BR112015001989B1 - Uso de butilidenoftalida (bp) - Google Patents
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Abstract
uso de butilidenoftalida (bp). uma composição farmacêutica para inibir a autofagia de neurônios motores, compreendendo uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo selecionado a partir do grupo que consiste de um composto de fórmula (i), um sal farmaceuticamente aceitável do composto, um éster farmaceuticamente aceitável do composto e as combinações dos mesmos: (i) em que, a é um grupo alquila c1-c5, opcionalmente, tendo uma ou mais ligações insaturad as, e sendo opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em -oh, = o, e alquila c1-c3; x é h, -oh, ou ; y é o ou s e pode, opcionalmente, se ligar com a para formar um anel de cinco membros; e r1 é h ou um grupo alquila c1-c20 substituído ou não substituído, em que um ou mais -ch 2- de alquila c1-c20 são opcionalmente substituídos por - nh- ou -o-.
Description
[0001] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para inibir a autofagia de neurônios motores e as aplicações desta, especialmente para retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores.
[0002] Um neurônio, também conhecido como uma célula nervosa é uma das unidades estruturais e funcionais do sistema nervoso do organismo. Os neurônios podem transmitir mensagens para outras células por sinais químicos e elétricos. Os neurônios podem variar em forma e tamanho, e os diâmetros dos neurônios pode variar de cerca de 4 μm a cerca de 100 μm. A estrutura de um neurônio pode ser dividida em três partes: um corpo celular, dendritos e um axônio, em que os dendritos podem transmitir sinais para os corpos celulares, e os axônios podem transmitir sinais a partir de corpos celulares.
[0003] Os neurônios podem ser classificados em três tipos, dependendo da direção da sua transdução de sinal e funções: neurônios sensoriais, neurônios motores e interneurônios, em que um neurônio motor é uma célula nervosa controlando as atividades do corpo de um organismo. Em geral, os neurônios motores no cérebro são conhecidos como neurônios motores superiores, enquanto os neurônios motores no tronco cerebral e da medula espinhal são conhecidos como neurônios motores inferiores. Distúrbios funcionais provocados pela degeneração dos neurônios motores podem resultar em doenças degenerativas de neurônios motores, tais como esclerose amiotrófica lateral (ALS), miastenia grave, miastenia, atrofia muscular, distrofia muscular, esclerose múltipla, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia muscular espinal, etc. Os pacientes que sofrem de doenças degenerativas do neurônio motor acima mencionado irão mostrar gradualmente sintomas como fraqueza muscular, atrofia, tremores, cãibras rigidez, o que pode levar à dificuldade em falar, dificuldade em engolir, e insuficiência respiratória.
[0004] A verdadeira causa de doenças degenerativas do neurônio motor ainda é incerta até a data. No entanto, a pesquisa mostrou que as possíveis causas da doença incluem a morte neuronal causada por autofagia excessiva estimulada pelo acúmulo de ânions de superóxido, doença auto-imune, a excitação neuronal excessiva (por exemplo, o acúmulo excessivo de glutamatos), oxidação excessiva, e hereditariedade etc. Os medicamentos atualmente utilizados na clínica no tratamento de doenças degenerativas de neurônios motores incluem antagonistas de glutamato, tais como tratamento com riluzol, antioxidantes como a vitamina E, fatores neurotróficos, moduladores imunes etc. No entanto, os referidos medicamentos normalmente não têm efeito terapêutico significativo ou apenas podem prolongar o período vida dos pacientes durante 3 a 6 meses. Por conseguinte, ainda há uma necessidade de um medicamento para retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores.
[0005] Os inventores da presente invenção verificaram que o composto de fórmula (I) da presente invenção pode ser utilizado para inibir a autofagia de neurônios motores e diminuir a morte de neurônios motores, desse modo, retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores.
[0006] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica para inibir a autofagia de neurônios motores, compreendendo uma quantidade eficaz de um componente ativo selecionado a partir do grupo que consiste de um composto de fórmula (I), um sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), um éster farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), e as combinações destes:
em que, A é um grupo hidrocarbila C1-C5, opcionalmente, tendo uma ou mais ligações insaturadas, sendo opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em -OH, = O, e um grupo hidrocarbila C1-C3; X é H, -OH,
, ou 
; Y é O ou S e, opcionalmente, se liga com A para formar um anel de cinco membros; e R1 é H ou um grupo hidrocarbila C1-C20 substituído ou não substituído, em que um ou mais -CH2- no grupo hidrocarbila são opcionalmente substituídos por -NH- ou -O-.
[0007] Outro objetivo da presente invenção consiste em utilizar o componente ativo acima referido, na fabricação de um medicamento para inibir a autofagia de neurônios motores.
[0008] Ainda um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para a inibição da autofagia de neurônios motores em um paciente, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um componente ativo que consiste em um composto de fórmula (I), e um sal e éster farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0009] A tecnologia detalhada e as formas de realização preferidas implementadas para a presente invenção serão descritas nos parágrafos seguintes para as pessoas versadas no campo para melhor apreciar as características da invenção reivindicada.
[0010] A Fig. 1A é um espectro de massa de uma mistura de butilidenoftalida e microssomas hepáticos humanos analisada por LC-MS / MS;
[0011] A Fig. 1B é um perfil metabólico mostrando o metabolismo de fase I de butilidenoftalida em um organismo;
[0012] A Fig. 1C é um perfil metabólico mostrando o metabolismo de fase II de butilidenoftalida em um organismo;
[0013] A Fig. 2 é um diagrama da curva de sobrevivência que mostra o efeito de butilidenoftalida no aumento da taxa de sobrevivência de camundongos transgênicos SOD1-G93A;
[0014] A Fig. 3 é um diagrama da curva de sobrevivência que mostra o efeito do tratamento com riluzol no aumento da taxa de sobrevivência de camundongos transgênicos SOD1-G93A;
[0015] A Fig. 4 é uma curva em escala BBB mostrando os efeitos de butilidenoftalida nos camundongos transgênicos SOD1-G93A;
[0016] A Fig. 5A é uma imagem de coloração histoquímica mostrando os efeitos de butilidenoftalida em retardar ou prevenir a morte de neurônios motores da medula de camundongos transgênicos SOD1-G93A;
[0017] A Fig. 5B é um diagrama de barras mostrando os efeitos de butilidenoftalida em retardar ou prevenir a morte de neurônios motores da medula de camundongos transgênicos SOD1-G93A;
[0018] A Fig. 6 é uma imagem de Western blot que mostra o efeito de butilidenoftalida na diminuição do nível de expressão da proteína LC3-II na espinha lombar de camundongos transgênicos G93A-SOD1; e
[0019] A Fig. 7 é uma imagem de Western blot que mostra o efeito de butilidenoftalida sobre a inibição da autofagia de NSC.
[0020] A seguir irá ser descrito algumas formas de realização da presente invenção em detalhe. No entanto, sem se afastar do espírito da presente invenção, a presente invenção pode ser concretizada em várias formas de realização e não deve ser limitada às formas de realização descritas no relatório descritivo. Além disso, a menos que de outra forma indicada aqui, as expressões "a", "o", ou semelhantes recitadas no relatório descritivo da presente invenção (especialmente nas reivindicações) devem incluir tanto o singular como o plural. Além disso, o termo "quantidade eficaz", utilizado no presente relatório descritivo se refere à quantidade do composto que pode aliviar pelo menos parcialmente a condição que está sendo tratada em um indivíduo suspeito quando administrada ao indivíduo. O termo "indivíduo" utilizado no presente relatório descritivo se refere a um mamífero, incluindo seres humanos e animais não-humanos.
[0021] Autofagia é um mecanismo importante para a regulação do crescimento celular, a homeostase celular e morte celular, que conduz à degradação de organelas próprias de uma célula ou de outros materiais através de lisossomas intracelulares de células. No entanto, como indicado acima, tem sido conhecido que a autofagia excessiva de neurônios motores é uma das causas de doenças degenerativas de neurônios motores. Portanto, se a autofagia de neurônios motores pode ser inibida, a morte de neurônios motores pode ser aliviada de modo a tratar as doenças degenerativas de neurônios motores.
[0022] Os inventores da presente invenção verificaram que o seguinte composto (1) pode inibir eficazmente a autofagia dos neurônios motores, e, assim, pode ser utilizado para retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores.
[0023] Composto (1), também conhecido como butilidenoftalida (BP), compreende dois isômeros no seu estado natural, (Z)-butilidenoftalida (cis- butilidenoftalida) e (E)-butilidenoftalida (trans- butilidenoftalida).
[0024] Foi confirmado que, após a butilidenoftalida ser metabolizada por metabolismo de fase I ou metabolismo de fase II no fígado de um organismo, um ou mais dos seguintes compostos (2) a (14) serão produzidos:
Sem se ser limitado pela teoria, é acreditado que o efeito de butilidenoftalida sobre a inibição da autofagia de neurônios motores no organismo se origina a partir da parte estrutural comum das estruturas químicas dos compostos anteriores (2) a (14).
[0025] Portanto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para inibir a autofagia de neurônios motores, compreendendo uma quantidade eficaz de um componente ativo selecionado a partir do grupo que consiste de um composto de fórmula (I), um sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), um éster farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), e as combinações destes:
em que A é um grupo hidrocarbila C1-C5, opcionalmente, tendo uma ou mais ligações insaturadas, e sendo opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em -OH, = O, e um grupo hidrocarbila C1-C3; X é H, -OH, 
, ou 
; Y é O ou S e, opcionalmente, se liga com A para formar um anel de cinco membros; e R1 é H ou um grupo hidrocarbila C1-C20 substituído ou não substituído, em que um ou mais -CH2- no grupo hidrocarbila são opcionalmente substituídos por -NH- ou -O-. Os neurônios motores incluem neurônios motores superiores, como os neurônios motores no cérebro e neurônios motores inferiores, tais como os neurônios motores no tronco cerebral e na medula espinhal.
[0026] De um modo preferido, no composto de fórmula (I), A é um grupo alquenila ou alquila C1-C5 sendo opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em -OH, = O, e grupo alquila C1-C3; e R1 é H ou um grupo hidrocarbila C1-C10 substituído ou não substituído, em que um ou mais -CH2- no grupo hidrocarbila são opcionalmente substituídos por -NH- ou -O-. Mais de preferência, A é
, ou; e R1 é H, 
[0027] Em uma forma de realização da composição farmacêutica da presente invenção, o composto de formula (I) é selecionado a partir do grupo que consiste dos compostos acima (1) a (14). O composto de fórmula (I) é, de preferência, o composto (1) (ou seja, butilidenoftalida), e é mais de preferência um composto da seguinte fórmula (isto é, (Z)-butilidenoftalida):
[0028] A composição farmacêutica da presente invenção pode inibir a autofagia de neurônios motores e pode aliviar a morte neuronal, e assim, pode ser utilizada para retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e / ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores. As doenças degenerativas de neurônios motores compreendem quaisquer doenças relacionadas com a autofagia de neurônios motores, incluindo, mas não se limitando a esclerose lateral amiotrófica, miastenia grave, miastenia, atrofia muscular, distrofia muscular, esclerose múltipla, atrofia de múltiplos sistemas, atrofia muscular espinal etc.
[0029] Em uma forma de realização, a composição farmacêutica da presente invenção é utilizada para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica. Os pacientes de esclerose lateral amiotrófica mostraram gradualmente atrofia muscular, o que geralmente causa tetraplegia, dificuldade para engolir e até mesmo insuficiência respiratória em 2 a 5 anos. As investigações têm demonstrado que a esclerose lateral amiotrófica pode estar relacionada com excitação neuronal excessiva (por exemplo, o acúmulo excessivo de glutamatos). Portanto, no momento, o antagonista de glutamato, tais como tratamento com riluzol, é geralmente utilizado na clínica para o tratamento de doenças neurodegenerativas do motor para aumentar a taxa de sobrevivência dos pacientes. Em comparação com o riluzol, a composição farmacêutica da presente invenção pode mais efetivamente retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores através da inibição da autofagia dos neurônios motores, e, assim, pode aumentar a taxa de sobrevivência de pacientes com esclerose lateral amiotrófica.
[0030] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser fabricada em um medicamento de qualquer forma adequado para administração e pode ser administrada por qualquer modo adequado. Por exemplo, mas não se limitando deste modo, a composição farmacêutica pode ser fabricada em um medicamento com uma forma adequada para administração oral, injeção subcutânea, administração nasal ou intravenosa. Devido ao fato de que um medicamento para a administração oral é conveniente para os pacientes tomarem regularmente por si só, é preferível que a composição farmacêutica seja fabricada em um medicamento em uma forma adequada para administração oral. Dependendo da forma e do objetivo do medicamento, a composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0031] Para a fabricação de um medicamento adequado para administração oral, a composição farmacêutica pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, que não tem qualquer influência adversa sobre a atividade do componente ativo nele composto, tal como um solvente, um solvente oleoso, diluente, estabilizador, agente de retardamento de absorção, desintegrante, emulsionante, antioxidante, aglutinante, lubrificante, absorvente de umidade, etc. O medicamento pode estar em uma forma adequada para administração oral, tal como um comprimido, uma cápsula, um grânulo, pó, um extrato fluido, uma solução, xarope, uma suspensão, uma emulsão, tinturas etc.
[0032] Como para um medicamento adequado para a injeção subcutânea ou intravenosa, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais componentes, tais como uma solução isotônica, uma solução tampão salina (por exemplo, uma solução tampão de fosfato ou uma solução tampão de citrato), um solubilizante, um agente emulsionante, outros veículos etc., de modo a fabricar o medicamento como uma injeção intravenosa, uma injeção intravenosa para emulsão, uma injeção para pó, uma injeção para suspensão, uma injeção para pó-suspensão, etc.
[0033] Além dos adjuvantes acima referidos, a composição farmacêutica pode compreender outros aditivos, tais como um agente aromatizante, um tonalizante, um agente de coloração etc., para melhorar o sabor e apelo visual do medicamento resultante. Para melhorar a capacidade de armazenamento do medicamento resultante, a composição farmacêutica pode também compreender uma quantidade adequada de um conservante, um conservante, um antis-séptico, um reagente anti-fungo etc. Além disso, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais outros componentes ativos, como um antioxidante (por exemplo, vitamina E), fator neurotrófico, modulador imune etc., para melhorar ainda mais o efeito da composição farmacêutica da presente invenção ou aumentar a flexibilidade e adaptabilidade para a aplicação do método, enquanto os outros componentes ativos não têm nenhum efeito adverso sobre o composto de fórmula (I) ou seus sais e derivados de éster.
[0034] Dependendo dos requisitos do indivíduo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada com frequências diferentes de administração, tais como uma vez por dia, várias vezes por dia ou uma vez durante dias etc. Por exemplo, quando aplicados ao corpo humano durante inibição da autofagia de neurônios motores, a dosagem da composição é de cerca de 30 mg (como o composto de fórmula (I))/kg de peso corporal a cerca de 2000 mg (como o composto de fórmula (I))/kg de peso corporal por dia, e de preferência é de cerca de 100 mg (como o composto de fórmula (I))/kg de peso corporal a cerca de 1000 mg (como o composto de fórmula (I))/kg de peso corporal por dia, em que a unidade "mg/kg de peso corporal” significa a dosagem necessária por kg de peso de corpo. No entanto, para os pacientes com condições agudas, a dose pode ser aumentada várias vezes ou várias dezenas de vezes, dependendo das exigências da prática. Em uma forma de realização utilizando a composição farmacêutica da presente invenção para o tratamento da esclerose lateral amiotrófica, o componente ativo é (Z)- butilidenoftalida e sua dosagem é de cerca de 500 mg/kg de peso corporal.
[0035] A presente invenção também proporciona o uso do composto de fórmula (I) e/ou o(s) sal(is) e éster(es) farmaceuticamente aceitável (s) do mesmo, na fabricação de um medicamento para inibir a autofagia de neurônios motores. Ao inibir a autofagia de neurônios motores, o medicamento pode ser utilizado para retardar o início de doenças degenerativas de neurônios motores e/ou tratar as doenças degenerativas de neurônios motores, tais como esclerose lateral amiotrófica, miastenia grave, miastenia, atrofia muscular, distrofia muscular, esclerose múltipla, atrofia de múltiplos sistemas, distrofia muscular espinal, e as combinações destas. As formulações e dosagens do medicamento, e os outros componentes opcionalmente contidos no mesmo estão todos em linha com as descrições acima.
[0036] A presente invenção também fornece um método para inibir a autofagia de neurônios motores em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um componente ativo selecionado a partir do grupo que consiste de um composto de fórmula (I), um sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), um éster farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (I), e as combinações dos mesmos. As formulações e dosagens do componente ativo estão todos em linha com as descrições acima.
[0037] A presente invenção será ainda ilustrada em detalhes com exemplos específicos do seguinte modo. No entanto, os exemplos seguintes são fornecidos apenas para ilustrar a presente invenção, e o escopo da presente invenção não é limitado por eles.
[0038] Tem sido conhecido que a via metabólica de medicamento dentro do fígado de um organismo pode ser dividida principalmente em metabolismo de fase I e fase II. O metabolismo de fase I ocorre, principalmente, pela reação redox ou reação de hidrólise do medicamento, e o metabolismo de fase II ocorre, principalmente, pelo sistema de citocromo P450 (CYP450) monoxigenase. Este exemplo simulou o metabolismo da fase I e II de butilidenoftalida que ocorre dentro do fígado de um organismo por respectivamente misturando butilidenoftalida com microssomas hepáticos ou hepatócitos criopreservados in vitro e os produtos da solução de reação foram analisados por espectrômetro em massa tandem - cromatografia líquida (LC-MS/MS) para identificar os metabólitos e o perfil metabólico. As etapas experimentais foram como se segue:
[0039] Butilidenoftalida (2 mM), respectivamente, foi misturada com uma solução tampão de K3PO4 (100 mM, pH 1.4) contendo microssomos hepáticos de humano, rato ou cão (0,5 mg/mL). A mistura foi mantida a 37°C durante 10 minutos, e, em seguida, co-fatores pré-aquecidos (NADPH (2 mM) e MgCl2 (3 mM)) foram adicionados e a mistura foi incubada a 37°C durante 60 minutos. Depois disso, o volume de 3 vezes de acetonitrila contendo 0,1% de ácido fórmico foi adicionado à mistura para terminar a reação. A mistura foi centrifugada a 13000 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante foi então recolhido e analisado por LC-MS/MS para identificar os metabólitos.
[0040] Mei o de William E contendo 5x105 hepatócitos descongelados de humano, de rato ou do cão, respectivamente foi adicionado à placa de cultura de 12 poços, e as células foram cultivadas durante 6 horas. Em seguida, 0,5 mL de butilidenoftalida (50 μM) foi adicionado à placa de cultura. Depois as células foram incubadas a 37°C, 95% de umidade relativa e CO2 a 5% durante 6 horas, 2 mL de acetonitrila (100%) foram adicionados para terminar a reação. A amostra foi recolhida, misturada de forma adequada, e centrifugada a 45000 g, 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante foi então recolhido, seco, e analisado por LC-MS/MS para identificar os metabólitos.
[0041] As amostras obtidas a partir de (1) e (2) foram dissolvidas separadamente em acetonitrila/0,1% de ácido fórmico, centrifugou-se a 45000g, 4°C durante 10 minutos. Em seguida, alíquotas (20 μl) de cada amostra foram injetadas em um frasco de auto-amostrador (Agilent Technologies, EUA) de um sistema de LC-MS/MS para realizar a análise de LC-MS/MS. O sistema de LC-MS/MS compreende um sistema Q TRAPTM ABSCIEX 5500 com sistema 1200SL HPLC (Agilent Technologies, EUA), uma coluna de HPLC (Symmetry® C18, 3,5 uM, 4,6x75 mm), e um amostrador automático (Agilent Technologies, EUA ). Um sistema de dois solventes (solvente A: ácido fórmico a 0,1%, solvente B: metanol contendo ácido fórmico a 0,1%) foi usado para realizar HPLC a uma vazão de 0,8 mL/min. O sistema de gradiente de HPLC foi definido como segue: 0 a 2 minutos, realizado em 10% de solvente B; 2 e 7 minutos com um gradiente de 10% a 95% de solvente B; 7 a 12 minutos, realizado a 95% de solvente B; 12 a 14 minutos com um gradiente de 95% a 10% de solvente B; 14 a 20 minutos, realizado em 10% de solvente B; e o tempo de retenção de análise de HPLC é de 20 minutos. A análise de espectrometria de massa foi realizada em um modo de ionização por eletropulverização de íons positivos (ESI +) a 5,5 kV, 550°C, e N2 (nitrogênio) foram utilizados como um gás auxiliar. Os picos mais intensos no espectro de LC-MS/MS e os picos deslocados em massa no espectro de LC-MS/MS de cada amostra, em comparação com o espectro de butilidenoftalida foram analisados por software LightSightTM para determinar os metabólitos nas amostras e identificar a via de biotransformação e o perfil metabólico da butilidenoftalida em um organismo. Os resultados são mostrados na Tabela 1, Tabela 2, Figura 1A, Figura 1B e Figura 1C.
[0042] A Figura 1A mostra o espectro de produto de fragmento da mistura de butilidenoftalida (m/z 189,1) e microssomos hepáticos humanos analisados por LC-MS/MS. Como mostrado na Figura 1A, os picos mais intensos (m/z) são 171,2 amu, 153,1 amu, 143,0 amu, 128,0, e 115,0 amu. Tabela 1
[0043] A Tabela 1 mostra os tipos de metabólitos produzidos a partir da reação da mistura de butilidenoftalida e microssomos hepáticos (isto é, do metabolismo de fase I) e a via de biotransformação adquiridos por análise de software. Os resultados mostram que os compostos (2) a (9) da presente invenção podem ser produzidos pela reação de uma mistura de butilidenoftalida e os microssomos hepáticos de rato, cão ou humano, indicando que a butilidenoftalida pode ser transformada em metabólitos semelhantes quando metabolizada nos fígados de organismos diferentes. A Figura 1B mostra o perfil metabólico obtido a partir da reação da mistura de butilidenoftalida e microssomos hepáticos, e as estruturas químicas dos compostos (2) a (9). Tabela 2
[0044] A Tabela 2 mostra os tipos de metabólitos produzidos a partir da reação da mistura de butilidenoftalida e hepatócitos criopreservados (ou seja, do metabolismo de fase II) e a via biotransformação adquirida por análise de software. Os resultados mostram que os compostos (11) a (14) da presente invenção podem ser produzidos pela reação de uma mistura de butilidenoftalida e os hepatócitos criopreservados de rato, cão ou humano, indicando que a butilidenoftalida pode ser transformada em metabólitos semelhantes quando metabolizada nos fígados de organismos diferentes. A Figura 1C mostra o perfil metabólico obtido a partir da reação da mistura de butilidenoftalida e hepatócitos criopreservados, e as estruturas químicas dos compostos (11) a (14).
[0045] Sabe-se que cerca de 20% de pacientes com esclerose lateral amiotrófica foram associados a mutações no gene que codifica enzima de Cu/Zn superóxido dismutase (SOD1), e G93A foi o principal sítio de mutação. Os camundongos transfectados com mutante humano SOD1-G93A pela técnica de transfecção de genes (daqui em diante referidos como camundongos transgênicos SOD1-G93A) foram utilizados como um modelo animal para o estudo clínico de esclerose lateral amiotrófica, pois os camundongos apresentam um curso semelhante ao da doença humana. Um camundongo transgênico SOD1-G93A irá mostrar os sintomas da esclerose lateral amiotrófica dentro de cerca de 90 ± 5 dias pós-natal e vai morrer dentro de cerca de 125 ± 5 dias pós-natal.
[0046] Este exemplo usou os camundongos transgênicos SOD1-G93A acima como o objeto de estudo para realizar a análise in vivo. Camundongos transgênicos SOD1-G93A (60 dias de idade) foram tratados com butilidenoftalida (adquirida a ECHO Chemical) por administração oral, com uma dosagem de peso de 500 mg/kg de corpo uma vez por dia, em que a unidade de "peso mg/kg de corpo "significa que a dosagem necessária por kg de peso corporal. Após os camundongos transgênicos SOD1-G93A serem tratados durante 30 dias, foram observados para ver se a butilidenoftalida pode prolongar a vida de camundongos transgênicos SOD1-G93A (isto é, mais de 125 dias). Os resultados são mostrados na Figura 2 e Tabela 3. Tabela 3
[0047] Como mostrado na Figura 2 e Tabela 3, os camundongos transgênicos SOD1-G93A com 60 dias de idade no grupo experimental que foram tratados com butilidenoftalida por administração oral diária sobreviveram durante cerca de 149 ± 4,39 dias, em média. Isto é, a vida de camundongos transgênicos SOD1-G93A no grupo experimental foi prolongada durante cerca de 22 ± 2 dias, em comparação com os camundongos transgênicos SOD1-G93A não tratados no grupo de controle (sobreviveram durante cerca de 127 ± 6,11). De acordo com a Figura 3 (obtida a partir de uma referência "Combined riluzole e sodium phenylbutyrate therapy in transgenic amyotrophic lateral sclerosis mice. Amyothrophic Lateral Sclerosis. 2009; 10: 85-94", que é totalmente aqui incorporada por referência), quando droga tradicional de esclerose lateral amiotrófica, riluzol, foi utilizada para tratar camundongos transgênicos SOD1-G93A, os camundongos sobreviveram durante 140 dias. Os resultados acima mostram que, em comparação com o riluzol, a presente invenção utilizando o composto de fórmula (I) pode aumentar de forma mais eficaz a taxa de sobrevivência de pacientes com esclerose lateral amiotrófica.
[0048] Camundongos transgênicos SOD1-G93A (60 dias de idade) foram tratados com butilidenoftalida por administração oral, com uma dosagem de peso de 500 mg/kg de corpo uma vez por dia. Depois de os camundongos terem sido tratados durante 30 dias, os membros posteriores dos ratos foram examinados por escala BBB (Escala de avaliação motora de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)). A escala de BBB dos membros posteriores de ratos normais foi de 21 pontos, enquanto a escala de BBB de camundongos transgênicos SOD1-G93A com doença progredida diminuiu de 21 a 0 pontos, em que a escala inferior representa um distúrbio de ação mais grave nos camundongos. Escala de BBB é usada para registrar a eficiência da droga.
[0049] Como mostrado na Figura 4, os camundongos transgênicos SOD1-G93A com 60 dias de idade no grupo experimental foram tratados com butilidenoftalida por administração oral diária. A escala de BBB dos membros posteriores dos ratos diminuiu lentamente de 125 a 135 dias (21 a 16 pontos), e diminuiu rapidamente depois de 135 dias (16 a 0 pontos); enquanto que a escala de BBB dos membros posteriores dos ratos não tratados no grupo de controle diminuiu rapidamente depois de 110 dias (19 a 0 pontos). Os resultados acima mostraram que a butilidenoftalida pode efetivamente retardar o início da esclerose lateral amiotrófica.
[0050] Camundongos transgênicos SOD1-G93A (60 dias de idade) foram tratados com butilidenoftalida por administração oral, com uma dosagem de peso de 500 mg/kg de corpo uma vez por dia. Os camundongos transgênicos SOD1-G93A no grupo experimental foram sacrificados no momento da morte, e as medulas espinhais foram recolhidas para executar manchamento de hematoxilina e eosina. Foi observado o número de neurônios motores na espinal medula e contado usando um microscópio, e os dados foram comparados com o do grupo de controle não tratado.
[0051] Como mostrado na Figura 5A, Figura 5B e na Tabela 4, o número de neurônios motores espinais de camundongos transgênicos G93A-SOD1 de 60 dias de idade no grupo experimental tratado com butilidenoftalida todos os dias era significativamente mais elevado do que o do grupo de controle (o número do grupo experimental: 24; o número do grupo de controle: 3). Os resultados acima mostram que a butilidenoftalida pode efetivamente retardar e/ou prevenir a morte de neurônios motores da medula, assim, aumentando a taxa de sobrevivência de camundongos transgênicos SOD1-G93A. Tabela 4
[0052] Camundongos transgênicos SOD1-G93A (60 dias de idade) foram tratados com butilidenoftalida por administração oral, com uma dosagem de peso de 500 mg/kg de corpo uma vez por dia. Foi indicado pela pesquisa que os camundongos transgênicos SOD1-G93A perderam seus neurônios motores da coluna vertebral, devido ao aumento significativo de autofagia durante a última fase da esclerose lateral amiotrófica (que pode ser visto na formação de imagem óptica in vivo da autofagia do neurônio motor em um modelo de camundongo da esclerose lateral amiotrófica. Autophagy 7: 9, 1-8; setembro de 2011, que é totalmente incorporada aqui por referência). Portanto, neste exemplo, os camundongos transgênicos SOD1-G93A no grupo experimental foram sacrificados no momento da morte para recolher a sua medula espinal, e as proteínas foram extraídas da medula espinal para efetuar Western Blotting e para analisar o biomarcador de proteína de autofagia, LC3-II, o qual foi utilizado para determinar se ocorreu autofagia nos neurônios motores espinais lombares dos camundongos, em que β-actina foi utilizada como um controle interno.
[0053] Como mostrado na Figura 6, quando comparado com os camundongos não tratados no grupo de controle, o nível de expressão da proteína de LC3-II e CLP3-II na medula espinal cervical, medula espinal torácica, e da medula espinal lombar de camundongos no grupo experimental era significativamente diminuído. Os resultados acima mostram que a butilidenoftalida pode inibir especificamente a autofagia de neurônios motores no organismo, e, desse modo, retardar o início da esclerose lateral amiotrófica, prolongar os dias de sobrevivência dos camundongos, e obter o efeito de tratamento de esclerose lateral amiotrófica.
[0054] O experimento celular foi realizado utilizando NSC (células-tronco neurais), que podem se diferenciar em neurônios motores do camundongo para imitar os neurônios motores do camundongo.
[0055] NSC foram incubadas em uma placa de cultura (10 cm de diâmetro). As células foram lavadas com PBS, quando cultivadas a uma densidade de 60 % de confluência e tratadas com diferentes concentrações de butilidenoftalida durante 12 horas. As células foram então tratadas com H2O2 (2500 μM/ml) durante 12 horas para estimular a autofagia de células. Em seguida, as células foram colhidas e as proteínas foram extraídas, e o nível de expressão da proteína de LC3-II em NSC foi analisado por SDS-PAGE e Western blotting. O resultado do Western blotting é mostrado na Figura 7.
[0056] Como mostrado na Figura 7, 10 μg/mL de butilidenoftalida pode proteger e prevenir NSC de danos de H2O2 pela inibição da autofagia (diminuição do nível de expressão da proteína de LC3-II).
[0057] Os exemplos acima são utilizados para ilustrar o princípio e eficácia da presente invenção e mostrar as características inventivas desta. As pessoas versadas neste campo podem prosseguir com uma variedade de modificações e substituições com base nas descrições e sugestões da invenção, tal como descrita, sem se afastarem do espírito e princípio desta. Por conseguinte, o escopo de proteção da presente invenção é aquele tal como definido nas reivindicações anexadas.
Claims (2)
1. Uso de butilidenoftalida (BP) caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar e/ou retardar o desencadeamento de doenças degenerativas de neurônios motores, esclerose lateral amiotrófica, miastenia grave, miastenia, atrofia muscular, distrofia muscular, esclerose múltipla, atrofia de múltiplos sistemas, atrofia muscular espinhal e combinações destas.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela BP ser (Z)-BP.
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