CN111172113A

CN111172113A - 细胞培养液及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN111172113A
Application number: CN201911410667.8A
Authority: CN
Inventors: 朱燕萍; 王志强; 郝艳鹏; 朱学珍; 叶琳璐
Original assignee: Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Puenrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明公开了一种细胞培养液及其制备方法和用途。该细胞培养液包括：培养液、青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素；其中，所述细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.01‑0.06mg/ml，链霉素的工作浓度是0.01‑0.1mg/ml，头孢类抗生素的工作浓度是0.01‑0.1mg/ml。该细胞培养液对HELA细胞进行培养时，不仅对病菌具有预防作用，而且具有更广谱的抗菌、抑菌范围，能够杀灭革兰阳性厌氧菌和革兰阴性厌氧菌，使得HELA细胞免受病菌污染，培养环境更加有利于HELA细胞的生长，使得HELA细胞的生长速度加快。

Description

细胞培养液及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术领域，特别是关于一种细胞培养液及其制备方法和用途。

背景技术

青霉素和链霉素都是常见的抗生素药物，都能够治疗多种炎症，所以在临床上的应用非常广泛。青霉素能够破坏细菌的细胞壁合成，可以使细菌内部出现高渗的情况，让细菌破裂死亡，是一种繁殖期杀菌剂，而链霉素可以抑制细菌繁殖过程中的蛋白质合成，是一种静止期杀菌剂。

双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液(200X)(Penicillin-StreptomycinSolution)双抗是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。虽然双抗对细胞的影响不是很大，但是，细胞培养液中长期加入双抗，很容易使青霉素失活，链霉素抗菌谱也不是很广。因此，在细胞培养液中，双抗只能起到预防作用。

混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物视为细胞污染。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变，也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现受到污染。受污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。但是，如果在处理细胞的操作过程中细胞污染，即便加入双抗也很难除去。另外，当细胞对环境影响比较敏感或细胞浓度比较低时，加入双抗会对细胞的生长产生影响。

头孢菌素类抗生素是广泛使用的一种抗生素。头孢菌素类分子中含有头孢烯的半合成抗生素，属于β-内酰胺类抗生素，是β-内酰胺类抗生素中的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的衍生物，因此它们具有相似的杀菌机制。

因此，为了抑制细胞培养液中细菌生长，避免细胞污染，亟需一种对组织微生物具有杀伤作用的细胞培养液。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞培养液，其能够提高对组织微生物的杀伤作用，具有更广谱的抗菌、抑菌范围，降低了细胞污染的几率，更加有利于细胞的生长。

为实现上述目的，本发明提供了细胞培养液，包括：培养液、胎牛血清、青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素；其中，所述细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.01-0.06mg/ml，链霉素的工作浓度是0.01-0.1mg/ml，头孢类抗生素的工作浓度是0.01-0.1mg/ml。

在一优选的实施方式中，上述培养液包含DMEM培养基。

在一优选的实施方式中，上述培养液包含DMEM培养基和胎牛血清。

在一优选的实施方式中，上述头孢类抗生素是头孢哌酮钠。

在一优选的实施方式中，上述DMEM培养基和胎牛血清的体积比是4-15∶1；优选的，上述DMEM培养基和胎牛血清的体积比是9∶1。

在一优选的实施方式中，上述青霉素钠的工作浓度是0.02-0.04mg/ml；优选的，上述青霉素钠的工作浓度是0.024mg/ml。

在一优选的实施方式中，上述链霉素的工作浓度是0.025-0.07mg/ml；优选的，上述链霉素的工作浓度是0.05mg/ml。

在一优选的实施方式中，上述头孢类抗生素的工作浓度是0.025-0.07mg/ml；优选的，上述头孢类抗生素的工作浓度是0.05mg/ml。

本发明的另一目的在于提供一种上述细胞培养液的制备方法，步骤包括：(1)将青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素分别溶于灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，用滤膜过滤，得到抗菌液；(2)配制培养液，然后在超净台内用滤膜过滤；以及(3)将步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到所述细胞培养液。

本发明的另一目的在于提供上述细胞培养液在用于培养HELA细胞的用途。

与现有技术相比，根据本发明具有如下有益效果：

本发明在含有链霉素和青霉素钠的培养液中加入头孢类抗生素，对HELA细胞进行培养时，不仅对病菌具有预防作用，而且具有更广谱的抗菌、抑菌范围，能够杀灭革兰阳性厌氧菌和革兰阴性厌氧菌，使得HELA细胞免受病菌污染，降低了细胞污染的几率；该培养液的环境更加有利于HELA细胞的生长，使得HELA细胞的生长速度加快；同时配置过程简单，操作易行，易于推广。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

如下实施例中采用的试剂如下：

注射用青霉素钠80万单位；注射用硫酸链霉素100万单位；头孢哌酮钠1.0g。

实施例1：细胞培养液的制备方法

该制备方法包括：

(1)取1支青霉素钠80万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取1支链霉素100万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取1支1.0g的头孢哌酮钠，溶解于90ml灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，再在超净台内用0.45μm的滤膜过滤，得到抗菌液；

(2)配制DMEM培养基200ml，然后在超净台内用0.22μm的滤膜过滤，得到培养液；

(3)取1ml步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到最终细胞培养液，该细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.024mg/ml、链霉素的工作浓度是0.05mg/ml、头孢类抗生素的工作浓度是0.05mg/ml。

实施例2：细胞培养液的制备方法

该制备方法包括：

(2)将DMEM培养基和胎牛血清按体积比是9∶1配制200ml，然后在超净台内用0.22μm的滤膜过滤，得到培养液；

实施例3：细胞培养液的制备方法

该制备方法包括：

(1)取2支青霉素钠80万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取2支链霉素100万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取1支1.0g的头孢哌酮钠，溶解于90ml灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，再在超净台内用0.45μm的滤膜过滤，得到抗菌液；

(3)取1ml步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到最终细胞培养液，该细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.048mg/ml、链霉素的工作浓度是0.1mg/ml、头孢类抗生素的工作浓度是0.05mg/ml。

实施例4：细胞培养液的制备方法

该制备方法包括：

(1)取半支青霉素钠80万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取1支链霉素100万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取2支1.0g的头孢哌酮钠，溶解于90ml灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，再在超净台内用0.45μm的滤膜过滤，得到抗菌液；

(3)取1ml步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到最终细胞培养液，该细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.012mg/ml、链霉素的工作浓度是0.05mg/ml、头孢类抗生素的工作浓度是0.1mg/ml。

实施例5：细胞培养液的制备方法

该制备方法包括：

(1)取2支青霉素钠80万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取1支链霉素100万单位，溶解于5ml灭菌双蒸水中；取半支1.0g的头孢哌酮钠，溶解于90ml灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，再在超净台内用0.45μm的滤膜过滤，得到抗菌液；

(3)取1ml步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到最终细胞培养液，该细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.048mg/ml、链霉素的工作浓度是0.05mg/ml、头孢类抗生素的工作浓度是0.025mg/ml。

对比例：细胞培养液的制备方法

该制备方法采用与实施例1完全相同的方法进行配制，唯一不同之处在于抗菌液包括：1支青霉素钠80万单位，1支链霉素100万单位，即该抗菌液不包含头孢哌酮钠；所得细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.024mg/ml、链霉素的工作浓度是0.05mg/ml。

实验例：HELA细胞培养

该HELA细胞培养的步骤如下：

(1)配制胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA-4Na)，以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温；

(2)将上述配制好的胰蛋白酶-EDTA溶液与无菌磷酸生理缓冲液(PBS)、对比例的细胞培养液倒入瓶子，得到培养液A；将上述配制好的胰蛋白酶-EDTA溶液与无菌磷酸生理缓冲液(PBS)、实施例1的细胞培养液倒入瓶子，得到培养液B；然后分别放入37℃水浴锅内预热；取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内；

(3)从培养箱内取出HELA细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞；

(4)吸出HELA细胞中旧培养液，用PBS清洗，加入适量胰蛋白酶-EDTA溶液，消化温度是37℃；

(5)弃去HELA细胞中的胰蛋白酶-EDTA溶液后分成2组，一组中加入对比例所得培养液，另外一组中加入实施例1所得培养液；

(6)用滴管将细胞吹打成细胞悬液，然后将细胞悬液吸入10ml离心管中，以1000转/分钟离心6-8分钟，弃去上清液：分别加入2ml对比例所得培养液、实施例1所得培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

HELA细胞培养48h后观察到如下情况：

对比例组：HELA细胞生长缓慢，未出现G+菌和流感杆菌、伤寒杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌及结核杆菌等引起的细菌污染。

实施例1组：HELA细胞生长情况良好，未出现G+菌和流感杆菌、伤寒杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、结核杆菌及大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、伤寒沙门菌、志贺菌属、枸橼酸杆菌属等肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌、流感杆菌、淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌、链球菌、肺炎球菌、多数革兰阳性厌氧菌和某些革兰阴性厌氧菌等引起的细菌污染。

由上述结果可知，对HELA细胞进行培养时，采用实施例1所得培养液比采用对比例所得培养液具有更广谱的抗菌、抑菌范围，培养液的环境更加有利于HELA细胞的生长，使得HELA细胞的生长速度加快，因此，将青霉素钠加入到链霉素和青霉素钠中，能够增强培养液的抗菌、杀菌效果，扩大杀菌、抑菌范围，使得HELA细胞免受病菌污染。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种细胞培养液，其特征在于，包括：培养液、青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素；其中，所述细胞培养液中青霉素钠的工作浓度是0.01-0.06mg/ml，链霉素的工作浓度是0.01-0.1mg/ml，头孢类抗生素的工作浓度是0.01-0.1mg/ml。

2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述培养液包含DMEM培养基。

3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述培养液包含DMEM培养基和胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述头孢类抗生素是头孢哌酮钠。

5.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于，所述DMEM培养基和胎牛血清的体积比是4-15∶1；优选的，所述DMEM培养基和胎牛血清的体积比是9∶1。

6.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述青霉素钠的工作浓度是0.02-0.04mg/ml；优选的，所述青霉素钠的工作浓度是0.024mg/ml。

7.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述链霉素的工作浓度是0.025-0.07mg/ml；优选的，所述链霉素的工作浓度是0.05mg/ml。

8.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述头孢类抗生素的工作浓度是0.025-0.07mg/ml；优选的，所述头孢类抗生素的工作浓度是0.05mg/ml。

9.一种权利要求1-8任一项所述的细胞培养液的制备方法，其特征在于，步骤包括：

(1)将青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素分别溶于灭菌双蒸水中，然后将稀释后的青霉素钠、链霉素和头孢类抗生素混合，用滤膜过滤，得到抗菌液；

(2)配制培养液，然后在超净台内用滤膜过滤；以及

(3)将步骤(1)所得抗菌液与步骤(2)所得培养液混合，得到所述细胞培养液。

10.权利要求1-8任一项所述的细胞培养液在用于培养HELA细胞的用途。