BR112019015552A2

BR112019015552A2 - Composições e métodos para promover crescimento capilar com os inibidores de mpc1

Info

Publication number: BR112019015552A2
Application number: BR112019015552-0A
Authority: BR
Inventors: E. Lowry William; CHRISTOFK Heather
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2020-03-17
Also published as: IL268345A; KR102440809B1; PE20200600A1; CN110300583A; AU2017314833A1; EA038943B1; JP7046086B2; EP3585381A1; IL268345B; EP3585381A4; SG11201906807VA; KR20190119118A; MX2019010101A; US11213513B2; CA3050635A1; EA201991988A1; JP2020524127A; US20200030289A1

Abstract

são fornecidos aqui métodos de acelerar, promover ou restaurar o crescimento capilar, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (i). também são fornecidas composições compreendendo o composto de fórmula (i).

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PROMOVER CRESCIMENTO CAPILAR COM OS INIBIDORES DE MPCT. PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório US 62/380. 205, depositado em 26 de agosto de 2016, e 62/463. 232, depositado em 24 de fevereiro de 2017, incorporados por referência nas suas totalidades.

FUNDAMENTOS [002] Mais de 400 milhões de pessoas em todo o mundo têm calvície. A calvície masculina afeta cerca de 50% da população masculina com 50 anos ou mais. Os tratamentos disponíveis para o crescimento do cabelo produzem pelos curtos e difusos e exigem aplicação contínua. Ou seja, quando o tratamento para, o crescimento de novos cabelos termina e a perda de cabelo é retomada.

[003] Dois fármacos atualmente aprovados pela Food & Drug Administration (FDA) para o tratamento da calvície são ROGAINE® (minoxidil tópico) e PROPECIA® (finasterida oral). O minoxidil é o único medicamento aprovado pela FDA para tratar a calvície feminina, mas só funciona para a perda de cabelo no topo da cabeça. A finasterida é usada em homens apenas porque pode causar defeitos congênitos em mulheres grávidas. A finasterida também tem efeitos adversos na saúde sexual.

[004] Existe uma necessidade de composições e métodos melhorados para acelerar, promover ou restaurar o crescimento capilar com menos efeitos adversos.

SUMÁRIO [005] Um aspecto da divulgação refere-se a métodos de acelerar, promover ou restaurar o crescimento capilar, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I):

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[006] Em algumas modalidades, são aqui divulgados métodos de tratamento de uma condição selecionada de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.

[007] Outro aspecto da divulgação refere-se a composições compreendendo um composto de fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo adequado para aplicação tópica à pele.

[008] Em algumas modalidades, aqui descritas, as composições podem ser utilizadas na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição como aqui descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [009] A Figura 1a mostra que a atividade da Lactato Desidrogenase foi enriquecida no nicho de células-tronco do folículo capilar. A coloração imuno-histoquímica (IHC) para a expressão de Ldha ao longo do ciclo capilar mostra a proteína Ldha confinada ao nicho da célula-tronco do folículo capilar (HFSC), o bojo, indicado pelo parêntese. A coloração IHC para Ldh total na epiderme mostra expressão na epiderme interfolicular, Infundíbulo, glândula sebácea e

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3/46 bojo do folículo capilar, mostrada no parêntese. A coloração IHC para Sox9 em seções seriais demarca a população HFSC. Barras de escala, 20 pm.

[0010] A Figura 1b, immunoblotting em populações de HFSC isoladas por FACS (a6low/Cd34⁺ e a6hi/Cd34⁺) versus epiderme total (Epi) mostra a expressão diferencial de Ldha no nicho de células-tronco. Sox9 é um marcador de HFSCs e β-actina é um controle de carga.

[0011] A Figura 1c, ensaio colorimétrico da atividade da enzima Ldh na epiderme mostra maior atividade na camada muscular do bojo (parênteses) e subcuticular (parênteses). Esta atividade foi enriquecida no bojo em diferentes fases do ciclo capilar. A atividade é indicada pela cor escura; o cinza é uma contracoloração nuclear. Note também que o desenvolvimento de fios de cabelo em camundongos pigmentados mostra fortes depósitos de melanina como observado aqui; os fios de cabelo nunca exibiram nenhuma mancha escura indicativa de atividade de Ldh.

[0012] A Figura 1d, atividade de Ldh em populações de células tríadas, medida usando um ensaio baseado em leitor de placa, também mostra a maior atividade de Ldh em duas populações distintas de HFSC (a6low/Cd34⁺ e a6hi/Cd34⁺) comparada às células epidérmicas (Epi) e fibroblastos (FBs). Cada barra representa o sinal médio para cada tipo de célula, onde n ~ 9 camundongos agrupados de 3 experimentos independentes. Mostrado como média ± s.e.m. T-teste pareado realizado, P < 0,05 mostrado para cada tipo de célula versus células epidérmicas.

[0013] A Figura 1e, HFSCs e células epidérmicas foram isoladas durante o telógeno (dia 50) por FACS, e os metabolitos foram extraídos e analisados por LC-MS. Mapas térmicos mostram níveis relativos de metabolitos glicolíticos e ciclo TCA de células isoladas de camundongos diferentes em experimentos independentes com células de três animais

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4/46 em cada, G6P-F6P, gllcose-6-fosfato e frutose-6-fosfato; FBP, frutosebisfosfato; DHAP, fosfato de di-hidroxiacetona; 3PG, 3-fosfoglicerato; e aKG, alfa-cetoglutarato. Os asteriscos indicam diferença significativa nos níveis de metabolites entre as células epidérmicas e as HFSCs, [0014] A Figura 1f, atividade de Ldh em populações de célulastronco separadas, medidas usando um ensaio baseado em leitoras de placas, mostra elevada atividade de Ldh à medida que as células-tronco se tornam ativadas na transição de telógeno para anágeno (Tel-Ana). [0015] A Figura 1g, mapa Térmico mostrando os níveis relativos dos metabolites glicolíticos e do ciclo de TCA extraídos das HFSCs quiescentes (Dia 50) e ativadas (Dia 70). Os asteriscos indicam diferença significativa entre os níveis de metabolites da HFSC.

[0016] A Figura 1 h, mapa térmico mostrando os níveis relativos dos metabolites glicolíticos e do ciclo TCA extraídos do quiescente (telógeno, dia 50), ativado (telógeno-anágeno, dia 70) e HFSCs que retomaram ao estado quiescente (anágeno, dia 90). Piruvato; Lac, laotato.

[0017] A Figura 1 i, Análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA) de dados de transcriptoma de RNA-seq ¹¹ de HFSCs versus epiderme total mostra enriquecimento para genes relacionados com glicólise em HFSCs (pontuação de enriquecimento normalizado (NES) = 1,72) [0018] A Figura 1j, GSEA em dados de transcriptoma de microarranjo de HFSCs versus epiderme total mostra enriquecimento para genes relacionados com glicólise em HFSCs (NES = 1,45) [0019] A Figura 1 k, dados de RNA-seq de HFSCs classificados durante a transição de telógeno ou telógeno-anágeno (Tel-Ana) mostram indução de Ldha.

[0020] A Figura 2a mostra a exclusão da atividade de Ldh bloqueada pela ativação de HFSC. Os animais Ldha*^l+ entraram no

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5/46 ciclo capilar (anágeno) de forma síncrona por volta do dia 70, medido pela raspagem e pela observação a partir do dia 50. Animais K15CrePR; Ldha^fí™ tratados com mifepristona mostram defeitos na entrada anágena.

[0021] A Figura 2b, patologia da pele mostrando que os animais K15CrePR; Ldha*¹* entraram em um anágeno normal tipificado pelo crescimento do folículo e espessamento hipodérmico, enquantoos animais Ldha^fím não mostraram nem permaneceram no telógeno.

[0022] A Figura 2c, o ensaio de atividade enzimática de Ldh mostrou forte atividade em HFSCs em animais K15CrePR; Ldha*^/+, enquanto animais K15CrePR; Ldha^m não tinham essa atividade nas HFSCs. (Nicho de HFSC indicado por parênteses).

[0023] A Figura 2d, gráfico mostrando a porcentagem de folículos em telógeno, transição telógeno-anágeno e anágeno em camundongos K15CrePR; Ldha*^l+ versus camundongos K15CrePR; Ldha^i}Í·:

[0024] A Figura 2e, mapa térmico mostrando os níveis relativos de metabolites glicoiíticos e do ciclo de TCA extraídos de HFSCs Ldha*¹* e HFSCs Ldha^ÍVfí e medidos por LC-MS. Os asteriscos indicam diferença significativa entre os níveis de metabolites da HFSC.

[0025] A Figura 2f, a coloração por imuno-histoquímica para Ki-67, um marcador de proliferação, está ausente em HFSCs Ldha^m. Phospho-S6, um marcador em HFSCs no início de um novo ciclo capilar, estava ausente em HFSCs Ldha^Wfí. A coloração para Ldha mostrou deleção específica em HFSCs. Os parênteses indicam o bojo. A coloração de Sox9 mostra que as HFSCs ainda estavam presentes no nicho sem Ldha. Barras de escala, 20 pm.

[0026] A Figura 2g, animais que possuem Ldha deletados especificamente em suas HFSCs como controlados por Lgr5CreER, mostram defeitos profundos na entrada em anágeno. direita, Patologia da pele mostrando que animais Lgr5CreER;Ldha^íl/fl principalmente

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6/46 permaneceram em telógeno. Barras de escala indicam 100 pm.

[0027] A Figura 2h, ensaio de atividade enzimática na epiderme mostra que os anímaisLgr5CreER;Ldha^fí/fí não tinham essa atividade nas HFSCs. Barras de escala indicam 20 pm.

[0028] A Figura 2í, análise de LC-MS de metabolites dos camundongos indicados.

[0029] A Figura 3a mostra a deleção de Mpc1 em células-tronco do folículo capilar que ativou um novo ciclo capilar. Os animais Mpc1^Wiapresentaram pigmentação e crescimento capilar, consistente com a entrada no ciclo anágeno às 9 semanas, enquanto os animais Mpd^+Í+não apresentaram pigmentação e crescimento capilar tão cedo.

[0030] A Figura 3b, o isolamento por FACS de populações de bojo de HFSC em camundongos Mpc1^+/+ versus Mpc1^ü!fí seguido por Western blotting mostrou deleção bem-sucedida da proteína Mpc1 no nicho de células-tronco. β-actina é um controle de carregamento.

[0031] A Figura 3c, o ensaio Platereader para a atividade de Ldh em populações de HFSC selecionadas, mostra atividade elevada em Mpc1^m comparada com HFSCs Mpc1^+/*.

[0032] A Figura 3d, a quantificação do fenótipo à direita mostra a porcentagem de folículos em telógenos, a transição de telógeno para anágeno e anágeno em camundongos Mpcr^l+ versus camundongos Mpc1^m.

[0033] A Figura 3e, a histologia em pele de deleção de tipo selvagem versus Mpd mostrou indução de anágeno na ausência de Mpc1. Barras de escala indicam 100 pm.

[0034] A Figura 3f, a coloração por imuno-histoquímica para Ki-67, um marcador de proliferação que é ativo apenas em HFSCs no início de um novo cicio capilar, estava presente apenas em HFSCs Mpc1^m em

8,5 semanas, consistente com sua entrada acelerada em um novo ciclo capilar. Phospho-S6, outro marcador que é apenas ativo em HFSCs no

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7/46 início de um novo ciclo capilar, estava presente apenas em HFSCs Mpc1^fím. A coloração de Sox9 mostra que as HFSCs estavam presentes no nicho sem Mpc1.

[0035] A Figura 3g_s a deleção de Mpc1 em camundongos portadores do alelo LgrõCreER mostra forte indução do ciclo capilar. Observe que as caixas vermelhas indicam áreas de crescimento de novos cabelos.

[0036] A Figura 3h, a quantificação da pigmentação nos genótipos indicados em três ninhadas independentes.

[0037] A Figura 3i, os animais tratados topicamente com o composto de fórmula (I) (20μΜ) mostraram pigmentação e crescimento capilar, indicativos de entrada em anágeno, após 8 dias de tratamento. O anágeno completo, indicado pela pelagem completa, foi obtido após 14 dias de tratamento. Camundongos tratados topicamente com controle de veículo não mostraram pigmentação nem crescimento capilar mesmo após 12 dias de tratamento, direita, patologia da pele mostrando que os animais tratados com o composto de fórmula (I) entraram num anágeno acelerado em 8 semanas tipificado por baixo crescimento do foiículo e espessamento hipodérmico, enquanto animais tratados com controle de veículo não mostraram nem permaneceram em telógeno.

[0038] A Figura 3], gráfico mostrando o tempo para o fenótipo observado em camundongos tratados com veículo versus composto de fórmula (I).

[0039] A Figura 3k, o ensaio de atividade da enzima Ldh na epiderme, mostrou forte atividade em HFSCs em animais de controle de veículos e compostos de fórmula (I). A atividade enzimática de Ldh foi também observada na epiderme interfolicular de animais tratados com composto de fórmula (I). A atividade de Ldh é indicada pela coloração escura; o cinza é contracoloração vermelha rápida nuclear.

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8/46 [0040] A Figura 31, análise metabolômica de lactato em HFSCs isoladas a partir do composto de pele tratada com fórmula (I) durante 48 horas.

[0041] A Figura 4a mostra a estratégia de triagem empregada para isolar duas populações de células do bojo. Este tipo particular foi usado para isolar as amostras de proteína mostradas por western blot na Fig. 1d.

[0042] A Figura 4b mostra coloração imuno-histoquímica (IHC) (superior) com anticorpo que reconhece especificamente Ldha e (inferior) com anticorpo que reconhece múltiplas isoformas da proteína lactato desidrogenase (Ldh). Barras de escala, 20 pm.

[0043] A Figura 4c, a coloração para o Ki-67 marca as células em divisão durante vários estágios do ciclo capilar. Os parênteses indicam o nicho de HFSC.

[0044] A Figura 4d, topo, validação do ensaio de atividade enzimática de Ldh colorimétrico. A maior atividade da enzima Ldh foi observada no bojo de HFSC e no músculo. Atividade indicada pela cor escura; o cinza é contracoloração vermelha rápida. Na ausência de substrato lactato não houve atividade detectável (cor escura). Inferior, validação adicional do ensaio de atividade da enzima Ldh colorimétrica. Atividade enzimática inibida pelo tratamento da pele com ácido clorídrico (HCI) antes da adição da solução de coloração com substrato lactato. Nenhuma atividade de Ldh (cor escura) detectada. Pele em que a atividade enzimática não é inibida por HCI mostra a maior atividade da enzima Ldh no bojo de HFSC e no músculo. Barras de escala, 50 pm.

[0045] A Figura 4e, análise dos dados de RNA-seq para validar que as HFSCs na transição teiógeno-anágeno estavam de fato em tal transição. Sabe-se que a transição telógeno-anágeno é impulsionada pelos sinais Shh (fatores Gli são alvos) e Wnt (Lef1, Axin, Condi são

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9/46 alvos) e correlacionada com o aumento da proliferação (Ki67 e Pena). Além disso, o Sox4 foi previamente identificado como um regulador da transição teiógeno-anágeno.

[0046] A Figura 4f, animais K15CrePR;Ldha^f!/fi tratados com Mifepristona durante o teiógeno (dia 50) foram deixados a desenvolver durante 6 meses. Nenhum dos camundongos K15CrePR;Ldha^fí/fímostrou regeneração completa do cabelo, em comparação com os animais de controle que todos cresceram completamente.

[0047] A Figura 4g, Exame histológíco de longo prazo dos camundongos K15CrePR;Ldha^fí/fí mostrou que HFSCs Ldha-null permaneceram em teiógeno enquanto HFSCs de tipo selvagem passaram por anágeno e então retornaram ao teiógeno. Isso é aparente em seções espessas (50 microns, à direita) que mostram um aumento no número de pelos no WT em relação aos folículos Ldha~nu\os. Barras de escala indicam 100 micrometres (esquerda) e 20 micrometres (meio e direita).

[0048] A Figura 4h, o marcador IHC para HFSC Sox9 mostrou que a deleção de Ldha de HFSCs não afeta sua presença no bojo mesmo após 6 meses. Além disso, os ensaios de atividade IHC e Ldh demonstram que a deleção de Ldha foi sustentada. Por causa do mosaicismo da deleção, em algumas porções de pele K15CrePR;Ldha^fí/fí, o Ldha não foi deietado. Na linha inferior está o tecido da pele que contém pelos nos camundongos K15CrePR;Ldha^fí/flonde Ldha ainda era expresso, mostrando que o novo crescimento capilar em camundongos K15CrePR;Ldha^fí/fí foi devido à falta de deleção de Ldha causada pela abordagem em mosaico usada para mediar a recombinação Cre. Barras de escala indicam 20 micrometres. [0049] A Figura 4i, para determinar como várias vias de sinalização anteriormente ligadas ao ciclo capilar são afetadas pela perda de Ldha em HFSCs, realizamos IHC para marcadores que indicam a atividade

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10/46 dessas vias em telógeno e na transição telógeno-anágeno. Observe que o pStat5 parece estar suprimido na transição normal telógeno-anágeno, e isso não parece ocorrer em HFSCs Ldha·· nulas. pStatl e pStat3 não parecem ser afetados pela perda de Ldha. A expressão de Gli3, um alvo da sinalização Shh, é tipicamente induzida em um germe de cabelo ativado derivado de HFSCs, mas HFSCs Ldha-nulas não fazem um germe de cabelo ativo. A ativação da via Wnt é indicada pela localização nuclear de β-catenina, e muito pouca β-catenina nuclear foi detectada em HFSCs Ldha-nulas. Barras de escala indicam 6 micrômetros.

[0050] A Figura 4j, seis meses após o início da deleção de Mpc1 em HFSCs (K15CrePR; Mpdfl/fl), camundongos sem Mpd não mostram efeitos deletérios como medidos pelo ciclo capilar (esquerda), patologia (meio, H e E), ou coloração por HFSCs (direita, Sox9). As barras de escala indicam 100 micrômetros no painel central e 50 micrômetros no painel direito.

[0051] A Figura 4k, para demonstrar que a deleção de Mpd promove proliferação especificamente em HFSCs, usamos camundongos K15CrePR;Ldha^lVfí portadores de um alelo de lox-stoplox-Tomato para observar HFSCs K15+ e proliferação com e sem deleção de Mpc1 (esquerda). Além disso, aproveitamos o ires-GFP dentro do alelo Lgr5CreER para colorir o Ki-67 e o GFP e procurar por colocalização com e sem deleção de Mpd (direita). Suportes brancos denotam área de bojo. Barras de escala representam 20 micrômetros.

[0052] A Figura 4I, a deleção de Mpd em camundongos portadores do alelo Lgr6CreER não mostra indução prematura do ciclo capilar.

[0053] A Figura 4m, o ensaio de atividade de Ldh em HFSCs triados de camundongos de controle ou com deleção de Mpd mediada por Lgr6CreER mostrou atividade aumentada em células sem Mpc1. [0054] A Figura 4n, análise da via KEGG, mostra genes

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11/46 relacionados com as vias metabólicas induzidas em HFSCs (vermelho) versus aqueles suprimidos (verde).

[0055] A Figura 5a, animais Ldha +/+ entram no ciclo capilar (anágeno) de forma síncrona no dia 70, medido pela raspagem e observação começando no dia 50. Os animais Ldha fl/fl que possuem Ldha deletado especificamente em suas HFSCs como controlados por LgrõCreER, mostram defeitos profundos na entrada no anágeno. direita, patologia cutânea mostrando que os animais Ldha +/+ entram em anágeno normal tipificado pelo crescimento do folículo e espessamento hipodérmico, enquanto os animais Ldha fl/fl não mostraram nem permaneceram em telógeno.

[0056] A Figura 5b, o ensaio de atividade enzimática de Ldh na epiderme mostra uma forte atividade em HFSCs em animais Ldha +/+, enquanto os animais Ldha fl/fl não tinham esta atividade nas HFSCs. (Nicho de HFSC indicado por parênteses).

[0057] A Figura 6a_s experiências replicadas adicionais para perda de MPC1 em HFSCs. Duas experiências independentes em que a perda de MPC1 em HFSCs foi iniciada pelo tratamento com Mifepristona no dia 50.

[0058] A Figura 6b, experiência de replicação adicional de análise metabolômica de lactato após 48-72 horas de tratamento com o composto de fórmula (I). As experiências também mostraram um aumento nos níveis de lactato, semelhantes aos mostrados na Fig. 3.

[0059] A Figura 7. Os animais tratados topicamente com o composto de fórmula (I) (20 μΜ) apresentaram crescimento capilar mais completo. Camundongos tratados topicamente com o controle do veículo mostraram crescimento capilar irregular.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0060] As células-tronco do folículo capilar (HFSCs) são células quiescentes de vida longa que são responsáveis por manter a

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12/46 homeostase celular do folículo. Enquanto normalmente dormentes, as HFSCs são rapidamente ativadas para se dividirem durante um novo ciclo capilar. Sabe-se que a quiescência de HFSCs é regulada por vários mecanismos intrínsecos e extrínsecos.

[0061] O folículo capilar é capaz de passar por ciclos cíclicos de repouso (telógeno), regeneração (anágeno) e degeneração (catágeno). A capacidade do folículo capilar de manter este ciclo depende da presença das células-tronco do folículo capilar, que residem no bojo (Fig. 1a). No início do anágeno, as células-tronco do bojo são ativadas por sinais recebidos da papila dérmica, que nessa fase encosta na área de bojo. Essas células-tronco saem do bojo e proliferam para baixo, criando uma trilha que se transforma na bainha radicular externa (ORS). Células-tronco do bojo são capazes de dar origem a todos os diferentes tipos de células do folículo capilar. A capacidade de HFSCs de manter a quiescência e ainda se tornar proliferativa por alguns dias antes de retornar à quiescência é única neste tecido.

[0062] As HFSCs exibem uma capacidade de ir e vir entre estados proliferativos e quiescentes in vivo durante o ciclo capilar¹·². Novos métodos para estudar o metabolismo de HFSCs in vivo são aqui fornecidos. A evidência é fornecida de que essas células requerem glicólise e atividade de lactato desidrogenase para permitir sua reativação após longos períodos de dormência. Além disso, esses achados foram usados para descobrir novos métodos farmacológicos para promover a ativação da HFSC e o ciclo capilar.

Métodos de Uso [0063] Em um aspecto, a divulgação fornece métodos de acelerar, promover ou restaurar o crescimento capilar, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I):

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0064] A expressão “restabelecer o crescimento capilar”, tal como aqui utilizada, significa melhorar o crescimento capilar. Por exemplo, isso inclui a proliferação ou ativação de células-tronco do folículo capilar, por exemplo, deslocamento dos folículos capilares da fase de repouso para a fase de crescimento ativo. Além disso, quando um sujeito apresenta sintomas, tais como alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície, o tratamento com um composto ou composição aqui descrito reduz estes sintomas em comparação com antes do tratamento. Em algumas modalidades, a restauração do crescimento capilar é medida em relação à ausência de administração do composto de fórmula (I).

[0065] Exemplos não limitativos de melhorias no crescimento capilar correlacionados à aceleração, promoção ou restauração do crescimento capilar podem ser selecionados de:

(a) melhoria na espessura da bainha radicular;

(b) melhoria na ancoragem capilar;

(c) diminuição da queda de cabelo;

(d) redução na quebra do cabelo;

(e) aumento da força capilar;

(f) melhoria na taxa de crescimento do cabelo;

(g) melhoria no brilho;

(h) melhoria do número de fios de cabelo visíveis;

(i) melhoria no comprimento do cabelo;

(j) melhoria no volume do fio;

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14/46 (k) mudança da fase telógena para a fase anágena;

(l) entrada em um novo ciclo capilar;

(m) aumento dos folículos capilares na fase de crescimento;

(n) aumento na ativação de células-tronco do folículo capilar (HFSC);

(o) ativar uma HFSC inativa;

(p) aumentar a glicólise em uma HFSC;

(q) ativar lactato desidrogenase em uma HFSC.

[0066] Em algumas modalidades, a administração compreende aplicar topicamente uma composição compreendendo o composto a uma área afetada.

[0067] Em algumas modalidades, o sujeito exibe sintomas selecionados de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície. Em algumas modalidades, o sujeito exibe sintomas selecionados de perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.

[0068] Em algumas modalidades, o sujeito exibe a calvície. Em algumas modalidades, a calvície é calvície de padrão masculino ou calvície de padrão feminino.

[0069] Em algumas modalidades, o sujeito exibe sintomas selecionados de perda de cabelo e queda de cabelo. Em algumas modalidades, a perda de cabelo ou queda de cabelo são causadas por eflúvio anágeno ou eflúvio telógeno.

[0070] Em algumas modalidades, o eflúvio anágeno é desencadeado pela quimioterapia (por exemplo, fármacos citostáticos) e pela ingestão de produtos tóxicos (por exemplo, veneno de rato).

[0071] Em algumas modalidades, o eflúvio telógeno é desencadeado por estresse (por exemplo, vacinações, trauma físico (incluindo acidente de carro, cirurgia e parto), doença crônica e certos medicamentos, incluindo antidepressivos) e dieta (por exemplo, falta de ferro, excesso de ferro, falta de zinco, falta de L-lisina, falta de vitamina

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B6, falta de vitamina B12 e excesso de vitamina A).

[0072] Em algumas modalidades, a perda de cabelo ou queda de cabelo são causados por um distúrbio autoímune.

[0073] Em algumas modalidades, a alopecia é selecionada de alopecia juvenil, alopecia prematura, alopecia senil, alopecia areata, alopecia androgenética, alopecia mecânica, alopecia pós~parto e alopecia sintomática.

[0074] Em algumas modalidades, o composto é aplicado a um folículo capilar.

[0075] Em algumas modalidades, o composto de fórmula (I) é utilizado na fabricação de um medicamento para o tratamento de quaisquer sintomas ou estados aqui descritos.

[0076] Em algumas modalidades, a condição está retardando ou interrompendo o crescimento capilar. Em algumas modalidades, a condição de retardar ou interromper o crescimento capilar é selecionada de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície. Em algumas modalidades, a condição selecionada de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.

[0077] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, o método compreende ativar uma HFSC quiescente. Em algumas modalidades, a HFSC quiescente está em um sujeito. Em algumas modalidades, a HFSC quiescente está num sujeito humano.

[0078] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, o método compreende aumentar a glicólise em uma HFSC. Em algumas modalidades, os níveis de metabolitos glicolíticos são aumentados em relação à ausência de administração do composto de fórmula (I). Em algumas modalidades, os metabolitos glicolíticos são selecionados a partir de glicose; G6P, giicose-6-fosfato; F6P, frutose-6-fosfato; FBP, frutose-bisfosfato; DHAP, fosfato de di-hidroxiacetona; 3PG, 3fosfoglicerato; 3PL, 3-fosfolactato; e aKG, alfa-cetoglutarato. Em

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16/46 algumas modalidades, os metabolites glicolíticos são selecionados a partir de glicose; G6P; F6P; FBP; DHAP; 3PG; e 3PL.

[0079] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, o método compreende ativar a lactato desidrogenase numa HFSC.

[0080] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, a HFSC é uma HFSC humana. Em algumas modalidades, a HFSC está dentro de um sujeito humano.

Composições [0081] Em um outro aspecto, a presente divulgação proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I), opcionalmente misturada com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0082] As composições e métodos da presente divulgação podem ser utilizados para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo. Em certas modalidades, o indivíduo é um mamífero, como um humano, ou um mamífero não humano. Quando administrada a um animal, como um humano, a composição ou o composto é, preferencialmente, administrado como uma composição farmacêutica que compreende, por exemplo, o composto de fórmula (I) da divulgação e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, soluções aquosas, como água ou solução salina fisiologicamente tamponada ou outros solventes ou veículos como glicóis, glicerol, óleos, tais como azeite, ou ésteres orgânicos injetáveis. Os excipientes podem ser escolhidos, por exemplo, para efetuar liberação retardada de um agente ou para alvejar seletivamente uma ou mais células, tecidos ou órgãos. A composição farmacêutica pode estar numa forma unitária de dosagem tal como tablete, cápsula (incluindo cápsula dispersível e cápsula de gelatina), grânulo, liófilo para reconstituição, pó, solução, xarope, creme, loção ou semelhantes. A composição pode também

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17/46 estar presente num sistema de liberação transdérmica, por exemplo, um emplastro de pele. A composição pode também estar presente numa solução ou composição adequada para administração tópica.

[0083] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo um composto de fórmula (I):

[0084] Em algumas modalidades, o veículo ou excipiente é geralmente seguro e não irritante quando aplicado à pele, em particular, para aplicação no cabelo ou no couro cabeludo.

[0085] Um veículo farmaceuticamente aceitável pode conter agentes fisiologicamente aceitáveis que atuam, por exemplo, para estabilizar, aumentar a solubilidade ou para aumentar a absorção de um composto tal como o composto de fórmula (I) da divulgação. Tais agentes fisiologicamente aceitáveis incluem, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranas, antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular ou outros estabilizantes ou excipientes. A escolha de um veículo farmaceuticamente aceitável, incluindo um agente fisiologicamente aceitável, depende, por exemplo, da rota de administração da composição. A preparação da composição pode ser um sistema de liberação de fármaco autoemulsificante ou um sistema de liberação de fármaco automicroemulsificante. A composição (preparação) pode também ser um lipossoma ou outra matriz de polímero, que pode ter nele incorporado, por exemplo, o composto de

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18/46 fórmula (I) da divulgação. Lipossomas, por exemplo, que compreendem fosfolipídeos ou outros lipídeos, são veículos fisiologicamente aceitável e metabolizáveis não tóxicos que são relativamente simples de fabricar e administrar.

[0086] A expressão “farmaceuticamente aceitável” é empregada no presente documento para referir-se àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão contidas no escopo do julgamento médico do parecer, adequados para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma razão benefício/risco razoável.

[0087] A expressão “veículo farmaceuticamente aceitável” conforme usado no presente documento significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um líquido ou uma carga sólida, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação. Cada veículo deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudiciais para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem:(1) açúcares, como glicose, lactose e sacarose; (2) amidos, tais como o amido de milho, amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de girassol, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho, óleo de soja (por exemplo, óleo de soja glicina), óleo de linhaça (por exemplo, óleo de semente linum usitatissium), e óleo de eucalipto (por exemplo, óleo de folha de eucalyptus globulus); (10) glicóis, como o propileno glicol; (11) polióis, tais como a glicerina, sorbitol, manitol e poiietilenoglicol; (12) ésteres, tais como o oleato de etil e laurato de etil;

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19/46 (13) ágar; (14) agentes tamponadores, tais como o hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) saiina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de tampão de fosfato; e (21) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas. [0088] Em algumas modalidades, o veículo é selecionado de polióis (por exemplo, propileno glicol, butileno glicol, pentileno glicol, hexileno glicol, caprilil glicol, e glicerina), carbitol, éteres de glicol (por exemplo, o éter monobutílico de etileno glicol, éter monometílico de propileno glicol, éter monobutílico de propileno glicol, dipropileno glicol e dietileno glicol), éteres alquilicos (por exemplo, éter monoetíiico de dietileno glicol (etoxi diglicol) e éter monobutílico de dietileno glicol), água livre de pirogêneos, álcool (por exemplo, álcool etílico, isopropanol, propanol, butanol, álcool benzílico, e álcool feniletílico).

[0089] Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão. Emulsões incluem óleo em água, silicone em água, água em óleo, água em silicone e semelhantes. Quando formulado como uma emulsão, um emulsificador é tipicamente incluído.

[0090] Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um ingrediente selecionado de um tensoativo, um espessante, uma fragrância, um agente de filtro de UV, uma cera, um silicone, um conservante, um óleo, uma vitamina, uma provitamina, um opacificante, um antioxidante, um emulsionante, um excipiente, um solvente e um tampão. Exemplos dos agentes anteriores podem ser encontrados no International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Twelfth Ed., 2008 ou online (aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[0091] Exemplos de um tensoativo incluem, mas não estão limitados a, oleto 5, ácido oleico, dodecil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio e poloxâmero 407.

[0092] Exemplos de um espessante incluem, mas não estão

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20/46 limitados a, álcoois graxos (por exemplo, álcool cetílico e álcool oleílico), fenóis etoxilados (por exemplo, octoxinol-1, nonoxinol-4 e nonoxinol-9), e polímeros (por exemplo, hidroxietilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose).

[0093] Exemplos de um agente de filtro de UV incluem, mas não estão limitados a, avobenzona, benzofenona~4, oxibenzona, octinoxato, dióxido de titânio e óxido de zinco.

[0094] Exemplos de cera incluem, mas não estão limitados a, cera de abelhas, cera de candelila, cera de carnaúba e cera de rícino.

[0095] Exemplos de um conservante Incluem, mas não estão limitados a, isotiazolinonas, parabenos, fenoxietanol, ácido benzoico, benzoato de sódio, ácido sórbico e sorbato de potássio.

[0096] Exemplos de um óleo incluem, mas não estão limitados a, óleo de abacate, óleo de coco, óleo de línhaça, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja.

[0097] Exemplos de uma vitamina incluem, mas não estão limitados a, vitamina E, vitamina C, vitamina B.

[0098] Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a:(1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, ácido eritórbico e ácido isoascórbico cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbil, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propil, alfa-tocoferol e afins; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

[0099] Exemplos de um emulsionante incluem, mas não estão limitados a, ceteareto-20, ceteareto-25, álcool cetearílico, lecitina,

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21/46 estearato de glicerila, estearato de sorbitano, oleato de glicerila, oleato de poiiglicerila, oleato de sorbitano, palmitato de isopropila, polissorbato 20, polissorbato 60, polissorbato 80, ácido esteárico e fosfato de cetiia. [00100] Em algumas modalidades, a composição é aplicada numa forma selecionada de um shampoo, um enxaguador capilar, um condicionador de cabelo, uma pomada, um gel para cabelo, uma mousse, um tônico hidroalcoólico, um creme, um pulverizador, uma emulsão e um líquido.

[00101] Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água e ácido esteárico. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável, um emulsionante, um óleo e uma fragrância. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água, propiieno glicol, gelatina, ácido esteárico, óleo de linhaça, óleo de soja, óleo de eucalipto e uma fragrância.

[00102] Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo organogel de lecitina plurônica. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água, poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 407) e lecitina. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água, poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 407), lecitina e etoxidiglicol. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água, poloxâmero 407, sorbato de potássio, lecitina, palmitato de isopropil e ácido sórbico. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo água, poloxâmero 407, sorbato de potássio, lecitina, palmitato de isopropil, ácido sórbico e etoxi diglicol. Em algumas modalidades, a composição é uma emulsão compreendendo gel PLO ou gel PLO Ultramax.

[00103] Uma composição (preparação) pode ser administrada a um sujeito por qualquer um de uma série de vias de administração incluindo,

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22/46 por exemplo, por via oral (por exemplo, remédios líquidos como em soluções aquosas ou não aquosas ou suspensões, comprimidos, cápsulas (incluindo cápsulas de aspersão e cápsulas de gelatina), bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua); absorção através da mucosa oral (por exemplo, sublingualmente); transdermalmente (por exemplo como um adesivo aplicado na pele); e topicamente (por exemplo, como um creme, unguento ou spray aplicado na pele, ou como um produto aplicado ao cabelo). Em certas modalidades, um composto pode ser simplesmente dissolvido ou suspenso em água estéril. Os detalhes das vias de administração apropriadas e composições adequadas para a mesma podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes US 6.110.973, 5.763.493, 5.731.000, 5.541.231, 5.427.798, 5.358.970 e 4.172.896, bem como em patentes citadas nas mesmas. [00104] As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de qualquer método bem conhecido na técnica da farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro sendo tratado, do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. Geralmente, em cem porcento, esta quantidade varia entre cerca de 0,001 por cento e cerca de 99 por cento do ingrediente ativo.

Em algumas modalidades, esta quantidade irá variar entre cerca de 5 por cento e cerca de 70 por cento. Em algumas modalidades, esta quantidade irá variar entre cerca de 10 por cento e cerca de 30 por cento. Em algumas modalidades, esta quantidade irá variar entre cerca de 0,001 por cento e cerca de 10 por cento em peso da composição. [00105] Métodos de preparação destas formulações ou composições

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23/46 incluem a etapa de colocar em associação um composto ativo, tal como o composto de fórmula (I) da divulgação, com o veículo e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas associando de modo uniforme e profundo um composto da presente divulgação a veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, então, se for necessário, conformando o produto.

[00106] Formulações da divulgação adequadas para administração oral podem estar sob a forma de cápsulas (incluindo cápsulas dispersíveis e cápsulas de gelatina), hóstias, pílulas, tablete, losangos (usando uma base flavorizada, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto), liófilo, pós, grânulos ou como uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou não aquoso ou como uma emulsão de óleo em água ou de água em óleo ou como um elixir ou xarope ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia) e/ou como colutório bucal e semelhantes, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um composto da presente invenção como um ingrediente ativo. As composições ou compostos também podem ser administradas como um bolus, eletuário ou pasta.

[00107] Para preparar formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas (incluindo cápsulas por aspersão e cápsulas de gelatina), comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos e semelhantes), o ingrediente ativo é misturado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquer um dos seguintes:(1) preenchedores ou extensores, como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, ou ácido silícico; (2) aglutinantes, como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, como glicerol; (4) agentes desintegrantes, como ágar-ágar,

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24/46 carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicates e carbonato de sódio; (5) agentes retardantes de solução, como parafina; (6) aceleradores de absorção, como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umectantes, como, por exemplo, álcool cetílico e/ou monoestearato de glicerol; (8) absorventes, como caulim e/ou argila de bentonita; (9) lubrificantes, como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e/ou misturas dos mesmos; e (10) agentes complexantes como ciclodextrinas modificadas e não modificadas; e (11) agentes corantes. No caso de cápsulas (incluindo cápsulas dispersíveis e cápsulas de gelatina), comprimidos e pílulas, as composições podem também compreender agentes de tamponamento. As composições sólidas de um tipo similar podem também ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina com carga macia ou dura usando tais excipientes como lactose ou açúcares de leite, bem como polietilenoglicóis de alto peso molecular e semelhantes.

[00108] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos comprimidos podem ser preparados usando aglutinante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, glicolato de amido de sódio ou carboximetil celulose de sódio reticulado), agente de ativo de superfície ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser fabricados por moldagem, numa máquina adequada, de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. [00109] Os comprimidos e outras formas de dosagem sólidas das composições, tais como dragéas, cápsulas (incluindo cápsulas por aspersão e cápsulas de gelatina), pílulas e grânulos, podem ser opcionalmente marcados ou preparados com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos

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25/46 bem conhecidos na técnica de formulações farmacêuticas. Eles também podem ser formulados de modo a proporcionar a liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo, por exemplo, hidroxipropllmetil celulose em proporções variadas para proporcionar o perfil de liberação desejado, outras matrizes poiiméricas, lipossomas e/ou microesferas. Os mesmos podem ser esterilizados, por exemplo, por meio da filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas em água estéril ou algum outro meio injetável estéril imediatamente antes do uso. Estas composições podem também opcionalmente conter agentes opacificantes e podem ser de uma composição que liberam apenas o ingrediente ativo (ou ingredientes ativos), ou preferenciaimente, numa certa porção do trato gastrointestinal, opcionalmente, de uma forma retardada. Os exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poiiméricas e ceras. O ingrediente ativo pode também estar em forma microencapsulada, se adequado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.

[00110] Formas de dosagem líquidas úteis para administração orai incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, llófilos para reconstituição, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagem liquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, ciclodextrinas e seus derivados, agentes solubilizantes e emulsificantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butiienoglicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitano e misturas dos mesmos.

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26/46 [00111] Além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como um agente umectante, um emulsionante, um agente de suspensão, um edulcorante, um aroma, um corante, uma fragrância e um conservante, [00112] As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão, como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto e misturas dos mesmos.

[00113] Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica incluem pós, aspersões, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções e emplastros. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer conservantes, tampões ou solventes que possam ser necessários.

[00114] As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além de um composto ativo, excipientes como animal e gorduras vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco ou misturas dos mesmos.

[00115] Pós e pulverizadores podem conter, adicionalmente a um composto ativo, excipientes, tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas dessas substâncias. Pulverizadores podem adicionalmente conter propelentes habituais, tais como clorofluoro-hidrocarbonetos e hidrocarbonetos não substituídos voláteis, tais como butano e propano. [00116] Emplastros transdérmicos têm a vantagem adicionada de fornecer distribuição controlada de um composto da presente divulgação para o corpo. Tais formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispersando o composto ativo no meio apropriado.

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Intensificadores de absorção também podem ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A taxa de tal fiuxo pode ser controlada ou proporcionando uma membrana de controle de taxa ou dispersando o composto numa matriz polimérica ou gel.

[00117] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições da divulgação incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite de oliva e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etil. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00118] Essas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, emulsificadores e agentes de dispersão. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico fenol e semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos tais como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Além disto, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[00119] As composições farmacêuticas podem incluir adicionalmente componentes para proporcionar liberação sustentada e/ou conforto. Esses componentes incluem polímeros mucomiméticos aniônicos de alto peso molecular, polissacarídeos gelificantes, e substratos de veículo de fármaco dividido finamente. Esses componentes são discutidos em mais detalhes nas Patentes US 4.911.920; 5.403.841; 5.212.162; e 4.861.760. Todos os conteúdos dessas patentes estão

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28/46 incorporados por referência neste documento em sua totalidade para todos os propósitos.

[00120] Para uso nos métodos desta divulgação, compostos ativos podem ser dados por si só ou como uma composição contendo, por exemplo, 0,001 a 99,5% (mais preferencialmente, 0,001 a 10%) de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00121] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente.

[00122] O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade da composição em particular ou combinação de compostos empregados, ou o éster, ou sal, ou amido desta, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do(s) composto(s) específico(s) a ser usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com a(s) composição(ões) específica(s) empregada(s), a idade, o gênero, o peso, a condição, a saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00123] Um médico ou veterinário tendo habilidade comum na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade terapeuticamente eficaz da composição necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar doses da composição ou composto em níveis inferiores àqueles exigidos a fim de alcançar o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumenta a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. “Quantidade terapeuticamente eficaz” significa a concentração de um composto que é suficiente para elicitar

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29/46 o efeito terapêutico desejado. É geralmente entendido que a quantidade eficaz do composto variará de acordo com o peso, gênero, idade e histórico médico do sujeito. Outros fatores que influenciam a quantidade eficaz podem incluir, mas não estão limitados a, a gravidade da condição do paciente, o distúrbio a ser tratado, a estabilidade do composto, e, se desejado, outro tipo de agente terapêutico a ser administrado com o composto de fórmula (I) da divulgação. Uma dose total maior pode ser distribuída por múltiplas administrações do agente. Os métodos para determinar a eficácia e dosagem são conhecidos dos versados na técnica (Isseibacher et al. (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882, aqui incorporada por referência).

[00124] Em geral, uma dose diária adequada de um composto ativo usado nas composições e métodos da divulgação será aquela quantidade do composto que é a menor dose eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz geralmente dependerá dos fatores descritos acima.

[00125] Se for desejado, a dose diária eficaz do composto ativo pode ser administrada como uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Em algumas modalidades da presente divulgação, o composto ativo pode ser administrado duas ou três vezes ao dia. Em algumas modalidades, o composto ativo será administrado uma vez ao dia.

[00126] O paciente que recebe este tratamento é qualquer animal em necessidade, incluindo primatas, em particular humanos, e outros mamíferos tais como equinos, bovinos, suínos e ovinos; e aves e animais de estimação em geral.

[00127] A invenção agora sendo descrita de forma geral será mais facilmente compreendida pela referência aos exemplos seguintes, que estão incluídos apenas para fins de ilustração de determinados

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30/46 aspectos e modalidades da presente invenção e não são destinados a limitar a invenção.

EXEMPLOS

Abreviações

ACN acetonitrila

AEC 3-amino-9-etilcarbazol

BCA ensaio bicinconínico

BCS soro de bezerro bovino

DMSO sulfóxido de dimetila

FACS triagem de células ativada por fluorescência

HFSC célula-tronco do folículo capilar

Hk hexoquinase

Ldh lactato desidrogenase

Ldha lactato desidrogenase A

Ldha lactato desidrogenase B

NAD dinucleotídeo de β-nicotinamida adenina

NADH dinucleotídeo de β-nicotinamida adenina reduzido

OCT meio ideal de temperatura de corte

PBS solução salina tamponada com fosfato

PLO organogel de lecitina plurônica p-S6 proteína ribossômica fosfo-S6 p-Stat3 transdutor de sinal de fosfo e ativador de transcrição 3 RIPA ensaio de radioimunoprecipitação

Ciclo de TCA ciclo de ácido tricarboxílico

XTT 2,3-bis (2-metóxí-4-nitro-5-sulfofenH)-2H-tetrazolio-5carboxanilida

Materiais e Métodos

Camundongos [00128] Os animais foram adquiridos de Jackson Labs (K15~CrePR, Lgr5-CreER e Lgr6-CreER), Rutter Lab (Mpc^fí/fj e Seth Lab (Ldha^fí/Íl)

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31/46 (Xie, H. et al., Ceti Metab., 19, 795-809 (2014)) e mantidos sob as condições estabelecidas por IUCUC e ARC. Para experimentos que incluem análise do estágio telógeno do ciclo capilar, os animais foram colhidos no dia 50 pós-natal, para animais de transição telógenoanágeno foram colhidos no dia 70, e para anágenos os animais foram colhidos no dia 90 pós-natal. Para as experiências que incluem análise de animais transgênicos, os animais K15~CrePR foram raspados e tratados por injeções intraperitoneais de mifepristona e Lgr5-CreER e os animais Lgr6~CreER. animais foram raspados e tratadaos com tamoxifeno (10 mg/mi dissolvido em óleo de semente de girassol, 2 mg por dia durante 3 dias) durante o telógeno (pós-natal dia 50), e monitorados para recrescimento capilar após a raspagemFenótipos mostrados de animais tratados foram produzidos 3 a 4 semanas após a administração de mifepristona. Para a Fig. 3, os animais do tipo selvagem C57BL/6J foram raspados no dia pós-natal 50 e tratados topicamente com Transderma PLO Gel (organogel de lecitina superior), PLO Gel Ultramax Base (TR220) (veículo), ou o composto de fórmula (I) (Composto (I)) (20 μΜ) (produto Sigma Aldrich PZ0160) durante períodos de tempo indicados. Ambos os machos e fêmeas foram utilizados neste estudo em números aproximadamente iguais, sem diferença aparente no fenótipo entre os sexos. Todos os fenótipos descritos são representativos de um mínimo de n = 3 pares de ninhadas, como indicado na descrição de cada experiência. Nenhuma medida estatística foi usada para determinar o tamanho da amostra de antemão, nem foram usadas estatísticas para medir os efeitos, pois os resultados foram essencialmente positivos ou negativos, como representado nas figuras. Os resultados descritos incluem dados de todos os animais tratados. Os investigadores não ficaram cegos quanto à alocação durante a coleta de dados experimentais, nem as experiências foram randomizadas. Os resultados apresentados foram imagens

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32/46 representativas de pelo menos três animais tratados independentemente e a genotipagem foi realizada antes e depois do tratamento com animais para confirmação.

Histologia, imunocoloração e imunoblotting [00129] Os tecidos foram isolados dos genótipos indicados e incorporados frescos em composto de temperatura de corte ideal (OCT) para preparações de tecido congelado, ou fixados durante a noite em formalina a 4% e embebidos em parafina. Para o tecido congelado, o corte foi realizado em um Leica 3200 Cryostat e fixado por 5 minutos em paraformaldeído a 4%. O tecido embebido em parafina foi seccionado, desparafinizado e preparado para histologia. Todas as seções preparadas para coloração foram bloqueadas em tampão de coloração contendo IgG de controle apropriado (cabra, coelho, etc.). A imunohistoquímica foi realizada em tecido embebido em parafina fixado com formalina, com citrato ou tampão de Tris, com os seguintes anticorpos: Ki67 (Abeam ab16667, 1:50), p-S6 (Sinalização Celular CST2215, 1:50), Sox9 (Abeam ab185230, 1:1000), Ldha (Abeam ab47010, 1:100), Ldh (Abeam ab125683, 1:100), p-Stat3 (Abeam ab68153, 1:200), pStatl (Abeam ab109461, 1:200), p-Stat5 (Abeam ab32364; 1:50), Gli3 (Abeam ab6050; 1:100), β-catenina (Abeam ab32572; 1:500). O sistema de peroxidase DAKO EnVision* HRP (Dako K400911-2) e o cromogênio de substrato Dako AEC (Dako K346430-2) foram utilizados para a detecção. As imagens foram coletadas num microscópio vertical Olympus BX43 e no microscópio de fluorescência vertical Zeiss modelo Axio Imager M1. Amostras de proteínas para western blots e ensaios enzimáticos foram extraídas de populações epidérmicas separadas por FACS em tampão de iise RIPA (Pierce) com inibidores da protease de Halt e fosfatase (Thermo-Fisher) e precipitadas em acetona para concentração. Foram utilizados os seguintes anticorpos: β-actina (Abeam ab8227; 1:1000), β-actina (Santa Cruz sc-47778; 1:1000), C

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Myc (Abeam ab32072; 1:1000), N-Myc (Santa Cruz sc-53993; 1:200), H3K27AC (Abeam ab177178; 1:200), Mpd (Sigma HPA045119). Isolamento celular e FACS [00130] Pele inteiras de camundongo dorsal e ventral foram excisados e flutuados em tripsina (0,25%) durante 1 h a 37Ό ou de um dia para o outro a 4Ό. A epiderme foi separada da derme por raspagem e as células epidérmicas foram dissociadas mecanicamente utilizando uma pipeta. As células epidérmicas foram filtradas com um filtro de células de 70 μΜ em 20% de soro de bovino (BCS), coletadas a 300g e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram, então, filtradas através de um filtro de células 40 μΜ e coradas para o processamento de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) com anticorpo monoclonal CD34 (RAM34), FITC, eBioscience™ (Catálogo #: 11-0341-82) e CD49d (Integrin alpha 4) Anticorpo Monoclonal (R1-2), PE, eBioscience™ (Catálogo#: 12-049281). Estratégia de bloqueio mostrada na Fig. 4a. As células foram triadas usando os triadores de células de alta velocidade BD FACSAria. Populações individuais positivas e duplas positivas foram coletadas em 20% de BCS, tampão de lise RIPA (Thermo Scientific, Pierce), ou 80% de metanol para os ensaios enzimáticos, Western blots ou análise de espectrometria de massa, respectivamente.

Ensaio de Ldh de leitor de placa [00131] A atividade de Ldh foi determinada em lisados celulares por medição da formação de 2,3-bis (2-metóxi~4~nitro-5-sulfofenil)-2Htetrazólio-5-carboxaniiida (XTT) formazano solúvel em relação direta com a produção de NADH ao longo do tempo a 475 nm a 37Ό utilizando um leitor de placas Synergy-MX (Biotek Instruments). Os lisados foram preparados em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (Thermo Scientific Pierce). O teor de proteína foi determinado usando o Kit de Ensaio de Proteína do ensaio bicinconínico (BCA) (Thermo

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Scientific Pierce). Foram utilizados 10 pg de proteína por poço. A solução de coloração continha 50 mM de tampão Tris pH 7,4, XTT 150 μΜ (Sigma), dinucleotídeo β-nicotinamida adenina (NAD) 750 μΜ (Sigma), metossulfato de fenazina 80 μ M (Sigma) e 10 mM de substrato lactato (Sigma). Determinou-se a atividade de Ldh em lisados celulares medindo a alteração na absorbância do seu substrato ou produto comum, dinucleotídeo de β-nicotinamida adenina reduzido (NADH) ao longo do tempo a 340 nm a 25Ό utilizando um leitor de placas SynergyMX (Biotek Instruments).

Ensaio de Ldh in situ [00132] As seções de criostato de pele de camundongo foram brevemente fixadas (formalina a 4% durante 5 min), lavadas com PBS pH 7,4 e depois incubadas com a solução apropriada para a atividade de LDH. O meio de coloração continha 50 mM de Tris pH 7,4, 750 μΜ NAD (Sigma), 80 μΜ de metossulfato de fenazina (Sigma), 600 μΜ decloreto de nitrotetrazólio azul (Sigma), 10 mM de MgCI2 (Sigma) e 10mM do substrato lactato (Sigma). As lâminas foram incubadas com meio de coloração a 37Ό até atingirem a intensidad e desejada, depois contracoloridas utilizando Vermelho Rápido Nuclear (Vector, Burlingame, CA) e montadas utilizando VectaMount (Vector, Burlingame, CA). As reações de controle foram realizadas usando o meio de incubação que não tinha a mistura de substrato ou NAD.

Análise metabolômica baseada em espectrometria de massa [00133] Os experimentos foram realizados conforme descrito em Folmes, C. D. et al. A bioenergética oxidativa somática transita para glicólise dependente de pluripotência para facilitar a reprogramação nuclear. Cell Metab 14, 264-271. Para extrair metabolites intracelulares, as células separadas por FACS foram brevemente lavadas com 150 mM de acetato de amônio frio (pH 7,3), seguido pela adição de 1 mL de metanol a 80% frio (MeOH) em gelo seco. Suspensões de células foram

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35/46 transferidas para tubos Eppendorf e 10 nmol de D/L-norvalina foram adicionados. Depois de misturar rigorosamente, a suspensão foi sedimentada por centrifugação (1,3*104 rpm,⁴O). O sobrenadante foi transferido para um frasco de vidro, os metabolites secos sob vácuo e ressuspensos em 70% de acetonitrila. Para a análise baseada em espectrometria de massa da amostra, 5 μΙ foram injetados em uma coluna Luna NH2 (150 mm x 2 mm, Phenomenex). As amostras foram analisadas com um UltiMate 3000RSLC (Thermo Scientific) acoplado a um espectrômetro de massa Q Exactive (Thermo Scientific). O Q Exactive foi executado com comutação de polaridade (+3,50 kV/-3,50 kV) no modo de varredura total com uma faixa de m/z de 65-975. A separação foi realizada utilizando A) 5 mM de acetato de amônio (NHLAcO) (pH 9,9) e B) acetonitrila (ACN). O gradiente começou com 15% de A) indo para 90% de A) ao longo de 18 min, seguido por uma etapa isocrática por 9 min e reversão para o inicial de 15% de A) por 7 min. Metabolites foram quantificados com TraceFinder 3. 3 usando medidas de massa precisas (< 3 ppm) e tempos de retenção. Estatísticas [00134] Ambos os machos e fêmeas foram utilizados neste estudo em números aproximadamente iguais, sem diferença aparente no fenótipo entre os sexos. Todos os fenótipos descritos são representativos de um mínimo de n = 3 pares de ninhadas, como indicado na descrição de cada experiência. Para análise do fenótipo de crescimento capilar, nenhuma medida estatística foi usada para determinar o tamanho da amostra de antemão, nem foram usadas estatísticas para medir os efeitos, pois os resultados foram essencialmente positivos ou negativos, como representado nas figuras. Os resultados descritos incluem dados de todos os animais tratados. Os investigadores não ficaram cegos quanto à alocação durante a coleta de dados experimentais, nem as experiências foram randomizadas.

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Todos os resultados apresentados foram imagens representativas de pelo menos três animais tratados independentemente e a genotipagem foi realizada antes e depois do tratamento com animais para confirmação. Para gráficos, todas as comparações são mostradas pelo teste t de Student não pareado bicaudal e todos os gráficos, barras ou linhas indicam que as barras de média e erro indicam erro padrão da média (sem).

Exemplo 1: A atividade da lactato desidrogenase é enriquecida no nicho de células-tronco do folículo capilar.

[00135] Numerosos estudos revelaram assinaturas únicas de expressão genética em HFSCs versus outras células folicuiares ou células da epiderme interfolicular³’⁶. Muitas dessas assinaturas são reguladas por fatores de transcrição que mais tarde demonstraram desempenhar papéis importantes na homeostase da HFSC⁷. A lactato desidrogenase é mais comumente codificada pelos genes de Ldha e Ldhb em mamíferos, cujos produtos proteicos formam homo ou heterotetrâmeros para catalisar a redução dependente de NADH do piruvato em lactato e a oxidação dependente de NAD⁺ de lactato em piruvato⁹. Por imunocoloração, o Ldha pareceu estar enriquecido em HFSCs in situ (telógeno) (Fig. 1a), IHC com um anticorpo que reconhece Ldha e Ldhb mostrou que apenas Ldha parece estar localizado no nicho de HFSC (Fig. 4a).

[00136] As HFSCs são conhecidas por passarem por sucessivos ciclos de quiescência (telógenos) pontuados por breves períodos de proliferação correlacionados com o início do ciclo capilar (transição telógeno-anágena). A proliferação ou ativação de HFSCs é bem conhecida por ser um pré-requisito para o avanço do ciclo capilar. A análise IHC também mostrou que a expressão de Ldha foi enriquecida em HFSCs (Sox9 +) em três estágios do ciclo capilar (Fig. 1a). Consistentemente, o immunoblotting dos lisados de células separadas

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37/46 mostrou uma expressão quase exclusiva de Ldha nas HFSCs basais (a6HiCD34 +) e significativamente mais Ldhb nas populações basal (a6HICD34+) e suprabasal (a6LoCD34+) da HFSC em relação à epiderme total (Fig. 1 b)³. A estratégia de triagem está delineada na Fig, 4b.

[00137] Para determinar se os padrões de expressão de Ldha se correlacionam com a atividade da enzima Ldh, um ensaio enzimático baseado em colorimetria foi usado para avaliar a capacidade de atividade de Ldh in situ. Normalmente realizado em lisados proteicos ou alíquotas com um leitor de placas (Nguyen, H., et ai., Cell, 127, 171-183 (2006)), o ensaio de atividade de Ldh foi adaptado para funcionar in situ em seções de tecido congelado. Observe que, como os testes de atividade de Ldh in situ e in vitro empregam o uso de excesso de substrato (lactato), os resultados desses ensaios refletem a capacidade de atividade de Ldh e não a atividade de estado estacionário.

[00138] A aplicação deste ensaio a amostras de pele demonstrou que a capacidade de atividade de Ldh foi significativamente maior em HFSCs, consistente com o padrão de expressão de Ldha (Fig. 1c). Além disso, a atividade de Ldh foi enriquecida em HFSCs ao longo do ciclo capilar (Fig. 1c). Como controle, ensaios conduzidos sem o substrato enzimático (lactato) ou em tecido tratado com ácido produziram atividade zero (Fig. 4d). Para validar ainda mais estes resultados, as populações epidérmicas foram separadas, lisados celulares nas células triadas foram gerados, e um ensaio enzimático baseado em colorimetria semelhante foi realizado nos lisados celulares separados, que também mostraram aumento na atividade de Ldh em HFSCs (Fig. 1d). Para melhor caracterizar o metabolismo da análise metabolômica de HFSCs foi realizada em populações selecionadas da pele de camundongo por cromatografia líquida de massa espectrométrica (LC-MS) (Fig. 1e). Vários metabolites glicolíticos, incluindo glicose/frutose-6-fosfato,

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38/46 frutose-bifosfato, fosfato de di-hidroxiacetona, 3-fosfoglicerato e lactato, foram rotineiramente mais altos em HFSCs em relação à epiderme total em três experimentos independentes (isolados de diferentes camundongos em dias diferentes). Por outro lado, a maioria dos metabolitos do ciclo de TCA não foi consistentemente diferente entre a epiderme e as HFSCs (Fig. 1e). Coletivamente, esses resultados sugerem que, embora todas as células da epiderme usem o ciclo de TCA extensivamente para gerar energia, as HFSCs também têm expressão aumentada de Ldha, atividade de Ldh e metabolismo glicolítico.

[00139] Medir o metabolismo ao longo do ciclo capilar, portanto, capturaria quaisquer mudanças dinâmicas que ocorressem em HFSCs que se correlacionassem com ativação ou quiescência. A análise dos dados de RNA-seq de HFSCs isoladas durante telógeno ou a transição telógeno-anágeno demonstrou não apenas que Ldha é a isoforma de Ldh predominante expressa em HFSCs (Fig. 1k), mas também é induzido durante a transição telógeno-anágeno (Figs. 1i e 1j) (NIHGEOGSE67404 e GSE51635). Para confirmar que as células analisadas por RNA-seq estavam de fato em telógeno ou na transição telógeno para anágeno, importantes marcadores dessa transição foram avaliados incluindo as vias Shh e Wnt (GH1, 2, 3; Lef1, AxinL Axin2, Ccndl) bem como marcadores de proliferação (Ki-67, Pena e Sox4) (Fig. 4e).

[00140] O ensaio de atividade de Ldh in vitro em Usados de HFSCs selecionados revelou uma modesta indução de atividade de Ldh correlacionada com a transição telógeno para anágeno (Fig. 1 f, direita). O estadiamento do ciclo capilar foi validado pela imunocoloração Ki-67 para determinar a ativação da HFSC (Fig. 4c). Além disso, as medições de metabolitos em estado estacionário extraídos de HFSCs tríadas mostraram um aumento no lactato em HFSCs à medida que eles

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39/46 transitam de telógeno para transição telógeno-anágeno, e então diminuem novamente em anágenos à medida que HFSCs retomam à quiescência (Fig. 1h).

Exemplo 2: A deleção da atividade de Ldh bloqueia a ativação de HFSC [00141] Para determinar se a atividade de Ldh está funcionalmente relacionada com a capacidade de HFSCs de permanecer quiescente ou de ativar no início de um ciclo capilar, Ldha especificamente foi excluído nas HFSCs. Aproveitando camundongos com alelos floxeados de Ldha¹², essa enzima foi deletada em HFSCs por cruzamento com camundongos portadores do alelo K15CrePR⁵, conhecido por ser indutível por Mifepristona especificamente em HFSCs. A deleção de Ldha em HFSCs foi iniciada pela administração de Mifepristona durante o telógeno (dia 50) e levou a uma recombinação tipicamente em mosaico dos alelos floxeados através da pele das costas. Os camundongos com deleção específica de HFSC de Ldha falharam em passar por um ciclo capilar adequado, com a maioria dos folículos permanecendo no telógeno em pelo menos 33 pares de ninhadas 3-4 semanas após o tratamento com Mifepristona (Fig. 2a).

[00142] A histologia mostrou que os folículos capilares WT entraram na transição telógeno para anágeno tipicamente no dia 70, e isso foi acompanhado pela expansão típica da hipoderme abaixo (Fig. 2b). No entanto, na pele do dorso com deleção de Ldha, a hipoderme não se expandiu, e a transição telógeno para anágeno foi severamente anulada (Fig. 2b). Em áreas de forte penetrância fenotípica, a atividade de Ldh foi severamente anulada no compartimento de HFSC (Fig 2c), demonstrando que o alelo de Ldha é criticamente importante para a atividade de Ldh em HFSCs e consistente com o fato de que a isoforma de Ldh é expressa ao mais alto nível. A quantificação da progressão do ciclo capilar em numerosos animais indicou que a maioria dos folículos sem Ldha permaneceu em telógeno (Fig. 2d).

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40/46 [00143] Além disso, para confirmar os fenótipos, o Ldha também foi excluído com uma estratégia Cre específica de HFSC. Lgr5~CreER tem sido usado para rastrear a linhagem em uma variedade de modelos de células-tronco adultas, e foi mostrado para marcar células com alta capacidade regenerativa, incluindo HFSCs (Jaks, V. et a!., Nat Genet 40, 1291-1299 (2008)). Lgr5CreER; Camundongos Ldha^í!/fí, tratados com tamoxifeno no pós-natal dia 50 antes de um ciclo capilar sincronizado, também falharam em ativar o anágeno em pelo menos 20 pares de ninhadas (Fig. 2g). O ensaio de Ldh/n situ e a metabolômica confirmaram o sucesso da deleção de Ldha nesses animais (Fig. 2h e Fig. 2i).

[00144] O efeito da perda de atividade de Ldha em células K15+ foi monitorado durante um período de seis meses e descobriu que a deleção de Ldha levou a um mosaico, mas bloqueio permanente da ativação de HFSC em algumas porções da pele do dorso (Fig. 4f). Esses dados confirmam que a atividade de Ldh é necessária para a ativação de HFSC e não é simplesmente um marcador de HFSCs. Um exame mais atento dessas deleções de Ldha a longo prazo mostrou que HFSCs Ldha-nulas continuaram expressando marcadores típicos, mas não tinham atividade de Ldh e falharam em iniciar novos ciclos capilares, enquanto os folículos que escaparam de deleção continuaram a expressar Ldha e a ciciar normalmente (Fig. 4g e Fig. 4h).

[00145] Depois de classificar HFSCs de animais com ou sem deleção de Ldha, a análise metabolômica baseada em LC-MS demonstrou que os níveis de lactato, bem como os níveis de outros metabolites glicolíticos, foram fortemente reduzidos na ausência de Ldha (Fig. 2e), evidência funcional de que a estratégia de direcionamento foi bemsucedida. O fato de que os metabolites glicolíticos a montante do lactato também foram suprimidos sugere que as HFSCs poderíam estar adaptando seu metabolismo para compensar a perda da atividade de

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Ldh. A imunocoioração para marcadores de ativação e proliferação de HFSC indicou uma falha na ativação de HFSC. KÍ67 e pS6 foram claramente demonstrados como abundantes no nicho HFSC no início do ciclo capilar¹³, e ambos os marcadores estavam ausentes no dorso com Ldha deletado (Fig. 3f). A imunocoloração para Ldha também confirmou a deleção bem-sucedida desta proteína, enquanto a coloração para Sox9, um marcador de HFSCs, indicava que essas células permaneciam em seu nicho, mas não foram ativadas na ausência de Ldha (Fig. 3f). A indução do ciclo capilar é também considerada regulada pela sinalização das vias Shh, Wnt e Jak-Stat. Cada um destes foi ensaiado por IHC em folículos normais ou de deleção de Ldha, e verificou-se que em geral estas vias não foram ativadas em HFSCs Lctea-nuias que não conseguiram entrar em uma transição telógeno-anágeno (Fig. 4i).

Exemplo 3:A deleção de Mpc1 em células-tronco do folículo capilar ativa um novo ciclo capilar [00146] Os animais K15CrePR foram cruzados com aqueles floxados para veículo de piruvato mitocondrial 1 (Mpc1) (K15CrePR;Mpc1^fí/íi). Mpd, como um heterodímero com Mpc2, forma o veículo de piruvato mitocondrial MPC, um veículo na membrana mitocondrial interna necessária para a entrada de piruvato na mitocôndria¹⁵. Demonstrou-se que a perda de função do Mpd impulsiona a produção de lactato através da conversão aumentada de piruvato em lactato por Ldh¹⁶. [00147] Em animais com deleção de Mpc1 em HFSCs, uma forte aceleração dos ciclos capilares ventral e dorsal foi observada com todas as características típicas de uma transição telógeno-anágeno (Fig. 3a) (12 pares de ninhadas; animais adicionais apresentados na Fig. 6a). Os animais K15CrePR;Mpc1^fí/fí tratados com Mifepristona foram os únicos a mostrar qualquer sinal de anágeno dorsal no dia 70. Western blotting em HFSCs tríadas validaram a perda da proteína Mpd (Fig.

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3b). Importante, as HFSCs purificadas sem Mpd mostraram uma forte indução da atividade de Ldh (Fig. 3c). A quantificação do cicio dorsal dos pelos ao longo dos três pares de ninhadas mostrou uma forte indução de anágeno na pele do dorso sem Mpc1 (Fig. 3d) e a histologia mostrou que a indução de anágeno era normal na aparência com uma expansão hipodérmica típica (Fig. 3e). A imunocoloração demonstrou a indução em HFSCs Mpd-nulas de vários marcadores de ativação do ciclo capilar, tais como Ki-67 e pS6, enquanto a expressão de Sox9 não foi afetada (Fig. 3f). A deleção a longo prazo de Mpd não levou a folículos aberrantes ou exaustão de HFSCs como julgado por patologia e coloração para Sox9 (Fig. 4j). Além disso, a deleção de Mpd com LgrSCreER mostrou um fenótipo muito semelhante à deleção com K15CrePR (Fig. 3feFig. 3g), validando o fato de que a deleção desta proteína em HFSCs leva à sua ativação (n = 12 pares de irmãos da ninhada). Finalmente, a imunofluorescência para o Ires-GFP do transgene LgrõCreER juntamente com Ki-67 e rastreamento de linhagem com K15CrePR;Mpc1^n/íí; camundongos Isl-Tomato também demonstraram que as HFSCs eram efetivamente proliferativas após a indução da deleção de Mpc1 por tamoxifeno ou mifepristona (Fig. 4k). [00148] Por outro lado, a deleção de Mpd na topo do folículo (infundíbulo, progenitores das glândulas sebáceas) e um número limitado de células interfoliculares com Lgr6CreER²⁸ não pareceu afetar o ciclo capilar (Lgr6CreER;Mpc1^tl/f!) (n = 10 pares de ninhadas) ou homeostase geral da pele durante pelo menos 2 meses (Fig. 4I). O ensaio de atividade de Ldh em células Lgr6+ triadas do tipo selvagem ou de pele de deleção demonstrou que a deleção de Mpd foi eficaz (Fig. 4m). Juntos, estes resultados indicam que o aumento da produção de lactato através do bloqueio do piruvato no ciclo de TCA tem um forte efeito na capacidade das HFSCs, mas não de outras células do folículo capilar, de se tornarem ativadas para iniciar um novo ciclo capilar.

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43/46 [00149] O composto de fórmula (I) é um inibidor farmacológico bem estabelecido do veículo de piruvato mitocondrial e conhecido por promover a produção de iactato como resultado em vários cenários¹⁷. O tratamento tópico de animais em teiógeno (dia 50) com o composto de fórmula (I) conduziu a uma aceleração robusta do ciclo capilar, bem como hiperproliferação menor da epiderme interfolicular (Fig. 3i). A quantificação do ciclo capilar ao longo de pelo menos 6 pares de animais (veículo versus o composto de fórmula (I)) indicou uma forte aceleração do ciclo capilar, começando em apenas 3-5 dias (Fig. 3j). Semelhante à deleção genética de Mpc1, o bloqueio farmacológico do veículo de piruvato mitocondrial por aplicação tópica do composto de fórmula (I) por 48 horas durante o teiógeno promoveu aumento da atividade de Ldh na epiderme interfolicular, consistente com o aumento da capacidade de produção de Iactato (Fig. 3k). Finaimente, a análise metabolômica demonstrou que a aplicação tópica do composto de fórmula (I) aumenta os níveis totais de Iactato em HFSCs tríadas (Fig. 3I).

[00150] Juntos, esses dados demonstram que a produção de Iactato, através de Ldha, é importante para a ativação da HFSC, e que as HFSCs podem manter uma alta capacidade de metabolismo giicolítico, pelo menos em parte, através da atividade de Myc. Uma ruptura genética ou farmacológica da produção de Iactato pode modular a atividade de HFSCs.

Exemplo 4: O tratamento de camundongos idosos acelera o ciclo capilar.

[00151] Camundongos de 17 meses de idade foram raspados e tratados em dias alternados com DMSO ou 20 uM do composto de fórmula (I) diluído em gel PLO (organogel de lecitina plurônica). As imagens foram adquiridas no dia indicado após a raspagem e realizadas por 30 dias. Os camundongos envelhecidos tratados com DMSO

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44/46 aumentaram o seu revestimento num padrão irregular, enquanto o tratamento com o composto de fórmula (I) levou a um novo crescimento mais completo (Fig. 7).

Referências

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Incorporação por Referência [00152] Todas as publicações de pedidos de patentes US e PCT e patentes US aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições contidas neste documento, prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de acelerar, promover ou restaurar o crescimento capilar, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração compreende aplicar topicamente uma composição compreendendo o composto a uma área afetada.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito exibe sintomas selecionados de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito exibe sintomas selecionados de perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito apresenta calvície.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a calvície é calvície de padrão masculino ou calvície de padrão feminino.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sujeito exibe sintomas selecionados de perda de cabelo e queda de cabelo.

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8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a perda de cabelo ou queda de cabelo são causadas por eflúvio anágeno ou eflúvio telógeno.
9. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a alopecia é selecionada de alopecia juvenil, alopecia prematura, alopecia senil, alopecia areata, alopecia androgenética, alopecia mecânica, e alopecia sintomática.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto é aplicado a um folículo capilar.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (I) é administrado diariamente.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo ou excipiente adequado para aplicação tópica à pele.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo que a concentração do composto é de cerca de

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0,001% a cerca de 10% em peso da composição.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 14 ou

15, caracterizada pelo fato de que a composição é uma emulsão.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um ingrediente selecionado de um tensoativo, um espessante, uma fragrância, um agente de filtro de UV, uma cera, um silicone, um conservante, um óleo, uma vitamina, uma provitamina, um opacificante, um antioxidante, um emulsionante, um excipiente, um solvente e um tampão.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um emulsionante.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizada pelo fato de que a composição é aplicada em uma forma selecionada de um shampoo, um enxaguador capilar, um condicionador de cabelo, uma pomada, um gel para cabelo, uma mousse, um tônico hidroalcoólico, um creme, um pulverizador, uma emulsão e um líquido.
20. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição de retardamento ou interrupção do crescimento capilar.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a condição cretardamento ou interrupção do crescimento capilar é selecionada de alopecia, perda de cabelo, queda de cabelo e calvície.
22. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição

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23. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento da calvície.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a calvície é calvície de padrão masculino ou calvície de padrão feminino.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de uma condição selecionada de perda de cabelo e queda de cabelo.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a perda de cabelo e a queda de cabelo são causadas por eflúvio anágeno ou eflúvio telógeno.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a alopecia é selecionada de alopecia juvenil, alopecia prematura, alopecia senil, alopecia areata, alopecia androgenética, alopecia mecânica, e alopecia sintomática.