BR112019011463A2

BR112019011463A2 - composições antibióticas compreendendo prata e selênio

Info

Publication number: BR112019011463A2
Application number: BR112019011463A
Authority: BR
Inventors: Holmgren Arne; Lu Jun; Zou Lili
Original assignee: Holmgren Arne
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2019-10-22
Also published as: KR20190092481A; EP3548043B1; US20180185410A1; ES2930900T3; WO2018104777A1; US11801262B2; AU2017374015B2; PL3548043T3; US20200281967A1; US10653717B2; JP7221208B2; AU2017374015A1; KR102507679B1; JP2020502264A; EP3548043A1; DK3548043T3; CA3046163A1

Abstract

a presente invenção se refere a composições antibióticas, por exemplo composições que compreendem um agente contendo metal e um agente de organosselênio, e usos dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: COMPOSIÇÕES ANTIBIÓTICAS COMPREENDENDO PRATA E SELÊNIO

REFERÊNCIA CRUZADA [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n^ U.S. 62/430.101, depositado em segunda-feira, 5 de dezembro de 2016, que é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

ANTECEDENTES [002] Resistência a antibióticos se tornou um grande desafio em todo o mundo. Bactérias gram-negativas apresentam uma grande ameaça à vida dos seres humanos e à medicina, em que quase nenhum antibiótico resta para o tratamento, o que torna urgente encontrar novos princípios e mecanismos. Um foco conjunto, desde os anos 90, em atacar bactérias gram-positivas resistentes a múltiplos fármacos crescentes (MDR) nos sistemas de saúde dos E.U.A. e da Europa parece ter sido fundamental para o estímulo dos números relativamente grandes de produtos que alvejam bactérias gram-positivas nos últimos anos. A emergência de bactérias gram-negativas MDR apresenta uma grande ameaça à vida humana e é um desafio para a medicina moderna.

BREVE RESUMO [003] Em alguns casos, a presente revelação fornece uma composição antibiótica, em que a composição antibiótica compreende: um agente contendo prata; e um agente de

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2/151 organosselênio. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender um íon de prata. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender nitrato de prata. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender citrato de di-hidrogênio de prata. 0 agente contendo prata pode ser fornecido como íons de prata, nitrato de prata e/ou citrato de di-hidrogênio de prata. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um composto de selenazol. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um composto de benzoisosselenazol-3 (2H) ona. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um ebselen. 0 composto de organosselênio pode compreender um composto de selenazol, um composto de benzoisosselenazol-3(2H)-ona e/ou um ebselen. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode estar em uma forma de dosagem de líquido. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser em uma forma de dosagem de uma solução ou uma suspensão. Em alguns exemplos, uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica pode ser de cerca de 0,5 a 50 μΜ, cerca de 1 a 25 μΜ, ou cerca de 1 a 10 μΜ. Em alguns exemplos, uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica pode ser de cerca de 5 μΜ. Em alguns exemplos, uma concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica pode ser de cerca de 4 a 25 μΜ, cerca de 30 a 200 μΜ, cerca de 30 a 150 μΜ, ou

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3/151 cerca de 30 a 100 μΜ. Em alguns exemplos, uma concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica pode ser de cerca de 40 μΜ ou cerca de 80 μΜ. Em alguns exemplos, o agente contendo prata e o agente de organosselênio, ou o inverso, podem estar a uma razão molar de cerca de 1:2 a cerca de 1:20, por exemplo, cerca de 1:4, 1:8 ou 1:16. Em alguns exemplos, a composição antibiótica exibe um valor de ICso de cerca de 10 a 100 nM para uma ou mais bactérias gramnegativas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica exibe um valor de ICso de cerca de 10 a 100 nM para uma ou mais bactérias gram-positivas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica exibe um valor de ICso de cerca de 50 nM ou menor para uma ou mais bactérias gram-negativas. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias gram-negativas podem compreender K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender AgNCç e ebselen. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 4 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem líquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 20 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem líquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 40 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem líquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de

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AgNOs e 80 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem líquida.

[004] Em alguns casos, a presente revelação fornece uma formulação farmacêutica que pode compreender a composição antibiótica revelada no presente documento. Em alguns exemplos, a formulação farmacêutica pode compreender, adicionalmente, um excipiente revelado no presente documento.

[005] Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para inibir ou eliminar uma ou mais bactérias, que compreende colocar a composição antibiótica revelada no presente documento em contato com a uma ou mais bactérias. Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para tratar uma infecção bacteriana, que compreende colocar a composição antibiótica revelada no presente documento em contato com a infecção bacteriana. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias gramnegativas. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias gram-positivas. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias resistentes a múltiplos fármacos. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias podem compreender K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos,

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5/151 a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em uma superfície. Em alguns exemplos, a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em um mamífero. Em alguns exemplos, a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em um ser humano. Em alguns exemplos, o contato pode ser através de injeção, por exemplo injeção intravenosa ou subcutânea. Em alguns exemplos, o contato pode ser através de aplicação tópica. Em alguns exemplos, o contato pode ser através de administração oral. Em alguns exemplos, o contato dura por pelo menos cerca de: 1 minuto, minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, ou um mês. Em alguns exemplos, o contato ocorre 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes de hora em hora ou diariamente. Em alguns exemplos, o contato ocorre aproximadamente a cada

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 minutos ou horas diariamente. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode estar em uma única dose unitária. Em alguns exemplos, a quantidade do agente de organosselênio colocado em contato com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias pode ser de cerca de 10 a 100 mg, cerca de 10 a 50 mg, ou cerca de 20 a 30 mg, por exemplo, cerca de 25 mg, por dosagem. Em alguns

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6/151 exemplos, uma quantidade da prata colocada em contato com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias pode ser de cerca de 1 a 20 mg, cerca de 1 a 10 mg, ou cerca de 5 a 7 mg, por exemplo, cerca de 6 mg, por dosagem.

[006] Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para preparar uma composição antibiótica, que compreende misturar um agente contendo prata e um agente de organosselênio. Em alguns exemplos, a mistura pode ser conduzida em um líquido. Em alguns exemplos, a mistura pode compreender adicionar o agente contendo prata em um líquido que pode compreender o agente de organosselênio. Em alguns exemplos, a mistura pode compreender adicionar o agente de organosselênio em um líquido que pode compreender o agente contendo prata.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [007] As Figuras IA e 1B ilustram efeitos de prata com ebselen em combinação com o cultivo de E. coli e células de HeLa. A Figura IA é um gráfico de linhas que mostra o efeito sinérgico de ebselen com nitrato de prata (AgNO3) em combinação com o cultivo de E. coli. Culturas de um dia para o outro de E. coli DHB4 foram diluídas 1:1.000 em 100 μΐ de meio de LB em placas de 96 micropoços, e tratadas por diluições de 100 μΐ em série de ebselen e AgNO3, em combinação por 16 h, e a viabilidade celular foi determinada medindo-se ODsoo _nm. Ag⁺ sozinho inibiu o cultivo de E. coli

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7/151 com uma concentração de inibição minima (MIC) de 42 μΜ após 16 h de tratamento, enquanto 2 μΜ de ebselen diminui drasticamente a MIC de Ag⁺ para 4,2 μΜ (p = 0,000028 < 0,001) . A Figura 1B é um gráfico de linhas que mostra efeitos de ebselen com AgNO3 em combinação com o cultivo de células de HeLa. Células de HeLa foram tratadas com concentrações em série de ebselen e AgNO3 por 24 h, e a toxicidade celular foi detectada através do ensaio de MTT. 5,0 μΜ de Ag⁺ e 2,5 μΜ de ebselen, em combinação, não mostraram nenhuma toxicidade sinérgica em células de HeLa humanas (p = 0,98 >

0,05) .	Nas	Fiquras IA	e 1B,	dados	são apresentados	como
médias	± s.	d. de três	experimentos	independentes. *:	P <
0,05,	**: p	< 0,01, ***	: p <	0,001 (	teste t). A Figura	1C é

um gráfico de barras que mostra que ebselen sozinho não tem efeito sobre o cultivo de E. coli. Culturas de um dia para o outro de E. coli DHB4 foram diluídas 1:1.000 em 100 μΐ de meio de LB em placas de 96 micropoços e tratadas com diferentes concentrações de ebselen por 16 h. A viabilidade celular foi determinada medindo-se a absorção a 600 nm. Dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t) .

[008] As Figuras 2A a 2D ilustram prata com ebselen que em combinação exibiram efeito bactericida sinérqico. E. coli DHB4 cultivada em ODsoo nm de 0,4 foi tratada com

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8/151 diluições em série de ebselen e AgN03 em combinação. A Figura 2A é um gráfico de linhas que mostra que a viabilidade celular foi representada medindo-se ODsoo nm. As curvas de cultivo mostraram um efeito bacteriostático sinérgico de Ag+ com ebselen em combinação no meio de LB. Cinco μΜ de Ag+ e 40 μΜ de ebselen, em combinação, inibiram o cultivo de E. coli 480 min após tratamento (p = 0,0075 < 0,01) . A Figura 2B é um gráfico de linhas que mostra alterações de unidades de formação de colônia de E. coli DHB4 em placas de LB 0, 10, 60, 120 e 240 min após tratamento. O efeito bactericida sinérgico de 5 μΜ de Ag+ e 80 μΜ de ebselen em combinação foi confirmado pelo ensaio de formação de colônia em placas de ágar e LB. Cinco μΜ de Ag+ e 80 μΜ de ebselen, em combinação, eliminaram a maioria de E. coli 60 min após tratamento (p = 0,00021 < 0,001) . A Figura 2C é um grupo de plotagens de FACS de E. coli DHB4 manchada com iodeto de propídio (PI), e a Figura 2D é um gráfico de barras que mostra valores médios ± s.d. (D) de E. coli DHB4 manchada com PI. Cinco μΜ de Ag+ e 20 μΜ de ebselen, em combinação, aprimoraram a frequência de fingimento com iodeto de propídio (PI) (p = 0,00083 < 0,001). Nas Figuras 2A a 2C, dados são

apresentados	como	médias ±	s.d.	de três	experimentos
independentes.	* .	p < 0,05,	** : p	< 0,01, *	**: p < 0, 001
(teste t) .
[009]	As	Figuras 3A	a 3F	ilustram	que prata com

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9/151 ebselen em combinação rompem diretamente os sistemas Trx e GSH bacterianos. E. coli DHB4 cultivada em ODgoo nm de 0,4 foi tratada com diluições em série de ebselen e AgNO3 em combinação. A Figura 3A é um gráfico de barras que mostra que atividades de TrxR foram testadas com o uso de redução de DTNB na presença de Trx em extratos de E. coli, 50 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, na presença de 100 nM de E. coli TrxR. Cinco μΜ de Ag⁺e 20 μΜ de ebselen, em combinação, resultaram em uma perda drástica de atividades de TrxR (p = 0, 00018 < 0,001) . A Figura 3B é um gráfico de barras que mostra que atividades de Trx foram testadas com o uso de redução de DTNB na presença de Trx em extratos de E. coli, 50 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, 5 μΜ de E. coli Trx. Cinco μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen, em combinação, resultaram em uma perda drástica de atividades de Trx (p = 0,0036 < 0,01) . A Figura 3C é um gráfico de barras que mostra alterações de estado de Trxl redox em E. coli após tratamento com ebselen e AgNO3. E. coli foi precipitado em 5% de TCA e alquilado com 15 mM de AMS, e o percentual de Trxl reduzido foi analisado através de Western blot. A Figura 3D é um grupo de imagens de Western blot que mostram alterações de estado de Trx2 redox em E. coli após tratamento com ebselen e AgNO3. E. coli foi precipitado em 5% de TCA e alquilado com 15 mM de AMS, Trx2 de diamida oxidada foi usado como um controle

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10/151 positivo de Trx2, e o percentual de Trx2 reduzido foi analisado através de Western blot. A Figura 3E é um gráfico de barras que mostra as quantidades de GSH que foram medidas

através	do	ensaio de redução	de	DTNB	de	GR	acoplado	em
extratos	de	E. coli, 5 0 mM de	Tris	•HC1	(pH	7,5:	), 200 μΜ	de
NADPH, 1	mM	de EDTA, 1 mM de DTNB,	5 0 nM	de	GR.	Cinco μΜ	de

Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen em tratamento de combinação reduziram o GSH funcional em 10 min em comparação com o controle (p = 0,000021 < 0,001) . A Figura 3F é uma imagem de Western blot que mostra alterações de glutationilação S de proteínas em E. coli. Células foram cultivadas, lavadas e ressuspensas em tampão de lise que contém 30 mM de IAM. Após lisadas por sonicação, ensaio de Western blotting foi realizado com anticorpo monoclonal de camundongo IgG2a (VIROGEN, 101-A/D8) para complexos de glutationa e proteína. Nas Figuras 3A, 3B e 3E, os dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t).

[010] As Figuras 4A a 4D ilustram efeitos inibidores de prata sobre sistema de E. coli Trx in vitro. A Figura 4A é um gráfico de linhas que mostra a inibição de E. coli TrxR por AgNO3. 100 nM de TrxR recombinante puro, e 5 μΜ de mistura de Trx foram incubados com solução de AgNO3 na presença de 200 μΜ de NADPH e, então, suas atividades foram detectadas através do ensaio de redução de DTNB. A Figura 4B

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11/151 é um espectro fluorescente de um complexo entre 10 μΜ de E. coli Trxl reduzido com AgNO3. 10 μΜ de proteína E. coli Trxl reduzida foram incubados com uma concentração em série de solução de AgNO3 e o espectro fluorescente foi detectado com um comprimento de onda de excitação a 280 nm. Trxl oxidado (Trx-S2) foi usado como um controle. A Figura 4C é um gráfico de barras que mostra a inibição de Trx por AgNO3. Após o tratamento descrito em (B) , a atividade de Trx foi testada por um método de DTNB na presença de E. coli Trxl. A Figura 4D é um gráfico de barras que mostra a reversibilidade de inibição de E. coli Trxl por AgNO3. E. coli Trxl inibido por prata foi passado por uma coluna de dessalinização para remover moléculas pequenas e, então, a atividade de Trx foi medida. E. coli Trxl sem a inibição foi usado como um controle. A inibição de Trxl por Ag⁺ foi irreversível, visto que a atividade de Trxl não foi recuperada após dessalinização (p = 0,00021 < 0,001) . Dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t).

[011] As Figuras 5A a 5C ilustram que ROS foi um fator determinante para o efeito bactericida sinérgico de prata e ebselen. A Figura 5A mostra histogramas de FACS de E. coli manchada com H2DCF-DA. A Figura 5B é um gráfico de barras de MFI média ± s.d. de E. coli manchada com H2DCF-DA. E. coli DHB4 cultivada em ODsoo nm de 0,4 foi tratada por 20

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12/151 μΜ de ebselen e 5 μΜ de AgN03. Nivel de ROS foi detectado por citometria de fluxo (CyAn adp, Beckman coulter) . 0 tratamento com 5 μΜ de Ag⁺ ou 20 μΜ de ebselen sozinho não altera as concentrações de ROS, enquanto a combinação de 5 μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen resultou em níveis aumentados de ROS (p = 0,00012 < 0,001). A Figura 5C é um gráfico de barras que mostra detecção de H2O2 com o uso do Kit de Ensaio de Peróxido/Peroxidase de Hidrogênio Vermelho da Amplex® (Invitrogen). Reações que contêm 50 μΜ de reagente vermelho da Amplex®, 0,1 U/ml de HRP e a quantidade indicada de H2O2 em 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4, foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente e detectadas com absorção a 560 nm. Antecedente determinado para uma reação de controle de não H2O2, foi subtraído de cada valor. Ο H2O2 aprimorado gerado por células de E. coli DHB4 tratadas com 5 μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen foi verificado (p = 0,00057 < 0, 0001) . Nas Figuras 5B e 5C, dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t).

[012] As Figuras 6A a 6B ilustram o modo de ação de prata e ebselen em modelo de peritonite leve e aguda em camundongos in vivo. A Figura 6A é um gráfico de linhas de medições de UFC de E. coli durante 36 horas no modelo de peritonite leve em camundongos. Camundongos foram infectados

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13/151 através de administração intraperitoneal de 100 μΐ de 1,7 x 10⁶ de células de E. coli ZY-1. Após 24 h, 12 camundongos por grupo receberam tratamentos antibacterianos (25 mg de ebselen/kg e 6 mg de AgNOs/kg de peso corporal). 12, 24 e 36 h após tratamento, o fluido peritoneal foi coletado para análise de UFC de E. coli (n = 12 camundongos para cada grupo) (p = 0,0055<0,01), e dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t). A Figura 6B é um gráfico de linhas de medições de UFC de E. coli durante 96 horas no modelo de peritonite aguda em camundongos. Inoculação foi realizada através de injeção intraperitoneal de 100 μΐ de 6,0 x 10⁶ UFC/ml de inóculos de E. coli ZY-1. Após inoculação por 1 h, 10 camundongos por grupo receberam tratamentos antibacterianos, e os camundongos foram observados por 7 dias para avaliar a sobrevivência geral (n = 10 camundongos para cada grupo) , e o experimento foi realizado duas vezes.

[013] A Figura 7 é um gráfico que mostra que o modelo Bliss para sinergia confirma um efeito sinérgico, entre Ag+ e 4 antibióticos, contra um modelo de bactérias gram-negativas, E. coli. O grau de sinergia foi quantificado, com o uso do Modelo Bliss para Sinergia, após 1 e 4 h de tratamento com 5 μΜ de AgNCç em combinação com os seguintes antibióticos: 80 μΜ de gentamicina, 80 μΜ de canamicina, 80

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14/151 μΜ de geneticina, 80 μΜ de tetraciclina e 80 μΜ de Ebselen foram usados como controle positivo.

[014] As Figuras 8A e 8B ilustram que ROS foi um fator determinante para efeitos bactericidas sinérgicos de prata e antibióticos em combinações. E. coli DHB4 cultivada em ODsoonm de 0,4 foi tratada com 80 μΜ de antibióticos e 5 μΜ de AgNCç em combinações, e prata e ebselen, em combinação, foram usados como um controle positivo. A Figura 8A é um gráfico de barras que mostra que o nível de ROS foi detectado através de citometria de fluxo (CyAnadp, Beckman coulter), e a MFI média ± s.d. de E. coli manchada de H2DCF-DA foi detectada. A Figura 8B é um gráfico de barras que mostra a detecção de H2O2 com o uso do Kit de Ensaio de Peróxido/Peroxidase de Hidrogênio Vermelho da Amplex® (Invitrogen). Reações que contêm 50 μΜ de reagente vermelho da Amplex®, 0,1 U/ml de HRP e a quantidade indicada de H2O2 em 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4, foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente e detectadas com absorção a 560 nm. Antecedente determinado por uma reação de controle de não H2O2, foi subtraído de cada valor. Dados são apresentados como médias ± s.d. de três experimentos independentes. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 (teste t) .

[015] As Figuras 9A a 9C ilustram que antibióticos sozinhos não poderíam romper diretamente o sistema de Trx

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15/151 bacteriano. E. coli DHB4 cultivada em ODgoonm de 0,4 foi tratada com antibióticos e AgNO3 em combinações por 10 min, e ebselen e AgNOs, em combinação, foram usados como um controle positivo. A Figura 9A é um gráfico de barras que mostra atividades de Trx testadas com o uso de redução de DTNB na presença de Trx em extratos de E. coli. A Figura 9B é um gráfico de barras que mostra atividades de TrxR testadas com o uso de redução de DTNB na presença de TrxR em extratos de E. coli. A Figura 9C é uma imagem de Western blot que mostra o percentual de Trxl reduzido. E. coli DHB4 cultivada em ODsoonm de 0,4 foi tratada com antibióticos e AgNO3 em combinações por 60 min, e ebselen e AgNCç, em combinação, foram usados como controle positivo. Extratos de E. coli foram precipitados em 5% de TCA e alquilados com 15 mM de AMS, e o percentual de Trxl reduzido foi analisado através de Western blot. A média ± s.d. de três experimentos independentes foi representada. Os significados de teste t foram calculados entre grupos de controle e restante, e *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: P < 0,001.

[016] As Figuras 10A e 10B ilustram que prata e antibióticos convencionais em combinações poderíam não romper diretamente o sistema de GSH bacteriano por 10 minutos. E. coli DHB4 cultivada em ODsoonm de 0,4 foi tratada com antibióticos e AgNOs em combinações por 10 min, e ebselen e AgNOs, em combinação, foram usados como um controle

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16/151 positivo. A Figura 10A é um gráfico de barras que mostra quantidades totais de GSH medidas através do ensaio de redução de DTNB de GR acoplado em extratos de E. coli. A Figura 10B é uma imagem de Western blot que mostra alterações em glutationilação S de proteína em E. coli. A média ± s.d. de três experimentos independentes é representada. Os significados de teste t foram calculados entre grupos de controle e teste, e *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: P < 0,001.

[017] As Figuras 11A e 11B ilustram que prata e antibióticos convencionais em combinações poderíam não romper diretamente o sistema de GSH bacteriano por 60 minutos. E. coli DHB4 cultivada em ODsoonm de 0,4 foi tratada com antibióticos e AgNOs em combinações por 60 min, e ebselen e AgNOs, em combinação, foram usados como um controle positivo. A Figura 11A é um gráfico de barras que mostra que as quantidades totais de GSH foram medidas através do ensaio de redução de DTNB de GR acoplado em extratos de E. coli. A Figura 11B é uma imagem de Western blot que mostra alterações em glutationilação S de proteína em E. coli. A média ± s.d.

de três	experimentos	independentes foi	representada.	Os
significados de teste	t foram calculados	entre grupos	de
controle	e restante, e	: p < 0,05, *: p	< 0,01, ***:	P <

0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA

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17/151 [018] A revelação no presente documento é direcionada, de modo geral, a composições antibióticas que compreendem múltiplos agentes farmaceuticamente ativos (dois, três, quatro ou mais) que são úteis, em combinação, como terapêutica antimicrobiana que trata e/ou previne infecção bacteriana eliminando ou inibindo-se o crescimento de bactérias. Por exemplo, uma composição que pode compreender um agente contendo metal (por exemplo, íon de prata) e um agente antimicrobiano (por exemplo, ebselen), em combinação sinérgica, revelada no presente documento, alveja sistemas de tiorredoxina e glutationa bacterianos e é potente contra infecções bacterianas, tais como aquelas causadas por bactérias gram-negativas.

[019] Uma quantidade eficaz quando usada em combinação com uma composição ou agente ativo revelado no presente documento é uma quantidade suficiente para produzir um resultado terapêutico em um indivíduo que necessita do mesmo. Por exemplo, um resultado terapêutico inclui, porém, sem limitação a tratar, prevenir, amenizar ou diminuir infecção bacteriana e/ou qualquer sintoma da mesma, tal como inflamação, febre, tosse, espirro, congestão nasal, prurido no nariz, garganta inflamada, dor, náusea, vômito ou constipação em um indivíduo.

[020] O termo cerca de significa a indicação numérica citada mais ou menos 15% daquela indicação numérica

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18/151 citada .

[021] A presente revelação mostra que bactérias gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos (MDR) são altamente sensíveis a prata e ebselen em uma combinação sinérgica. Em contraste, prata não mostra nenhuma toxicidade sinérgica com ebselen contra células de mamíferos. Experimentos bioquímicos revelaram que prata e ebselen causaram uma redução rápida de glutationa e inibição do sistema de tiorredoxina em bactérias. íons de prata foram identificados como fortes inibidores de redutase de tiorredoxina e tiorredoxina de E. coli, que são necessárias para redutase de ribonucleotideo e sintese de DNA e defesa contra estresse oxidante. A eficácia bactericida de prata e ebselen que provoca estresse oxidante foi adicionalmente verificada no tratamento de peritonite leve e aguda de E. coli MDR em camundongos. Esses resultados demonstram que sistemas de redox dependente de tiol em bactérias poderíam ser alvejados no projeto de novos fármacos antibacterianos. Prata e ebselen atuam como uma sonda para alvejar sistemas bacterianos essenciais que podem ser desenvolvidos para tratamentos eficientes inovadores contra infecções bacterianas gram-negativas MDR. Prata atuou de maneira fortemente sinérgica com o fármaco de selenazol ebselen, para combater bactérias gram-negativas MDR difíceis de tratar no hospital, alvejando-se sistemas antioxidantes

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19/151 dependentes de tiol. Os resultados foram provados, adicionalmente, tratando-se com sucesso camundongos com peritonite leve ou aguda causada por E. coli MDR. Sistema redox é um sistema antioxidante universal que é essencial para o organismo vivo, a inibição de sistema redox resultará em estresse oxidante, o que mostra um princípio antibacteriano inovador para testar e usar novos antibióticos.

[022] Em alguns casos, uma composição antibiótica revelada no presente documento elimina bactérias gramnegativas MDR. Em alguns exemplos, a composição antibiótica alveja seletivamente sistemas bacterianos de redox dependente de tiol por meio de efeito bactericida forte de prata e ebselen em combinação sinérgica contra infecções bacterianas GSH-positivas, particularmente em bactérias gram-negativas MDR. Em alguns exemplos, os íons de prata são fortes inibidores tanto de Trx quanto de TrxR de E. coli, e a combinação com ebselen reduz GSH e gera um forte aumento em geração de ROS. Em alguns exemplos, a presença de ebselen melhora a eficácia de prata e, assim, diminui a concentração antibacteriana de prata necessária para elicitar um efeito, com toxicidade seletiva altamente significativa em bactérias sobre células de mamíferos. Essa toxicidade seletiva facilita a aplicação médica sistemática de prata no tratamento de bactérias gram-negativas MDR. Em alguns

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20/151 exemplos, o efeito bactericida sinérgico de Ag⁺ com ebselen, em combinação, é eficiente contra esses patógenos gramnegativos MDR (Tabela 1). Adicionalmente, resultados de experimentos animais indicaram que essa combinação antibiótica pode ser considerada um candidato para ensaios clínicos contra bactérias MDR (Figuras 6A a 6B, Tabela 1). Prata e ebselen, juntos, podem ser considerados uma sonda que alveja funções essenciais nas bactérias. Os resultados experimentais apresentados aqui propuseram mecanismos para o efeito antibacteriano sinérgico de Ag⁺ com ebselen em combinação. Prata e ebselen podem inibir diretamente TrxR de E. coli, e reduzir rapidamente GSH, o que resultou na elevação de produção de ROS para determinar morte celular (sinopse) . Caminhos de redox dependente de tiol regulam várias funções celulares centrais. Assim, Ag⁺ com ebselen, em combinação, podem reagir com grupos SH em GSH e, particularmente Trx e TrxR, e possivelmente diversas outras proteínas, o que indica que o efeito inibidor de Ag⁺ com ebselen, em combinação, pode envolver diversos alvos celulares. Adicionalmente, Ag⁺e ebselen podem alvejar outras moléculas: por exemplo, diguanilato ciclase e antígeno 85 de M. tuberculosis. Isso pode prejudicar o desenvolvimento de resistência a antibiótico em bactérias.

AGENTES ATIVOS [023] É revelada, no presente documento, uma

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21/151 combinação de um agente contendo metal e um agente antimicrobiano. Um agente contendo metal pode compreender um metal ou ion de metal revelado no presente documento. 0 agente contendo metal pode compreender um ion de metal que tem atividade antibiótica, por exemplo, íons de prata, cobre, zinco, mercúrio, estanho, chumbo, bismuto, cádmio, cério, cromo e tálio. íons de metal antimicrobianos de prata, ouro, cobre e zinco, podem ser considerados seguros para uso in vivo e não substancialmente absorvidos no corpo. 0 agente antimicrobiano pode ser um antibiótico, tal como gentamicina, canamicina, geneticina, tetraciclina, um agente sem oragosselênio, ou um agente de organosselênio (por exemplo, ebselen ou um análogo do mesmo), ou qualquer agente antimicrobiano descrito no presente documento. Em alguns exemplos, um agente contendo metal (por exemplo, prata) aprimora os efeitos antibacterianos de um agente de organosselênio (por exemplo, ebselen) ou determinados antibióticos contra bactérias gram-negativas através do alvejamento direto do sistema de tiorredoxina (Trx) bacteriano, do sistema de glutationa (GSH), ou ambos. Em alguns exemplos, alvejar/atacar o sistema de GSH aumenta a eficácia de uma composição antibiótica na eliminação de uma ou mais bactérias. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica pode compreender um agente de prata e um antibiótico revelado no presente documento.

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22/151 [024] Em alguns casos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender um agente contendo metal, seja na forma de um átomo de metal ou um íon de metal não ligado ou ligado a outra molécula por meio de uma ligação covalente ou não covalente (por exemplo, iônica) . Agentes contendo prata podem incluir, porém, sem limitação a compostos covalentes, tais como citrato de di-hidrogênio de prata, sulfadiazina de prata e sais de prata, tal como óxido de prata, carbonato de prata, desoxicolato de prata, salicilato de prata, iodeto de prata, nitrato de prata, paraaminobenzoato de prata, para-aminossalicilato de prata, acetilsalicilato de prata, ácido etilenodiaminatetra-acético de prata (EDTA de Ag), picrato de prata, proteína de prata, citrato de prata, lactato de prata e laurato de prata. Os agentes de prata podem ser compostos covalentes ou, por exemplo, sais de prata, ions de complexo de prata, prata coloidal, partículas de prata/zeólito, prata/fosfato, prata/vidro compósitas (antimicrobianas, de liberação controlada), ou qualquer mistura dos mesmos. Em alguns exemplos, sais de prata são cloreto de prata, nitrato de prata, acetato de prata, benzoato de prata, bromato de prata, clorato de prata, lactato de prata, molibdato de prata, nitrito de prata, óxido de prata (I), perclorato de prata, permanganate de prata, selenato de prata, selenito de prata, sulfadiazina de prata, sulfato de prata e misturas dos

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23/151 mesmos. Em alguns exemplos, ions de complexo de prata são ions de complexo de cloro de prata, ions de complexo de tiossulfato de prata, ou misturas dos mesmos. Em alguns exemplos, partículas de prata coloidal são nanopartícuias de prata.

[025] Em alguns exemplos, o agente contendo metal pode compreender um sal de metal. O sal de metal pode ser um sal de prata, como nitrato de prata, acetato de prata, benzoato de prata, carbonato de prata, iodato de prata, iodeto de prata, lactato de prata, laurato de prata, óxido de prata, palmitato de prata, proteína de prata ou sulfadiazina de prata. O agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de cobre, tal como nitrato de cobre (II), sulfato de cobre, perclorato de cobre, acetato de cobre, potássio de cobre de tetraciano. O agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de zinco, tal como nitrato de zinco (II), sulfato de zinco, perclorato de zinco, acetato de zinco e tiocianato de zinco; tal fonte de íon de mercúrio, como perclorato de mercúrio, nitrato de mercúrio e acetato de mercúrio. O agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de estanho, tal como sulfato de estanho. O agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de chumbo, tal como sulfato de chumbo e nitrato de chumbo. O agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de bismuto, tal como cloreto de bismuto e iodeto de

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24/151 bismuto. 0 agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de cádmio, tal como perclorato de cádmio, sulfato de cádmio, nitrato de cádmio e acetato de cádmio. 0 agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de cromo, tal como perclorato de cromo, sulfato de cromo, sulfato de amônia e cromo e acetato de cromo. 0 agente contendo metal pode compreender uma fonte de íon de tálio, tal como fonte de íon de tálio, como perclorato de tálio, sulfato de tálio, nitrato de tálio ou acetato de tálio. A prata pode ser fornecida em uma forma solúvel ou insolúvel, tal como cloreto de prata, absorvida em um suporte ou partículas selecionadas dentre o grupo que consiste em óxido de titânio, óxido de magnésio, óxido de alumínio, óxido de silício, óxido de cálcio, óxido de bário, hidroxiapatita de cálcio, giz, carbonatos de cálcio moídos ou precipitados naturais, carbonatos de magnésio de cálcio, silicatos, silicatos em folha, zeólitos, argilas, bentonitas e óxido de titânio. Prata insolúvel em um material de apoio pode ser útil para aplicação tópica. A composição revelada no presente documento também pode incluir uma quantidade eficaz de um dispersante, tal como polinaftalenossulfonato, naftalenossulfonato ou alquilsulfossuccinato.

[026] Em alguns exemplos, a concentração inibidora mínima (MIC) para uma ou mais bactérias para um metal antibiótico (por exemplo, prata) contido em uma composição

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25/151 antibiótica revelada no presente documento pode ser menor que cerca de: 50 μΜ, 25 μΜ, 20 μΜ, 10 μΜ, 5 μΜ, 1 μΜ, 0,5 μΜ, 0,1 μΜ, 50 ηΜ, 25 ηΜ, 20 ηΜ, 10 nM, 5 nM ou 1 ηΜ.

[027] Agentes de organosselênio são compostos químicos que contêm ligações químicas de carbono para selênio. Selênio pode existir com o estado de oxidação -2, +2, +4, +6, por exemplo, Se (II). Agentes de organosselênio

incluem,

porém, sem limitação a selenóis, disselenetos,

haletos de selenila, selenetos (seleno-éteres), selenóxidos, selenonas, ácidos selenênicos, ácidos selenínicos, ácidos perselenínicos, selenuranos, seleniranos, selonas (por

exemplo,

seleno-ureia), selenocisteína, selenometionina,

difenildisseleneto, benzenosselenol. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender composto de

selenazol

ou isosselenazol, por exemplo, um composto de

benzoisosselenazol-3(2H)-ona, por exemplo, ebselen (Nome

químico:

2-fenil-l,2-benzisosselenazol-3 (2H)-ona, Nome da

IUPAC: 2-fenil-l,2-benzosselenazol-3-ona) , disseleneto de

ebselen,	ou um análogo estrutural, tais como aqueles
revelados	no presente documento.
[028]	Em alguns exemplos, o agente de

organosselênio pode compreender um composto representado pela seguinte Fórmula geral (I) ou (!') :

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(CIIjV—IV

(!’) em que R¹ e

R² representam independentemente, um átomo de hidrogênio um átomo de halogênio um grupo trifluorometila e semelhantes;

r3 representa um grupo arila um grupo heterociclico aromático e semelhantes; R⁴ representa um átomo de hidrogênio, um grupo hidroxila, um grupo —S-αaminoácido e semelhantes; R⁵ representa um átomo de hidrogênio ou um grupo Ci-Cs alquila; Y representa átomo de oxigênio ou átomo de enxofre; n representa um número inteiro de 0 a 5; e o átomo de selênio pode ser oxidado, cujo exemplo inclui 2-fenil-l,2-benzisosselenazol-3(2H)-ona ou uma forma de anel aberto da mesma. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um composto selecionado dentre o grupo que consiste em 2-fenil-l,2-benzisoselenazol-3(2H)-ona ou uma forma de anel aberto da mesma e

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27/151 um sal fisiologicamente aceitável da mesma. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender uma substância selecionada dentre o grupo que consiste em 2fenil-1,2-benziso-selenazol-3(2H)-ona ou uma forma de anel aberto da mesma e um sal fisiologicamente aceitável da mesma. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender uma substância selecionada dentre o grupo que consiste em 2-fenil-l,2-benziso-selenazol-3(2H)-ona ou uma forma de anel aberto da mesma e um sal f isiologicamente aceitável da mesma.

[029] Como o grupo Ci-Cs alquila representado por R¹e R², um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada pode ser usado, e exemplos incluem grupo metila, grupo etila, grupo n-propila, grupo isopropila, grupo ciclopropila, grupo n-butila, grupo sec-butila, grupo isobutila, grupo tercbutila, grupo n-pentila e grupo n-hexila. Como o grupo Ci-Cs alcoxila representado por R¹ e R², um grupo alcoxila de cadeia linear ou ramificada pode ser usado, e exemplos incluem grupo metóxi, grupo etóxi, grupo n-propóxi, grupo isopropóxi, grupo n-butóxi, grupo sec-butóxi, grupo terc-butóxi, grupo n-pentóxi e grupo n-hexóxi.

[030] Como o grupo arila representado por R³, por exemplo, um grupo arila monocíclico a um tricíclico, preferencialmente um monocíclico ou um bicíclico que tem de 6 a 14 átomos de carbono, preferencialmente de 6 a 10 átomos

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28/151 de carbono pode ser usado. Mais especificamente, grupo fenila ou grupo naftila e semelhantes, são preferenciais. Como o grupo heterociclico aromático representado por R³, por exemplo, um grupo heterociclico aromático monociclico a um triciclico, preferencialmente um monociclico ou um biciclico que contém um ou mais heteroátomos, tais como átomo de nitrogênio, átomo de oxigênio e átomo de enxofre, pode ser usado. Quando dois ou mais heteroátomos estão contidos, os mesmos podem ser iguais ou diferentes. Exemplos incluem grupo tienila, grupo furila, grupo pirrolila, grupo imidazolila, grupo pirazolila, grupo isoxazolila, grupo piridila, grupo pirazinila, grupo pirimidinila, grupo piridazinila, grupo indolizinila, grupo isoindolila, grupo indolila, grupo isoquinolila, grupo quinolila, grupo ftalazinila, grupo naftilidinila, grupo quinoxalinila, grupo quinazolinila, grupo cinolinila, grupo pteridinila, grupo carbazolila, grupo acridinila, grupo fenantridinila e grupo fenotiazinila.

[031] O grupo arila, o grupo heterociclico aromático, o grupo cicloalquila com 5 a 7 membros, ou o grupo cicloalquenila com 5 a 7 membros representado por R³ pode ter um ou mais substituintes no anel. Quando o anel é substituído por dois ou mais substituintes, os mesmos podem ser iguais ou diferentes. A posição do substituinte não é particularmente limitada, e o substituinte pode estar

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29/151 presente em qualquer posição no anel. 0 tipo do substituinte não é particularmente limitado, e exemplos incluem um grupo Ci-Cs alquila, um grupo C2-C6 alquenila, um grupo C2-C6 alquinila, um grupo Cg-Ci4 arila, um grupo heterocíclico (o heterociclo usado no presente documento inclui grupos heterocíclicos aromáticos e grupos heterocíclicos parcialmente saturados ou saturados), um átomo de halogênio (o átomo de halogênio usado no presente documento pode ser qualquer um dentre átomo de flúor, átomo de cloro, átomo de bromo, ou átomo de iodo), grupo hidroxila, grupo oxo, grupo amino, grupo amônia, grupo imino, grupo mercapto, grupo tioxo, grupo ciano, grupo nitro, grupo carboxila, grupo fosfato, grupo sulfo, grupo hidrazino, um grupo Ci-Cs ureido, um grupo Ci-Cs imido, grupo isotiocianato, grupo isocianato, um grupo Ci-Cs alcoxila, um grupo Ci-Cs alquiltio, um grupo Cg-Ci4 ariloxi, um grupo heterocíclic-óxi, um grupo Cg-Ci4 ariltio, um grupo heterocíclic-tio, um grupo C7-C15 aralquila, um grupo heterociclo-alquila, um grupo C7-C15 aralquilóxi, um grupo heterocíclic-alquiloxi, um grupo Ci-Cs alcoxicarbonila, um grupo Cg-Ci4 ariloxicarbonila, um grupo heterocíclicoxicarbonila, um grupo C2- C7 alquilcarbonila, um grupo Ce~ C14 arilcarbonila, um grupo heterocíclic-carbonila, um grupo C2-C7 alquilcarbonilóxi, um grupo Cg-Ci4 arilcarbonilóxi, um oxigrupo heterocíclic-carbonila, um grupo C2-C8 alquilcarbonilamino, um grupo Ci-Cs sulfonila, um grupo Ci-Cs

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30/151 sulfinila, um grupo Ci-Cs sulfonilamino, um grupo Ci-Cs carbamoila e um grupo C2-C6 sulfamoila.

[032] Os substituintes exemplificados acima podem ser adicionalmente substituídos por um ou mais outros substituintes. Exemplos de tais substituintes incluem um grupo hidroxi-Ci-Cs alquila, um grupo Ci-Cs alquila halogenado, um grupo mono ou di-Ci-Cs alquilamino, um grupo Ci-Cs alquilcarbonila halogenado, um grupo Cg-Ci4 arila halogenado, um grupo hidroxi-Cs-Ci4 arila e um grupo mono ou di-Ci-Cs alquilcarbamoíla. No entanto, os substituintes explicados acima são citados apenas para exemplificação, e os substituintes usados não se limitam a esses exemplos.

[033] Embora o tipo do grupo -S-a-aminoácido representado por R⁴ não seja particularmente limitado, o grupo pode ser, preferencialmente, um resíduo de aminoácido que contém grupo tiol. O resíduo de -S-a-aminoácido pode ser um resíduo de um aminoácido que constitui uma proteína ou um composto peptídico. O tipo de proteínas ou compostos peptídicos não é particularmente limitado desde que o mesmo seja fisiologicamente aceitável. Por exemplo, proteína sérica, tal como albumina e globulina pode ser, preferencialmente, usada. Dentre as proteínas séricas, albumina é mais preferencial, e albumina humana é particularmente preferencial. Exemplos do grupo aralquila representados por R⁴ cuja porção química de arila pode ser

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31/151 opcionalmente substituída por um ou mais substituintes incluem grupo benzila, grupo para-hidroxibenzila e grupo 2,4-di-hidrobenzila. R⁴ e R⁵ podem combinar juntos para representar uma única ligação, e nesse caso, um anel de 5 membros é formado, o qual contém o átomo de nitrogênio ligado a R⁵ e o átomo de selênio. Como o grupo Ci-Cs alquila representado por R⁵, aqueles exemplificados acima podem ser usados.

[034] Sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos representados pela Fórmula geral (I) ou (I') mencionada acima podem ser usados. O sal fisiologicamente aceitável pode ser adequadamente escolhido pela pessoa versada na técnica. Hidratos dos compostos como forma livre ou sais fisiologicamente aceitáveis também podem ser usados. Quando o composto representado pela Fórmula geral (I) ou (!') mencionada acima tem um ou mais átomos de carbono assimétricos, estereoisômeros, tais como isômeros ópticos e diaestereoisômeros, qualquer mistura dos estereoisômeros, racematos e semelhantes podem ser usados.

[035] Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um ebselen ou um análogo do mesmo, tal como um composto que tem uma Fórmula de:

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ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que X é selênio ou enxofre, e em que R é selecionado dentre o grupo que consiste em:

H, alquila que tem uma cadeia de carbono de 1 a 14 átomos de carbono, em que a cadeia de carbono é ramificada ou não ramificada, que é opcionalmente substituída por benzisosselenazol-3(2H)-ona-2-ila, benzisotiazol-3(2H)-ona2-ila, OH, alcoxila, SH, NH2, N-alquilamino, N,Ndialquilamino, COOH, arila que é opcionalmente substituída por C1-C5 alquila, OH, alcoxila, SH, NH2, N-alquilamino, N ,N-dialquilamino, COOH, OHO, NO2, F, 01, Br, I e heteroarila que é opcionalmente substituída por C1-C5 alquila, OH, alcoxila, SH, NH2, N-alquilamino, N,N-dialquilamino, COOH, OHO, NO2, F, 01, Br e I, arila que é opcionalmente substituída por C1-C5 alquila, OH, alcoxila, SH, NH2, N-alquilamino, N,Ndialquilamino, COOH, OHO, NO2, F, 01, Br e I, heteroarila que é opcionalmente substituída por C1-C5 alquila, OH, alcoxila, SH, NH2, N-alquilamino, N,N-dialquilamino, COOH, OHO, NO2, F, 01, Br e I, e em que A representa uma cadeia de carbono saturada, insaturada ou poli-insaturada com 3 a 6

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33/151 membros, em que N pode opcionalmente substituir um ou mais carbonos, e que é opcionalmente substituído por um ou mais dentre OR, SR e alquilamino, C1-C5 alquila, OH, alcoxila, SH, NH2, .N-alquilamino, N, N-dialquilamino, COOH, OHO, NO2, F, 01, Br e I.

[036] Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um ebselen que tem uma estrutura química de:

O (EbSe 1) . Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um análogo estrutural de ebselen, tal como de classes de disseleneto de benzisosselenazol-3(2H)-onas, bisbenzisosselenazol-3 (2H)onas, 7-azabenzisosselenazol-3(2H)-ona, selenamida e bis (2carbamoil)fenila substituídos por benzisosselenazol-3(2H)ona-arila, -alquila, 2-piridila ou 4-piridila, por exemplo, que têm uma estrutura química abaixo.

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EbSe 8

EbSe 9

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35/151

EbSe 12

EbSe 13

EbSe 14

EbSe15

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[037] Em alguns exemplos, a concentração inibidora mínima (MIC) para uma ou mais bactérias para um agente de organosselênio (por exemplo, ebselen) contido em uma composição antibiótica revelada no presente documento pode

ser	menor	gue	cerca de:	100	μΜ, 90	μΜ, 8 0	μΜ, 70 μΜ, 60	μΜ,
50	μΜ,	40	μΜ,	30 μΜ, 25	μΜ,	2 0 μΜ,	15 μΜ,	10 μΜ, 5 μΜ, 1	μΜ,
0,5	μΜ	ou	0,1	μΜ.
	[	038]		Métodos	e	composições	apresentados	no

presente documento podem utilizar um agente ativo em uma base livre, sal, hidrato, polimorfo, isômero, diaestereoisômero, pró-fármaco, metabolite, complexo de par de íons ou forma de guelato. Um agente ativo pode ser formado com o uso de um ácido ou base não tóxica farmaceuticamente aceitável, gue inclui ácido ou base inorgânica, ou um ácido ou base orgânica. Em alguns exemplos, um agente ativo gue pode ser utilizado em combinação com os métodos e composições

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37/151 apresentados no presente documento pode ser um sal farmaceuticamente aceitável derivado de ácidos que incluem, porém, sem limitação aos seguintes: ácido acético, algínico, antranílico, benzenossulfônico, benzoico, canfossulfônico, cítrico, etenossulfônico, fórmico, fumárico, furóico, galacturônico, glucônico, glucurônico, glutâmico, glicólico, bromídrico, clorídrico, isetiônico, lático, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, nítrico, pamóico, pantotênico, fenilacético, fosfórico, propiônico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, sulfúrico, tartárico ou p-toluenossulfônico. Em alguns exemplos, o agente ativo pode ser um sal de ácido metanossulfônico.

[039] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender, adicionalmente, ou pode ser coadministrada com um ou mais fármacos antibacterianos/antimicrobianos, por exemplo, amicacina, azitromicina, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cloranfenicol, ciprofloxacina, clindamicina, colistina, domeclociclina, doxiciclina, eritromicina, gentamicina, mafenida, metaciclina, minociclina, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, oxitetraciclina, polimixina B, pirimetamina, sulfacetamida, sulfisoxazol, tetraciclina, tobramicina, trimetoprima ou qualquer combinação dos mesmos.

[040] Em alguns exemplos, uma composição

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38/151 antibiótica revelada no presente documento pode compreender, adicionalmente, ou pode ser coadministrada com fármaco (ou fármacos) antibacteriano de oxazolidinona, e/ou um ou mais fármacos selecionados dentre acebutolol, aceclidina, ácido acetilsalicilico, acetilsulfisoxazol N4, alclofenac, alprenolol, anfenac, amilorida, ácido aminocapróico, aminoclonidina, aminozolamida, anisindiona, apafante, atenolol, bacitracina, benoxaprofeno, benoxinato, benzofenac, bepafante, betametasona, betaxolol, betanocol, brimonidina, bronfenac, bromexina, ácido bucloxico, bupivacaina, butibufeno, carbacol, carprofeno, celecoxibe, cefalexina, cloranfenicol, clordiazepóxido, clorprocaina, clorpropamida, clortetraciclina, cicloprofeno, cinmetacina, ciprofloxacina, clidanac, clindamicina, clonidina, clonixina, clopirac, cocaina, cromolina, ciclopentolato, cipro-heptadina, demecário, dexametasona, dibucaina, diclofenac, diflusinal, dipivefrina, dorzolamida, enoxacina, epinefrina, eritromicina, eserina, estradiol, ácido etacrinico, etidocaina, etodolac, fenbufeno, fenclofenac, fenclorac, fenoprofeno, fentiazac, ácido flufenâmico, flufenisal, flunoxaprofeno, fluorocinolona, fluorometolona, flurbiprofeno e ésteres dos mesmos, propionato de fluticasona, furaprofeno, furobufeno, furofenac, furosemida, ganciclovir, gentamicina, gramicidina, hexilcaina, homatropina, hidrocortisona, ibufenac, ibuprofeno e ésteres

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39/151 dos mesmos, idoxuridina, indometacina, indoprofeno, interferons, isobutilmetilxantina, isofluorofato, isoproterenol, isoxepac, cetoprofeno, cetorolac, labetolol, lactorolac, latanoprosta, levo-bunolol, lidocaina, lonazolac, loteprednol, meclofenamato, medrisona, ácido mefenâmico, mepivacaina, metaproterenol, metanamina, metilprednisolona, metiazinico, metoprolol, metronidazol, minopafante, miroprofeno, MK-663, modipafante, nabumetomo, nadolol, namoxirato, nafazolina, naproxeno e ésteres dos mesmos, neomicina, nepafenac, nitroglicerina, norepinefrina, norfloxacina, nupafante, olfloxacina, olopatadina, oxaprozina, oxepinac, oxifenbutazona, oxiprenolol, oxitetraciclina, parecoxibe, penicilina, perfloxacina, fenacetina, fenazopiridina, feniramina, fenilbutazona, fenilefrina, fenilpropanolamina, fosfolina, pilocarpina, pindolol, pirazolac, piroxicam, pirprofeno, polimixina, polimixina B, prednisolona, prilocaina, sondanecida, procaina, proparacaina, ácido protizinico, rimexolona, rofecoxibe, salbutamol, escopolamina, sotalol, sulfacetamida, ácido sulfanilico, sulindac, suprofeno, tenoxicam, terbutalina, tetracaina, tetraciclina, teofilamina, timolol, tobramicina, tolmetina, triancinolona, trimetoprima, trospectomicina, valdecoxibe, vancomicina, vidarabina, vitamina A, varfarina, zomepirac e sals farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

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40/151

FORMULAÇÕES [041] Em alguns casos, a presente revelação fornece uma composição antibiótica, em que a composição antibiótica compreende: um agente contendo prata; e um agente de organosselênio. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender um íon de prata. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender nitrato de prata. Em alguns exemplos, o agente contendo prata pode compreender citrato de di-hidrogênio de prata. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um composto de selenazol. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um composto de benzoisosselenazol-3(2H)ona. Em alguns exemplos, o agente de organosselênio pode compreender um ebselen. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode estar em uma forma de dosagem de liquido. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser em uma forma de dosagem de uma solução ou uma suspensão. Em alguns exemplos, uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica pode ser de cerca de 0,5 a 50 μΜ, cerca de 1 a 25 μΜ, ou cerca de 1 a 10 μΜ. Em alguns exemplos, uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica pode ser de cerca de 5 μΜ. Em alguns exemplos, uma concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica pode ser de cerca de 4 a 25 μΜ, cerca de 30 a 200 μΜ, cerca de 30 a 150 μΜ, ou cerca de 30 a 100 μΜ. Em

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41/151 alguns exemplos, uma concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica pode ser de cerca de 40 μΜ ou cerca de 80 μΜ. Em alguns exemplos, o agente contendo prata e o agente de organosselênio podem estar a uma razão molar de cerca de 1:2 a cerca de 1:20. Em alguns exemplos, o agente contendo prata e o agente de organosselênio podem estar a uma razão molar de cerca de 1:4, 1:8 ou 1:16. Em alguns exemplos, a composição antibiótica exibe um valor de ICso de cerca de 10 a 100 nM para uma ou mais bactérias gram-negativas ou bactérias grampositivas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica exibe um valor de ICso de cerca de 50 nM ou menor para uma ou mais bactérias gram-negativas ou bactérias grampositivas. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias gramnegativas podem compreender K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender AgNCç e ebselen. Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode estar em uma forma de dosagem liquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 4 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem liquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 20 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem liquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de

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AgNOs e 40 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem liquida. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode compreender 5 μΜ de AgNCç e 8 0 μΜ de ebselen em uma forma de dosagem liquida.

[042] Em alguns casos, a presente revelação fornece uma formulação farmacêutica que pode compreender a composição antibiótica revelada no presente documento. Em alguns exemplos, a formulação farmacêutica pode compreender, adicionalmente, um excipiente revelado no presente documento.

[043] Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para preparar uma composição antibiótica, que compreende misturar um agente contendo prata e um agente de organosselênio. Em alguns exemplos, a mistura pode ser conduzida em um liquido revelado no presente documento, por exemplo, uma suspensão, um coloide, ou uma solução. Em alguns exemplos, o liquido compreende um ou mais agentes ativos ou excipientes revelados no presente documento. Em alguns exemplos, a mistura pode compreender adicionar o agente contendo prata em um liquido que pode compreender o agente de organosselênio. Em alguns exemplos, a mistura pode compreender adicionar o agente de organosselênio em um liquido que pode compreender o agente contendo prata.

[044] Em alguns exemplos, um agente ativo revelado no presente documento pode estar presente em cerca de: 0,01

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43/151 a 0,1, 0,1 a 1, 1 a 10, 1 a 20, 5 a 30, 5 a 40, 5 a 50, 10 a 20, 10 a 25, 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 15 a 20, 15 a 25, 15 a 30, 15 a 40, 15 a 50, 20 a 30, 20 a 40, 20 a 50, 20 a

100, 30 a	40, 30 a 50, 30 a 60, 30 a 70, 30 a 80, 30 a 90,
30 a 100,	40 a 50, 40 a 60, 40 a 70, 40 a 80, 40 a 90, 40 a
100, 50 a	60, 50 a 70, 50 a 80, 50 a 90, 50 a 100, 50 a 150,
50 a 200,	50 a 300, 100 a 300, 100 a 400, 100 a 500, 1, 2,
3, 4, 5,	6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
100, 150,	200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750,	800, 850, 900, 950 ou 1.000 μΜ, ou qualquer

combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, um agente ativo revelado no presente documento pode estar presente em cerca de: 1 mg a 2,5 mg, 2,5 a 25 mg, 2,5 a 30 mg, 5 a 20 mg, 5 a 15 mg, 5 a 10 mg, 10 a 15 mg, 10 a 2 0 mg, 10 a 2 5 mg, 11,5 a 13 mg, 5 mg, 5,5 mg, 6 mg, 6,5 mg, 7 mg, 7,5 mg, 8 mg, 8,5 mg, 9 mg, 9,5 mg, 10 mg, 10,5 mg, 11 mg, 11,5 mg, 12 mg,

12,5 mg, 13 mg, 13,5 mg, 14 mg, 14,5 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, ou 20 mg. Em alguns exemplos, um agente ativo revelado no presente documento pode estar presente em

cerca de:	5 a 50 mg, 5 a 40 mg, 5 a 30 mg, 10 a 25 mg, 15 a
2 0 mg, 10	mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17
mg, 18 mg,	, 19 mg, 2 0 mg, 21 mg, 2 2 mg, 2 3 mg, 2 4 mg, 2 5 mg,
30 mg, 35	mg, 40 mg, 45 mg, ou 50 mg, ou qualquer combinação

dos mesmos. Em alguns exemplos, dois agentes ativos estão presentes em uma razão molar ou de peso em peso de cerca de:

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1:10 a 1:30, 1:20 a 1:30, 1:10 a 1:20, 1:1 a 1:15, ou 1:1 a

1:0, 1:1 a 1:5, 1:1 a 1:4, 1:1 a 1:3, ou 1:1 a 1:2. Em alguns

exemplos, dois agentes ativos estão	presentes em uma	razão
molar	ou de	peso em peso de cerca de:	1:30, 1:29,	1:28,	1:27,
1:26,	1:25,	1:24, 1:23, 1:22, 1:21,	1:20, 1:19,	1:18,	1:17,
1:16,	1:15,	1:14, 1:13, 1:12, 1:11	, 1:10, 1:9	, 1:8,	1:7,
1: 6,	1:5, 1	:4, 1:3, 1:2, ou 1:1.
	[045]	Em alguns casos, uma	composição	antibiótica

pode compreender múltiplos agentes ativos administrados em pelo menos cerca de 0,001 mg, por exemplo, pelo menos cerca de: 0,01 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0.3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3 mg,

3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg, 5 mg, 5,5 mg, 6 mg, 6,5 mg, 7 mg, 7,5 mg, 8 mg, 8,5 mg, 9 mg, 9,5 mg, ou 10 mg, por kg de peso corporal de um indivíduo que necessita do mesmo. A composição em pó pode compreender uma dose total de um agente ativo administrado em cerca de 0,1 a cerca de 10,0 mg, por exemplo,

cerca

de

0,1

a

10,0

mg,

cerca de

0,1

a 9,

. 0

mg,

cerca

de

0,1

a 8,0

mg,

cerca

de 0

, 1 a

7,0 mg, cerca de

0,

1 a

6, 0

mg,

cerca

de 0,

1 a

5, 0

mg

, cerca

de 0,1 a

4,0

mg,

cerca

de

0,1

a

3, 0

mg, cerca

de

0,

1 a

2,0

mg, cerca

de

0, 1

a

1,0

mg,

cerca

de

0,1a

0,5

mg,

cerca

de C

), 2 a 10,0

mg,

cerca

de

0,2

a 9

, o

mg,

cerca

de

0,2

a

8,0

mg,

cerca de

0,2

a 7,

0

mg,

cerca

de

0,2

a 6, 0

mg,

cerca

de 0

, 2 a

5,0 mg, cerca de

0,

2 a

4,0

mg,

cerca

de 0,

2 a

3, 0

mg

, cerca

de 0,2 a

2,0

mg,

cerca

de

0,2

a

1,0

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mg, cerca	de	0,2 a 0,5	mg, cerca de	0,5	a :	10,0	mg,	cerca	de
0,5 a 9,0	mg,	cerca de	0,5 a 8,0 mg,	cerca	de	0,5	a 7, 0	mg,
cerca de	0,5	a 6,0 mg,	cerca de 0,5	a 5	, o	mg,	cerca de	0,5
a 4,0 mg,	cerca de 0,5	a 3,0 mg, cerca de	o,	5 a	2,0	mg, cerca
de 0,5 a	1,0	mg, cerca	de 1,0 a 10,0	mg,	cerca	de	1,0 a	5, 0
mg, cerca	de	1,0 a 4,0	mg, cerca de	1, 0	a	3, 0	mg,	cerca	de
1,0 a 2,0	mg,	cerca de	2,0 a 10,0 mg,	cerca	de	2,0	a 9, 0	mg,
cerca de	2,0	a 8,0 mg,	cerca de 2,0	a 7	, o	mg,	cerca de	2,0
a 6,0 mg,	cerca de 2,0	a 5,0 mg, cerca de	2,	0 a	4,0	mg, cerca
de 2,0 a	3, 0	mg, cerca	de 5,0 a 10,0	mg,	cerca	de	5,0 a	9, 0
mg, cerca	de	5,0 a 8,0	mg, cerca de	5, 0	a	7,0	mg,	cerca	de
5,0 a 6,0	mg,	cerca de	6,0 a 10,0 mg,	cerca	de	6, 0	a 9, 0	mg,
cerca de	6, 0	a 8,0 mg,	cerca de 6,0	a 7	, o	mg,	cerca de	7,0
a 10,0 mç	j, cerca de 7	, 0 a 9,0 mg,	cerca	de Ί	', 0	a 8,0	mg,

cerca de 8,0 a 10,0 mg, cerca de 8,0 a 9,0 mg, ou cerca de 9,0 a 10,0 mg, por kg de peso corporal de um indivíduo gue necessita do mesmo.

[046]

Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode compreender dois ou mais agentes ativos (por exemplo, um composto de metal, ebselen ou um derivado dos mesmos), cada um desses pode estar, independentemente, presente em uma dose de cerca de: 1 a 10 mg, 2,5 a 3 0 mg, 2,5 a 20 mg, 1 a 2 0 mg, 1 a 3 0 mg, 5 a 3 0 mg, a 4 0 mg, 2 0 a 5 0 mg, 3 0 a 6 0 mg, 4 0 a 7 0 mg, 5 0 a 8 0 mg, a 90 mg, ou 1 a 100 mg, gue inclui porém, sem

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46/151 limitação a cerca de: 1,0 mg, 1,5 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg, 7,5 mg, 8,0 mg, 8,5 mg, 9,0 mg, 9,5 mg, 10,0, 10,5 mg, 11,0 mg, 12,0 mg, 12,5 mg, 13,0 mg, 13,5 mg, 14,0 mg, 14,5 mg, 15,0 mg, 15,5 mg, 16 mg,

16.5 mg, 17 mg, 17,5 mg, 18 mg, 18,5 mg, 19 mg, 19,5 mg, 2 0 mg, 2 0,5 mg, 21 mg, 21,5 mg, 2 2 mg, 22,5 mg, 2 3 mg, 23,5 mg, 2 4 mg, 2 4,5 mg, 2 5 mg, 25,5 mg, 2 6 mg, 26,5 mg, 2 7 mg, 27,5 mg, 2 8 mg, 2 8,5 mg, 2 9 mg, 29,5 mg, 3 0 mg, 30,5 mg, 31 mg,

31.5 mg, 3 2 mg, 32,5 mg, 3 3 mg, 33,5 mg, 3 6 mg, 36,5 mg, 3 7 mg, 37,5 mg, 3 8 mg, 38,5 mg, 3 9 mg, 39,5 mg, 4 0 mg, 40,5 mg, 41 mg, 41,5 mg, 4 2 mg, 42,5 mg, 4 3 mg, 43,5 mg, 4 4 mg, 44,5 mg, 4 5 mg, 4 5,5 mg, 4 6 mg, 46,5 mg, 4 7 mg, 47,5 mg, 4 8 mg, 4 8,5 mg, 4 9 mg, 49,5 mg, 5 0 mg, 5 5 mg, 6 0 mg, 6 5 mg, 7 0 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, ou 100 mg.

EXCIPIENTES [047] Em alguns exemplos, a composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender, adicionalmente, um ou mais excipientes, por exemplo, substância diferente, ou substância igual, porém, de tamanhos diferentes. Em alguns exemplos, o excipiente pode compreender um carreador, por exemplo, polissacarideo ou oligossacarídeo insolúvel em água. Em alguns exemplos, o carreador pode ser selecionado dentre um grupo que consiste em acetato de celulose, butirato de acetato de celulose, propionate de acetato de celulose, ftalato de acetato de

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47/151 celulose, quitosana, β-ciclodextrina, etilcelulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), celulose microcristalina, amido e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o excipiente pode compreender um agente espessante, por exemplo, um polissacarideo solúvel em água. Em alguns exemplos, o agente espessante pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), acácia, ácido algínico, dióxido de silicone coloidal, cálcio de carboximetilcelulose, gelatina, hidroxipropilcelulose, hidroxilpropilcelulose (hipromelose), metilcelulose, sacarose, alginato de sódio, carboximetilcelulose de sódio e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o excipiente pode compreender um primeiro excipiente (qualquer excipiente revelado no presente documento) e um segundo excipiente (qualquer excipiente revelado no presente documento). Em alguns exemplos, o excipiente pode compreender um carreador (por exemplo, celulose microcristalina) e um agente espessante (por exemplo, HPMC).

[048] Em alguns exemplos, a composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender, adicionalmente, um ou mais excipientes farmacêuticos, por exemplo, ácido ascórbico, di-hidrato de EDTA, glicerina, mono-hidrato de ácido cítrico, di-hidrato de citrato de sódio, benzoato de sódio, propionato de sódio, 70% de solução

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48/151 de sorbitol, sucralose, amarelo 6 da FD&C, sabor artificial de laranja, sabor artificial de hortelã, água purificada, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o um ou mais excipientes farmacêuticos compreendem ácido ascórbico, di-hidrato de EDTA, glicerina, mono-hidrato ácido cítrico, di-hidrato de citrato de sódio, propilparabeno, metilparabeno, propilenoglicol, solução de 70% de sorbitol, sucralose, amarelo 6 da FD&C, sabor artificial de laranja, sabor artificial de hortelã, água purificada, ou qualquer combinação dos mesmos.

[049] Conservantes adequados incluem de maneira não restritiva substâncias contendo mercúrio, tais como sais fenilmercúricos (por exemplo, acetato fenilmercúrico, borato e nitrato) e timerosal; dióxido de cloro estabilizado; compostos de amônia quaternária, tais como cloreto de benzalcônio, brometo de cetiltrimetilamônia e cloreto de cetilpiridínio; ureia de imidazolidinila; parabenos, tais como metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno e butilparabeno, e sais dos mesmos; fenoxietanol; clorofenoxietanol; fenoxipropanol; clorobutanol ;

clorocresol;	álcool feniletílico;	EDTA	dissódico;	e	ácido
sórbico e sais dos mesmos.
[050]	Um ou mais agentes	de	ajuste de	pH	e/ou

agentes tamponantes aceitáveis podem ser incluídos em uma composição revelada no presente documento, que inclui

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49/151 ácidos, tais como ácidos acético, bórico, citrico, lático, fosfórico e clorídrico; bases, tais como hidróxido de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, citrato de sódio, acetato de sódio, lactato de sódio e tris-hidroximetilaminometano; e tampões, tais como citrato/dextrose, bicarbonate de sódio e cloreto de amônia. Tais ácidos, bases e tampões são incluídos em uma quantidade necessária para manter o pH da composição em uma faixa farmaceuticamente aceitável.

[051] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender um agente de ajuste de pH. Em alguns exemplos, o agente de ajuste de pH pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em ácido ascórbico, ascorbato de sódio, ácido tartárico, tartrato de sódio, tartrato de potássio, tartrato de cálcio, tartrato de litio, ácido citrico, citrato de sódio, citrato de potássio, citrato de cálcio, citrato de litio, ácido fosfórico, di-hidrogenfosfato de sódio, mono-hidrogenfosfato de sódio, fosfato de litio, fosfato de potássio, fosfato de cálcio, carbonato de sódio, hidrogencarbonato de sódio, ácido lático, lactato de sódio, lactato de potássio, lactato de cálcio, ácido acético, acetato de sódio, acetato de potássio, acetato de cálcio, ácido propiônico, ácido sulfúrico, sulfato de sódio, sulfato de potássio, ácido bórico, borato de sódio, ácido maleico, maleato de litio, maleato de sódio, maleato de potássio, maleato de cálcio,

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50/151 ácido succinico, succinato de litio, succinato de sódio, succinato de potássio, succinato de cálcio, ácido fumárico, ácido glutâmico, ácido fórmico, ácido málico, ácido clorídrico, ácido nitrico, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, trietanolamina, di-isopropanolamina, solução de amônia, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina meglumina, citrato de sódio, bicarbonate de sódio, bicarbonate de potássio e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, um agente de ajuste de pH revelado no presente documento pode ser ácido acético; ácido adipico; sulfato de alumínio e amônia; bicarbonate de amônia; carbonato de amônia; citrato de amônia, dibásico; citrato de amônia, monobásico; hidróxido de amônia; fosfato de amônia, dibásico; fosfato de amônia, monobásico; acetato de cálcio; pirofosfato de ácido cálcico; carbonato de cálcio; cloreto de cálcio; citrato de cálcio; fumarato de cálcio; gluconato de cálcio; hidróxido de cálcio; lactato de cálcio; óxido de cálcio; fosfato de cálcio, dibásico; fosfato de cálcio, monobásico; fosfato de cálcio, tribásico; sulfato de cálcio; dióxido de carbono; ácido citrico; creme de tártaro; ácido fumárico; ácido glucônico; glucono-delta-lactona; ácido clorídrico; ácido lático; carbonato de magnésio; citrato de magnésio; fumarato de magnésio; hidróxido de magnésio; óxido de magnésio; fosfato de magnésio; sulfato de magnésio; ácido málico; sulfato de manganês; ácido metatartárico; ácido

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51/151 fosfórico; tartrato de ácido potássico; sulfato de alumínio e potássio; bicarbonate de potássio; carbonato de potássio; cloreto de potássio; citrato de potássio; fumarato de potássio; hidróxido de potássio; lactato de potássio; fosfato de potássio, dibásico; fosfato de potássio, tribásico; sulfato de potássio; tartrato de potássio; tripolifosfato de potássio; acetato de sódio; pirofosfato de ácido sódico; tartrato de ácido sódico; fosfato de alumínio e sódio; sulfato de alumínio e sódio; bicarbonate de sódio; bissulfato de sódio; carbonato de sódio; citrato de sódio; fumarato de sódio; gluconato de sódio; hexametafosfato de sódio; hidróxido de sódio; lactato de sódio; fosfato de sódio, dibásico; fosfato de sódio, monobásico; fosfato de sódio, tribásico; hexametafosfato de potássio e sódio; tartrato de potássio e sódio; tripolifosfato de potássio e sódio; pirofosfato de sódio, tetrabásico; tripolifosfato de sódio; ácido sulfúrico; ácido sulfuroso; ácido tartárico; ou qualquer combinação dos mesmos.

[052] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode compreender um álcool de açúcar. Em alguns exemplos, o álcool de açúcar pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em manitol, glicerol, galactitol, fucitol, inositol, volemitol, maltotritol, maltoetetraitol, poliglicitol, eritritol, treitol, ribitol, arabitol, xilitol, alitol, dulcitol,

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52/151 glucitol, sorbitol, altritol, iditol, maltitol, lactitol, isomalte e qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o álcool de açúcar tem 3, 4, 5, 6, 7, 12, 18 ou 24 carbonos.

[053] Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode compreender aditivos adequados, que incluem, porém, sem limitação a diluentes, ligantes, tensoativos, lubrificantes, antiaderentes, materiais de revestimento, plastificantes, agentes corantes, agentes saborizantes ou materiais farmaceuticamente inertes.

Exemplos de diluentes incluem, por exemplo, celulose; derivados de celulose, tais como celulose microcristalina e semelhantes; amido; derivados de amido, tais como amido de milho, ciclodextrina e semelhantes; açúcar; álcool de açúcar, tais como lactose, D-manitol e semelhantes; diluentes inorgânicos, tais como gel de hidróxido de alumínio seco, carbonato de cálcio precipitado, aluminometassilicato de magnésio, fosfato de cálcio dibásico e semelhantes. Exemplos de ligantes incluem, por exemplo, hidroxiprop11celulose, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose (hidroxipropilmetilcelulose), povidona, dextrina, pululano, amido de hidroxipropila, álcool polivinílico, acácia, ágar, gelatina, agradante, macrogol e semelhantes. Exemplos de tensoativos incluem, por exemplo, ésteres de sacarose de ácidos graxos, estearato de

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53/151 polioxila, óleo de ricino hidrogenado de polioxietileno, polioxipropilenoglicol de polioxietileno, sesquioleato de sorbitana, trioleato de sorbitana, monoestearato de sorbitana, monopalmitato de sorbitana, monolaurato de sorbitana, polissorbato, monostearato de glicerila, sulfato de laurila sódico, lauromacrogol, sais de amônia quaternária (por exemplo, cloridrato de benzildimetiltetradecilamônia, cloreto de benzetônio, cloridrato de benzilcetildimetilamônia, cloridrato de benzildimetilstearilamônia, cloridrato de benzildodecildimetilamônia, brometo de benzildodecildimetilamônia) e semelhantes. Exemplos de lubrificantes incluem, por exemplo, ácido esteárico, estearato de cálcio, estearato de magnésio, talco e semelhantes. Exemplos de antiaderentes incluem, por exemplo, gel de hidróxido de alumínio seco, silicato de magnésio e semelhantes. Exemplos de materiais de revestimento incluem, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose 2910, copolímero E de metacrilato de aminoalquila, dietilaminoacetato de polivinilacetal, macrogol 6000, óxido de titânio e semelhantes. Exemplos de plastificantes incluem, por exemplo, citrato de trietila, triacetina, macrogol 6000 e semelhantes.

FORMAS DE DOSAGEM [054] Em alguns exemplos, agentes ativos revelados

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54/151 no presente documento são formulados como uma forma de dosagem de comprimido, cápsula, gel, pirulito, infusão parenteral, intraespinhal, inalação, pulverização, aerossol, adesivo transdérmico, transporte de iontoforese, gel de absorção, líquido, tanato líquido, supositórios, injeção, gotejamento I.V. ou uma combinação dos mesmos para tratar os indivíduos. Em alguns exemplos, os agentes são formulados como forma de dosagem oral única, tal como um comprimido, cápsula, selo, cápsula de gelatina mole, cápsula de gelatina dura, cápsula de liberação prolongada, comprimido de tanato, comprimido de desintegração oral, comprimido de múltiplas camadas, comprimido efervescente, microesfera, líquido, suspensão oral, drágea mastigável, solução oral, drágea, pirulito, xarope oral, pó embalado estéril que inclui excipientes farmaceuticamente aceitáveis, outras formas de dosagem orais, ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, uma composição da revelação no presente documento pode ser administrada com o uso de uma ou mais formas de dosagem diferentes que são adicionalmente reveladas no presente documento. Por exemplo, uma composição que compreende múltiplos agentes ativos pode ser administrada em forma sólida, semissólida, de microemulsão, de gel, de adesivo ou líquida. Tais formas de dosagem são adicionalmente reveladas no presente documento. Em alguns exemplos, a revelação no presente documento se refere a métodos e

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55/151 composições formuladas para entrega oral a um indivíduo em necessidade. Em alguns exemplos, uma composição pode ser formulada de modo a entregar um ou mais agentes farmaceuticamente ativos a um indivíduo através de uma camada mucosa na boca ou esôfago. Em alguns exemplos, a composição pode ser formulada para entregar um ou mais agentes farmaceuticamente ativos a um indivíduo através de uma camada mucosa no estômago e/ou nos intestinos.

[055] Em alguns exemplos, composições reveladas no presente documento são fornecidas em formas de dosagem de liberação modificada (tal como liberação imediata, liberação controlada ou ambas), que compreendem uma quantidade eficaz de um agente ativo; e um ou mais excipientes de controle de liberação, conforme revelado no presente documento. Veículos de dosagem de liberação modificada adeguados incluem, porém, sem limitação a dispositivos de matriz hidrofílica ou hidrofóbica, revestimentos de camada de separação solúveis em água, revestimentos entéricos, dispositivos osmóticos, dispositivos multiparticulados e combinações dos mesmos. Em alguns exemplos, as composições compreendem excipientes de controle de não liberação. Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento são fornecidas em formas de dosagem revestidas entéricas. Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento compreendem excipientes de controle de não liberação. Em alguns exemplos,

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56/151 as composições reveladas no presente documento são fornecidas em formas de dosagem efervescentes. Em alguns exemplos, as composições compreendem excipientes de controle de não liberação.

[056] Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode ser fornecida em uma forma de dosagem que tem pelo menos um componente que facilita a liberação imediata de um agente ativo, e pelo menos um componente que pode facilitar a liberação controlada de um agente ativo. Em alguns exemplos, a forma de dosagem pode ter capacidade para gerar uma liberação descontínua do composto na forma de pelo menos dois pulsos consecutivos separados em tempo de 0,1 até 24 horas. As composições podem compreender um ou mais excipientes de controle de liberação e controle de não liberação, tais como aqueles excipientes adequados para uma membrana rompivel semipermeável e como substâncias engoliveis. Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode ser fornecida em uma forma de dosagem para administração oral a um indivíduo, que compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou carreadores, envolvidos em uma camada reativa intermediária que compreende um material em camadas poliméricas resistente ao suco gástrico parcialmente neutralizado com alcalinos e que tem capacidade de troca de cátions e uma camada externa resistente ao suco gástrico. Em

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57/151 alguns exemplos, as composições compreendem, adicionalmente, celulose, hidrogenofosfato de dissódio, hidroxipropilcelulose, hipromelose, lactose, manitol, ou sulfato de laurila sódico. Em alguns exemplos, as composições compreendem, adicionalmente, monostearato de glicerila 40 a 50, hidroxipropilcelulose, hipromelose, estearato de magnésio, copolimero tipo C de ácido metacrilico, polissorbato 80, esferas de açúcar, talco ou citrato de trietila. Em alguns exemplos, as composições compreendem, adicionalmente, cera de carnaúba, crospovidona, monoglicerideos diacetilados, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, ftalato de hipromelose, estearato de magnésio, manitol, hidróxido de sódio, fumarato de estearila de sódio, talco, dióxido de titânio ou óxido férrico amarelo. Em alguns exemplos, as composições compreendem, adicionalmente, estearato de cálcio, crospovidona, hidroxipropilmetilcelulose, óxido de ferro, manitol, copolimero de ácido metacrilico, polissorbato 80, povidona, propilenoglicol, carbonato de sódio, sulfato de laurila sódico, dióxido de titânio e citrato de trietila.

[057] Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento estão em formas de dosagem unitárias ou múltiplas formas de dosagem. Formas de dosagem unitárias, conforme usado no presente documento, se referem a unidades fisicamente discretas adequadas para administração a

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58/151 indivíduos humanos ou não humanos e individualmente embaladas. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada de um ingrediente (ou ingredientes) ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em combinação com os carreadores ou excipientes farmacêuticos necessários. Exemplos de formas de dosagem unitárias incluem, porém, sem limitação a ampolas, seringas, e comprimidos e cápsulas individualmente embalados. Em alguns exemplos, formas de dosagem unitárias são administradas em frações ou múltiplos das mesmas. Uma múltipla forma de dosagem pode ser uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas em um único recipiente, que pode ser administrado em forma de dosagem unitária segregada. Exemplos de múltiplas formas de dosagem incluem, porém, sem limitação a frascos, garrafas de comprimidos ou cápsulas, ou garrafas de litros ou galões. Em alguns exemplos, as múltiplas formas de dosagem compreendem diferentes agentes farmaceuticamente ativos.

[058] Em alguns exemplos, um kit pode ser fornecido que compreende uma composição antibiótica revelada no presente documento. Em alguns exemplos, o kit pode, adicionalmente, compreender um conjunto de instruções.

[059] Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento podem ser formuladas em formas de dosagem para administração oral, parenteral ou tópica. Em

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59/151 alguns exemplos, as composições podem ser formuladas como uma forma de dosagem de liberação modificada, que incluem formas de dosagem de liberação imediata, atrasada, estendida, prolongada, contínua, pulsátil, controlada, estendida, acelerada e rápida, alvejada, programada, e de retenção gástrica. Em alguns exemplos, as composições podem estar em uma ou mais formas de dosagem. Por exemplo, uma composição pode ser administrada em uma forma sólida ou líquida. Exemplos de formas de dosagem sólidas incluem, porém, sem limitação a unidades discretas em cápsulas ou comprimidos, como um pó ou grânulo, ou presentes em um comprimido convencionalmente formado através de moldagem por compressão. Em alguns exemplos, tais comprimidos são preparados comprimindo-se em uma máquina adequada os três ou mais agentes e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os comprimidos moldados podem ser opcionalmente revestidos ou classificados, ao ter indícios inscritos nos mesmos e podem ser assim formulados para provocar liberação imediata, substancialmente imediata, lenta, controlada ou prolongada dos agentes ativos revelados no presente documento. Em alguns exemplos, formas de dosagem reveladas no presente documento compreendem carreadores ou sais aceitáveis conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association (1986), incorporado a título de referência no

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60/151 presente documento em sua totalidade. Em alguns exemplos, um ou mais agentes farmaceuticamente ativos são misturados com um excipiente farmacêutico para formar uma composição de pré-formulação sólida que compreende uma mistura homogênea de compostos revelados no presente documento. Se referir às composições reveladas no presente documento como homogêneas, pode significar que os agentes estão dispersos de maneira uniforme ao longo da composição, de modo que a composição possa ser subdividida em formas de dosagem unitárias, tais como comprimidos ou cápsulas. Em alguns exemplos, essa composição de pré-formulação sólida pode ser, então, subdividida em formas de dosagem unitárias do tipo descrito acima que compreende de, por exemplo, cerca de 1,0 mg a cerca de 15 mg de um agente ativo revelado no presente documento.

[060] Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento são formuladas, no caso de cápsulas ou comprimidos, para serem engolidas inteiras, por exemplo, com água. Acredita-se que a inclusão do agente de redução de efeito colateral, tal como uma anti-histaminico ou antiemético para abater sintomas comuns de náusea e vômito seja benéfica, em que a prometazina ou um sal da mesma, ou semelhantes, eliminarão ou minimizarão a quantidade de desconforto. Efeitos negativos reduzidos ou eliminados incluem, porém, sem limitação a náusea, vômito, outras

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61/151 perturbações gástricas, constipação, erupções cutâneas, reações alérgicas, tais como inchaço, dificuldade

respiratória,	fechamento	de	garganta,	dor	abdominal,
sangramento ou	contusão incomum,	supressão	de CNS	e supressão
respiratória.
[061]	Em alguns	exemplos, uma	forma	de dosagem

revelada no presente documento pode ser fabricada com o uso de processos que são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, para a fabricação de comprimidos (que incluem, porém, sem limitação a comprimidos de camada única, bicamada, revestidos, de múltiplas camadas) ou cápsulas, os agentes podem ser dispersos de maneira uniforme em um ou mais excipientes, por exemplo, com o uso de granulação de alto cisalhamento, granulação de baixo cisalhamento, granulação de leito fluido ou mesclando-se para compressão direta. Excipientes incluem diluentes, ligantes, desintegrantes, dispersantes, lubrificantes, antiaderentes, estabilizadores, tensoativos e corantes. Diluentes, também denominados cargas, são usados para aumentar o volume de um comprimido, de modo que um tamanho prático possa ser fornecido para compressão. Exemplos sem limitação de diluentes incluem lactose, celulose, celulose microcristalina, manitol, amido seco, amidos hidrolisados, açúcar em pó, talco, cloreto de sódio, dióxido de silício, óxido de titânio, di-hidrato de fosfato de dicálcio, sulfato

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62/151 de cálcio, carbonato de cálcio, alumina e caulim. Em alguns exemplos, ligantes transmitem qualidades coesivas a uma formulação de comprimido, ou uma formulação de partícula em uma cápsula, e são usados para ajudar um comprimido a permanecer intacto após compressão. Exemplos sem limitação de ligantes adequados incluem amido (que inclui amido de milho e amido pré-gelatinizado), gelatina, açúcares (por exemplo, glucose, dextrose, sacarose, lactose e sorbitol), celuloses, polietilenoglicol, ceras, gomas naturais e sintéticas, por exemplo, acácia, agradante, alginato de sódio e polímeros sintéticos, tais como polimetacrilatos e polivinilpirrolidona. Em alguns exemplos, lubrificantes facilitam a fabricação de comprimido; exemplos sem limitação dos mesmos incluem estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, beenato de glicerila e polietilenoglicol. Em alguns exemplos, desintegrantes facilitam a desintegração de comprimido após administração, e exemplos sem limitação dos mesmos incluem, amidos, ácido algínico, polímeros reticulados, tais como, por exemplo, polivinilpirrolidona reticulada, sódio de croscarmelose, glicolato de amido de potássio ou sódio, argilas, celuloses, amidos, gomas e semelhantes. Exemplos sem limitação de antiaderentes adequados incluem dióxido de silício, talco e semelhantes. Em alguns exemplos, estabilizadores inibem ou retardam reações de decomposição de fármaco, que incluem

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63/151 reações oxidantes. Em alguns exemplos, um tensoativo pode ser aniônico, catiônico, anfotérico ou não iônico. Em alguns exemplos, os comprimidos (ou partículas) compreendem substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes tamponantes de pH, conservantes, por exemplo, antioxidantes, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de solubilização, agentes de revestimento, agentes saborizantes e semelhantes. Em alguns exemplos, excipientes exemplificativos incluem éteres de celulose, tais como hidroxipropilmetilcelulose (por exemplo, Metocel K4M) ou celulose microcristalina silicifiçada; excipientes à base de polivinilacetato, tais como, por exemplo, Kollidon SR, e polímeros e copolímeros à base de metacrilatos e ácido metacrílico, tais como, por exemplo, Eudragit NE 30D; celulose microcristalina, carboximetilcelulose de sódio, glicolato de amido de sódio, amido de milho, silica coloidal, sulfato de laurila sódico, estearato de magnésio, Prosolve SMCC (HD90), sódio de croscarmelose, crospovidona NF, Avicel PH200 ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento compreendem uma ou mais combinações de excipientes que retardam a liberação dos agentes revestindo ou temporariamente ligando ou diminuindo-se sua solubilidade dos agentes ativos. Exemplos desses excipientes incluem éteres de celulose, tais como hidroxipropilmetilcelulose (por exemplo, Metocel K4M) ou

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64/151 celulose microcristalina silicifiçada, excipientes à base de polivinilacetato, tal como, por exemplo, Kollidon SR, e polímeros e copolímeros à base de metacrilatos e ácido metacrílico, tal como, por exemplo, Eudragit NE 30D.

[062] Em alguns exemplos, as composições compreendem um ou mais carreadores que protegem os agentes contra a eliminação rápida do corpo, tal como formulações ou revestimentos de liberação temporal. Tais carreadores incluem formulações de liberação controlada, que incluem, por exemplo, sistemas de entrega microencapsulados. Em alguns exemplos, os agentes ativos são incluídos no carreador farmaceuticamente aceitável em quantidades suficientes para tratar a dor de um indivíduo, com efeitos negativos reduzidos. Em alguns exemplos, as composições estão em forma de dosagem oral e compreendem uma matriz que inclui, por exemplo, um agente ativo formulado para liberação controlada. Em alguns exemplos, a matriz pode ser compressível em um comprimido e pode ser opcionalmente sobre revestida com um revestimento que controla a liberação do agente ativo da composição. Em alguns exemplos, níveis sanguíneos de analgésicos são mantidos dentro de uma faixa terapêutica durante um período de tempo estendido. Em alguns determinados casos, a matriz pode ser encapsulada. Comprimidos ou cápsulas que contêm uma composição revelada no presente documento podem ser revestidos ou compostos de

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65/151 outra forma para fornecer uma forma de dosagem gue gera a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou cápsula contém um componente de dosagem interior e de dosagem exterior, em gue o último está na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica gue serve para resistir à desintegração no estômago e permite gue o componente interior passe intacto no duodeno ou para ser controlado na libertação. Em alguns exemplos, para liberação controlada prolongada, a cápsula tem furos microperfurados. Em alguns exemplos, um revestimento gue compreende um composto de redução de efeito colateral pode ser preparado misturando-se por adição um composto como prometazina com polivinilpirrolidona (PVP) 29/32 ou hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e água/álcool isopropilico e acetato de trietila. Tal revestimento pode ser revestido por pulverização nos núcleos de comprimido. Em alguns exemplos, o revestimento pode ser aplicado com o uso de um processo de revestimento por prensa com uma mescla gue consiste em 80% em peso de prometazina e 20% em peso de lactose e hidroxipropilmetilcelulose tipo 2910. Técnicas de revestimento por prensa são conhecidas na técnica e são

descritas	no documento de Patente	n° U.S. 6.	372.254, gue
pode ser	incorporado no presente	documento	a titulo de
referência	em sua totalidade.
[063]	Em alguns exemplos,	uma forma	de dosagem

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66/151 revelada no presente documento pode ser uma forma de dosagem efervescente. Efervescente significa que a forma de dosagem, quando misturada com liquido, que inclui água e saliva, se desenvolve em um gás. Alguns agentes efervescentes (ou par efervescente) se desenvolvem em gás por meio de uma reação quimica que ocorre após exposição do agente de desintegração efervescente em água e/ou em saliva na boca. Essa reação pode ser o resultado da reação de uma fonte de ácido solúvel e uma fonte de monocarbonato ou carbonato alcalina. A reação desses dois compostos gerais produz gás de dióxido de carbono após contato com a água ou saliva. Um par efervescente (ou o ácido e a base individuais separadamente) pode ser revestido com um solvente protetor ou revestimento entérico para evitar a reação prematura. Em alguns exemplos, tal par pode ser misturado com partículas anteriormente liofilizadas (tais como um ou mais agentes farmaceuticamente ativos revestidos com um solvente protetor ou revestimento entérico) . Em alguns exemplos, a fonte de ácido pode ser qualquer uma que seja segura para consumo humano e inclui ácidos alimentares, ácido e antiácidos de hidrito, tal como, por exemplo: citrico, tartárico, amálico, fumérico, adipico e succinico. Fontes de carbonato incluem sal de carbonato e bicarbonate sólido seco, tal como, por exemplo, bicarbonate de sódio, carbonato de sódio, bicarbonate de potássio e carbonato de potássio, carbonato de magnésio e semelhantes.

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Reagentes que evolvem oxigênio ou outros gases e que são seguros para o consumo humano também são incluídos. Em alguns exemplos, ácido cítrico e bicarbonato de sódio podem ser usados.

[064] Em alguns exemplos, uma forma de dosagem revelada no presente documento pode estar em uma forma de doce (por exemplo, matriz), tal como um pirulito ou drágea. Em alguns exemplos, um ou mais agentes farmaceuticamente ativos estão dispersos dentro de uma matriz de doce. Em alguns exemplos, a matriz de doce pode compreender um ou mais açúcares (tais como dextrose ou sacarose) . Em alguns exemplos, a matriz de doce pode ser uma matriz livre de açúcar. A escolha de uma matriz de doce particular pode ser submetida a ampla variação. Em alguns exemplos, edulcorantes convencionais, tais como sacarose são utilizados, ou álcoois de açúcar adequados para uso em pacientes diabéticos, tais como sorbitol ou manitol podem ser empregados. Em alguns exemplos, outros edulcorantes, tais como os aspartames, são facilmente incorporados em uma composição em conformidade com composições reveladas no presente documento. A base de doce pode ser muito mole e de rápida dissolução, ou pode ser dura e de lenta dissolução. Várias formas terão vantagens em diferentes situações. Em alguns exemplos, uma massa de doce que compreende pelo menos um agente farmaceuticamente ativo pode ser administrada por via oral a um indivíduo que

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68/151 necessita da mesma, de modo que o agente será liberado na boca de um indivíduo conforme a massa de doce se dissolve. 0 fármaco entra rapidamente na corrente sanguinea do indivíduo, e de maneira importante, no sangue nas veias que corre da boca e das áreas faringea e esofágica passa por uma porção substancial do corpo (de modo que o fármaco possa ser absorvido) antes do sangue passar pelo figado (onde o fármaco pode ser inativado). Em alguns exemplos, um indivíduo que necessita do mesmo pode ser um ser humano adulto ou criança que sofre de uma tosse e/ou dor. Em alguns exemplos, uma matriz de doce (por exemplo, pirulito ou drágea) revelada no presente documento pode compreender uma composição que carece de um estimulante. Em alguns exemplos, a composição tem um efeito sedativo adicionalmente ao fornecimento de alivio de tosse e/ou dor a um indivíduo que necessita do mesmo. Em alguns exemplos, a matriz de doce (pirulito ou drágea) pode compreender uma composição que pode compreender um estimulante. Em alguns exemplos, a composição fornece um efeito antissedativo adicionalmente ao fornecimento de alivio de tosse e/ou dor a um indivíduo que necessita do mesmo. Em alguns exemplos, uma massa de doce revelada no presente documento pode compreender uma ou mais camadas que compreendem diferentes agentes farmaceuticamente ativos e/ou taxas de dissolução. Em alguns exemplos, uma massa de doce de múltiplas camadas (tal como um pirulito) pode compreender

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69/151 uma camada externa com uma concentração de um ou mais agentes farmaceuticamente ativos que se diferem daqueles de uma ou mais camadas internas. Tal sistema de entrega de fármaco tem uma variedade de aplicações. A titulo de exemplo, pode ser desejável conseguir rapidamente uma dose predeterminada de um primeiro agente farmaceuticamente ativo na corrente sanguínea para obter um efeito desejado e, então, usar uma camada interna diferente para entregar um ou mais outros agentes. As escolhas de matriz e da concentração do fármaco na matriz são fatores importantes com relação à taxa de absorção de fármaco. Em alguns exemplos, uma matriz que dissolve rapidamente entrega fármaco na boca de um paciente para absorção mais rapidamente do que uma matriz que pode ser lenta de se dissolver. Em alguns exemplos, uma matriz de doce que contém um ou mais agentes farmaceuticamente ativos em uma alta concentração libera mais do um ou mais agentes farmaceuticamente ativos em um dado periodo de tempo do que um doce que tem uma baixa concentração.

[065] Em alguns exemplos, as formas de dosagem reveladas no presente documento assumem a forma de partículas farmacêuticas fabricadas através de uma variedade de métodos, que incluem, porém, sem limitação a homogeneização de alta pressão, moagem de bola seca ou úmida, ou precipitação de partícula pequena (por exemplo, nGimat's NanoSpray). Outros métodos úteis para preparar uma

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70/151 formulação em pó adequada são a preparação de uma solução de ingredientes ativos e excipientes, seguido por precipitação, filtração e pulverização, ou seguido por remoção do solvente através de liofilização, seguido por pulverização do pó até o tamanho de partícula desejado. Em alguns exemplos, as

partículas farmacêuticas	têm um tamanho	final de	3 a 1	.000
pm,	tal como no máximo 3	, 4, 5, 6,	7, 8	, 9,10, 20	, 30,	40,
50,	60, 70, 80, 90, 100,	150, 200,	250,	300, 350,	400,	450,
500,	550, 600, 650, 700,	750, 800,	850,	900, 950,	1.000	pm.

Em alguns exemplos, as partículas farmacêuticas têm um tamanho final de 10 a 500 pm. Em alguns exemplos, as partículas farmacêuticas têm um tamanho final de 50 a 600 pm. Em alguns exemplos, as partículas farmacêuticas têm um tamanho final de 100 a 800 pm. Em alguns exemplos, essas formas de dosagem incluem partículas de liberação imediata em combinação com partículas de liberação controlada em uma razão suficientemente útil para entregar as dosagens desejadas de agentes ativos.

COMPOSIÇÕES LÍQUIDAS [066] Em alguns aspectos, composições liquidas reveladas no presente documento são estáveis em prateleira, por exemplo, as composições liquidas não se separam na prateleira (tanto flutuantes quanto sedimentadas) ou não necessitam de agitação vigorosa (que afeta bastante a consistência de dosagem). Em alguns exemplos, um ou mais

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71/151 agentes ativos em composições líquidas reveladas no presente documento são fornecidos como em liberação modificada, por exemplo, liberação controlada, liberação imediata ou misturados. Em alguns exemplos, um ou mais agentes ativos em composições líquidas reveladas no presente documento podem compreender um descongestionante, antitussivo, expectorante ou analgésico em uma matriz formulada para liberação modificada. Expectorantes exemplificativos incluem cloreto de amônia, N-acetilcisteína, ambroxol, guaifenesina (por exemplo, glicerol, guaiacolato), hidrato de terpina, guaiacolato de glicerila, iodeto de potássio, citrato de potássio, guaicolsulfonato de potássio, extrato de folha de orégano de 25 a 500 mg (que pode ser um extrato líquido) , trevo vermelho de 25 a 500 mg, raiz de groselha de 25 a 500 mg, feno-grego de 25 a 500 mg, ou qualquer mistura dos mesmos. Exemplos de carreadores para as atividades incluem qualquer polímero degradável, parcialmente degradável ou não degradável e, de modo geral, biocompatível, por exemplo, polistirex, polipropileno, polietileno, polacrilex, ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA) e/ou ácido poliglicólico polilático (PGLA), por exemplo, na forma de um líquido, matriz ou microesfera.

[067] Em alguns exemplos, uma composição líquida revelada no presente documento tem uma viscosidade (viscosidade de mandril) de cerca de 0,15 a cerca de 1 Pa-s

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72/151 (150 a cerca de 1.000 centipoises) a 50 RPM, por exemplo, de cerca de 0,20 a cerca de 1 Pa-s (200 a cerca de 1.000 centipoises) a 50 RPM ou de cerca de 0,40 a cerca de 0,70 Pa-s (400 a cerca de 700 centipoises) a 50 RPM; ou de cerca de 0,15 a cerca de 1,2 Pa-s (150 a cerca de 1.200 centipoises) medida a 10 RPM. A viscosidade pode ser medida através de um método na USP (Farmacopeia dos Estados Unidos), selecionado dentre <911> Métodos de Viscosimetro para Viscosidade Capilar, <912> Métodos de Reômetro Giratório, e/ou <913> Método de Viscosimetro de Bola de Rolamento. Em alguns exemplos, uma quantidade do modificador de viscosidade usada depende da espessura desejada da composição e do tipo de modificador de viscosidade usado. Em alguns exemplos, combinações de modificadores de viscosidade são empregadas. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa com uma viscosidade de cerca de 1,5 a cerca de 4,5 Pa-s (1.500 a cerca de 4.500 cps), até cerca de 1,0 em p/v de goma xantana pode ser usada com até cerca de 3,0 em p/v de celulose microcristalina pode ser como um modificador de viscosidade. Em alguns exemplos, um pH de uma composição líquida revelada no presente documento pode ser de cerca de: 2,5 a 5, 6 a 8, 5 a 9, 4 a 10, 7 a 8, 7 a 9, 7 a 10, 6 a 7, 5 a 7 ou 4 a 7. Em alguns exemplos, um pH de uma composição líquida revelada no presente documento pode ser de cerca de: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em alguns exemplos, o pH pode ser de

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73/151 cerca de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,8, 7,9, 7,10, por exemplo, na faixa de cerca de 6,8 a cerca de 7,4.

[068] Em um aspecto, uma composição líquida revelada no presente documento pode ser uma suspensão que compreende microesferas (por exemplo, microesferas), em que uma porção da uma ou mais microesferas tem um perfil de liberação imediata e outra porção tem um perfil de liberação controlada. Em alguns exemplos, uma ou mais microesferas incluem um revestimento entérico, um revestimento de resina, um revestimento de laca, um revestimento sensível ao pH, uma matriz de polímero biodegradável, uma matriz solúvel em água, uma matriz iônica, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, uma ou mais microesferas incluem um ou mais polímeros selecionados dentre celulose, etilcelulose, metilcelulose, propilcelulose, metoxipropilcelulose, nitrato de celulose, álcool poli(vinílico), cloreto de poli(vinila), poliestireno, polietileno, polipropileno, acetato de poli (etileno-co-vinila), ácido poli(hidroxibutírico), ácido poli (hidroxivaleriânico-cohidroxibutírico) , ácido poli(lático), ácido poli(glicólico), ácido poli (lático-co-glicólico), poli (.epsilon.(caprolactonas), ácido poli (.epsilon.-caprolactona-co-DLlático), anidrido poli(maleico), poliamidas, gelatina, quitosana, colágeno, poli(hidroxialquil)-L-glutaminas,

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74/151 ácido poli(.gama.-etil-L-glutaminato-co-glutâmico), ácido poli (L-leucina-co-L-aspártico), ácido poli (prolina-coglutâmico), 2-cianoacrilatos de poli(alquila), poliuretanos, metacrilato de poli(metila), ácido poli(metilmetacrilato-cometacrílico) e metacrilato de poli(metacrilato-cohidroxipropila), poliestireno, polistirex, polacrilex, sais dos mesmos e qualquer combinação dos mesmos.

[069] Em alguns exemplos, uma composição líquida revelada no presente documento pode ser um xarope, uma suspensão pronta para o uso, ou xarope ou suspensão líquida extemporaneamente preparada tal como, por exemplo, pó seco para reconstituição em água, concentrado líquido para diluição, comprimido ou cápsula dispersível. No caso de xarope ou suspensão extemporaneamente preparada, a concentração de ingredientes pode ser com base no produto reconstituído. Em alguns exemplos, a forma de dosagem líquida pode ser para administração oral, injeção intravenosa, injeção intramuscular, ou para administração tópica (por exemplo, como um creme, gel, pomada ou bandagem). Uma forma de dosagem líquida administrada por via oral pode ser benéfica para indivíduos que têm disfagia ou dificuldade em engolir. Em alguns exemplos, a forma de dosagem líquida inclui um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica líquida contém um ou mais agentes ativos, por

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75/151 exemplo, presentes em quantidades terapeuticamente eficazes na forma de dosagem. Essas quantidades se diferem dependendo do fármaco e regimes de dosagem prescritos. Por exemplo, preparações liquidas destinadas a crianças contêm altas concentrações de fármaco para permitir pequenas doses e frequência de dosagem reduzida. Em alguns exemplos, uma quantidade de fármaco na composição pode ser de cerca de 0,02 a cerca de 15 por cento em peso, por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 10 por cento em peso da composição total. No caso de pó seco para reconstituição em água, o fármaco pode estar presente como partículas não revestidas ou revestidas.

[070] Em alguns exemplos, uma composição líquida revelada no presente documento pode compreender uma base de excipiente líquida de disfarce de gosto para administração de um medicamento de gosto desagradável. Em alguns exemplos, a dita base de excipiente tem viscosidades maiores que o normal, por exemplo, devido à presença de polietilenoglicol e/ou carboximetilcelulose de sódio. Em alguns exemplos, base de excipiente líquida de alta viscosidade fornece benefícios de disfarce de gosto ao ponto de que composições extrafortes possam ser preparadas contendo concentrações aumentadas de composições farmacêuticas de gosto desagradável. Por exemplo, um agente ativo normalmente administrado em dosagens de não mais que 100 miligramas em 5 mililitros de

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76/151 liquido, pode ser administrado em dosagens de 200 miligramas no mesmo volume do liquido sem que o paciente sinta um gosto excessivamente desagradável.

[071] Em outro aspecto, um método revelado no presente documento aumenta a vida útil em prateleira e estabilidade dos agentes ativos, por exemplo, evitando-se a separação dos componentes tomando-se medidas para reduzir ou eliminar a formação de bolha. Em alguns exemplos, etapas para minimizar, reduzir e/ou eliminar a formação de bolha incluem, porém, sem limitação, usar as seguintes etapas sozinhas ou em combinação: usar uma bomba de diafragma para combinar, por exemplo, a água e o agente tixotrópico e um ou mais conservantes, corantes e saborizantes; colocar o tubo de recirculação abaixo da superfície do liquido; adicionar líquidos ao longo do lado de um vaso que retém o liquido; salpicar microesferas (por exemplo, uma ou mais microesferas que incluem um ou mais agentes ativos) na superfície do liquido; misturar a solução na ausência de uma ou mais pás que raspam o vaso; misturar a solução com um misturador impulsor; misturar a solução com um misturador impulsionador a uma velocidade que reduz ou minimiza cavitação e combinações de duas ou mais dentre essas etapas.

[072] Em alguns exemplos, uma composição liquida revelada no presente documento pode ser para uso no tratamento de uma doença ou afecção revelada no presente

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77/151 documento, por exemplo, tosse, alergia, resfriado ou sintomas associados. Em alguns exemplos, um indivíduo (por exemplo, pessoa) que sofre de resfriado ou sintomas parecidos com resfriado encontra alívio ao ingerir por via oral uma quantidade eficaz e segura das composições líquidas, conforme descrito acima. A quantidade eficaz e segura da composição líquida pode ser dependente da concentração dos componentes terapêuticos presentes nas composições líquidas. Em alguns exemplos, a quantidade eficaz e segura da composição líquida pode estar em uma faixa de 1 a 30 ml, por exemplo, 1 a 10 ml, por dosagem da composição líquida. Em alguns exemplos, uma composição líquida revelada no presente documento pode ser seguramente consumida por uma criança. Em alguns exemplos, um indivíduo (por exemplo, pessoa) pode ser ingerir múltiplas doses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 doses) da composição líquida por dia. Em alguns exemplos, uma composição líquida no presente documento fornece uma quantidade eficaz de um ou mais agentes ativos por 2 a 4 horas, 4 a 6 horas, 6 a 8 horas, 12 horas ou 24 horas. Em alguns exemplos, uma composição líquida revelada no presente documento pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, pessoa) em uma forma líquida (por exemplo, através de copo ou reservatório de dosagem, tal como uma colher) ou pode ser encapsulada em uma cápsula de gelatina mole que pode ser mastigável ou engolível pelo indivíduo. Em alguns exemplos,

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78/151 a composição liquida pode ser mesclada com composições, tal como gelo, leite, refrigerante, suco ou alguma outra composição comestível e administrada ao indivíduo.

[073] Em alguns exemplos, uma forma de dosagem liquida revelada no presente documento pode ser para administração oral, injeção intravenosa, injeção intramuscular, ou para administração tópica (por exemplo, como um creme ou gel). Uma forma de dosagem liquida administrada por via oral pode ser benéfica para indivíduos que têm disfagia ou dificuldade em engolir. Uma única dose de uma forma de dosagem liquida administrada por via oral pode ser de 1 ml a cerca de 500 ml em volume, ou mais. Por exemplo, a dose única de uma forma de dosagem liquida administrada por via oral pode ser de cerca de 1 a 500 ml, 1 a 250 ml, 1 a 100 ml, 1 a 50 ml, 1 a 30 ml, 1 a 20 ml, 1 a 15 ml, 1 a 10 ml, 1 a 5 ml, 1 a 2,5 ml, 2,5 a 50 ml, 2,5 a 30 ml, 2,5 a 20 ml, 2,5 a 15 ml, 2,5 a 10 ml, 2,5 a 5 ml, 5 a 50 ml, 5 a 30 ml, 5 a 20 ml, 5 a 15 ml, 5 a 10 ml, 10a 50 ml, 10 a 30 ml, 10 a 20 ml, 10 a 15 ml, 15 a 50 ml, 15 a 30 ml, 15 a 20 ml, 20 a 50 ml, 20 a 30 ml, 30 a 50 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, 3 ml, 3,5 ml, 4 ml, 4,5 ml, 5 ml, 5,5 ml, 6 ml, 6,5 ml, 7 ml, 7,5 ml, 8 ml, 8,5 ml, 9 ml, 9,5 ml, 10 ml, 11 ml, 12 ml, 13 ml, 14 ml, 15 ml, 16 ml, 17 ml, 18 ml, 19 ml, 20 ml, 21 ml, 22 ml, 23 ml, 24 ml, 25 ml, 30 ml, 35 ml, 40 ml, 45 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100

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79/151

ml,	110 ml,	120	ml,	130 ml, 140	ml, 150	ml,	160	ml,	170 ml,
180	ml, 190	ml,	200	ml, 250 ml,	300 ml,	350	ml,	400	ml, 450
ml,	ou 500	ml.
	[074]		Em	alguns	exemplos,		carreadores

farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes revelados no presente documento incluem agente (ou agentes) de modificação de pH (por exemplo, agente (ou agentes) tamponante), agente (ou agentes) de estabilização, agente (ou agentes) espessante, agente (ou agentes) edulcorante, agente (ou agentes) saborizante, agente (ou agentes) corante, agente (ou agentes) conservante, agente (ou agentes) emulsificante, agente (ou agentes) de solubilização, agente (ou agentes) antioxidante ou qualquer combinação dos mesmos.

[075] Em alguns exemplos, um agente de estabilização revelado no presente documento inclui qualquer componente de mono-hidroxifenol ou componente de polihidroxifenol adequado, ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, tais agentes de estabilização também funcionam como agentes antioxidantes, ou agentes antimicrobianos. Em alguns exemplos, um agente espessante ou agente de aprimoramento de viscosidade revelado no presente documento melhora a sensação na boca da forma de dosagem liquida oral e/ou ajuda a revestir o forro do trato gastrointestinal. Agentes espessantes exemplificativos

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80/151 incluem acácia, bentonita de ácido alginico, carbômero, cálcio ou sódio de carboximetilcelulose, álcool cetostearilico, metilcelulose, etilcelulose, glicerina, goma guar de gelatina, hidroxietilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), qualquer outro componente à base de celulose adequado, maltodextrina, álcool polivinilico, povidona, carbonato de propileno, alginato de propilenoglicol, alginato de sódio, glicolato de amido de sódio, agradante de amido e goma xantana, ou uma combinação dos mesmos. Agente espessante, quando incluso, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1 por cento em volume a 20 por cento em volume (v/v), com base no volume total da solução. Em um exemplo, glicerina pode estar presente em uma guantidade de cerca de 1 por cento em volume a 10 por cento em volume (v/v) , com base no volume total da solução. Quantidades exemplificativas de agente espessante incluem de cerca de 1 por cento em volume a 12 por cento em volume (v/v) , e preferencialmente em uma quantidade de cerca de 4 por cento em volume a 10 por cento em volume (v/v), com base no volume total da solução. Uma quantidade exemplificativa inclui cerca de 6 a 10 por cento em volume (v/v) . Em alguns exemplos, um agente edulcorante pode ser opcionalmente incluído na forma de dosagem oral liquida. Agentes edulcorantes exemplificativos incluem sorbitol, sacarina, acessulfame,

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81/151 por exemplo, potássio de acessulfame, sucralose, xilitol, maltitol, sacarose, aspartame, frutose, neotame, glicerina, sacarato de sódio, dipotássio de glicirrizina, acessulfame K, manitol, açúcar invertido e combinações dos mesmos, ou componentes que contêm um agente edulcorante, tal como um ou mais componentes contendo sucralose ou componentes contendo sacarina, podem ser adicionados para modificar o gosto da composição. Alternativa ou adicionalmente, um edulcorante viscoso, tal como uma ou mais dentre uma solução de sorbitol, um xarope (solução de sacarose), ou xarope de milho de alto teor de frutose pode ser usado e, adicionalmente aos efeitos edulcorantes, pode ser útil para aumentar a viscosidade e para retardar a sedimentação. Em alguns exemplos, o agente edulcorante inclui um componente contendo acessulfame, sucralose ou sacarina. Em alguns exemplos, o agente edulcorante inclui glicerina, sacarina, açúcar liquido (solução de sacarose) ou uma combinação dos mesmos. Tal agente edulcorante, caso presente, pode estar presente em uma quantidade suficiente para minimizar ou mascarar quaisquer sabores externos no gosto dos agentes ativos, e também minimizar ou mascarar quaisquer outros componentes de sabor externo inclusos na formulação, caso desejado. Agente (ou agentes) edulcorante, quando incluso, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1 por cento em volume a 85 por cento em volume (v/v) , com base no volume

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82/151 total da solução. Em um exemplo, o agente edulcorante pode estar presente em uma quantidade de cerca de 5 por cento em volume a 70 por cento em volume (v/v) , com base no volume total da solução. Quantidades exemplificativas de glicerina

incluem	cerca de 2 por cento em	volume	a	18	por	cento em
volume (	ϊν/ν), preferencialmente	cerca	de	5	por	cento em
volume a	10 por cento em volume	(v/v).	Em	alguns	exemplos,

quantidades exemplificativas de açúcar liquido incluem cerca de 40 por cento em volume a 75 por cento em volume (v/v) , preferencialmente cerca de 60 por cento em volume a 70 por cento em volume (v/v), com base no volume total da solução. Em alguns exemplos, determinados tipos de agente espessante ou agente edulcorante atuam como um agente de solubilização ou um agente de estabilização, ou ambos, ou têm outras propriedades, quando incluídos como um componente de um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um agente edulcorante, tal como glicerina atua como um agente espessante. Em alguns exemplos, uma forma de dosagem oral liquida contém, adicionalmente a um agente edulcorante, um agente saborizante, por exemplo, um ou mais dentre frutas naturais e artificiais, banana, morango e abacaxi artificiais. Em alguns exemplos, um agente corante, quando incluído na forma de dosagem liquida, pode ser fornecido em uma quantidade suficiente para fornecer as composições com uma aparência melhor e/ou distinta. Agentes corantes

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83/151 exemplificativos incluem um ou mais aditivos alimentares orgânicos e sintéticos (por exemplo, corantes alimentares, tais como corante alimentar vermelho n° 2 e 3, corante alimentar amarelo n° 4 e 5 e corante alimentar azul n° 1 e 2), corantes de lago insolúveis em água (por exemplo, sais de alumínio dos aditivos alimentares orgânicos sintéticos acima, etc.), e pigmentos naturais (por exemplo, betacaroteno, clorofila, vermelho de óxido de ferro, etc.). Outros corantes adequados incluem D&C Vermelho n° 33, FD&C Vermelho n° 3, FD&C Vermelho n° 40, D&C Amarelo n° 10 e D&C Amarelo n° 6, ou qualquer combinação desses ou dos corantes acima. Em alguns exemplos, agente (ou agentes) conservante adequado é opcionalmente incluído na forma de dosagem líquida. O agente (ou agentes) conservante pode estar em uma quantidade suficiente para estender a vida útil em prateleira ou estabilidade de armazenamento, ou ambas, da forma de dosagem líquida. Agentes conservantes exemplificativos incluem benzoato de sódio, ésteres de ácido paraoxibenzoico, parabenos de metila, etila, butila e propila, clorobutanol, álcool benzílico, álcool feniletílico, ácido dehidroacético, ácido sórbico, cloreto de benzalcônio (BKC), cloreto de benzetônio, fenol, nitrato fenilmercúrico, timerosal e uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, o pH da forma de dosagem líquida pode ser ajustado por um agente tamponante. O agente tamponante pode estar presente

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84/151 em uma quantidade suficiente para tamponar o pH da solução e minimizar degradação dos ingredientes ativos. Em alguns exemplos, alguns agentes tamponantes também modulam a solubilidade de ingrediente ativo na forma de dosagem liquida. Agentes tamponantes exemplificativos incluem um ou mais dentre sais de gluconato, lactato, citrato, acetato, fosfato, benzoato e/ou carbonato. 0 pH pode ser ajustado com uma combinação de dois ou mais desses agentes tamponantes, por exemplo, ácido citrico e benzoato de sódio. 0 agente tamponante pode estar presente como uma solução de tampão. Em outro exemplo, o agente tamponante inclui um fosfato, tal como um fosfato de potássio ou fosfato de sódio, ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, agentes emulsificantes podem ser incluídos na forma de dosagem liquida em uma quantidade suficiente para facilitar a dispersão mais uniforme de um ou mais ingredientes ativos ou outro excipiente farmaceuticamente aceitável que pode não ser geralmente solúvel no liquido. Agentes emulsificantes exemplificativos incluem gelatina, gema, caseina, colesterol, acácia, agradante, chondrus, pectina, metilcelulose, carbômero, álcool cetostearilico, álcool cetilico, ou uma combinação dos mesmos. Agentes de solubilização podem ser incluídos na forma de dosagem liquida, por exemplo, em uma quantidade suficiente para facilitar dissolução maior e mais rápida de um ou mais

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85/151 ingredientes ativos ou outros excipientes. Agentes de solubilização exemplificativos incluem um álcool, por exemplo, álcool 95% etílico, um glicol, glicerina, Dmanitol, trealose, benzoato de benzila, tris-aminometano, colesterol, trietanolamina, carbonato de sódio, citrato de sódio, salicilato de sódio, acetato de sódio e uma combinação dos mesmos. Álcoois exemplificativos incluem etanol, isopropanol, t-butanol, fenol, cresol, um álcool benzílico, ou uma combinação dos mesmos. Glicóis exemplificativos incluem C2-20 alquenos funcionalizados com um glicol, que inclui propilenoglicol, polipropilenoglicol, polietilenoglicol, etc., ou uma combinação dos mesmos. Um agente de solubilização pode ser incluído em uma quantidade de cerca de 1 por cento em volume a 20 por cento em volume (v/v), ou cerca de 4 por cento em volume a 15 por cento em volume (v/v), com base no volume total da solução. Quantidades exemplificativas de agente de solubilização incluem cerca de 7 por cento em volume a 12 por cento em volume (v/v) com base no volume total da solução. Em alguns exemplos, um agente de estabilização pode ser incluído na forma de dosagem líquida. Agentes de estabilização exemplificativos incluem, por exemplo, um ou mais excipientes líquidos, tais como etanol, glicerina; um ou mais glicóis, tais como polietilenoglicol, por exemplo, PEG400, propilenoglicol, ou polipropilenoglicol; um componente

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86/151 à base de celulose, tal como hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) ou hidroximetilcelulose (HMC); ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, determinados agentes de solubilização funcionam de maneira eficaz como um agente de estabilização. Por exemplo, propilenoglicol funciona tanto como um agente de solubilização quanto como um agente de estabilização. Em alguns exemplos, um antioxidante (ou antioxidantes) pode ser incluído na forma de dosagem líquida. Antioxidantes exemplificativos incluem um ou mais flavonoides, antocianidinas, antocianinas, proantocianidinas e combinações dos mesmos. 0 antioxidante (ou antioxidantes), quando usado, pode ajudar a fornecer estabilidade a longo prazo às composições líquidas, por exemplo, em condições ambiente por pelo menos cerca de um mês, preferencialmente por pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 24 meses, ou mais, dependendo do tipo e da concentração de antioxidante usado e dependendo de outros componentes do microambiente de armazenamento, tal como pH, agente tamponante, etc.

[076] Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento exibe desempenho melhorado ou mais desejado com relação à concentração, dissolução, dispersão, estabilidade, segurança, emulsificação, eficácia, sabor, comprometimento do paciente, biodisponibilidade de fármaco e/ou outras propriedades farmacocinéticas, químicas e/ou

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87/151 físicas. Em alguns exemplos, uma quantidade eficaz de um ou mais agentes ativos pode ser dissolvida para gerar uma solução substancialmente estável, ou estável com um ou mais dos carreadores farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes, conforme revelado no presente documento. Em alguns exemplos, uma forma de dosagem oral líquida revelada no presente documento pode ser uma forma de dosagem oral líquida de liberação controlada. A forma de dosagem oral líquida de liberação controlada pode fornecer liberação controlada ou prolongada de um ou mais ingredientes ativos a partir de um material de gel, matriz, cápsula, ou resina, ou qualquer combinação de tecnologia de liberação controlada ou prolongada que possa ser suspensa ou dissolvida em uma composição líquida. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral líquida de liberação controlada pode compreender um ou mais excipientes, tais como goma xantana, alginato de sódio, pares de coacervado complexos, tais como gelatina ou outros polímeros e carragenina, e formulações de metilcelulose de gelificação térmica. Tais excipientes podem influenciar a dissolução e/ou taxa de difusão de um ingrediente ativo suspenso, de modo a modificar as características de absorção do ingrediente ativo em comparação com uma forma de dosagem oral líquida convencional. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral líquida de liberação controlada pode ser administrada em uma composição normalmente líquida e apenas

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88/151 subsequentemente forma uma matriz persistente semissólida ou semelhante a gel no ambiente do estômago. Em alguns exemplos, uma forma de dosagem oral liquida de liberação controlada pode compreender uma solução ou suspensão aquosa, parcialmente aquosa ou não aquosa de goma xantana, alginato de sódio ou alginato de sódio LV (baixa viscosidade, cálcio reduzido), gelatina e carragenina, metilcelulose, ou uma combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral liquida de liberação controlada pode compreender goma xantana (por exemplo, Kelco SS-4749 e outros tipos comercialmente disponíveis) em uma quantidade de cerca de 0,3 a cerca de 3,0 por cento em peso. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral liquida de liberação controlada pode compreender goma xantana em uma quantidade de cerca de 1,0 por cento em peso. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral liquida de liberação controlada pode compreender alginato de sódio em uma quantidade de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 por cento em peso, ou de cerca de 0,3 a cerca de 1,5 por cento em peso de cada um dentre gelatina e carragenina. Em alguns exemplos, cada carragenina do tipo lota e gelatina tipo B pode estar presente em niveis de pelo menos cerca de 0,5 por cento em peso. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral liquida de liberação controlada pode compreender pelo menos cerca de 1 por cento em peso de alginato de sódio. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral liquida de liberação

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89/151 controlada pode compreender metilcelulose (por exemplo, Tipo A15C, Dow Chemical Co.) em uma quantidade de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 por cento em peso. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral líquida de liberação controlada pode compreender metilcelulose (por exemplo, Tipo A15C, Dow Chemical Co.) em uma quantidade de cerca de 2,0 por cento em peso. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral líquida de liberação controlada compreende outros excipientes, tais como, por exemplo, goma alfarroba, sais, tais como NaCl, açúcares, tais como sorbitol, Na3PO4, CaCO3, Ca2HPO4 e semelhantes. A forma de dosagem oral líquida de liberação controlada pode compreender compostos de carbonato, tal como carbonato de cálcio. O carbonato de cálcio pode flutuar a matriz gelatinosa em uma região predeterminada do estômago, de modo que a mesma possa entrar em contato com o ambiente de pH mais apropriado por um período de tempo prolongado devido ao esvaziamento gástrico atrasado. Em alguns exemplos, a forma de dosagem oral líquida de liberação controlada inclui soluções ou suspensões aquosas, soluções ou suspensões parcialmente aquosas, tais como, por exemplo, glicerina, álcoois e glicóis de peso molecular alto ou baixo ou mesmo soluções ou suspensões não aguosas, tais como, por exemplo, glicerina, álcoois e glicóis de peso molecular alto ou baixo.

[077] Em alguns exemplos, uma composição líquida

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90/151 revelada no presente documento pode, adicionalmente, compreender um ou mais excipientes: ácido ascórbico, dihidrato de EDTA, glicerina, mono-hidrato de ácido citrico, di-hidrato de citrato de sódio, solução de sorbitol (por exemplo, 70%), sucralose, corante alimentar (por exemplo, FD&C Amarelo n°6), sabor de fruta ou alimentar (por exemplo, sabor de laranja artificial ou natural), sabor de menta (por exemplo, sabor de hortelã artificial ou natural) ou água. Em alguns exemplos, a composição liquida pode, adicionalmente, compreender um ou ambos dentre benzoato de sódio e propionato de sódio. Em alguns exemplos, a composição liquida pode, adicionalmente, compreender um ou mais dentre propilparabeno, metilparabeno ou propilenoglicol. Em alguns exemplos, a composição liquida pode, adicionalmente, compreender pseudoefedrina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma (por exemplo, HC1 de pseudoefedrina).

MÉTODOS PARA PREPARAR COMPOSIÇÕES LIQUIDAS [078] Em um aspecto, um método para preparar uma composição liquida revelada no presente documento inclui mesclar uma ou mais microesferas que têm um ou mais agentes ativos com uma solução tixotrópica densa que tem uma densidade que pode ser de ou aproximadamente a densidade da uma ou mais microesferas e um agente tixotrópico, água e um ou mais conservantes sob condições que reduzem a formação de bolha. Em outro aspecto, um método para preparar uma

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91/151 composição liquida inclui mesclar uma mistura que compreende uma ou mais microesferas que compreendem um ou mais agentes ativos, um agente espessante e um tensoativo misturando-se com um impulsor de baixa cavitação e recirculando-se a mistura sob a superfície da mistura de modo a minimizar a formação de bolha. Em outro aspecto, um método para preparar uma composição liquida inclui mesclar uma mistura que compreende um ou mais agentes ativos em um ou sobre um carreador um agente espessante sob condições que minimizam a introdução de ar. As condições que minimizam, reduzem e/ou eliminam a introdução de ar e/ou bolhas de ar incluem uma ou mais dentre as seguintes etapas usadas sozinhas, em combinação e/ou em qualquer ordem: usar uma bomba de

diafragma para	combinar,	por	exemplo, a água	e o agente
tixotrópico e	um ou	mais	conservantes,	corantes e
saborizantes;	colocar o	tubo	de recirculação	abaixo da

superfície do liquido; adicionar líquidos ao longo do lado de um vaso que retém o liquido; salpicar microesferas (por exemplo, uma ou mais microesferas que incluem um ou mais agentes ativos) na superfície do liquido; misturar a solução na ausência de uma ou mais pás que raspam o vaso; misturar a solução com um misturador impulsor; misturar a solução com um misturador impulsionador a uma velocidade que reduz ou minimiza cavitação e combinações de duas ou mais dentre essas etapas. Em outro aspecto, um método para preparar uma

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92/151 composição líquida inclui mesclar uma mistura de uma ou mais microesferas de liberação controlada com um ou mais agentes ativos em um carreador em uma solução que tem uma baixa concentração iônica e um agente tixotrópico, sob condições que minimizam a introdução de bolhas de ar.

[079] Conforme usado no presente documento, o termo tixotrópico pode ser usado para descrever um ou mais agentes, por exemplo, determinados géis, que liquefazem quando submetidos a forças vibratórias como simples agitação e, então, solidificam novamente quando ficam parados. Comportamento tixotrópico pode ser observado quando moléculas de cadeia longa tendem a se orientarem na direção de fluxo; como a força aplicada pode ser aumentada, a resistência ao fluxo pode ser diminuída. Ainda, quando alto estresse de cisalhamento pode ser removido, a solução se reverterá rapidamente para seu estado viscoso original. Algumas celuloses exibem comportamento tixotrópico em que a solução retorna para seu estado viscoso por um período de tempo. Exemplos de agentes tixotrópicos incluem celulose (por exemplo, carboximetilcelulose) , gomas (por exemplo, xantana), colágeno, gelatina e aerogéis.

[080] Em alguns exemplos, quando formulado com partículas, por exemplo, micropartícuias ou nanopartícuias, o perfil de liberação de um ou mais agentes ativos é facilmente adaptado adicionando-se um revestimento, por

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93/151 exemplo, um revestimento de gelatina duro ou mole, um revestimento de amido, um revestimento de resina ou polímero e/ou um revestimento celulósico. Embora sem limitação a microparticulas ou nanoparticulas (como, por exemplo, em microcápsulas ou nanocápsulas), tais formas de dosagem podem ser adicionalmente revestidas com, por exemplo, um revestimento de vedação, um revestimento entérico, um revestimento de liberação prolongada ou um revestimento de liberação atrasada alvejada. Um revestimento pode ser aplicado a um ativo que pode ser comprimido, moldado ou extrudado. Um revestimento pode ser aplicado através de uma dispersão aquosa ou após dissolver em solvente apropriado.

[081] Em alguns exemplos, um carreador revelado no presente documento pode ser completa ou parcialmente biodegradável. Carreadores exemplificativos incluem matrizes ou polímeros permeáveis e semipermeáveis que controlam as características de liberação da formulação. Tais polímeros incluem, por exemplo, acilatos de celulose, e acetatos, assim como os polímeros seletivamente permeáveis formados pela coprecipitação de um policátion e um poliânion. Outros carreadores incluem, por exemplo, amido, amido modificado e derivados de amido, gomas, que incluem porém sem limitação a goma xantana, ácido alginico, outros alginatos, benitonita, veegum, goma ágar, guar, alfarroba, goma arábica, psilio de marmelo, semente de linho, goma de quiabo,

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94/151 arabinoglatina, pectina, agradante, escleroglucano, dextrana, amilose, amilopectina, dextrina, etc., polivinilpirrolidona reticulada, resinas de troca de ion, tal como polimetacrilato de potássio, carragenina (e derivados), goma karaya, goma biossintética, etc. Outros polímeros úteis incluem: policarbonatos (poliésteres lineares de ácido carbônico); materiais microporosos (bisfenol, um poli(vinilcloreto) microporoso, poliamidas microporosa, copolimeros modacrilicos microporosos, estireno acrílico microporoso e seus copolimeros); polissulfonas porosas, poli(vinilideno) halogenado, policloroéteres, polímeros de acetal, poliésteres preparados por esterificação de um ácido dicarboxilico ou anidrido com um poliol de alquileno, poli(alquilenossulfetos) , fenólicos, poliésteres, polímeros porosos assimétricos, polímeros de olefina reticulados, homopolimeros microporosos hidrofílicos, copolimeros ou interpolimeros que têm uma densidade de volume reduzida, e outros materiais similares, poli (uretano), poli (uretano), poli(imidas), poli(benzimidazóis) reticulados de cadeia estendida, colodion, proteínas regeneradas, poli(vinilpirrolidona) reticulada semissólida. Aditivos adicionais e seus niveis, e seleção de um material ou materiais de revestimento primário dependerão das seguintes propriedades: resistência a dissolução e desintegração no estômago; impermeabilidade

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95/151 a fluidos gástricos e fármaco/carreador/enzima enquanto no estômago; capacidade para dissolver ou desintegrar rapidamente no sitio de intestino alvo; estabilidade física e química durante armazenamento; não toxicidade; fácil aplicação como um revestimento (substrato amigável); e econômica praticamente.

TRATAMENTOS E USOS [082] Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para inibir ou eliminar uma ou mais bactérias, que compreende colocar a composição antibiótica revelada no presente documento em contato com a uma ou mais bactérias. Em alguns casos, a presente revelação fornece um método para tratar uma infecção bacteriana, que compreende colocar a composição antibiótica revelada no presente documento em contato com a infecção bacteriana. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias gramnegativas. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos. Em alguns exemplos, a uma ou mais bactérias podem compreender K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli ou qualquer combinação das mesmas. Em alguns exemplos, a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em uma superfície. Em alguns exemplos, a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em um mamífero. Em alguns exemplos, a infecção

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96/151 bacteriana ou uma ou mais bactérias podem estar em um ser humano. Em alguns exemplos, o contato pode ser através de injeção, por exemplo injeção intravenosa ou subcutânea. Em alguns exemplos, o contato pode ser através de aplicação tópica. Em alguns exemplos, o contato pode ser pela boca. Em alguns exemplos, o contato dura por pelo menos cerca de: 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 18 horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, ou um mês. Em alguns exemplos, o contato ocorre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes de hora em hora ou diariamente. Em alguns exemplos, o contato ocorre aproximadamente a cada 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 minutos ou horas diariamente. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode estar em uma única dose unitária. Em alguns exemplos, a quantidade do agente de organosselênio colocado em contato com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias pode ser de cerca de 10 a 100 mg, cerca de 10 a 50 mg, ou cerca de 20 a 30 mg, por exemplo, cerca de 25 mg, por dosagem. Em alguns exemplos, uma quantidade da prata colocada em contato com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias pode ser de cerca de 1 a 20 mg, cerca de 1 a 10 mg, ou cerca de 5 a 7 mg, por exemplo, cerca de 6 mg, por dosagem.

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97/151 [083] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode ser usada para tratar ou prevenir infecções bacterianas ou infecção viral, e em alguns casos, infecções de protozoários. Em alguns exemplos, o tratamento inibe ou elimina uma ou mais bactérias. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser dada como uma medida preventiva (prof ilática) para populações em risco, tal como aqueles com um sistema imune enfraquecido (particularmente em casos de HIV para prevenir pneumonia) , aqueles tomam fármacos imunossupressores, pacientes de câncer e aqueles que passam por cirurgia. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser usada em procedimentos cirúrgicos para ajudar prevenir infecção de incisões feitas. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser usada em profilaxia antibiótica dentária para prevenir bacteremia e consequente endocardite infecciosa. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser usada para prevenir infecção em casos de neutropenia particularmente relacionado câncer.

[084] Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser aplicada por via oral, tópica ou por injeção, por exemplo, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser dada topicamente, por exemplo, para algumas afecções de pele que incluem acne e celulite, ou na forma de colírios na

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98/151 conjuntiva para conjuntivite ou colírios para infecções de ouvido e casos agudos de ouvido do nadador. Em alguns casos, vantagens de aplicação tópica incluem atingir concentração alta e prolongada de antibiótico no local de infecção; reduzir o potencial para absorção sistemática e toxicidade, e volume total de antibiótico necessário são reduzidos, desse modo, também se reduz o risco de mau uso de antibiótico. Em alguns exemplos, a composição antibiótica pode ser aplicada topicamente sobre determinados tipos de feridas cirúrgicos para reduzir o risco de infecções em local cirúrgico.

[085] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento, tal como em uma forma de revestimento, é usada para esterilizar uma superfície. Por exemplo, a composição antibiótica pode ser aplicada em equipamento cirúrgico, e qualquer superfície em contato com equipamento cirúrgico, antes de uma operação. O equipamento específico também pode ser revestido com tal composição antibiótica para prevenir contaminação cruzada de determinados micróbios que poderíam interferir com uma medição a ser tomada com o equipamento. Em alguns casos, a composição antibiótica pode ser aplicada na forma de um filme, folha, líquido, aerossol ou revestimento em uma superfície biológica ou não biológica. Aplicações adicionais podem incluir aderir uma composição antibiótica em um órgão transplantado para prevenir infecção por um patógeno durante

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99/151 um processo de transplante.

[086] Em alguns exemplos, um indivíduo adequado para o tratamento pode ser uma superfície. Em alguns exemplos, um indivíduo adequado para o tratamento pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano, camundongo, rato, porquinho-da-índia, cachorro, gato, cavalo, vaca, porco, ou primata não humano, tal como um macaco, chimpanzé ou babuíno. Em alguns exemplos, o indivíduo pode ser um ser humano. Em alguns exemplos, o indivíduo pode ser um adulto. Em alguns exemplos, o indivíduo pode ser uma criança. Em alguns exemplos, o indivíduo pode ter 2 anos de idade ou mais, 4 anos de idade ou mais, 6 anos de idade ou mais, 12 anos de idade ou mais, ou 18 anos de idade ou mais. Em alguns exemplos, um indivíduo adequado para o tratamento pode ser mais novo que 18 anos de idade, 12 anos de idade ou 6 anos de idade.

[087] Em alguns exemplos, as composições reveladas no presente documento são administradas a um indivíduo aproximadamente a cada 4 a cerca de 6 horas, aproximadamente a cada 12 horas, aproximadamente a cada 24 horas, aproximadamente a cada 48 horas ou mais frequentemente. Em alguns exemplos, uma composição revelada no presente documento pode ser administrada uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes ou mais com mais frequência diariamente. Em alguns

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100/151 exemplos, uma forma de dosagem revelada no presente documento fornece uma concentração plasmática eficaz de um agente ativo de cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos após administração, tal como cerca de: 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 11 min, 12 min, 13 min, 14 min, 15 min, 16 min, 17 min, 18 min, 19 min, 20 min, 21 min, 22 min, 23 min, 24 min, 25 min. Em alguns exemplos, uma forma de dosagem da revelação no presente documento fornece uma concentração plasmática eficaz de um agente ativo de cerca de 20 minutos a cerca de 24 horas após administração, tal como cerca de 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 h, 1,2 h, 1,4 h, 1,6 h, 1,8 h, 2 h, 2,2 h, 2,4 h, 2,6 h, 2,8 h, 3 h, 3,2 h, 3,4 h, 3,6 h, 3,8 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 9 h, 10 h, 11 h, 12 h, 13 h, 14 h, 15 h, 16 h, 17 h, 18 h, 19 h, 20 h, 21 h, 22 h, 23 h, ou 24 h depois da administração. Em alguns exemplos, o agente ativo pode estar presente em uma concentração plasmática eficaz em um indivíduo por cerca de 4 a cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, ou 1 dia a 30 dias, que inclui,

porém, sem	limitação a	1, 2, 3, 4,	5, 6, 7, 8, 9,	10, 12,
12, 13, 14,	15, 16, 17,	18, 19, 20,	21, 22, 23, 24,	25, 26,
27, 28, 29	ou 30 dias.

[088] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias resistentes a múltiplos fármacos. Em

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101/151 alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias gram-positivas ou bactérias gram-negativas. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias grampositivas resistentes a múltiplos fármacos. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias gram negativas resistentes a múltiplos fármacos, que têm não suscetibilidade a pelo menos um agente em três ou mais categorias antimicrobianas. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias, que incluem Bacillus cereus var mycoides, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Aspergillus niger, Aureobasiduim pullulans, Chaetomium globosum, Gliocladium virens, Penicillum funiculosum, Candida albicans, Acinetobacter baumannii, Enterobacteriaceae, cocci, bacilli, enterococci resistente à vancomicina, ou

Saccharomyces cerevisiae. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe ou elimina uma ou mais bactérias gram-negativas, que incluem K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento inibe

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102/151 ou elimina uma ou mais dentre Escherichia coli (E. coii) , Salmonella, Shigella e outros Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bactérias de ácido acético, Legionella, cianobacteria, spirochaetes, bactérias de enxofre verde e de não enxofre verde. Em alguns exemplos, a composição antibiótica revelada no presente documento exibe uma concentração inibidora de 50% (IC50) menor que cerca de: 50 μΜ, 2 5 μΜ, 2 0 μΜ, 10 μΜ, 5 μΜ, 1 μΜ, 0,5 μΜ, 0,1 μΜ, 5 0 ηΜ, 25 ηΜ, 20 ηΜ, 10 ηΜ, 5 ηΜ ou 1 ηΜ para uma ou mais bactérias.

[089] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento trata da infecção causada por um ou mais organismos que são espécies de Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), Streptococcus (por exemplo, Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae), Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Propionibacterium, Chlamydia, Moraxella, Haemophilus e Neisseria. Em alguns exemplos, as espécies são Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Corynebacterium sp., Propionibacterium sp., Moraxella catarrhalis e Haemophilus influenzae.

[090] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento pode ser adequada

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103/151 para administração tópica em um olho, tal como uma forma de colirio ou creme pro olho, sendo que a composição compreende: uma combinação de agentes ativos em concentração eficaz para tratamento e/ou profilaxia de uma infecção bacteriana grampositiva ou gram-negativa de pelo menos um tecido do olho, e pelo menos um excipiente oftalmicamente aceitável que reduz uma taxa de remoção da composição do olho por lacrimação.

[091] Em alguns exemplos, uma composição antibiótica revelada no presente documento penetra ou dissolve um biofilme microbiano. Um biofilme microbiano, também denominado um biofilme biológico, pode ser uma comunidade de células microbianas incorporada em uma matriz extracelular de substâncias poliméricas e aderente a uma superfície biológica ou não biótica. Uma faixa de microorganismos (bactérias, fungos e/ou protozoários, com bacteriófagos associados e outros virus) pode ser encontrada nesses biofilmes. Biofilmes são onipresentes em natureza, são normalmente encontrados em uma faixa ampla de ambientes. Biofilmes são crescentemente reconhecidos pela comunidade cientifica e médica como implicados em diversas infecções, e especialmente sua contribuição na insubmissão de tratamento de infecção. Biofilmes podem ser agentes etiológicos para diversos estados de doença em mamíferos e estão envolvidos 80% das infecções em seres humanos. Exemplos podem incluir infecções de ferida e pele, infecções de ouvido

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104/151 médio, infecções de trato gastrointestinal, infecções de membrana peritoneal, infecções de trato urogenital, infecções orais de tecido mole, formação de placa dentária, infecções oculares (que incluem contaminação de lente de contato), endocardite, infecções em fibrose cistica, e infecções de dispositivos médicos residentes, tais como próteses de articulação, implantes dentários, cateteres e implantes cardíacos. Micróbios em bioflimes podem ser significativamente mais resistentes ao tratamento antimicrobiano do que suas contrapartidas planctônicas. Formação de biofilme não é limitada apenas à capacidade de micróbios em se prenderem a uma superfície. Micróbios que crescem em um biofilme podem interagir mais entre si do que com o substrato físico real em que o biofilme se desenvolveu inicialmente.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Experimentos in vitro

1.1 Resultados

Combinação de prata com ebselen exibiu toxicidade sinérgica seletiva contra bactérias [092] O efeito de nitrato de prata com ebselen em combinação no cultivo de bactérias de modelo gram-negativo, E. coli, foi investigado nas microplacas. Culturas de um dia para o outro de DHB4 foram diluídas 1:1.000 vezes em meio de Luria-Bertani (LB), e tratadas com prata iônica (Ag⁺) como

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105/151 um sal de nitrato (AgNO3) por 16 h. Ag⁺ sozinho inibiu cultivo de E. coli com uma concentração de inibição mínima (MIC) de 42 μΜ após 16 h de tratamento, enquanto a adição de 2 μΜ de ebselen diminuiu drasticamente a MIC de Ag⁺ para 4,2 μΜ (p = 0,000028 < 0,001) (Figura IA). Enquanto isso, 5 μΜ de Ag⁺ e 2,5 μΜ de ebselen, em combinação, não mostraram nenhuma toxicidade sinérgica em células de HeLa humanas (p = 0,98 > 0,05) (Figura 1B). Adicionalmente, a toxicidade de ebselen propriamente (2, 4, 8 μΜ) em células de mamíferos e bacterianas foi similar (Figuras IA e 1B) sem efeito em cultivo bacteriano (Figura 1C). Esses resultados indicam que o tratamento de Ag⁺ com ebselen em combinação exibe toxicidade sinérgica seletiva significativa em bactérias sobre células de mamíferos, e a diminuição drástica de MIC de prata contra bactérias na presença de ebselen torna o uso médico sistemático de prata confiável.

[093] A inibição de cultivo em grande escala de E. coli por Ag⁺ com ebselen em combinação também foi observada em teste de agitação de tubos de 15 ml. Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até um ODsoo nm de 0,4, e tratadas com 5 μΜ de Ag⁺ e concentrações em série de ebselen (0, 20, 40, 80 μΜ) . As curvas de cultivo mostraram um efeito sinérgico de Ag+ com ebselen em combinação em meio de LB (Figura 2A), e o efeito bactericida sinérgico de 5 μΜ de Ag+ e 80 μΜ de ebselen em combinação foi adicionalmente confirmado pelo

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106/151 ensaio de formação de colônia em placas de ágar de LB (Figura 2B). Enquanto isso, apenas 80 μΜ do próprio ebselen poderíam inibir cultivo de E. coli nas primeiras 8 h, e voltar ao normal 12 h após o tratamento. Enquanto 40 μΜ de ebselen ou 5 μΜ de Ag⁺ sozinhos não inibiram cultivo bacteriano, Ag⁺ com ebselen em combinação resultou em forte inibição de cultivo de E. coli (Figuras 2A e 2B). Alinhado com isso, 5 μΜ de Ag+ e 20 μΜ de ebselen, em combinação, aprimoraram a frequência de fingimento com iodeto de propidio (PI) (p = 0,00083 < 0,001) (Figuras 2C e 2D) . PI é um corante fluorescente de membrana impermeável que foi amplamente usado para detectar permeação de membrana celular e células mortas. Acima de tudo, esses resultados indicam que Ag⁺ e ebselen, em combinação, exibiram um efeito sinérgico seletivo em bactérias.

Cinco patógenos gram-negativos MDR dos mais difíceis de tratar clinicamente isolados foram sensíveis a Ag⁺ com ebselen em combinação [094] Há cinco espécies de patógeno gram-negativo MDR mais difíceis de tratar no hospital, que também são bactérias GSH-positivas típicas: Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae e Escherichia coli. Duas cepas de cada espécie foram isoladas, culturas de um dia para o outro foram diluídas 1:1.000 vezes em meio de LB, e tratadas com Ag⁺ com

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107/151 uma concentração em série de ebselen em combinação por 16 h. Os efeitos bactericidas sinérgicos de Ag⁺ com ebselen em combinação contra todas as 10 cepas testadas foram observados (Tabela 1) . Dentre essas cinco espécies, A. baumannii e E. cloacae são cepas resistentes a fármaco muito prontamente formadas, que são necessárias para serem tratadas ou a cefalosporina de quarta geração no hospital, que inclui imipenem, cefepime e cefotaxime, etc. As cepas de A. baumannii (AB-1/2) e E. cloacae (ECL-1) resistentes a imipenem, cefepime e cefotaxime isoladas foram identificadas (Tabela 2, e 3) , e foram sensíveis a Ag⁺ com ebselen em combinação (Tabela 1). Esses resultados indicam que Ag⁺ com ebselen em combinação pode ser 'a gota d'água' que é ativo contra uma faixa de bactérias com resistência existente, que aumentaria a chance correta para terapia empiricamente prescrita, mesmo para infecções resistentes a antibióticos convencionais .

Ag⁺ com ebselen em combinação rompeu diretamente sistemas Trx e GSH bacterianos [095] Visto que se acredita que Ag⁺ e ebselen sejam agentes de alvejamento de tiol, atividade de TrxR ou Trx bacteriana em células foi tratada por Ag⁺ com ebselen em combinação (Figuras 3A e 3B). Enquanto as atividades de TrxR e Trx em extratos de célula não foram influenciadas por Ag⁺ou ebselen sozinhos, 5 μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen em

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108/151 combinação resultaram em uma perda drástica de atividades de TrxR (p = 0,00018 < 0,001) e Trx (p = 0,0036 < 0,01) (Figuras 3A e 3B). Consistente com essa observação, o estado redox de Trxl medido por Western Blot Redox também foi afetado pelo tratamento de Ag⁺ com ebselen em combinação. Trxl estava, em maior parte, em forma reduzida em bactérias não tratadas, que se tornaram oxidadas após tratamento de fármacos em combinação (Figura 3C) . Um anticorpo Trx2 foi usado para detectar Trx2 oxidado no experimento para investigar o efeito de tratamento no estado redox de Trxs. Trx2 reduzido podería não ser detectado por esse anticorpo provavelmente devido ao bloqueio do sítio de reconhecimento. Nenhum dos Trx2 oxidados foi observado após o tratamento, enquanto o Trx2 de diamida oxidada de controle positivo foi detectado (Figura 3D). Esses resultados mostraram que Trx2 foi menos sensível ao tratamento em comparação com Trxl. Adicionalmente, os níveis de proteína de Trx 1 e 2 não foram afetados pelo tratamento de 10 min com Ag⁺ e ebselen em combinação (Figuras 3C e 3D) .

[096] A adição de 5 μΜ de Ag⁺ e 20, 40 ou 80 μΜ de ebselen também diminuiu os níveis de GSH. Cinco μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen em tratamento de combinação reduziram o GSH funcional em 10 min em comparação com o controle (p = 0,000021 < 0,001) (Figura 3E). Ebselen sozinha em 80 e 40 μΜ também reduziu níveis de GSH, embora de maneira menos eficiente que os fármacos correspondentes em combinação na

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109/151 mesma concentração (p = 0,000076 e 0,000029, < 0,01). Em vez disso, nem 5 μΜ de Ag⁺ nem 20 μΜ de ebselen modularam níveis de GSH nas condições testadas em comparação com controle (p = 0,081 e 0,712, > 0,05) (Figura 3E).

[097] Se Ag⁺ com ebselen em combinação diminuiu ou reduziu GSH podería afetar glutationilação S de proteínas foi mais explorado (Figura 3F). Glutationilação S de proteínas foi diminuída em bactérias tratadas com Ag⁺ com ebselen, porém, não naquelas incubadas apenas com 5 μΜ de Ag⁺ ou 20 μΜ de ebselen sozinhos. Assim, a presença de 5 μΜ de Ag⁺ diminuiu a glutationilação S de proteína quando combinada com 20 μΜ de ebselen, o que reflete a perda de GSH (Figura 3F).

[098] Visto que Trx e GSH/Grx são sistemas principais dependentes de tiol, foram investigados os efeitos de Ag⁺ com ebselen em combinação em mutantes redox de E. coli deficientes de sistema Trx ou GSH. Mutantes de E. coli que carecem de componentes de sistema de GSH (gshA~) e que vivem em Trx e TrxR foram mais sensíveis ao tratamento com Ag⁺ e ebselen em comparação com o tipo selvagem (WT) (Tabela 4 a 6) . Todos os resultados mostraram que Ag⁺ com ebselen em combinação tem fortes efeitos sinérgicos em sistemas Trx e GSH bacterianos, e alvejam sistemas dependentes de tiol como uma estratégia antibiótica inovadora.

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Prata inibe irreversivelmente atividades de Trx e TrxR bacterianas [099] As atividades enzimáticas de TrxR e Trxl celulares foram diminuídas enquanto os níveis de proteína correspondentes estavam inalterados pelo tratamento de Ag⁺com ebselen em combinação, o que sugere que TrxR e Trx foram inibidos. Visto que ebselen é um inibidor competitivo reversível conhecido de TrxR bacteriano, o efeito de Ag⁺ na atividade de TrxR e Trx de E. coli foi investigado. Quando 100 nM de TrxR de E. coli de NADPH pré-incubado foram incubados com Ag⁺, o ICso foi de cerca de 50 nM (Figura 4A) , similar ao composto de ouro auranofina. Para detectar se TrxR de E. coli pode ser especificamente inibido por Ag⁺, a enzima foi incubada com Ag⁺ na presença de Trxl de E. coli reduzido, a eficiência inibidora com relação a TrxR diminuiu (Figura 4A) . Isso indicou que Trx também reagiu com Ag⁺ e teve um papel protetor para o TrxR. Espectroscopia de fluorescência verificou adicionalmente que Ag⁺ interagiu com Trxl reduzido e alterou seus espectros de fluorescência (Figura 4B) . A incubação com 1 a 10 μΜ de Ag⁺ aumentou a intensidade de fluorescência de triptofano de 10 μΜ de Trxl. Enquanto isso, a intensidade fluorescente de 10 μΜ de Trxl diminuiu quando tratado com 20 a 100 μΜ de Ag⁺ (Figura 4B). Alinhado com isso, a atividade de Trx diminuiu juntamente com o aumento de concentração de Ag⁺ (Figura 4C) . A inibição

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111/151 de Trxl por Ag⁺ foi irreversível, visto que a atividade de Trxl não foi recuperada após dessalinização (p = 0,00021 < 0,001) (Figura 4D). Isso indicou que Ag⁺ formou um complexo apertado com os grupos sulfidrila em Trwl de E. coli reduzido. Todos esses resultados mostram que prata inibe irreversivelmente as atividades de Trx e TrxR bacterianos.

ROS é um fator determinante para o efeito bactericida sinérgico de Ag⁺ e ebselen [100] Uma função principal de sistemas de GSH e Trx é recuperar ROS para manter o equilíbrio em redox celular redox e proteger contra o estresse oxidante. A inibição do sistema de Trx e a redução de GSH podem ser responsáveis pela elevação de ROS. Para determinar se níveis de ROS aumentados contaram para o efeito bactericida, níveis de ROS foram determinados em células tratadas com Ag⁺ e ebselen. O tratamento com 5 μΜ de Ag⁺ ou 20 μΜ de ebselen sozinho não altera as concentrações de ROS, enquanto a combinação de 5 μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen resultou em níveis aumentados de ROS (p = 0,00012 < 0,001) (Figuras 5A e 5B). Adicionalmente, o aprimoramento de níveis de H2O2 causado pelo tratamento com 5 μΜ de Ag⁺ e 20 μΜ de ebselen em combinação também foi verificado pelo método de Amplex Vermelho (p = 0,00057 < 0, 0001) (Figura 5C) . Adicionalmente, mutantes de E. coli que carecem de componentes OxyR (OxyR~)

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112/151 que prejudicam agrupamentos de desidratase de E. coli a partir de lesão de H2O2 foram mais sensíveis ao tratamento de Ag⁺ e ebselen em comparação com o tipo selvagem (WT) (Tabela 4 a 6). Todos os resultados mostraram que a letalidade de Ag⁺ com ebselen contra bactérias é acompanhada por geração de ROS.

1.2 Materiais e Métodos

Cepas bacterianas [101] Todos os experimentos in vitro foram realizados com Escherichia coli (E. coli) DHB4 e seus fenótipos redox derivados (Tabela 6), e cepas gram-negativas de resistência a múltiplos fármacos (MDR) clinicamente isoladas (Tabelas 2, 3, 7) . Todos os experimentos in vivo foram realizados com E. coli ZY-1 (Tabela 7), que foi isolado a partir da urina do paciente clinico no Hospital First Affiliated da Three Gorges University na Provincia de Hubei, P. R. China, com uma aprovação para pesquisa pelo Comitê de Ética do Hospital First Affiliated da Three Gorges University e um consentimento informado do paciente. A cepa foi completamente identificada e armazenada. Outras cepas gramnegativas MDR clinicamente isoladas (Tabela 2, 3) foram obtidas de pacientes clínicos no Hospital Renmin da Three Gorges University na Provincia de Hubei, PRC, com todas as aprovações e consentes informados.

Antibióticos e produtos químicos

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113/151 [102] Todos os experimentos foram realizados em meio de Luria-Bertani (LB) (EMD millipore). A menos que seja especificado de outra forma, as seguintes concentrações foram usadas para os experimentos antibacterianos com cepas de E. coli e patógenos clínicas: 0, 1, 2, 4, 5, 20, 40, 80 μΜ 2-fenil-l, 2-benzisosselenazol-3(2H)-ona (ebselen) (Daiichi), e 0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μΜ de nitrato de prata (Sigma-Aldrich). Ácido 4-acetamido-4'maleimidilstilbeno-2,2'-dissulfônico (AMS) (Invitrogen), coquetéis inibidores de protease (Roche), ensaio de proteína DC™ (Bio-RAD), iodeto de propídio (PI) (BD Biosciences), TrxR de E. coli DHB4, anticorpo Trxl anti-E. coli de ovelha e anticorpo Trx2 anti-E. Coli de coelho foram da IMCO Corp. (Stockholm, Suécia), IgG-HRP anti-coelho de cabra (Santa Cruz, n° de lote H1015), IgG-HRP anti-cabra de coelho (Southern Biotech, n° lote 12011 a PG56), anticorpo monoclonal de camundongo IgG2a para complexos de glutationa e proteína (VIROGEN, n° de lote 101 a A, número de clone D8), 4 a 12% de gel de Bis-Tris bolt (VWR), todos os outros reagentes foram da Sigma-Aldrich.

Efeito sinérgico de prata com ebselen em combinação em cultivo de E. coli [103] Culturas de um dia para o outro de células de E. coli DHB4 foram diluídas 1:1.000 vezes em meio de Luria

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Bertani (LB) e tratadas com concentrações em série de AgNO3 e/ou ebselen por 16 h. A viabilidade celular foi determinada medindo-se a absorção a 600 nm. A cultura tratada com 0,8% (v/v) de DMSO foi usada como um controle.

Análise de toxicidade de prata com ebselen em combinação contra células de mamíferos [104] Células de HeLa foram adquiridas da ATCC, e através de detecção de micoplasma e autenticação de linha celular humana através de análise de STR (ATCC, E.U.A.). Células de HeLa cultivadas em meio de DMEM complementado com 10% de FCS, 100 unidades/ml de penicilina e 100 μμ/πιΐ de estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2. As células foram semeadas em placas de 96 micropoços e cultivadas até 70 a 80% de confluência. As células foram

tratadas com	combinações em	série	de ebselen e	AgNO3 por	24
h. A toxicidade celular foi	detectada através	do ensaio	de
MTT.
Efeito	antibacteriano	de	prata com	ebselen	em

combinação sinérgica no cultivo de cepas gram-negativas MDR clinicamente isoladas [105] Dez cepas gram-negativas (GSH-positivas) MDR clinicamente isoladas foram cultivadas até um ODsoo nm de 0,4 e foram diluídas 1:100 em 100 μΐ de meio de LB em placas de 96 micropoços. Diluições em série de 100 μΐ de ebselen e AgNO3 foram adicionadas a poços individuais. A concentração

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115/151 inibidora mínima (MIC) foi determinada após 16 h de cultura a 37 °C. A cultura tratada com 0,8% (v/v) de DMSO foi usada como um controle.

Detecção de efeito bactericida de prata com ebselen em combinação em cepas de E. coli [106] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas em 15 ml de tubos até um ODgoo _nm de 0,4, e tratadas com 5 μΜ de AgNO3 e concentração em série de ebselen (0, 20, 40, 80 μΜ) em combinação. A sobrevivência de E. coli não tratado foi comparada com as células tratadas com antibiótico medindose ODsoo nm e contando-se as colônias. Para ensaio de formação de colônia, células foram coletadas em 10 min, 1 h, 2 h, e 4 h através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS. As células foram diluídas em série em PBS, e 100 μΐ de culturas foram colocados em placas de LB. As colônias foram contadas após incubação de um dia para o outro, e UFC/ml foi calculado com o uso da seguinte Fórmula: [(colônias)*(fator de diluição)] / (quantidade em placa).

[107] Adicionalmente, as células cultivadas e lavadas como acima foram coletadas em 10 min através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS. Núcleos foram manchados com 5 pg/ml de iodeto de propídio (PI) por 20 min na ausência de um permeado celular e analisados através de citometria de fluxo (CyAn

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116/151 adp, Beckman coulter).

Medição de atividade de Trx/TrxR e quantidade de GSH em lisados celulares de E. coli tratados com prata e ebselen [108] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção a ODgoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com diluições diferentes de ebselen e AgNO3 por 10 min. Células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, então, as células foram ressuspensas em tampão de lise (25 mM de Tris -HC1, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, 2,5 mM de EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM de Na₃VO₄, 20 mM de β-glicerofosfato de sódio, 10 mM de pirofosfato de sódio, 0,5% de Triton X-100) que contém coquetel inibidor de protease e lisadas através de sonicação. Os lisados celulares foram obtidos através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min e a concentração de proteína foi medida através de ensaio de proteína de Lowry (Bio-Rad DC™) .

[109] Atividade de TrxR de E. coli DHB4 em extratos celulares foi medida através de um ensaio de atividade de redução de DTNB. Os experimentos foram realizados com placas de 96 micropoços na solução que contém 50 mM de Tris -HOI (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, na presença de 5 μΜ de E. coli Trx. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min com um leitor de placa de micropoço VERSA e a inclinação de 2 min inicial foi usada para representar atividade de

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TrxR. A atividade de Trx foi detectada através desse método acoplado com 100 nM de E. coli TrxR em vez de 5 μΜ de E. coli Trx na mistura de reação.

[110] Para medir níveis de GSH, 25 pg dos Usados celulares foram adicionados na solução que contém 50 nM de GR, 50 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min.

Estado redox de Trx em E. coli tratado com prata e ebselen em combinação [111] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção a ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com diferentes diluições de ebselen e AgNO3 por 10 min. Western blotting foi realizado para detectar o estado redox de Trxl e Trx2 das células de E. coli tratadas com ebselen e AgNO3. As células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e precipitaram a proteína com 5% de TCA em 1,0 ml. Os precipitados foram lavados com 1 ml de acetona pré-congelada 3 vezes, e dissolvidos em 50 mM de Tris-HC1 (pH 8,5) com 0,5% de SDS que contém 15 mM de AMS a 37°C por 2 h. Proteínas foram obtidas através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min para remover as pelotas, e a concentração de proteína foi medida através de ensaio de proteína de Lowry (Bio-Rad DC™) .

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Estado redox de Trxl e Trx2 foi detectado com anticorpo Trxl anti-E. coli de ovelha e (anticorpo Trx2 anti-E. coli de coelho) em diluição de 1:1.000, seguido pela detecção de Reagente Quimioluminescência Plus.

Glutationilação S de Proteínas em E. coli tratado com prata e ebselen em combinação [112] Glutationilação S de proteínas total das células de E. coli tratadas com ebselen com AgNO3 em combinação foram detectadas através de Western blotting. Células foram cultivadas e lavadas conforme descrito acima, e ressuspensas em tampão de lise (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, 2,5 mM de EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM de NasVO4, 20 mM de β-glicerofosfato de sódio, 10 mM de pirofosfato de sódio, 0,5% de Triton X-100, coquetel inibidor de protease) que contém 30 mM de IAM. Após lisados pela sonicação, os lisados celulares foram obtidos através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min. A concentração de proteína foi medida através de ensaio de proteína de Lowry (Bio-Rad DC™). Amostras foram incubadas com tampão de carregamento de SDS a 90°C por 10 min e, então, separadas em 4 a 12% de gel de Bis-Tris bolt com tampão de execução de MES (150 V, 40 min) . O ensaio de Western blotting foi realizado com anticorpo monoclonal de camundongo IgG2a (VIROGEN, 101-A/D8) para complexos de glutationa e proteína.

Efeito sinérgico de prata e ebselen no cultivo de

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119/151 fenótipos redox de E. coli DHB4 [113] Onze fenótipos redox de E. coli DHB4 foram cultivados até um ODgoo nm de 0,4 e foram diluídos 1:100 em 100 μΐ de meio de LB em placas de 96 micropoços. Diluições em série de ebselen e AgNO3 foram adicionadas a poços individuais. A concentração inibidora mínima (MIC) foi determinada após 24 h de cultura a 37 °C. A cultura tratada com 0,8% (v/v) de DMSO foi usada como um controle.

Inibição de Trx/TrxR bacteriano recombinante por prata [114] Inibição de TrxR bacteriano recombinante por Prata foi realizada com o uso de enzima de E. coli. Os experimentos foram realizados com placas de 96 micropoços na solução que contém 50 mM de Tris-HC1 (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, na presença de 5 μΜ de E. coli Trx. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min com um leitor de placa de micropoço VERSA e a inclinação de 2 min inicial foi usada para representar atividade de TrxR. A atividade de Trx foi detectada através desse método acoplado com o uso de 100 nM de E. coli TrxR em vez de 5 μΜ de E. coli Trx na mistura de reação.

Análise de espectros fluorescentes [115] Espectros fluorescentes de E. coli Trx reduzido com Prata foram gravados a 10 μΜ em um gravador de múltiplas marcas PerkinElmer Enspire com o uso de uma excitação em 280 nm.

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Medição de produção de ROS [116] As células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODgoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com diferentes combinações de ebselen e AgNO3 por 10 min. Para analisar a quantidade de produção de ROS nas bactérias, células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e manchadas com 5 μΜ de H2DCF-DA por 20 min. Após a incubação, células foram centrifugadas e ressuspensas em PBS, e a produção de ROS foi quantificada através de citometria de fluxo (CyAn adp, Beckman coulter).

Produção de H2O2 [117] As células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção a ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com 20 μΜ de ebselen e 5 μΜ de AgNO3 por 10 min. Células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e sonicadas por 10 s. Na presença de 50 μΜ de reagente Amplex® Vermelho, 0,1 U/ml de HRP em 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4, 50 μΐ de amostras foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente protegidas da luz, e detectadas com absorção a 560 nm (sondas moleculares, Eugene, OR).

Efeito de ebselen em cultivo de E. coli

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121/151 [118] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até um ODsoo nm de 0,4, e tratadas com diluições em série de ebselen (0, 2, 4, 8 μΜ) por 16 h. A viabilidade celular foi determinada medindo-se a absorção a 600 nm. A cultura tratada com 0,8% (v/v) de DMSO foi usada como um controle.

Ensaio de taxa de sobrevivência direta [119] O ensaio de taxa de sobrevivência direta foi realizado para avaliar a capacidade de sobrevivência de cepa de E. coli DHB4 tratada com ebselen e AgNO3 em sangue de camundongos saudáveis. As células tratadas com solução salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7,6) foram usadas como o controle positivo, e o experimento foi realizado duas vezes. Brevemente, o sangue foi extraído de 3 camundongos e coletado em tubos heparinizados. Aproximadamente 100 células de E. coli DHB4 foram coletadas durante a fase logarítmica, lavadas com PBS estéril, e adicionadas a 100 μΐ de sangue. Após incubação a 37 °C por 6 h, alíquotas de 100 μΐ duplicadas de cada amostra sanguínea foram espalhadas em ágar de LB, e as colônias sobreviventes foram enumeradas após incubação de um dia para o outro. Os resultados mostraram que ebselen e AgNO3 poderíam ajudar a imunidade inata a clarear E. coli.

Inibição de TrxR de mamífero recombinante por prata [120] Os experimentos foram realizados com placas de 96 micropoços na solução que contém 50 mM de Tris-HOI (pH 7,5) , 250 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, na presença

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122/151 de 10 nM de E. coli TrxR. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min com um leitor de placa de micropoço VERSA e a inclinação de 2 min inicial foi usada para representar atividade de TrxR.

Análise estatística [121] Os significados de Média, Desvio Padrão (SD) e teste t (duas caudas, não pareadas) foram calculados no Software GrapPad Prism. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001.

Exemplo 2. Experimentos in vivo

2.1 Resultados [122] O efeito bactericida de Ag⁺ com ebselen em combinação também foi observado em meio de LB que contém sangue de camundongos heparinizados. Para investigar se a atividade bactericida de Ag⁺ com ebselen em combinação também é eficiente in vivo, camundongos foram infectados i.p. com 6,0 x 10⁷ ou 1,7 x 10⁶ E. coli ZY-1 MDR (Tabela 7), que molda uma peritonite aguda e uma peritonite leve, respectivamente. O LD50 de E. coli ZY-1 administrado i.p. foi de 1,3 x 10⁷UFC/ml. Uma hora (modelo agudo) ou 24 h (modelo leve) após infecção, os camundongos foram tratados i.p. com ebselen, Ag⁺ ou os fármacos em combinação, ou restantes não tratados. A combinação de Ag⁺ e ebselen resultou em uma redução significativa de carga bacteriana em comparação com o controle no modelo de peritonite leve. Camundongos tratados

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123/151 com ebselen sozinhos ou não tratados mostraram niveis similares de carga de bactérias após 36 h de infecção com 6, 0 x 10⁷ E. coli, enquanto tratamento com Ag⁺ com ebselen em combinação atingiu uma redução de 100 vezes em comparação com o controle (p = 0,0055<0,01) (Figura 6A) . Adicionalmente, 80% dos camundongos tratados com Ag⁺ com ebselen em combinação sobreviveram no modelo de camundongos com peritonite aguda, em comparação com 30% no grupo de controle (Figura 6B). Essas constatações demonstraram o efeito antibacteriano eficaz de Ag⁺ e ebselen contra patógeno gramnegativo MDR in vivo.

[123] Ag⁺ ou ebselen sozinho se mostrou seguro em estudos anteriores. Para testar a toxicidade da combinação, camundongos foram divididos 5 por grupo, que foram tratados com 6 mg de AgNO3/kg de peso corporal em combinação com concentrações em série de ebselen (10, 15, 20, e 25 mg de ebselen/kg de peso corporal). Camundongos foram observados por 7 dias e permaneceram viáveis sem mortalidade. O efeito de 25 mg de ebselen/kg e 6 mg de AgNCç/kg de peso corporal em combinação foi avaliado em camundongos medindo-se o metabólito chave e concentrações de enzima com o uso de um Analisador de Quimica Sanguínea após tratamento por 6, 24 e 48 horas. A densidade de linfócitos e monócitos e algumas enzimas, tais como alanina transaminase em camundongos tratados com Ag⁺ e ebselen em combinação foi reduzida no

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124/151 ponto inicial (6 h); no entanto, seus valores voltam para o normal a 24 h após tratamento (Tabela 8), o que indica que há uma resposta ao estresse após o tratamento inicial. Esses resultados demonstraram que Ag⁺ e ebselen foram não tóxicos para camundongos nas condições testadas.

2.2 Materiais e Métodos

Ensaio de modelo de camundongos com peritonite leve [124] A aprovação do Comitê de Assistência e Cuidados Médicos de Animais da Three Gorges University da China foi obtida antes do uso dos animais para pesquisa. Camundongos machos tipo Kunming de 6 semanas de idade saudáveis (peso corporal de 18 ± 2 g) foram adquiridos pelo Centro Laboratorial de Animals da China, Three Gorges University. Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas individualmente ventiladas (cinco camundongos por gaiola) sob um ciclo de luz negra constante (12 h) em um alojamento animal de SPF convencional e estiveram liberados para acessar comida e água. Cinco camundongos foram amostrados aleatoriamente para examinar a recuperação bacteriana a partir do cérebro, fígado, baço e rim para descartar infecção por E. coli antes da manipulação experimental, e nenhuma bactéria foi detectada.

[125] A experimentação foi realizada em projeto de bloco aleatório e ensaio cego único. 0 tamanho de amostra foi calculado através de análise de potência, e estimado

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125/151 como: tamanho de amostra corrigido = tamanho de amostra/(1 a [% de atrito/100]) . Quarenta e oito camundongos foram divididos em 4 grupos, 12 camundongos/grupo. Inoculação foi realizada através de injeção intraperitoneal de 100 μΐ de 1,7 x 10⁶ de células de E. coli ZY-1 com o uso de uma seringa de calibre 26. O inóculo foi entregue em suspensão com 8% (p/v) de mucina em solução estéril. 24 h após introdução do inóculo, 12 camundongos por grupo receberam tratamentos antibacterianos. 0, 12, 24 e 36 h após infecção, lavagens peritoneais foram realizadas através de injeção de 1,0 ml de solução salina na cavidade intraperitoneal seguido por uma massagem abdominal (100 vezes/camundongo). Subsequentemente, o abdômen foi aberto e 200 μΐ de fluido peritoneal (PF) foi recuperado do peritônio para análise de UFC/ml de E. coli, e UFC/ml foi enumerado. Para a medição de UFC/ml, o fluido peritoneal foi diluido em série em PBS (pH 7,6) . Experimentos são realizados três vezes.

Ensaio de modelo de camundongos com peritonite aguda [126] A experimentação foi projetada em projeto de bloco aleatório e ensaio cego único, e 40 camundongos foram divididos em 4 grupos, 10 camundongos/grupo. Inoculação foi realizada através de injeção intraperitoneal de 100 μΐ de 6,0 x 10⁶ UFC/ml de inóculos de E. coli ZY-1 com o uso de uma seringa de calibre 26. O inóculo foi entregue em suspensão com 8% (p/v) de mucina em solução estéril. 1 h

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126/151 após a introdução do inóculo, 10 camundongos por grupo receberam tratamentos antibacterianos, e os camundongos foram observados por 7 dias para avaliar a sobrevivência geral. Experimentos são realizados duas vezes.

Análise de toxicidade in vivo de prata com ebselen em combinação [127] Cinco camundongos por grupo foram tratados com 6 mg de AgNO3/kg de peso corporal e a concentração em série de ebselen (10, 15, 20, 25 mg de AgNCç/kg de peso corporal) por via intraperitoneal. Camundongos foram observados por 7 dias, e a sobrevivência geral foi calculada.

Análise de amostras sanguíneas [128] Três camundongos por grupo foram tratados com PBS administrado por via parenteral, 25 mg de ebselen/kg de peso corporal em combinação com 6 mg de AgNOs/kg de peso corporal, e veículo. Os animais foram observados por dois dias e a coleta de amostra de sangue retro-orbital foi realizada 6, 24 e 48 h após tratamento. O sangue foi coletado em tubos de teste de sangue inteiro heparinizado e analisado, adicionalmente, pelo Analisador de Química Sanguínea (SYSMEX XE5000).

Análise estatística [129] Os significados de Média, Desvio Padrão (SD) e teste t (duas caudas, não pareadas) foram calculados no Software GrapPad Prism. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p <

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127/151

0,001.

Exemplo 3. Comparação com antibióticos convencionais

3.1 Resultados contra e. Coli

Combinação de prata com determinados antibióticos exibiu toxicidade sinérgica contra e. Coli [130] Os efeitos antibacterianos de nitrato de prata (AgNO3) e nove antibióticos que representam cinco diferentes categorias funcionais (beta-lactamas, aminoglicosídeos, síntese, tetraciclina e macrolídeos) no cultivo de uma bactéria gram-negativa modelo, E. coli, foram investigados nas microplacas de 96 poços. Culturas de um dia para o outro de E. coli DHB4 foram diluídas 1:1.000 vezes em meio de Luria Bertani (LB), e tratadas com diluições em série de prata iônica (Ag⁺) como um sal de nitrato e 9 antibióticos em combinações, separadamente, por 24 h. Ebselen foi usado como o controle positivo, que atuou sinergicamente com prata contra bactérias gram-negativas. Os resultados mostraram aqui que 4 (gentamicina, canamicina, geneticina, tetraciclina) dentre os 9 antibióticos tiveram atividade

sinérgica sobre	cultivo de E.	coli DHB4	(Tabela 9).
Adicionalmente	, o	modelo Bliss foi	usado para	determinar a
natureza dos	efeitos terapêuticos	exibidos	pela prata e
antibióticos	em	combinações. 0	grau de	sinergia foi
quantificado	em	1 e 4 h entre	Ag⁺ e 4	antibióticos

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128/151 (gentamicina, canamicina, geneticina e tetraciclina) em combinações, e os resultados mostraram que Ag⁺ e 4 antibióticos tiveram, de fato, combinações sinérgicas contra E. coli (Figura 7). Todos os resultados apontaram que prata podería aprimorar os efeitos antibacterianos de determinados antibióticos contra bactérias gram-negativas.

ROS foi um fator letal para efeitos bactericidas sinérgicos de Ag⁺ e antibióticos [131] Ag⁺ e ebselen em combinação poderíam induzir um alto nível de ROS, e os efeitos de Ag⁺ e antibióticos em combinações precisam de mais estudos. Portanto, foram determinados níveis de ROS em células tratadas com Ag⁺ e 4 antibióticos em combinações, e Ag⁺ e ebselen em combinação foram usados como um controle positivo. Os resultados mostraram que o tratamento com 5 μΜ de Ag⁺ e 8 0 μΜ de antibióticos, em combinações, resultou em níveis aumentados de ROS (p < 0,0001) (Figura 8A). Adicionalmente, o aprimoramento de níveis de H2O2 causado pelo tratamento com 5 μΜ de Ag⁺ e 80 μΜ de antibióticos, em combinações, também foi verificado pelo método de Amplex Vermelho (p < 0,0001) (Figura 8B). Os resultados demonstraram que ROS foi um dos fatores determinantes para efeitos bactericidas sinérgicos de Ag⁺ e antibióticos em combinações contra E. coli.

Ag⁺ e antibióticos poderíam romper o sistema de Trx

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129/151 bacteriano [132] Uma função principal de sistemas antioxidantes dependentes de tiol é recuperar ROS para manter o equilíbrio em redox celular redox e proteger contra o estresse oxidante. A inibição do sistema de Trx e a redução de GSH podem ser responsáveis pela elevação de ROS. Ag⁺ e ebselen em combinação provou alvejar ambos os sistemas Trx e GSH bacterianos, enquanto os efeitos de Ag⁺ e antibióticos em combinações precisam de mais estudos. E. coli DHB4 cultivada em ODsoonm de 0,4 foi tratada com 5 μΜ de Ag⁺ e 80 μΜ de antibióticos em combinações, e Ag⁺ e ebselen em combinação foram usados como um controle positivo. Resultados mostraram aqui que após 10 min de tratamento, a atividades de Trx em extratos celulares tratados por Ag⁺ e antibióticos em combinações foram drasticamente inibidos em comparação com antibióticos ou grupo de controle (Figura 9A, p < 0,001); enquanto isso, as atividades de TrxR em extratos celulares tratados por Ag⁺ e antibióticos em combinações também foram estatisticamente diminuídos em comparação com antibióticos ou grupo de controle (Figura 9B, p < 0,05) . Os mesmos resultados foram obtidos quando o tempo de tratamento foi prolongado para 60 min. Esses resultados sugeriram que prata e antibióticos em combinações têm influência direta em Trxl.

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130/151 [133] Consistente com essa observação, o estado redox de Trxl medido por Western Blot Redox também foi afetado por Ag⁺ e antibióticos em combinações após 60 min de tratamento. Trxl estava em forma reduzida em bactérias não tratadas, e se tornou oxidado após o tratamento por Ag⁺ e antibióticos em combinações (Figura 9C) . Em contraste, apenas 10 min de tratamento por Ag⁺ e antibióticos em combinações poderíam não provocar oxidação de Trxl. Ao mesmo tempo, os níveis de proteína total de Trxl não foram afetados depois de um tratamento de 10 min ou 60 min por Ag⁺ e antibióticos em combinações. Esses resultados mostraram que ao alvejar sistema de Trx, prata e antibióticos, em combinações, não atuam tão rápido quanto prata e ebselen. Todos os resultados mostraram que prata e antibióticos em combinações tiveram influência direta no sistema de Trx.

Ag⁺ e antibióticos convencionais não poderíam romper diretamente o sistema de GSH bacteriano [134] 5 μΜ de Ag⁺ e 80 μΜ de ebselen em combinação também provou reduzir o GSH após 10 min de tratamento. Nesse estudo, apenas 5 μΜ de Ag⁺ e 80 μΜ de gentamicina ou canamicina, em combinações, podería reduzir levemente a quantidade de GSH total em extratos celulares em comparação com os próprios antibióticos (p < 0,05) (Figura 10A) , enquanto isso, outras combinações não mostraram diferenças

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131/151 (Figura 10B) (p > 0,05) . Os mesmos resultados foram obtidos quando o tempo de tratamento foi prolongado em 60 min (Figuras 11A e 11B). Adicionalmente, a glutationilação S de proteína foi diminuída em bactérias tratadas com Ag⁺ e ebselen em combinação, porém, não naquelas incubadas com 5 μΜ de Ag⁺ e antibióticos em combinação para tratamentos de 10 min (Figura 10B) ou 60 min (Figura 11B).

[135] Todos os resultados acima sugeriram que a prata e antibióticos convencionais não tiveram efeito direto sobre o sistema de GSH bacteriano ao atuar contra bactérias gram-negativas. 4 dentre os 9 antibióticos convencionais atuaram sinergicamente com prata contra E. coli, uma bactéria gram-negativa modelo (Tabela 9), que pode ocorrer através de um alvejamento direto de Trx e TrxR e que induz produção de ROS (Figuras 8A a 8B, e 9A a 9C), porém, não no teor de GSH (Figuras 10A a 10B e 11A a 11B) . O efeito sinérgico veio junto com a produção de espécies de oxigênio reativas.

3.2 Resultados contra cinco patógenos gram-negativos MDR [136] Os quatro antibióticos convencionais identificados em 3.1 foram mais estudados em comparação com ebselen em combinação com prata. Ao usar cepas clinicamente isoladas de K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae e E. coli, apenas ebselen em 4 μΜ, dentre os cinco antibióticos reduziu a MIC de prata drasticamente.

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Cinco patógenos gram-negativos MDR mais difíceis de tratar clinicamente isolados foram altamente sensíveis a apenas Ag⁺ e ebselen em combinações [137] Há cinco espécies de patógenos gram-negativos MDR mais difíceis de tratar clinicamente isolados: Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae e Escherichia coli. Uma cepa de cada espécie foi isolada, e culturas de um dia para o outro foram diluídas 1:1.000 vezes em meio de LB, e tratada com concentrações em série de Ag⁺ e antibióticos em combinações por 24 h (Tabela 10) . Os resultados mostraram que Ag⁺ e antibióticos em combinação exibiram efeitos antibacterianos fracos nessas bactérias gram-negativas MDR, enquanto isso, Ag⁺ e ebselen em combinação podem ser o único antibiótico eficaz contra uma faixa de bactérias resistentes. Os resultados podem ser explicados pelo fato de que prata e antibióticos em combinação poderíam apenas romper diretamente o sistema de Trx, porém, não ambos os sistemas de Trx e GSH.

[138] Embora prata e 4 diferentes antibióticos em combinações poderíam inibir diretamente Trx e TrxR, ainda, o efeito direto que alveja o sistema de GSH não é universal. A presença do sistema GSH-Grx em E. coli pode ser com relação a uma reserva para o sistema de Trx. GSH/Grxs em E. coli

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133/151 participam no processo antioxidante através de desglutationilação e transferem elétrons para ribonucleotídeo redutase. Prata e quatro antibióticos convencionais em combinações não mostraram efeitos sobre a quantidade de GSH, e as proteínas S glutationiladas não são muito diferentes daquelas no grupo de controle (Figura 10). Assim, isso pode explicar que as atividades de bactérias gram-negativas anti-MDR de prata e antibióticos em combinações foram muito mais fracas que prata e ebselen em combinação.

3.3 Materiais e Métodos

Cepas bacterianas [139] Todos os experimentos in vitro foram realizados com Escherichia coli (E. coli) DHB4, e cepas gramnegativas de resistência a múltiplos fármacos (MDR) clinicamente isoladas mostradas abaixo. Cepas gram-negativas MDR clinicamente isoladas foram obtidas de pacientes clínicos no Hospital Renmin da Three Gorges University na Província de Hubei, PRC, com todas as aprovações e consentes informados.

Cepas gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos clinicamente isoladas usadas nesse trabalho

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134/151

Cepa	Descrição
KP-2	K. pneumonia subespécie pneumonia n° 0322#
AB-1	Acinetobacter baumannii (A. baumannii) n° H#
PA-1	Pseudomonas aeruginose (P. aeruginose) n° 1298#
ECL-2	E. cloacae n° 2301#
ECO-1	Escherichia coli (E. coli) n° 1139#

Sensibilidade de fármaco de bactérias gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos isoladas clinicamente

Antibiótico	KP-2 AB-1	PA-1	ECL-2	ECO-1
Amicaci na.	S	R	S	S	s
Ampicilina	R	R	R/S	/	s
Aztreonam	R	R	R	R	R
Cefazolina	R	R	R	/	R
Cefepima	R	R	R	R	R
Cefotaxima	R	R	R	R	R
Ceftazidima	R	R	R	R	R/S
C1 o r a n f e n 1 c o 1	R	R	/	R	S
C1 p r o f 1 o x a c i n a	R	R	R	R	R
G e n *ú a m i c .1. n a.	R	R	S	R	S
Imipenem	S	R	S	R	S
L e v o f 1. o x a c i n a	R	R	R	R	R
Meropeném	S	R	R	R	S
Piperacilina	R	R	R/S	R	R
Polimixina	/	S	S	S	/
Sulbactam	R	R	/	/	R/S
Sulfanilamide	R	/	R	R	R
Tazobactam	R	R	R/S	R	S
Tetraciclina	R	R	R	R	R
*R: resistente; S	: sensível.
Antibióticos	e	produtos	guímicos

[140] Todos os experimentos foram realizados em

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135/151 meio de Luria Bertani (LB) (EMD milipore), 2-fenil-l, 2benzisosselenazol-3(2H)-ona (ebselen) (Daiichi), 9 antibióticos: ampicilina, carbenicilina, gentamicina, estreptomicina, geneticina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina, eritromicina, nitrato de prata (SigmaAldrich) , maleimida de metoxipolietilenoglicol (MeO-PEG-Mal) (Sigma-Aldrich), iodoacetamida (IAM) (Sigma-Aldrich), coquetéis inibidores de protease (Roche), N-acetilcisteina (NAG) (Sigma-Aldrich), ensaio de proteína DC™ (Bio-RAD), TrxR de E. coli DHB4, anticorpo Trxl anti-E. coli de ovelha foi da IMCO Corp. (Stockholm, Suécia; http://www.imcocorp.se), IgG-HRP anti-ovelha de coelho (Santa cruz), anticorpo monoclonal de camundongo IgG2a para complexos de glutationa e proteína (VIROGEN), 4 a 12% de gel de Bis-Tris bolt(VWR), todos os outros reagentes foram da Sigma-Aldrich.

Antibióticos usados no estudo com suas dosagens e alvos primários

Antibiótico	Abreviação	Dose (μΜ) usada	Alvo primário
Ampicilina	Amp	0/1/2/4	Formação de parede celular
Carbenicilin a	Car	0/1/2/4	Formação de parede celular
Cloranfenico 1	Cio	0/1/2/4	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 50S
Eritromicina	Eri	0/1/2/4	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 50S

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Gentamicina	Gent	0/1/2/4/80	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 30S
Geneticina	Gene	0/1/2/4/80	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 30S
Canamicina	Can	0/1/2/4/80	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 30S
Estreptomici na	Estr	0/1/2/4	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 30S
Tetraciclina	Tet	0/1/2/4/80	Síntese de proteína, subunidade ribossômica 30S

Efeito antibacteriano sinérgico de prata e antibióticos em combinações no cultivo de E. coli DHB4 [141] E. coli DHB4 do estoque congelado foi cultivado de um dia para o outro a 37 °C, 400 rpm. A cultura de um dia para o outro foi diluída 1:100 com 5 ml de meio de LB em tubos de 15 ml e incubada a 37°C em 400 rpm. Células foram cultivadas até um ODsoo nm de 0,4 e foram usadas para tratamento antibiótico. Brevemente, células foram diluídas 1:1.000 em 100 μΐ de meio de LB em placas de 96 micropoços. Diluições em série de 100 μΐ de antibióticos (0, 1, 2, 4 μΜ) e nitrato de prata (AgNO3, 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μΜ) foram adicionadas aos poços individuais. A concentração de inibição mínima (MIC) foi determinada como a concentração mais baixa de fármacos que inibiram 90% de crescimento em comparação com as células não tratadas após 24 h de cultura a 37 °C. As culturas tratadas com as mesmas diluições em série de 100 μΐ de ebselen e nitrato de prata foram usadas

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137/151 como o controle positivo.

Quantificar sinergia de ebselen e prata com o uso do modelo bliss [142] Sinergismo de fármaco foi determinado com o uso do Modelo de Independência de Bliss, que calcula um grau de sinergia com o uso da seguinte Fórmula: S = (fxo/foo) (foy/foo) - (fxy/foo) , em que f_XY se refere à taxa de cultivo de tipo selvagem na presença dos fármacos combinados a uma concentração X, para um dos fármacos, e Y para os outros; fxo e fox se referem às taxas de cultivo de tipo selvagem na presença dos fármacos individuais em uma concentração de X e Y, respectivamente; foo se refere à taxa de cultivo de tipo selvagem na ausência de fármacos; e S corresponde ao grau de sinergia, um parâmetro que determina uma interação sinérgica para valores positivos e uma interação antagônica para aqueles negativos. Taxas de cultivo em pontos no tempo diferentes são determinadas calculando-se a inclinação da curva de cultivo ou eliminação que é analisada ¹⁸.

Medição de produção de ROS [143] As células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODsoo m de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com prata e antibióticos em combinações por 10 min. Para analisar a quantidade de

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138/151 produção de ROS nas bactérias, células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e manchadas com 5 μΜ de H2DCF-DA por 20 min. Após a incubação, células foram centrifugadas e ressuspensas em PBS, e a produção de ROS foi quantificada através de citometria de fluxo (CyAnadp, Beckman coulter).

Medição de Produção de H2O2 [144] As células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com prata e antibióticos em combinações por 10 min. Células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e sonicadas por 10 s. Na presença de 50 μΜ de reagente Amplex® Vermelho, 0,1 U/ml de HRP em 50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4, 50 μΐ de amostras foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente protegidas da luz, e detectadas com absorção a 560 nm (sondas moleculares, Eugene, OR).

Medição de atividades de Trx/TrxR e quantidade de GSH em lisados de célula de E. coli tratados com antibióticos e prata [145] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células

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139/151 bacterianas foram tratadas com 80 μΜ de antibióticos e 5 μΜ de AgNO3 por 10 e 60 min, respectivamente. As culturas tratadas com 80 μΜ de ebselen e 5μΜ de AgNO3 foram usadas como o controle positivo. Células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, então, as células foram ressuspensas em tampão de lise (25 mM de Tris-HC1, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, 2,5 mM de EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM de Na₃VO₄, 20 mM de β-glicerofosfato de sódio, 10 mM de pirofosfato de sódio, 0,5% de Triton X-100) que contém coquetel inibidor de protease e lisadas por sonicação. Os lisados celulares foram obtidos através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min e as concentrações de proteína medidas através do ensaio de proteína de Lowry.

[146] Atividade de TrxR de E. coli DHB4 em extratos celulares foi medida através de um ensaio de atividade de redução de DTNB ²³. Os experimentos foram realizados com placas de 96 micropoços na solução que contém 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB, na presença de 5 μΜ de E. coli Trxl. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min com um leitor de placa de micropoço VERSA e a inclinação de 2 min inicial foi usada para representar atividade de TrxR. A atividade de Trx foi detectada por esse método acoplado com 100 nM de E. coli TrxR em vez de 5 μΜ de E. coli Trx na mistura de reação.

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Para medir niveis de GSH, 25 pg dos lisados de célula foram adicionados na solução que contém 50 nM de GR, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 200 μΜ de NADPH, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTNB. A absorção a 412 nm foi medida por 5 min.

Estado redox de Trxl em E. coli tratado por prata e antibióticos em combinações [147] Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com 80 μΜ de antibióticos e 5 μΜ de AgNO3 por 10 e 60 min, respectivamente. As culturas tratadas com 80 μΜ de ebselen e 5μΜ de AgNO3 foram usadas como o controle positivo. Western blotting foi realizado para detectar o estado redox de Trxl das células de E. coli tratadas. As células foram coletadas através de centrifugação a 6.000 rpm por 5 min e completamente lavadas 3 vezes com PBS, e precipitaram a proteína com 5% de TCA em 1,0 ml. Os precipitados foram lavados com 1 ml de acetona pré-congelada em 3 vezes e dissolvidos em 50 mM de Tris-HCI (pH 8,5) com 0,5% de SDS que contém 15 mM de MeO-PEG-Mal a 37°C por 2 h. Proteínas foram obtidas através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min para remover as pelotas, e a concentração de proteína foi medida através do ensaio de proteína de Lowry. Proteínas foram incubadas com tampão de carregamento de SDS a 90°C por 10 min e, então,

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141/151 separadas em 4 a 12% de gel de Bis-Tris bolt com tampão de execução de MES (150 V, 40 min). O estado redox de Trxl foi detectado com anticorpo Trxl anti-E. coli de ovelha em diluição de 1:1.000, seguido pela detecção de Reagente de Quimioluminescência Plus.

Glutationilação S de Proteínas em E. coli tratada por prata e antibióticos em combinações [148] Glutationilação S de proteína total de células de E. coli tratadas com antibióticos e AgNO3 em combinações também foi detectada por Western blotting. Células de E. coli DHB4 foram cultivadas até a absorção em ODsoo nm de 0,4 em meio de LB, e as células bacterianas foram tratadas com 80 μΜ de antibióticos e 5 μΜ de AgNO3 por 10 e 60 min, respectivamente. As culturas tratadas com 80 μΜ de ebselen e 5μΜ de AgNO3were foram usadas como o controle positivo. Células foram lavadas 3 vezes, e ressuspensas em tampão de Use (25 mM de Tris-HC1, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2,5 mM de EDTA, 2,5 mM de EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM de Na₃VO₄, 20 mM de β-glicerofosfato de sódio, 10 mM de pirofosfato de sódio, 0,5% de Triton X-100, coquetel inibidor de protease) que contém 50 mM de IAM. Após Usados por sonicação, os Usados de célula foram obtidos através de centrifugação a 13.000 rpm por 20 min. A concentração de proteína foi medida através de ensaio de proteína de Lowry, e o ensaio de Western blotting foi realizado conforme descrito acima com anticorpo

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142/151 monoclonal de camundongo IgG2a (VIROGEN, 101 a A/D8) para complexos de glutationa e proteína S.

Efeitos antibacterianos de antibióticos e prata sobre o cultivo de bactérias gram-negativas MDR clinicamente isoladas

[149	] Cinco cepas	gram-negativas	MDR	clinicamente
isoladas	foram cultivadas	até	Um. OÜ600 nm	de	0,4 e	foram
diluídas	1:1.000 em 100 μΐ	de	meio de LB	em	placas	de 9 6

micropoços. Diluições em série de 100 μΐ de antibióticos (0, 1, 2, 4 μΜ) e AgNO3 (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 μΜ) em combinações foram adicionadas aos poços individuais.

A MIC foi determinada após 16 h de cultura a 37 °C. As culturas tratadas com as mesmas diluições em série de 100 μΐ de ebselen e nitrato de prata foram usadas como o controle positivo.

Análise estatística [150] Os significados de Média, Desvio Padrão (SD) e teste t (duas caudas, não pareadas) foram calculados no Software Grap Pad Prism. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001.

Tabela 1. MIC de Prata (μΜ) na presença de ebselen contra diferentes espécies gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos

Ebsel MIC de prata (μΜ) na presença de ebselen contra Outros

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143/151 en espécies gram-negativas resistentes a múltiplos (μΜ) fármacos

Õ

	KP- 1	KP- 2	AB- 1	AB -2	PA- 1	PA- 2	ECL -1	ECL -2	ECO-1	ECO- 2	ECO -3	ECO- 4
	80	80	80	80	80	80	80	80	40	80	40	40
1	80	40	80	80	80	80	40	40	20	80	40	20
2	40	20	40	40	20	40	20	40	10	40	20	10
4	10	20	10	20	20	20	20	10	5	10	10	5

KP-1: Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) subespécie pneumoniae n° 13; KP-2: K. pneumoniae subespécie pneumoniae n° 0322; AB-1: Acinetobacter baumannii (A. baumannii) n° H;

AB-2: A. baumannii n° 0361; PA-1: Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) n° 1298; PA-2: P. aeruginosa n° 0009; ECL-1: Enterobacter cloacae (E. cloacae) n° 0431; ECL-2: E. cloacae n° 2301; ECO-1: Escherichia coli (E. coli) n° 1139; ECO-2: E. coli n° 2219; ECO-3: E. coli ZY-1; ECO-4: MG1655 (ATCC

700926).

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Tabela 2. Cepas gram-negativas resistentes a múltiplos fármacos isoladas clinicamente

Cepa	Descrição
KP-1	Klebsiella pneumonia (K. pneumonia) subespécie pneumonia ⁿ°13
KP-2	K. pneumonia subespécie pneumonia ⁿ°0322
AB-1	Acinetobacter baumannii (A. baumannii) n° H
AB-2	A. baumannii ⁿ°0361
PA-1	Pseudomonas aeruginose (P. aeruginose) n° 1298
PA-2	P. aeruginose n° 0009
ECL-1	Enterobacter cloacae (E. cloacae)) n° 0431
ECL-2	E. cloacae n° 2301
ECO-1	Escherichia coli (E. coli) n°¹¹³⁹
ECO-2	E. coli n°²²¹⁹
WZ11	E. coli ZY-1
MG1655	ATCC 700926
Tabela 3. Sensibilidade de fármaco de cepas gram-
negativas	resistentes a múltiplos fármacos isoladas

clinicamente
Antibióti _Kp_i CO	KP- 2	AB- 1	AB- 2	PA- 1	PA- 2	ECL1	ECL- 2	ECO1	ECO- 2	ECO- 3

Amicacina	R	S	R	R	S	R	S	S	S	S	S
Ampicilin a	R	R	R	R	R/S	R	/	/	S	R	S
Aztreonam	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R	S
Cefazolin
a	R	R	R	R	R	R	/	/	R	R	S
Cefepima	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R	S
Cefotaxim
a	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R	S
Ceftazidi
ma	R	R	R	R	R	R	R	R	R/S	R	S
Cloranfen
icol	R	R	R	R	/	R	R	R	S	S	S

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Ciproflox acina	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R
Gentamici na	R	R	R	R	S	R	R	R	S	R	S
Imipenem	R	S	R	R	S	/	S	R	S	S	S
Levofloxa cina	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R	/
Meropeném	R	S	R	R	R	R/S	S	R	S	S	S
Piperacil ina	R	R	R	R	R/S	R	R	R	R	R	S
Polimixin a	/	/	S	S	S	S	R	S	/	/	/
Sulbactam	R	R	R	/	/	/	/	/	R/S	R	S
Sulfanila mi da	S	R	/	S	R	R	R	R	R	R	R
Tazobacta m	R	R	R	R	R/S	R	S	R	S	R/S	S
Tetracicl ina	S	R	R	R	R	R	R	R	R	S	S

*R: resistente; S: sensível.

Tabela 4. MIC de prata (μΜ) na presença de ebselen contra mutantes de E. coli DHB4

MIC de prata (μΜ) na presença de ebselen contra mutantes redox de Escherichia coli DHB4

Ebsele

n (μΜ) 0	_ WT	trxA	trxB	trxC	trxA ~B~C~	oxiR~	gshA	trxA gshA~	gor	. gorgrxA B~C~	grxA trxA
	40	40	40	40	40	20	20	20	40	20	20
1	10	10	10	10	10	5	5	5	10	10	10
2	5	2,5	2,5	5	2,5	1,25	2,5	2,5	5	2,5	2,5
4	1,2 5	1,25	0, 62 5	1,2 5	1,25	0, 62 5	0, 625	0, 62 5	1,2 5	0, 62 5	0, 62 5

Tabela 5. MIC de ebselen (μΜ) na presença de prata contra mutantes de E. coli DHB4

Prat MIC de ebselen (μΜ) na presença de ebselen contra mutantes

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a (μΜ) 0	redox de Escherichia coli DHB4	trxA~ gshA~	gor	gor~ grxA~ B~C~	grxA trxA
WT	trx A-	trxB	. _ trxA trxC~ „ _ ~B~C~	gshA oxiR~ 7
	80	80	80	80 80	40	40	40	80	40	40
0,62 5	8	8	8	8 8	4	4	4	8	8	8
1,25	4	4	2	4 4	2	2	2	4	2	2
2,5	4	2	2	4 2	2	2	2	2	2	2
5	2	1	1	2 1	1	1	1	1	1	1
10	1	1	0,5	1 0,5	0,5	0,5	0,5	1	0,5	0,5
20	0,5	0,5	0,5	0,5 0,5	0	0	0	0,5	0	0
40	0	0	0	0 0	0	0	0	0	0	0
	Tabela 6.	Fenbtipos redox de	Escherichia coli DHB4

Genótipo

Cepa

	DHB4 (F' lac-pro lacl⁰/ Δ (ara-leu) 7697	araD139
Tipo selvagem	AlacX74 galE galK rpsL phoR Δ (phoA) Pvul	I AmalF3
trxA~	thi) DHB4 AtrxA
trxB~	DHB4 trxB:: Kan
trxC~	DHB4 AtrxC
trxA~trxB~ trxC~	DHB4 AtrxA AtrxC trxB::Kan nadB::Tn
oxiR~	DHB4 oxiR::Kan
gshA~	DHB4 gshA20::Kan
trxA~gshA~	DHB4 AtrxA gshA20::Kan
gor~	DHB4 gor522...mini-TnlOTc
gor~grxA~B~C~	DHB4 gor522gxA::Kan grxB::Kan mini-TnlOTc	grxC::Cm
grxA~trxA~	DHB4 AtrxA grxA::Kan
Tabela	7. Sensibilidade de fármaco de E.	coiizy-i
isolado clinicamente
Antibiótico	ZY-1
Amicacina	s
Ampicilina	s

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Aztreonam S Cefazolina S Cefepima S Cefotaxima S Ceftazidima S Cloranfenicol S Ciprofloxacins S Gentamicins S Imipenem S Levofloxacina S Meropeném S Piperacilina S Polimixina / Sulbactam S Sulfanilamida R Tazobactam S Tetraciclina R

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148/151

Tabela 8. Análise de amostras sanguíneas a partir de tratamento de camundongos com ou sem <0 <0 ω <0 <0 (Ü (Ü ís <d +1 +1 +1 +1

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149/151

ί4 ί4 φ φ Í4

Φ £ Η μ

Ρ ο

tn

Ο £ g Η

Φ

-Η ο ω

Φ

Ρ ω

Φ m

Φ

Ή ο

-Η ω

ο φ

ω ο ω ο

-Η υ

Ό £

Ο g

£

Ο S ο

-Η υ Ό 44 £ Η g

1-4

Φ

Ή

Ο

Φ £

PLT: plaquetas; MPV: volume de plaqueta médio; PDW: largura de distribuição de plaqueta; PCT:

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150/151 plaquetócrito; P-LCC: contagem de plaqueta grande; P-LCR: razão de plaqueta grande; RBC:

Ebselen. Estreptomicina: 4 + 40, 8 + 40, 16 + 40, nenhum efeito sinérgico.

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Tabela 10. MIC de prata (μΜ) na presença de diferentes antibióticos contra bactérias gram-

Claims

1. Composição antibiótica caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica compreende um agente contendo prata e um agente de organosselênio.

2. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente contendo prata compreende um ion de prata.

3. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o agente contendo prata compreende nitrato de prata.

4. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o agente contendo prata compreende citrato de di-hidrogenio de prata.

5. Composição antibiótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o agente de organosselênio compreende um composto selenazol.

6. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o agente de organosselênio compreende um composto de benzoisosselenazol3- (2H)-ona.

7. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o agente de organosselênio compreende um ebselen.

8. Composição antibiótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a

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2/8 composição antibiótica está em uma forma de dosagem liguida.

9. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de gue a composição antibiótica está em uma forma de dosagem de uma solução ou uma suspensão.

10. Composição antibiótica, de acordo com gualguer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de gue uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica é de cerca de 0,5 a 50 μΜ, cerca de 1 a 25 μΜ, ou cerca de 1 a 10 μΜ.

11. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 10, 1)2 03 03 7 pelo fato de gue uma concentração do agente contendo prata na composição antibiótica é de cerca de 5 μΜ.

12. Composição antibiótica, de acordo com gualguer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de gue uma concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica é de cerca de 4 a 25 μΜ, cerca de 30 a 200 μΜ, cerca de 30 a 150 μΜ, ou cerca de 30 a 100 μΜ.

13. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de gue a concentração do agente de organosselênio na composição antibiótica é de cerca de 40 μΜ ou cerca de 80 μΜ.

14. Composição antibiótica, de acordo com gualguer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de gue o

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3/8 agente contendo prata e o agente de organosselênio estão a uma relação molar de cerca de 1:2 a cerca de 1:20.

15. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o agente contendo prata e o agente de organosselênio estão a uma razão molar de cerca de 1:4, 1:8 ou 1:16.

16. Composição antibiótica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica exibe um valor IC50 de cerca de 10 a 100 nM para uma ou mais bactérias Gram-negativas.

1 / . Composição anmoiótica., de acordo com a. reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica apresenta um valor de IC50 de cerca de 50 nM ou inferior a uma ou mais bactérias Gram-negativas.

18. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que uma ou mais bactérias Gram-negativas compreendem K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E. cloacae, E. coli, ou qualquer combinação das mesmas.

19. Composição antibiótica, de acordo com qualquer uma G ci üó -ú θ X/ ndicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica compreende AgNCn e ebselen.

20. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica compreende 5 μΜ de AgNOs e 4 μΜ de ebselen em

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4/8 forma de dosagem liquida.

21. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica compreende 5 μΜ de AgNOs e 20 μΜ de ebselen em forma de dosagem liquida.

22. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antibiótica compreende 5 μΜ de AgNOs e 40 μΜ de ebselen em forma de dosagem liquida.

23. Composição antibiótica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que st composição antibiótica compreende 5 μΜ de AgNOs e 80 μΜ de ebselen em forma de dosagem liquida.

24. Formulação farmacêutica caracterizada por compreender a composição antibiótica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

25. Método de inibição ou morte de uma ou mais bactérias caracterizado por compreender o contato da composição antibiótica conforme definida em. qualquer uma das reivindicações 1 a 23 com uma ou mais bactérias.

26. Método para tratar uma infecção bacteriana caracterizado por compreender contatar a composição antibiótica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 com a infecção bacteriana.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26,

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5/8 caracterizado pelo faro de que uma ou mais bactérias compreendem uma ou mais bactérias

Gram-negativas.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais bactérias c o mp r e e n de m uma

Gram-negativas mu 11 i r re si s tentes.

29.

Método, ie acordo com a reivindicação caracterizado pelo fato de que uma ou mais bactérias compreendem K. pneumonia, A. baumannii, P. aeruginosa, E.

cloacae, E. coli, ou qualquer combinação das mesmas.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana ou as uma ou mais bactérias estão em uma uperri

31. Métod

CJ.P¹ com qualquer reivindicações 25 a 30, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana ou as uma ou mais bactérias estão em um mamífero.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana ou as uma ou mais bactérias estão em um humano.

Métod com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que o contato é por injeção.

34. Método, de acordo com reivindicação 33,

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6/8 caracterizado pelo fato de que ontato é por injeçãc intravenosa ou subcutânea.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que o contato é por aplicação tópica.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que o contato é por administração oral.

Métod de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 36 caracterizado pelo fato de que o contato dura pelo menos cerca de: 1 minuto

2 minutos minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 segundos, minutos, 1 hora, 2 horas,

3 horas

4 horas, 5 horas,

6 noras, horas, 8 horas, 9 horas, 10 noras, 11 horas, 12 noras, 18 horas, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma

8Θ1Τ13.ΙΊ6. OU UIU ITiêS .

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 37, caracterizado pelo fato de que o contato ocorre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes por hora ou diariamente.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 38, caracterizado pelo fato de que o contato ocorre a cada 3, 4, 5,

8, 9, 10, 11 ou 12 minutos ou horas diariamente.

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7/8

40. Método, cie acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 39, caracterizado pelo fato de que a composição antibiótica está em uma única dose unitária.

41 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicí ações 2 5 a 40, caracterizado pelo fato de que a quantidade 2 do agente de organosselênio contatado com. a

infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias é de cerca de

10 a 100 n ig, cerca de 10 a 50 mg, ou cerca de 20 a 30 mg por

osagem.

42 . Método, de acordo com a reivindicação 41,

caracterizado pelo fato de que uma quantidade do agente de organosselênio contatado com a infecção bacteriana ou uma ou

mais bacte árias é de aproximadamente 25 mg por dosagem. 4 3 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicí ações 25 a 42, caracterizado pelo fato de que uma

quantidade de prata contatada com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias é de cerca de 1 a 20 mg, cerca de 1 a

10 mg, ou cerca de 5 a 7 mg por dosagem. 44 . Método, de acordo com. a reivindicação 43,

caracterizado pelo fato de que uma quantidade de prata contatada com a infecção bacteriana ou uma ou mais bactérias é de aproximadamente 6 mg por dosagem..

45 . Método para preparar uma composição antibiótica

caracterizado por compreender misturar um agente contend

praua e ur n agente ae organosseienio.

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8/8

Método, de acordo com a reivindicação 4ΐ caracterizado pelo tato de que a mistura é conduzida em um líquido,

Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende adicionar o agente contendo prata a um. líquido que compreende o agente de organosselênio.

48. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende a adição io agente de organosselênio a um líquido que compreende o agente contendo prata.