), seguindo as especificações do fabricante. Após o cálculo dos números absolutos de células por µl, % da lise específica é calculada usando a seguinte fórmula = (1- (número absoluto de células por µl na amostra tratada com anticorpo 26452 TIGIT/média de triplicado de nenhum tratamento com anticorpo)) x100. Como mostrado na Fig. 20B, o anticorpo anti-TIGIT 26452 hIgG1 desencadeia lise específica mais alta em Tregs (62,22%) do que no total de células T CD8+ (12,2%) ou no total de células T CD4+ (16,36%). B. ADCC ex vivo em tumor de camundongo

[0273] Para confirmar que o anticorpo IgG2a de camundongo anti-TIGIT pode depletar as células T reguladoras TIGIT+, foi realizado um ensaio ADCC ex vivo. Camundongos fêmeas Balb/c de 8 semanas foram inoculados com 500.000 células de câncer de cólon CT26 (ATCC® CRL-2638™) por via subcutânea. Três semanas após a inoculação, os tumores foram coletados e dissociados com um kit de dissociação de tumores (Miltenyi Biotec). A suspensão de célula única foi incubada com anticorpo de 133 nM anti-TIGIT 26493 (isotipo mIgG1 ou mIgG2a) por 20 h (1 milhão de células/200 µl em RPMI + 10% de FBS). Após 20 h, as células foram coradas com anticorpos anti-CD4, anti-TIGIT, anti-CD8 e anti-FoxP3 (todos da eBioscience) após a coloração com um corante de viabilidade (Molecular Probes, L34955) e bloco Fc.

[0274] A Fig. 21 mostra a % de diminuição nas contagens absolutas de células TIGIT+ em comparação com o tratamento com controle de isotipo para os diferentes subconjuntos imunes de TIGIT+. A redução mais forte após o tratamento com anticorpo anti-TIGIT mIgG2a é evidente nas células T reguladoras (queda de cerca de 40%), sugerindo que essas células são mais suscetíveis a ADCC do que as células T CD4+ ou CD8+ convencionais.

[0275] No geral, esses resultados demonstram a eficácia do hIgG1 ou mIgG2a anti-TIGIT em esgotar as células imunes TIGIT+ com uma atividade mais forte demonstrada na população Treg. Exemplo 16: Previsão de imunogenicidade usando análise in silico

[0276] O potencial imunogênico dos clones 29494 e 29489, bem como sua variante 31282, foi avaliado por previsão in silico usando a EpiMatrix Protein Score (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131:189). Para concluir a análise, as sequências de entrada foram analisadas em estruturas de 9-mer sobrepostas e cada estrutura foi avaliada em relação a um painel de oito alelos HLA de Classe II comuns. Esses alelos são "supertipos". Cada um é funcionalmente equivalente, ou quase equivalente, a muitos alelos adicionais de "membros da família". Tomados coletivamente, esses oito alelos de supertipo, juntamente com seus respectivos membros da família, "cobrem" mais de 95% da população humana (Southwood et al. (1998) J. Immunol 160: 3363). Cada "avaliação" estrutura-a-alelo é uma declaração sobre a afinidade de ligação prevista a HLA. As pontuações da avaliação EpiMatrix variam de aproximadamente -3 a +3 e são normalmente distribuídas. As pontuações da avaliação do EpiMatrix acima de 1,64 são definidas como "hits"; isto é, potencialmente imunogênico e digno de mais consideração.

[0277] Todos os outros fatores são iguais, quanto mais ligantes de HLA (ou seja, EpiMatrix atingidos) contidos em uma determinada proteína, maior a probabilidade de a proteína induzir uma resposta imune. A pontuação EpiMatrix Protein Score é a diferença entre o número previsto de epítopos de células T esperado em uma proteína de um determinado tamanho e o número de supostos epítopos previstos pelo sistema EpiMatrix. A pontuação EpiMatrix Protein Score está correlacionada com a imunogenicidade observada. As pontuações EpiMatrix Protein Score são "normalizadas" e podem ser plotadas em uma escala padronizada. A pontuação EpiMatrix Protein Score de uma proteína "média" é zero.

As pontuações EpiMatrix Protein Score acima de zero indicam a presença de excesso de ligantes de MHC e denotam um maior potencial de imunogenicidade, enquanto as pontuações abaixo de zero indicam a presença de menos ligantes de MHC do que o esperado e um potencial menor de imunogenicidade. A pontuação de proteínas acima de +20 é considerada como tendo um potencial imunogênico significativo. Ajuste para a presença de epítopos reguladores de células T.

[0278] Os anticorpos são proteínas únicas, pois as sequências de aminoácidos de seus domínios variáveis, especialmente suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), podem variar de maneira extraordinária. É essa variabilidade que permite que os anticorpos reconheçam uma ampla variedade de antígenos. No entanto, os eventos de recombinação e mutação que controlam a maturação de anticorpos também podem produzir epítopos de células neo-T ou T novas. Esses neoepítopos podem parecer "estranhos" às células T circulantes. A presença de neoepítopos nas sequências de anticorpos pode levar à formação de uma resposta de anticorpos humano-anti- humano; também conhecida como resposta HAHA ou ADA (Anticorpos Antifármaco).

[0279] As células T reguladoras desempenham um papel importante na supressão das respostas imunes a proteínas totalmente humanas na periferia, incluindo aquelas que contêm sequências mutadas e/ou altamente variáveis, como CDRs de anticorpos. As células T reguladoras são engatadas e ativadas por epítopos de células T reguladoras. O risco inerente associado à presença de neoepítopos nas sequências de anticorpos parece ser balanceado pela presença de epítopos de células T reguladoras que ocorrem naturalmente.

[0280] Ao rastrear as sequências de muitos isolados de anticorpos humanos, o EpiVax identificou vários ligantes de HLA altamente conservados os quais acredita-se possuir um potencial regulador. Evidências experimentais sugerem que muitos desses peptídeos são, de fato, ativamente tolerogênicos na maioria dos indivíduos. Estes epítopos de células T altamente conservados, reguladores e promíscuos são agora conhecidos como Tregitopes (De Groot et al. (2008) Blood 112:3303)

[0281] Em muitos casos, o potencial imunogênico de neoepítopos contidos em anticorpos humanizados pode ser efetivamente controlado na presença de um número significativo de Tregitopes. Para fins de análise da imunogenicidade de anticorpos, a EpiVax desenvolveu um EpiMatrix Score ajustado por Tregitope e a previsão correspondente da resposta de anticorpos antiterapêuticos. Para calcular o EpiMatrix Score ajustado por Tregitope, as pontuações dos Tregitopes são deduzidas da pontuação EpiMatrix Protein Score. As pontuações ajustadas por Tregitope demonstraram estar bem correlacionadas com a resposta imune clínica observada para um conjunto de 23 anticorpos comerciais (De Groot et al. (2009) Clinical Immunol. 131:189).

[0282] As sequências de anticorpos dos clones 29489, 29494 e 31282 são pontuadas na extremidade inferior da escala EpiMatrix, indicando potencial limitado de imunogenicidade. A análise de regressão de anticorpos monoclonais licenciados prevê a resposta da ADA em ~ 0% dos pacientes expostos ao clone de anticorpos 29489 e 31282. Para o clone 29494, a análise prediz a resposta de ADA em 2,78% dos pacientes expostos para a sequência basal de VH e 2,88% para a sequência variante de VH. Os dados estão resumidos na Tabela 13, abaixo. Tabela 13: Pontuações EpiMatrix e Tregitope ajustada para EpiMatrix Input Sequência Lenght Comprim Avaliações Assessments EpiMatrix Hits de Pontuação EpiMatrix Pontuação de EpiMatrix Tregitope de Entrada Sequence ento EpiMatrix Hits de EpiMatrix Score Ajustada para Tregitope adjusted• EpiMatrix Score 29489_VH 121 904 40 -19.41 -47.26 29489_VL 108 800 39 -17.58 -51.75 31282_VH 121 904 40 -19.41 -47.26 31282_VL 108 800 39 -17.58 -51.75 29494_VH 125 936 54 2.68 -7.18 29494_VL 107 792 40 -12.2 -38.83 Exemplo 17: Determinação de afinidade para ligação de clones anti-TIGIT à proteína TIGIT humana recombinante

[0283] O anticorpo 31282 foi comparado com clones de anticorpo anti-TIGIT descritos em outros pedidos de patente. Especificamente, 31282 foi comparado com: 4.1D3.Q1E (também referido como 4.1D3, de WO2017/053748); 22G2 (de WO2016106302); 31C6 (de WO2016/028656); 313M2 (de WO2016/191643); e TIG1 (de WO2017/152088). As referências e sequências dos clones de anticorpos comparados são mostradas na Tabela 14 abaixo: Tabela 14: Sequências de domínios VH e VL de anticorpos anti-TIGIT comparativos clone a- Referência Sequência

TIGIT

4.1D3.Q1E VH: SEQ ID NO: 34 de Sequência de VH: WO2017/053748 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGD VL: SEQ ID NO: 36 de SVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGK WO2017/053748 TYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSK

NQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTY DLLAGPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 343 neste documento) Sequência de VL:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQ TVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPNLL IYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL

TISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGP GTKVEIK (SEQ ID NO: 344 neste documento) 22G2 VH: SEQ ID NO: 7 de Sequência de VH: WO2016/106302 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG VL: SEQ ID NO: 9 de GSVSSGIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYI WO2016/106302 YYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQF

SLKLSSVTAADTAVYYCARDYYVSGN

YYNVDYYFFGVDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 345 neste documento) Sequência de VL:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQ SVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPE

DFAVYYCQQRSNWPPLFTFGPGTKVD IK (SEQ ID NO: 346 neste documento) 31C6 VH: SEQ ID NO: 127 Sequência de VH: (MEB125.3 da WO2016/028656 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG 1C6.A1.205 VL: SEQ ID NO: 130 YTFSSYVMHWVRQAPGQGLEWIGYID VH4/VL1) de WO2016/028656 PYNDGAKYAQKFQGRVTLTSDKSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPYG WYFDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 347 neste documento) Sequência de VL:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASE HIYSYLSWYQQKPGKAPKLLIYNAKTL AEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE

DFATYYCQHHFGSPLTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 348 neste documento) 313M32 VH: SEQ ID NO: 67 de Sequência VH: WO2016/191643 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSG VL: SEQ ID NO: 68 de YSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYIS WO2016/191643 YSGSTSYNPSLRSRVTISRDTSKNQFF

LKLSSVTAADTAVYYCARRQVGLGFA YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 349 neste documento) Sequência de VL:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQ DVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY

RYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYYCQQHYSTPWTFG (SEQ ID NO: 350 neste documento) TIG1 VH: SEQ ID NO: 10 de Sequência VH: WO2017/152088 DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS

VL: SEQ ID NO: 14 de GFTFSNFGMHWVRQAPEKGLEWVAFI WO2017/152088 SSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNPKNT

LFLQMTSLRSEDTAMYYCARMRLDYY AMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 351 neste documento) Sequência de VL:

DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKS ISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQ SGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDF

AMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 352 neste documento) A. Produção em células de mamíferos

[0284] A fim de produzir quantidades suficientes de clones a-TIGIT selecionados para caracterização adicional, vetores de DNA que codificam para clones de anticorpos específicos (clones 31282_up, 4.1D3, 22G2, 31C6, 313M32 e TIG1) foram gerados e transduzidos para células HEK para produção de isotipo de IgG1 humana. Fragmentos de DNA sintético otimizados para códon humano para domínios variáveis de anticorpos foram encomendados em Geneart. As sequências de domínio variável foram perfeitamente ligadas a vetores de expressão pUPE contendo a sequência de sinal IgKappa de camundongo e regiões constantes da respectiva classe de anticorpos. Os vetores de expressão foram verificados por análise de restrição e sequenciamento de DNA. Para transfecção transitória, foram produzidos maxipreps de DNA livre de endotoxina (Sigma) e os vetores de cadeia pesada e leve foram cotransfectados em células HEK293EBNA1, em meio Freestyle (ThermoFisherScientific), de acordo com os protocolos estabelecidos. Foi adicionado Primatone (volume final a 0,55%) 24 horas após a transfecção. O meio condicionado foi coletado 6 dias após a transfecção. Os anticorpos foram purificados em lotes por cromatografia de afinidade Mabselect sureLX (GE Healthcare). Os anticorpos ligados foram lavados em 2 etapas com PBS contendo NaCl 1M e PBS. Os anticorpos foram eluídos com Citrato a 20 mM, NaCl a 150 mM e pH 3 e foram neutralizados até aproximadamente pH 7 com 1/6 de volume de 1M de K2HPO4/KH2PO4 a pH 8.

[0285] Em seguida, os anticorpos foram ainda purificados por filtração em gel usando uma coluna Superdex200, equilibrada em PBS. As frações foram analisadas por NuPAGE e as frações contendo anticorpos foram reunidas. Os produtos finais foram esterilizados sobre um filtro de seringa a 0,22 µM. O produto foi analisado por NuPAGE e os níveis de endotoxina foram medidos por ensaio LAL.

[0286] Além disso, o clone 31282 também foi produzido na célula CHO-K1 como se segue (clone 31282_wu) no isotipo IgG1 ou IgG4. Os vetores de DNA que codificam os anticorpos foram construídos e transfectados em células CHO-K1. Os fragmentos de DNA otimizados pelo códon CHO para domínios variáveis de anticorpos foram sintetizados e ligados a vetores de expressão contendo a sequência de sinal e regiões constantes da respectiva classe de anticorpos. Os vetores de expressão foram verificados por análise de restrição e sequenciamento de DNA. Os vetores das cadeias pesada e leve foram cotransfectados em células CHO-K1 por eletroporação (Bio-rad) de acordo com os protocolos estabelecidos. As culturas transfectadas foram escalonadas e inoculadas em culturas descontínuas. O meio condicionado foi coletado após 14 dias de culturas em lotes semidescontínuos.

[0287] A cultura de células coletadas foi primeiramente esclarecida por dois estágios de filtração profunda com D0HC e A1HC (Millipore) conectados em série. Em seguida, a coleta clarificada foi primeiramente purificada por cromatografia de afinidade com MabSelect SuRe (GE Healthcare). Os anticorpos ligados foram lavados em 2 etapas com NaAc-HAc a 50 mM (pH 5,5) contendo NaCl a 1 M e NaAc-HAc a 50 mM (pH 5,5). Os anticorpos foram então eluídos com NaAc-HAc a 50 mM (pH 3,5) e neutralizados até aproximadamente pH 5,5 com Tris-HCl a 1 M (pH 9,0).

[0288] Em seguida, o intermediário neutralizado foi ainda polido por cromatografia de troca aniônica (AEX) usando POROS HQ50 (Life Tech) no modo de fluxo contínuo. A coluna foi equilibrada com NaAc-HAc a 50 mM (pH 5,5) antes do carregamento. O fluxo de AEX coletado durante a etapa de carregamento e recuperação foi ainda polido por cromatografia de troca catiônica (CEX) no modo de eluição de ligação usando POROS XS (Life Tech.). A coluna CEX foi equilibrada em NaAc-HAc a 50 mM (pH 5,5) e os anticorpos foram eluídos por eluição em gradiente linear (LGE) para atingir NaAc-HAc a 50 mM (pH 5,5) contendo NaCl a 0,5 M em 10 CV. A ultrafiltração final e a diafiltração (UF/DF) usando Pellicon 3, ultracel a 30 kD, tipo A (Millipore) foram realizadas para concentrar o eluído CEX e trocar o tampão em His-HCl a 20 mM (pH 5,5). Posteriormente, Polissorbato 80 (PS80) e sacarose foram adicionados à amostra filtrada por dia para obter o produto final cuja concentração era de aproximadamente 20 g/L, no tampão de His-HCl a 20 mM, 0,01% (p/p) PS 80 e 9% (p/v) de sacarose (pH 5,5). O produto passou por todos os testes de PQA. A pureza da SEC, o nível de endotoxina e outros critérios cumpriram todos os requisitos. B. Medição Biacore

[0289] A análise do biossensor foi realizada a 25°C em um sistema tampão HBS-EP (HEPES a 10 mM, pH 7,3, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,05% de Tween20) usando a tecnologia Biacore T200, chip sensor CM5 (executado em Novalix, França). O hotel de amostra foi mantido a 8°C. O anticorpo de captura de IgG anti-humano de cabra (específico para o fragmento Fcγ, Jackson ImmunoResearch Laboratories) foi imobilizado (10000 RU) para ambas as células de fluxo do chip sensor usando a química padrão de acoplamento de amina. Este tipo de superfície forneceu um formato para captura reproduzível de anticorpos de análise frescos após cada etapa de regeneração. A célula de fluxo 2 foi usada para analisar o anticorpo capturado, enquanto a célula de fluxo 1 foi usada como uma célula de fluxo de referência. Foram preparadas 6 concentrações diferentes de antígeno variando de 30 a 0,123 nM em tampão de execução. Cada uma das concentrações da amostra de antígeno foi executada como uma única réplica, exceto a execução de 3,33 nM em duplicata. Também foram realizadas duas injeções em branco (tampão) e usadas para avaliar e subtrair artefatos do sistema. As fases de associação (300 s) e dissociação (600 s) para todas as concentrações de antígeno foram realizadas a uma taxa de fluxo de 30 uL/min. A superfície foi regenerada com três injeções sequenciais (15 s, 15 se 60 s) de glicina-HCl a 10 mM, pH 1,5. Os sensorgrams obtidos foram ajustados globalmente num modelo 1:1 (assumindo os mesmos valores cinéticos para todas as concentrações aplicadas). A afinidade também foi determinada a partir do estado estacionário do clone

313M32, pois o modelo cinético 1:1 não era confiável, mostrando equilíbrio com o TIGIT humano no final do tempo de associação. Os resultados obtidos para os diferentes clones a-TIGIT são apresentados na Tabela 15. Tabela 15: Avaliação cinética e de afinidade Ligação de modelo cinético 1:1 Modelo de estado estacionário Clone Ka (1/s) Kd (1/s) Kd (nM) Rmax Kd (nM) Rmax (RU) (RU) 31282_wu 3,86+06 4,62-04 0,120 16,7 31282_up 3,70+06 4,75-04 0,128 15,3

4.1D3 1,07+06 4,72-05 0,044 14,4 22G2 2,51+06 1,78-04 0,071 11,1 31C6 3,10+06 2,09-04 0,067 16,7 313M32 na na na na 10,1 17,2 TIG1 5,24+06 1,31-02 2,49 11,1 Exemplo 18: Ligação celular de anticorpos antagonistas anti-TIGIT A. Ligação de clones anti-TIGIT a Jurkat-hTIGIT

[0290] A afinidade dos anticorpos anti-TIGIT humanos foi medida utilizando células Jurkat E6.1 transduzidas com TIGIT humano (Jurkat hTIGIT). Para analisar a afinidade dos anticorpos selecionados para hTIGIT, 105 células foram distribuídas por poço e incubadas com concentração decrescente (8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031; 0,016; 8x10-3 e 4x10-3 nM) de vários clones de anticorpos antagonistas anti-TIGIT (Fig. 2). Os anticorpos foram incubados com as células por 20 min a 4°C em tampão FACS. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humana (Fc gama específica) - PE (eBioscience, 12-4998-82, a 2,5 µg/ml) por 20 minutos em gelo e lavadas duas vezes. A intensidade da fluorescência foi analisada usando LSR BD Fortessa e a ligação celular foi registrada como a intensidade média de fluorescência do PE nas células que expressam TIGIT em sua superfície.

[0291] A concentração semimáxima de ligação (EC50) a Jurkat-hTIGIT foi calculada usando uma equação de ajuste de curva de quatro variáveis em Prism. Os resultados estão ilustrados na Figura 22A e os valores resumidos na Tabela 16 abaixo. Os valores de EC50 para a ligação de Jurkat-hTIGIT estão muito próximos do clone 31282, sem diferença significativa entre os anticorpos produzidos nas células HEK (31282_up, 0,13nM) ou nas células CHO-K1 (31282-wu, 0,10nM). O clone 31C6 e TIG1 também mostram valores de EC50 abaixo de 0,2 nM, enquanto a afinidade para outros clones (4.1D3, 22G2 e 313M32) é menor e os resultados mostram valores de EC50 variando de 0,267 a 0,445 nM. Os resultados demonstram uma forte ligação a TIGIT humano expresso por membrana em um sistema de manipulação para os clones anti-TIGIT 31282, 31C6 e TIG1, enquanto outros clones têm uma afinidade mais baixa. Tabela 16: Dados de EC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para ligação a Jurkat-hTIGIT Clone Ligação de EC50 a Fold change de EC50 Jurkat-hTIGIT (em comparada a EC50 do nM) melhor clone (31282_wu) 31282_wu 0,10 1 31282_up 0,13 1,3 313M32 0,44 4,2

4.1D3 0,27 2,5 22G2 0,32 3,0 31C6 0,13 1,2 TIG1 0,17 1,6 B. Ligação de clones anti-TIGIT a células T CD8+ primárias de PBMCs humanas saudáveis

[0292] As PBMC humanas isoladas de voluntários saudáveis foram analisadas quanto à ligação por anticorpos antagonistas anti-TIGIT. As células foram distribuídas a 1x105 células por poço. As células foram incubadas com anti- CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) e CD64 (BD Bioscience 555525) à temperatura ambiente por 10 min, e os clones de anticorpos anti-TIGIT anti-humanos indicados foram adicionado diretamente a uma concentração final de 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031; 0,016; 8 x 10-3 e 4 x 10-3 nM em tampão FACS e incubados por 20 min a 4°C. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humano (Fc gama específico)-

PE (eBioscience, 12-4998-82, a 2,5 µg/ml) durante 20 minutos a 4°C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com os seguintes anticorpos e mistura de LVD: anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8- BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919) e LVD efluor 660 (eBioscience 65-0864-18).

[0293] Os valores de EC50 para a ligação a células T primárias humanas CD8+ foram calculados utilizando o sinal MFI nas células TIGIT T+ CD8+ vivas. Os resultados são ilustrados na Figura 22B e as concentrações de EC50 resumidas na Tabela 17 abaixo. Os valores de EC50 para a ligação de células T CD8+ humanas primárias estão muito próximos do clone 31282, sem diferença acentuada entre os anticorpos produzidos nas células HEK (31282_up, 0,21 nM) ou nas células CHO- K1 (31282-wu, 0,19 nM). A comparação entre os diferentes clones de anticorpos antagonistas a-TIGIT mostra o melhor valor de EC50 para a ligação em células T CD8+ humanas primárias ao clone 31282_wu (0,19 nM) e clone 31282_up (0,21 nM). Os clones 31C6 e TIG1 mostram uma diferença em EC50 de 2 vezes, enquanto os clones 22G2, 313M32 e 4.1D3 diferem por um fator de 6,1 a 9,7 vezes. No geral, 31282_wu e 31282_up mostram a melhor ligação a TIGIT expresso por membrana em células T CD8 + humanas primárias. Tabela 17: Dados de EC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para ligação a células T CD8+ humanas primárias Clone Concentração de EC50 para Fold change de EC50 ligação a células T CD8+ (em comparada a EC50 do melhor nM) clone (31282_wu) 31282_wu 0,19 1 31282_up 0,21 1,1 313M32 1,45 7,5

4.1D3 1,88 9,7 22G2 1,17 6,1 31C6 0,39 2,0 TIG1 0,38 2,0 C. Ligação de clones anti-TIGIT a células T CD8+ primárias de PBMCs de pacientes com câncer

[0294] As PBMC humanas isoladas de pacientes com câncer foram analisadas quanto à ligação por diferentes clones de anticorpo antagonista anti- TIGIT. As células foram distribuídas a 1x105 células por poço. As células foram incubadas com anti-CD16 (Clone 3G8, BioLegend 302002), CD32 (Clone FLI8.26, BD Bioscience 557333) e CD64 (BD Bioscience 555525) à temperatura ambiente por 10 min, e os anticorpos TIGIT anti-humanos indicados foram diretamente adicionados a uma concentração final de: 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,062 e 0,031 nM em tampão FACS e incubados por 20 min a 4°C. Após a lavagem, as células foram incubadas com Ig anti-humano (Fc gama específico)-PE (eBioscience, 12- 4998-82, a 2,5 µg/ml) durante 20 minutos a 4°C. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas com os seguintes anticorpos e mistura de corante de viabilidade vital (LVD): anti-CD4-PercP-Cy5.5 (clone A161A1, BioLegend 357414); anti-CD8- BV510 (clone SK1, BD Bioscience 563919) e LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14). As células foram lavadas e fixadas e a coloração da superfície foi quantificada usando BD LSR Fortessa. Os dados da citometria de fluxo foram analisados usando FlowJo V10.1. A MFI TIGIT em células LVD- TIGIT+CD8+ separadas foi usada para calcular os valores de EC50. As curvas de regressão não linear são mostradas na Figura 22C e os valores resumidos na Tabela 18 abaixo.

[0295] Os clones 31282_wu e 31282_up mostram um valor de EC50 muito próximo para a ligação em células T CD8+ de pacientes com câncer com concentração de 0,14 e 0,12 nM, respectivamente. O resto dos clones mostra menor afinidade com os clones 31C6, TIG1 e 22G2, mostrando uma afinidade 1,5, 2,7 e 3,1 vezes menor, respectivamente. O valor de EC50 medido para o clone 313M32 é 8,3 vezes menor em comparação com o clone 31282_up. O clone 4.1D3 mostra a menor afinidade, ligando-se com uma diferença de 9,5 vezes ao melhor clone testado. Tabela 18: Dados de EC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para ligação a células T CD8+ humanas primárias de pacientes com câncer Clone Valor de EC50 para ligação Fold change de EC50 de células T CD8+ (em nM) comparada a EC50 do melhor clone (31282) 31282_wu 0,14 1,2

31282_up 0,12 1,0 313M32 1,0 8,3

4.1D3 1,15 9,5 22G2 0,37 3,1 31C6 0,18 1,5 TIG1 0,33 2,7 Exemplo 19: Ensaio de competição entre clones de anticorpos antagonistas anti-TIGIT e ligante natural de TIGIT (CD155)

[0296] As células Jurkat que superexpressam TIGIT humano (Jurkat- hTIGIT) foram coletadas e distribuídas em 5,104 células/poço e incubadas com anticorpos TIGIT anti-humanos nas seguintes concentrações: 133,33; 42,20; 13,33; 4,22; 1,33; 0,422; 0,133; 0,042; 0,0133; 4,2x10-3; 1,3x10-3; 4,2x10-4; 1,3x10-4; 4,2x10-5 nM em meio completo durante 45 minutos a 37°C. O excesso de anticorpo foi lavado e, em seguida, as células foram incubadas com CD155-His a 15 µg/ml (Creative Biomart, PVR-3141H) por 45 minutos a 37°C. Em seguida, o CD155-His ligado foi detectado usando o anti-His tag-PE (Biolegend, 362603, a 2 µl por teste), incubado por 30 min a 4°C. As células foram analisadas por FACS usando BD LSRFortessa e a meia concentração (IC50) que impede a ligação a CD155 foi calculada com base na intensidade média de fluorescência de PE nas células totais.

[0297] Os resultados estão ilustrados na Figura 23 e os valores resumidos na Tabela 19 abaixo. Os clones anti-TIGIT 31282_wu e 31282_up mostram os melhores valores de IC50 para a competição de CD155 em células Jurkat projetadas para expressar hTIGIT com concentração de 0,05 e 0,04 nM, respectivamente. Outros clones (4.1D3, 22G2, 31C6, TIG1) têm valores de IC50 entre 0,07 e 0,09 nM enquanto o clone 313M32 compete com CD155 pela ligação a TIGIT com uma eficiência muito menor (0,65nM). Tabela 19: Dados de IC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para competição de CD155 em humanos TIGIT Clone CompetiçãoIC50 da CD155 Fold change de IC50 para ligação a TIGIT (em comparada a IC50 do nM) melhor clone (31282_up) 31282_wu 0,05 1,3

31282_up 0,04 1 313M32 0,65 16,7

4.1D3 0,07 1,9 22G2 0,09 2,2 31C6 0,07 1,7 TIG1 0,06 1,6 Exemplo 20: Caracterização funcional de clones anti-TIGIT antagonistas A. Ensaio funcional TIGIT com células Jurkat-hTIGIT

[0298] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano, cocultivamos células Jurkat, que expressam o hTIGIT e um repórter da luciferase ativado após o engatamento de TCR (células Thaw-and-Use TIGIT Effector da Promega), com a linhagem celular CHO-K1 projetada para expressar ativador humano de PVR/CD155 e TCR (Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 da Promega). A ativação de células Jurkat com superexpressão de TIGIT pode ser induzida por contato com células CHO-K1 que expressam CD155 após o engatamento de TCR em células Jurkat e pode ser aumentada na presença de anticorpo antagonista anti-TIGIT. Para comparar a potência dos diferentes clones de a-TIGIT para aumentar a ativação das células Jurkat, a experiência foi conduzida na presença de concentrações crescentes de anticorpos e os valores de EC50 foram calculados.

[0299] As células CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, incubadora O/N com CO2 a 5%. No dia seguinte, as células TIGIT Effector (Promega, CS198811) foram adicionadas de acordo com as recomendações do fabricante às placas de células CD155 aAPC/CHO-K1 contendo meio fresco completo com anticorpo anti-TIGIT em concentrações crescentes (0,03; 0,11; 0,33; 1,06; 3,34; 10,56; 33,38; 105,49; e 333 nM) e incubados a 37°C, 5% de CO2 durante 6 horas. Após as 6 horas de incubação, a ativação da célula TIGIT Effector foi avaliada medindo-se a atividade da luciferase usando o Bio-GloTM Luciferase Assay System (Promega, G7941).

[0300] Como mostrado na Figura 24A e resumido na Tabela 20, o anticorpo anti-TIGIT 31282 tem a melhor eficácia em termos de valor de EC50 e máxima indução do sinal de luciferase no ensaio. A atividade observada para o clone produzido nas células HEK (31282_up) ou CHO-K1 (31282_wu) é comparável com um sinal máximo de luciferase 8 vezes maior que o isotipo de controle (Bioexcell, BE0297) e com uma concentração de EC50 medida em 3,3 nM e 3,5 nM respectivamente. A título de comparação, os clones 4.1D3, 22G2 e 31C6 têm uma atividade máxima entre 5,3 e 6,7 vezes o controle do isotipo, associado a uma EC50 entre 5 e 10nM. Os valores de EC50 para o clone 313M32 e TIG1 não puderam ser determinados devido a uma atividade baixa e ajuste inadequado das curvas nas concentrações testadas (Figura 24A). Tabela 20: Dados de EC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para atividade funcional em células Jurkat-hTIGIT Nome de Indução comparada EC50 (nM) Fold change de EC50 Clone a controle de comparada a EC50 do isotipo (fold melhor clone change) (31282_up) 31282_wu 8,4 3,5 1,1 31282_up 8,0 3,3 1 313M32 / P.F. /

4.1D3 5,8 10,3 3,1 22G2 5,3 5,2 1,6 31C6 6,7 5,3 1,6 TIG1 / P.F. / P.F.: ajuste inadequado B. Ensaio funcional TIGIT em células T CD8+ humanas primárias de voluntários saudáveis

[0301] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano, cocultivamos células T CD8+ humanas primárias de PBMC de doadores humanos saudáveis com a linhagem celular CHO-K1 projetada para expressar PVR/CD155 humano e ativar células T humanas. Observamos que a liberação de IFNg pelas células T CD8+ na presença de células CHO-K1 expressando CD155 manipuladas poderia ser aumentada pelo bloqueio de hTIGIT com anticorpos antagonistas anti-TIGIT. Para comparar a potência desses anticorpos em aumentar a liberação de IFNg, a experiência foi conduzida na presença de concentrações crescentes de anticorpos e os valores de EC50 foram calculados.

[0302] As células CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas em placas de 96 poços de fundo em U de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, 5% de CO2 da incubadora O/N. No dia seguinte, as células T CD8+ foram purificadas de acordo com as recomendações do fabricante, usando um kit de seleção negativa (Stemcell Technologies, 17953) de células mononucleares do sangue periférico humano congeladas isoladas do sangue total de doadores saudáveis (Immunehealth). Células T CD8 purificadas e concentrações crescentes (0,011 nM, 0,033 nM, 0,11 nM, 0,33 nM, 1,06 nM, 3,3 nM, 10,6 nM, 33,3 nM e 105,5 nM) de anticorpos foram então adicionadas ao CD155 aAPC/CHO-K1 (100.000 células T CD8/100 µL de meio completo contendo anticorpo) e incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 5 dias. Finalmente, as concentrações de IFNg foram avaliadas no sobrenadante celular utilizando um ensaio ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) que foi executado de acordo com as recomendações do fabricante.

[0303] Como mostrado na Figura 24B e resumido na Tabela 21, o clone a- TIGIT 31282 e 4.1D3 exibe a melhor indução da secreção de IFNg com um aumento de 2,7 e 2,9 vezes sobre o anticorpo de controle de isotipo. O clone 31282 tem a melhor eficácia para indução da produção de IFNg em termos de concentração de EC50, que foi medida em 0,13 nM. O clone 31C6 mostra um valor de EC50 2,3 vezes diferente, enquanto o clone 22G2 e 4.1D3 são 3,1 e 10,8 vezes menos potentes que o clone 31282. Não foi possível determinar nenhum valor para o clone 313M32 devido a uma atividade baixa e ajuste inadequado das curvas nas concentrações testadas (Figura 24B). Tabela 21: Dados de EC50 e comparação de diferentes clones a-TIGIT para atividade funcional em células T CD8+ humanas primárias Clone Indução EC50 (nM) Fold change comparada a de EC50 controle de comparada a isotipo (fold EC50 do change) melhor clone (31282_wu) 31282_wu 2,7 0,13 1 313M32 / P.F. /

4.1D3 2,9 1,43 10,8 22G2 1,5 0,41 3,1 31C6 1,6 0,30 2,3 C. Ensaio funcional TIGIT em células T CD3+ humanas primárias de pacientes com câncer

[0304] Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor TIGIT humano em células T de pacientes com câncer, as células T CD3+ humanas primárias de PBMC de um paciente com câncer foram cocultivadas com uma linhagem de células CHO-K1 projetada para expressar PVR/CD155 humano e ativar células T humanas (CHO-TCR-CD155). Observamos que a liberação de IFNg pelas células T CD3+ na presença de células CHO-K1 expressando CD155 manipuladas poderia ser aumentada pelo bloqueio de hTIGIT com anticorpo antagonistas anti-TIGIT 31282.

[0305] As células CD155 aAPC/CHO-K1 (Promega, CS198811) foram semeadas em placas de 96 poços de fundo em U de acordo com as recomendações do fabricante e incubadas a 37°C, incubadora O/N com CO2 a 5%. No dia seguinte, as células T CD3+ foram purificadas de acordo com as recomendações do fabricante, usando um kit de seleção negativa (Stemcell Technologies, 17951) de células mononucleares do sangue periférico humano fresco isoladas do sangue total de um paciente com câncer (HNSCC) coletado 24 horas antes (Biopartners). As células T CD3+ purificadas e 66,7nM de anticorpos foram então adicionadas a CD155 aAPC/CHO-K1 (100.000 células T CD3/100ul de meio completo contendo anticorpo) e incubadas a 37°C, CO2 a 5% por 5 dias. Finalmente, as concentrações de IFNg foram avaliadas no sobrenadante celular utilizando um ensaio ELISA (Affymetrix eBioscience, 88-7316-86) que foi executado de acordo com as recomendações do fabricante.

[0306] Como mostrado na Figura 24C, o anticorpo 31282 induziu uma forte atividade funcional para aumentar a secreção de IFNg, demonstrando o potencial desse anticorpo a-TIGIT para reativar células T PBMC de pacientes com câncer. D. O clone a-TIGIT 31282 aumenta a produção intracelular de citocinas em células T de pacientes com câncer PBMC e células tumorais dissociadas (DTC)

[0307] Neste exemplo, a coloração por citometria de fluxo intracelular foi realizada para avaliar a produção de citocinas de células T a partir de PBMC correspondente recém-isolado e linfócitos infiltrados em tumores dentro de células tumorais dissociadas (DTC) de pacientes com câncer de carcinoma renal. Para DTC, os tumores foram picados mecanicamente e depois incubados com o kit de dissociação de tumores (Miltenyi Biotech # 130-095-929) sob rotação em um dissociador gentleMACS, seguindo as instruções do fabricante para tipos específicos de tumores. As células foram estimuladas durante 16 h com um coquetel de esferas de estimulação de células T (Dynabeads, Thermo Fisher) antes de se realizar a coloração intracelular. Durante as últimas 3 horas de estimulação, foram adicionados às células o coquetel Transport Inhibitor Cocktail de proteína (eBioscience) e o coquetel de estimulação celular (eBioscience). Os anticorpos conjugados foram adquiridos da Ebioscience/Thermo Fisher Scientific, BioLegend ou BD Biosciences. A coloração da superfície foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, usando tampão FACS filtrado (PBS + 2 mM EDTA + 0,1% de BSA) e tampão Brilliant Stain (BD # 563794). As células foram bloqueadas com FcBlock Humano apropriado (BD # 564220) antes da coloração da superfície. Para coloração intracelular, as células foram fixadas e permeabilizadas usando a solução BD Cytofix/cytoperm (BD Biosciences). As células foram coradas com o seguinte painel de anticorpos: anti-CD45-BB515 (Clone HI30, BD Horizon 564585), anti- CD73-BV421 (Clone AD2, BD Horizon 562430), anti-CD8a-BV510 (Clone SK1, BD Horizon 563919), anti-CD3-BV650 (Clone SK7, BD Horizon 563999), anti-IFNg- BV711 (Clone 4S.B3, BD Horizon 564793), anti-IL-2-APC (MQ1-17H12, eBioscience 17-7029-82), anti-CD4-APC-R700 (Clone RPA-T4, BD Horizon 564975), LVD efluor 780 (eBioscience 65-0865-14), anti-TIGIT-PE (Clone MBSA43, eBioscience E13456-108), anti-CD39-PE-Dazzle594 (Clone A1, Biolegend 328224) e TNFa-PE-cy7 (Clone Mab11, eBioscience 25-7349-82). A aquisição foi realizada num FACS Fortessa (BD Biosciences) e analisada com o software FlowJo (FlowJo,

LLC). As células viáveis foram separadas na dispersão Forward e Side. Os subconjuntos de células T foram bloqueados da seguinte forma: CD45+ CD3+ for PBMC and CD45+ CD3+CD4+ e CD45+ CD3+ CD8+ para DTC. As células T secretoras de citocinas foram fechadas usando controles não corados e não estimulados.

[0308] A Figura 24D mostra que o conteúdo intracelular de IL2, IFNg e TNFa foram todos aumentados após a ativação na presença do clone a-TIGIT 31282. Este aumento foi observado nas células T CD3+ de PBMC, de acordo com os dados ilustrados na Figura 24C, mas também em ambos TIL CD4+ e CD8+ das células tumorais dissociadas. Isso demonstra o potencial do clone a-TIGIT 31282 para aumentar a ativação das populações PBMC e TIL das células T de pacientes com câncer. Exemplo 21: clone a-TIGIT 31282 induz citotoxicidade preferencial de Treg em PBMC de pacientes com câncer

[0309] Neste exemplo, PBMCs isoladas de um paciente com câncer de pulmão foram ressuspensas em meio RPMI completo (suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor + 50U de penicilina + 50 U de estreptomicina). Foram distribuídas 2,5x105 PBMCs humanas por poço em placa de 96U. O clone 31282 do anticorpo TIGIT anti-humano, o controle do isotipo IgG1 humano (BioXcell BE0297) ou o Rituximabe (InvivoGen hcd20-mab1) foram adicionados a uma concentração final de 6,6 nM a cada poço correspondente. As células foram incubadas por 20 horas a 37°C com 5% de CO2. Em seguida, as células foram coletadas e coradas com o seguinte painel de anticorpos: LVD efluor 520 (eBioscience 65-0867-14), ant-TCRab-PercP-Cy5.5 (Clone IP26, Biolegend 306723), anti-CD4-BV510 (Clone SK3, BD Horizon 562970), anti-CD8-APC-Cy7 (Clone SK1, Biolegend 344714), anti-CD25-BV605 (Clone 2A3, Biolegend 562660), anti-CD127-APC (A019D5, Biolegend 351316), anti-CCR7-BV421 (Clone G043H7, Biolegend 353207) e anti-CD45RO-PE-Cy7 (Clone UCHL1, Biolegend 304229). Os resultados são apresentados em células vivas separadas. A quantificação absoluta é feita usando as esferas AccuCheck Counting (Life Technologies), seguindo as especificações do fabricante. Após o cálculo dos números absolutos de células por µl, % da lise específica é calculada usando a seguinte fórmula = (1- (número absoluto de células por µl na amostra tratada com anticorpo 31282 TIGIT/média de triplicado de amostras tratadas de isotipo de controle)) x100. Os resultados são apresentados como % média da lise específica em triplicados +/- DP. A atividade citotóxica das células efetoras ADCC/ADCP foi avaliada medindo a % de lise celular específica em células CD19+ separadas após incubação com Rituximabe.

[0310] Como mostrado na Figura 25, o clone anti-TIGIT 31282 desencadeia lise específica mais alta nas células Tregs (30,1 +/- 3%) do que nas células T CD45RO+CCR7+/-CD8+ (células T CD8+ de memória total) (-1,48 +/- 6 %) ou T CD45RO+CCR7+/-CD4+ (células T CD4+ T de memória total) (0,64+/- 3%). O controle positivo de rituximabe desencadeia 77,9% (+/- 6,8%) da lise específica em células CD19+ separadas. Os dados gerais demonstram uma depleção preferencial das células Treg de PBMC de pacientes com câncer em comparação com as populações de células T CD4+ eCD8 + de memória total. Observou-se depleção preferencial semelhante de células Treg usando células de um paciente com adenocarcinoma do cólon. Exemplo 22: Caracterização da expressão de TIGIT em populações imunes de células tumorais dissociadas e PBMC de paciente com câncer

[0311] Análises por citometria de fluxo foram realizadas para avaliar a expressão de TIGIT em subconjuntos de células imunes de PBMC emparelhadas recém-isoladas e linfócitos infiltrados em tumores dentro de células tumorais dissociadas (DTC) de pacientes com câncer. Foram obtidas amostras de diferentes indicações: câncer de ovário, câncer de rim, HNSSC, carcinoma cutâneo, melanoma e câncer de pulmão. Para DTC, os tumores foram picados mecanicamente e depois incubados com o kit de dissociação de tumores (Miltenyi Biotech # 130-095-929) sob rotação em um dissociador gentleMACS, seguindo as instruções do fabricante para tipos específicos de tumores. As PBMC foram isoladas do sangue total em um meio gradiente de densidade (Lymphoprep Axis- Shield # 1115758). Os dados de fenotipagem foram comparados com PBMC congelada isolada de indivíduos saudáveis (n = 10).

[0312] As células foram coradas de acordo com as instruções do fabricante, usando tampão FACS filtrado (PBS + 2 mM de EDTA + 0,1% BSA) e tampão Brilliant Stain (BD # 563794). As células foram bloqueadas com FcBlock Humano apropriado (BD # 564220) antes da coloração e foram fixadas usando tampão de fixação IC (eBioscience # 00-8222-49) antes da aquisição. As DTC foram coradas com o seguinte painel de anticorpos: anti-CD45-BB515 (Clone HI30, BD Horizon 564585), anti-CD73-BV421 (Clone AD2, BD Horizon 562430), anti-CD8a-BV510 (Clone SK1, BD Horizon 563919), anti-CD3-BV650 (Clone SK7, BD Horizon 563999), anti-CD56-BV711 (Clone 5.1H11, Biolegend 362542), anti-CD279-BV785 (Clone EH12.2H7, Biolegend 329930), anti-CD127-APC (Clone A019D5, Biolegend 351316), anti-CD4-APC-R700 (Clone RPA-T4, BD Horizon 564975), LVD efluor 780 (eBioscience 65-0865-14), anti-TIGIT-PE (Clone MBSA43, eBioscience E13456- 108), anti-CD39-PE-Dazzle594 (Clone A1, Biolegend 328224) e CD25-PE-cy7 (Clone BC96, Biolegend 302612). As PBMC foram coradas com o seguinte painel de anticorpos: anti-CD45RO-BB515 (Clone UCHL1, BD Horizon 564529), anti- CD73-BV421 (Clone AD2, BD Horizon 562430), anti-CD8a-BV510 (Clone SK1, BD Horizon 563919), anti-CD3-BV650 (Clone SK7, BD Horizon 563999), anti-CD56- BV711 (Clone 5.1H11, Biolegend 362542), anti-CD197-BV786 (Clone 3D12, BD Horizon 563710), anti-CD127-APC (Clone A019D5, Biolegend 351316), anti-CD4- APC-R700 (Clone RPA-T4, BD Horizon 564975), LVD efluor 780 (eBioscience 65- 0865-14), anti-TIGIT-PE (Clone MBSA43, eBioscience E13456-108), anti-CD39- PE-Dazzle594 (Clone A1, Biolegend 328224) e CD25-PE-cy7 (Cl bone BC96, Biolegend 302612). A aquisição foi realizada num FACS Fortessa (BD Biosciences) e analisada com o software FlowJo (FlowJo, LLC). As células viáveis foram separadas na dispersão Forward e Side. Vários subconjuntos de células imunes foram separados como segue: CD3+ CD4+ CD127+ CD25- (células CD3+ CD4+ não Treg), CD3+ CD4+ CD127baixo CD25+ (Células T reguladoras), CD3+ CD8+ (células CD3+ CD8+ T), CD3- CD56+ (células NK), CD3+ CD56+ (células NKT), CD3- CD56- (células não T/NK). As esferas Quantibrite PE (BD # 340495) foram executadas nas mesmas configurações do instrumento e usadas para converter dados de fluorescência em número de anticorpos ligados por célula.

[0313] A frequência da expressão de TIGIT em diferentes populações imunes é representada na Figura 26A e a densidade de TIGIT para cada subconjunto é representada na Figura 26B usando a representação de caixa e fio de bigode usando o método Tukey para calcular percentis.

[0314] Os dados mostram que a frequência de TIGIT no subconjunto de células T é maior em PBMC de pacientes com câncer em comparação com a PBMC de doadores saudáveis. Essa frequência é aumentada ainda mais em TILs de DTC (Figura 26A). Enquanto a mesma observação é feita observando a densidade de TIGIT na superfície de células CD3+ CD4+ não Treg e células CD4+ Treg, para células T CD3+ CD8+, o número de moléculas TIGIT por célula diminui em TILs de DTC (Figura 26B). Exemplo 23: Mapeamento de epítopo estrutural e funcional de TIGIT e clone 31282

[0315] Para caracterizar e entender melhor a interação entre o clone 31282 do mAb anti-TIGIT e a proteína recombinante TIGIT, a estrutura cristalina de 31282 no complexo com TIGIT foi determinada por difração de raios-X. A. Expressão, purificação e cristalização de TIGIT e Fab

[0316] Os resíduos de TIGIT humanos 23-128 foram produzidos por Proteros Biostructures GmbH. O TIGIT (23-128) com tag HIS do terminal N (clivável por trombina) foi clonado em pET15b e expresso em meio LB em Bl21 (DE3) a 37°C nos corpos de inclusão. Os corpos de inclusão (IBs) foram lavados com tampão contendo Tris/HCl a pH 7,4 e Tris/HCl a pH 7,4, Brij-35 a 0,05%. Os IBs foram desnaturados com 6 M de Gdm/HCl, Tris a 50 mM, pH a 8,5 e DTT a 10 mM. O re- enovelamento foi realizado em Tris/HCl a 50 mM, pH 8, GSH a 1 mM, GSSG a 0,5 mM, NaCl a 150 mM. A proteína re-enovelada foi purificada na HIS-trap. A tag HIS do terminal N foi removida por clivagem com trombina e purificação adicional em Superdex-75 equilibrada em Tris/HCl a 50 mM, pH 7,5, NaCl a 200 mM.

[0317] Para expressão do fragmento Fab, células HEK293F foram cultivadas em Freestyle F17 com 1% de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L- glutamina e 0,1% de Pluronic. Culturas expandidas para transfecção foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer de 3 L (Corning, volume de trabalho de cultura de células de 2 L, 37°C, 8% v/v de CO2, 80 - 120 rpm, amplitude de 50 mm). A cultura foi diluída um dia antes da transfecção e o número de células ajustado para 1x106 células/ml. O volume da cultura de expressão foi de 6L. Uma transfecção transitória foi realizada com plasmídeos para cadeia leve e pesada de Fab. Uma MasterMix de DNA/FectoPro (FectoPro, PolyPlus) foi preparada em meio F17 puro e incubada por 10 minutos (de acordo com o protocolo PolyPlus). Essa mistura de transfecção foi adicionada gota a gota à suspensão celular e o Booster foi adicionado imediatamente. 18 horas após a transfecção, a cultura foi alimentada com 3 g/L de glicose.

[0318] Para purificação do fragmento Fab, o sobrenadante de 6 L da cultura de células HEK293 foi coletado por centrifugação 6 dias após a transfecção e aplicado a uma coluna KappaSelect de 30 ml. O KappaSelect foi lavado com PBS a pH 7,4, eluído com citrato de sódio a pH 3 e as frações contendo Fab foram neutralizadas com tampão Tris. O Fab foi ainda purificado na coluna Superdex S- 200 equilibrada em Tris a 20 mM, pH 8, NaCl a 100 mM e armazenado a -80°C até utilização posterior.

[0319] Para a formação do complexo Fab-TIGIT, TIGIT purificado foi misturado com Fab purificado numa razão de 1,5:1 e o complexo foi purificado em Superdex-200 equilibrado em Tris a 20 mM, pH 8, NaCl a 100 mM. O complexo Fab-TIGIT foi concentrado a 35 mg/ml para cristalização. O complexo Fab-TIGIT foi cristalizado a 277K usando o método de difusão de vapor, misturando 0,1 μl de solução de proteína (35,3 mg/ml em TRIS a 20mM, pH 8,0; NaCl a 100 mM) em uma razão de 1:1 com solução de reservatório (0,10 M de sódio cacodilato a pH 6,00; 15% (p/v) de PEG4000). Os cristais foram crioprotegidos por imersão em solução de reservatório com glicerol a 25% adicionado. B. Coleta e Processamento de Dados

[0320] Um protocolo criogênico foi estabelecido usando os protocolos padrão da Proteros Biostructures GmbH. Os cristais foram congelados instantaneamente e medidos a uma temperatura de 100 K. Os dados de difração de raios X foram coletados dos cristais do complexo Fab:TIGIT na SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Suíça) usando condições criogênicas. Os cristais pertencem ao grupo espacial P1. Os dados foram processados nos programas XDS e XSCALE. As estatísticas de coleta e processamento de dados podem ser encontradas na Tabela 22. Tabela 22: Estatísticas de coleta e processamento de dados Fonte de raio X PXII/X10SA (SLS1) Comprimento de onda [Å] 1,0000

Detector PILATUS 6M Temperatura [K] 100 Grupo espacial P1 Célula: a; b; c; [Å] 41,73; 71,46; 110,26 a; b; g; [˚] 96,7; 95,8; 106,5 Resolução [Å] 2,31 (2,56-2,31) Reflexões únicas 50537 (13271) Multiplicidade 2,0 (1,9) Integralidade [%] 96,1 (95,3) Rsim [%] 8,1 (43,5) Rmeas [%] 11,0 (59,1) Média(I)/sd3 8,11 (1,94) 1 FONTE DE LUZ SUÍÇA (SLS, Villigen, Suíça) 2valores entre parênteses referem-se ao compartimento de maior resolução 3calculado a partir de reflexões independentes C. Modelagem e Refinamento de Estrutura

[0321] As informações de fase necessárias para determinar e analisar a estrutura foram obtidas por substituição molecular. Uma estrutura previamente resolvida de Fab foi usada como modelo de pesquisa. A construção e o refinamento subsequentes do modelo foram realizados de acordo com os protocolos padrões com os pacotes de software CCP4 e COOT. Para o cálculo do fator R livre, uma medida para validar cruzadamente a correção do modelo final, cerca de 2,5% das reflexões medidas foram excluídas do procedimento de refinamento (consulte a Tabela 23).

[0322] O refinamento do TLS (usando REFMAC5, CCP4) foi realizado, o que resultou em menores fatores R e em maior qualidade do mapa de densidade de elétrons. Restrições de NCS locais geradas automaticamente foram aplicadas (palavra-chave "ncsr local" das versões mais recentes do REFMAC5). A parametrização do ligante e a geração dos arquivos de biblioteca correspondentes foram realizadas com CHEMSKETCH e LIBCHECK (CCP4), respectivamente.

[0323] O modelo de água foi construído com o algoritmo "Find waters" do COOT, colocando moléculas de água em picos do mapa Fo-Fc contornados em

3,0, seguido de refinamento com REFMAC5 e verificando todas as águas com a ferramenta de validação do COOT. Os critérios para a lista de águas suspeitas foram: fator B maior que 80 Å2, mapa 2Fo-Fc menor que 1,2 s, distância até o contato mais próximo menor que 2,3 Å ou maior que 3,5 Å. As moléculas de água suspeitas e aquelas no local de ligação do ligante (distância do ligante menor que 10 Å) foram verificadas manualmente. A estrutura complexa final foi refinada com PHENIX. Escolhemos o parâmetro de refinamento, incluindo coordenadas XYZ, Espaço real, Fatores B individuais e Fatores B de grupo. Otimize o peso dos raios X/estereoquímica e as restrições de NCS também foram escolhidas para refinamento. O Gráfico de Ramachandran do modelo final mostra 95,39% de todos os resíduos na região preferida, 3,95% na região permitida. As estatísticas da estrutura final e do processo de refinamento estão listadas na Tabela 23. Tabela 23: Estatísticas de refinamento1 Resolução [Å] 108,40-2,31 Número de reflexões (trabalho/teste) 49289/1247 Rtrabalho 0,2025 Rlivre [%] 0,2466 Número total de átomos: Proteína 8282 Água 676 Desvio da geometria ideal: 3 Comprimentos de ligação [Å] 0,003 Ângulos de ligação [deg] 0,771 Gráfico de Ramachandran: 2 Regiões preferidas [%] 95,39 Regiões permitidas [%] 3,95 Regiões não permitidas [%] 0,66 1 valores conforme definido em PHENIX 2Calculado com COOT D. Estrutura geral

[0324] As cadeias pesada e leve do fragmento de anticorpo Fab humano mostram o dobramento típico de anticorpos humanos (Figura 27A). Existem dois heterotrímeros na unidade assimétrica com basicamente a mesma conformação geral. O modelo compreende os resíduos 23 a 128 do TIGIT, resíduos 1 a 224 da cadeia pesada do clone 31282 e resíduos 1 a 214 da cadeia leve do clone 31282. Uma região de alça curta da cadeia pesada não é totalmente definida pela densidade de elétrons e, portanto, não foi incluída no modelo.

[0325] As imagens de difração foram analisadas usando o programa FoldX para estimar a contribuição energética de resíduos e definir pontos de acesso de interação. Os resíduos de aminoácidos que formam a interface de ligação estão bem definidos no mapa de densidade de elétrons. Os dados de difração de raios X interpretados mostram claramente as interações entre o Fab e o TIGIT (Figura 27B e 27C). O CDR da cadeia leve do clone 31282 está interagindo com 2 regiões de TIGIT com CDR L1 Arg30 e Tyr33 entrando em contato com os resíduos de TIGIT Asn58 e Glu60; com CDR L1 Arg30 e CDR L3 Phe93 entrando em contato com o resíduo de TIGIT Ile109. O CDR L2 não tem contato com TIGIT (Tabela 24). A cadeia pesada do clone 31282 interage com diferentes regiões de TIGIT com CDR H1 Tyr33 entrando em contato com TIGIT no resíduo Leu73; com CDR H2 Val50, Ser54 e Ser57 entrando em contato com TIGIT no resíduo Leu73; com CDR H3 Asp102, Tyr103 e Trp104 entrando em contato com TIGIT no resíduo Gln56, Ile68, Leu73 e His76.

[0326] Com base nessa estrutura cristalina do complexo a-TIGIT clone 31282/TIGIT, os resíduos de TIGIT que são contatados pelo clone 31282 (resíduos de epítopos para TIGIT ligados pelo clone 31282) e os resíduos do clone 31282 que são contatados por TIGIT (resíduos de parátopos para o clone 31282 ligado por TIGIT) foram determinados. As Tabelas 24 e 25 e a Figura 27C mostram os resíduos de TIGIT em contato com os resíduos de cadeia leve (Tabela 24) ou pesada (Tabela 25) do clone 31282. Os resíduos de contato foram definidos como cada aminoácido que atende cada um dos seguintes critérios: (i) possui uma contribuição de energia livre de ligação calculada superior a 0,3 kcal/mol; (ii) possui um fator B ponderado experimental menor que o fator B ponderado de todos os resíduos na estrutura de raio-X, (iii) faz pelo menos 3 pares de contatos interatômicos de átomos pesados com átomos de anticorpo a uma distância menor ou igual a 4,0 Angstroms; (iv) não produz apenas ligação de hidrogênio exposta a solvente ou interações iônicas, (v) se for um resíduo polar não aromático (Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys ou Arg), faz pelo menos uma ligação de hidrogênio ou interação iônica com o anticorpo. Tabela 24: Resumo dos resíduos epítopos de TIGIT e resíduos parátopos correspondentes na cadeia leve do clone 31282 Aminoácido de TIGIT Aminoácido do Clone 31282 Cadeia leve Asn 58 Tyr 33 Glu 60 Arg 30 Tyr 33 Ile 109 Arg30 Phe 93 Tabela 25: Resumo dos resíduos epítopos de TIGIT e resíduos parátopos correspondentes na cadeia pesada do clone 31282 Aminoácido de TIGIT Cadeia Pesada de Aminoácidos do Clone 31282 Gln 56 Trp 104 Ile 68 Tyr 103 Trp104 Leu 73 Tyr33 Val50 Ser 54 Val 50 His 76 Asp 102 Tyr 103 Trp104 Exemplo 24: Ensaio de competição entre os clones de a-TIGIT 31282 e

32959.

[0327] O clone 32959 do anticorpo anti-TIGIT de isotipo IgG1 humano foi produzido em células HEK e purificado como descrito no Exemplo 17 acima.

[0328] As células Jurkat que superexpressam TIGIT humano (Jurkat-

hTIGIT) foram coletadas e distribuídas em 5,104 células/poço e incubadas com o clone a-TIGIT antagonista 31282 nas seguintes concentrações: 0nM (No Ab), 0,08nM, 0,16nM, 0,8nM e 8nM, que representam uma faixa de concentração de 0 a 100 vezes o Kd deste clone. O excesso de anticorpo foi lavado e as células foram incubadas com concentração decrescente (8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031; 0,016; 0,008 e 0,004 nM) do clone anti-TIGIT 32959 diretamente acoplado (AF647) durante 30 min a 4°C. A intensidade de fluorescência geométrica média foi analisada usando LSR BD Fortessa. A ligação celular foi registrada como a intensidade de florescência média de AF647. Para o cálculo da ligação de EC50 do clone 32959, a concentração semi-máxima de ligação (EC50) ao hTIGIT-Jurkat foi calculada usando uma equação de ajuste de curva de quatro variáveis em Prism, e os valores obtidos são mostrados na Tabela 26 e ilustrados na Fig.28. Os resultados mostram uma forte ligação do clone a-TIGIT 32959, independentemente da concentração do clone 31282, demonstrando a ausência de competição com um anticorpo a-TIGIT antagonista. Tabela 26: Concentração de EC50 para ligação do clone a-TIGIT 32959 a Jurkat-hTIGIT na presença de concentração crescente do clone a-TIGIT antagonista 31282 a-TIGIT a-TIGIT a-TIGIT a-TIGIT a-TIGIT 31282 a 31282 a 31282 a 31282 a 31282 a 0nM 0,08nM 0,16nM 0,8nM 8nM Ligação EC50 (nM) para o 0,22 0,33 0,37 0,49 0,39 clone a-TIGIT 32959 Ligação celular Jurkat Human 588

TIGIT FON (Fold Over Negative) para o clone a-TIGIT 32959

Exemplo 25: Determinação do perfil farmacocinético do clone 31282 após injeção iv única em macaco cinomolgo

[0329] Os macacos cinomolgo receberam IgG1 ou IgG4 do clone a-TIGIT 31282 por injeção intravenosa em bolus. O anticorpo foi administrado em 3 concentrações diferentes (0,1mg/kg; 1mg/kg; 10mg/kg) a 2 animais (1 macho e 1 fêmea). O sangue foi coletado 504 horas após a dose no dia 1. As amostras de sangue foram processadas para plasma e analisadas quanto à concentração de IgG1 ou IgG4 do clone a-TIGIT 31282, utilizando um método ELISA. Os dados de tempo de concentração plasmática de animais individuais foram usados para calcular os valores dos parâmetros toxicocinéticos para IgG1 e IgG4 do clone a- TIGIT 31282 após dosagem IV usando o modelo intravascular em Phoenix WinNonlin (versão 6.3, Pharsight, Certara Company, Princeton, NJ).

[0330] Após a administração em bolus IV de IgG1 e IgG4 do clone a-TIGIT 31282 a 0,1, 1 e 10 mg/kg, as concentrações de IgG1 foram quantificáveis no plasma de macacos machos e fêmeas durante 240 h, 336 h e 504 h após a dose, respectivamente, e o IgG4 foi quantificável por 168 h, 240 h e 504 h, respectivamente (Figura 29 e Tabela 27). Não houve diferenças aparentes relacionadas ao sexo na exposição sistêmica (Cmax e AUClast) a IgG1 e IgG4 após a administração intravenosa em bolus i.v. de IgG1 ou IgG4 do clone a-TIGIT 31282, com proporções (machos/fêmeas) variando de 0,855 a 1,16.

[0331] Após a administração em bolus iv de IgG1 do clone a-TIGIT 31282 em macacos machos e fêmeas, as concentrações plasmáticas de IgG1 diminuíram bifásicamente em todos os níveis de dose, com meia-vida terminal média (t1/2) variando de 84,7-174 h (Figura 29). A depuração sistêmica (CL) foi consistente nas doses estudadas, variando de 0,280 a 0,392 mL/h/kg. O volume aparente de distribuição no estado estacionário (Vss) foi consistente entre os níveis de dose testados, com valores variando de 53,7-66,5 mL/kg. Os aumentos de 10 vezes na dose de IgG1 do clone a-TIGIT 31282 na faixa de 0,1 a 1 mg/kg e de 1 a 10 mg/kg resultaram em aumentos aproximadamente proporcionais na exposição (aumentos de 9,57 a 14,5 vezes).

[0332] Após a administração i.v. de igG4 do clone a-TIGIT 31282 em macacos machos e fêmeas, as concentrações plasmáticas de IgG4 diminuíram bifásicamente em todos os níveis de dose testados, com t1/2 de 148-334 h (Figura 29 e Tabela 28). O CL foi consistente entre os níveis de dose testados, variando de 0,160 a 0,219 m/h/kg. A média de Vss variou de 41,2 a 70,7 mL/kg. Os aumentos de 10 vezes na dose de IgG4 do clone a-TIGIT 31282 na faixa de 0,1 a 1 mg/kg e de 1 a 10 mg/kg resultaram em aumentos aproximadamente proporcionais na exposição a igG4 (aumentos de 9,32 a 12,5 vezes). Tabela 27: Resumo dos parâmetros Toxicocinéticos médios de IgG1 humana do clone a-TIGIT 31282 após bolus i.v. em macaco Cinomolgo IgG1 humana do clone a-TIGIT 31282 Dose (mg/kg) 0,1 1 10 Cmax (ug/mL) 2,34 22,4 268 tmax (h) 1 1 1 AUCúltimo (h*ug/ml) 224 2330 33700 t1/2 (h) 174 84,7 111 Cl (mL/h/kg) 0,292 0,392 0,280 Vss (mL/kg) 66,5 57,2 53,7 Tabela 28: Resumo dos parâmetros Toxicocinéticos médios de IgG4 humana do clone a-TIGIT 31282 após bolus i.v. em macaco Cinomolgo IgG4 humana do clone a-TIGIT 31282 Dose (mg/kg) 0,1 1 10 Cmax (ug/mL) 2,81 26,2 283 tmax (h) 1 1 1 AUCúltimo (h*ug/ml) 238 2690 39100 t1/2 (h) 251 334 182 Cl (mL/h/kg) 0,190 0,160 0,216 Vss (mL/kg) 65,7 70,7 57,5 Exemplo 26: Caracterização da expressão de TIGIT em populações de células tumorais humanas

[0333] Análises por citometria de fluxo foram realizadas para avaliar a expressão de TIGIT em células T ou B normais e tumorais em amostras de sangue de pacientes com câncer com diferentes indicações de câncer no sangue.

[0334] Amostras de pacientes com Síndrome de Sézary foram testadas para comparar a expressão de TIGIT em populações de células T CD4+ malignas e normais. Para separar essas populações, uma pré-determinação do rearranjo do TCR-Vb do clone maligno foi realizada usando o kit de repertório Beckman Coulter TCR-Vb (# IM3497). Depois que o clone maligno foi identificado, a expressão de TIGIT foi perfilada nas células imunológicas dos pacientes com Síndrome de Sézary usando os seguintes reagentes comerciais: anti-CD3 Krome Orange (# B00068), anti–CD4-PE (# A07751), anti, CD8-PC7 ( # 737661), anti–CD56-PC5 (# A07789), anti–CD45-Pacific Blue (# A74763), anti-CD19-AF750 (# A94681) e anti- Vb8-FITC (# IM1233) (todos da Beckman-Coulter) e anti-TIGIT-APC (clone MBSA43, ebiosciences # 17-9500-42). As análises por citometria de fluxo das amostras dos pacientes com Síndrome de Sézary foram realizadas em um aparelho CytoFlex (Beckman-Coulter). Os dados foram analisados com o software FloJo (FlowJo, LLC).

[0335] Um exemplo representativo é mostrado na Figura 30A. A estratégia de separação para esse doador que possui um clone TCR-Vb8 maligno é mostrada na Figura 30A com células malignas sendo CD45+CD3+CD4+Vb8+ e células T CD4+ normais sendo CD45+CD3+CD4+Vb8-. Uma forte expressão de TIGIT é observada nas células T CD4+ malignas em comparação com as células T CD4 + normais (MFI respectiva de 4987 e 999) (Figura 30B).

[0336] Da mesma forma, análises por citometria de fluxo foram realizadas para avaliar a expressão de TIGIT em células B normais e malignas em amostras de medula óssea de pacientes com LLC. As amostras foram coradas com o seguinte painel de anticorpos: LVD efluor 780 (eBioscience 65-0865-14), anti- CD45-BB515 (Clone HI30, BD Horizon 564585), anti-CD5-BV510 (Clone UCHT2, Biolegend 363381), anti-CD19-BV711 (Clone SJ25C1, BD Horizon 563036) e anti- TIGIT-PE (Clone MBSA43, eBioscience E13456-108). A aquisição foi realizada no FACS Fortessa (BD Biosciences) e analisada com o software FlowJo (FlowJo, LLC). As células viáveis foram separadas na dispersão Forward e Side. Vários subconjuntos de células foram separados como se segue: CD45+ CD19+ CD5- (células B normais) e CD45+ CD19+ CD5+ (B-LLC maligno).

[0337] Um exemplo representativo é mostrado na Figura 31 com a estratégia de separação ilustrada na Figura 31A. Uma alta proporção de células B-

LLC malignas é positiva para TIGIT (75%), em contraste com as células B normais (1%) (IMFs de 1440 e 810, respectivamente) (Figura 31B).

[0338] No geral, os dados obtidos demonstram que as células tumorais expressam TIGIT em indicações específicas de câncer de sangue. Exemplo 27: Atividade antitumoral do anticorpo antagonista anti-TIGIT em monoterapia no modelo de linfoma de células T de camundongo.

[0339] Para esta experiência, as células de linfoma de células T EL4 (ATCC® TIB-39™) foram modificadas para expressar estavelmente TIGIT de camundongo (EL4-mTIGIT). As células EL4 transduzidas com um vetor semelhante codificando para GFP foram usadas como controle (EL4-GFP). Grupos de células foram subclonados para obter clones de EL4-mTIGIT e EL4-GFP. O anticorpo anti- TIGIT utilizado foi uma versão modificada do anticorpo 29527 (modificado de modo que o resíduo 27 de VH FR3 seja mutado de L para V e onde o resíduo 6 de VH FR4 seja mutado de M para T) e produzido em um isotipo de IgG1 humano. Camundongos Balb/c fêmeas de 8 semanas foram inoculados com 1.000.000 células EL4-mTIGIT ou 200.000 células EL4-GFP por via subcutânea. No dia 7 após a inoculação, quando os volumes tumorais estavam em média em torno de 110 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento com volume tumoral igual (n=15 por grupo para EL4-mTIGIT e n=10 por grupo para EL4- GFP). Os camundongos foram tratados com 200 µg de anticorpo anti-TIGIT ou anticorpo de controle de isotipo (hIgG1, BioXcell) por injeções intraperitoneais nos dias 7, 10, 13 e 16 após a inoculação do tumor. O crescimento do tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com pinças eletrônicas três vezes por semana, do dia 7 ao dia 26. Os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor excedeu 2000 mm3. As curvas de crescimento tumoral foram analisadas estatisticamente por um modelo linear misto. As diferenças entre os grupos de tratamento foram avaliadas testando a interação do grupo de tratamento*tempo.

[0340] A Figura 32 ilustra as curvas de crescimento tumoral em camundongos inoculados com EL4-mTIGIT (AC) ou EL4-GFP (DF). Representam- se curvas medianas de crescimento tumoral (A e D), bem como curvas individuais de crescimento tumoral para camundongos tratados com controle de isotipo de hIgG1 (B e E) ou a-TIGIT Ab antagonista (C e F). Em camundongos inoculados com células EL4-mTIGIT, houve uma supressão significativa do crescimento tumoral quando tratados com anti-TIGIT Ab em comparação com o grupo tratado com controle de isotipo (p <0,001). Enquanto no grupo tratado com anticorpo de controle de isotipo, 3 de 15 camundongos demonstraram um controle do crescimento tumoral com um volume abaixo de 700 mm3 ao final do modelo, esse número foi aumentado para 8 de 15 camundongos no grupo tratado com anticorpo anti-TIGIT antagonista. Nenhuma eficácia antitumoral ou resposta completa pôde ser observada em camundongos portadores de tumor EL4-GFP ao comparar o tratamento com a-TIGIT antagonista com o anticorpo de controle de isotipo. Juntos, esses dados demonstram que o anticorpo a-TIGIT antagonista (hIgG1) tem eficácia antitumoral significativa em um modelo com células tumorais que expressam TIGIT. Exemplo 28: Atividade antitumoral do anticorpo anti-TIGIT antagonista em combinação com anticorpos de ponto de verificação imune em modelos de camundongos com carcinoma de cólon CT26

[0341] Além da combinação de anti-TIGIT Ab com um anticorpo anti-PD1 (Exemplos 12, 13 e 14), a eficácia antitumoral de um anticorpo anti-TIGIT também foi avaliada em combinação com anticorpos agonistas específicos para moléculas coestimuladoras 4-1BB, OX40 e GITR, bem como com um anticorpo antagonista específico para a molécula inibidora de ponto de verificação ICOS.

[0342] A linhagem celular tumoral CT26 foi adquirida da ATCC® (CRL- 2638™). Camundongos balb/c fêmeas de 8 semanas foram inoculados subcutaneamente no flanco direito com 500.000 células. No dia 9 após a inoculação, quando os volumes tumorais estavam em média em torno de 75 mm3, os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento com igual volume tumoral (n=10 camundongos por grupo). Todos os anticorpos foram administrados por via intraperitoneal a cada 3 dias, começando no dia da randomização, para um total de 3 injeções. O anticorpo anti-TIGIT usado foi uma versão modificada do anticorpo 29527 (modificado para que o resíduo 27 de VH FR3 seja mutado de L para V e onde o resíduo 6 de VH FR4 seja mutado de M para T) produzido em um isotipo de IgG2a de camundongo, que foi administrado a 20 µg/camundongo. Anti- 4-1BB (clone 3H3, BioXCell, BE0239) foi administrado a 5 µg/camundongo, a-OX-

40 (clone OX-86, BioXCell, BE0031) foi administrado a 20 µg/camundongo, a-GITR (clones DTA -1, BioXCell, BE0063) foi administrado a 10 µg/camundongo; e a-ICOS (clone 7E.17G9, BioXCell, BE0059) foi administrado a 200 µg/camundongo. O crescimento do tumor foi monitorado e os volumes dos tumores foram medidos com pinças eletrônicas três vezes por semana, do dia 7 ao dia 35. Os camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor excedeu 2000 mm3. As curvas de crescimento tumoral foram analisadas estatisticamente por um modelo linear misto em volumes tumorais transformados logaritmicamente. As diferenças entre os grupos de tratamento foram avaliadas testando a interação do grupo de tratamento*tempo. Isso resultou em um bom modelo adequado para a grande maioria dos dados, exceto para volumes tumorais muito pequenos (abaixo de 10mm3). Portanto, esses pequenos volumes tumorais foram tratados como valores ausentes. Para testar um efeito sinérgico resultante da combinação do anticorpo anti-TIGIT com o anticorpo de ponto de verificação imune correspondente (IC– isto é, anti-41BB, anti-OX40, anti-GITR e anti-ICOS), os grupos de tratamento foram recodificados por um combinação de duas variáveis; anti-TIGIT (sim/não) e IC (sim/não). Um efeito sinérgico, além do efeito aditivo de cada tratamento (anti- TIGIT*tempo e IC*tempo) foi avaliado testando o termo de interação anti- TIGIT*IC*tempo.

[0343] A Fig. 33A mostra curvas de crescimento tumoral mediano por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anti- TIGIT em monoterapia ou em combinação com anti-4-1BB. Houve supressão significativa de crescimento tumoral em camundongos tratados com anti-TIGIT + anti-4-1BB em comparação com monoterapia com anti-TIGIT ou anti-4-1BB (p=0,0005 e p<0,0001, respectivamente). A combinação de anticorpos anti-TIGIT e anti-4-1BB resultou em 6/10 camundongos mostrando uma resposta completa (onde o tumor é <30mm3 e considerado não mensurável), em comparação com 1/10 ou 0/10 de resposta completa em grupos tratados respectivamente com a- TIGIT ou a-4-1BB como um agente único. Estes dados demonstram a eficácia antitumoral significativa da terapia anti-TIGIT em combinação com anti-4-1BB no tratamento de tumores pré-estabelecidos.

[0344] A Fig. 33B mostra curvas de crescimento tumoral mediano por grupo,

bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anti- TIGIT em monoterapia ou em combinação com anti-OX-40. Houve supressão significativa de crescimento tumoral em camundongos tratados com anti-TIGIT + anti-OX-40 em comparação com monoterapia com anti-TIGIT ou anti-OX-40 (p=0,0002 e p<0,0001, respectivamente). A combinação de anti-TIGIT + anti-OX- 40 alcançou eficácia antitumoral sinérgica superior ao efeito aditivo de ambos os tratamentos em monoterapia (p = 0,02). A combinação de anticorpos anti-TIGIT e anti-OX-40 resultou em 7/10 camundongos mostrando uma resposta completa em comparação com 1/10 ou 0/10 de resposta completa em grupos tratados respectivamente com a-TIGIT ou a-OX-40 como um único agente. Estes dados demonstram a eficácia antitumoral significativa e sinérgica da terapia anti-TIGIT em combinação com anti-OX-40 no tratamento de tumores pré-estabelecidos.

[0345] A Fig. 33C mostra curvas de crescimento tumoral mediano por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anti- TIGIT em monoterapia ou em combinação com anti-GITR. Houve supressão significativa do crescimento tumoral em camundongos tratados com anti-TIGIT + anti-GITR em comparação à monoterapia com anti-TIGIT ou anti-GITR (p<0,0001). A combinação de anti-TIGIT + anti-GITR alcançou eficácia antitumoral sinérgica superior ao efeito aditivo de ambos os tratamentos em monoterapia (p = 0,01). A combinação de anticorpos anti-TIGIT e anti-GITR resultou em 6/10 camundongos mostrando uma resposta completa em comparação com 1/10 ou 0/10 de resposta completa em grupos tratados respectivamente com anti-TIGIT ou anti-GITR como um único agente. Estes dados demonstram a eficácia antitumoral significativa e sinérgica da terapia anti-TIGIT em combinação com anti-GITR no tratamento de tumores pré-estabelecidos.

[0346] A Fig. 33D mostra curvas de crescimento tumoral mediano por grupo, bem como curvas de crescimento individuais para camundongos tratados com anti- TIGIT em monoterapia ou em combinação com anti-ICOS. Houve supressão significativa de crescimento tumoral em camundongos tratados com anti-TIGIT + anti-ICOS em comparação com monoterapia com anti-TIGIT ou anti-ICOS (p=0,003 e p<0,0001, respectivamente). A combinação de anticorpos anti-TIGIT e anti-ICOS resultou em 1/10 camundongos mostrando uma resposta completa (onde o tumor é <30mm3 e considerado não mensurável), em comparação com 1/10 ou 0/10em grupos tratados respectivamente com anticorpos anti-TIGIT ou anti-ICOS como um agente único. Estes dados demonstram a eficácia antitumoral significativa e sinérgica da terapia anti-TIGIT em combinação com anti-ICOS no tratamento de tumores pré-estabelecidos. Exemplo 29: Atividade do anticorpo anti-TIGIT antagonista nas gd células T

[0347] gd (gama-delta, ou g/d) As células T são uma população de células T não convencionais com atividade antitumoral descrita (Zhao et al. 2018. J Transl Med. 16: 122) e atividade antiviral (por exemplo, infecção por CMV) e também foram implicados em doenças autoimunes (Malik S et al. 2016. Front Immunol. 7:14).

[0348] Foram realizadas análises por citometria de fluxo para avaliar a expressão de TIGIT em células gdT em PBMC isoladas recentemente de indivíduos saudáveis com status soronegativo ou soropositivo para citomegalovírus (CMV) (o status CMV foi avaliado pela EFS Nouvelle Aquitaine, Bordeaux, França). As células foram coradas de acordo com as instruções do fabricante, usando tampão FACS filtrado (PBS + 2 mM EDTA + 0,1% de BSA). A aquisição foi realizada em um FACS Fortessa (BD Biosciences) e analisada com o software BD FACS DIVA (BD Biosciences). As células foram separadas na dispersão e viabilidade Forward e Side. As células T foram separadas como se segue: CD3+ TCR+ V2- (Células T V2-) utilizando os seguintes anticorpos: anti-TCR2 APC, clone REA591 #130-109- 280 de Miltenyi; anti-TCR V2-PE-Vio 770, clone REA771, #130-111-012 de Miltenyi; CD3 anti-humano de camundongo BV421, clone UCHT1, #560365 de BD Biosciences; Kit viável do Zombie Aqua Fixable, #423101 da Biolegend.

[0349] Semelhante às ab células T convencionais, as células Vd2- gd não convencionais expressam TIGIT em populações humanas positivas e negativas de CMV (anti-TIGIT, clone MBSA43, #12-98500-42 de eBioscience) (Fig. 34A). Para caracterizar a consequência funcional do bloqueio do receptor de TIGIT nesta população de células, células T Vd1+ gd isoladas magneticamente (anti-TCR Vd1- FITC, clone REA173 #130-100-532 e anti-FITC Microbeads #130-048-701, ambos da Miltenyi) ou PBMC total de doadores positivos de CMV foram ativados com anti-

V 1 (10µg/ml) (clone R9.1, #IM1761 da Beckman Coulter) e IL-15 (20µg/ml), #200- 15-50UG da Peprotech), IL-2 (100U/ml, #200-02-1MG Peprotech) foi adicionalmente adicionada a células T V 1+ isoladas, na presença ou na ausência do ligante TIGIT CD155 (#9174-CD-050 da R&D Systems). A Fig. 34B mostra uma diminuição dependente da dose nag secreção de IFN (kit ELISA, #3420-1h-20 da Mabtech) mediada pela adição do ligante de TIGIT CD155 (0, 0,1, 1 e 10µg/ml) com uma inibição máxima atingida a 1 µg/ml de CD155. A adição do clone anti-TIGIT Ab 31282 (10µg/ml) restaura completamente a produção de IFNg para um nível igual ou superior à condição sem ligante CD155, enquanto o controle do isotipo IgG1 humano tem efeito muito limitado.

A Fig 34C demonstra um efeito inibidor semelhante mediado por CD155 (10µg/ml) após a ativação de anti-Vd1 do PBMC total e uma restauração total da secreção de IFNg quando o clone a-TIGIT 31282 é adicionado à mistura.

Estes dados demonstram que, semelhante às ab células T, a atividade das células gd T pode ser prejudicada pela ligação de CD155 a TIGIT e que os anticorpos anti-TIGIT impedem completamente essa inibição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga ao TIGIT humano, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a combinação é selecionada do grupo que consiste em: (i) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 61, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 63; (ii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 4, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 5, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 6, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 49, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 50 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 51; (iii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 7, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 8, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 9, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 52, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 53 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 54; (iv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 11, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 12, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 55, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 56 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 57; (v) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 15, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 58, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 59 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 60; (vi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 2, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 46, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 47 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 48; (vii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 19, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 20, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21, LCDR1 compreendendo SEQ

ID NO: 64, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 65 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 66; (viii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 22, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 23, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 24, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 67, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 68 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 69; (ix) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 25, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 26, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 27, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 70, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 71 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 72; (x) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 28, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 29, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 30, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 73, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 74 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 75; (xi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 31, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 32, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 33, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 76, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 77 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 78; (xii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 34, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 35, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 36, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 79, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 80 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 81; (xiii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 37, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 38, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 39, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 82, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 83 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 84; (xiv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 40, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 41, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 42, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 85, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 86 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 87; (xv) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 43, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 44, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 45, LCDR1 compreendendo SEQ

ID NO: 88, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 89 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 90; (xvi) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 271, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 272, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 273, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 283, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 284 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 285; (xvii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 274, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 275, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 276, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 286, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 287 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 288; (xviii) HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 277, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 278, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 279, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 289, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 290 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 291.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID Nos: 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 327, 329 e 331, e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência; e opcionalmente compreendendo um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 328, 330 e 332, e sequências de aminoácidos exibindo pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que a combinação é selecionada do grupo que consiste em: (i) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos

90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212 ou uma sequência aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (ii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 213 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 214 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (iii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 215 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 216 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (iv) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 217 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (v) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 220 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (vi) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 221 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 222 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (vii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 223 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 224 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (viii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 225 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 226 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (ix) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 227 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 228 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (x) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 230 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xi) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 232 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 233 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 234 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xiii) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 236 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xiv) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 237 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 238 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xv) um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 239 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 240 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xvi) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 327 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 328 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; (xvii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 329 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 330 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela; e (xviii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 331 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 332 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a ela.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH), HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG), HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV), LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA), LCDR2 compreende SEQ ID NO: 62 (GASSRAT), e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 221 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta, e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 222 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta.

6. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga ao TIGIT humano e que não compete com CD155 pela ligação ao TIGIT, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (HCDR1), uma CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) e uma CDR3 da cadeia pesada (HCDR3), em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 280, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 281, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 282; e que compreende ainda: um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1), uma CDR2 da cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3), em que LCDR1 compreende SEQ ID NO: 292, LCDR2 compreende SEQ ID NO: 293 e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 294.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 333 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta, e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 334 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta.

8. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga ao TIGIT humano e que não compete com CD155 pela ligação ao TIGIT, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada (HCDR1), uma CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) e uma CDR3 da cadeia pesada (HCDR3), em que HCDR1 compreende SEQ ID NO: 353, HCDR2 compreende SEQ ID NO: 354, HCDR3 compreende SEQ ID NO: 355; e que compreende ainda: um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 da cadeia leve (LCDR1), uma CDR2 da cadeia leve (LCDR2) e uma CDR3 da cadeia leve (LCDR3), em que LCDR1 compreende SEQ ID NO: 356, LCDR2 compreende SEQ ID NO: 357 e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 358.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 367 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta, e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 368 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a esta.

10. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que concorre cruzadamente pela ligação ao TIGIT humano com o anticorpo, conforme qualquer uma das reivindicações 1-9.

11. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga ao TIGIT humano no mesmo epítopo que um anticorpo, conforme qualquer uma das reivindicações 1-9.

12. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga ao TIGIT humano em um epítopo compreendendo os resíduos Q56 e I109 do TIGIT, compreendendo opcionalmente os resíduos Q56, N58 e I109, compreendendo opcionalmente os resíduos Q56, N58, E60, I68 L73, H76 e I109.

13. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga ao TIGIT humano em um epítopo que consiste nos resíduos de TIGIT Q56, N58, E60, I68, L73, H76 e I109.

14. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga ao TIGIT humano no mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 16, HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17, HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18, LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 61, LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62 e LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 63.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG humano, preferencialmente um anticorpo IgG1 humano.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que exibe uma ou mais funções efetoras selecionadas a partir de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e fagocitose mediada por células dependente de anticorpo (ADCP) contra células expressando TIGIT humano na superfície celular.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que destrói seletivamente as células Treg que expressam TIGIT.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que exibe afinidade equivalente para as células Treg que expressam TIGIT e para as células T CD8+ que expressam TIGIT.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que diminui a expressão de TIGIT nas células T CD8 e/ou nas células Treg.

20. Polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados caracterizados pelo fato de que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer reivindicação anterior.

21. Polinucleotídeo isolado que codifica um domínio VH e/ou um domínio VL de um anticorpo anti-TIGIT, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma ou mais sequências selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 241-270, 335-342 e 369-370.

22. Polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados que codificam um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo anti-TIGIT, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado ou combinação de polinucleotídeos isolados compreende SEQ ID NO: 251 e SEQ ID NO: 252.

23. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo ou combinação de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 20, reivindicação 21 ou reivindicação 22, operacionalmente ligado a sequências reguladoras que permitem a expressão do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira ou em um sistema de expressão sem células.

24. Célula hospedeira ou sistema de expressão sem células caracterizado pelo fato de que contém o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 23.

25. Método para produzir um anticorpo recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do sistema de expressão de células hospedeiras ou sem células, de acordo com a reivindicação 24, em condições que permitem a expressão do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e a recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno expresso.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de câncer.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de infecção por CMV.

29. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29,

caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de câncer.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de infecção por CMV.

33. Método de tratamento de câncer em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, ao sujeito, tratando desse modo o câncer.

34. Método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

35. Método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos são selecionados dentre: um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD- L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo angti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

36. Método para promover a atividade de células T caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma população de células T em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19.

37. Método para promover a atividade de células T, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o método promove a atividade das células T αβ.

38. Método para promover a atividade de células T, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o método promove a atividade das células T γδ.

39. Método para promover a atividade de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o método é realizado in vitro.

40. Método para promover a atividade de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o método é realizado in vivo em um sujeito humano.

41. Método para promover a atividade de células T, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano tem câncer.

42. Método para promover a atividade de células T, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o sujeito humano tem uma infecção viral, opcionalmente em que a infecção viral é uma infecção por CMV.

43. Método para promover a atividade de células T, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda colocar população de células T em contato com um ou mais dentre um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

44. Método de tratamento de infecção viral em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, ao sujeito, tratando desse modo a infecção viral.

45. Método de tratamento de infecção viral, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

46. Método de tratamento de infecção viral, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos são selecionados dentre: um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo angti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

47. Método de tratamento de infecção viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é uma infecção por CMV.

48. Combinação caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um ou mais de um agente quimioterapêutico, um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-41BB, um anticorpo anti-OX40, um anticorpo anti-GITR e um anticorpo anti-ICOS.

49. Combinação, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19.

50. Combinação, de acordo com as reivindicações 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-TIGIT ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma combinação de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que: HCDR1 compreende SEQ ID NO: 16 (YTFTSYYMH), HCDR2 compreende SEQ ID NO: 17 (VIGPSGASTSYAQKFQG), HCDR3 compreende SEQ ID NO: 18 (ARDHSDYWSGIMEV), LCDR1 compreende SEQ ID NO: 61 (RASQSVRSSYLA), LCDR2 compreende SEQ ID NO: 62 (GASSRAT), e LCDR3 compreende SEQ ID NO: 63 (QQYFSPPWT).

51. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de câncer ou infecção viral, opcionalmente em que a infecção viral é uma infecção por CMV.

52. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35, 36 e 38-44.

Figura 1 – Sequências de CDR de VH

Anticorpo CDR1 de VH CDR2 de VH CDR3 de VH

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 177/229 1/51

Figura 2 – Sequências de CDR de VL

Anticorpo CDR1 de VL CDR2 de VL CDR3 de VL

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 178/229 2/51

Figura 3 – Sequências de FR de VH

Anticorpo FR1 de VH FR2 de VH FR3 de VH FR4 de VL

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 179/229 3/51

Figura 3 (cont)

Figura 4 – Sequências de FR de VL

Anticorpo FR1 de VL FR2 de VL FR3 de VL FR4 de VL

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 181/229 5/51

Figura 4 (cont)

Figura 5 – sequências de proteínas de domínio variável

Anticorpo Proteína de VH Proteína de VL

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 183/229 7/51

Figura 5 (cont)

Figura 6 – sequências de DNA de domínio variável

Anticorpo DNA de VH DNA de VL

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 186/229 10/51

DNA de VL DNA de VH Figura 6 (cont) Anticorpo

DNA de VL DNA de VH Figura 6 (cont)

Anticorpo

DNA de VL DNA de VH Figura 6 (cont)

Anticorpo

DNA de VL DNA de VH Figura 6 (cont)

Anticorpo

Figura 7 – Competição com ligante de CD155 humano

Conc de mAb (log nM) Conc de mAb (log nM)

Figura 8 – Expressão de TIGIT em diferentes populações imunes de PBMC de doadores saudáveis % de expressão de TIGIT % de expressão de TIGIT

Figura 9 – Ligação a Jurkat-hTIGIT

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM)

Figura 10 – Ligação a células T CD8+ humanas

% de TIGIT+ separadas em CD8+

Conc. de mAb (log nM)

% de TIGIT+ separadas em CD8+ % de TIGIT+ separadas em CD8+

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM) % de TIGIT+ separadas em CD8+

Conc. de mAb (log nM) % de TIGIT+ separadas em diferentes tipos celulares humanos primários

Conc. de mAb (log nM)

Figura 11 – Ligação a células T CD8+ primárias de cynomolgus

% de TIGIT+ separadas em CD69+CD8+

Conc. de mAb (log nM) % de TIGIT+ separadas em CD69+CD8+

% de TIGIT+ separadas em CD69+CD8+

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM) % de TIGIT+ separadas em CD69+CD8+

Conc. de mAb (log nM)

Figura 12 – Efeito de anticorpos anti-TIGIT em um bioensaio CHO-TCR-CD155 e Jurkat-hTIGIT Variação de indução (sobre controle de iso)

Precursor Descendente Controle de isotipo

Variação de indução sobre No Ab Variação de indução sobre No Ab Variação de indução sobre No Ab Variação de indução sobre No Ab

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 197/229 Conc. de mAb (log nM)

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM) 21/51

Variação de indução sobre No Ab Variação de indução sobre No Ab

Conc. de mAb (log nM) Variação de indução sobre No Ab Conc. de mAb (log nM)

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM)

Figura 13 – Efeito de anticorpos anti-TIGIT em um ensaio funcional baseado em célula T CD8 + humana

Controle de isotipo 167nM IFN gama IFN gama

IFN gama

Isotipo de controle Isotipo de controle

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM) IFN gama

IFN gama

Isotipo de controle Isotipo de controle

Conc. de mAb (log nM) Conc. de mAb (log nM)

Isotipo de controle

Conc. de mAb (log nM)

Figura 14 – Efeito de anticorpos anti-TIGIT em um ensaio funcional baseado em TIL humana Produção de hiFN (pg/ml)

Sem estimulação Controle de isotipo

Figura 15 – Caracterização de anticorpo anti-TIGIT substituto de camundongo que demonstra atividade funcional em camundongo

Concentração de mAb (log nM) % de atividade de CTL específico de OVA IFN-gama

Controle de isotipo Controle de isotipo

Figura 16 – Eficácia antitumoral do anticorpo antagonista anti-TIGIT Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³) Tempo (dias) Tempo (dias)

Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Tempo (dias) Tempo (dias) Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³)

Tempo (dias) Tempo (dias) Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Tempo (dias) Tempo (dias)

Figura 17 – Eficácia antitumoral dependente de isotipo de anticorpo antagonista anti-TIGIT

Veículo

Veículo Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³)

Dias depois da inoculação Dias depois da inoculação Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Dias depois da inoculação Dias depois da inoculação

Volume tumoral (mm³) Veículo

Dias depois da inoculação

Veículo

Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Dias depois da inoculação Dias depois da inoculação

Figura 18 – Mecanismo de eficácia antitumoral de anticorpo antagonista anti-TIGIT

Veículo Veículo

IFN-gama

Veículo Veículo IFN-gama

IFN-gama

Veículo Veículo

IFN-gama IFN-gama

Figura 19 – Mecanismo de eficácia antitumoral de anticorpo antagonista anti-TIGIT (análise transcricional) -Log 10(p-valor)

Fold change de log2 Pontuação de célula citotóxica

Pontuação de célula T CD8

Figura 20 – Atividade de ADCC em PBMC de humano saudável Separação em Separação em Separação em CD45RO+CD4+ CD45RO+CD8+ CD25hiCD127loCD4+

Controle de isotipo

% de lise específica (hlgG1) % de lise específica (em células T separadas)

Ab a 66,6nM Ab a 0,66 nM Ab a 0,0066 nM Iso a 66,6nM Iso a 0,666nM Iso a 0,00666nM

Total Memória Total Memória

Figura 21 – Depleção preferencial de células Treg em suspensão tumoral de camundongo

Anticorpo

Ctrl de isotipo de IgG2a % de redução de células TIGIT+

CD4 convencional

Figura 22 conc. de mAb (Log nM) em TIGIT+CD8+ separadas

MFI TIGIT em TIGIT+CD8+ separadas

MFI TIGIT

Figura 23 conc. de mAb (Log nM)

Figura 24 Variação de indução (sobre controle de iso)

conc. de mAb (log nM) (sobre controle de iso) Variação de indução conc. de mAb (Log nM)

Figura 24 (continuação)

IFN-gama hlgG1_Isotipo

Figura 25

31282 a 6,6 nM (em populações imunes separadas)

Rituximab a 6,6 nM % de lises específica

Memória Memória total total

Moléculas/célula de TIGIT % de células positivas de TIGIT Figura 26

Células não-Treg CD3+CD4+

Petição 870200011026, de 23/01/2020, pág. 214/229 Células não-Treg CD3+CD4+

Células Treg Células Treg

Células T CD3+CD8+ Células T CD3+CD8+ 38/51

Células NK Células NK

Células NKT Células NKT

Células não-T/NK Células não-T/NK

Câncer Câncer

Figura 27

Figura 27C

Figura 28

Clone a-TIGIT 31282 a 8nM Clone a-TIGIT 31282 a 0,8nM Clone a-TIGIT 31282 a 0,16nM Clone a-TIGIT 31282 a 0,08nM Sem Ab

Conc. do clone a-TIGIT 32959 (Log nM)

Figura 29 hlgG1 do clone a-TIGIT 31282 hlgG4 do clone a-TIGIT 31282 Concentração de anticorpos, mg/L

Tempo, dias

Figura 30

Todos os eventos Células T CD4+

CD4 não maligno, Vb8- CD4 maligno, Vb8+ Contagem

Figura 31

Vivo Todos os eventos Vivas-mortas

Células B normais CD19+ CD5- B-CLL maligna, CD19+ CD5+ Contagem

Figura 32

Isotipo de hlgG1 Isotipo de hlgG1

Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

dias após a inoculação dias após a inoculação

Isotipo de hlgG1 Isotipo de hlgG1 Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

dias após a inoculação dias após a inoculação Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

dias após a inoculação dias após a inoculação

Figura 33

Volume Tumoral Mediano Volume Tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Volume Tumoral (mm³)

Volume Tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação

Figura 33

Volume Tumoral Mediano Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação

Figura 33

Volume tumoral (mm³) Volume Tumoral Mediano

Dias após a inoculação Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação

Figura 33

Volume Tumoral Mediano Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Volume tumoral (mm³) Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação Volume tumoral (mm³)

Volume tumoral (mm³)

Dias após a inoculação Dias após a inoculação

Figura 34 % Células Vδ2 de TIGIT+

Pos CMV Neg CMV

Sem ativação a-Vd1 + hlgG1 isotipo