TWI812632B - 抗tigit抗體 - Google Patents

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Abstract

提供了抑制TIGIT介導的信號傳導的抗TIGIT抗體及其抗原結合片段，以及包含所述抗體或其抗原結合片段的組合以及使用其的方法。

Description

抗TIGIT抗體
本發明係關於降低TIGIT介導的信號傳導的免疫抑制作用的抗TIGIT抗體，更特別係關於本發明的抗體或抗原結合片段可以藉由阻止T細胞（常規αβ T細胞和非常規γδ T細胞）和NK細胞上的配體結合和/或消耗TIGIT陽性Treg細胞，和/或藉由誘導TIGIT受體的內化來抑制TIGIT介導的免疫抑制。
癌症免疫療法依賴於對免疫系統的調節以提高對腫瘤細胞的識別和反應。這種調節可以藉由多種機制實現，包括活化免疫細胞上存在的共刺激分子或藉由抑制共抑制受體。免疫反應的活化是一種複雜的機制，涉及許多細胞群，如對於啟動抗原特異性反應來說重要的抗原呈遞細胞以及負責破壞腫瘤細胞的效應細胞。調節效應細胞如細胞毒性T細胞的活性的機制很多，並且代表了癌症免疫療法背景下選擇的靶標。
TIGIT（具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體），也稱為WUCAM、VSIG9或Vstm3，是優先在NK、CD8+和CD4+ T細胞以及調節性T細胞（Treg細胞，或簡稱為“Treg”）上表達的共抑制受體。TIGIT是跨膜蛋白，其含有在其細胞內部分中的已知ITIM結構域、跨膜結構域和在該受體的細胞外部分上的免疫球蛋白可變結構域。數種配體被描述為與TIGIT受體結合，其中CD155/PVR顯示出最佳親和力，其次是CD113/PVRL3和CD112/PVRL2（Yu等（2009）Nat. Immunol. 10:48）。也在NK和T細胞上表達的已知共刺激受體DNAM/CD226與TIGIT競爭結合CD155和CD112但親和力較低，這表明嚴格控制這些效應細胞的活化可避免對表達CD155配體的正常細胞的不受控制的細胞毒性。
在腫瘤浸潤淋巴細胞（tumour infiltrating lymphocyte，TIL）上和在疾病環境如HIV感染中，TIGIT的表達增高。與TIGIT陰性對應物相比，TIGIT表達標誌著具有較低效應功能的耗竭T細胞（Kurtulus等（2015）J.Clin.Invest. 276:112；Chew等（2016）Plos Pathogens. 12）。相反地，與TIGIT陰性Treg群體相比，表達TIGIT的Treg細胞顯示出增強的免疫抑制活性（Joller等（2014）Immunity. 40:569）。
如已被證明是免疫治療的相關靶標並且其拮抗性抗體已被批准用於治療人類癌症的另一些在T細胞上表達的共抑制受體（PD1或CTLA4）一樣，拮抗性抗TIGIT抗體的開發可説明開啟免疫系統並且更好地對抗癌細胞。已經提出，單一治療或與a-PD1抗體組合的拮抗性抗TIGIT抗體可以在臨床前模型中實現強的抗腫瘤效力（Johnston等（2014）Cancer Cell 26:1；WO2016/028656；US2016/0176963；US2016/0376365，其全部藉由引用併入本文）。
因此，可抑制TIGIT受體活性的TIGIT特異性拮抗性抗體代表了降低與腫瘤微環境相關的免疫抑制作用並且由此提高對腫瘤細胞的抗腫瘤免疫反應的機會。
本發明提供了可以降低TIGIT介導的信號傳導的免疫抑制作用的抗TIGIT抗體。特別地，本發明的抗體或抗原結合片段可以藉由阻止T細胞（常規αβ T細胞和非常規γδ T細胞）和NK細胞上的配體結合和/或消耗TIGIT陽性Treg細胞，和/或藉由誘導TIGIT受體的內化來抑制TIGIT介導的免疫抑制。
在一個方面，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與人TIGIT結合且包含含有選自圖1所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）和重鏈CDR3（HCDR3）的重鏈可變結構域，並且其還包含含有選自圖2所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3）的輕鏈可變結構域。
在某些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中所述組合選自由來自圖1中各抗體的HCDR與來自圖2中對應抗體的LCDR形成的組合的組。
在某些實施方案中，根據本發明的抗體或抗原結合片段可以包含重鏈可變結構域並且任選地包含輕鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域具有選自以下的氨基酸序列：SEQ ID No: 211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、327、329和331，以及與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；所述輕鏈可變結構域具有選自以下的氨基酸序列：SEQ ID No: 212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、328、330和332的氨基酸序列，以及與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在某些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的組合，其中所述組合選自由來自圖5中各抗體的VH或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列與來自圖5中相同抗體的VL或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列形成的組合的組。
本文提供的最優選抗體和抗原結合片段是基於本文提供的抗體31282的CDR或完全可變結構域的那些。
如本文所證明的，基於抗體31282的這些優選抗TIGIT抗體和抗原結合片段具有特別令人驚訝且有利的特性。這些特性包括：與先前描述的每種受試抗TIGIT抗體相比，對在CD8 T細胞（來自健康供體或來自癌症患者）上表達的TIGIT具有更高的親和力；與先前描述的每種受試抗TIGIT抗體相比，與CD155/PVR競爭的IC50 更佳；與先前描述的每種受試抗TIGIT抗體相比，在T細胞活化測定中EC50 更佳；以及強力地提高來自癌症患者周邊血液的T細胞中並且重要的是腫瘤浸潤淋巴細胞中的活性。此外，本文令人驚訝地顯示，根據本發明的抗體和抗原結合片段，尤其是基於抗體31282的那些，優先消耗Treg細胞。也就是說，與常規CD4和CD8T細胞相比，暴露於所提供的抗TIGIT抗體的表達TIGIT的Treg細胞經歷更大比例的裂解。這是令人驚訝的，因為常規CD4和CD8 T細胞也表達TIGIT，但不會在與所述抗體接觸時經歷同樣程度的細胞裂解。還令人驚訝地顯示，根據本發明的抗體和抗原結合片段，尤其是基於抗體31282的那些，不僅促進常規T細胞促炎活性，而且還提高非常規γδ T細胞的活性。
因此，在某些優選的實施方案中，本文提供了包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗體或抗原結合片段，其中： HCDR1包含SEQ ID NO: 16（YTFTSYYMH）或由其組成， HCDR2包含SEQ ID NO: 17（VIGPSGASTSYAQKFQG）或由其組成， HCDR3包含SEQ ID NO: 18（ARDHSDYWSGIMEV）或由其組成， LCDR1包含SEQ ID NO: 61（RASQSVRSSYLA）或由其組成， LCDR2包含SEQ ID NO: 62（GASSRAT）或由其組成，並且 LCDR3包含SEQ ID NO: 63（QQYFSPPWT）或由其組成。
在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域包含以下或由以下組成：根據SEQ ID NO: 221的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；並且輕鏈可變結構域包含以下或由以下組成：根據SEQ ID NO: 222的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在某些優選的實施方案中，抗TIGIT抗體是本文所述的抗體31282。
在另一個方面，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與根據本發明第一方面的抗體（例如本文所例示的抗體）交叉競爭結合人TIGIT。
在另一個方面，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與根據本發明第一方面的抗體（例如本文所例示的抗體）結合相同的表位。
在另一個方面，本發明提供了抗體或其抗原結合片段，其結合包含TIGIT殘基Q56和I109，任選地包含殘基Q56、N58和I109的人TIGIT表位。在一些優選的實施方案中，提供了抗體或其抗原結合片段，其結合包含TIGIT殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109的人TIGIT表位。
在某些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段結合由TIGIT殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109組成的人TIGIT表位。
在另一個方面，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與人TIGIT結合並且不與CD155競爭結合TIGIT。
在某些實施方案中，結合人TIGIT並且不與CD155競爭結合TIGIT的抗體或抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 280或由其組成，HCDR2包含SEQ ID NO: 281或由其組成，HCDR3包含SEQ ID NO: 282或由其組成，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 292或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO: 293或由其組成，且LCDR3包含SEQ ID NO: 294或由其組成。
在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 333所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；並且輕鏈可變結構域包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 334所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在某些優選的實施方案中，與人TIGIT結合且不與CD155競爭結合TIGIT的抗體包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 353，HCDR2包含SEQ ID NO: 354，HCDR3包含SEQ ID NO: 355，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 356，LCDR2包含SEQ ID NO: 357，且LCDR3包含SEQ ID NO: 358。
在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO: 367所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，並且輕鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO: 368所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在另一個方面，本發明提供了分離的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其優先消耗表達TIGIT的Treg細胞，任選地其中所述抗體或抗原結合片段是根據本發明第一方面的抗體或抗原結合片段，例如本文所例示的抗體。
在另一個方面，本發明提供了根據本發明其他方面的抗體（例如本文所例示的抗體）的親和力變體（affinity variant）。
在另一個方面，本發明提供了分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合，其編碼根據本發明的任何其他方面的抗體或抗原結合片段，例如本文所例示的抗體。
在另一個方面，本發明提供了編碼抗TIGIT抗體的VH和/或VL結構域的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自SEQ ID No: 241-270、335-342和369-370的一個或更多個序列。
在另一個方面，本發明提供了表達載體，其包含與調節序列有效連接的根據本發明的多核苷酸或多核苷酸的組合，所述調節序列允許抗原結合多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表達。
在另一個方面，本發明提供了包含根據本發明的表達載體的宿主細胞或無細胞表達系統。
在另一個方面，本發明提供了產生重組抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在允許表達所述抗體或抗原結合片段的條件下培養根據本發明的宿主細胞或無細胞表達系統，以及回收所表達的抗體或抗原結合片段。
在另一個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含根據本發明的抗體或抗原結合片段（例如本文所例示的抗體）和至少一種可藥用載體或賦形劑。
在另一個方面，本發明提供了根據本發明的抗體或抗原結合片段或者根據本發明的藥物組合物，其用於治療。
在另一個方面，本發明提供了根據本發明的抗體或抗原結合片段（例如本文所例示的抗體）或者根據本發明的藥物組合物，其用於治療癌症的方法。
在另一個方面，本發明提供了根據本發明的抗體或抗原結合片段（例如本文所例示的抗體）或者根據本發明的藥物組合物，其用於治療病毒感染、任選地CMV感染的方法。
在另一個方面，本發明提供了在物件中治療癌症的方法，其包括向所述物件施用有效量的根據本發明的抗體或抗原結合片段（例如本文所例示的抗體）或者根據本發明的藥物組合物，從而治療癌症。
在另一個方面，提供了在物件中治療病毒感染的方法，其包括向所述物件施用有效量的根據本發明的抗體或抗原結合片段或者根據本發明的藥物組合物，從而治療病毒感染。在一些優選的實施方案中，所述病毒感染是CMV感染。
在另一個方面，提供了促進T細胞活性的方法，其包括使T細胞群與根據本發明的抗體或抗原結合片段接觸。在某些實施方案中，所述方法促進αβ T細胞活性。在某些實施方案中，所述方法促進γδ T細胞活性。 在某些實施方案中，所述方法在體外進行。在某些實施方案中，所述方法在體內進行，例如在人物件中進行。
在某些實施方案中，提供了根據本發明的方法，或者用於根據本發明的方法的抗體或抗原結合片段或者藥物組合物，其中所述方法還包括施用一種或更多種另外的治療劑。在某些優選的實施方案中，一種或更多種另外的藥劑選自：化學治療劑、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體。
在另一個方面，提供了組合，其包含抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，以及化學治療劑、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體中的一種或更多種。在另一個方面，提供了根據本發明的組合，其用於治療。在另一個方面，提供了根據本發明的組合，其用於治療癌症的方法或用於治療病毒感染的方法。在另一個方面，提供了根據本發明的組合，其用於根據本發明的方法。在一個優選的實施方案中，抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是本發明的抗體或其抗原結合片段。
在所有相關方面，優選地任何待治療的物件是人物件。在所有相關方面，優選地與根據本發明的抗體接觸的細胞（例如T細胞）是人細胞（例如人T細胞）。
除非在技術上不相容或指出相反，否則所描述的任何優選實施方案均可以任選地與所有其他優選實施方案中的一個或更多個組合使用。
如本文所使用的，術語“免疫球蛋白”包括具有兩條重鏈和兩條輕鏈的組合的多肽，無論其是否具有任何相關的特異性免疫反應性。“抗體”是指對目的抗原（例如TIGIT）具有顯著已知的特異性免疫反應活性的這樣的組合體。術語“TIGIT抗體”或“抗TIGIT抗體”在本文中用於指對TIGIT蛋白展現出免疫學特異性的抗體。抗體和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，在它們之間具有或不具有鏈間共價連接。脊椎動物系統中的基本免疫球蛋白結構已被相對充分地瞭解。
通用術語“免疫球蛋白”包括可以在生物化學上區分的五種不同類別的抗體。儘管所有五類抗體都在本發明的範圍內，但以下討論通常針對IgG類的免疫球蛋白分子。關於IgG，免疫球蛋白包含兩條相同的分子量為約23,000道爾頓的輕多肽鏈和兩條相同的分子量為53,000至70,000的重鏈。四條鏈在“Y”構型中藉由二硫鍵連接，其中輕鏈從“Y”的口起始並繼續藉由可變區而括住重鏈。
抗體的輕鏈被分類為kappa或lambda（k，l）。每個重鏈類別可以與k或l輕鏈結合。通常，輕鏈和重鏈彼此共價結合，並且當藉由B細胞或經遺傳改造的宿主細胞產生免疫球蛋白時，兩個重鏈的“尾”部藉由共價二硫鍵或非共價鍵彼此結合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構型的叉形末端的N末端延伸至每條鏈底部的C末端。本領域具有通常知識者將理解，重鏈被分類為gamma、mu、alpha、delta或epsilon（g、m、a、d、e），其中還有一些亞類（例如g1-g4）。該鏈的性質將抗體的“類別”分別確定為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亞類（同種型）如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已經被充分表徵並且已知賦予功能特化。鑒於本公開內容，本領域具有通常知識者容易辨別這些類別和同種型中每一種的經修飾形式，並且其相應地在本發明的範圍內。
如上所述，抗體的可變區允許抗體選擇性地識別並且特異性地結合抗原上的表位。也就是說，抗體的VL結構域和VH結構域組合形成限定三維抗原結合位點的可變區。該四級抗體結構形成了存在於Y的每個臂末端的抗原結合位點。更具體地，抗原結合位點由VH和VL鏈中每一個上的三個互補性決定區（CDR）限定。
如本文所使用的，術語“TIGIT蛋白”或“TIGIT抗原”或“TIGIT”可互換使用，並且是指結合脊髓灰質炎病毒受體（PVR-也稱為CD155）的人T細胞免疫受體（GenBank登錄號：NM_173799）。TIGIT也稱為VSIG9、VSTM3或WUCAM。對TIGIT的提及包括在人宿主中和/或在人培養細胞系表面上天然表達的天然人TIGIT蛋白，以及其重組形式和片段，還有天然存在的突變體形式。
如本文所使用的，術語“結合位點”包含負責選擇性結合目的靶抗原（例如TIGIT）的多肽區域。結合結構域包含至少一個結合位點。例示性結合結構域包括抗體可變結構域。本發明的抗體分子可以包含單個結合位點或多個（例如，兩個、三個或四個）結合位點。
如本文所使用的術語“來源於”指定蛋白質（例如TIGIT抗體或其抗原結合片段）是指多肽的來源。在一個實施方案中，來源於特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或與其相關的序列。在一個實施方案中，來源於特定起始多肽的氨基酸序列不是連續的。例如，在一個實施方案中，一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR來源於起始抗體。在一個實施方案中，來源於特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有與起始序列或其部分的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或者對於本領域具有通常知識者而言可以其他方式識別為其來源於起始序列的氨基酸序列，其中所述部分由至少3至5個氨基酸、至少5至10個氨基酸、至少10至20個氨基酸、至少20至30個氨基酸或至少30至50個氨基酸組成。在一個實施方案中，改變來源於起始抗體的一個或更多個CDR序列以產生變體CDR序列（例如，親和力變體），其中變體CDR序列維持TIGIT結合活性。
如本文所使用的，“保守氨基酸替換”是其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基取代的替換。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族，包括鹼性側鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β-支化側鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳族側鏈（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基可以用來自同一側鏈家族的另一氨基酸殘基取代。在另一個實施方案中，一串氨基酸可以用側鏈家族成員的在順序和/或組成方面不同的結構相似串取代。
如本文所使用的，術語“重鏈部分”包括來源於免疫球蛋白重鏈的恆定結構域的氨基酸序列。包含重鏈部分的多肽包含以下中的至少一個：CH1結構域、鉸鏈（例如，上、中和/或下鉸鏈區）結構域、CH2結構域、CH3結構域，或者其變體或片段。在一個實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段可以包含免疫球蛋白重鏈的Fc部分（例如，鉸鏈部分、CH2結構域和CH3結構域）。在另一個實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段可缺少恆定結構域的至少一部分（例如，CH2結構域的全部或部分）。在某些實施方案中，至少一個並且優選全部的恆定結構域來源於人免疫球蛋白重鏈。例如，在一個優選實施方案中，重鏈部分包含完全人鉸鏈結構域。在另一些優選的實施方案中，重鏈部分包含完全人Fc部分（例如，來自人免疫球蛋白的鉸鏈、CH2和CH3結構域序列）。
在某些實施方案中，重鏈部分的組成恆定結構域來自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可以包含來源於IgG1分子的CH2結構域和來源於IgG3或IgG4分子的鉸鏈區。在另一些實施方案中，恆定結構域是嵌合結構域，其包含不同免疫球蛋白分子的部分。例如，鉸鏈可以包含來自IgG1分子的第一部分和來自IgG3或IgG4分子的第二部分。如上所述，本領域具有通常知識者將理解，重鏈部分的恆定結構域可以被修飾，使得其與天然存在的（野生型）免疫球蛋白分子在氨基酸序列方面不同。也就是說，本文公開的本發明多肽可以包含對一個或更多個重鏈恆定結構域（CH1、鉸鏈、CH2或CH3）和/或輕鏈恆定區結構域（CL）的改變或修飾。例示性修飾包括一個或更多個結構域中一個或更多個氨基酸的添加、缺失或替換。
如本文所使用的，術語“可變區”和“可變結構域”可互換使用並且旨在具有等同含義。術語“可變”是指以下事實：可變結構域VH和VL的某些部分在抗體之間在序列上廣泛不同，並且用於每種特定抗體對其靶抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變結構域中。其集中在VL結構域和VH結構域中每一個中形成抗原結合位點的一部分的稱為“超變環”的三個區段中。Vλ 輕鏈結構域的第一、第二和第三超變環在本文中稱為L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，並且可以定義為包含VL結構域中的殘基24-33（L1(λ)，由9、10或11個氨基酸殘基組成）、49-53（L2(λ)，由3個殘基組成）和90-96（L3(λ)，由5個殘基組成）（Morea等，Methods 20，267-279，2000）。Vκ 輕鏈結構域的第一、第二和第三超變環在本文中稱為L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，並且可以定義為包含VL結構域中的殘基25-33（L1(κ)，由6、7、8、11、12或13個殘基組成）、49-53（L2(κ)，由3個殘基組成）和90-97（L3(κ)，由6個殘基組成）（Morea等，Methods 20，267-279，2000）。VH結構域的第一、第二和第三超變環在本文中稱為H1、H2和H3，並且可以定義為包含VH結構域中的殘基25-33（H1，由7、8或9個殘基組成）、52-56（H2，由3或4個殘基組成）和91-105（H3，長度高度可變）（Morea等，Methods 20，267-279，2000）。
除非另有說明，否則術語L1、L2和L3分別指VL結構域的第一、第二和第三超變環，並且涵蓋從Vκ 和Vλ 同種型獲得的超變環。術語H1、H2和H3分別指VH結構域的第一、第二和第三超變環，並且涵蓋從任何已知的重鏈同種型獲得的超變環，包括γ、ε、δ、α或μ。
超變環L1、L2、L3、H1、H2和H3可各自包含“互補性決定區”或“CDR”的一部分，如下文所限定。術語“超變環”和“互補性決定區”不是嚴格同義的，因為超變環（HV）是基於結構定義的，而互補性決定區（CDR）是基於序列變異性定義的（Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991）並且HV和CDR的限制在一些VH和VL結構域中可能是不同的。 VL和VH結構域的CDR通常可以定義為包含以下氨基酸：輕鏈可變結構域中的殘基24-34（LCDR1）、50-56（LCDR2）和89-97（LCDR3），以及重鏈可變結構域中的殘基31-35或31-35b（HCDR1）、50-65（HCDR2）和95-102（HCDR3）；（Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991）。因此，HV可以包含在對應的CDR內，並且本文對VH和VL結構域的“超變環”的提及應被解釋為也涵蓋對應的CDR，反之亦然，除非另有說明。
可變結構域的更高度保守部分稱為框架區（FR），如下文所定義。天然重鏈和輕鏈各自的可變結構域包含四個FR（分別為FR1、FR2、FR3和FR4），主要採用β折疊構型，其藉由三個超變環連接。每條鏈中的超變環藉由FR緊密保持在一起，並且與來自另一條鏈的超變環一起有助於形成抗體的抗原結合位點。抗體的結構分析揭示了序列與由互補性決定區形成的結合位點的形狀之間的關係（Chothia等，J. Mol. Biol. 227，799-817，1992；Tramontano等，J. Mol. Biol，215，175-182，1990）。儘管其具有高序列變異性，但六個環中的五個僅採用一小部分（repertoire）主鏈構象，稱為“規範結構”。這些構象首先由環的長度決定，其次由環中和框架區中某些位置的關鍵殘基的存在決定，其藉由其堆積、氫鍵鍵合或採取不尋常主鏈構象的能力來決定構象。
如本文所使用的，術語“CDR”或“互補性決定區”意指在重鏈和輕鏈多肽二者的可變區內發現的非連續抗原結合位點。這些特定區域已由以下文獻描述：Kabat等，J. Biol. Chem. 252，6609-6616，1977；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991；Chothia等，J. Mol. Biol. 196，901-917，1987；以及MacCallum等，J. Mol. Biol. 262，732-745，1996，其中定義包括當彼此比較時氨基酸殘基的重疊或子集。涵蓋如上文引用的每篇參考文獻所定義的CDR的氨基酸殘基被示出用於比較。優選地，術語“CDR”是Kabat基於序列比較所定義的CDR。表 1:CDR 定義 1 殘基編號根據Kabat等（同上）的命名法2 殘基編號根據Chothia等（同上）的命名法3 殘基編號根據MacCallum等（同上）的命名法
如本文所使用的，術語“框架區”或“FR區”包括作為可變區的一部分但不是CDR的一部分的氨基酸殘基（例如，使用CDR的Kabat定義）。因此，可變區框架的長度為約100至120個氨基酸，但僅包括在CDR之外的那些氨基酸。對於重鏈可變結構域的具體實例和由Kabat等定義的CDR，框架區1對應於涵蓋氨基酸1-30的可變區結構域；框架區2對應於涵蓋氨基酸36-49的可變區結構域；框架區3對應於涵蓋氨基酸66-94的可變區結構域；並且框架區4對應於從氨基酸103到可變區末端的可變區結構域。輕鏈的框架區類似地由每一個輕鏈可變區CDR分開。類似地，使用Chothia等或McCallum等的CDR定義，框架區邊界由如上所述的相應CDR末端分開。在一些優選的實施方案中，CDR如Kabat所定義。
在天然存在的抗體中，存在於每個單體抗體上的六個CDR是短的、非連續的氨基酸序列，其在抗體在水性環境中呈現其三維構型時特別地定位以形成抗原結合位點。重鏈和輕鏈可變結構域的其餘部分在氨基酸序列中顯示出較小的分子間變異性，並且被稱為框架區。框架區主要採用β折疊構型，並且CDR形成連接β折疊結構的環且在一些情況下形成β折疊結構的一部分。因此，這些框架區起到形成支架的作用，該支架藉由鏈間非共價相互作用而將六個CDR定位在正確的方向上。由定位的CDR形成的抗原結合位點限定了與免疫反應性抗原上表位互補的表面。該互補表面促進抗體與免疫反應性抗原表位的非共價結合。本領域具有通常知識者可以容易地識別CDR的位置。
如本文所使用的，術語“片段”是指抗體或抗體鏈的區段或部分，其包含的氨基酸殘基少於完整或完全抗體或抗體鏈。術語“抗原結合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，其結合抗原或與完整抗體（即，與其所來源於的完整抗體）競爭與抗原結合（即，特異性結合TIGIT）。如本文所使用的，術語抗體分子的“片段”包括抗體的抗原結合片段，例如，抗體輕鏈可變結構域（VL）、抗體重鏈可變結構域（VH）、單鏈抗體（scFv）、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段以及單結構域抗體片段（DAb）。片段可以例如藉由完整或完全抗體或抗體鏈的化學或酶促處理或者藉由重組手段獲得。
如本文所使用的，術語“效價”是指多肽中潛在靶標結合位元點的數目。每個靶標結合位點特異性結合一個靶分子或靶分子上的特定位點。當多肽包含多於一個靶標結合位點時，每個靶標結合位點可以特異性結合相同或不同的分子（例如，可以結合不同的配體或不同的抗原，或同一抗原上的不同表位）。本發明的結合分子具有至少一個對TIGIT特異性的結合位點。
如本文所使用的，術語“特異性”是指與給定靶標（例如TIGIT）結合（例如，免疫反應）的能力。多肽可以是單特異性的並且含有一個或更多個特異性結合靶標的結合位點，或者多肽可以是多特異性的並且含有兩個或更多個特異性結合相同或不同靶標的結合位點。在一個實施方案中，本發明的抗體對多於一種靶標具有特異性。例如，在一個實施方案中，本發明的多特異性結合分子結合TIGIT和第二靶標分子。在這種情況下，第二靶標分子是除TIGIT之外的分子。
如本文所使用的，關於多肽，術語“合成的”包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如，非天然存在的多肽，其為天然存在的多肽的經修飾形式（例如，包含例如添加、替換或缺失的突變）或包含以線性氨基酸序列連接於在性質上不是與其天然連接的第二氨基酸序列（其可以是或可以不是天然存在的）的第一氨基酸序列（其可以是或可以不是天然存在的）。
如本文所使用的，術語“改造”包括藉由合成手段（例如藉由重組技術、體外肽合成、藉由肽的酶促或化學偶聯或者這些技術的一些組合）操作核酸或多肽分子。優選地，已經改造了本發明的抗體以改善一種或更多種特性，例如抗原結合、穩定性/半衰期或效應功能。
如本文所使用的，術語“經修飾的抗體”包括合成形式的抗體，其被改變使得其不是天然存在的，例如，包含至少兩個重鏈部分但不包含兩個完全重鏈的抗體（例如，缺失結構域的抗體或微抗體（minibody））；多特異性形式的抗體（例如雙特異性、三特異性等），其被改變以結合兩種或更多種不同抗原或單抗原上的不同表位；連接於scFv分子的重鏈分子，等等。scFv分子是本領域已知的並且描述於例如美國專利5,892,019中。另外，術語“經修飾的抗體”包括多價形式的抗體（例如，三價、四價等，與同一抗原的三個或更多個拷貝結合的抗體）。在另一個實施方案中，本發明的經修飾的抗體是融合蛋白，其包含至少一個缺少CH2結構域的重鏈部分，並且包含含有受體配體對中一個成員的結合部分的多肽結合結構域。
術語“經修飾的抗體”在本文中也可用於指本發明的TIGIT抗體的氨基酸序列變體。本領域具有通常知識者將理解，可以修飾本發明的TIGIT抗體以產生變體TIGIT抗體，其與其所來源於的TIGIT抗體相比在氨基酸序列方面不同。例如，可以進行導致“非必需”氨基酸殘基的保守替換或改變的核苷酸或氨基酸替換（例如，在CDR中和/或框架殘基中）。氨基酸替換可包括用天然存在的或非天然的氨基酸取代一個或更多個氨基酸。
“抗體片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變結構域。抗原結合抗體片段的一些實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、雙特異性Fab和Fv片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、單鏈可變片段（scFv）和由抗體片段形成的多特異性抗體（參見Holliger和Hudson，Nature Biotechnol. 23:1126-1136，2005，其內容藉由引用併入本文）。
如本文所使用的，術語“親和力變體”是指與本發明的參照TIGIT抗體相比在氨基酸序列中展現出一個或更多個變化的變體抗體，其中所述親和力變體與參照抗體相比展現出對TIGIT的改變的親和力。優選地，與參照TIGIT抗體相比，親和力變體對TIGIT展現出改善的親和力。這種改善可以表觀為對TIGIT的KD更低，或對TIGIT的解離速度更慢。與參照TIGIT抗體相比，親和力變體通常展現出CDR的氨基酸序列中的一個或更多個變化。此類替換可以導致用不同的氨基酸殘基取代CDR中給定位置處存在的原始氨基酸，所述不同氨基酸殘基可以是天然存在的氨基酸殘基或非天然存在的氨基酸殘基。氨基酸替換可以是保守的或非保守的。
如本文所使用的，術語“親和力”或“結合親和力”應基於抗體結合背景下本領域的通常含義來理解，並且反映抗原與抗體或其抗原結合片段上的結合位點之間結合的強度和/或穩定性。
本文提供的抗TIGIT抗體的特徵在於以高親和力結合人TIGIT。可以使用本領域具有通常知識者已知的標準技術評估對TIGIT的結合親和力。
結合親和力也可以表示為特定抗體的解離常數或KD 。KD 值越小，抗體與其靶抗原之間的結合相互作用越強。在一個實施方案中，可以藉由使用本領域已知的方法評估包含確定的VH/VL配對的Fab克隆的結合親和力，例如藉由ForteBio™系統、藉由MSD-溶液平衡滴定（SET）或藉由表面等離子體共振，例如使用如所附實施例中所述的Biacore™系統。根據本發明的抗體的Fab片段對TIGIT通常展現出藉由ForteBio™測量的1×10-10 至5×10-8 M、任選地7×10-10 至4×10-8 M的KD 。在該範圍內的KD 可以作為Fab和對應的二價mAb對hTIGIT表現出高親和力結合的指示。包含兩個對hTIGIT（單獨地）展現出在所述範圍內的KD 的Fab的二價mAb也被認為表現為以高親和力結合hTIGIT。在1×10-11 至5×10-9 、任選地2×10-11 至1×10-9 的範圍內的MSD KD 可作為與hTIGIT以高親和力結合的指示。根據本發明的抗體的Fab片段對TIGIT通常展現出藉由Biacore™測量的1×10-10 M至1×10-9 M、任選地1×10-10 至7×1010 、任選地2×10-10 至7×10-10 M的KD 。在該範圍內的KD 可作為Fab和對應的二價mAb表現出與hTIGIT以高親和力結合的指示。
還可以使用如所附實施例中所述的基於細胞的系統評估對人TIGIT的結合親和力，其中測試mAb與哺乳動物細胞（表達TIGIT的細胞系或離體細胞）的結合，例如使用ELISA或流式細胞術。藉由流式細胞術（例如FACS）分析（例如實施例10中所述），可以指示對TIGIT的高親和力為例如不超過0.5 nM的EC50 。在某些實施方案中，本發明的抗體展現出不超過0.5 nM、任選不超過0.2 nM的細胞結合EC50 。表示為EC50 的基於細胞的親和力確定優選使用表達hTIGIT的Jurkat細胞或來自人周邊血液單個核細胞（PBMC）的原代CD8 T細胞確定。
如本文所使用的“Treg細胞”或簡稱為“Treg”是指調節性CD4+ T細胞——即，降低常規T細胞（CD8或CD4 T細胞）的效應功能的T細胞。可以根據本領域已知的方法鑒定Treg，例如使用流式細胞術來鑒定表達高水準CD25和低水準或不存在CD127的CD4細胞。
如上所總結的，本發明至少部分地涉及與TIGIT結合的抗體及其抗原結合片段。現在將更詳細地描述根據本發明的TIGIT抗體和抗體片段的特性和特徵。抗 TIGIT 抗體
在一個方面，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與人TIGIT結合，並且包含含有選自圖1所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）和重鏈CDR3（HCDR3）的重鏈可變結構域，並且其還包含含有選自圖2所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3）的輕鏈可變結構域。即，本發明提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與人TIGIT結合，並且包含含有重鏈CDR1（HCDR1）、重鏈CDR2（HCDR2）和重鏈CDR3（HCDR3）的重鏈可變結構域，其中： (i) HCDR1選自SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、271、274和277； (ii) HCDR2選自SEQ ID No: 2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、272、275和278； (iii) HCDR3選自SEQ ID No: 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、273、276和279； 並且其還包含含有輕鏈CDR1（LCDR1）、輕鏈CDR2（LCDR2）和輕鏈CDR3（LCDR3）的輕鏈可變結構域，其中： (iv) LCDR1選自SEQ ID No: 46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、283、286和289； (v) LCDR2選自SEQ ID No: 47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、284、287和290；並且 (vi) LCDR3選自SEQ ID No: 48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、285、288和291。
包含與VL結構域配對以形成抗原（人TIGIT）結合位元點的VH結構域的任何給定抗TIGIT抗體或其抗原結合片段將包含以下6個CDR的組合：可變重鏈CDR3（HCDR3）、可變重鏈CDR2（HCDR2）、可變重鏈CDR1（HCDR1）、可變輕鏈CDR3（LCDR3）、可變輕鏈CDR2（LCDR2）和可變輕鏈CDR1（LCDR1）。儘管選自上文列出的CDR序列組的6個CDR的許多不同組合是允許的並且在本發明的範圍內，然而6個CDR的某些組合是特別優選的；這些即為在表現出以高親和力結合人TIGIT的單個mAb內的“天然”組合。在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中所述組合選自由來自圖1中各抗體的HCDR與來自圖2中對應抗體的LCDR形成的組合的組。
即，在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中所述組合選自： (i)包含SEQ ID NO: 1的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的HCDR2、包含SEQ ID NO: 3的HCDR3、包含SEQ ID NO: 46的LCDR1、包含SEQ ID NO: 47的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 48的LCDR3； (ii)包含SEQ ID NO: 4的HCDR1、包含SEQ ID NO: 5的HCDR2、包含SEQ ID NO: 6的HCDR3、包含SEQ ID NO: 49的LCDR1、包含SEQ ID NO: 50的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 51的LCDR3； (iii)包含SEQ ID NO: 7的HCDR1、包含SEQ ID NO: 8的HCDR2、包含SEQ ID NO: 9的HCDR3、包含SEQ ID NO: 52的LCDR1、包含SEQ ID NO: 53的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 54的LCDR3； (iv)包含SEQ ID NO: 10的HCDR1、包含SEQ ID NO: 11的HCDR2、包含SEQ ID NO: 12的HCDR3、包含SEQ ID NO: 55的LCDR1、包含SEQ ID NO: 56的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 57的LCDR3； (v)包含SEQ ID NO: 13的HCDR1、包含SEQ ID NO: 14的HCDR2、包含SEQ ID NO: 15的HCDR3、包含SEQ ID NO: 58的LCDR1、包含SEQ ID NO: 59的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 60的LCDR3； (vi)包含SEQ ID NO: 16的HCDR1、包含SEQ ID NO: 17的HCDR2、包含SEQ ID NO: 18的HCDR3、包含SEQ ID NO: 61的LCDR1、包含SEQ ID NO: 62的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 63的LCDR3； (vii)包含SEQ ID NO: 19的HCDR1、包含SEQ ID NO: 20的HCDR2、包含SEQ ID NO: 21的HCDR3、包含SEQ ID NO: 64的LCDR1、包含SEQ ID NO: 65的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 66的LCDR3； (viii)包含SEQ ID NO: 22的HCDR1、包含SEQ ID NO: 23的HCDR2、包含SEQ ID NO: 24的HCDR3、包含SEQ ID NO: 67的LCDR1、包含SEQ ID NO: 68的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 69的LCDR3； (ix)包含SEQ ID NO: 25的HCDR1、包含SEQ ID NO: 26的HCDR2、包含SEQ ID NO: 27的HCDR3、包含SEQ ID NO: 70的LCDR1、包含SEQ ID NO: 71的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 72的LCDR3； (x)包含SEQ ID NO: 28的HCDR1、包含SEQ ID NO: 29的HCDR2、包含SEQ ID NO: 30的HCDR3、包含SEQ ID NO: 73的LCDR1、包含SEQ ID NO: 74的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 75的LCDR3； (xi)包含SEQ ID NO: 31的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的HCDR2、包含SEQ ID NO: 33的HCDR3、包含SEQ ID NO: 76的LCDR1、包含SEQ ID NO: 77的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 78的LCDR3； (xii)包含SEQ ID NO: 34的HCDR1、包含SEQ ID NO: 35的HCDR2、包含SEQ ID NO: 36的HCDR3、包含SEQ ID NO: 79的LCDR1、包含SEQ ID NO: 80的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 81的LCDR3； (xiii)包含SEQ ID NO: 37的HCDR1、包含SEQ ID NO: 38的HCDR2、包含SEQ ID NO: 39的HCDR3、包含SEQ ID NO: 82的LCDR1、包含SEQ ID NO: 83的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 84的LCDR3； (xiv)包含SEQ ID NO: 40的HCDR1、包含SEQ ID NO: 41的HCDR2、包含SEQ ID NO: 42的HCDR3、包含SEQ ID NO: 85的LCDR1、包含SEQ ID NO: 86的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 87的LCDR3； (xv)包含SEQ ID NO: 43的HCDR1、包含SEQ ID NO: 44的HCDR2、包含SEQ ID NO: 45的HCDR3、包含SEQ ID NO: 88的LCDR1、包含SEQ ID NO: 89的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 90的LCDR3； (xvi)包含SEQ ID NO: 271的HCDR1、包含SEQ ID NO: 272的HCDR2、包含SEQ ID NO: 273的HCDR3、包含SEQ ID NO: 283的LCDR1、包含SEQ ID NO: 284的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 285的LCDR3； (xvii)包含SEQ ID NO: 274的HCDR1、包含SEQ ID NO: 275的HCDR2、包含SEQ ID NO: 276的HCDR3、包含SEQ ID NO: 286的LCDR1、包含SEQ ID NO: 287的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 288的LCDR3；和 (xviii)包含SEQ ID NO: 277的HCDR1、包含SEQ ID NO: 278的HCDR2、包含SEQ ID NO: 279的HCDR3、包含SEQ ID NO: 289的LCDR1、包含SEQ ID NO: 290的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 291的LCDR3。
在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變結構域並且任選地包含輕鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域具有選自以下的氨基酸序列：SEQ ID No: 211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、327、329和331，以及與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列；所述輕鏈可變結構域具有選自以下的氨基酸序列：SEQ ID No: 212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、328、330和332的氨基酸序列，以及與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
儘管從上面列出的VH和VL結構域序列組中選擇的所有可能的VH結構域和VL結構域的配對都是允許的並且在本發明的範圍內，然而特別優選某些VH和VL組合；這些即為在表現出以高親和力結合人TIGIT的單個mAb內的“天然”組合。
在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的組合，其中所述組合選自由來自圖5中各抗體的VH或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列與來自圖5中相同抗體的VL或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列形成的組合的組。在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的組合，其中所述組合選自： (i)包含SEQ ID NO: 211的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 212的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (ii)包含SEQ ID NO: 213的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 214的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (iii)包含SEQ ID NO: 215的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 216的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (iv)包含SEQ ID NO: 217的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 218的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (v)包含SEQ ID NO: 219的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 220的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (vi)包含SEQ ID NO: 221的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 222的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (vii)包含SEQ ID NO: 223的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 224的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (viii)包含SEQ ID NO: 225的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 226的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (ix)包含SEQ ID NO: 227的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 228的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (x)包含SEQ ID NO: 229的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 230的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xi)包含SEQ ID NO: 231的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 232的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xii)包含SEQ ID NO: 233的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 234的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xiii)包含SEQ ID NO: 235的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 236的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xiv)包含SEQ ID NO: 237的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 238的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xv)包含SEQ ID NO: 239的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 240的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xvi)包含SEQ ID NO: 327的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 328的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的輕鏈可變結構域； (xvii)包含SEQ ID NO: 329的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 330的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的輕鏈可變結構域；和 (xviii)包含SEQ ID NO: 331的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含SEQ ID NO: 332的氨基酸序列或與其同一性為至少90%的氨基酸序列的輕鏈可變結構域。
對於上面列出的特定VH/VL組合中的每一種，將具有與所述VH結構域序列同一性為至少90%、92%、95%、97%或99%的氨基酸序列的VH結構域與具有與所述VL結構域序列同一性為至少90%、92%、95%、97%或99%的氨基酸序列的VL結構域進行組合也是允許的並且在本發明的範圍內。儘管如此，其中VH結構域的氨基酸序列與給定的參照VH序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與參照序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同的重鏈CDR，同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。同樣地，儘管如此，其中VL結構域的氨基酸序列與給定的參照序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與參照序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同的輕鏈CDR，同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。
在前一段落和本文其他部分，抗體/抗原結合片段的結構基於與所述參照序列（與給定的SEQ ID NO）的%序列同一性來限定。在這種情況下，兩個氨基酸序列之間的%序列同一性可以藉由比較以最佳方式排列的這兩個序列而確定，並且其中待比較的氨基酸序列可以相對於參照序列包含添加或缺失以用於這兩個序列之間的最佳排列。如下計算同一性百分比：確定兩個序列之間氨基酸殘基相同的相同位置的數目，將該相同位置的數目除以比較視窗中的位置總數並將得到的結果乘以100以獲得這兩個序列之間的同一性百分比。通常，比較窗口對應於所比較序列的全長。例如，可以使用BLAST程式“BLAST 2 sequences”（Tatusova等，"Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"，FEMS Microbiol Lett. 174:247-250），其可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 網站獲得，使用的參數是默認給出的那些（特別是參數“開放空位罰分”：5，和“延伸空位罰分”：2；所選矩陣是例如程式提出的矩陣“BLOSUM 62”），待比較的兩個序列之間的同一性百分比由程式直接計算。確定查詢序列與參照序列的序列同一性在本領域具有通常知識者的能力範圍內，並且可以使用商業上可獲得的分析軟體如BLASTTM 進行。
在某些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段可以包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 16，HCDR2包含SEQ ID NO: 17，HCDR3包含SEQ ID NO: 18，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 61，LCDR2包含SEQ ID NO: 62且LCDR3包含SEQ ID NO: 63。
在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 221所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，並且輕鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 222所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域是本文提供的抗體31282的VH和VL結構域。
本文提供的抗體31282來源於抗體29489。抗體31282由29489 藉由VH FR4區域中氨基酸116處的M-T替換產生。該替換被理解為除去抗體的潛在氧化位點，並且從而改善穩定性而不影響功能。因此，抗體31282和29489共有相同的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，區別僅在於框架中。
因此，在本發明的抗體或抗原結合片段的某些實施方案中，重鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 219所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，並且輕鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 220所示的氨基酸序列與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域是本文提供的抗體29489的VH和VL結構域。
儘管如此，其中VH結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 221或219所示序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO:221和219的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同的重鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 16、17和18），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。同樣地，儘管如此，其中VL結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 222或220所示序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO: 222和220的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同的輕鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 61、62和63），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。
本文描述的具有圖1-5中所示的序列的例示性TIGIT抗體由5種親本抗體克隆開發。表2總結了本文所述抗體的譜系。在酵母中表達原初（naïve）親本人抗TIGIT抗體，並且選擇那些對TIGIT具有高功能活性的抗體（灰色行，命名為26……），並進行親和力成熟。然後，在哺乳動物細胞中表達所選擇的親和力成熟抗體（每個親本下面的白色行，命名為29…或3…）。此外，抗體31282由29489 藉由VH FR4區域中氨基酸116處的M-T替換產生。該替換被理解為除去抗體的潛在氧化位點，並且從而改善穩定性而不影響功能。此外，抗體31288由29494藉由VH FR1區域中氨基酸2處的V-L替換和VH FR4區域中氨基酸120處的M-T替換產生。V-L替換被理解為恢復VH4-39種系的序列，並且M-T替換是除去抗體的潛在氧化位點且從而改善穩定性而不影響功能。 表 2
第二代抗體展現出比各自親本抗體更高的親和力。
在某些實施方案中，本發明提供了抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中VH結構域來源於選自以下的人V區種系序列：VH3-07、VH3-30、VH1-46、VH4-0B、VH4-39、VH1-69、VH3-09、VH3-33、VH3-30。在某些優選的實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含來源於人V區種系VH1-46的VH結構域。
如果重鏈可變區的序列更可能來源於給定的種系而不是任何其他種系，則VH結構域“來源於”特定的V區種系序列。TIGIT 表位
本發明還提供了抗體或其抗原結合片段，其在包含殘基Q56和I109的表位處與人TIGIT結合。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段至少在殘基Q56、N58和I109處結合人TIGIT。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段在包含殘基Q56、N58和I109以及任選地殘基E60、I68、L73和H76中一個或更多個的表位處結合人TIGIT。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段在包含殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109的表位處結合人TIGIT。
在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段在由TIGIT殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109組成的表位處結合人TIGIT。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段與抗體31282結合相同的表位。
在抗體或抗原結合片段結合包含指定TIGIT殘基的人TIGIT表位元的情況下，抗體結合這些殘基中的每一個且任選地結合TIGIT的其他殘基。在抗體或抗原結合片段結合由TIGIT殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109組成的人TIGIT表位元的情況下，抗體結合這些殘基中的每一個而不結合TIGIT的其他殘基。
如果抗體或抗原結合片段在與TIGIT結合時與指定的TIGIT氨基酸殘基接觸，則其在給定表位處與人TIGIT結合。如本文所使用的，如果在藉由抗體-TIGIT結合形成的蛋白質複合物中，殘基符合以下標準中的每一個，則抗體與該TIGIT殘基接觸：（i）其具有大於0.3 kcal/mol的計算的結合自由能貢獻，（ii）其實驗平均B因數低於X射線結構中所有殘基的平均B因數，（iii）其與抗體原子形成至少3對小於或等於4.0埃的距離的重原子原子間接觸，（iv）其不產生僅溶劑暴露性氫鍵或離子相互作用，（v）如果其是非芳族極性殘基（Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys或Arg），其與抗體產生至少一個氫鍵或離子相互作用。結合自由能的計算在本領域具有通常知識者的能力範圍內。優選使用經驗力場計算結合自由能，優選FoldX。FoldX對於本領域具有通常知識者來說是熟悉的，並且可以在http://foldxsuite.crg.eu/ 公開獲得。使用FoldX計算結合自由能也在Guerois等J. Mol. Biol. 2002；320(2):369-87中描述，其藉由引用併入本文。如本領域具有通常知識者所熟悉的，重原子都是非氫原子（包括C、N、O、S）。
因此，本發明還提供了至少在殘基Q56和I109處與人TIGIT接觸的抗體或其抗原結合片段。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段至少在殘基Q56、N58和I109處與人TIGIT接觸。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段至少在殘基Q56、N58和I109以及任選地殘基E60、I68、L73和H76中一個或更多個處與人TIGIT接觸。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段至少在殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109處與人TIGIT接觸。
在某些這樣的實施方案中，抗體或其抗原結合片段僅在殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109處與人TIGIT接觸。
用於確定抗體或抗原結合片段與TIGIT的哪些殘基接觸的方法是本領域具有通常知識者熟悉的，包括X射線晶體學，如在實施例23中所描述的。
還提供了與本文所述的抗體或抗原結合片段結合相同表位的分離的抗體或其抗原結合片段。抗體亞型
TIGIT抗體可以採用其中存在VH結構域和VL結構域二者的多種不同的實施方案。術語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用，並且涵蓋但不限於單克隆抗體（包括全長單克隆抗體）、多克隆抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體），只要其對人TIGIT蛋白表現出合適的免疫學特異性即可。如本文所使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同質的抗體的群體獲得的抗體，即除可能少量存在的可能天然發生的突變外，構成群體的各抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與通常包含針對抗原上不同決定簇（表位）的不同抗體的常規（多克隆）抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇或表位。
在一些非限制性實施方案中，本文提供的TIGIT抗體可包含以下CH1結構域和/或CL結構域，其氨基酸序列完全或基本上是人的。如果TIGIT抗體意圖用於人治療用途，則抗體的整個恆定區或其至少一部分通常具有完全或基本上人的氨基酸序列。因此，CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域和CL結構域（以及CH4結構域，如果存在的話）的一個或更多個或者任意組合對於其氨基酸序列可以是完全或基本上人的。這樣的抗體可以是任何人同種型的，其中特別優選人IgG4和IgG1。
有利地，CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域和CL結構域（以及CH4結構域，如果存在的話）可以全部具有完全或基本上人的氨基酸序列。在人源化或嵌合抗體或者抗體片段的恆定區的背景下，術語“基本上人的”是指與人恆定區至少90%、或至少92%、或至少95%、或至少97%、或至少99%的氨基酸序列同一性。在本上下文中，術語“人氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列，其包括種系、重排和體細胞突變的基因。這樣的抗體可以是任何人同種型，其中特別優選人IgG4和IgG1。
還提供了以下TIGIT抗體，其包含相對於人序列藉由進行一個或更多個氨基酸添加、缺失或替換而被改變的“人”序列恆定結構域。
本文提供的TIGIT抗體可以是任何同種型。意圖用於人治療用途的抗體將通常是IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，通常是IgG型，在這種情況下，其可以屬於IgG1、IgG2a和b、IgG3或IgG4四個亞類中的任何一個。在這些亞類中的每一種中，允許在Fc部分內進行一個或更多個氨基酸替換、插入或缺失，或者進行其他結構修飾，例如以增強或降低Fc依賴性功能。
在某些優選的實施方案中，本文提供的TIGIT抗體是IgG抗體。在某些實施方案中，根據本發明的抗體是IgG1抗體。在某些替代實施方案中，根據本發明的抗體是IgG4抗體。
已知IgG4抗體經歷Fab臂交換（FAE），其可導致IgG4抗體的不可預測的藥效學特性。已顯示鉸鏈區中的S228P突變阻止FAE（Silva等，J Biol Chem. 2015年2月27日；290(9): 5462–5469）。因此，在某些其中根據本發明的抗體是IgG4抗體的這樣的實施方案中，抗體包含突變S228P——即在228位絲氨酸突變成脯氨酸（根據EU編號）。
在一些非限制性實施方案中，構想可在重鏈和/或輕鏈的恆定區內、特別是在Fc區內進行一個或更多個氨基酸替換、插入或缺失。氨基酸替換可導致用不同的天然存在氨基酸或用非天然或經修飾的氨基酸取代替換的氨基酸。還允許其他結構修飾，例如糖基化模式的改變（例如藉由添加或缺失N-或O-連接的糖基化位點）。取決於TIGIT抗體的預期用途，就其與Fc受體的結合特性（例如調節效應功能）來修飾本發明的抗體可以是合乎期望的。
在某些實施方案中，TIGIT抗體可以包含給定抗體同種型（例如人IgG1）的Fc區，其被修飾以降低或基本上消除與該抗體同種型天然相關的一種或更多種抗體效應功能。
如本文所證明的，具有細胞裂解效應功能的抗體可有效地減少Treg細胞群，但令人驚訝的是，不會對常規效應T細胞群產生不利影響。這種選擇性可以允許更強力地抑制Treg的調節作用，同時保留抗腫瘤效應T細胞。
因此，在某些替代實施方案中，TIGIT抗體保留與該抗體同種型天然相關的一種或更多種抗體效應功能。例如，本發明的TIGIT抗體可以是保留ADCC功能性的IgG1抗體。在另一些實施方案中，TIGIT抗體可以包含給定抗體同種型（例如人IgG1）的Fc區，其被修飾以增強與該抗體同種型天然相關的一種或更多種抗體效應功能。在該上下文中，“抗體效應功能”包括抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞毒性（CDC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）中的一種或更多種，或者全部。
在某些實施方案中，抗TIGIT抗體是經修飾的抗體。
在某些實施方案中，提供了雙特異性抗體，其包含對TIGIT具有特異性的第一臂和對第二靶標具有特異性的第二臂。在一些優選的實施方案中，第二靶標是免疫檢查點分子。在某些實施方案中，第二靶標是OX40。在某些實施方案中，第二靶標是ICOS。在某些實施方案中，第二靶標是GITR。在某些實施方案中，第二靶標是4-1BB。在某些實施方案中，第二靶標是PD-1。在某些實施方案中，第二靶標是PD-L1。在某些實施方案中，對TIGIT具有特異性的第一臂包含根據本發明的抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的組合。在某些實施方案中，第一臂包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 16，HCDR2包含SEQ ID NO: 17，HCDR3包含SEQ ID NO: 18，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 61，LCDR2包含SEQ ID NO: 62且LCDR3包含SEQ ID NO: 63。
與本文公開的TIGIT抗體“交叉競爭”的單克隆抗體或其抗原結合片段是在與結合本發明TIGIT抗體的位點相同或重疊的位點處結合人TIGIT的那些。競爭性單克隆抗體或其抗原結合片段可以例如藉由抗體競爭測定來鑒定。例如，可以使純化或部分純化的人TIGIT的樣品結合至固體支持物。然後，添加本發明的抗體化合物或其抗原結合片段和懷疑能夠與此本發明抗體化合物競爭的單克隆抗體或其抗原結合片段。標記了兩種分子中的一種。如果標記的化合物和未標記的化合物與TIGIT上的分開且不連續的位元點結合，則標記的化合物將有相同的結合水準，無論是否存在懷疑的競爭化合物。然而，如果相互作用位點相同或重疊，則未標記的化合物將競爭，並且與抗原結合的標記化合物的量將會降低。如果未標記的化合物過量存在，則將有非常少的（如果有的話）標記化合物結合。
出於本發明的目的，競爭性單克隆抗體或其抗原結合片段是將本發明抗體化合物與TIGIT的結合降低約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%的那些。進行這種競爭測定的程式的細節在本領域中是習知的，並且可以在例如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988，567-569，1988，ISBN 0-87969-314-2中找到。可以藉由使用純化的抗體對這些測定進行定量。藉由滴定針對其自身的一種抗體建立標準曲線，即，對於標記和競爭者使用相同的抗體。滴定未標記的競爭性單克隆抗體或其抗原結合片段抑制標記分子與板結合的能力。繪製結果，並比較達到所需結合抑制程度所需的濃度。本發明的抗體對 TIGIT 展現出高親和力並且與 CD155 競爭
在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段對人TIGIT展現出高親和力。在某些實施方案中，根據本發明的抗體的Fab片段對TIGIT展現出藉由ForteBio™測量的1×10-10 至5×10-8 M、任選地7×10-10 至4×10-8 M的KD 。在某些實施方案中，根據本發明的抗體展現出1×10-11 至5×10-9 M、任選地2×10-11 至1×10-9 的MSD KD 。在某些實施方案中，根據本發明的抗體的Fab片段對TIGIT展現出藉由Biacore™測量的1×10-10 M至1×10-9 M、任選地1×10-10 至7×10-10 M、任選地2×10-10 至7×10-10 M的KD 。 表 3
如實施例中所證明的，抗體31282對轉基因細胞上表達的TIGIT表現出令人驚訝高的親和力。因此，在某些實施方案中，本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段顯示對人TIGIT的結合EC50 小於0.5 nM。在優選的此類實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出約0.05至約0.4 nM、優選約0.05至約0.3 nM、優選約0.05至約0.2 nM、優選約0.05至約0.15 nM的結合EC50 。在某些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段顯示對人TIGIT的結合EC50 為約0.1 nM。在一些優選的實施方案中，抗體包含抗體31282的CDR。優選地，使用表達人TIGIT的Jurkat細胞確定EC50 ，如實施例18中所述。在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段與小鼠TIGIT和/或食蟹猴TIGIT交叉反應。
由於“29…”第二代抗體是高功能性親本抗體的親和力成熟後代，預期其將表現出與親本抗體至少相似或等同的功能特性，反之亦然。
如本文所述，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段對由CD8 T細胞表達的TIGIT和由Treg細胞表達的TIGIT具有等同的親和力。如本文使用的，如果對CD8 T細胞的親和力是對Treg細胞的親和力的0.5-1.5倍，則抗體或抗原結合片段對CD8 T細胞和Treg細胞具有“等同親和力”。例如，對Treg細胞表現出0.03 nM的親和力的對CD8 T細胞和Treg細胞具有同等親和力的抗體可對CD8 T細胞表現出0.015-0.045 nM的親和力。
表3提供了對本發明的抗TIGIT抗體的親和力特性的概述，其中灰色儲存格指示親本抗體克隆，其中每個譜系的第二代和第三代抗體顯示在相應親本抗體的正下方（也參見表2）。
如實施例中所證明的，抗體31282對人原代CD8+ T細胞上表達的TIGIT表現出令人驚訝高的親和力。因此，在某些實施方案中，本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段對人TIGIT表現出的結合EC50 小於0.5 nM。在優選的此類實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出約0.05至約0.4 nM、優選約0.1至約0.3 nM的結合EC50 。在某些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段對人TIGIT表現出的結合EC50 為約0.2 nM。在一些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段包含抗體31282的CDR。優選地，使用來自人PBMC、優選來自健康個體的人PBMC的CD8+ T細胞確定EC50 ，如實施例18中所述。
如所附實施例中所證明的，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段對TIGIT表達CD8 T細胞表現出高親和力，並且對表達TIGIT的Treg細胞表現出高親和力。在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段對TIGIT表達CD8 T細胞和表達TIGIT的Treg細胞表現出特徵在於EC50 小於0.5 nM、優選小於0.3 nM、優選小於0.2 nM的親和力。在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段對TIGIT表達CD8 T細胞和表達TIGIT的Treg細胞表現出等同的親和力。
根據本發明的抗體（例如抗體31282）對來自癌症患者的CD8+ T細胞表現出令人驚訝高的親和力。這是特別有利的，因為藉由抑制TIGIT信號傳導提高來自癌症患者的T細胞的效應活性可以導致更有效的腫瘤控制。因此，在某些實施方案中，本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段對來自癌症患者的人CD8+ T細胞上的人TIGIT表現出小於0.5 nM的結合EC50 。在優選的此類實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出約0.05至約0.4 nM、優選約0.1至約0.3 nM的結合EC50 。在某些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段對人TIGIT表現出的EC50 為約0.1 nM至約0.2 nM。在一些優選的實施方案中，抗體或抗原結合片段包含抗體31282的CDR。優選地，使用來自從患有癌症的患者獲取的PBMC的CD8+ T細胞確定EC50 ，如實施例18中所述。
如所附實施例中所證明的，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段與CD155/PVR競爭結合TIGIT。在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段表現出的與CD155的競爭的特徵在於IC50 為0.2 nM或更低、優選0.1 nM或更低。在某些實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出的與CD155的競爭的特徵在於IC50 為約0.05 nM或更低。在某些優選的實施方案中，所表現出的IC50 為約0.05 nM。不希望受理論束縛，預期抗體與CD155競爭結合TIGIT降低CD155誘導的TIGIT介導的信號傳導的水準，從而提高效應T細胞活化的水準。
本發明還提供了本文所述抗體的“親和力變體”。
本發明還提供了分離的抗體或其抗原結合片段，其與本文所述的抗體或抗原結合片段交叉競爭結合人TIGIT。本發明的抗體促進促炎性 T 細胞活性
根據本發明的抗體（例如抗體31282）在促進CD8+ T細胞的促炎活性方面令人驚訝地有效。如實施例中所證明的，根據本發明的抗體或抗原結合片段（特別是31282）比比較性抗TIGIT抗體更有效地促進促炎性CD8+ T細胞活性（由IFNg釋放指示）（參見圖24）。在TIGIT表達轉基因Jurkat報導細胞和原代CD8 T細胞中證明了相對於比較抗體的該改進的效力。因此，在某些實施方案中，如實施例19中所述，本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段對由Jurkat報導細胞表達的人TIGIT表現出小於5 nM的活化EC50 。在優選的此類實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出的EC50 為約1 nM至約4 nM、優選約2 nM至約4 nM。
在某些實施方案中，如實施例19中所述，本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段對來自健康個體的CD8 T細胞表現出小於0.4 nM的活化EC50 。CD8 T細胞活性（即，促炎活性）可以藉由炎性細胞因數（例如IFNg）的產生來測量。在優選的此類實施方案中，抗體或抗原結合片段表現出約0.05 nM至約0.4 nM、優選約0.1 nM至約0.2 nM的EC50 。優選地，使用來自從健康個體獲取的PBMC的CD8+ T細胞確定EC50 ，如實施例19中所述。
在所附實施例中另外地且令人驚訝地證明，所提供的抗TIGIT抗體有效地提高gamma-delta（γδ，或g/d） T細胞（即表達γδ TCR亞基的T細胞，與常規αβ TCR亞基相對）的活性。這樣的γδ T細胞形成免疫系統的獨特且重要的組分，並且本文提供的抗體促進這些細胞的活性的能力凸顯了所述抗體的效用。
因此，本文還提供了促進γδ T細胞活性的方法，其包括使γδ T細胞群與抗TIGIT抗體接觸。在某些實施方案中，所述方法在體外進行。在某些實施方案中，所述方法在人物件中體內進行。在某些這樣的實施方案中，人物件患有癌症。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含根據本發明的抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的組合。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 16，HCDR2包含SEQ ID NO: 17，HCDR3包含SEQ ID NO: 18，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 61，LCDR2包含SEQ ID NO: 62且LCDR3包含SEQ ID NO: 63。T-reg 細胞的選擇性消耗
如本文所證明的，抗TIGIT抗體能夠選擇性地消耗表達TIGIT的Treg細胞。也就是說，抗TIGIT抗體降低表達TIGIT的Treg細胞相對於T細胞總群的比例的程度大於其降低效應或記憶CD4或CD8 T細胞的比例。
在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段選擇性地消耗表達TIGIT的Treg細胞。
表達TIGIT的Treg細胞的這種選擇性消耗可以藉由TIGIT表達Treg的選擇性裂解來介導（例如藉由ADCC或CDC（參見圖20、21和25））。TIGIT表達Treg被理解為是比不表達TIGIT的Treg更強力的調節性細胞。不希望受理論束縛，藉由裂解表達TIGIT的Treg細胞的選擇性消耗係藉由消耗Treg細胞的總數而且消耗表現出更強力調節功能的那些Treg細胞來預期提高T細胞效應功能（例如T細胞介導的細胞毒性、促炎細胞因數釋放）。圖24證明了這種提高的T細胞效應功能。
因此，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段選擇性地裂解表達TIGIT的Treg細胞。
表達TIGIT之Treg細胞的選擇性消耗也可以藉由誘導TIGIT受體的內化使得其不再在細胞膜上表達來介導。不希望受理論束縛，藉由誘導TIGIT內化使得TIGIT+ Treg細胞成為TIGIT- Treg細胞，預期這些細胞的調節功能變得不那麼強（因為TIGIT+ Treg是更強力的調節細胞）。由於受體內化和隨後這些Treg的調節效力下降，預期T細胞效應功能提高。因此，在某些實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段抑制表達TIGIT的Treg細胞的抑制活性，優選係藉由誘導表達TIGIT的Treg細胞的TIGIT內化來抑制。
特別有利的是，根據本發明的抗TIGIT抗體對CD8 T細胞和Treg細胞表現出高親和力，並且還表現出Treg細胞的選擇性消耗，從而藉由兩種機制促進T細胞效應功能。抗體效應功能（例如ADCC、CDC）的保留導致Treg的有效消耗，並且該選擇性意味著抗體效應功能不會導致效應T細胞的不希望的消耗。該選擇性特別令人驚訝，因為先前產生抗TIGIT抗體的嘗試已經試圖消除抗體效應功能以避免表達TIGIT的效應T細胞的裂解。此外，由於本發明的TIGIT抗體表現出對效應T細胞（例如CD8 T細胞）的親和力，因此可以藉由競爭CD155結合和/或誘導效應T細胞上TIGIT的內化來抑制這些細胞中TIGIT介導的信號傳導。組合地，本發明抗體的這些作用可導致T細胞效應功能的顯著上調。
根據本發明的抗體和抗原結合片段表現出的另一些令人驚訝的有利特性包括提高腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的T細胞效應功能（例如促炎細胞因數的釋放）。暴露於腫瘤微環境可導致TIL表現出無反應性或所謂的“耗竭”表型，這可能是由於抗原過度暴露和/或免疫抑制性腫瘤微環境。增強TIL的效應功能是合乎期望的，因為正是這些細胞浸潤腫瘤本身並因此定位在最適合減小腫瘤大小或生長的位點；然而由於許多TIL的無反應或耗竭表型，預期難以增強其效應功能。因此，暴露於本發明抗體之後來自TIL的促炎反應的提高是令人驚訝的，並且表明所述抗體可以是特別有效的治療劑。
抗體和抗原結合片段表現出的另一些令人驚訝的有利特性包括提高gamma-delta（γδ）T細胞的促炎活性的能力。先前從未報導過抗TIGIT抗體促進非常規T細胞如γδ T細胞的活性的能力，並且該能力提供了治療除癌症以外的已知γδ T細胞在其中很重要的疾病的潛力。例如，據報導γδ T細胞參與對致病性感染（細菌、病毒（例如CMV）、真菌）的反應以及在保護免受自身免疫病方面起作用。此外，促進非常規T細胞活性的這一令人驚訝的能力為抗體的抗腫瘤作用提供了進一步的效力。
在另一個方面，提供了從T細胞群中選擇性地消耗Treg細胞的方法，其包括使T細胞群與抗TIGIT抗體或其抗原結合片段接觸，由此抗TIGIT抗體選擇性地消耗Treg細胞群。在某些實施方案中，該方法在體外進行。在某些實施方案中，該方法在人物件中體內進行。在某些這樣的實施方案中，人物件患有癌症。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含根據本發明的抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的組合。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 16，HCDR2包含SEQ ID NO: 17，HCDR3包含SEQ ID NO: 18，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 61，LCDR2包含SEQ ID NO: 62且LCDR3包含SEQ ID NO: 63。
如所附實施例中所證明的，本發明還提供了不與CD155/PVR競爭結合TIGIT的抗TIGIT抗體。因此，在另一個方面，本發明提供了人TIGIT抗體或其抗原結合片段，其不與CD155/PVR競爭結合人TIGIT。在某些這樣的實施方案中，根據本發明的CD155非競爭性抗TIGIT抗體的Fab片段對TIGIT表現出藉由ForteBio™測量的5x10-9 至5x10-8 M、任選地1x10-8 至3x10-8 M的KD 。
在某些優選的實施方案中，抗體可包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 280，HCDR2包含SEQ ID NO: 281，HCDR3包含SEQ ID NO: 282，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 292，LCDR2包含SEQ ID NO: 293且LCDR3包含SEQ ID NO: 294。在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 333所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，並且輕鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 334所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
儘管如此，其中VH結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 333所示序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO: 333的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同的重鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 280、281和282），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。同樣地，儘管如此，其中VL結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 334所示的序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO: 334的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同的輕鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 292、293和294），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。
在某些優選的實施方案中，抗體可包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中HCDR1包含SEQ ID NO: 353，HCDR2包含SEQ ID NO: 354，HCDR3包含SEQ ID NO: 355，並且LCDR1包含SEQ ID NO: 356，LCDR2包含SEQ ID NO: 357且LCDR3包含SEQ ID NO: 358。在某些這樣的實施方案中，重鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 367所示的氨基酸序列，或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，並且輕鏈可變結構域可包含SEQ ID NO: 368所示的氨基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
儘管如此，其中VH結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 367所示序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO: 367的HCDR1、HCDR2和HCDR3相同的重鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 353、354和355），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。同樣地，儘管如此，其中VL結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO: 368所示序列展現出低於100%序列同一性的實施方案可包含與SEQ ID NO: 368的LCDR1、LCDR2和LCDR3相同的輕鏈CDR（分別為SEQ ID NO: 356、357和358），同時在框架區內展現出氨基酸序列變異。多核苷酸、載體和表達系統
本發明還提供了編碼本發明TIGIT抗體的多核苷酸分子、以及含有與允許在宿主細胞或無細胞表達系統中表達抗原結合多肽的調節序列有效連接的編碼本發明TIGIT抗體的核苷酸序列的表達載體，以及含有該表達載體的宿主細胞或無細胞表達系統。
編碼本發明TIGIT抗體的多核苷酸分子包括例如重組DNA分子。如本文所使用的，術語“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互換並且指任何單鏈或雙鏈的DNA或RNA分子，並且如果是單鏈的話，則還指其互補序列的分子。在討論核酸分子時，本文可根據以5’至3’方向提供序列的常規慣例描述特定核酸分子的序列或結構。在本發明的一些實施方案中，核酸或多核苷酸是“分離的”。當應用於核酸分子時，該術語是指與在其所來源於生物體的天然存在基因組中同其緊密相鄰的序列相分離的核酸分子。例如，“分離的核酸”可包含插入到載體（例如質粒或病毒載體）中，或整合到原核細胞或真核細胞或者非人宿主生物體的基因組DNA中的DNA分子。當應用於RNA時，術語“分離的多核苷酸”主要指由如上定義的分離的DNA分子編碼的RNA分子。或者，該術語可以指這樣的RNA分子：其已經從在其天然狀態（即在細胞或組織中）下與之締合的其他核酸純化/分離的RNA分子。分離的多核苷酸（DNA或RNA）還可以代表生物或合成手段直接產生並且與在其產生期間存在的其他組分分離的分子。
為了重組產生根據本發明的TIGIT抗體，可以製備編碼其的重組多核苷酸（使用標準分子生物學技術）並將其插入可複製載體中以在所選宿主細胞或無細胞表達系統中表達。合適的宿主細胞可以是原核生物、酵母、或高等真核生物的細胞，特別是哺乳動物細胞。可用的哺乳動物宿主細胞系的一些實例是藉由SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚腎系（293細胞或亞克隆用於在懸浮培養物中生長的293細胞，Graham等，J. Gen. Virol. 36:59-74，1977）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216，1980；或CHO來源的克隆，如CHO-K1，ATCC CCL-61，Kao和Puck，Genetics of somatic mammalian cells，VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells，Proc. Natl. Acad. Sci. 60:1275-1281，1968）；小鼠支援細胞（TM4；Mather，Biol. Reprod. 23:243-252，1980）；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-AG14（ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287）或NS0（HPA培養物保藏號85110503）；猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68，1982）；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系（Hep G2），以及DSM的PERC-6細胞系。適用於這些宿主細胞中每一種的表達載體也是本領域習知的。
應注意，術語“宿主細胞”通常是指培養的細胞系。其中已引入編碼根據本發明的抗原結合多肽的表達載體的全人被明確排除在“宿主細胞”的定義之外。
在一個重要方面，本發明還提供了產生本發明TIGIT抗體的方法，該方法包括在允許TIGIT抗體表達的條件下培養含有編碼TIGIT抗體的多核苷酸（例如表達載體）的宿主細胞（或無細胞表達系統），以及回收所表達的TIGIT抗體。該重組表達方法可用於根據本發明的TIGIT抗體的大規模生產，包括意圖用於人治療用途的單克隆抗體。用於大規模製備適於體內治療用途的重組抗體的合適載體、細胞系和生產方法通常是本領域可獲得的並且是本領域具有通常知識者習知的。
因此，根據本發明，提供了分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合，其編碼包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的以下組合的抗體或抗原結合片段，其中所述組合選自： (i)包含SEQ ID NO: 16的HCDR1、包含SEQ ID NO: 17的HCDR2、包含SEQ ID NO: 18的HCDR3、包含SEQ ID NO: 61的LCDR1、包含SEQ ID NO: 62的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 63的LCDR3； (ii)包含SEQ ID NO: 4的HCDR1、包含SEQ ID NO: 5的HCDR2、包含SEQ ID NO: 6的HCDR3、包含SEQ ID NO: 49的LCDR1、包含SEQ ID NO: 50的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 51的LCDR3； (iii)包含SEQ ID NO: 7的HCDR1、包含SEQ ID NO: 8的HCDR2、包含SEQ ID NO: 9的HCDR3、包含SEQ ID NO: 52的LCDR1、包含SEQ ID NO: 53的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 54的LCDR3； (iv)包含SEQ ID NO: 10的HCDR1、包含SEQ ID NO: 11的HCDR2、包含SEQ ID NO: 12的HCDR3、包含SEQ ID NO: 55的LCDR1、包含SEQ ID NO: 56的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 57的LCDR3； (v)包含SEQ ID NO: 13的HCDR1、包含SEQ ID NO: 14的HCDR2、包含SEQ ID NO: 15的HCDR3、包含SEQ ID NO: 58的LCDR1、包含SEQ ID NO: 59的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 60的LCDR3； (vi)包含SEQ ID NO: 1的HCDR1、包含SEQ ID NO: 2的HCDR2、包含SEQ ID NO: 3的HCDR3、包含SEQ ID NO: 46的LCDR1、包含SEQ ID NO: 47的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 48的LCDR3； (vii)包含SEQ ID NO: 19的HCDR1、包含SEQ ID NO: 20的HCDR2、包含SEQ ID NO: 21的HCDR3、包含SEQ ID NO: 64的LCDR1、包含SEQ ID NO: 65的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 66的LCDR3； (viii)包含SEQ ID NO: 22的HCDR1、包含SEQ ID NO: 23的HCDR2、包含SEQ ID NO: 24的HCDR3、包含SEQ ID NO: 67的LCDR1、包含SEQ ID NO: 68的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 69的LCDR3； (ix)包含SEQ ID NO: 25的HCDR1、包含SEQ ID NO: 26的HCDR2、包含SEQ ID NO: 27的HCDR3、包含SEQ ID NO: 70的LCDR1、包含SEQ ID NO: 71的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 72的LCDR3； (x)包含SEQ ID NO: 28的HCDR1、包含SEQ ID NO: 29的HCDR2、包含SEQ ID NO: 30的HCDR3、包含SEQ ID NO: 73的LCDR1、包含SEQ ID NO: 74的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 75的LCDR3； (xi)包含SEQ ID NO: 31的HCDR1、包含SEQ ID NO: 32的HCDR2、包含SEQ ID NO: 33的HCDR3、包含SEQ ID NO: 76的LCDR1、包含SEQ ID NO: 77的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 78的LCDR3； (xii)包含SEQ ID NO: 34的HCDR1、包含SEQ ID NO: 35的HCDR2、包含SEQ ID NO: 36的HCDR3、包含SEQ ID NO: 79的LCDR1、包含SEQ ID NO: 80的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 81的LCDR3； (xiii)包含SEQ ID NO: 37的HCDR1、包含SEQ ID NO: 38的HCDR2、包含SEQ ID NO: 39的HCDR3、包含SEQ ID NO: 82的LCDR1、包含SEQ ID NO: 83的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 84的LCDR3； (xiv)包含SEQ ID NO: 40的HCDR1、包含SEQ ID NO: 41的HCDR2、包含SEQ ID NO: 42的HCDR3、包含SEQ ID NO: 85的LCDR1、包含SEQ ID NO: 86的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 87的LCDR3； (xv)包含SEQ ID NO: 43的HCDR1、包含SEQ ID NO: 44的HCDR2、包含SEQ ID NO: 45的HCDR3、包含SEQ ID NO: 88的LCDR1、包含SEQ ID NO: 89的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 90的LCDR3； (xvi)包含SEQ ID NO: 271的HCDR1、包含SEQ ID NO: 272的HCDR2、包含SEQ ID NO: 273的HCDR3、包含SEQ ID NO: 283的LCDR1、包含SEQ ID NO: 284的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 285的LCDR3； (xvii)包含SEQ ID NO: 274的HCDR1、包含SEQ ID NO: 275的HCDR2、包含SEQ ID NO: 276的HCDR3、包含SEQ ID NO: 286的LCDR1、包含SEQ ID NO: 287的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 288的LCDR3；和 (xviii)包含SEQ ID NO: 277的HCDR1、包含SEQ ID NO: 278的HCDR2、包含SEQ ID NO: 279的HCDR3、包含SEQ ID NO: 289的LCDR1、包含SEQ ID NO: 290的LCDR2、和包含SEQ ID NO: 291的LCDR3。
在某些實施方案中，提供了分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合，其編碼包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合的抗體或抗原結合片段，其中： （i）HCDR1包含SEQ ID NO: 16或由其組成，HCDR2包含SEQ ID NO: 17或由其組成，HCDR3包含SEQ ID NO: 18或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO: 61或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO: 62或由其組成，並且LCDR3包含SEQ ID NO: 63或由其組成。
此外，根據本發明，提供了編碼本文所述抗體或抗原結合片段的分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合。在某些實施方案中，提供了編碼本文提供的抗體31282或其抗原結合片段的分離的多核苷酸。
此外，根據本發明，提供了編碼抗TIGIT抗體的VH和/或VL結構域的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自SEQ ID No: 241-270、335-342和369-370的一個或更多個序列。在某些實施方案中，分離的多核苷酸包含根據SEQ ID NO: 251的序列和/或根據SEQ ID NO: 252的序列。在其中多核苷酸包含根據SEQ ID NO: 251的序列和根據SEQ ID NO: 252的序列的某些實施方案中，所述序列是連續的。在其中多核苷酸包含根據SEQ ID NO: 251的序列和根據SEQ ID NO: 252的序列的某些實施方案中，所述序列不是連續的。
此外，根據本發明，提供了表達載體，其包含與調節序列有效連接的根據本發明的多核苷酸，所述調節序列允許抗原結合多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表達。
此外，根據本發明，提供了含有根據本發明的表達載體的宿主細胞或無細胞表達系統。
此外，根據本發明，提供了產生重組抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在允許抗體或抗原結合片段表達的條件下培養根據本發明的宿主細胞或無細胞表達系統，以及回收所表達的抗體或抗原結合片段。藥物組合物
本文還提供了藥物組合物，其包含與一種或更多種可藥用載體或賦形劑一起配製的根據本發明的抗體或抗原結合片段。這樣的組合物可包含一種TIGIT抗體或（例如，兩種或更多種不同的）TIGIT抗體的組合。用於配製用於人治療用途的抗體的技術是本領域習知的，並且在例如Wang等，Journal of Pharmaceutical Sciences，第96卷，第1-26頁，2007中進行了綜述。
本文提供的TIGIT抗體和藥物組合物可用於治療，特別是疾病、特別是受益於抑制TIGIT功能的病症的治療性治療。組合產品
如本文所證明的，當與免疫檢查點抑制劑——特別是抗ICOS拮抗劑抗體或抗PD-1抗體（即，對於人免疫調節分子PD-1具有特異性的拮抗劑抗體）組合施用時，本發明的抗體或其抗原結合片段特別有效。與單獨的任一種抗體相比，與抗ICOS或抗PD-1抗體組合施用抗TIGIT抗體導致腫瘤生長的協同降低。使用根據本發明的抗TIGIT抗體和抗PD-L1抗體的組合預期觀察到類似的效果。
本文進一步證明，當與免疫檢查點共刺激分子特異性激動劑抗體——特別是抗4-1BB、抗OX40或抗GITR激動劑抗體組合施用時，本發明的抗體或其抗原結合片段特別有效。與單獨的任一種抗體相比，與抗4-1BB、抗OX40或抗GITR激動劑抗體組合施用抗TIGIT抗體導致腫瘤生長的協同降低。
在另一個方面，提供了組合產品，其包含抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，以及化學治療劑、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體中的一種或更多種。在某些優選的實施方案中，抗TIGIT抗體或抗原結合片段是根據本發明提供的抗體或抗原結合片段。在一個最優選的實施方案中，抗TIGIT抗體或抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中： HCDR1包含SEQ ID NO: 16（YTFTSYYMH）， HCDR2包含SEQ ID NO: 17（VIGPSGASTSYAQKFQG）， HCDR3包含SEQ ID NO: 18（ARDHSDYWSGIMEV）， LCDR1包含SEQ ID NO: 61（RASQSVRSSYLA）， LCDR2包含SEQ ID NO: 62（GASSRAT），並且 LCDR3包含SEQ ID NO: 63（QQYFSPPWT）。
還提供了本文提供的組合，其用於治療癌症或病毒感染的方法，任選地其中病毒感染是CMV感染。還提供了如本文提供的組合，其用於本文提供的方法。
如本文所使用的，在兩種或更多種活性劑作為“組合”、“治療組合”或“組合治療”（這些術語可互換使用）提供的情況下，這不要求或排除活性劑被配製成單一組合物。組合治療給予其常規解釋：施用兩種或更多種活性劑，使得患者可以從每種藥劑獲得益處。“組合治療”不必需共配製、共施用、同時施用或固定劑量配製。治療方法
本文提供的TIGIT抗體或其抗原結合片段以及藥物組合物可用於體內抑制癌性腫瘤細胞的生長，並且因此可用於治療腫瘤。
因此，本發明的另一些方面涉及抑制人患者中腫瘤細胞生長的方法，以及治療或預防癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的如本文所述的TIGIT抗體或抗原結合片段、如本文所述的藥物組合物，或如本文所述的組合。
本發明的另一方面提供了如本文所述的TIGIT抗體或抗原結合片段，其用於抑制人患者中腫瘤細胞的生長。本發明的又一方面提供了如本文所述的TIGIT抗體或抗原結合片段，其用於治療或預防人患者中的癌症。
在另一方面，本發明提供了選擇性地消耗癌症患者中Treg細胞的方法，該方法包括向患者施用抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體在人TIGIT上的表位處結合，所述表位包含殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109，優選係由殘基Q56、N58、E60、I68、L73、H76和I109組成。在某些實施方案中，抗TIGIT抗體是本文提供的抗TIGIT抗體。
在某些實施方案中，抗TIGIT抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中：HCDR1包含SEQ ID NO: 16（YTFTSYYMH）或由其組成，HCDR2包含SEQ ID NO: 17（VIGPSGASTSYAQKFQG）或由其組成，HCDR3包含SEQ ID NO: 18（ARDHSDYWSGIMEV）或由其組成，LCDR1包含SEQ ID NO: 61（RASQSVRSSYLA）或由其組成，LCDR2包含SEQ ID NO: 62（GASSRAT）或由其組成，並且LCDR3包含SEQ ID NO: 63（QQYFSPPWT）或由其組成。
在某些優選的實施方案中，待治療的患者患有選自以下的癌症：腎癌（例如，腎細胞癌）、乳腺癌、腦腫瘤、慢性或急性白血病（包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病）、淋巴瘤（如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）、淋巴細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、B細胞淋巴瘤（如CLL）、T細胞淋巴瘤（如Sezary綜合征））、鼻咽癌、黑素瘤（如轉移性惡性黑素瘤）、前列腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌（如頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC））、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS）贅生物、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma）、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、間皮瘤。在某些實施方案中，抑制的癌症是肺癌、膀胱癌、乳腺癌、腎癌（例如腎上皮癌）、頭頸癌（例如HNSCC）或結腸癌（例如結腸腺癌）。在某些實施方案中，癌症是結腸癌（例如結腸腺癌）或肺癌。在某些實施方案中，癌症是血液癌。在某些這樣的實施方案中，癌症是淋巴瘤。在某些實施方案中，癌症是T細胞淋巴瘤或B細胞淋巴瘤。
在某些實施方案中，治療癌症的方法還包括施用另外的治療劑，例如化學治療劑。
如本文所證明的，當與免疫檢查點抑制劑——特別是抗ICOS拮抗劑抗體或抗PD-1抗體（即，對人免疫調節分子PD-1具有特異性的拮抗劑抗體）組合施用時，本發明的抗體或其抗原結合片段特別有效。與單獨的任一種抗體相比，與抗ICOS或抗PD-1抗體組合施用抗TIGIT抗體導致腫瘤生長的協同降低。使用根據本發明的抗TIGIT抗體和抗PD-L1抗體的組合預期觀察到類似的效果。
本文還證明，當與免疫檢查點共刺激分子特異性激動劑抗體——特別是抗4-1BB、抗OX40或抗GITR激動劑抗體組合施用時，本發明的抗體或其抗原結合片段特別有效。與單獨的任一種抗體相比，與抗4-1BB、抗OX40或抗GITR激動劑抗體組合施用抗TIGIT抗體導致腫瘤生長的協同降低。
因此，本文還提供了在物件中治療癌症的方法，其包括向物件施用有效量的根據本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，並且還施用有效量的抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體和抗GITR抗體，或抗ICOS抗體。
此外，本文提供的證明抗TIGIT抗體可以提高γδ細胞以及常規T細胞的活性的資料表明抗TIGIT抗體可用於治療除癌症之外的病症。特別地，已知γδ T細胞在對感染（例如細菌、真菌或病毒感染）的反應中很重要。如實施例29所示，當與抗TIGIT抗體接觸時，來自CMV血清陽性物件的γδ T細胞表現出顯著提高的活化，其特徵在於IFNg分泌的增加。以這種方式促進CMV患者中γδ T細胞活化的能力表明施用抗TIGIT抗體將促進γδ T細胞的抗病毒活性。
因此，本文提供了在物件中治療病毒感染的方法，其包括施用有效量的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。還提供了在物件中治療病毒感染的方法，其包括向物件施用有效量的本文提供的抗TIGIT抗體或抗原結合片段或者藥物組合物，從而治療病毒感染。在一些優選的實施方案中，病毒感染是CMV感染。
在某些實施方案中，所述方法還包括施用一種或更多種另外的治療劑。在某些實施方案中，一種或更多種治療劑選自：抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體。
如實施例中所證明的，本文公開的抗TIGIT抗體有效地促進T細胞活性，尤其是促炎性T細胞活性。可以藉由本領域具有通常知識者熟悉的方法測量T細胞活性，例如如實施例中所描述的藉由測量IFNg產生。
因此，本文還提供了促進T細胞活性的方法，其包括使T細胞群與本文所述的抗體或抗原結合片段接觸。
在某些實施方案中，促進T細胞活性的方法在體外進行。在某些實施方案中，促進T細胞活性的方法在人物件中體內進行。在某些這樣的實施方案中，人物件患有癌症。在某些實施方案中，人物件患有病毒感染，例如CMV感染。
在某些實施方案中，所述方法促進常規αβ T細胞活性。在某些實施方案中，所述方法促進CD4 T細胞活性。在某些實施方案中，所述方法促進CD8 T細胞活性。在某些實施方案中，所述方法促進γδ（gamma-delta） T細胞活性。
在實施例中還證明，當與抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體或抗ICOS抗體組合使用時，本文公開的抗TIGIT抗體在促進T細胞活性方面特別有效。顯著的是，該組合提供了T細胞活性的協同（即大於加和）提高。
因此，在某些實施方案中，促進T細胞活性的方法還包括使T細胞群與以下一種或更多種接觸：抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體。
本文描述的但不脫離本發明的精神和範圍的本發明實施方案的變體方案和等同方案是本領域具有通常知識者熟悉的。參照以下非限制性實施例將進一步理解本發明。 實施例 實施例 1 ： TIGIT 抗原結合蛋白的選擇
TIGIT ABP選自以IgG形式表達並呈遞在酵母細胞表面上的人抗體的合成文庫，通常如例如WO2009036379；WO2010105256；WO2012009568；以及Xu等，Protein Eng Des Sel .，第26(10)卷，第663-670頁（2013）中所述，更具體地如下文所提供的。從重組文庫分離的ABP的序列和特徵在圖1至6中提供。
如以前所述繁殖八個初始人合成酵母文庫，每個約109 多樣性（參見例如，Xu等，2013；WO2009036379；WO2010105256和WO2012009568）。對於前兩輪選擇，如所述（參見例如Siegel等，2004），進行利用Miltenyi MACS系統的磁珠分選技術。簡單地說，將酵母細胞（約1010 細胞/文庫）與生物素化的TIGIT-Fc抗原（Creative Biomart）在FACS洗滌緩衝液（磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）/0.1%牛血清白蛋白（BSA））中孵育。用50 ml冰冷的洗滌緩衝液洗滌一次後，將細胞沉澱重懸於40 mL洗滌緩衝液中，並將鏈黴親和素微珠（Streptavidin MicroBead）（500 μl）添加到酵母中並在4℃孵育15分鐘。接下來，將酵母沉澱，重懸於5 mL洗滌緩衝液中，並上樣到Miltenyi LS柱上。上樣5 mL後，用3 ml FACS洗滌緩衝液洗滌柱3次。然後從磁場中取出柱，將酵母用5 mL生長培養基洗脫，然後生長過夜。使用流式細胞術進行以下輪次分選。將約1×108 個酵母沉澱，用洗滌緩衝液洗滌三次，並在室溫下在平衡條件下與生物素化的TIGIT-Fc融合抗原（10 nM）一起孵育。然後將酵母洗滌兩次並用LC-FITC（1:100稀釋）和SA-633（1:500稀釋）或EA-PE（1:50稀釋）二級試劑在4℃下染色15分鐘。用冰冷的洗滌緩衝液洗滌兩次後，將細胞沉澱重懸於0.4 mL洗滌緩衝液中並轉移至蓋有篩檢程式的分選管中。使用FACS ARIA分選器（BD Biosciences）進行分選，並分配分選圈選以選擇相對於背景對照的特異性結合物。使用隨後的幾輪選擇以減少利用來自CHO細胞的可溶性膜蛋白的非特異性結合物的數量（參見，例如，WO2014179363和Xu等，Protein Eng Des Sel，第26(10)卷，第663-670頁（2013）），並使用TIGIT-Fc抗原鑒定對TIGIT具有改善的親和力的結合物。在最後一輪分選後，將酵母平板接種並挑選個體菌落用於表徵和提名用於親和熟化的克隆。篩選63個克隆用於功能活性。根據該篩選，克隆26518、26452、26486、26521和26493具有最佳功能活性，並被選擇用於進一步優化。實施例 2 ：抗體優化
使用三種熟化策略進行初始克隆的優化：輕鏈多樣化；HCDR1和HCDR2的多樣化；以及在所選HCDR1和HCDR2多樣性庫內的HCDR3多樣化。
輕鏈多樣化：從初始輸出（如上所述）中提取重鏈可變區並將其轉化到多樣性為1×106 的輕鏈文庫中。如上所述進行選擇，進行一輪MACS分選和三輪FACS分選，各輪使用10 nM或1 nM生物素化TIGIT-HIS抗原（Creative Biomart）。
HCDR1和HCDR2選擇：將來自從輕鏈多樣化程式選擇的克隆的HCDR3重組到具有多樣性為1×108 的HCDR1和HCDR2變體的預製文庫中，並使用單體HIS-TIGIT抗原進行選擇。藉由在室溫下在平衡條件下使用降低濃度的生物素化HIS-TIGIT抗原（100至1 nM）來施加親和壓力。
HCDR3/HCDR1/HCDR2選擇：從IDT訂購寡核苷酸，其包含HCDR3以及HCDR3每一側的同源側翼區。藉由在整個HCHR3上以每個寡核苷酸兩個位置的NNK多樣性對HCDR3中的氨基酸位置上雜色（variegated）。使用與HCDR3的側翼區退火的引物將HCDR3寡核苷酸雙鏈化。重鏈可變區的剩餘FWR1至FWR3從具有改善的親和力的抗體庫中擴增，所述抗體從上文所選擇的HCDR1和HCDR2多樣性中分離。然後藉由將雙鏈HCDR3寡核苷酸、FWR1至FWR3合併片段和重鏈表達載體轉化到已含有原始初始親本的輕鏈的酵母中來產生文庫。如使用FACS分選的先前迴圈期間那樣進行四輪選擇。對於每輪FACS，評估文庫的PSR結合、物種交叉反應性和親和壓力，並進行分選以獲得具有所需特徵的群體。如上所述在HCDR1和HCDR2選擇中進行這些選擇的親和壓力。實施例 3 ：抗體產生和純化
A. 在酵母中產生 為了產生足夠量的優化和未優化的所選抗體用於進一步表徵，使酵母克隆生長至飽和，然後在30℃下振盪誘導48小時。誘導後，沉澱酵母細胞，收穫上清液用於純化。使用蛋白A柱純化IgG，並用pH 2.0的乙酸洗脫。藉由木瓜蛋白酶消化產生Fab片段，並在蛋白A（GE LifeSciences）和KappaSelect（GE Healthcare LifeSciences）的兩步過程中純化。
B. 在哺乳動物細胞中產生 為了產生足夠量的優化和未優化的所選抗體用於進一步表徵，產生編碼特定抗體克隆的DNA載體並將其轉導到HEK細胞中。在Geneart訂購用於抗體可變結構域的人密碼子優化的合成DNA片段。將可變結構域序列無縫連接到含有小鼠IgKappa信號序列和各抗體類別恆定區的pUPE表達載體中。藉由限制性分析和DNA測序驗證表達載體。對於暫態轉染，產生無內毒素DNA maxiprep（Sigma），並根據已建立的方案，在Freestyle培養基（ThermoFisherScientific）中將重鏈和輕鏈載體共轉染至HEK293EBNA1細胞。轉染後24小時添加Primatone（0.55％終體積）。轉染後6天收穫條件化培養基。藉由Mabselect sureLX（GE Healthcare）親和色譜分批純化抗體。用含有1M NaCl和PBS的PBS分兩步洗滌結合的抗體。用20 mM檸檬酸鹽150 mM NaCl pH3洗脫抗體，並用1/6體積的1M K2HPO4/KH2PO4 pH 8中和至約pH 7。
接下來，使用在PBS中平衡的Superdex200柱藉由凝膠過濾進一步純化抗體。藉由NuPAGE分析級分，併合並含有抗體的級分。終產物在0.22 µM注射器篩檢程式上滅菌。藉由NuPAGE分析產物，並藉由LAL測定測量內毒素水準。實施例 4 ：抗 TIGIT 抗體與重組人 TIGIT 蛋白結合的親和力測定
A. ForteBio KD 測量 通常如先前所述進行所選抗體的ForteBio親和力測量（參見，例如，Estep等 ，Mabs ，第5(2)卷，第270-278頁（2013））。簡單地說，藉由將IgG線上載入到AHQ感測器上來進行ForteBio親和力測量。將感測器在測定緩衝液中離線平衡30分鐘，然後線上監測60秒以進行基線建立。將具有載入的IgG的感測器暴露於100 nM抗原（人TIGIT-Fc、人TIGIT-His或cyno TIGIT-Fc）5分鐘，然後將它們轉移至測定緩衝液5分鐘以進行解離速率測量。使用1:1結合模型分析動力學。藉由ForteBio測試了超過90種抗體的親和力，表3提供了15種所選抗TIGIT抗體的資料，證明了與重組TIGIT蛋白的強結合。
B. MSD-SET KD 測量 通常如先前所述（Estep等 ，Mabs ，第5(2)卷，第270-278頁（2013））進行選擇抗體的平衡親和測量。簡單地說，在PBS + 0.1％無IgG BSA（PBSF）中進行溶液平衡滴定（SET），抗原（TIGIT-His單體）保持恆定為10至100 pM，並與3至5倍系列稀釋的Fab或mAb（始於10 pM至10 nM）一起孵育。將抗體（PBS中20 nM）包被在標準結合MSD-ECL板上在4℃過夜或在室溫下30分鐘。然後將板用BSA封閉30分鐘，然後用洗滌緩衝液（PBSF+0.05％Tween 20）洗滌三次。施加SET樣品並在700 rpm振盪下在板上孵育150秒，然後洗滌一次。藉由在板上孵育3分鐘，用PBSF中的250 ng/mLsulfotag標記的鏈黴親和素檢測板上捕獲的抗原。將板用洗滌緩衝液洗滌三次，然後使用具有表面活性劑的1×Read Buffer T在MSD Sector Imager 2400儀器上讀數。將游離抗原百分比作為Prism中滴定抗體的函數作圖，並擬合二次方程以提取KD 。為了提高產量，在整個MSD-SET實驗中使用液體處理機器人，包括SET樣品的製備。藉由MSD測試所選抗體的親和力，表4提供7個抗TIGIT克隆的資料，證明與重組TIGIT蛋白的強結合。表 4 ：對所選抗 TIGIT 抗體親和力的 MSD 分析
C. Biacore 測量 在25℃下，在HBS-EP緩衝系統（10 mM HEPES pH 7.3，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05％表面活性劑P20）中，使用與CM5感測器晶片對接的Biacore 8K光學生物感測器（GE Healthcare，Marlboro，MA）進行生物感測器分析。將樣品集（sample hotel）保持在8℃。使用標準胺偶聯化學將山羊抗人IgG捕獲抗體（Fcγ片段特異性，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA；109-005-098）固定（11700+/-200 RU）至感測器晶片的兩個流動池。該表面類型提供了在每個再生步驟後可重複捕獲新鮮分析抗體的格式。流動池2用於分析捕獲抗體（60-90 RU），而流動池1用作參照流動池。在運行緩衝液中製備30至0.123 nM（3倍稀釋）的抗原濃度。每種抗原樣品濃度作為單次重複進行。還運行兩次空白（緩衝液）注射並用於評估和減去系統假像（artefact）。所有抗原濃度的結合（300秒）和解離（600秒）階段以30 uL/min的流速進行。藉由以流速為30 uL/min的三次連續注射（15秒、15秒和60秒）10 mM甘氨酸（pH 1.5）再生表面。使用Biacore 8K評估軟體1.0版對資料進行比對、雙重引用並擬合成1:1結合模型。藉由Biacore測試所選抗體的親和力，表5提供5個抗TIGIT克隆的資料，證明與重組TIGIT蛋白的強結合。表 5 ：對所選抗 TIGIT 抗體親和力的 Biacore 分析 實施例 5 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體和 TIGIT 天然配體之間的競爭測定
A. Octet Red384 表位分類（ epitope binning ） / 配體阻斷 使用標準夾心形式交叉阻斷測定進行選擇抗體的表位分類/配體阻斷。將對照抗靶標IgG上樣到AHQ感測器上，並用不相關的人IgG1抗體阻斷感測器上未被佔據的Fc結合位點。然後將感測器暴露於100 nM靶抗原（hTIGIT，Creative Biomart），接著暴露於第二抗靶標抗體或配體（抗TIGIT抗體和CD155或CD113或CD112）。使用ForteBio的資料分析軟體7.0處理資料。抗原締合後第二抗體或配體的另外結合表明未被佔據的表位（非競爭者），而無結合則表明表位阻斷（競爭者或配體阻斷）。測試親本抗體（優化前）與天然配體的競爭，表6總結了針對CD155、CD112和CD113競爭所獲得的資料。發現親本克隆26432不與CD155競爭TIGIT的結合。所有其他所選抗TIGIT抗體與天然配體競爭結合重組人TIGIT蛋白。表 6 ：未優化抗 TIGIT 抗體的針對 TIGIT 天然配體的分類分析
B. 抗 TIGIT 拮抗性抗體與 CD155 在 Jurkat-hTIGIT 上的競爭 收集過表達人TIGIT的Jurkat細胞（Jurkat-hTIGIT），以105 個細胞/孔分配，並在37℃下在完全培養基中與以下濃度的抗人TIGIT抗體一起孵育45分鐘：166.6；53.24；17.01；5.43；1.73；0.55；0.17；0.05；0.01；5.78x10-3 ；1.85x10-3 ；5.9x10-3 nM。洗去過量的抗體，然後將細胞與5 µg/ml的CD155-His（Creative Biomart，PVR-3141H）在37℃孵育45分鐘。然後，使用抗His標籤-PE（Biolegend，362603，每次測試2 µl）檢測結合的CD155-His，在4℃孵育30分鐘。使用BD LSRFortessa 藉由FACS分析細胞，並基於幾何平均螢光計算阻斷CD155結合的半濃度（IC50 ）。
結果如下：對於克隆29489為0.101 nM；對於克隆29494為0.07 nM；對於克隆29520為0.102 nM，並且對於克隆29527為0.078 nM，結果在圖7中示出。其他測試抗體的值總結在下表7中。總之，該結果證明了測試的拮抗性抗TIGIT抗體與CD155的強烈競爭結合膜表達的TIGIT。表 7 ：人 TIGIT 上 CD155 競爭的 IC50 數據 實施例 6 ：疏水相互作用色譜的表徵（ MAbs.2015 年 5-6 月； 7(3):553–561 ）
使用Zeba 40 kDa 0.5 mL旋轉柱（Thermo Pierce，目錄號87766）將抗TIGIT IgG1抗體樣品緩衝交換到pH 6.5的1 M硫酸銨和0.1 M磷酸鈉中。在Dionex ProPac HIC-10柱上建立鹽梯度，從1.8 M硫酸銨，0.1 M磷酸鈉（pH 6.5）至不含硫酸銨的相同條件。梯度以0.75 ml/min的流速運行17分鐘。在運行結束時添加乙腈洗滌步驟以除去任何殘餘的蛋白質，並在下一個注射迴圈之前將柱用7個柱體積重新平衡。在A280吸光度下監測峰保留時間，並基於梯度和流速計算洗脫時的硫酸銨濃度。表8總結了15種所選抗TIGIT抗體的結果。表 8 ：所選抗 TIGIT 抗體的疏水相互作用色譜分析 實施例 7 ：多特異性試劑 PSR 製備物的表徵
A. 多特異性試劑的製備： 根據Xu等，mAbs 2013製備多特異性試劑（PSR）。簡單地說，使用2.5升CHO-S細胞作為起始材料。將細胞在填充至400 mL的在500 mL離心瓶中以2,400×g沉澱5分鐘。合併細胞沉澱，然後重懸於25 ml緩衝液B中，並以2,400×g沉澱3分鐘。傾析緩衝液並重複洗滌一次。使用polytron均化器將細胞沉澱重懸浮於3×沉澱體積的含有1×蛋白酶抑制劑（Roche，cOmplete，無EDTA）的緩衝液B中，將細胞保持在冰上。然後將勻漿以2,400×g離心5分鐘，保留上清液並再沉澱一次（2,400×g/5分鐘）以確保除去未破碎的細胞、細胞碎片和細胞核；所得上清液是總蛋白製備物。然後將上清液轉移到兩個Nalgene Oak Ridge 45 mL離心管中，並在4℃以40,000×g沉澱40分鐘。然後將含有分離的細胞溶質蛋白（SCP）的上清液轉移到乾淨的Oak Ridge管中，再以40,000×g離心一次。平行地，保留含有膜級分（EMF）的沉澱，並在40,000離心20分鐘以除去殘留的上清液。然後用緩衝液B沖洗EMF沉澱。然後將8 mL緩衝液B加入到膜沉澱中以移出沉澱並轉移到Dounce均化器中。待沉澱均質化後，將它們轉移到50 mL錐形管中並代表最終的EMF製備物。
將約106 –107 個細胞/mL的10億哺乳動物細胞（例如CHO、HEK293、Sf9）從組織培養環境轉移到4×250 mL錐形管中，並以550×g沉澱3分鐘。所有後續步驟均用冰冷的緩衝液在4℃下或在冰上進行。用100 mL PBSF（1×PBS+1 mg/mL BSA）洗滌細胞，併合並到一個錐形管中。除去上清液後，然後將細胞沉澱重懸於30 mL緩衝液B（50 mM HEPES，0.15 M NaCl，2 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM MgCl2，10％甘油，pH 7.2）中，並以550×g沉澱3分鐘。傾析緩衝液B上清液，將細胞重懸於3×沉澱體積的緩衝液B加2.5×蛋白酶抑制劑（Roche，cOmplete，無EDTA）中。從此處開始包括緩衝液B中的蛋白酶抑制劑。將細胞均質化4次30秒脈衝（Polyton均化器，PT1200E），並將膜級分在4℃以40,000×g沉澱1小時。用1 mL緩衝液B沖洗沉澱物；保留上清液並代表s。將沉澱轉移到具有3 mL緩衝液B的Dounce均化器中，並藉由緩慢上下移動研杵30-35次進行重懸。將富集的膜級分（EMF）移入新的收集管中，沖洗研杵以收集所有潛在的蛋白質。使用Dc-蛋白測定試劑盒（BioRad）確定純化的EMF的蛋白濃度。為了溶解EMF，轉移到增溶緩衝液（50 mM HEPES，0.15 M NaCl，2 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM MgCl2，1％正十二烷基-b-D-麥芽吡喃糖苷（DDM），1×蛋白酶抑制劑，pH 7.2）中至終濃度為1 mg/mL。將混合物在4℃旋轉過夜，然後在50 mL Oak Ridge管（Fisher Scientific，050529-ID）中以40,000×g離心1小時。收集代表可溶性膜蛋白（SMP）的上清液，並如上所述定量蛋白產率。
對於生物素化，根據製造商的方案（Pierce，Thermo Fisher）製備NHS-LC-生物素原液。簡單地說，每1 mg EMF樣品添加20 ul生物素試劑，並在輕輕攪拌下於4℃孵育3小時。 用緩衝液B將體積調節至25 mL並轉移至Oak Ridge離心管中。將生物素化的EMF（b-EMF）以40,000×g沉澱1小時，並在不干擾沉澱的情況下用3 mL緩衝液C（緩衝液B減去甘油）沖洗兩次。去除殘留溶液。如前所述，將沉澱用Dounce均化器在3 mL緩衝液C中重懸。重懸的沉澱現在代表生物素化的EMF（b-EMF），並如上所述溶解以製備b-SMP。
B. PSR 結合分析： 通常如WO2014/179363中所述進行PSR分析。簡單地說，為了表徵在酵母上呈遞的單克隆抗體的PSR譜，將200萬個IgG呈遞酵母轉移到96孔測定板中並以3000×g沉澱3分鐘以除去上清液。將沉澱重懸於50 ul新鮮製備的b-PSR原液的1:10稀釋液中，並在冰上孵育20分鐘。用200 ul冷PBSF洗滌細胞兩次，並將沉澱重懸於50 ul的次級標記混合物（Extravidin-R-PE，抗人LC-FITC和碘化丙錠）中。將混合物在冰上孵育20分鐘，然後用200 ul冰冷的PBSF洗滌兩次。將細胞重懸於100 ul冰冷的PBSF中，並使用HTS樣品注射器在FACS Canto（BD Biosciences）上跑板。分析流式細胞術資料的R-PE通道中的平均螢光強度，並相對於適當的對照歸一化以評估非特異性結合。表9總結了針對15種所選抗TIGIT抗體所獲得的多特異性試劑結合的結果，其確認了大多數克隆的低得分。表 9 ：多特異性試劑的分析 實施例 8 ：來自健康人 PBMC 的免疫群體上 TIGIT 表達的表徵
A. T 細胞亞群上的 TIGIT 表達譜 進行流式細胞術分析以評估從健康個體新鮮分離的PBMC中的免疫細胞亞群 上TIGIT的表達。綴合的抗體購自Ebioscience/Thermo Fisher Scientific，BioLegend或BD Biosciences。使用過濾的FACS緩衝液（PBS + 2 mM EDTA + 0.1％ BSA）和Brilliant Stain緩衝液（BD＃563794）按照製造商的說明對細胞進行染色。在染色之前用合適的人FcBlock（BD＃564220）封閉細胞，並在採集之前使用IC固定緩衝液（eBioscience＃00-8222-49）固定。在FACS Fortessa（BD Biosciences）上進行採集，並用FlowJo軟體（FlowJo，LLC）進行分析。在前向和側向散射上圈選活細胞。圈選以下的多種免疫細胞子集：CD19+ （B細胞）、CD3- CD19- CD14+ （單核細胞）、CD3+ TCRab- （TCRgd T細胞）、CD3+ TCRab+ （TCRab T細胞）、CD3- CD19- CD14- HLA-DR- CD56低 / 高 （NK細胞）、CD3- CD19- CD14- HLA-DR+ （樹突狀細胞）、CD3+ TCRab+ CD4+ CD127低 CD25+ （調節性T細胞）、CD3+ TCRab+ CD4+ 或CD8+ CD45RO- CCR7+ （CD4或CD8初始T細胞）、CD3+ TCRab+ CD4+ 或CD8+ CD45RO+ （記憶T細胞）以及CD45RO- CD62L- （效應T細胞）。
如圖8A和8B所示，TIGIT優先在NK細胞、調節性T細胞和CD8記憶T細胞上表達。其在其他T細胞亞群中存在較少，其中低比例的初始T細胞顯示出TIGIT表達。此外，TIGIT不在單核細胞、樹突狀細胞和B細胞上表達（圖8B）。這組資料與公佈的資料一致（Yu等NI 2008和Wang等EJI 2015）。實施例 9 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體的細胞結合
A. 抗 TIGIT 抗體與 Jurkat-hTIGIT 和 Jurkat-mTIGIT 的結合 使用用人TIGIT轉導的Jurkat E6.1細胞（Jurkat hTIGIT）或小鼠TIGIT轉導的Jurkat E6.1細胞（Jurkat-mTIGIT）測量人抗TIGIT抗體的親和力。為了分析所選抗體對hTIGIT或mTIGIT的親和力，每孔分配105 個細胞，並與以100 nM的單劑量的抗TIGIT抗體（表3）或濃度降低（166.6；53.24；17.01；5.43；1.73；0.55；0.17；0.05；0.01；5.78×10-3 ；1.85×10-3 ；5.9×10-3 nM）的所選抗體一起孵育（圖9）。將抗體與細胞在4℃下在FACS緩衝液中孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 µg/ml）在冰上孵育20分鐘並洗滌兩次。使用LSR BD Fortessa分析幾何平均螢光強度。對於每種抗體，將細胞結合記錄為與未轉染的細胞系相比，轉染細胞系上PE的中值螢光強度（表3）。為了計算EC50 結合，在Prism中使用四變數曲線擬合方程計算與hTIGIT-Jurkat的半數最大結合濃度（EC50 ），並且獲得的值如下：對於克隆29489為0.082 nM；對於克隆29494為0.07 nM；對於克隆29520為0.119 nM並且對於克隆29527為0.05 nM，資料在圖9中所示。結果證明了所測試的抗TIGIT抗體與膜表達的人TIGIT強烈結合。
B ．抗 TIGIT 拮抗性抗體與人原代 T 細胞的結合 分析來自健康志願者的分離的人PBMC與拮抗性抗TIGIT抗體的結合。細胞以每孔5×105 個細胞分配。將細胞與抗CD16（克隆3G8，BioLegend 302002）、CD32（克隆FLI8.26，BD Bioscience 557333）和CD64（BD Bioscience 555525）在室溫下孵育10分鐘，並且直接添加FACS緩衝液中以下終濃度的指定的抗人TIGIT抗體：12.65；4；1.26；0.40；0.126；0.040；0.12和4x10-3 nM，並在4℃孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 μg/ml）在4℃孵育20分鐘。然後，對於圖10A和10B的結果，洗滌細胞並與以下抗體和LVD混合物一起孵育：抗CD4-PercP-Cy5.5（克隆A161A1，BioLegend 357414）；抗CD8-BV510（克隆SK1，BD Bioscience 563919）和LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）。對於圖10C，洗滌細胞並與以下抗體和LVD混合物一起孵育：LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）、抗TCRab-PercP-Cy5.5（克隆IP26，Biolegend 306723）、抗CD4-BV510（克隆SK3，BD Horizon 562970）、抗CD8-APC-Cy7（克隆SK1，Biolegend 344714）、抗CD25-BV605（克隆2A3，Biolegend 562660）、抗CD127-APC（A019D5，Biolegend 351316）、抗CCR7-BV421（克隆G043H7，Biolegend 353207）和抗CD45RO-PE-Cy7（克隆UCHL1，Biolegend 304229）。
使用圈選的LVD- CD8+ T細胞上陽性TIGIT染色細胞的％來計算與CD8+ 人原代T細胞結合的EC50 值（圖10A和10B）。使用圈選的LVD- TCRab+ CD45RO+ CD8+ T細胞（對於記憶CD8+ T細胞）或圈選的LVD- TCRab+ CD127lo CD25hi CD4+ T細胞（針對Treg）上陽性TIGIT染色細胞的％計算與人記憶CD8+ 或Treg原代T細胞結合的EC50 值，並且示出在圖10C中。
如圖10A所示，與總人CD8+ T細胞結合的EC50 值如下：對於克隆29489為0.123 nM；對於克隆29520為0.181 nM，並且對於克隆29527為0.253 nM。進行了29489和31282之間（29489突變體在殘基116上具有M至T的突變）的直接比較，並且EC50 值分別為0.057 nM和0.086 nM，表明了2種克隆對於人原代CD8+ T細胞具有強且相似的結合效力（圖10B）。獲得的與記憶CD8+ T細胞和Treg結合的EC50 值分別為0.039 nM和0.03 nM，表明對兩個群體具有強且相似的親和力（圖10C）。
C. 抗 TIGIT 拮抗性抗體與食蟹猴原代 T 細胞的結合 來自食蟹猴（Macaca fascicularis ）的分離的PBMC獲自BioPRIM。將細胞解凍並使用用於非人靈長類動物的T細胞活化/擴增試劑盒（Miltenyi Biotec）按照製造商的說明以1:2（珠:細胞比率）進行刺激。第二天，收集細胞，計數並以每孔5×104 個細胞分配。將細胞與抗CD16（克隆3G8，BioLegend 302002）、CD32（克隆FLI8.26，BD Bioscience 557333）和CD64（BD Bioscience 555525）在室溫下孵育10分鐘，並且直接添加FACS緩衝液中以下終濃度的所選抗人TIGIT抗體：12.65；4；1.26；0.40；0.126；0.040；0.12和4×10-3 nM，並在4℃孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 μg/ml）在4℃孵育20分鐘。然後，對於圖11A和11B中所示資料，洗滌細胞並與以下抗體和LVD混合物一起孵育：抗CD4-PercP-Cy5.5（克隆A161A1，BioLegend 357414）；抗CD8-BV510（克隆SK1，BD Bioscience 563919），CD69-APC-Cy7（克隆FN50，BioLegend，310914）和LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）。使用BD LSR Fortessa 藉由FACS分析染色的細胞。使用圈選的LVD- CD69+ CD8+ T細胞上陽性TIGIT染色細胞的％計算結合的EC50 值。如圖11所示，與食蟹猴CD8+ T細胞結合的EC50 值如下：克隆29489為0.487 nM，克隆29520為1.73 nM並且克隆29527為0.378 nM。還比較了克隆29489和31282（其中29489突變體在殘基116上具有M至T的突變），EC50 值分別為0.25 nM和0.26 nM，如圖11B中所示，表明2種克隆對食蟹猴原代CD8+ T細胞具有相似且強的親和力。實施例 10 ：拮抗性抗 TIGIT 活性的體外功能表征
A. 對 CHO-TCR-CD155 和 Jurkat-hTIGIT 共培養物的 TIGIT 生物測定 為了表徵阻斷人TIGIT受體的功能結果，我們將表達hTIGIT和在與TCR接合時活化的螢光素酶報告蛋白的Jurkat細胞（來自Promega的解凍使用的TIGIT效應細胞）和經改造以表達人CD155和TCR啟動物的CHO-K1細胞系（來自Promega的解凍使用的CD155 aAPC/CHO-K1）共培養。過表達TIGIT的Jurkat細胞的活化可以藉由在Jurkat細胞上的TCR接合時與表達CD155的CHO-K1細胞的接觸來誘導，並且可以在拮抗性抗TIGIT抗體的存在下提高。為了比較不同抗體提高Jurkat細胞活化的效力，在提高的抗體濃度存在下進行實驗並計算EC50 值。
根據製造商的建議，將解凍使用的CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞接種，並在37℃，5％CO2培養箱O/N中孵育。第二天，根據製造商的建議，將解凍使用的TIGIT效應細胞（Promega，CS198811）添加到含有新鮮全培養基的CD155 aAPC/CHO-K1細胞板中，新鮮全培養基具有133 nM的抗TIGIT抗體（圖12A）或提高濃度（0.22；0.54；1.36；3.41；8.53；21.3；53.3；133.33和333 nM）的抗TIGIT抗體（圖12B），並在37℃，5％CO2下孵育6小時。
孵育6小時後，藉由使用Bio-GloTM 螢光素酶測定系統（Promega，G7941）測量螢光素酶活性來評估TIGIT效應細胞的活化。
圖12A顯示與同種型對照相比，添加所選克隆對螢光素酶信號的影響。資料證明了那些導致Jurkat-hTIGIT細胞更強活化的抗體的拮抗活性。表10總結了相對於同種型對照克隆（03847），對於不同抗TIGIT抗體獲得的螢光素酶表達的倍數變化誘導。表 10 ：相對於同種型對照的倍數變化誘導
如圖12B所示，用0.22 nM至333 nM的抗TIGIT抗體評估Jurkat-hTIGIT細胞活化，給出了以下EC50 值：對於克隆29489為3.0 nM；對於克隆29494為4.4 nM；對於克隆29520為2.3 nM並且對於克隆29527為32 nM；對於克隆32919為2.7 nM且對於克隆32931為3.2 nM，證明了連續阻斷TIGIT抑制信號傳導的強功能活性。還比較了克隆29489和31282（29489突變體在殘基116上具有M至T突變），EC50 值分別為4.3 nM和8.1 nM，如圖12C中所示，表明2個克隆的相似的功能活性。
B. 基於人原代 CD8+ T 細胞的功能測定 為了表徵阻斷人TIGIT受體的功能結果，我們將來自健康人供體的PBMC的人原代CD8+ T細胞與經改造以表達人CD155和活化人T細胞的CHO-K1細胞系共培養。我們觀察到，藉由用抗TIGIT拮抗性抗體阻斷hTIGIT，可以提高在經改造的表達CD155的CHO-K1細胞的存在下由CD8+ T細胞的IFNg釋放。為了比較這些抗體提高IFNg釋放的效力，在提高的抗體濃度存在下進行實驗並計算EC50 值。
根據製造商的建議將解凍使用的CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞接種在U形底96孔板中，並在37℃，5% CO2培養箱O/N中孵育。第二天，根據製造商的建議，藉由使用陰性選擇試劑盒（Stemcell Technologies，17953）從分離自健康供體的總血液的冷凍人周邊血液單核細胞（Immunehealth）中純化CD8+ T細胞。然後將經純化的CD8 T細胞與提高的濃度（0.11 nM，0.33 nM，1.06 nM，3.3 nM，10.6 nM，33.3 nM，105.5 nM和333 nM）的抗體（100.000個CD8 T細胞/100 ul含有抗體的完全培養基）一起孵育1小時。之後，將抗體-CD8混合物添加到含有50 µl新鮮全培養基的CD155 aAPC/CHO-K1細胞板中，並在37℃，5% CO2下孵育5天。最後，使用根據製造商的建議進行的ELISA測定（Affymetrix eBioscience，88-7316-86）評估細胞上清液中的IFNg濃度。
如圖13A所示，與同種型對照相比，所有抗TIGIT抗體均提高IFNg分泌。對於克隆29489觀察到最高的提高（6.4倍），然後是29494（5.8倍）、29520（5.4倍）、29499（5.2倍）、29527（4.5倍）和29513（3.2倍）。
還進行了劑量範圍研究（0.22 nM至333 nM的抗TIGIT抗體）以評估人原代CD8 T細胞的IFNg分泌的提高的EC50 值。如圖13B所示，抗TIGIT抗體29489顯示出最佳活性，EC50 為3.5 nM，接著是克隆29527 EC50 =5.1 nM）、克隆29494（EC50 =6.1 nM）和克隆29520（EC50 =11.1 nM）。最後，平行測試了克隆29489及其突變體31282，並證明了相似的活性，EC50 值分別為0.49 nM和0.50 nM（圖13C）。總之，這些資料證明了拮抗性抗TIGIT抗體阻斷CD8+ 人T細胞中的TIGIT抑制信號和提高效應功能的強功能活性，如藉由IFNg產生的強烈提高所表徵的。
C. 人 TIL 功能測定 為了表徵阻斷來自癌症患者的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）上的人TIGIT受體的功能結果，我們將來自卵巢腹水患者的TIL的人原代CD8+ T細胞與經改造以表達人CD155和活化人T細胞的CHO-K1細胞系共培養。我們觀察到，藉由用抗TIGIT拮抗性抗體阻斷hTIGIT，可以提高在經改造的表達CD155的CHO-K1細胞的存在下由CD8+ T細胞的IFNg釋放。
根據製造商的建議將解凍使用CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞接種在U形底96孔板中，並在37℃，5% CO2培養箱O/N中孵育。第二天，根據製造商的建議，藉由使用陰性選擇試劑盒（Stemcell Technologies，17953）從分離自卵巢腹水的冷凍人TIL（Immunehealth）中純化CD8 T細胞。然後將經純化的CD8+ T細胞與抗TIGIT抗體克隆26452（克隆29489和31282的未優化親本）（100,000 CD8+ T細胞/100 µl含有抗體的完全培養基）孵育1小時。之後，將抗體-CD8混合物添加到含有50 ul新鮮全培養基的CD155 aAPC/CHO-K1細胞板中，並在37℃，5% CO2下孵育5天。
最後，使用根據製造商的建議進行的ELISA測定（Affymetrix eBioscience，88-7316-86）評估細胞上清液中的IFNg濃度。如圖14所示，當將抗TIGIT抗體添加至共培養物時，IFNg分泌提高了差不多2倍。這些資料證明了拮抗性抗TIGIT抗體阻斷CD8+ 人TIL中的TIGIT抑制信號和提高腫瘤環境中T細胞的效應功能的強功能活性。實施例 11 ：在小鼠中具有功能活性的抗 TIGIT 拮抗性抗體的表徵
A ．用於替代品抗 TIGIT 拮抗性抗體的小鼠 CD155 競爭測定 對於該測定，使用經改造以過表達小鼠TIGIT的Jurkat細胞（Jurkat-mTIGIT）（克隆E6-1，ATCC TIB-152）。抗TIGIT抗體26493用作替代品，因為該抗體顯示出對小鼠TIGIT的交叉反應性以及與人TIGIT的結合。將細胞在37℃下與25 μl完全培養基（RPMI+10％FBS）中的不同濃度的抗TIGIT抗體克隆26493（0.03至10 µg/ml）預孵育45分鐘。將細胞洗滌一次，並在培養箱中與50 μl完全培養基中的4 μg/ml小鼠CD155-His-Fc標籤蛋白（Thermo Fisher，50259M03H50）孵育45分鐘。將細胞洗滌一次，並在4℃下用PE-抗His抗體（Biolegend，362603）染色30分鐘。藉由FACS測量的中值螢光強度（MFI）用作CD155與Jurkat-mTIGIT結合的量度。圖15A顯示抗TIGIT克隆26493對CD155競爭的劑量-回應曲線，確定了IC50 為2.3 nM（上虛線代表來自同種型的信號，下虛線代表來自沒有CD155的細胞的信號）。這些結果證明了抗TIGIT抗體與CD155配體競爭小鼠TIGIT的功能效力。
B. 小鼠功能體外測定：抗原特異性細胞毒性（ OT-I ） 為了評估OT-I CD8+ T細胞對OVA脈衝靶細胞的抗原特異性細胞毒活性以及抗TIGIT抗體在該測定中的作用，藉由機械解離從C57BL/6-Tg(TcraTcrb) 1100Mjb/Crl小鼠（Charles River）的脾分離OT1細胞，然後使用EasySep™小鼠T細胞分離試劑盒（Stemcell，目錄號19851）對小鼠T細胞進行陰性選擇。作為抗原呈遞細胞，將天然表達CD155的PanO2癌細胞用絲裂黴素C（25μg/ml）處理，隨後用OVA-肽（S7951-1MG，Sigma Aldrich，1 μg/ml，在37℃下1小時）脈衝。將CD8+ T細胞和PanO2在133 nM的抗TIGIT克隆26493或同種型對照存在下共培養3天。在第3天，收集上清液用於藉由ELISA檢測IFNg（圖15B）和T細胞用於細胞毒測定（圖15C）。作為靶細胞，使用OVA脈衝的PanO2。根據製造商的說明，分別用CFSE（C1157，ThermoFisher）和CellTrace™ Far Red細胞增殖試劑盒（C34564，ThermoFisher）標記靶細胞和未脈衝Pan02細胞（非靶標內部對照）（各1×106 ）。將這些細胞混合（1:1比率）並以每孔2×104 個平板接種。以1×105 個細胞/孔（效應細胞）添加經刺激的OT-1 CD8+ T細胞，得到在133 nM的抗-TIGIT克隆26493或同種型對照存在下10:1的效應物與靶標比率。24小時後，用PBS洗滌細胞並藉由胰蛋白酶消化升起細胞。然後將細胞用活/死可固定紫色死細胞染色試劑盒（Molecular Probes，L34955）染色。然後藉由流式細胞術監測活靶細胞與非靶細胞的比例的變化來測量靶細胞的細胞毒性殺傷。
圖15B顯示抗TIGIT抗體使IFNg產生提高差不多2倍，而圖15C顯示小鼠OT-I CD8+ T細胞的細胞毒活性提高約60％。總之，這些結果證實了抗TIGIT抗體提高小鼠CD8+ T細胞效應功能的功能活性。實施例 12 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體在單一療法中和與抗 PD1 抗體組合時在小鼠模型中的抗腫瘤活性
A ．單一療法中抗 TIGIT 拮抗性抗體的體內抗腫瘤活性 對於該實驗，在小鼠IgG2a同種型的哺乳動物細胞中產生抗TIGIT克隆26493。對8週齡的雌性Balb/c小鼠皮下接種500,000個CT26結腸癌細胞（ATCC® CRL-2638™）。在接種後第9天，當腫瘤體積平均約為45 mm3 時，將小鼠隨機分在具有相等腫瘤體積的處理組中（每組n=8）。在第9天、第12天和第15天，藉由腹膜內注射用200μg抗TIGIT或同種型對照（mIgG2a，BioXcell），或200μg抗PD-1（RMP1-14，BioXcell）和200μg同種型對照（mIgG2a，BioXcell），或200μg抗PD-1（RMP1-14，BioXcell）和不同濃度的抗TIGIT（200μg、60μg、20μg）在第9天、第12天和第15天腹膜內注射小鼠。監測腫瘤生長並從第9天到第36天每週三次用電子卡尺測量腫瘤體積。當腫瘤體積超過2000 mm3 時處死小鼠。藉由線性混合模型統計分析腫瘤生長曲線。藉由測試時間*處理組的相互作用來評估處理組之間的差異。為了測試抗TIGIT和抗PD-1之間的協同作用，藉由兩個變數的組合記錄處理組：抗TIGIT（是/否）和抗PD-1（是/否）。除了每種處理的加性作用（抗TIGIT*時間和抗PD-1*時間）之外，藉由測試抗TIGIT*抗PD-1*時間的相互作用項來評估協同作用。
圖16A顯示了每組的中值腫瘤生長曲線以及單一療法中用抗TIGIT抗體處理的小鼠的個體生長曲線。儘管對照組中，沒有小鼠的腫瘤消退，但是用抗TIGIT處理的2/8只小鼠具有完全回應。在其餘小鼠中，存在明顯的腫瘤生長延遲。在對照組中，沒有小鼠存活超過30天，而在處理組中，7/8只小鼠存活超過30天。
圖16B顯示了每組的中值腫瘤生長曲線以及在單一療法中或與抗TIGIT組合的抗PD1處理的小鼠的個體生長曲線。與抗PD-1單一療法相比，用抗TIGIT+抗PD-1處理的小鼠中腫瘤生長受到顯著抑制（p＜0.0001）。抗TIGIT+抗PD-1的組合實現了協同抗腫瘤效力，其超過了單一療法處理的加性作用（p=0.02）。抗TIGIT（200 ug）與抗PD1抗體的組合導致7/8只小鼠顯示完全回應。抗PD1和較低劑量的抗TIGIT的組合維持了抗腫瘤效力，當抗TIGIT抗體降低至60μg時，8/8小鼠實現完全回應，當抗TIGIT抗體進一步減少至20 μg時，5/8小鼠實現完全回應（圖16C）。這些資料證明了用於處理預先建立的腫瘤時單一療法中（p＜0.0001）或與抗PD1抗體組合（p＜0.0001）時抗TIGIT療法的顯著抗腫瘤效力。實施例 13 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體在單一療法中和與抗 PD1 抗體組合時在小鼠模型中的同種型依賴性抗腫瘤活性。
對於該實驗，在小鼠IgG2a和小鼠IgG1同種型的哺乳動物細胞中產生抗TIGIT克隆26493。對8週齡的雌性Balb/c小鼠皮下接種500,000個CT26結腸癌細胞（ATCC® CRL-2638™）。在接種後第10天，當腫瘤體積平均為約為100 mm3 時，將小鼠隨機分在具有相等腫瘤體積的處理組（每組n=10）。為了評估單一療法，在第10天、第13天和第16天藉由腹膜內注射用200μg抗TIGIT或同種型對照（mIgG2a，BioXcell）處理小鼠。為了評估與抗PD-1的組合，在第10天、第13天和第16天，用200μg抗PD-1（RMP1-14，BioXcell）和200μg同種型對照（mIgG2a，BioXcell）或200μg抗PD-1（RMP1-14，BioXcell）和200μg抗TIGIT的組合藉由腹膜內注射處理小鼠。監測腫瘤生長，並且從第10天至第33天每週三次用電子卡尺測量腫瘤體積。當腫瘤體積超過2000mm3 時，處死小鼠。
圖17A顯示了每組的中值腫瘤生長曲線以及用抗TIGIT抗體單一療法的個體生長曲線，圖17B用於抗TIGIT和抗PD1抗體的組合療法。在單一療法和與抗PD-1的組合二者中，當作為小鼠IgG2a同種型施用時，用抗TIGIT抗體處理導致顯著的抗腫瘤效力（分別為p=0.0001和p=0.009）。然而，抗-TIGIT作為小鼠IgG1同種型未觀察到抗腫瘤效力，這表明Fc受體與mIgG2a的相互作用對於鼠CT26模型中抗TIGIT拮抗性抗體的抗腫瘤活性是重要的。這些資料證明了在用於處理預先建立的腫瘤時，抗TIGIT療法在單一療法或組合中的同種型依賴性抗腫瘤效力。實施例 14 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體體內抗腫瘤活性作用機制的表徵
A. 脾和腫瘤的流式細胞術分析 為了研究拮抗性抗TIGIT抗體的體內作用模式，在單一療法中和與抗PD-1組合的抗TIGIT抗體26493（IgG2a）處理後，藉由流式細胞術分析腫瘤的免疫細胞浸潤。如實施例12所述接種和處理小鼠。第二次處理後兩天，處死小鼠（每組8只小鼠）並收穫腫瘤。用腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotec）解離腫瘤。對於直接離體染色，用活力染料（Molecular Probes，L34955）和Fc-block染色後，用抗CD45、抗CD4、抗CD8和抗FoxP3（均來自eBioscience）對細胞染色。對於離體刺激，將細胞與細胞刺激混合物（eBioscience）和蛋白質轉運抑制劑（eBioscience）一起孵育3小時。然後用抗CD4和抗CD8抗體以及Fc-block染色。在用商業緩衝液（IC固定緩衝液和透化緩衝液）固定和透化後，將細胞用抗IL-10和抗IFNg（均來自eBioscience）染色。在所有圖中，顯示了與相關對照組（單一療法的同種型對照、組合的抗PD-1）相比的百分比變化，其中負值表示與對照組相比的降低，而正值表示升高。
圖18A顯示用抗TIGIT mIgG2a抗體體內治療腫瘤導致CD4+ TIL群體內調節性T細胞的比例與對照組相比降低28％，這在用抗TIGIT mIgG1處理後未觀察到。這表明存在TIGIT+ Treg細胞的消耗，可能解釋了如實施例14中討論的兩種同種型的差異效力。圖18B顯示無CD8+ TIL的消耗，而是觀察到兩種同種型的略微增加（mIgG1與對照相比增加17％，mIgG2a增加16％）。這些發現一起導致用抗TIGIT mIgG2a處理的腫瘤中CD8/Treg比率增加超過50％（圖18C）。對於用抗TIGIT mIgG2a抗體處理的組，瘤內T細胞的功能也得到改善，CD4+ （圖18D）和CD8+ TIL（圖18E）二者的IFNg產生強烈增加。這導致在CD4+ TIL/CD8+ 群體中離體刺激後產生IFN-g的細胞/產生IL-10的細胞的比率強烈提高（圖18F）。
圖18G顯示與抗PD-1單一療法相比，將抗TIGIT mIgG2a與抗PD-1組合導致調節性T細胞減少33％。同樣，對於CD8+ T細胞，情況正好相反，與抗PD-1單一療法相比，mIgG1和mIgG2a同種型的CD8+ T細胞浸潤分別增加22％和28％（圖18H）。總之，對於與抗TIGIT mIgG2a的組合而言，這導致腫瘤中CD8+ TIL與Treg比率增加超過兩倍（圖18I）。此外，抗TIGIT抗體mIgG2a與抗PD-1組合處理表明腫瘤內CD4+ T細胞的Th1與Th2表型的轉變，其中產生IFNg的CD4細胞明顯增加（圖18J），而產生IL-10的CD4細胞減少（圖18K）。與單一療法中用抗PD-1處理的小鼠相比，這導致CD4+ TIL群體中離體刺激後IFNg/IL-10產生性細胞的強烈增加（圖18L）。表 11 ：抗 TIGIT mIgG2a 和載劑處理的小鼠之間差異表達的基因 表 12 ：抗 TIGIT mIgG2a+ 抗 PD-1 和抗 PD1 處理的小鼠之間差異表達的基因
B. 藉由 NanoString 對腫瘤的轉錄組學分析 為了研究抗TIGIT抗體的體內作用模式，藉由轉錄組學分析（Nanostring）分析在單一療法中和與抗PD-1組合中用抗TIGIT處理的腫瘤的免疫細胞浸潤。如實施例12所述接種和處理小鼠。在用抗TIGIT和/或抗PD1抗體進行第三次處理後兩天，處死小鼠並收穫腫瘤。提取RNA並用nCounter技術（PanCancer免疫分析組，Nanostring；由VIB Nucleomics Core進行）直接定量選擇的參與癌症免疫學的770個基因的表達。用nSolver軟體（Nanostring）分析資料。
圖19A顯示了在載劑處理的小鼠和抗TIGIT mIgG2a處理的小鼠之間差異調節的基因的火山圖。高度統計學顯著的基因落在圖的頂部，並且高度差異表達的基因落到任一側（左側：在抗TIGIT處理的小鼠中下調，右側：在抗TIGIT處理的小鼠中上調）。高度上調的基因的實例包括穿孔素、顆粒酶B和CTLA-4。實線表示未校正的p值為0.01，虛線表示校正的p值為0.05（Benjamini-Hochberg校正）。表11和表12分別顯示了抗TIGIT mIgG2a與載劑相比以及aPD-1+抗TIGIT mIgG2a與抗PD1相比，顯著差異表達的基因。當針對免疫細胞的功能子集的得分總結了多個基因時，最顯著的發現是細胞毒細胞和CD8+ T細胞評分的增加（圖19B）。與單獨的抗PD-1相比，用抗PD-1 +抗TIGIT mIgG2a處理的小鼠中存在相同的變化。在用單一療法或與抗PD-1組合的抗TIGIT mIgG1處理的小鼠中未觀察到變化。
總之，這些結果表明，用抗TIGIT抗體體內處理後觀察到的抗腫瘤效力是由腫瘤中Treg浸潤減少而CD8+ 效應T細胞群增加介導的。此外，提高了CD4+ 和CD8+ TIL的效應功能，如藉由產生IFNg的細胞的比例更高、向Th1反應的轉變和對T細胞細胞毒功能重要的基因表達的提高所示出的。實施例 15 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體誘導的抗體依賴性細胞毒性（ ADCC ）活性
A ．來自健康供體的人 PBMC 上的體外 ADCC 將來自健康人供體的分離的PBMC重懸於完全RPMI培養基（補充有10％熱滅活的FBS+50 U青黴素+50 U鏈黴素，並補充有200 IU IL-2/ml）中。在96U孔板中每孔分配2,5×105 人PBMC。將在哺乳動物細胞中產生的抗人TIGIT抗體克隆26452或IgG1同種型對照（Biolegend，403102）以66.6、0.66和0.006 nM的終濃度添加到每個相應的孔中。將細胞在37℃，5% CO2下孵育20小時。然後收集細胞並用以下抗體組染色：LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）、抗-TCRab-PercP-Cy5.5（克隆IP26，Biolegend 306723）、抗CD4-BV510（克隆SK3，BD Horizon 562970）、抗CD8-APC-Cy7（克隆SK1，Biolegend 344714）、抗CD25-BV605（克隆2A3，Biolegend 562660）、抗CD127-APC（A019D5，Biolegend 351316）、抗CCR7-BV421（克隆G043H7，Biolegend 353207）和抗CD45RO-PE-Cy7（克隆UCHL1，Biolegend 304229）。結果顯示在圈選的活細胞上。CD45+ CD4+ 或CD45+ CD8+ 代表總CD4+ 或CD8+ T細胞。CD45+ RO+ CD4+ 或CD45+ RO+ CD8+ 細胞代表記憶CD4+ 或CD8+ T細胞，而CD25hi CD127low CD4+ 代表Treg細胞。圈選的Treg上TIGIT+ 細胞的比例高於在圈選的記憶CD8+ T細胞和CD4+ T細胞上的比例，如圖20A所示。
使用AccuCheck計數珠（Life technologies）按照製造商的說明書進行絕對定量。在計算每µl的絕對細胞數後，使用以下公式計算特異性裂解的％=（1-（26452 TIGIT抗體處理的樣品上每μl的絕對細胞數/無抗體處理的一式三份的平均值））×100。如圖20B所示，抗TIGIT 26452 hIgG1抗體對Treg觸發的特異性裂解（62.22％）高於總CD8+ T細胞（12.2％）或總CD4+ T細胞（16.36％）。
B ．小鼠腫瘤上的離體 ADCC 為了證實抗TIGIT小鼠IgG2a抗體可消耗TIGIT+ 調節性T細胞，建立了離體ADCC測定。對8週齡的雌性Balb/c小鼠皮下接種500,000個CT26結腸癌細胞（ATCC® CRL-2638™）。接種三週後，收穫腫瘤並用腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotec）解離。將單細胞懸浮液與133 nM抗TIGIT抗體26493（mIgG1或mIgG2a同種型）一起孵育20小時（1百萬細胞/200 µl RPMI+10％FBS中）。20小時後，用活力染料（Molecular Probes，L34955）和Fc-block染色後，用抗CD4、抗TIGIT、抗CD8和抗FoxP3抗體（均來自eBioscience）對細胞染色。
圖21顯示對於不同TIGIT+ 免疫子集，與同種型對照處理相比絕對TIGIT+ 細胞計數的％降低。抗TIGIT mIgG2a抗體處理後的最強降低在調節性T細胞中明顯（約40％的降低），表明這些細胞比常規CD4+ 或CD8+ T細胞更易受ADCC影響。
總之，這些結果證明了抗TIGIT hIgG1或mIgG2a消耗TIGIT+ 免疫細胞的效力，其在Treg群體上證明了更強的活性。實施例 16 ：使用電腦分析的免疫原性預測
使用EpiMatrix蛋白質評分（De Groot等，（2009）Clinical Immunol. 131:189）藉由電腦預測評估克隆29494和29489及其變體31282的免疫原性潛力。為了完成該分析，將輸入序列解析為重疊的9聚體框架，並且關於一組八個常見的II類HLA等位基因評估每個框架。這些等位基因是“超類型”。每一個在功能上等同於或幾乎等同於許多其他等位基因“家庭成員”。總的來說，這8個超類型等位基因及其各自的家族成員“覆蓋”了超過95％的人口（Southwood等，（1998）J. Immunol 160:3363）。每個框架逐個等位基因的“評估”陳述了預測的HLA結合親和力。EpiMatrix評估分數從約-3至+3，並且是正常分佈的。EpiMatrix評估分數高於1.64被定義為“命中”；也就是說，具有潛在的免疫原性並值得進一步考慮。
在所有其他因素相同的情況下，給定蛋白質中包含的HLA配體（即EpiMatrix命中）越多，蛋白質誘導免疫反應的可能性越大。EpiMatrix蛋白質評分是預期在給定大小的蛋白質中發現的預測T細胞表位元的數目與EpiMatrix系統預測的推定表位元的數目之間的差異。EpiMatrix蛋白質評分與觀察到的免疫原性相關。EpiMatrix蛋白質評分是“歸一化的”，可以根據標準化比例繪製。“平均”蛋白質的EpiMatrix蛋白質評分為零。EpiMatrix蛋白質評分高於零 表明存在過量的MHC配體並且表示更高的免疫原性潛力，而得分低於零 表明存在比預期更少的潛在MHC配體並且具有更低的免疫原性潛力。評分高於+20的蛋白質被認為具有顯著的免疫原性潛力。
調節性 T 細胞表位的存在的調整 抗體是獨特的蛋白質，因為其可變結構域（特別是其互補決定區（CDR））的氨基酸序列可以在非常大的程度上變化。正是這種可變性使得抗體能夠識別廣泛種類的抗原。然而，控制抗體熟化的重組和突變事件也可以產生新的或新T細胞表位。這些新表位對於迴圈T細胞來說可表現為“外來的”。抗體序列中新表位的存在可導致形成人抗人抗體反應；也稱為HAHA反應或ADA（抗藥物抗體）。
調節性T細胞在抑制對外周的完全人蛋白，包括含有突變和/或高度可變序列如抗體CDR的那些蛋白的免疫反應中起重要作用。調節性T細胞藉由調節性T細胞表位進行接合和活化。與抗體序列中新表位的存在相關的固有風險似乎藉由天然存在的調節性T細胞表位的存在來平衡。
藉由篩選許多人抗體分離物的序列，EpiVax已經鑒定了數種高度保守的HLA配體，其被認為具有調節潛力。實驗證據表明，在大多數物件中，這些肽中的許多實際上是有致耐受活性的（actively tolerogenic）。這些高度保守的、調節性且混雜的T細胞表位目前稱為Tregitopes（De Groot等（2008）Blood 112:3303）。
在許多情況下，在存在大量Tregitope的情況下，可以有效地控制人源化抗體中包含的新表位的免疫原性潛力。出於抗體免疫原性分析的目的，EpiVax已經開發了經Tregitope調整的EpiMatrix評分和相應的抗治療性抗體反應預測。為了計算經Tregitope調整的EpiMatrix評分，從EpiMatrix蛋白質評分中扣除Tregitopes的評分。已顯示經Tregitope調整的評分與一組23種商業抗體的觀察到的臨床免疫反應良好相關（De Groot等，（2009）Clinical Immunol. 131:189）。
克隆29489、29494和31282抗體序列評分在EpiMatrix量表的低端，表明有限免疫原性的潛力。對於抗體克隆29489和31282，許可的單克隆抗體的回歸分析預測約0％的暴露患者中的ADA響應。對於克隆29494，分析預測基線VH序列中2.78％的暴露患者中的ADA響應，變體VH序列則為2.88％。資料總結在下表13中。表 13 ： EpiMatrix 和 Tregitope 調整的 EpiMatrix 評分 實施例 17 ：抗 TIGIT 克隆與重組人 TIGIT 蛋白結合的親和力測定
將抗體31282與其他專利申請中描述的抗TIGIT抗體克隆進行比較。具體地，將31282與以下進行比較：4.1D3.Q1E（也稱為4.1D3，來自WO2017/053748）；22G2（來自WO2016106302）；31C6（來自WO2016/028656）；313M2（來自WO2016/191643）；以及TIG1（來自WO2017/152088）。比較的抗體克隆的參考和序列在下表14中示出：表 14 ：比較性抗 TIGIT 抗體的 VH 和 VL 結構域序列
A ．在哺乳動物細胞中產生 為了產生足夠量的選擇的a-TIGIT克隆用於進一步表徵，產生編碼特定抗體克隆（克隆31282_up、4.1D3、22G2、31C6、313M32和TIG1）的DNA載體並將其轉導到HEK細胞中以用於生產人IgG1同種型。在Geneart訂購用於抗體可變結構域的人密碼子優化的合成DNA片段。可變結構域序列無縫連接到含有小鼠IgKappa信號序列和各抗體類別恆定區的pUPE表達載體中。藉由限制性分析和DNA測序驗證表達載體。對於暫態轉染，產生無內毒素DNA maxipreps（Sigma），並根據已建立的方案，在Freestyle培養基（ThermoFisherScientific）中將重鏈和輕鏈載體共轉染至HEK293EBNA1細胞。轉染後24小時添加Primatone（0.55％終體積）。轉染後6天收穫條件化培養基。藉由Mabselect sureLX（GE Healthcare）親和色譜分批純化抗體。用含有1M NaCl的PBS和PBS分兩步洗滌結合的抗體。用20 mM檸檬酸鹽150 mM NaCl pH3洗脫抗體，並用1/6體積的1 M K2HPO4/KH2PO4 pH 8中和至約pH 7。
接下來，使用在PBS中平衡的Superdex200柱藉由凝膠過濾進一步純化抗體。藉由NuPAGE分析級分，併合並含有抗體的級分。最終產物經0.22 µM注射器篩檢程式滅菌。藉由NuPAGE分析產物，並藉由LAL測定測量內毒素水準。
此外，按照（克隆31282_wu）在IgG1或IgG4同種型上，還在CHO-K1細胞中產生克隆31282。構建編碼抗體的DNA載體並將其轉染到CHO-K1細胞中。合成用於抗體可變結構域的CHO密碼子優化的DNA片段，並將其連接到含有信號序列和各抗體類別的恆定區的表達載體中。藉由限制性分析和DNA測序驗證表達載體。根據已建立的方案，藉由電穿孔（Bio-rad）將重鏈和輕鏈載體共轉染至CHO-K1細胞。將轉染的培養物按比例放大並接種到補料分批培養基中。分批補料培養14天后收穫條件化培養基。
首先藉由兩個深度過濾階段澄清收穫的細胞培養物，其中D0HC和A1HC（Millipore）串聯連接。然後，首先用MabSelect SuRe（GE Healthcare）藉由親和色譜純化經澄清的收穫物。用含有1 M NaCl和50 mM NaAc-HAc（pH5.5）的50 mM NaAc-HAc（pH 5.5）分兩步洗滌結合的抗體。然後將抗體用50 mM NaAc-HAc（pH 3.5）洗脫，並用1 M Tris-HCl（pH 9.0）中和至約pH 5.5。
接下來，使用POROS HQ50（Life Tech）以流通模式藉由陰離子交換色譜（AEX）進一步拋光中和的中間體。在上樣之前，將柱用50 mM NaAc-HAc（pH 5.5）平衡。在上樣和回收步驟期間收集的AEX流通物使用POROS XS（Life Tech.）藉由陽離子交換色譜（CEX）以結合-洗脫模式進一步拋光。將CEX柱在50 mM NaAc-HAc（pH 5.5）中平衡，並藉由線性梯度洗脫（LGE）洗脫抗體，以達到在10 CV中含有0.5 M NaCl的50 mM NaAc-HAc（pH 5.5）。使用Pellicon 3，ultracel 30 kD，A型（Millipore）進行最終的超濾和透析（UF/DF）以將CEX洗脫液和交換緩衝液濃縮到20 mM His-HCl（pH 5.5）中。然後，將聚山梨酯80（PS80）和蔗糖添加到經過滲濾的樣品中，得到在20 mM His-HCl、0.01％（w/w）PS 80和9％（w/v）蔗糖（pH 5.5）的緩衝液中的最終產物，其濃度約為20 g/L。該產品已通過所有PQA測試。SEC純度、內毒素水準和其他標準均符合要求。
B ． Biacore 測量 使用Biacore T200技術，CM5感測器晶片（在Novalix下運行，France），在25℃下，在HBS-EP緩衝系統（10 mM HEPES pH 7.3，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05% Tween20）中進行生物感測器分析。樣品集保持在8℃。使用標準胺偶聯化學將山羊抗人IgG捕獲抗體（Fcγ 片段特異性，Jackson ImmunoResearch Laboratories）固定（10000 RU）至感測器晶片的兩個流動池。該表面類型提供了在每個再生步驟後可重複捕獲新鮮分析抗體的格式。流動池2用於分析捕獲的抗體，而流動池1用作參照流動池。在運行緩衝液中製備從30至0.123 nM的6種不同的抗原濃度。除了3.33 nM一式兩份外，每個抗原樣品濃度作為單個重複進行。還運行兩次空白（緩衝液）注射並將其用於評估和減去系統假像。所有抗原濃度的結合（300秒）和解離（600秒）階段以30 uL/min的流速進行。藉由三次連續注射（15秒、15秒和60秒）10 mM甘氨酸-HCl（pH 1.5）來再生表面。將獲得的傳感圖全域擬合至1:1模型（假設所有應用濃度具有相同的動力學值）。親和力也由克隆313M32的穩態確定，因為1:1動力學模型擬合不太可靠，在結合時間結束時顯示與人TIGIT的平衡。表15中報告了不同a-TIGIT克隆所獲得的結果。表 15 ：動力學和親和力評估 實施例 18 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體的細胞結合
A ．抗 TIGIT 克隆與 Jurkat-hTIGIT 的結合 使用用人TIGIT（Jurkat hTIGIT）轉導的Jurkat E6.1細胞測量人抗TIGIT抗體的親和力。為了分析所選抗體對hTIGIT的親和力，每孔分配105 個細胞並與降低濃度（8；4；2；1；0.5；0.25；0.125；0.062；0.031；0.016；8×10-3 和4×10-3 nM）的多種抗TIGIT拮抗性抗體克隆一起孵育（圖2）。將抗體與細胞在4℃下在FACS緩衝液中孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 µg/ml）在冰上孵育20分鐘並洗滌兩次。使用LSR BD Fortessa分析螢光強度，並將細胞結合記錄為在其表面表達TIGIT的細胞中PE的中值螢光強度。
在Prism中使用的四變數曲線擬合方程計算對Jurkat-hTIGIT的半數最大結合濃度（EC50 ）。結果如圖22A所示，值總結在下表16中。對於克隆31282，結合Jurkat-hTIGIT的EC50 值非常接近，在HEK細胞（31282_up，0.13 nM）或CHO-K1細胞（31282-wu，0.10 nM）中產生的抗體之間沒有顯著差異。克隆31C6和TIG1也顯示出低於0.2 nM的EC50 值，而其他克隆（4.1D3、22G2和313M32）的親和力更低，結果顯示EC50 值為0.267至0.445 nM。結果證明，抗TIGIT克隆31282、31C6和TIG1與改造系統中膜表達的人TIGIT強烈結合，而其他克隆具有的親和力較低。表 16 ：不同 a-TIGIT 克隆與 Jurkat-hTIGIT 結合的 EC50 資料和比較
B ．抗 TIGIT 克隆與來自健康人 PBMC 的原代 CD8+ T 細胞的結合 分析來自健康志願者的分離的人PBMC與拮抗性抗TIGIT抗體的結合。以每孔1×105 個細胞分配細胞。將細胞與抗CD16（克隆3G8，BioLegend 302002）、CD32（克隆FLI8.26，BD Bioscience 557333）和CD64（BD Bioscience 555525）在室溫下孵育10分鐘，並將指定抗人TIGIT抗體克隆直接添加到FACS緩衝液中，終濃度為8；4；2；1；0.5；0.25；0.125；0.062；0.031；0.016；8×10-3 和4×10-3 nM，並在4℃孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 µg/ml）在4℃孵育20分鐘。然後，洗滌細胞並將其與以下抗體和LVD混合物一起孵育：抗CD4-PercP-Cy5.5（克隆A161A1，BioLegend 357414）；抗CD8-BV510（克隆SK1，BD Bioscience 563919）和LVD efluor 660（eBioscience 65-0864-18）。
使用活TIGIT+ CD8+ T細胞上的MFI信號計算與CD8+ 人原代T細胞結合的EC50 值。結果如圖22B所示，EC50 濃度總結在下表17中。對於克隆31282，結合人原代CD8+ T細胞的EC50 值非常接近，在HEK細胞（31282_up，0.21 nM）或CHO-K1細胞（31282-wu，0.19 nM）中產生的抗體之間沒有顯著差異。拮抗性a-TIGIT抗體的不同克隆之間的比較顯示克隆31282_wu（0.19 nM）和克隆31282_up（0.21 nM）對人原代CD8+ T細胞的結合有最佳EC50 值。克隆31C6和TIG1顯示EC50 的差異為2倍，而克隆22G2、313M32和4.1D3的差異為6.1至9.7倍。總之，31282_wu和31282_up顯示出與人原代CD8+ T細胞上膜表達的TIGIT的最佳結合。表 17 ：不同 a-TIGIT 克隆與人原代 CD8+ T 細胞結合的 EC50 資料和比較
C ．抗 TIGIT 克隆與來自癌症患者 PBMC 的原代 CD8+ T 細胞的結合 分析來自癌症患者的分離的人PBMC與不同的拮抗性抗TIGIT抗體克隆的結合。細胞以每孔1×105 個細胞分配。將細胞與抗CD16（克隆3G8，BioLegend 302002）、CD32（克隆FLI8.26，BD Bioscience 557333）和CD64（BD Bioscience 555525）在室溫下孵育10分鐘，並且將指定抗人TIGIT抗體直接添加到FACS緩衝液中，終濃度為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062和0.031 nM，在4℃孵育20分鐘。洗滌後，將細胞與抗人Ig（Fcγ特異性）-PE（eBioscience，12-4998-82，2.5 μg/ml）在4℃孵育20分鐘。然後，洗滌細胞並與以下抗體和生命活力染料（LVD）混合物一起孵育：抗CD4-PercP-Cy5.5（克隆A161A1，BioLegend 357414）；抗CD8-BV510（克隆SK1，BD Bioscience 563919）和LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）。洗滌並固定細胞，並使用BD LSR Fortessa定量表面染色。使用FlowJo V10.1分析流式細胞術資料。將圈選的LVD- TIGIT+ CD8+ 細胞上的TIGIT MFI用於計算EC50 值。非線性回歸曲線顯示在圖22C中，並且值總結在下表18中。
克隆31282_wu和31282_up對於來自癌症患者的CD8+ T細胞的結合顯示出非常接近的EC50 值，其濃度分別為0.14和0.12 nM。其餘克隆顯示較低的親和力，其中克隆31C6、TIG1和22G2分別顯示出1.5、2.7和3.1倍的較低親和力。與克隆31282_up相比，克隆313M32的測量EC50 值低8.3倍。克隆4.1D3顯示出最低的親和力，與所測試的最佳克隆的差異為9.5倍。表 18 ：不同 a-TIGIT 克隆與來自癌症患者的人原代 CD8+ T 細胞結合的 EC50 資料和比較 實施例 19 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體克隆和 TIGIT 天然配體（ CD155 ）之間的競爭測定
收集過表達人TIGIT（Jurkat-hTIGIT）的Jurkat細胞，以5.104 細胞/孔分配，並與以下濃度 抗人TIGIT抗體一起在完全培養基中在37℃下孵育45分鐘：133.33；42.20；13.33；4.22；1.33；0.422；0.133；0.042；0.0133；4.2×10-3 ；1.3×10-3 ；4.2×10-4 ；1.3×10-4 ；4.2×10-5 nM。洗去過量的抗體，然後將細胞與15 µg/ml的CD155-His（Creative Biomart，PVR-3141H）在37℃孵育45分鐘。然後，使用抗His標籤-PE（Biolegend，362603，每次測試2 µl）檢測結合的CD155-His，在4℃孵育30分鐘。使用BD LSRFortessa 藉由FACS分析細胞，並且基於總細胞中PE的中值螢光強度計算阻止CD155結合的半濃度（IC50 ）。
結果在圖23中示出，並且值總結在下表19中。抗TIGIT克隆31282_wu和31282_up顯示對改造以表達hTIGIT的Jurkat細胞的CD155競爭有最佳IC50 值，濃度分別為0.05和0.04 nM。其他克隆（4.1D3、22G2、31C6、TIG1）的IC50 值為0.07至0.09 nM，而克隆313M32克隆與CD155競爭結合TIGIT的效率低得多（0.65 nM）。表 19 ：不同 a-TIGIT 克隆對人 TIGIT 上 CD155 競爭的 IC50 資料和比較 實施例 20 ：拮抗性抗 TIGIT 克隆的功能表征
A. 使用 Jurkat-hTIGIT 細胞的 TIGIT 功能測定 為了表徵阻斷人TIGIT受體的功能結果，我們將表達hTIGIT和在TCR接合時活化的螢光素酶報告基因的Jurkat細胞（來自Promega的解凍使用CD155 aAPC/CHO-K1）和經過工程改造以表達人PVR/CD155和TCR啟動物的CHO-K1細胞系（來自Promega的解凍使用CD155 aAPC/CHO-K1）共培養。過表達TIGIT的Jurkat細胞的活化可以藉由在Jurkat細胞上TCR接合時與表達CD155的CHO-K1細胞接觸來誘導，並且可以在拮抗性抗TIGIT抗體的存在下提高。為了比較不同a-TIGIT克隆提高Jurkat細胞活化的效力，在提高的抗體濃度存在下進行實驗並計算EC50 值。
根據製造商的建議接種CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞，並在37℃，5％CO2培養箱O/N下孵育。次日，根據製造商的建議，將TIGIT效應細胞（Promega，CS198811）加入到含有具濃度逐漸增加的抗TIGIT抗體（0.03；0.11；0.33；1.06；3.34；10.56；33.38；105.49;和333 nM）的新鮮全培養基的CD155 aAPC/CHO-K1細胞板中，並在37℃，5％CO2下孵育6小時。孵育6小時後，藉由使用Bio-GloTM 螢光素酶測定系統（Promega，G7941）測量螢光素酶活性來評估TIGIT效應細胞的活化。
如圖24A所示並總結於表20中的，在測定中，抗TIGIT抗體31282具有在EC50 值和螢光素酶信號的最大誘導方面的最佳作用。在HEK（31282_up）或CHO-K1（31282_wu）細胞中產生的克隆所觀察到的活性相當，其具有比對照同種型高8倍的最大螢光素酶信號（Bioexcell，BE0297），並且EC50 濃度分別測量為3.3 nM和3.5 nM。作為比較，克隆4.1D3、22G2和31C6具有比同種型對照高5.3至6.7倍的最大活性，這與5至10 nM的EC50 相關。由於在測試濃度下低活性和曲線的不良擬合，無法確定克隆313M32和TIG1的EC50 值（圖24A）。表 20 ：不同 a-TIGIT 克隆對 Jurkat-hTIGIT 細胞功能活性的 EC50 資料和比較 P.F.:不良擬合
B. 來自健康志願者的人原代 CD8+ T 細胞的 TIGIT 功能測定 為了表徵阻斷人TIGIT受體的功能結果，我們將來自健康人供體的PBMC的人原代CD8+ T細胞與經工程改造以表達人PVR/CD155和活化人T細胞的CHO-K1細胞系共培養。我們觀察到，藉由用抗TIGIT拮抗性抗體阻斷hTIGIT，可以使在經改造表達CD155的CHO-K1細胞的存在下CD8+ T細胞的IFNg釋放提高。為了比較這些抗體提高IFNg釋放的效力，在提高的抗體濃度存在下進行實驗並計算EC50 值。
根據製造商的建議將CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞接種在U形底96孔板中，並在37℃，5％CO2培養箱O/N下孵育。次日，根據製造商的建議，使用陰性選擇試劑盒（Stemcell Technologies，17953）從來自從健康供體（Immunehealth）的總血液分離的冷凍人周邊血液單核細胞中純化CD8+ T細胞。然後將純化的CD8T細胞和提高濃度（0.011 nM、0.033 nM、0.11 nM、0.33 nM、1.06 nM、3.3 nM、10.6 nM、33.3 nM和105.5 nM）的抗體加入CD155 aAPC/CHO-K1（100,000個CD8 T細胞/100ul含有抗體的完全培養基）中，並在37℃，5％CO2下孵育5天。最後，使用根據製造商的建議進行的ELISA測定（Affymetrix eBioscience，88-7316-86）在細胞上清液中評估IFNg濃度。
如圖24B所示並總結於表21中的，a-TIGIT克隆31282和4.1D3顯示出最佳的IFNg分泌誘導，其相對於同種型對照抗體分別增加2.7和2.9倍。就測量為0.13nM的EC50 濃度而言，克隆31282具有誘導IFNg產生的最佳作用。與克隆31282相比，克隆31C6顯示2.3倍的EC50 值差異，而克隆22G2和4.1D3的效力低3.1和10.8倍。由於在測試濃度下的低活性低和曲線的不良擬合，因此無法確定克隆313M32的值（圖24B）。表 21 ：不同 a-TIGIT 克隆對人原代 CD8+ T 細胞的功能活性的 EC50 資料和比較
C. 來自癌症患者的人原代 CD3+ T 細胞的 TIGIT 功能測定 為了表徵阻斷來自癌症患者的T細胞上的人TIGIT受體的功能結果，將來自癌症患者的PBMC的人原代CD3+ T細胞與經改造以表達人PVR/CD155和活化人T細胞的CHO-K1細胞系（CHO-TCR-CD155）共培養。我們觀察到，藉由用抗TIGIT拮抗性抗體31282阻斷hTIGIT，可以提高在經改造表達CD155的CHO-K1細胞存在下CD3+ T細胞的IFNg釋放。
根據製造商的建議將CD155 aAPC/CHO-K1（Promega，CS198811）細胞接種在U形底96孔板中，並在37℃，5％CO2培養箱O/N下孵育。次日，根據製造商的建議，使用陰性選擇試劑盒（Stemcell Technologies，17951）從新鮮人周邊血液單核細胞中純化CD3+ T細胞，所述新鮮人周邊血液單核細胞是從24小時前收集的癌症患者（HNSCC）的總血液中分離的（Biopartners）。然後將純化的CD3+ T細胞與66.7 nM抗體加入CD155 aAPC/CHO-K1（100,000 CD3 T細胞/100 ul含有抗體的完全培養基）中，並在37℃，5％CO2下孵育5天。最後，使用根據製造商的建議進行的ELISA測定（Affymetrix eBioscience，88-7316-86）在細胞上清液中評估IFNg濃度。
如圖24C所示，抗體31282誘導強力的功能活性以提高IFNg分泌，證明該a-TIGIT抗體有潛力重新活化來自癌症患者的PBMC T細胞。
D. a-TIGIT 克隆 31282 使來自癌症患者 PBMC 以及解離的腫瘤細胞（ DTC ）的 T 細胞中的細胞內細胞因數的產生提高 在該實施例中，進行細胞內流式細胞術染色以評估來自腎癌癌症患者的新鮮分離的匹配的PBMC和解離的腫瘤細胞（DTC）內腫瘤浸潤的淋巴細胞的T細胞細胞因數產生。對於DTC，將腫瘤機械破碎，然後按照製造商對特定腫瘤類型的說明，用腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotech＃130 095 929）在gentleMACS解離器中旋轉下孵育。在進行細胞內染色之前，將細胞用T細胞刺激珠混合物（Dynabeads，Thermo Fisher）刺激16小時。在刺激的最後3小時期間，將蛋白質轉運抑制劑混合物（eBioscience）和細胞刺激混合物（eBioscience）加入細胞中。綴合抗體購自Ebioscience/Thermo Fisher Scientific，BioLegend或BD Biosciences。使用經過濾的FACS緩衝液（PBS+2 mM EDTA+0.1 ％BSA）和Brilliant Stain緩衝液（BD＃563794）按照製造商的說明進行表面染色。在表面染色之前，用合適的人FcBlock（BD＃564220）封閉細胞。對於細胞內染色，使用BD Cytofix/cytoperm溶液（BD Biosciences）固定並透化細胞。細胞用以下抗體組染色：抗CD45-BB515（克隆HI30，BD Horizon 564585）、抗CD73-BV421（克隆AD2，BD Horizon 562430）、抗CD8a-BV510（克隆SK1，BD Horizon 563919）、抗CD3-BV650（克隆SK7，BD Horizon 563999）、抗IFNγ-BV711（克隆4S.B3，BD Horizon 564793）、抗IL-2-APC（MQ1-17H12，eBioscience 17-7029-82）、抗CD4-APC-R700（克隆RPA-T4，BD Horizon 564975）、LVD efluor 780（eBioscience 65-0865-14）、抗TIGIT-PE（克隆MBSA43，eBioscience E13456-108）、抗CD39-PE-Dazzle594（克隆A1，Biolegend 328224）以及TNFα-PE-cy7（克隆Mab11，eBioscience 25-7349-82）。在FACS Fortessa（BD Biosciences）上進行採集，並用FlowJo軟體（FlowJo，LLC）進行分析。在前向和側向散射上對存活細胞進行圈選。T細胞亞群如下圈選：用於PBMC的CD45+ CD3+ 以及用於DTC的CD45+ CD3+ CD4+ 和CD45+ CD3+ CD8+ 。使用未染色和未刺激的對照對分泌細胞因數的T細胞進行圈選。
圖24D顯示在a-TIGIT克隆31282存在下活化後IL2、IFNg和TNFα的細胞內含量均提高。根據圖24C中所示的資料，在來自PBMC的CD3+ T細胞中觀察到這種提高，但在來自解離的腫瘤細胞的CD4+ 和CD8+ TIL中也觀察到這種提高。這證明了a-TIGIT克隆31282提高來自癌症患者T細胞的PBMC和TIL群體的活化的潛力。實施例 21 ： a-TIGIT 克隆 31282 在來自癌症患者的 PBMC 中誘導 Treg 的優先細胞毒性
在該實施例中，將來自肺癌患者的分離的PBMC重懸於完全RPMI培養基（補充有10％FBS熱滅活+50 U青黴素+50 U鏈黴素）中。在96U孔板中每孔分配2.5×105 個人PBMC。將抗人TIGIT抗體克隆31282、人IgG1同種型對照（BioXcell BE0297）或利妥昔單抗（InvivoGen hcd20-mab1）以6.6 nM的終濃度添加至每個相應的孔。將細胞在37℃，5％CO2下孵育20小時。然後收集細胞並用以下抗體組染色：LVD efluor 520（eBioscience 65-0867-14）、抗TCRab-PercP-Cy5.5（克隆IP26，Biolegend 306723）、抗CD4-BV510（克隆SK3，BD Horizon 562970）、抗CD8-APC-Cy7（克隆SK1，Biolegend 344714）、抗CD25-BV605（克隆2A3，Biolegend 562660）、抗CD127-APC（A019D5，Biolegend 351316）、抗CCR7-BV421（克隆G043H7，Biolegend 353207）以及抗CD45RO-PE-Cy7（克隆UCHL1，Biolegend 304229）。根據圈選的活細胞顯示結果。使用AccuCheck Counting珠（Life technologies）按照製造商的說明進行絕對定量。在計算每μl的絕對細胞數後，使用下式計算特異性裂解的％=（1-（31282 TIGIT抗體處理樣品上每μl的絕對細胞數/對照同種型處理樣品的一式三份的平均值））×100。結果表示為一式三份的特異性裂解的平均％+/-SD。藉由測量在與利妥昔單抗孵育後圈選的CD19+ 細胞上特異性細胞裂解的％來評估ADCC/ADCP效應細胞的細胞毒活性。
如圖25所示，抗TIGIT克隆31282在Treg細胞上（30.1+/-3％）引發比在CD45RO+ CCR7+/- CD8+ T細胞（總記憶CD8+ T細胞）（-1.48+/-6％）或CD45RO+ CCR7+/- CD4+ T（總記憶CD4+ T細胞）（0.64+/-3％）上更高的特異性裂解。利妥昔單抗陽性對照在圈選的CD19+ 細胞上引發77.9％（+/-6.8％）的特異性裂解。總體資料表明，與總記憶CD4+ 和CD8+ T細胞群相比，來自癌症患者PBMC中Treg細胞的優先消耗。使用來自患有結腸腺癌的患者的細胞觀察到類似的Treg細胞的優先消耗。實施例 22 ：來自癌症患者 PBMC 和解離的腫瘤細胞的免疫群體上 TIGIT 表達的表徵
進行流式細胞術分析以評估對來自癌症患者的新鮮分離的匹配的PBMC和解離的腫瘤細胞（DTC）內的腫瘤浸潤的淋巴細胞的免疫細胞亞群的TIGIT表達。獲得來自不同適應症的樣品：卵巢癌、腎癌、HNSSC、皮膚癌、黑素瘤和肺癌。對於DTC，將腫瘤機械破碎，然後按照製造商對特定腫瘤類型的說明，用腫瘤解離試劑盒（Miltenyi Biotech＃130 095 929）在gentleMACS解離器中旋轉下孵育。在密度梯度培養基（Lymphoprep Axis-Shield＃1115758）上從全血中分離PBMC。將表型資料與從健康個體分離的冷凍PBMC進行比較（n=10）。
使用經過濾的FACS緩衝液（PBS+2 mM EDTA+0.1％BSA）和Brilliant Stain緩衝液（BD＃563794）按照製造商的說明對細胞進行染色。在染色之前用合適的人FcBlock（BD＃564220）封閉細胞，並在採集之前使用IC固定緩衝液（eBioscience＃00-8222-49）固定。DTC用以下抗體組染色：抗CD45-BB515（克隆HI30，BD Horizon 564585）、抗CD73-BV421（克隆AD2，BD Horizon 562430）、抗CD8a-BV510（克隆SK1，BD Horizon 563919）、抗CD3-BV650（克隆SK7，BD Horizon 563999）、抗CD56-BV711（克隆5.1H11，Biolegend 362542）、抗CD279-BV785（克隆EH12.2H7，Biolegend 329930）、抗CD127-APC（克隆A019D5，Biolegend 351316）、抗CD4-APC-R700（克隆RPA-T4，BD Horizon 564975）、LVD efluor 780（eBioscience 65-0865-14）、抗TIGIT-PE（克隆MBSA43，eBioscience E13456-108）、抗CD39-PE-Dazzle594（克隆A1，Biolegend 328224）以及CD25-PE-cy7（克隆BC96，Biolegend 302612）。PBMC用以下抗體組染色：抗CD45RO-BB515（克隆UCHL1，BD Horizon 564529）、抗CD73-BV421（克隆AD2，BD Horizon 562430）、抗CD8a-BV510（克隆SK1，BD Horizon 563919）、抗CD3-BV650（克隆SK7，BD Horizon 563999）、抗CD56-BV711（克隆5.1H11，Biolegend 362542）、抗CD197-BV786（克隆3D12，BD Horizon 563710）、抗CD127-APC（克隆A019D5，Biolegend 351316）、抗CD4-APC-R700（克隆RPA-T4，BD Horizon 564975）、LVD efluor 780（eBioscience 65-0865-14）、抗TIGIT-PE（克隆MBSA43，eBioscience E13456-108）、抗CD39-PE-Dazzle594（克隆A1，Biolegend 328224）以及CD25-PE-cy7（克隆BC96，Biolegend 302612）。在FACS Fortessa（BD Biosciences）上進行採集，並用FlowJo軟體（FlowJo，LLC）進行分析。在前向和側向散射上對存活細胞進行圈選。多種免疫細胞亞群如下圈選：CD3+ CD4+ CD127+ CD25- （CD3+ CD4+ 非Treg細胞），CD3+ CD4+ CD127低 CD25+ （調節T細胞），CD3+ CD8+ （CD3+ CD8+ T細胞），CD3- CD56+ （NK細胞），CD3+ CD56+ （NKT細胞），CD3- CD56- （非T/NK細胞）。Quantibrite PE珠（BD＃340495）在相同的儀器設置下運行並用於將螢光資料轉換成每個細胞結合的抗體數。
使用盒須展示、用Tukey方法計算百分位數，圖26A中展示了不同免疫群體上TIGIT表達的頻率，圖26B中表示每個亞群的TIGIT密度。
資料顯示，與來自健康供體的PBMC相比，來自癌症患者的PBMC上的T細胞亞群的TIGIT頻率更高。在DTC TILS上該頻率進一步提高（圖26A）。雖然觀察CD3+ CD4+ 非Treg細胞和CD4+ Treg細胞表面上TIGIT的密度獲得了相同的觀察結果，但對於CD3+ CD8+ T細胞，DTC TILS上每個細胞的TIGIT分子數量減少（圖26B）。實施例 23 ： TIGIT 和克隆 31282 的結構和功能表位元作圖
為了進一步表徵和理解抗TIGIT mAb克隆31282與TIGIT重組蛋白之間的相互作用， 藉由X射線衍射確定與TIGIT複合的31282的晶體結構。
A.TIGIT 和 Fab 表達、純化和結晶 人TIGIT殘基23-128由Proteros Biostructures GmbH生產。將具有N-末端HIS-標籤（凝血酶可切割）的TIGIT（23-128）克隆到pET15b中，並在BL21（DE3）中在LB培養基中於37℃下在包涵體中表達。用含有Tris/HCl pH 7.4和Tris/HCl pH 7.4,0.05％Brij-35的緩衝液洗滌包涵體（IB）。IB用6 M Gdm/HCl，50 mM Tris pH 8.5和10 mM DTT變性。在50 mM Tris/HCl pH 8，1 mM GSH，0.5 mM GSSG，150 mM NaCl中進行重折疊。在HIS-trap上純化重折疊的蛋白質。藉由凝血酶切割除去N-末端HIS-標籤，並在50 mM Tris/HCl pH 7.5，200 mM NaCl中平衡的Superdex-75上進一步純化。
對於Fab片段表達，將HEK293F細胞在含有1％青黴素/鏈黴素、2 mM L-穀氨醯胺和0.1％Pluronic的Freestyle F17中生長。用於轉染的擴增培養物在3 L Erlenmeyer燒瓶中培養（Corning，2 L細胞培養工作體積，37℃，8％v/v CO2，80-120 rpm，50 mm振幅）。在轉染前一天稀釋培養物，並將細胞數調節至1×106 個細胞/ml。表達培養物的體積為6 L。用Fab的輕鏈和重鏈的質粒進行暫態轉染。在純F17培養基中製備DNA/FectoPro的MasterMix（FectoPro，PolyPlus）並孵育10分鐘（根據PolyPlus方案）。將該轉染混合物滴加到細胞懸浮液中，立即加入Booster。轉染後18小時，向培養物中加入3 g/L葡萄糖。
為了純化Fab片段，在轉染後6天藉由離心收穫6 L HEK293細胞培養物上清液，並施加於30 ml KappaSelect柱。將KappaSelect用pH 7.4的PBS洗滌，用pH 3的檸檬酸鈉洗脫，並用Tris緩衝液中和含有Fab的級分。將Fab在Superdex S-200柱上進一步純化（所述柱在20 mM Tris pH 8，100 mM NaCl中平衡），並儲存在-80℃直至進一步使用。
對於Fab-TIGIT複合物形成，將純化的TIGIT與純化的Fab以1.5:1的比例混合，並將複合物在Superdex-200上純化，所述Superdex-200在200 mM Tris pH 8，100 mM NaCl中平衡。將Fab-TIGIT複合物濃縮至35 mg/ml用於結晶。使用蒸氣擴散法，藉由將0.1 μl蛋白質溶液（35.3 mg/ml，在20 mM TRIS pH 8.0；100 mM NaCl中）與儲庫溶液（0.10 M二甲胂酸鈉pH 6.00；15％（w/v）PEG4000）以1:1的比例混合，在277 K下結晶Fab-TIGIT複合物。藉由將晶體浸入添加有25％甘油的儲庫溶液中來對其進行冷凍保護。
B ．資料收集和處理 使用Proteros Biostructures GmbH標準方案建立冷凍方案。晶體已經快速冷凍並在100 K的溫度下測量。使用低溫條件在SWISS LIGHT SOURCE（SLS，Villigen，Switzerland）從Fab:TIGIT複合晶體收集X射線衍射資料。晶體屬於空間群P1。使用程式XDS和XSCALE處理資料。資料收集和處理統計資料見表22。 表22：資料收集和處理統計 1 SWISS LIGHT SOURCE（SLS，Villigen，Switzerland）2 括弧中的值指的是最高解析度庫3 從獨立反射計算
C. 結構建模和細化 藉由分子置換獲得確定和分析結構所需的相資訊。先前解析的Fab結構用作搜索模型。根據標準協定使用套裝軟體CCP4和COOT執行隨後的模型構建和細化。對於自由R因數（交叉驗證最終模型正確性的一種量度）的計算，大約2.5％的測量反射被排除在細化程式之外（見表23）。
TLS細化（使用REFMAC5，CCP4），這導致較低的R因數和較高的電子密度圖品質。已應用自動生成的本地NCS限制（較新的REFMAC5版本的關鍵字“ncsr local”）。配體參數化和相應文庫檔的產生分別用CHEMSKETCH和LIBCHECK（CCP4）進行。
藉由將水分子置於3.0處輪廓的Fo-Fc圖譜的峰值，然後使用REFMAC5進行細化，並使用COOT的驗證工具檢查所有水來使用COOT的“Find waters”演算法建立水模型。疑似水列表的標準是：B因數大於80 Å2，2Fo-Fc圖小於1.2 s，與最近接觸的距離小於2.3 Å或大於3.5 Å。手動檢查疑似水分子和配體結合位點（配體的距離小於10 Å）。最終的複合物結構用PHENIX細化。我們選擇了細化參數，包括XYZ座標、實空間、個體B因數和B組因數。優化X射線/立體化學重量和NCS限制也被選擇用於改進。最終模型的Ramachandran圖顯示優選區域中所有殘基的95.39％，在允許區域中為3.95％。表23列出了最終結構和細化過程的統計資料。 表23：細化統計1 1 PHENIX中確定的值2 用COOT計算
D. 總體結構 人Fab抗體片段的重鏈和輕鏈顯示人抗體的典型折疊（圖27A）。在不對稱單元中存在兩個具有基本相同的整體構象的異源三聚體。該模型包含TIGIT的23至128位殘基，克隆31282的重鏈的1至224位殘基和克隆31282的輕鏈的1至214位殘基。重鏈的一個短環區域未由電子密度完全限定，因此未包括在模型中。
使用FoldX程式分析衍射圖像以估計殘基的能量貢獻並定義相互作用的熱點。形成結合介面的氨基酸殘基在電子密度圖中明確限定。解析的X射線衍射資料清楚地顯示了Fab和TIGIT之間的相互作用（圖27B和27C）。克隆31282輕鏈CDR與TIGIT的2個區域相互作用，其中CDR L1 Arg30和Tyr33與TIGIT殘基Asn58和Glu60接觸；CDR L1 Arg30和CDR L3 Phe93與TIGIT殘基Ile109接觸。CDR L2與TIGIT沒有聯繫（表24）。克隆31282重鏈與TIGIT的不同區域相互作用，其中CDR H1 Tyr33與殘基Leu73上的TIGIT接觸；CDR H2 Val50、Ser54和Ser57與殘基Leu73上的TIGIT接觸；CDR H3 Asp102、Tyr103和Trp104與TIGIT在殘基Gln56、Ile68、Leu73和His76上接觸。
基於a-TIGIT克隆31282/TIGIT複合物的這種晶體結構，確定與克隆31282接觸的TIGIT殘基（由克隆31282結合的TIGIT的表位殘基）和與TIGIT接觸的克隆31282的殘基（由TIGIT結合的克隆31282的互補位殘基）。表24和25以及圖27C顯示了與克隆31282的輕鏈（表24）或重鏈（表25）鏈殘基接觸的TIGIT殘基。接觸殘基定義為滿足以下標準中的每一個的每種氨基酸：（i）其計算的結合自由能貢獻大於0.3 kcal/mol，（ii）其實驗平均B因數低於X射線結構中所有殘基的平均B因數，（iii）其在距離小於或等於4.0埃的情況下與抗體原子形成至少3對重原子的原子間接觸，（iv）其不僅產生溶劑暴露的氫鍵或離子相互作用，（v）如果其是非芳族極性殘基（Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys或Arg），則其與抗體形成至少一個氫鍵或離子相互作用。 表24：TIGIT的表位殘基和克隆31282的輕鏈上的相應互補位殘基的總結 表25：TIGIT的表位殘基和克隆31282的重鏈上的相應互補位殘基的總結 實施例 24 ： a-TIGIT 克隆 31282 和 32959 之間的競爭測定。
在HEK細胞中產生人IgG1同種型的抗TIGIT抗體克隆32959，並如上文實施例17中所述進行純化。
收集過表達人TIGIT的Jurkat細胞（Jurkat-hTIGIT），以5.104 細胞/孔分配，並與以下濃度的拮抗性a-TIGIT克隆31282一起孵育：0 nM（無Ab）、0.08 nM、0.16 nM、0.8 nM和8 nM，其代表了該克隆的Kd的0至100倍的濃度範圍。洗去過量的抗體，並將細胞與降低濃度（8；4；2；1；0.5；0.25；0.125；0.062；0.031；0.016；0.008和0.004 nM）的直接偶聯（AF647）抗TIGIT克隆32959在4℃下孵育30分鐘。使用LSR BD Fortessa分析幾何平均螢光強度。細胞結合記錄為AF647的中值螢光強度。為了計算克隆32959的EC50 結合，在Prism中使用四變數曲線擬合方程計算對hTIGIT-Jurkat的半數最大結合濃度（EC50 ），所得到的值如表26所示，如圖28所示。結果顯示與克隆31282的濃度無關的a-TIGIT克隆32959的強結合，證明不存在與拮抗性a-TIGIT抗體的競爭。 表26：在提高濃度的拮抗性a-TIGIT克隆31282存在下，a-TIGIT克隆32959與Jurkat-hTIGIT結合的EC50 濃度 實施例 25 ：在食蟹猴中單次 i.v. 注射後測定克隆 31282 的藥代動力學特徵
食蟹猴藉由i.v.推注接受a-TIGIT克隆31282 IgG1或IgG4。將抗體以3種不同濃度（0.1 mg/kg；1 mg/kg；10 mg/kg）施用於2只動物（1只雄性和1只雌性）。在第1天給藥後通過504小時收集血液。將血液樣品處理為血漿並使用ELISA方法分析a-TIGIT克隆31282 IgG1或IgG4的濃度。使用Phoenix WinNonlin（版本6.3，Pharsight，a Certara Company，Princeton，NJ）中的血管內模型，使用來自個體動物的血漿濃度-時間資料來計算IV給藥後a-TIGIT克隆31282 IgG1和IgG4的毒代動力學參數值。
在IV推注施用0.1、1和10 mg/kg的a-TIGIT克隆31282 IgG1和IgG4後，分別在給藥後通過240小時、336小時和504小時對雄性和雌性猴的血漿中IgG1濃度進行定量，並分別通過168小時、240小時和504小時對IgG4和IgG4進行定量（圖29和表27）。在i.v.推注施用a-TIGIT克隆31282 IgG1或IgG4後，對IgG1和IgG4的全身暴露沒有明顯的性別相關差異（Cmax和AUClast），比率（雄性/雌性）範圍為0.855至1.16。
在以i.v.推注向雄性和雌性猴施用a-TIGIT克隆31282 IgG1後，血漿IgG1濃度在所有劑量水準下雙相下降，平均終末半衰期（t1/2）為84.7至174小時（圖29）。在所研究的劑量範圍內，系統清除率（CL）是一致的，範圍為0.280至0.392 mL/小時/kg。穩態分佈（Vss）的表觀體積在所測試的劑量水準之間是一致的，值範圍為53.7至66.5 mL/kg。a-TIGIT克隆31282 IgG1劑量在0.1至1 mg/kg和1至10 mg/kg範圍內提高10倍導致暴露大致成比例提高（9.57至14.5倍的提高）。
在向雄性和雌性猴i.v.施用a-TIGIT克隆31282 IgG4後，血漿IgG4濃度在所有測試劑量水準下雙相下降，t1/2為148至334小時（圖29和表28）。CL在所測試的劑量水準中是一致的，範圍為0.160至0.219 mL/小時/kg。平均Vss範圍為41.2至70.7 mL/kg。a-TIGIT克隆31282 IgG4劑量在0.1至1 mg/kg和1至10 mg/kg範圍內提高10倍導致IgG4暴露的大致成比例提高（9.32至12.5倍的提高）。 表27：在食蟹猴中靜i.v.推注後a-TIGIT克隆31282人IgG1的平均毒代動力學參數的總結 表28：在食蟹猴中i.v.推注後a-TIGIT克隆31282人IgG4的平均毒代動力學參數的總結 實施例 26 ：人腫瘤細胞群上 TIGIT 表達的表徵
進行流式細胞術分析以評估來自具有不同血癌適應症的癌症患者的血液樣品中的正常和腫瘤T或B細胞上TIGIT的表達。
測試Sézary綜合征患者樣品以比較惡性和正常CD4+ T細胞群體上的TIGIT表達。為了分離這些群體，使用Beckman Coulter TCR-Vb譜系試劑盒（＃IM3497）進行惡性克隆TCR-Vb重排的預先確定。一旦鑒定出惡性克隆，使用以下商業試劑在Sézary綜合征患者的免疫細胞上分析TIGIT表達：抗CD3 Krome Orange（#B00068）、抗CD4-PE（#A07751）、抗CD8-PC7（#737661）、抗CD56-PC5（#A07789）、抗CD45-Pacific Blue（#A74763）、抗CD19-AF750（#A94681）和抗Vb8-FITC（#IM1233）（均來自Beckman-Coulter）以及抗TIGIT-APC（克隆MBSA43，ebiosciences# 17-9500-42）。在CytoFlex裝置（Beckman-Coulter）上進行Sézary綜合征患者樣品的流式細胞術分析。用FloJo軟體（FlowJo，LLC）分析資料。
圖30A示出了代表性例示。具有惡性TCR-Vb8克隆的該供體的圈選策略示於圖30A，其中惡性細胞為CD45+ CD3+ CD4+ Vb8+ ，正常CD4+ T細胞為CD45+ CD3+ CD4+ Vb8- 。與正常CD4+ T細胞相比，在惡性CD4+ T細胞上觀察到TIGIT的強烈表達（MFI分別為999和4987）（圖30B）。
類似地，進行流式細胞術分析以評估來自CLL患者的骨髓樣品中的正常和惡性B細胞上TIGIT的表達。樣品用以下抗體組染色：LVD efluor 780（eBioscience 65-0865-14）、抗CD45-BB515（克隆HI30，BD Horizon 564585）、抗CD5-BV510（克隆UCHT2，Biolegend 363381）、抗CD19-BV711（克隆SJ25C1，BD Horizon 563036）以及抗TIGIT-PE（克隆MBSA43，eBioscience E13456-108）。在FACS Fortessa（BD Biosciences）上進行採集，並用FlowJo軟體（FlowJo，LLC）進行分析。在前向和側向散射上對存活細胞進行圈選。如下對多種細胞亞群進行圈選：CD45+ CD19+ CD5- （正常B細胞）和CD45+ CD19+ CD5+ （惡性B-CLL）。
圖31中示出了代表性例示，其中圈選策略如圖31A所示。與正常B細胞（1％）（分別為1440和810的MFI）相比，高比例的惡性B-CLL細胞對TIGIT呈陽性（75％）（圖31B）。
總之，獲得的資料表明腫瘤細胞在特定的血癌適應症中表達TIGIT。實施例 27 ：在小鼠 T 細胞淋巴瘤模型中抗 TIGIT 拮抗性抗體在單一療法中的抗腫瘤活性。
對於該實驗，將EL4 T細胞淋巴瘤細胞（ATCC TIB-39TM ）改造以穩定表達小鼠TIGIT（EL4-mTIGIT）。將用編碼GFP的類似載體轉導的EL4細胞用作對照（EL4-GFP）。將細胞群亞克隆以獲得EL4-mTIGIT和EL4-GFP的克隆。所使用的抗TIGIT抗體是抗體29527的修飾形式（經修飾使得VH FR3的27位殘基從L突變為V並且其中VH FR4的6位殘基從M突變為T）並在人IgG1同種型上產生。對8週的雌性Balb/c小鼠皮下接種1,000,000個EL4-mTIGIT細胞或200.000個EL4-GFP細胞。在接種後第7天，當腫瘤體積平均為約110mm3 時，將小鼠隨機分在具有相等腫瘤體積的處理組中（對於EL4-mTIGIT，每組n=15，對於EL4-GFP，每組n=10）。在腫瘤接種後第7天、第10天、第13天和第16天藉由腹膜內注射用200 μg抗TIGIT或同種型對照抗體（hIgG1，BioXcell）處理小鼠。監測腫瘤生長，並且從第7天至第26天每週三次用電子卡尺測量腫瘤體積。當腫瘤體積超過2000 mm3 時處死小鼠。藉由線性混合模型統計分析腫瘤生長曲線。藉由測試時間*處理組的相互作用來評估處理組之間的差異。
圖32顯示了用EL4-mTIGIT（A-C）或EL4-GFP（D-F）接種的小鼠的腫瘤生長曲線。示出了用hIgG1同種型對照（B和E）或拮抗性a-TIGIT Ab（C和F）處理的小鼠的中位元腫瘤生長曲線（A和D）以及個體腫瘤生長曲線。在接種EL4-mTIGIT細胞的小鼠中，與同種型對照處理組相比，當用抗TIGIT Ab處理時，腫瘤生長被顯著抑制（p＜0.001）。在用同種型對照抗體處理的組中，15只小鼠中的3只在模型結束時顯示出腫瘤生長控制，體積低於700 mm3 ，而在用拮抗性抗TIGIT抗體處理的組中，這個數字增加到15只小鼠中的8只。當將拮抗性a-TIGIT處理與同種型對照抗體進行時，在攜帶EL4-GFP腫瘤的小鼠中沒有觀察到抗腫瘤作用或完全回應。總之，這些資料證明拮抗性a-TIGIT抗體（hIgG1）在具有表達TIGIT的腫瘤細胞的模型中具有顯著的抗腫瘤效力。實施例 28 ：在 CT26 結腸癌小鼠模型中抗 TIGIT 拮抗抗體與免疫檢查點抗體組合的抗腫瘤活性
除了抗TIGIT Ab與抗PD1抗體的組合之外（實施例12、13和14），還評估了抗TIGIT抗體與對共刺激分子4-1BB、OX40和GITR特異的激動劑抗體以及對檢查點抑制分子ICOS特異的拮抗性抗體組合的抗腫瘤作用。
CT26腫瘤細胞系購自ATCC®（CRL-2638TM ）。將8週的雌性balb/c小鼠在右側皮下接種500,000個細胞。在接種後第9天，當腫瘤體積平均約為75 mm3 時，將小鼠隨機分在腫瘤體積相等的處理組（每組n=10只小鼠）。從隨機化當天開始，每3天腹膜內給予所有抗體，總共進行3次注射。使用的抗TIGIT抗體是在小鼠IgG2a同種型上產生的抗體29527的修飾形式（經修飾使得VH FR3的27位殘基從L突變為V，並且其中VH FR4的6位殘基從M突變為T），其以20 μg/小鼠給予。以5 μg/小鼠給予抗4-1BB（克隆3H3，BioXCell，BE0239），以20 μg/小鼠給予a-OX-40（克隆OX-86，BioXCell，BE0031），以10μg/小鼠給予a-GITR（克隆DTA-1，BioXCell，BE0063），以200μg/小鼠給予a-ICOS（克隆7E.17G9，BioXCell，BE0059）。監測腫瘤生長，並且從第7天至第35天每週三次用電子卡尺測量腫瘤體積。當腫瘤體積超過2000 mm3 時，處死小鼠。藉由線性混合模型基於對數轉化的腫瘤體積統計分析腫瘤生長曲線。藉由測試時間*處理組的相互作用來評估處理組之間的差異。這導致了絕大多數資料的良好模型擬合，除了非常小的腫瘤體積（低於10 mm3 ）。因此，這些小腫瘤體積被視為缺失值。為了測試將抗TIGIT抗體與相應的免疫檢查點抗體（IC-即抗41BB、抗OX40、抗GITR和抗ICOS）組合而產生的協同作用，處理組藉由兩個變數的組合重新編碼：抗TIGIT（是/否）和IC（是/否）。除了每種處理的加性作用（抗TIGIT*時間和IC*時間）之外，藉由測試相互作用項（抗TIGIT*IC*時間）來評估協同作用。
圖33A顯示了每組的腫瘤中值生長曲線以及在單一療法中或與抗4-1BB組合中藉由抗TIGIT處理的小鼠的個體生長曲線。與抗TIGIT或抗4-1BB單一療法相比，用抗TIGIT+抗4-1BB處理的小鼠中腫瘤生長受到顯著抑制（分別為p=0.0005和p＜0.0001）。與分別用a-TIGIT或a-4-1BB作為單一藥劑處理的組中的1/10或0/10完全回應相比，抗TIGIT和抗4-1BB抗體的組合導致6/10小鼠顯示完全回應（其中腫瘤＜30 mm3 並且被認為是不可測量的）。這些資料證明了抗TIGIT處理與抗4-1BB組合用於治療預先建立的腫瘤的顯著抗腫瘤作用。
圖33B顯示了每組的腫瘤中值生長曲線以及在單一療法中或與抗OX-40組合的抗TIGIT處理的小鼠的個體生長曲線。與抗TIGIT或抗OX-40單一療法相比，用抗TIGIT+抗OX-40處理的小鼠中腫瘤生長受到顯著抑制（分別為p=0.0002和p＜0.0001）。抗TIGIT+抗OX-40的組合實現了協同抗腫瘤作用，這超過了兩種單一療法處理的加性作用（p=0.02）。與分別用a-TIGIT或a-OX-40作為單一藥劑處理的組中的1/10或0/10完全回應相比，抗TIGIT和抗OX-40抗體的組合導致7/10小鼠顯示完全回應。這些資料證明了抗TIGIT處理與抗OX-40組合用於治療預先建立的腫瘤的顯著和協同的抗腫瘤作用。
圖33C顯示了每組的腫瘤中值生長曲線以及在單一療法中或與抗GITR組合的抗TIGIT處理的小鼠的個體生長曲線。與抗TIGIT或抗GITR單一療法相比，用抗TIGIT+抗GITR處理的小鼠中腫瘤生長受到顯著抑制（p＜0.0001）。抗TIGIT+抗GITR的組合實現了協同抗腫瘤作用，這超過了兩種單一療法處理的加性作用（p=0.01）。與分別用抗TIGIT或抗GITR作為單一藥劑處理的組中的1/10或0/10相比，抗TIGIT和抗GITR抗體的組合導致6/10小鼠顯示完全回應。這些資料證明了抗TIGIT療法與抗GITR組合用於治療預先建立的腫瘤的顯著和協同的抗腫瘤作用。
圖33D顯示了每組的腫瘤中值生長曲線以及在單一療法中或與抗ICOS組合中藉由抗TIGIT處理的小鼠的個體生長曲線。與抗TIGIT或抗ICOS單一療法相比，用抗TIGIT+抗ICOS處理的小鼠中腫瘤生長受到顯著抑制（分別為p=0.003和p=0.0001）。與分別用抗TIGIT或抗ICOS抗體作為單一藥劑處理的組中的1/10或0/10相比，抗TIGIT和抗ICOS抗體的組合導致1/10小鼠顯示完全回應（其中腫瘤＜30mm3 並且被認為是不可測量的）。這些資料證明了抗TIGIT療法與抗ICOS聯合用於治療預先建立的腫瘤的顯著和協同的抗腫瘤作用。實施例 29 ：抗 TIGIT 拮抗性抗體對 g d T 細胞的活性
gd（γ-δ或g/d）T細胞是具有描述的抗腫瘤活性和抗病毒活性（例如CMV感染）的非常規T細胞群（Zhao等，2018. J Transl Med.16: 122），並且還涉及自身免疫疾病（Malik S等，2016. Front Immunol. 7:14）。 進行流式細胞術分析以評估從具有巨細胞病毒（CMV）的血清陰性或血清陽性狀態（CMV狀態由EFS Nouvelle Aquitaine，Bordeaux，France評估）的健康個體新鮮分離的PBMC上的gdT細胞上TIGIT的表達。使用經過濾的FACS緩衝液（PBS+2 mM EDTA+0.1％BSA）按照製造商的說明對細胞進行染色。在FACS Fortessa（BD Biosciences）上進行採集，並用BD FACS DIVA軟體（BD Biosciences）進行分析。基於前向和側向散射和存活力對細胞進行圈選。gdT細胞如下進行圈選：CD3+ TCR+ V2- （V2- T 細胞）使用如下抗體：抗TCR APC，來自Miltenyi的克隆REA591#130-109-280；抗TCR V2-PE-Vio 770，來自Miltenyi的克隆REA771，#130-111-012；BV421小鼠抗人CD3，來自BD Biosciences的克隆UCHT1，#560365；來自Biolegend的Zombie Aqua可固定活力試劑盒，#423101。
與常規ab T細胞相似，非常規Vd2- gd T細胞在CMV陰性和陽性兩種人群中表達TIGIT（抗TIGIT，來自eBioscience的克隆MBSA43，#12-98500-42）（圖34A）。為了表徵阻斷TIGIT受體對這種細胞群的功能結果，在存在或不存在TIGIT-配體CD155（來自R&D Systems的#9174-CD-050）的情況下，用以下活化來自CMV陽性供體的磁性分離的Vd1+ gd T細胞（抗TCR Vd1-FITC，克隆REA173 #130-100-532和抗FITC微珠#130-048-701，兩者均來自Miltenyi）或總PBMC：抗Vd1（10 ug/ml）（來自Beckman Coulter的克隆R9.1，#IM1761）和IL-15（20 ng/ml）（來自Peprotech 的#200-15-50UG），另外將IL-2（100 U/ml，#200-02-1MG Peprotech）加入到分離的Vd1+ gdT細胞中。圖34B顯示藉由添加TIGIT-配體CD155（0、0.1、1和10 ug/ml）介導的IFNg分泌（ELISA試劑盒，來自Mabtech的#3420-1h-20）的劑量依賴性降低，在1 ug/ml的CD155下達到最大抑制。添加抗TIGIT Ab克隆31282（10 ug/ml）完全恢復IFNg產生至與沒有CD155配體的條件相同或更高的水準，而人IgG1同種型對照具有非常有限的作用。圖34C顯示了當將a-TIGIT克隆31282加入混合物中時，在總PBMC的抗Vd1活化和IFN-g分泌的完全恢復後由CD155（10 μg/ml）介導的類似抑制作用。這些資料表明，與ab T細胞相似，CD155與TIGIT連接可損害gd T細胞的活性，並且抗TIGIT抗體可完全阻止這種抑制。
無
圖 1 ： 提供了本發明抗體的重鏈可變結構域（VH）互補性決定區（complementarity determining region，CDR）序列的表格。
圖 2 ： 提供了本發明抗體的輕鏈可變結構域（VL）CDR序列的表格。
圖 3 ： 提供了本發明抗體的重鏈可變結構域（VH）框架（FR）序列的表格。
圖 4 ：提供了本發明抗體的輕鏈可變結構域（VL）框架（FR）序列的表格。
圖 5 ：提供了本發明抗體的重鏈可變結構域（VH）和輕鏈可變結構域（VL）氨基酸序列的表格。
圖 6 ：提供了編碼本發明中抗體的VH和VL結構域的多核苷酸序列的表格。
圖 7 ：示出了hCD155和抗TIGIT抗體結合Jurkat-hTIGIT的競爭測定結果的圖。
圖 8 ：（A）示出了來自7個健康人供體的PBMC特定T細胞群中TIGIT陽性細胞的比例的圖。（B）示出了來自7個健康人供體的PBMC不同免疫群體中TIGIT陽性細胞的比例的圖。
圖 9 ：示出了抗TIGIT抗體對Jurkat-hTIGIT的結合測定結果的圖。
10 ：（A和B）示出了抗TIGIT抗體對來自人健康PBMC原代CD8+ T細胞的結合測定結果的圖。（C）示出了抗TIGIT抗體對來自人健康PBMC原代記憶CD8+ T細胞和Treg的結合測定結果的圖。
圖 11 ：示出了抗TIGIT抗體對來自食蟹猴健康PBMC原代CD8+ T細胞的結合測定結果的圖。
圖 12 ：示出了抗TIGIT抗體在CHO-TCR-CD155和Jurkat-hTIGIT生物測定中的作用的圖。
圖 13 ：示出了抗TIGIT抗體在對來自用CHO-TCR-CD155細胞活化的健康供體的人原代CD8 T細胞的功能測定中提高IFNg分泌的作用的圖。
圖 14 ：示出了抗TIGIT抗體在對來自用CHO-TCR-CD155細胞活化的卵巢腹水的人原代CD8+ TIL的功能測定中提高IFNg分泌的作用的長條圖。
圖 15 ：（A）示出了小鼠CD155和抗TIGIT抗體之間結合Jurkat-mTIGIT的競爭測定結果的圖。（B）示出了抗TIGIT抗體在對小鼠OT-1 T細胞的功能測定中提高IFNg分泌的作用的圖。（C）示出了抗TIGIT抗體在對小鼠OT-1 T細胞的功能測定中提高細胞毒性的作用的圖。
圖 16 ： （A）示出了單一治療的抗TIGIT抗體在CT26腫瘤模型中的抗腫瘤效力的圖。（B和C）示出了與抗PD1組合的抗TIGIT抗體在CT26腫瘤模型中的抗腫瘤效力的圖。
圖 17 ：（A）示出了單一治療的抗TIGIT抗體在CT26腫瘤模型中的同種型依賴性抗腫瘤效力的圖。（B）示出了與抗PD1組合的抗TIGIT抗體在CT26腫瘤模型中的同種型依賴性抗腫瘤效力的圖。
圖 18 ： （A和G）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對Treg細胞在總CD4+ T細胞群中比例的調節的圖。（B和H）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對CD8+ T細胞在總CD45+ 細胞群中比例的調節的圖。（C和I）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對CD8+ /Treg T細胞比率的調節的圖。（D和J）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對IFNg 分泌CD4+ T細胞的調節的圖。（E）示出了用抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對IFNg分泌CD8+ T細胞的調節的圖。（L和F）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中IFNg/IL-10分泌CD4+ T細胞比率的圖。（K）示出了用與抗PD1抗體組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對IL-10分泌CD4+ T細胞的調節的圖。
圖 19 ：（A）示出了抗TIGIT抗體處理調節CT26腫瘤中基因表達的作用並且藉由NanoString分析測量的火山圖（Volcano plot）。（B）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對細胞毒評分的調節的箱形圖。（C）示出了用單一治療或與抗PD1組合的抗TIGIT抗體處理的CT26腫瘤中對CD8+ T細胞評分的調節的箱形圖。
圖 20 ：（A）示出了來自人健康志願者的PBMC中TIGIT+ CD4+ 、CD8+ T細胞和Treg群體的比例的長條圖。（B）示出了抗TIGIT抗體對來自人健康志願者的PBMC中常規CD4+ 、CD8+ T細胞和Treg群體的體外細胞毒性作用的圖。
圖 21 ：示出了抗TIGIT抗體對CT26腫瘤中常規CD4+ 、CD8+ T細胞和Treg群體的離體細胞毒性作用的圖。
圖 22 ： （A）示出了抗TIGIT抗體克隆對Jurkat-hTIGIT細胞的結合測定的結果的圖。（B）示出了抗TIGIT抗體克隆對來自健康人PBMC的原代CD8+ T細胞的結合測定的結果的圖。（C）示出了抗TIGIT抗體克隆對來自癌症患者PBMC的原代CD8+ T細胞的結合測定的結果的圖。
圖 23 ：示出了人CD155和抗TIGIT抗體克隆對結合Jurkat-hTIGIT的競爭測定的結果的圖。
圖 24 ：示出了拮抗劑a-TIGIT克隆的功能表征的圖。（A）示出了抗TIGIT抗體在使用Jurkat-hTIGIT效應細胞的功能測定（螢光素酶報導子測定）中的作用的圖。（B）示出了抗TIGIT抗體在測量來自健康志願者的人原代CD8+ T細胞的IFNg分泌的功能測定中的作用的圖。（C）示出了抗TIGIT抗體克隆31282在測量來自PBMC的癌症患者CD3+ T細胞的IFNg分泌的功能測定中的作用的圖。（D）示出了抗TIGIT抗體克隆31282在測量癌症患者TIL或PBMC中細胞內細胞因數染色的功能測定中的作用的圖。
圖 25 ： a-TIGIT克隆31282對來自癌症患者的PBMC中總記憶CD4+ 或CD8+ T細胞和Treg群體的細胞毒活性。
圖 26 ：示出了來自癌症患者的免疫群體中TIGIT表達的表徵的圖。（A）來自癌症患者PBMC和TIL的免疫群體中TIGIT表達的頻率。（B）對來自癌症患者PBMC和TIL的免疫群體中TIGIT表達的絕對定量。
圖 27 ：（A）Fab：TIGIT複合物的結構，其顯示為帶狀圖；（B）克隆31282和TIGIT之間的完全結合介面；（C）克隆31282和TIGIT之間的結合介面，示出了接觸的殘基。
圖 28 ：抗TIGIT克隆31282和32959之間的競爭測定。
圖 29 ：在食蟹猴中以0.1 mg/kg（頂行）、1 mg/kg（中行）或10 mg/kg（下行）的單劑量靜脈內注射後抗TIGIT克隆31282的血漿濃度的測量結果。左欄：31282 IgG1；右欄31282 IgG4。
圖 30 ：示出了對來自Sézary綜合征患者的惡性和正常CD4+ T細胞群上TIGIT表達的表徵的圖。（A）分離惡性和正常CD4+ T細胞的圈選(gate)策略。（B）對2個不同群體的TIGIT染色的MFI。
圖 31 ：示出了對來自CLL患者的惡性和正常B細胞群上TIGIT表達的表徵的圖。（A）分離惡性和正常B細胞的圈選策略。（B）對2個不同群體的TIGIT染色的MFI。
圖 32 ：（A至C）示出了接種有EL4-mTIGIT腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線的圖。（A）中值腫瘤生長曲線。（B）用hIgG1同種型對照抗體處理的小鼠的個體腫瘤生長曲線。（C）用小鼠替代拮抗劑a-TIGIT抗體（hIgG1）處理的小鼠的個體腫瘤生長曲線。（D至F）示出了接種有EL4-GFP腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線的圖。（D）中值腫瘤生長曲線。（E）用hIgG1同種型對照抗體處理的小鼠的個體腫瘤生長曲線。（F）用替代拮抗劑a-TIGIT（hIgG1）處理的小鼠的個體腫瘤生長曲線。
圖 33 ：（A至D）示出了接種有CT26腫瘤的小鼠的腫瘤生長曲線的圖。（A）用抗TIGIT和抗4-1BB抗體處理的小鼠的腫瘤中值和個體腫瘤生長曲線。（B）用抗TIGIT和抗OX-40抗體處理的小鼠的腫瘤中值和個體腫瘤生長曲線。（C）用抗TIGIT和抗GITR抗體處理的小鼠的中值和個體腫瘤生長曲線。（D）用抗TIGIT和抗ICOS抗體處理的小鼠的腫瘤中值和個體腫瘤生長曲線。
圖 34 ：示出了抗TIGIT抗體對gd T細胞的作用的圖。（A）來自CMV陽性和陰性人供體的PBMC的Vd2- gd T細胞群中TIGIT陽性細胞的中值比例和TIGIT MFI信號。（B）示出了抗TIGIT Ab在對分離的人原代Vd1+ γδ T細胞的功能測定中提高IFNg分泌的活性的圖。（C）示出了抗TIGIT Ab在對總PBMC的功能測定中提高IFNg分泌的活性的圖。
<110> 比利時商艾托斯比利時公司(ITEOS BELGIUM SA)
<120> 抗TIGIT抗體
<130> NLW/P153274WO00
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<170> PatentIn version 3.5
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Figure 107126050-A0305-02-0115-50
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Figure 107126050-A0305-02-0115-51
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Figure 107126050-A0305-02-0115-52
<210> 53
<21> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 107126050-A0305-02-0116-53
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Figure 107126050-A0305-02-0116-54
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Figure 107126050-A0305-02-0116-55
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Figure 107126050-A0305-02-0116-56
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Figure 107126050-A0305-02-0116-57
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Figure 107126050-A0305-02-0117-58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Figure 107126050-A0305-02-0117-59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Figure 107126050-A0305-02-0117-60
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Figure 107126050-A0305-02-0117-61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Figure 107126050-A0305-02-0117-62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Figure 107126050-A0305-02-0118-63
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Figure 107126050-A0305-02-0118-64
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Figure 107126050-A0305-02-0118-65
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Figure 107126050-A0305-02-0118-66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Figure 107126050-A0305-02-0118-67
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Figure 107126050-A0305-02-0119-68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Figure 107126050-A0305-02-0119-69
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Figure 107126050-A0305-02-0119-70
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Figure 107126050-A0305-02-0119-72
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Figure 107126050-A0305-02-0119-73
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Figure 107126050-A0305-02-0120-74
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Figure 107126050-A0305-02-0120-75
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Figure 107126050-A0305-02-0120-76
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Figure 107126050-A0305-02-0120-77
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 107126050-A0305-02-0120-78
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 107126050-A0305-02-0121-79
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 107126050-A0305-02-0121-80
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Figure 107126050-A0305-02-0121-81
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Figure 107126050-A0305-02-0121-82
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 107126050-A0305-02-0121-83
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 107126050-A0305-02-0122-84
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 107126050-A0305-02-0122-85
<210> 85
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 107126050-A0305-02-0122-86
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 107126050-A0305-02-0122-88
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 107126050-A0305-02-0122-89
Figure 107126050-A0305-02-0123-90
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 107126050-A0305-02-0123-91
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 107126050-A0305-02-0123-92
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 107126050-A0305-02-0123-93
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Figure 107126050-A0305-02-0123-94
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 107126050-A0305-02-0124-95
<210> 93
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 107126050-A0305-02-0124-96
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 107126050-A0305-02-0124-97
<210> 95
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 107126050-A0305-02-0124-98
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 107126050-A0305-02-0124-99
<210> 97
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 107126050-A0305-02-0125-100
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 107126050-A0305-02-0125-101
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 107126050-A0305-02-0125-102
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 107126050-A0305-02-0125-103
<210> 101
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Figure 107126050-A0305-02-0126-104
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 107126050-A0305-02-0126-105
<210> 103
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 107126050-A0305-02-0126-106
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Figure 107126050-A0305-02-0126-107
<210> 105
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 107126050-A0305-02-0127-108
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 107126050-A0305-02-0127-109
<210> 107
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Figure 107126050-A0305-02-0127-110
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Figure 107126050-A0305-02-0127-111
<210> 109
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Figure 107126050-A0305-02-0127-112
Figure 107126050-A0305-02-0128-113
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Figure 107126050-A0305-02-0128-114
<210> 111
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Figure 107126050-A0305-02-0128-115
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 107126050-A0305-02-0128-116
<210> 113
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Figure 107126050-A0305-02-0128-117
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 107126050-A0305-02-0129-118
<210> 115
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Figure 107126050-A0305-02-0129-119
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Figure 107126050-A0305-02-0129-120
<210> 117
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Figure 107126050-A0305-02-0129-121
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Figure 107126050-A0305-02-0130-122
<210> 119
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Figure 107126050-A0305-02-0130-123
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Figure 107126050-A0305-02-0130-124
<210> 121
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Figure 107126050-A0305-02-0130-125
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Figure 107126050-A0305-02-0131-126
<210> 123
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Figure 107126050-A0305-02-0131-127
<210> 124
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Figure 107126050-A0305-02-0131-128
<210> 125
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Figure 107126050-A0305-02-0131-129
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Figure 107126050-A0305-02-0131-130
<210> 127
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Figure 107126050-A0305-02-0132-131
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Figure 107126050-A0305-02-0132-132
<210> 129
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Figure 107126050-A0305-02-0132-133
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Figure 107126050-A0305-02-0132-134
<210> 131
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Figure 107126050-A0305-02-0133-135
<210> 132
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
Figure 107126050-A0305-02-0133-136
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Figure 107126050-A0305-02-0133-137
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
Figure 107126050-A0305-02-0133-138
<210> 135
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Figure 107126050-A0305-02-0133-139
Figure 107126050-A0305-02-0134-140
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Figure 107126050-A0305-02-0134-141
<210> 137
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Figure 107126050-A0305-02-0134-142
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 107126050-A0305-02-0134-143
<210> 139
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Figure 107126050-A0305-02-0134-144
<210> 140
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Figure 107126050-A0305-02-0135-145
<210> 141
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Figure 107126050-A0305-02-0135-146
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Figure 107126050-A0305-02-0135-147
<210> 143
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Figure 107126050-A0305-02-0135-148
<210> 144
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Figure 107126050-A0305-02-0136-149
<210> 145
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Figure 107126050-A0305-02-0136-150
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Figure 107126050-A0305-02-0136-151
<210> 147
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Figure 107126050-A0305-02-0136-152
<210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Figure 107126050-A0305-02-0136-153
<210> 149
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
Figure 107126050-A0305-02-0137-154
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Figure 107126050-A0305-02-0137-414
<210> 151
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Figure 107126050-A0305-02-0137-155
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Figure 107126050-A0305-02-0137-156
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Figure 107126050-A0305-02-0138-157
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Figure 107126050-A0305-02-0138-158
<210> 155
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Figure 107126050-A0305-02-0138-159
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Figure 107126050-A0305-02-0138-160
<210> 157
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Figure 107126050-A0305-02-0138-161
Figure 107126050-A0305-02-0139-162
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Figure 107126050-A0305-02-0139-163
<210> 159
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Figure 107126050-A0305-02-0139-164
<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Figure 107126050-A0305-02-0139-165
<210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Figure 107126050-A0305-02-0139-166
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Figure 107126050-A0305-02-0140-167
<210> 163
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Figure 107126050-A0305-02-0140-168
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Figure 107126050-A0305-02-0140-169
<210> 165
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Figure 107126050-A0305-02-0140-170
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Figure 107126050-A0305-02-0141-171
<210> 167
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Figure 107126050-A0305-02-0141-172
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Figure 107126050-A0305-02-0141-173
<210> 169
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Figure 107126050-A0305-02-0141-174
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Figure 107126050-A0305-02-0142-175
<210> 171
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
Figure 107126050-A0305-02-0142-176
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Figure 107126050-A0305-02-0142-177
<210> 173
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Figure 107126050-A0305-02-0142-178
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Figure 107126050-A0305-02-0142-179
<210> 175
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Figure 107126050-A0305-02-0143-180
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Figure 107126050-A0305-02-0143-181
<210> 177
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
Figure 107126050-A0305-02-0143-182
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Figure 107126050-A0305-02-0143-183
<210> 179
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
Figure 107126050-A0305-02-0144-184
<210> 180
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
Figure 107126050-A0305-02-0144-185
<210> 181
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 181
Figure 107126050-A0305-02-0144-186
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
Figure 107126050-A0305-02-0144-187
<210> 183
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Figure 107126050-A0305-02-0144-188
Figure 107126050-A0305-02-0145-189
<210> 184
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
Figure 107126050-A0305-02-0145-190
<210> 185
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Figure 107126050-A0305-02-0145-191
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Figure 107126050-A0305-02-0145-192
<210> 187
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
Figure 107126050-A0305-02-0145-193
<210> 188
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Figure 107126050-A0305-02-0146-194
<210> 189
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 189
Figure 107126050-A0305-02-0146-195
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
Figure 107126050-A0305-02-0146-196
<210> 191
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 191
Figure 107126050-A0305-02-0146-197
<210> 192
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 192
Figure 107126050-A0305-02-0147-198
<210> 193
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 193
Figure 107126050-A0305-02-0147-199
<210> 194
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 194
Figure 107126050-A0305-02-0147-200
<210> 195
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
Figure 107126050-A0305-02-0147-202
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
Figure 107126050-A0305-02-0147-203
Figure 107126050-A0305-02-0148-204
<210> 197
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
Figure 107126050-A0305-02-0148-205
<210> 198
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 198
Figure 107126050-A0305-02-0148-206
<210> 199
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
Figure 107126050-A0305-02-0148-207
<210> 200
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 200
Figure 107126050-A0305-02-0148-208
<210> 201
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 201
Figure 107126050-A0305-02-0149-209
<210> 202
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 202
Figure 107126050-A0305-02-0149-415
<210> 203
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
Figure 107126050-A0305-02-0149-210
<210> 204
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 204
Figure 107126050-A0305-02-0149-211
<210> 205
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
Figure 107126050-A0305-02-0150-212
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 206
Figure 107126050-A0305-02-0150-213
<210> 207
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
Figure 107126050-A0305-02-0150-214
<210> 208
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 208
Figure 107126050-A0305-02-0150-215
<210> 209
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
Figure 107126050-A0305-02-0150-216
Figure 107126050-A0305-02-0151-217
<210> 210
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 210
Figure 107126050-A0305-02-0151-218
<210> 211
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 211
Figure 107126050-A0305-02-0151-219
<210> 212
<21> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 212
Figure 107126050-A0305-02-0152-220
<210> 213
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Figure 107126050-A0305-02-0152-221
Figure 107126050-A0305-02-0153-222
<210> 214
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 214
Figure 107126050-A0305-02-0153-223
<210> 215
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
Figure 107126050-A0305-02-0153-224
Figure 107126050-A0305-02-0154-225
<210> 216
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
Figure 107126050-A0305-02-0154-226
<210> 217
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
Figure 107126050-A0305-02-0155-228
<210> 218
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
Figure 107126050-A0305-02-0155-229
Figure 107126050-A0305-02-0156-230
<210> 219
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
Figure 107126050-A0305-02-0156-231
<210> 220
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
Figure 107126050-A0305-02-0156-232
Figure 107126050-A0305-02-0157-233
<210> 221
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
Figure 107126050-A0305-02-0157-234
<210> 222
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
Figure 107126050-A0305-02-0158-235
<210> 223
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
Figure 107126050-A0305-02-0158-236
Figure 107126050-A0305-02-0159-238
<210> 224
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
Figure 107126050-A0305-02-0159-239
<210> 225
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
Figure 107126050-A0305-02-0159-240
Figure 107126050-A0305-02-0160-241
<210> 226
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Figure 107126050-A0305-02-0160-242
<210> 227
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
Figure 107126050-A0305-02-0160-243
Figure 107126050-A0305-02-0161-245
<210> 228
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
Figure 107126050-A0305-02-0161-246
<210> 229
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 229
Figure 107126050-A0305-02-0162-247
<210> 230
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
Figure 107126050-A0305-02-0162-248
Figure 107126050-A0305-02-0163-249
<210> 231
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 231
Figure 107126050-A0305-02-0163-250
<210> 232
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
Figure 107126050-A0305-02-0163-251
Figure 107126050-A0305-02-0164-252
<210> 233
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 233
Figure 107126050-A0305-02-0164-253
<210> 234
<21> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
Figure 107126050-A0305-02-0165-254
<210> 235
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 235
Figure 107126050-A0305-02-0165-255
Figure 107126050-A0305-02-0166-256
<210> 236
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 236
Figure 107126050-A0305-02-0166-257
<210> 237
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 237
Figure 107126050-A0305-02-0166-258
Figure 107126050-A0305-02-0167-259
<210> 238
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Figure 107126050-A0305-02-0167-260
<210> 239
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 239
Figure 107126050-A0305-02-0168-261
<210> 240
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 240
Figure 107126050-A0305-02-0168-262
Figure 107126050-A0305-02-0169-263
<210> 241
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<400> 241
Figure 107126050-A0305-02-0169-264
<210> 242
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 242
Figure 107126050-A0305-02-0169-265
<210> 243
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<400> 243
Figure 107126050-A0305-02-0170-266
<210> 244
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 244
Figure 107126050-A0305-02-0170-267
<210> 245
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 245
Figure 107126050-A0305-02-0170-268
Figure 107126050-A0305-02-0171-269
<210> 246
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 246
Figure 107126050-A0305-02-0171-270
<210> 247
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
Figure 107126050-A0305-02-0171-271
<210> 248
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 248
Figure 107126050-A0305-02-0172-272
<210> 249
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 249
Figure 107126050-A0305-02-0172-273
<210> 250
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 250
Figure 107126050-A0305-02-0172-274
Figure 107126050-A0305-02-0173-275
<210> 251
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 251
Figure 107126050-A0305-02-0173-276
<210> 252
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 252
Figure 107126050-A0305-02-0173-277
<210> 253
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 253
Figure 107126050-A0305-02-0174-280
<210> 254
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 254
Figure 107126050-A0305-02-0174-281
<210> 255
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 255
Figure 107126050-A0305-02-0174-282
Figure 107126050-A0305-02-0175-283
<210> 256
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 256
Figure 107126050-A0305-02-0175-284
<210> 257
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 257
Figure 107126050-A0305-02-0175-285
<210> 258
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 258
Figure 107126050-A0305-02-0176-286
<210> 259
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
Figure 107126050-A0305-02-0176-287
<210> 260
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 260
Figure 107126050-A0305-02-0176-288
Figure 107126050-A0305-02-0177-289
<210> 261
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 261
Figure 107126050-A0305-02-0177-416
<210> 262
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
Figure 107126050-A0305-02-0177-290
<210> 263
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 263
Figure 107126050-A0305-02-0178-291
<210> 264
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 264
Figure 107126050-A0305-02-0178-292
<210> 265
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
Figure 107126050-A0305-02-0178-293
<210> 266
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 266
Figure 107126050-A0305-02-0179-294
<210> 267
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
Figure 107126050-A0305-02-0179-295
<210> 268
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 268
Figure 107126050-A0305-02-0179-296
Figure 107126050-A0305-02-0180-297
<210> 269
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 269
Figure 107126050-A0305-02-0180-298
<210> 270
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 270
Figure 107126050-A0305-02-0180-299
<210> 271
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 271
Figure 107126050-A0305-02-0181-300
<210> 272
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 272
Figure 107126050-A0305-02-0181-301
<210> 273
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 273
Figure 107126050-A0305-02-0181-302
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 274
Figure 107126050-A0305-02-0181-303
<210> 275
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 275
Figure 107126050-A0305-02-0181-304
<210> 276
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 276
Figure 107126050-A0305-02-0182-305
<210> 277
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 277
Figure 107126050-A0305-02-0182-306
<210> 278
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 278
Figure 107126050-A0305-02-0182-307
<210> 279
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 279
Figure 107126050-A0305-02-0182-308
<210> 280
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 280
Figure 107126050-A0305-02-0183-309
<210> 281
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 281
Figure 107126050-A0305-02-0183-310
<210> 282
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 282
Figure 107126050-A0305-02-0183-311
<210> 283
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 283
Figure 107126050-A0305-02-0183-312
<210> 284
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 284
Figure 107126050-A0305-02-0183-313
<212> PRT
<213> 智人
<400> 285
Figure 107126050-A0305-02-0184-314
<210> 286
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 286
Figure 107126050-A0305-02-0184-315
<210> 287
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 287
Figure 107126050-A0305-02-0184-316
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 288
Figure 107126050-A0305-02-0184-317
<210> 289
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 289
Figure 107126050-A0305-02-0184-318
<210> 290
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 290
Figure 107126050-A0305-02-0185-319
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 291
Figure 107126050-A0305-02-0185-320
<210> 292
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 292
Figure 107126050-A0305-02-0185-321
<210> 293
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 293
Figure 107126050-A0305-02-0185-323
<210> 294
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 294
Figure 107126050-A0305-02-0185-324
<210> 295
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 295
Figure 107126050-A0305-02-0186-325
<210> 296
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 296
Figure 107126050-A0305-02-0186-326
<210> 297
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 297
Figure 107126050-A0305-02-0186-327
<210> 298
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 298
Figure 107126050-A0305-02-0186-328
<210> 299
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 299
Figure 107126050-A0305-02-0186-329
Figure 107126050-A0305-02-0187-330
<210> 300
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 300
Figure 107126050-A0305-02-0187-331
<210> 301
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 301
Figure 107126050-A0305-02-0187-332
<210> 302
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 302
Figure 107126050-A0305-02-0187-333
<210> 303
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 303
Figure 107126050-A0305-02-0187-334
<210> 304
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 304
Figure 107126050-A0305-02-0188-335
<210> 305
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Figure 107126050-A0305-02-0188-336
<210> 306
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 306
Figure 107126050-A0305-02-0188-337
<210> 307
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 307
Figure 107126050-A0305-02-0188-338
<210> 308
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 308
Figure 107126050-A0305-02-0189-339
<210> 309
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Figure 107126050-A0305-02-0189-340
<210> 310
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Figure 107126050-A0305-02-0189-341
<210> 311
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Figure 107126050-A0305-02-0189-342
<210> 312
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 312
Figure 107126050-A0305-02-0190-343
<210> 313
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 313
Figure 107126050-A0305-02-0190-344
<210> 314
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 314
Figure 107126050-A0305-02-0190-345
<210> 315
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 315
Figure 107126050-A0305-02-0190-346
<210> 316
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 316
Figure 107126050-A0305-02-0190-347
<210> 317
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 317
Figure 107126050-A0305-02-0191-348
<210> 318
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 318
Figure 107126050-A0305-02-0191-349
<210> 319
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 319
Figure 107126050-A0305-02-0191-350
<210> 320
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 320
Figure 107126050-A0305-02-0191-351
<210> 321
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 321
Figure 107126050-A0305-02-0192-352
<210> 322
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 322
Figure 107126050-A0305-02-0192-353
<210> 323
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 323
Figure 107126050-A0305-02-0192-354
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 324
Figure 107126050-A0305-02-0192-355
<210> 325
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 325
Figure 107126050-A0305-02-0192-356
Figure 107126050-A0305-02-0193-357
<210> 326
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 326
Figure 107126050-A0305-02-0193-358
<210> 327
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 327
Figure 107126050-A0305-02-0193-359
<210> 328
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
Figure 107126050-A0305-02-0194-360
<210> 329
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 329
Figure 107126050-A0305-02-0194-361
Figure 107126050-A0305-02-0195-413
<210> 330
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 330
Figure 107126050-A0305-02-0195-362
<210> 331
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 331
Figure 107126050-A0305-02-0195-363
Figure 107126050-A0305-02-0196-364
<210> 332
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 332
Figure 107126050-A0305-02-0196-365
<210> 333
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 333
Figure 107126050-A0305-02-0196-366
Figure 107126050-A0305-02-0197-367
<210> 334
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 334
Figure 107126050-A0305-02-0197-368
<210> 335
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 335
Figure 107126050-A0305-02-0198-369
<210> 336
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 336
Figure 107126050-A0305-02-0198-370
<210> 337
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 337
Figure 107126050-A0305-02-0198-371
Figure 107126050-A0305-02-0199-372
<210> 338
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 338
Figure 107126050-A0305-02-0199-373
<210> 339
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 339
Figure 107126050-A0305-02-0199-374
<210> 340
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 340
Figure 107126050-A0305-02-0200-375
<210> 341
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 341
Figure 107126050-A0305-02-0200-376
<210> 342
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 342
Figure 107126050-A0305-02-0200-377
Figure 107126050-A0305-02-0201-378
<210> 343
<211> 126
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 343
Figure 107126050-A0305-02-0201-379
<210> 344
<211> 113
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 344
Figure 107126050-A0305-02-0201-380
Figure 107126050-A0305-02-0202-381
<210> 345
<211> 130
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 345
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Claims (20)

  1. 一種與人TIGIT結合的分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合，其中：HCDR1包含SEQ ID NO：16(YTFTSYYMH)，HCDR2包含SEQ ID NO：17(VIGPSGASTSYAQKFQG)，HCDR3包含SEQ ID NO：18(ARDHSDYWSGIMEV)，LCDR1包含SEQ ID NO：61(RASQSVRSSYLA)，LCDR2包含SEQ ID NO：62(GASSRAT)，且LCDR3包含SEQ ID NO：63(QQYFSPPWT)。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：221所示的胺基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：222所示的胺基酸序列或與其展現出至少90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其為人IgG抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其選擇性地消耗表現TIGIT的Treg細胞。
  5. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其對表現TIGIT的Treg細胞和表現TIGIT的CD8+ T細胞展現出等同的親和力。
  6. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其降低CD8 T細胞和/或Treg細胞上的TIGIT表現。
  7. 如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中該人IgG抗體為人IgG1抗體。
  8. 一種分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  9. 一種分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合，其編碼抗TIGIT抗體的VH結構域和VL結構域，其中該分離的多核苷酸或分離的多核苷酸的組合包含SEQ ID NO：251和SEQ ID NO：252。
  10. 一種表現載體，其包含與調節序列有效(operably)連接的如請求項8或請求項9之多核苷酸或多核苷酸的組合，該調節序列允許該抗體或其抗原結合片段在宿主細胞中表現。
  11. 一種宿主細胞，其包含如請求項10之表現載體。
  12. 一種產生重組抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在允許該抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養請求項11之宿主細胞，以及回收所表現 的抗體或其抗原結合片段。
  13. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其係用於療法。
  14. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其係用於治療癌症的方法。
  15. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，及至少一種醫藥上可接受之載體或賦形劑。
  16. 如請求項15之藥物組合物，其係用於療法。
  17. 如請求項15之藥物組合物，其係用於治療癌症的方法。
  18. 一種如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項15之藥物組合物的用途，其係用於製備用於治療癌症的藥物。
  19. 如請求項18之用途，其中該藥物與一或多種另外的治療劑投與。
  20. 如請求項19之用途，其中該一或多種另外的治療劑係選自：化學治療劑、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗41BB抗體、抗OX40抗體、抗GITR抗體和抗ICOS抗體。
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