BR112019011006B1 - Composição de termogel, processo para a preparação de uma composição de termogel e usos da composição de termogel - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de 2- [(3-aminopropil) amino]etanotiol liofilizado, compreendendo as seguintes etapas: a) a reação de uma solução de amifostina com um ácido forte, para obter uma solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, e b) a liofilização da solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem adição de excipientes

Description

[001] A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de formulação de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado, bem como ao liofilizado correspondente, tal como obtido pelo referido processo.

[002] A amifostina é um pró-fármaco fosforilado que é convertido em 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol (aminotiol) ativo livre sob a ação da fosfatase alcalina. Atualmente, a amifostina é administrada por via intravenosa, mas efeitos adversos importantes estão associados à via de administração (hipotensão, náusea...). A administração por via oral da amifostina tem sido testada em animais e em humanos, mas estudos mostraram que a amifostina e o aminotiol são pouco absorvidos principalmente devido à degradação significativa no trato gastrointestinal (Kouvaris JR et al, Amifostine: the first selective-target and broad spectrum radioprotector. The Oncologist 2007; 12: 738-747).

[003] A amifostina é atualmente comercializada em vários países como Ethyol®, um pó liofilizado estéril para perfusão intravenosa para as seguintes indicações: - redução da toxicidade renal cumulativa associada à administração repetida de cisplatina em pacientes com câncer de ovário avançado, e - redução da incidência de xerostomia moderada a grave em pacientes submetidos a tratamento com radiação pós-operatório para câncer de cabeça e pescoço, onde a porta de radiação inclui uma porção substancial das glândulas parótidas.

[004] O documento US 6.239.119 revela métodos de tratamento ou proteção do tecido mucoso contra danos associados à radiação e/ou tratamento quimioterápico de cânceres, pela aplicação tópica de amifostina e compostos relacionados. Também revela o tratamento e a prevenção de infecções associadas à mucosite por aplicação tópica de amifostina e compostos relacionados.

[005] Até agora, não existe uma formulação de termogel estável compreendendo amifostina ou um derivado da mesma eficiente para tratar a mucosite oral induzida por radiação.

[006] O objetivo da presente invenção é preparar uma formulação tópica estável para quimio-radioproteção, compreendendo 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol, que adere às membranas mucosas ou na pele.

[007] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um processo para a preparação de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado estável, com ou sem a presença de excipientes.

[008] Outro objetivo da presente invenção é fornecer 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol liofilizado estável formulado ou a ser formulado em um gel termossensível para o tratamento de mucosite induzida por radiação.

[009] Outro objetivo da presente invenção é fornecer 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol liofilizado estável formulado ou a ser formulado em um gel termossensível para o tratamento de eritema cutâneo induzido por radiação.

[010] A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado, em particular de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado estável, com ou sem a presença de excipientes, compreendendo as seguintes etapas: a) a reação de uma solução de amifostina com um ácido forte, para obter uma solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, e b) a liofilização da solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem adição de excipientes.

[011] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de uma formulação de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado, com ou sem a presença de excipientes, compreendendo as etapas mencionados acima.

[012] O processo de preparação de acordo com a invenção tem a vantagem de aumentar a estabilidade do 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado obtido.

[013] De um modo preferido, o 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado obtido contém, de um modo preferido, menos de 5%, de um modo mais preferido menos de 2% e ainda mais preferivelmente menos de 1% (% de área) de dissulfeto (ou quaisquer outras impurezas) em peso, em relação ao peso total do referido produto, após armazenamento durante um determinado período nas condições ICH (Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Produtos Farmacêuticos para Uso Humano).

[014] De um modo preferido, o 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol liofilizado (ou aminotiol) está na forma de um sal. Como mostrado abaixo, o uso do ácido forte para a conversão de amifostina em aminotiol proporciona um sal.

[015] Em particular, quando se utiliza ácido clorídrico, esta etapa de conversão pode ser representada da seguinte forma:.

[016] De acordo com a invenção, a solução de amifostina compreende uma solução ácida de amifostina.

[017] De acordo com a invenção, o termo “ácido forte” refere-se a um ácido que ioniza completamente em uma solução. Dentro do presente pedido, refere-se a qualquer ácido amplamente utilizado no campo farmacêutico. De preferência, um ácido forte de acordo com a invenção tem um pKa igual ou inferior a 2,0.

[018] De preferência, o ácido forte é escolhido a partir do grupo que consiste em: ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e misturas dos mesmos. Mais preferencialmente, o ácido forte é o ácido clorídrico.

[019] O objetivo da etapa a), tal como definida acima, é obter uma conversão tão completa quanto possível, juntamente com a menor quantidade de impurezas. A solução obtida de aminotiol tem assim uma pureza elevada.

[020] De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa a) tal como definida acima, envolve a reação de uma solução de amifostina com ácido clorídrico.

[021] De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa a) é realizada a uma temperatura compreendida entre 50 °C e 90 °C.

[022] Abaixo de 50 °C, o processo de conversão é muito longo (especialmente por mais de 24 horas) e o rendimento do aminotiol é inferior a 90%. Acima de 90 °C, o processo de conversão é acelerado, mas novas impurezas desconhecidas são formadas.

[023] De preferência, a etapa a) é realizada a uma temperatura compreendida entre 50 °C e 70 °C, e mais preferencialmente a uma temperatura igual a 60 °C.

[024] De acordo com uma forma de realização preferida, a etapa a) é realizada durante 30 minutos a 24 horas.

[025] Abaixo de 30 minutos, a conversão não está completa, sendo o rendimento de aminotiol inferior a 90%. Acima de 24 horas, novas impurezas desconhecidas são formadas.

[026] De preferência, a etapa a) é realizada durante uma hora.

[027] De acordo com uma forma de realização preferida, a concentração de amifostina está compreendida entre 80 mg/ml e 500 mg/ml.

[028] Abaixo de uma concentração de amifostina de 80 mg/ml, é vantajoso realizar uma etapa de diluição, em particular a etapa de diluição a1) como explicado abaixo.

[029] Acima de uma concentração de 500 mg/ml de amifostina, o processo é difícil de ser implementado devido à solubilidade da amifostina.

[030] De preferência, a concentração de amifostina é igual a 500 mg/ml.

[031] De acordo com uma forma de realização preferida, a molaridade do ácido (ou a sua concentração molar) está compreendida entre 1M e 4M.

[032] Para uma molaridade do ácido abaixo de 1M, o processo de conversão pode ser muito longo e o rendimento do aminotiol é inferior a 90%.

[033] Para uma molaridade do ácido acima de 4M, o pH final do termogel resultante seria muito baixo (pH < 4,0) e, assim, o termogel não seria adequado para a sua administração. Assim, seria necessário realizar outra etapa de ajuste do pH.

[034] De preferência, a molaridade do ácido é igual a 4 M.

[035] De acordo com uma forma de realização, a razão molar entre a quantidade de amifostina e a quantidade de ácido está compreendida entre 1: 0,5 e 1: 3 e, de preferência, entre 1: 0,5 e 1: 2.

[036] Quando a razão molar é inferior a 1: 0,5, o processo de conversão é muito longo e o rendimento do aminotiol é inferior a 90%.

[037] Quando a razão molar é acima de 1: 3, o pH final do termogel resultante seria muito baixo (pH < 4,0) e, assim, o termogel não seria adequado para a sua administração e outra etapa de ajuste de pH deveria ser adicionada ao processo de fabricação.

[038] A etapa b) é uma etapa de liofilização, também conhecida como liofilização ou criodessecação. Esta etapa envolve o congelamento da solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem a presença de excipientes, tais como intensificadores de penetração, mascaramento de sabores como aromas e adoçantes, agentes muco-adesivos, co-solventes, umectantes, agentes corantes e outros excipientes funcionais como poloxâmeros, e depois a redução da pressão circundante para permitir que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa.

[039] De preferência, para esta etapa de liofilização, vários parâmetros devem ser considerados: a taxa de congelamento, a temperatura de congelamento de prateleira e a temperatura de prateleira da secagem primária.

[040] De acordo com uma forma de realização preferida, a taxa de congelamento deve ser alta. De preferência, esta taxa de congelamento é de cerca de 1,6 °C por minuto durante uma etapa de 40 minutos. Esta alta taxa de congelamento torna possível evitar a formação de uma “pele” (ou “casca”) na superfície do liofilizado, devido à alta concentração de soluto ácido excluída pela matriz de gelo durante o congelamento.

[041] De acordo com uma forma de realização preferida, a temperatura de congelamento de prateleira é baixa. De preferência, a temperatura de congelamento de prateleira é de cerca de -60 °C, de modo a congelar toda a solução ácida de aminotiol antes da sublimação.

[042] De acordo com uma forma de realização preferida, a temperatura de prateleira da secagem primária é baixa. De preferência, a temperatura de prateleira da secagem primária é inferior a -40 °C, a fim de evitar a fusão do produto. Durante a primeira etapa da secagem primária, a temperatura do produto é inferior à temperatura de fusão do produto.

[043] O processo de acordo com a invenção pode ainda compreender uma etapa a1), após a etapa a) e antes da etapa b), para diluir a solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem adição de excipientes na solução.

[044] A etapa a1) consiste preferencialmente na adição de uma solução aquosa compreendendo água ou pelo menos um poloxâmero na solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol.

[045] De preferência, a etapa a1) consiste na adição de uma solução aquosa compreendendo pelo menos um poloxâmero na solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol.

[046] Poloxâmeros (nomes comerciais: Pluronics®, Lutrol®, Kolliphor®), são copolímeros em blocos não-iônicos de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) sintetizados pela adição sequencial de óxido de propileno primeiro e, depois, óxido de etileno a um propileno glicol solúvel em água de baixo peso molecular (Thermosensitive Self-Assembling Block Copolymers as Drug Delivery Systems. G. Bonacucina, M. Cespi, G. Mencarelli, G. Giorgiono e G. F. Palmieri. Polymers 2011, 3, 779-811).

[047] De preferência, os poloxâmeros utilizados na presente invenção são Poloxamer 407, Poloxamer 188 e misturas dos mesmos.

[048] Poloxamer 407 é um copolímero comumente utilizado em formulações tópicas farmacêuticas.

[049] Uma mistura de Poloxamer 407 e Poloxamer 188 é amplamente utilizada em aplicações farmacêuticas para a propriedade termossensível. A combinação dos dois graus de Poloxamers-407 e 188 permite direcionar várias transições de temperaturas sol-gel.

[050] Na concentração constante de Poloxamer 407, o aumento da concentração de Poloxamer 188 aumentou gradualmente a transição de temperatura sol-gel, inicialmente para um máximo, e então diminuiu.

[051] A presente invenção também se refere a um liofilizado, em particular um liofilizado estável, de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol suscetível de ser obtido de acordo com o processo como definido acima.

[052] A presente invenção também se refere a um processo para a preparação de uma composição termogel de 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol, em particular uma composição termogel estável de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, compreendendo a reconstituição do liofilizado, como definido acima, com uma solução aquosa.

[053] De acordo com a invenção, um gel termossensível é um sistema de formação in situ que é líquido antes da administração, por exemplo à temperatura ambiente ou a 5 °C ± 3 °C, e que gelatiniza em condições de aquecimento. Após o resfriamento, este sistema se torna líquido novamente.

[054] A solução aquosa utilizada para esta etapa de reconstituição pode compreender água e/ou poloxâmeros, como definido acima.

[055] Preferencialmente, esta solução aquosa é constituída por água quando o aminotiol liofilizado foi preparado por um processo que compreende a implementação de uma etapa a1), como definida acima, envolvendo a diluição com uma solução compreendendo pelo menos um poloxâmero.

[056] De preferência, esta solução aquosa compreende pelo menos um poloxâmero quando o aminotiol liofilizado foi preparado por um processo que compreende a implementação de uma etapa a1), como definida acima, envolvendo a diluição apenas com água.

[057] De preferência, nesta solução aquosa, outros excipientes podem ser adicionados para os seguintes fins, mas não limitados a: intensificadores de penetração tais como Transcutol® (éter monoetílico de dietileno glicol), mascaramento de sabores como aromas e adoçantes, agentes muco-adesivos, co-solventes, umectantes, agentes corantes e outros excipientes funcionais.

[058] De um modo preferido, a solução aquosa para a etapa de reconstituição compreende ainda aromas, tais como aroma de hortelã e/ou mascaradores amargos, e/ou outros excipientes, tais como intensificadores de penetração.

[059] Por exemplo, a solução aquosa para a etapa de reconstituição do aminotiol liofilizado contém um aroma de hortelã, um mascarador amargo e água, de preferência nas seguintes quantidades respectivas: 4%, 0,05% e 95,95% p/p/p.

[060] A presente invenção também se refere a uma composição de termogel de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol suscetível de ser obtida de acordo com o processo como definido acima.

[061] A presente invenção também se refere à composição de termogel de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol como mencionado acima, para o seu uso no tratamento de mucosite oral induzida por radiação.

[062] A presente invenção também se refere à composição de termogel de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol como mencionado acima, para seu uso no tratamento de eritema cutâneo induzido por radiação.

[063] A presente invenção também se refere à composição de termogel de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol como mencionado acima, para seu uso para tratar ou proteger tecido mucoso ou cutâneo contra danos associados com terapia anticâncer, em particular com radiação e/ou tratamento quimioterápico de cânceres.

[064] A presente invenção também se refere a um método de tratamento ou proteção de tecido mucoso ou cutâneo contra danos associados com terapia anticâncer, em particular com radiação e/ou tratamento quimioterápico de cânceres, pela aplicação da composição de termogel como definida acima.

[065] Como danos associados ao tratamento de cânceres com radiação, os seguintes podem ser citados: mucosite oral (em caso de radiação de câncer de cabeça e pescoço), epitelite no pescoço (em caso de radiação de câncer de cabeça e pescoço), esofagite (em caso de radiação do pulmão), eritema cutâneo (no caso de irradiação da mama), enterite (no caso de irradiação abdominal), vaginite e secura vaginal (no caso de irradiação pélvica), retite (no caso de irradiação pélvica) e perda de cabelo (em caso de irradiação cerebral).

[066] Especialmente, a presente invenção refere-se à composição de termogel de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol como mencionado acima, para seu uso no tratamento dos danos escolhidos a partir do grupo que consiste em: epitelite no pescoço, eritema cutâneo no câncer de mama e alopecia em caso de irradiação cerebral.

EXEMPLOS A - CONVERSÃO DE AMIFOSTINA EM AMINOTIOL EM SOLUÇÃO EXEMPLO A-1: EM CONDIÇÃO DE ÁCIDO CLORÍDRICO OU ÁCIDO FOSFÓRICO 1M

[067] Uma solução de amifostina (substância farmacológica adquirida da Shangai Boylechem Co., Ltd) a 350 mg/ml é preparada em ácido clorídrico ou ácido fosfórico 1 M e aquecida em um banho-maria a 50 °C durante 24 horas. Após 24 horas, a composição da solução foi analisada pelo método de HPLC. As porcentagens de área (%) de amifostina, aminotiol e dissulfetos são dadas na tabela abaixo.

[068] A conversão da amifostina em condição de ácido fosfórico 1M é completa (e quase completa em ácido clorídrico 1M com pouca amifostina residual) sem formação de impureza desconhecida e apenas poucos dissulfetos.

EXEMPLO A-2: EM CONDIÇÃO DE ÁCIDO CLORÍDRICO 4M

[069] Uma solução de amifostina a 500 mg/ml é preparada em ácido clorídrico 4M e aquecida em banho-maria a 50 °C ou a 60 °C durante 24 horas. A 1h-3h-6h e 24 horas, a composição da solução foi analisada pelo método de HPLC. As porcentagens de área (%) de amifostina, aminotiol e dissulfetos são dadas na tabela abaixo.

[070] A conversão da amifostina em condição de ácido clorídrico 4M está completa após 6 horas a 50 °C e apenas 1 hora a 60 °C, sem criar impurezas desconhecidas.

EXEMPLO A-3 (COMPARATIVO): EM CONDIÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO

[071] Uma solução de amifostina a 350 mg/ml é preparada em ácido cítrico 1M (ácido fraco) e aquecida em banho-maria a 50 °C durante 24 horas. Após 24 horas, a composição da solução foi analisada pelo método de HPLC. As porcentagens de área (%) de amifostina, aminotiol e dissulfetos (WR-33278) são dadas na tabela abaixo.

[072] A conversão de amifostina em condição de ácido cítrico é completa, mas não é adequada devido à formação de novas impurezas desconhecidas em grande quantidade.

[073] Este exemplo comparativo mostra que a utilização de ácido cítrico que não é um ácido forte, de acordo com a invenção, não é adequada para a conversão de amifostina em aminotiol.

EXEMPLO A-4 (COMPARATIVO): EM CONDIÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO

[074] Uma solução de amifostina a 350 mg/ml é preparada em ácido acético 1M e aquecida em banho-maria a 50 °C durante 24 horas. Após 24 horas, a composição da solução foi analisada pelo método de HPLC. As porcentagens de área (%) de amifostina, aminotiol e dissulfetos são dadas na tabela abaixo.

[075] A conversão de amifostina em condição de ácido acético não é completa, permanece amifostina residual não convertida. Além disso, novas impurezas desconhecidas em grande quantidade são formadas.

[076] Este exemplo comparativo mostra que a utilização de ácido acético que não é um ácido forte, de acordo com a invenção, não é adequada para a conversão de amifostina em aminotiol.

B - EXEMPLO DE CONDIÇÕES DE LIOFILIZAÇÃO EXEMPLO B-1: LIOFILIZAÇÃO USANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 1M COMO MATRIZ

[077] Uma solução de amifostina é primeiramente convertida em aminotiol em ácido clorídrico 1M, com base no Exemplo A-1. Após a conversão, a solução é diluída em água para obter uma solução final a 50 mg/ml expressa em aminotiol e 2 ml são distribuídos em frasco de vidro para liofilização. EXEMPLO DE RECEITA LIOFILIZADA:

[078] Após a liofilização, a aparência da torta obtida é boa. Para a reconstituição, adicionar 2 ml de gel placebo contendo Poloxamer 407/188 19/6 p/p, para obter um gel termossensível final de aminotiol a 50 mg/ml, com uma temperatura de gelificação entre 25 °C e 30 °C.

EXEMPLO B-2: LIOFILIZAÇÃO USANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 4M E POLOXÂMEROS 21/4 COMO MATRIZ

[079] Uma solução de amifostina a 500 mg/ml é primeiramente convertida totalmente em aminotiol em ácido clorídrico 4M durante 1 hora a 60 °C (com base no Exemplo A-2). Após a conversão, a solução é diluída em Poloxâmeros P407/ P188 21/4 p/p para obter um gel final a 50 mg/ml expresso em aminotiol. Em seguida, 2ml são distribuídos em frascos de vidro para liofilização. EXEMPLO DE RECEITA LIOFILIZADA:

[080] Após liofilização, a torta obtida tem boa aparência.

[081] Para a reconstituição, adicionar 1,4 ml de água, para obter um gel termossensível final de WR-1065 a 50mg/ml, com uma temperatura de gelificação entre 28 °C e 30 °C.

EXEMPLO B-3: LIOFILIZAÇÃO USANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 4M E POLOXÂMEROS 18/6 COMO MATRIZ

[082] Uma solução de amifostina a 500 mg/ml é primeiramente convertida totalmente em aminotiol em ácido clorídrico 4M durante 1 hora a 60 °C (com base no Exemplo A-2). Após a conversão, a solução é diluída em Poloxâmeros P407/ P188 18/6 p/p para obter um gel final a 50 mg/ml expresso em aminotiol. Em seguida, 2ml são distribuídos em frascos de vidro para liofilização.

[083] A receita liofilizada aplicada é a mesma apresentada no Exemplo B-2 acima.

[084] Após liofilização, a torta obtida tem boa aparência.

[085] Para a reconstituição, adicionar 1,4 ml de água, para obter um gel termossensível final de aminotiol a 50 mg/ml, com uma temperatura de gelificação entre 65 °C e 70 °C.

EXEMPLO B-4: LIOFILIZAÇÃO UTILIZANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 1M E POLOXÂMEROS 20/4 COMO MATRIZ

[086] Uma solução de amifostina a 350 mg/ml é primeiramente convertida totalmente em aminotiol em ácido clorídrico 1M durante 6 horas a 60 °C. Após a conversão, a solução é diluída em Poloxâmeros P407/ P188 20/4 p/p para obter um gel final a 50 mg/ml expresso em aminotiol. Em seguida, 2ml são distribuídos em frascos de vidro para liofilização.

[087] A receita liofilizada aplicada é a mesma apresentada no Exemplo B-2 acima.

[088] Após liofilização, a torta obtida tem boa aparência.

[089] Para a reconstituição, adicionar 1,5 ml de água, para obter um gel termossensível final de WR-1065 a 50mg/ml, com uma temperatura de gelificação entre 30 °C e 35 °C.

EXEMPLO B-5: LIOFILIZAÇÃO UTILIZANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 1M E POLISSORBATO 80 COMO MATRIZ

[090] Uma solução de amifostina é primeiramente convertida em aminotiol em ácido clorídrico 1M, com base no Exemplo A-1. Após a conversão, a solução é diluída em água contendo 0,2% de Polissorbato 80 como crioprotetor, para obter uma solução final a 50mg/ml expressa em aminotiol. 2 ml são distribuídos em frascos de vidro para liofilização.

[091] A receita liofilizada aplicada é a mesma apresentada no Exemplo B-2 acima.

[092] Durante a liofilização, a torta obtida colapsou dando um aspecto fundido à torta. Para a reconstituição, adicionar 2 ml de gel placebo contendo Poloxamer 407/188 19/6 p/p, para obter um gel termossensível final de aminotiol a 50 mg/ml, com uma temperatura de gelificação entre 25 °C e 30 °C.

EXEMPLO B-6: LIOFILIZAÇÃO USANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 4M COMO MATRIZ

[093] Uma solução de amifostina é primeiramente convertida totalmente em aminotiol em ácido clorídrico 4M, com base no Exemplo A-2. Após a conversão, a solução é diluída em água para obter uma solução final a 50 mg/ml expressa em aminotiol e 2 ml são distribuídos em frasco de vidro para liofilização. EXEMPLO DE RECEITA LIOFILIZADA:

[094] Durante a liofilização, a torta obtida colapsou dando um aspecto fundido à torta.

[095] Para a reconstituição, adicionar 2 ml de gel placebo contendo Poloxamer 407/188 19/6 p/p, para obter um gel termossensível final de aminotiol a 50 mg/ml, com uma temperatura de gelificação de cerca de 30 °C.

EXEMPLO B-7: LIOFILIZAÇÃO USANDO ÁCIDO CLORÍDRICO 4M E HIDRÓXIDO DE SÓDIO COMO MATRIZ

[096] Uma solução de amifostina é primeiramente convertida totalmente em aminotiol em ácido clorídrico 4M, com base no Exemplo A-2. Após conversão, o pH da solução é ajustado para pH > 6,0 adicionando hidróxido de sódio 10M. Em seguida, a solução ajustada é diluída em água para obter uma solução final a 50 mg/ml expressa em aminotiol. 2 ml são distribuídos em frascos de vidro para liofilização.

[097] A receita liofilizada aplicada é a mesma apresentada acima no Exemplo B-1.

[098] Durante a liofilização, a torta obtida colapsou consideravelmente, dando uma aparência fundida à torta. Para a reconstituição, adicionar 2 ml de gel placebo contendo Poloxamer 407/188 19/6 p/p, para obter um gel termossensível final de aminotiol a 50 mg/ml, com uma temperatura de gelificação de cerca de 30 °C.

C - PREPARAÇÃO DE GÉIS DE AMINOTIOL EXEMPLO C-1: RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM GEL DE POLOXÂMEROS PARA OBTER UM GEL DE AMINOTIOL A 50 MG/ML

[099] De modo a preparar um gel de aminotiol a 50 mg/ml, adicionar 2 ml de P407/ P188 19/6 p/p ao liofilizado obtido como descrito no Exemplo B-1 (HCl 1M em matriz de liofilização) ou Exemplo B-5 (HCl 1M + PS80 em matriz de liofilização). O gel final formulado tem uma temperatura de gelificação entre 25 a 30 °C.

EXEMPLO C-2: RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM GEL DE POLOXÂMEROS PARA OBTER UM GEL DE AMINOTIOL A 50 MG/ML

[100] De modo a preparar um gel de aminotiol a 50 mg/ml, adicionar 2 ml de P407/ P188 19/6 p/p ao liofilizado obtido como descrito no Exemplo B-6 (HCl 4M em matriz de liofilização) ou Exemplo B-7 (HCl 4M + NaOH em matriz de liofilização). O gel final formulado tem uma temperatura de gelificação de cerca de 30 °C.

EXEMPLO C-3: RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM SOLUÇÃO AQUOSA PARA OBTER UM GEL DE AMINOTIOL A 50 MG/ML

[101] De modo a preparar um gel de aminotiol a 50 mg/ml, adicionar 1,4 ml de solução contendo, por exemplo, aroma de hortelã/ mascarador amargo/ água 4%/ 0,05%/ 95,95% p/p/p ao pó liofilizado obtido como descrito no Exemplo B-2. O gel final formulado tem uma temperatura de gelificação de cerca de 27 a 29 °C.

EXEMPLO C-4: RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM SOLUÇÃO AQUOSA PARA OBTER UM GEL DE AMINOTIOL A 50 MG/ML

[102] De modo a preparar um gel de aminotiol a 50 mg/ml, adicionar 1,5 ml de água ao pó liofilizado obtido como descrito no Exemplo B-4. O gel final formulado tem uma temperatura de gelificação de cerca de 30 a 35 °C.

EXEMPLO C-5: RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM SOLUÇÃO AQUOSA PARA OBTER UM GEL DE AMINOTIOL A 50 MG/ML

[103] De modo a preparar um gel de aminotiol a 50 mg/ml, adicionar 1,4 ml de água ao pó liofilizado obtido como descrito no Exemplo B-3. O gel final formulado tem uma temperatura de gelificação de cerca de 65 a 70 °C.

D - ESTABILIDADE DO PÓ LIOFILIZADO DE AMINOTIOL (WR-1065)

[104] Um estudo de estabilidade é realizado para comparar a estabilidade de: - WR-1065 obtido por conversão de amifostina (350 mg/ml ou 500 mg/ml) em condição ácida (respectivamente HCl 1M ou HCl 4M), diluído em água ou na mistura P407/ P188 e depois liofilizado (baseado nos exemplos descritos nas partes A e B), e - Pó cristalino de sal cloridrato WR-1065.

[105] A estabilidade é avaliada por análise de amostras armazenadas sob atmosfera de argônio a 25 °C/ 60% de UR. O objetivo do argônio é fornecer dois materiais sob a mesma condição de estabilidade.

[106] De acordo com os resultados de estabilidade obtidos: - após 1 mês a 25 °C/ 60% de UR, menos de 2% de impurezas foram detectadas em todas as formulações de aminotiol testadas e este valor permaneceu estável; e - a WR-1065 liofilizada obtida da conversão da amifostina em condições ácidas e o sal cloridrato da WR-1065 têm a mesma estabilidade.

E - TENTATIVAS DE DESENVOLVER TRATAMENTO COM GEL DE METABÓLITO ATIVO DE AMIFOSTINA ESTÁVEL EXEMPLO E-1: ESTABILIZAÇÃO DE AMINOTIOL

[107] Inicialmente, avaliou-se a possibilidade de desenvolver um termogel de aminotiol, para obter uma formulação estável e pronta para usar com pelo menos 6 meses de estabilidade em condições refrigeradas.

[108] As formulações de gel de aminotiol não são estáveis quando armazenadas a 5 °C ou à temperatura ambiente. Durante o armazenamento, o aminotiol degrada na impureza de oxidação (dissulfeto WR- 33278) significativamente.

[109] Por exemplo, um gel de aminotiol a 50 mg/ml apresentou um aumento da impureza de dissulfeto de 3,6 para 13,8% (% de área) após 15 dias de armazenamento a 5 °C.

[110] Diferentes parâmetros foram testados para melhorar a estabilidade do aminotiol em solução: - aditivos do agente conservante como um antioxidante e/ou um agente quelante (metabissulfeto, EDTA, ácido tartárico, ácido cítrico, N- acetilcisteína, ácido alfa-lipóico, cloridrato de cisteína, ácido ascórbico, Ditiotreitol DTT); - inertização de nitrogênio, ou - concentração de droga (50 mg/ml, 220 mg/ml).

[111] Por exemplo, um estudo de estabilidade foi realizado após um mês a 5 °C ± 3 °C em gel de aminotiol a 50 mg/ml. Em primeiro lugar, uma solução de aminotiol é preparada por conversão de 350 mg/ml de solução de amifostina aquecida em HCl 1M (com base no Exemplo A-1). Em seguida, a solução é diluída a 50 mg/ml (expressa em aminotiol) em diferentes soluções antioxidantes e colocada a 5 °C ± 3 °C de estabilidade.

[112] Quaisquer que sejam os aditivos testados (antioxidante, agente quelante), a solução de aminotiol não é suficientemente estável a 5 °C e a formação de ponte dissulfeto não é impedida. Além disso, a N-acetilcisteína acelera a degradação do aminotiol, criando uma nova impureza importante. Então, essa opção de estabilização do aminotiol não é adequada.

[113] Entre eles, a melhor estabilidade foi obtida pela formulação com DTT a 0,5%. É estável por pelo menos um mês a 5 °C, mas a quantidade de DTT a 0,5% não é apropriada para o uso pretendido.

EXEMPLO E-2: CONVERSÃO RÁPIDA DE AMIFOSTINA EM AMINOTIOL

[114] Como o aminotiol não é estável, os inventores avaliaram a possibilidade de desenvolver um termogel de amifostina que será convertido em aminotiol (WR-1065) imediatamente antes da administração. Para desenvolver um produto comercialmente adequado, o objetivo é encontrar condições adequadas para obter conversão total (> 90%) em menos de 30 minutos.

[115] Nos experimentos seguintes, o pó cristalino de amifostina foi adicionado a diferentes géis de placebo e mediu-se a taxa de conversão e o rendimento em Aminotiol WR-1065.

[116] Diferentes parâmetros foram testados: - ácido (ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido perclórico), - concentração de amifostina (20 - 80 mg/ml), ou - temperatura (37 °C ou temperatura ambiente - TA).

[117] Por exemplo, o pó cristalino de amifostina foi incorporado diretamente a uma concentração de 40 mg/ml em géis de placebo contendo uma mistura de 14% p/p de Poloxamer P407 e 26% p/p de P188 e 15% ou 30% v/v de HCl 1M. A conversão foi monitorada após 30 minutos a 37 °C e de 30 minutos a 3 horas à temperatura ambiente.

[118] Após 30 minutos a temperatura ambiente ou a 37 °C, a conversão em aminotiol é muito baixa, quaisquer que sejam os parâmetros testados (o máximo obtido é de aproximadamente 30%).

EXEMPLO E-3: CONVERSÃO RÁPIDA DE DISSULFETO EM AMINOTIOL

[119] Como a conversão de amifostina em aminotiol dentro de 30 minutos é difícil, outra opção de formulação foi avaliada, convertendo o dissulfeto WR-33278 em aminotiol WR-1065 imediatamente antes da administração.

[120] A conversão de dissulfeto em aminotiol foi testada em uma formulação em gel contendo uma quantidade elevada de dissulfeto (área de 37,7%). Para reduzir as ligações dissulfeto, um forte agente redutor, o ditiotreitol (DTT), foi testado em diferentes concentrações.

[121] Em primeiro lugar, a solução de aminotiol é preparada por conversão de 350 mg/ml de solução de amifostina aquecida em HCl 1M (com base no Exemplo A-1). Então a solução é diluída a 50 mg/ml (expresso em aminotiol) em água e armazenada durante alguns dias à temperatura ambiente para obter uma formação elevada de dissulfetos por degradação. Após alguns dias, o DTT é finalmente adicionado ao gel e as análises foram realizadas após 30 minutos de incubação com DTT à temperatura ambiente. PERFIL DE PUREZA 30 MINUTOS APÓS A ADIÇÃO DA DTT

[122] Usando o DTT, dissulfetos podem ser reduzidos consideravelmente a aminotiol em 30 minutos à temperatura ambiente, mas a concentração necessária no DTT é maior que a quantidade autorizada para reações toxicológicas.

F - AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DE UM TERMOGEL DE ACORDO COM A INVENÇÃO CONTENDO AMINOTIOL PARA A PREVENÇÃO DE MUCOSITE ORAL RELACIONADA À RADIAÇÃO EXEMPLO F-1: PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES EM GEL PARA ESTUDO DE EFICÁCIA

[123] As seguintes formulações foram utilizadas para um estudo de eficácia como explicado a seguir. As formulações foram preparadas no dia anterior ao estudo de eficácia, armazenadas a 5 °C e analisadas no dia da dosagem.

[124] A pureza do lote de amifostina usado foi levada em consideração. Para a formulação de aminotiol, a concentração em mg/ml é expressa como concentração equivalente de amifostina. Usando razão molecular, 80 mg/ml de amifostina é equivalente a 50 mg/ml de aminotiol.

[125] Todas as formulações em gel foram coloridas por azul brilhante para melhor visualização da aplicação.

[126] O gel n° 1 tem a mesma composição que uma composição de termogel de acordo com a invenção (correspondendo a um liofilizado reconstituído de acordo com a invenção).

EXEMPLO F-2: ESTUDO DE EFICÁCIA DAS FORMULAÇÕES EM GEL DO EXEMPLO F-1

[127] O objetivo deste exemplo foi avaliar a eficácia das composições de termogel do Exemplo F-1 contendo amifostina contra a mucosite oral induzida por radiação in vivo.

[128] Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (12 semanas de idade) adquiridos da Janvier CERT (Le Genest St. Isle, França) após um período de aclimatação de 7 dias. Eles tiveram livre acesso a alimentos (referência SAFE R0340, Augy, França) e água. Eles foram alojados em um ciclo de luz/ escuridão de 12 horas a uma temperatura ambiente de 22 °C ± 2 °C e umidade relativa de 55% ± 15%.

[129] A irradiação foi realizada localmente com um tubo Varian NDI 226 de raios X (200kV, 15mA, 0,2mm Cu) a uma taxa de dose de 1,33 Gy/min, sendo o resto do corpo protegido por um escudo de chumbo. Os camundongos foram eutanasiados quando a perda de peso corporal excedeu 20% do peso inicial por mais de 24 horas ou em caso de sinais clínicos graves (pontos finais éticos).

[130] O experimento seguinte foi realizado usando o modelo de mucosite oral como descrito em Mangoni, M., Vozenin, M.C., Biti, G., e Deutsch, E. (2012). Normal tissues toxicities triggered by combined anti- angiogenic and radiation therapies: hurdles might be ahead. British journal of cancer, 107, 308-314.

[131] Dois parâmetros foram monitorados: o peso corporal e a pontuação de Parkins. Isto representa um sistema de pontuação arbitrário concebido por Parkins e colaboradores com pontuações separadas para edema e eritema avaliados por observação macroscópica (Parkins, C.S., Fowler, J.F. e Yu, S. (1983). A murine model of lip epidermal/mucosal reactions to X-irradiation, Radiotherapy and oncology: Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 1, 159-165). De fato, com doses elevadas de irradiação, observam-se as reações epidérmicas/ de mucosas dos lábios, começando aproximadamente 5 dias após a irradiação e atingindo um pico cerca de 10 a 13 dias após a irradiação. Consistem principalmente em um edema e um eritema. A pontuação de Parkins representa a soma da pontuação para edema e da pontuação para eritema.

[132] A pontuação de Parkins é calculada da seguinte forma: “pontuação de Parkins” = pontuação de edema + pontuação de eritema.

EXPERIMENTO

[133] Uma dose única de irradiação foi aplicada no focinho de camundongos. Isso induziu uma reação de mucosa/ epidérmica do lábio que foi monitorada através de observação macroscópica e pontuando.

[134] Um experimento cego foi realizado para determinar o efeito de géis contendo ou não uma substância ativa na severidade e duração da mucosite oral. Três géis foram avaliados: um gel placebo (Gel n° 3), um gel contendo 80 mg/ml de Amifostina (Gel n° 2) e um gel contendo 50 mg/ml de Amifostina tiol (Gel n° 1) (correspondendo a 80 mg/ml de Amifostina). Os camundongos foram anestesiados (injeção intraperitoneal de Cetamina 75 mg/kg + Domitor 1 mg/kg) 10 minutos antes da aplicação do gel. O gel foi aplicado na boca (5 µl em cada bochecha) e nos lábios (40 µl). Assim, um volume total de 50 µl cobriu a mucosa do camundongo, o que corresponde a 4 mg de Amifostina por camundongo. Os focinhos dos camundongos foram irradiados 30 minutos após a aplicação do gel usando uma fração única de 20 Gy (taxa de dose de 1,33 Gy/min). O Antisedan foi injetado 1 hora após a injeção da mistura anestésica. Estes camundongos foram comparados com camundongos que receberam uma injeção intravenosa (IV) de Amifostina (4 mg por camundongo, isto é, correspondendo a uma injeção intravenosa de 200 µl de uma solução de 20 mg/ml de Amifostina) 30 minutos antes da irradiação e com um grupo controle de camundongos recebendo apenas uma irradiação localizada de 20 Gy.

[135] Para resumir, 30 camundongos foram alocados em 5 grupos e depois irradiados: - Controle; - Gel placebo; - Gel de amifostina (80 mg/ml, 4 mg de amifostina/ camundongo); - Gel de aminotiol (50 mg/ml, correspondendo a 80 mg/ml de amifostina ou 4 mg de amifostina/ camundongo); - Amifostina intravenosa (IV) (20 mg/ml, 4 mg amifostina/ camundongo).

[136] Gráficos representando a evolução da pontuação de Parkins e o peso corporal ao longo do tempo são apresentados na Figura 1. Na Figura 1, a curva (*) corresponde ao controle, a curva (¦) corresponde ao gel placebo, a curva (?) corresponde ao gel de amifostina, a curva (^) corresponde ao gel de amifostina tiol e a curva (x) corresponde à amifostina IV.

[137] A irradiação dos focinhos dos camundongos com uma dose de 20 Gy em uma posição ventral induziu um fenótipo grave caracterizado por uma perda de peso corporal significativa e piora do estado geral de saúde. Todos os camundongos controle tiveram que ser sacrificados entre o dia 14 e o dia 20. No grupo de gel placebo, os camundongos exibiram uma tendência para um fenótipo ainda pior, uma vez que tinham de ser sacrificados um pouco mais cedo. A sobrevivência mediana foi de 16 dias versus 19 dias para o gel placebo e os grupos controle, respectivamente. No entanto, deve-se notar que a diferença não foi estatisticamente significativa (teste de Log-rank). Surpreendentemente, a presença de Amifostina no gel não teve impacto visível no desenvolvimento e na intensidade da mucosite, já que os camundongos apresentaram um fenótipo similar ao longo do tempo para aqueles dos camundongos do grupo controle. Pelo contrário, a injeção intravenosa de Amifostina resultou em uma reação da mucosa de intensidade moderada. O edema e o eritema desapareceram completamente tão logo o dia 20 após a irradiação e nenhum segundo pico (período de cura) foi observado para este grupo (Figura 1). Curiosamente, com o gel Amifostina tiol, os camundongos mostraram um fenótipo intermediário. Eles não perderam peso durante a reação aguda (dias 10 a 15), mesmo se uma mucosite estabelecida fosse detectada. Esses camundongos não atingiram um ponto final que levou ao seu sacrifício e todos os camundongos ainda estavam vivos no final do experimento, em claro contraste com o destino dos camundongos do grupo do gel da Amifostina.

[138] O fenótipo oposto observado para os grupos gel de Amifostina e gel de Amifostina tiol e a clara ausência de eficácia do gel de Amifostina sugerem que a Amifostina não é ou não converteu eficientemente em Amifostina tiol quando é incluída no gel e aplicada no focinho. Assim, o composto ativo livre amifostina tiol deve ser administrado diretamente para prevenir, pelo menos parcialmente, o desenvolvimento da mucosite induzida por radiação.

EXEMPLO F-3: PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES EM GEL PARA UM SEGUNDO ESTUDO DE EFICÁCIA

[139] As seguintes formulações foram utilizadas para um estudo de eficácia como explicado a seguir. As formulações foram preparadas no dia anterior ao estudo de eficácia, armazenadas a 5 °C e analisadas no dia da dosagem.

[140] A pureza do lote de amifostina usado foi levada em consideração e a concentração em mg/ml é expressa como concentração equivalente de amifostina.

[141] Os géis n° 4, 5 e 6 têm a mesma composição que uma composição de termogel de acordo com a invenção (correspondendo a um liofilizado reconstituído de acordo com a invenção).

EXEMPLO F-4: ESTUDO DE EFICÁCIA DAS FORMULAÇÕES EM GEL DO EXEMPLO F-3

[142] O objetivo deste segundo experimento de eficácia foi confirmar os resultados obtidos no primeiro experimento relativo ao impacto da Amifostina tiol na mucosite induzida por radiação e estabelecer dados sobre uma relação dose-resposta. Como um efeito intermediário foi observado com o gel contendo 80 mg/ml de Amifostina (correspondendo a 50 mg/ml de amifostina tiol), teria sido interessante testar um gel mais concentrado para determinar se poderíamos melhorar a proteção da mucosa oral mais radicalmente contra radiação ionizante.

[143] O experimento foi realizado com géis contendo 20, 40 ou 80 mg/ml de Amifostina (correspondendo a 12,5, 25 ou 50 mg/ml de amifostina tiol, respectivamente). Uma dose menor de irradiação (uma fração única de irradiação de 18 Gy) foi distribuída ao focinho, de modo que todos os camundongos pudessem ser mantidos vivos até o final do experimento. Quantidades diferentes de composto foram administradas aos camundongos (1; 2 ou 4 mg por camundongo).

[144] O mesmo procedimento experimental como no exemplo F-2 foi usado. Resumidamente, camundongos foram anestesiados, Amifostina ou Amifostina tiol foram administradas 10 minutos mais tarde ou não dependendo do grupo (aplicação de gel ou injeção intravenosa), camundongos foram irradiados dorsalmente a uma dose de 18 Gy, 30 minutos após a administração de Amifostina ou Amifostina tiol, e despertados 20 minutos depois.

[145] Quarenta camundongos foram alocados em 6 grupos: - Controle (n = 6 camundongos); - Gel placebo (n = 6 camundongos); - Amifostina tiol 20 mg/ml em gel (1 mg de amifostina/ camundongo, n = 6 camundongos); - Amifostina tiol 40 mg/ml em gel (2 mg de amifostina/ camundongo, n = 6 camundongos); - Amifostina tiol 80 mg/ml em gel (4 mg de amifostina/ camundongo, n = 6 camundongos); e - Amifostina intravenosa (IV) (20 mg/ml) (4 mg de amifostina/ camundongo, n = 5 camundongos).

[146] Para cada grupo, o desenvolvimento da mucosite oral foi avaliado em 5 ou 6 camundongos, dependendo do grupo. Uma irradiação com dose de 18 Gy induziu um fenótipo menos grave do que a irradiação com dose de 20 Gy que foi usada no primeiro experimento de eficácia. A perda de peso corporal foi manejável e todos os camundongos ainda estavam vivos no final do experimento.

[147] Gráficos representando a evolução da pontuação de Parkins e o peso corporal ao longo do tempo são apresentados na Figura 2. Na Figura 2, a curva (?) corresponde ao controle, a curva (*) corresponde ao gel placebo, a curva (^) corresponde ao gel n °4, a curva (¦) corresponde ao gel n° 5, a curva (x) corresponde ao gel n° 6 e a curva (•) corresponde à amifostina IV.

[148] Como esperado, a irradiação induziu um pico de reação da mucosa no grupo controle no dia 13, como mostrado na Figura 2. Isto foi seguido por um período de cura que se estendeu do dia 18 ao dia 30 como já observado no Exemplo F-2 para o grupo Amifostina tiol em gel. Para o grupo da Amifostina IV, o pico agudo da reação da mucosa também foi observado no dia 12, mas foi de intensidade menor do que a observada para o gel de controle (pontuação de 2,2 versus 3,6, respectivamente). O período de cura estava quase ausente neste grupo, como já foi observado no Exemplo F-2. Para os outros grupos, a pontuação no pico foi de 4,1; 3,2; 2,8 e 2,4 para o gel placebo e 20 mg/ml; 40 mg/ml e 80 mg/ml de géis de Amifostina (correspondendo a 12,5, 25 ou 50 mg/ml de amifostina tiol), respectivamente. Durante o período de cura, as curvas para o controle, o gel placebo, os 20 mg/kg e os 40 mg/kg de géis de Amifostina tiol foram dificilmente distinguíveis um do outro. A aplicação de 20 mg/kg de gel de Amifostina tiol não alterou a intensidade do pico de mucosite e a pontuação registrada durante o período de cura foi comparável àquela do grupo controle. Com 40 mg/ml de gel de Amifostina tiol, observou-se uma diminuição da intensidade do pico da mucosite. Isto foi reforçado ainda mais com o gel de Amifostina tiol a 80 mg/ml, que também induziu uma redução da pontuação registada durante o período de cura.

EXEMPLO F-5: PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES EM GEL POR RECONSTITUIÇÃO DE Pó LIOFILIZADO COM SOLUÇÃO AQUOSA PARA UM TERCEIRO ESTUDO DE EFICÁCIA

[149] As seguintes formulações foram utilizadas para um estudo de eficácia com irradiação fracionada como explicado a seguir. O termogel liofilizado foi reconstituído no dia anterior ao estudo de eficácia, armazenado a 5 °C e analisado no dia da dosagem.

[150] A pureza do lote de amifostina usado foi levada em consideração e a concentração em mg/ml é expressa como concentração equivalente de amifostina.

[151] Após a reconstituição, os géis de formulação final n° 8 e 9 têm a mesma composição que àquela antes da liofilização, de acordo com a invenção.

EXEMPLO F-6: ESTUDO DE EFICÁCIA DAS FORMULAÇÕES EM GEL DO EXEMPLO F-5

[152] O objetivo deste terceiro experimento de eficácia foi confirmar os resultados obtidos no primeiro experimento em relação ao impacto da Amifostina tiol na mucosite induzida por radiação em um cenário de um regime de irradiação fracionada e utilizando termogéis liofilizados reconstituídos.

[153] O experimento foi realizado com um gel placebo e um gel contendo 40 mg/ml de Amifostina (correspondendo a 25 mg/ml de amifostina tiol). Quatro frações de 8 Gy foram distribuídos por quatro dias consecutivos (todos os dias a partir do dia 0 ao dia 3; o dia 0 correspondendo ao primeiro dia de tratamento) ao focinho. O esquema de fracionamento de quatro frações de 8 Gy foi escolhido, pois é biologicamente equivalente a 1 fração de 18 Gy (Dose Biologicamente Efetiva: BED ~ 120 Gy). A mesma quantidade de composto (correspondente a 2 mg de amifostina por camundongo) foi administrada a camundongos antes de cada fração de irradiação. Assim, o composto foi aplicado 4 vezes durante quatro dias consecutivos.

[154] Para cada dia, foi utilizado um procedimento experimental semelhante ao do Exemplo F-2. Resumidamente, camundongos foram anestesiados, Amifostina ou Amifostina tiol foram administrados 10 minutos mais tarde ou não, dependendo do grupo (aplicação de gel ou injeção intravenosa), os camundongos foram irradiados dorsalmente a uma dose de 8 Gy 30 minutos após a administração de Amifostina ou Amifostina tiol e acordados 20 minutos depois. O mesmo procedimento experimental foi repetido por 4 dias consecutivos.

[155] Vinte e quatro camundongos foram alocados em 4 grupos: - Irradiação sem gel (n = 6 camundongos); - Irradiação com amifostina tiol em gel (25 mg/ml, correspondendo a 2 mg de amifostina ou 1,25 mg de amifostina tiol/ camundongo / dia) (n = 6 camundongos); - Irradiação com Gel Placebo (n = 4 camundongos); - Irradiação com injeção intravenosa (IV) de amifostina (2 mg de amifostina/ camundongo) (n = 6 camundongos).

[156] Para cada grupo, o desenvolvimento da mucosite oral e peso corporal foram analisados diariamente (6 dias/ semana) do dia 3 ao dia 60. Os gráficos que representam a evolução da pontuação de Parkins e o peso corporal ao longo do tempo são apresentados na Figura 3. Na Figura 3, a curva (?) corresponde ao controle, a curva (*) corresponde ao gel placebo, a curva (^) corresponde ao gel n° 9, a curva (¦) corresponde à amifostina IV.

[157] Como já observado após a irradiação de uma única fração, um pico de reação da mucosa foi induzido 15 dias após a primeira fração de irradiação no grupo controle. O período de cura prolongou-se até 60 dias após a irradiação. Uma perda de peso corporal perceptível foi observada nos dias 12-16 e correlacionada com o pico de mucosite. Como esperado, o gel placebo não mostrou nenhum efeito sobre o desenvolvimento, a intensidade e a duração da mucosite. Para o grupo da Amifostina IV, o pico agudo da reação da mucosa também foi observado por volta do dia 15, mas foi de menor intensidade (pontuação de 2,6 para o grupo Amifostina IV versus 6,4 para o grupo controle) e os camundongos recuperados da mucosite pelo 30° dia. Curiosamente, o mesmo resultado que para o grupo Amifostina IV foi observado para o grupo gel de Amifostina tiol: a pontuação no pico foi de 2,6 e os camundongos não apresentaram quaisquer sinais de mucosite após o dia 30. Assim, a aplicação local do gel de amifostina tiol protegeu os camundongos contra a mucosite induzida por radiação. Com este gel, a mucosite foi de menor intensidade e duração.

G - AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DE UM TERMOGEL DE ACORDO COM A INVENÇÃO CONTENDO AMINOTIOL PARA A PREVENÇÃO DE ERITEMA CUTÂNEO RELACIONADO À RADIAÇÃO EXEMPLO G-1: PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES EM GEL POR RECONSTITUIÇÃO DE PÓ LIOFILIZADO COM SOLUÇÃO AQUOSA PARA ESTUDO DE EFICÁCIA

[158] As seguintes formulações foram utilizadas para um estudo de eficácia com irradiação fracionada como explicado a seguir. O termogel liofilizado foi reconstituído no dia anterior ao estudo de eficácia, armazenado a 5 °C e analisado no dia da dosagem.

[159] A pureza do lote de amifostina usado foi levada em consideração e a concentração em mg/ml é expressa como concentração equivalente de amifostina.

[160] Após reconstituição, os géis de formulação final n° 10 e 11 têm a mesma composição que antes da liofilização, de acordo com a invenção.

EXEMPLO G-2: ESTUDO DE EFICÁCIA DAS FORMULAÇÕES EM GEL DO EXEMPLO G-1

[161] O objetivo deste exemplo foi avaliar a eficácia das composições de termogel do Exemplo G-1 contendo amifostina contra o eritema cutâneo induzido por radiação in vivo.

[162] Foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (12 semanas de idade) adquiridos da Janvier CERT (Le Genest St. Isle, França) após um período de aclimatação de 7 dias. Eles tiveram livre acesso a alimentos (referência SAFE R0340, Augy, França) e água. Eles foram alojados em um ciclo de luz/ escuridão de 12 horas a uma temperatura ambiente de 22 °C ± 2 °C e umidade relativa de 55% ± 15%.

[163] A irradiação foi realizada localmente com um tubo de raios- X XRAD320 (320 kV, 12,5 mA) a uma taxa de dose de 1,08 Gy/min, sendo o resto do corpo protegido por um escudo de chumbo. Apenas a pele nas costas dos camundongos foi irradiada. Os camundongos foram eutanasiados quando a perda de peso corporal excedeu 20% do peso inicial por mais de 24 horas, no caso de sinais clínicos graves ou no final do experimento (pontos finais éticos).

[164] Em altas doses de irradiação, reações epidérmicas (eritema, descamação, ulceração...) são observadas, começando aproximadamente 15 dias após a irradiação e atingindo um pico cerca de 20 dias após a irradiação. Um sistema de pontuação arbitrário foi utilizado para avaliar o desenvolvimento do eritema cutâneo induzido por radiação. ESCALA DE PONTUAÇÃO

EXPERIMENTO

[165] O objetivo deste experimento de eficácia foi avaliar o impacto de Amifostina tiol no eritema cutâneo induzido por radiação em um cenário de um regime de irradiação fracionada e utilizando termogéis liofilizados reconstituídos.

[166] O experimento foi realizado com um gel placebo e um gel contendo 40 mg/ml de Amifostina (correspondendo a 25 mg/ml de amifostina tiol). Quatro frações de 12 Gy foram administradas durante quatro dias consecutivos (todos os dias desde o dia 1 ao dia 4; o dia 1 correspondendo ao primeiro dia de tratamento) à pele nas costas dos camundongos. A mesma quantidade de composto (correspondendo a 4 mg de amifostina por camundongo) foi administrada a camundongos antes de cada fração de irradiação. Assim, o composto foi aplicado 4 vezes durante quatro dias consecutivos.

[167] Para cada dia, um procedimento experimental similar foi usado. Resumidamente, os camundongos foram anestesiados, o gel de Amifostina tiol ou o gel placebo foram aplicados diretamente na pele depilada no dorso dos camundongos 10 minutos mais tarde ou não, dependendo do grupo (volume final de gel = 100 µl). O gel foi removido 1 hora depois com compressas embebidas em água. Os camundongos foram então irradiados a uma dose de 12 Gy e acordados 10 minutos depois. O mesmo procedimento experimental foi repetido por 4 dias consecutivos.

[168] Dez camundongos foram alocados em 3 grupos: - Irradiação sem gel (n = 4 camundongos); - Irradiação com gel de Amifostina tiol (Gel n° 11) (25 mg/ml, correspondendo a 4 mg de amifostina ou 2,5 mg de amifostina tiol/ camundongo / dia) (n = 3 camundongos); - Irradiação com Gel Placebo (Gel n° 10) (n = 3 camundongos).

[169] Para cada grupo, o desenvolvimento de eritema cutâneo e o peso corporal foram analisados diariamente (6 dias/ semana) do dia 3 ao dia 50. A reação epidérmica foi monitorada através de observação macroscópica e pontuação. Gráficos representando a evolução da pontuação de eritema são apresentados na Figura 4. Curvas individuais para o grupo controle, o grupo gel placebo (Gel n° 10) e o grupo gel n° 11 estão representadas nas Figuras 4A, 4B e 4C, respectivamente.

[170] Em nosso experimento, a irradiação da pele do camundongo induziu uma descamação grave com um pico de reação epidérmica por volta do dia 20. A descamação atingiu um platô e ainda estava presente no final do período de observação. Nenhuma perda de peso corporal foi observada durante o curso do experimento. Como esperado, o gel placebo não mostrou nenhum efeito relacionado ao desenvolvimento, a intensidade e a duração da reação epidérmica. Curiosamente, no grupo de camundongos tratados com o gel de amifostina tiol, o desenvolvimento de eritema foi retardado em 2 camundongos de 3, e neste grupo, um camundongo curou da reação cutânea e se recuperou do eritema pelo 50° dia (pontuação de 0,5 no dia 50). Assim, a aplicação local do gel de Amifostina tiol parece proteger os camundongos do eritema induzido por radiação.

Claims (15)

1. COMPOSIÇÃO DE TERMOGEL, caracterizada por conter 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol e pelo menos um poloxâmero, para uso para tratar ou proteger tecido mucoso ou cutâneo contra danos associados com terapia anticâncer.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo a reivindicação 1, caracterizada por conter Poloxamer 407, Poloxamer 188 ou uma mistura dos mesmos.

3. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE TERMOGEL, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender a reconstituição de um liofilizado com uma solução aquosa, com ou sem adição de excipientes, dito liofilizado sendo preparado de acordo com o seguinte processo: (a) a reação de uma solução de amifostina com um ácido forte tendo um pKa igual a ou menor que 2,0, para obter uma solução de 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol, e (b) a liofilização da solução de 2- [(3-aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem adição de excipientes.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo ácido forte ser escolhido a partir do grupo que consiste em: ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e misturas dos mesmos.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado pelo ácido forte ser ácido clorídrico.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pela etapa (a) ser realizada a uma temperatura compreendida entre 50 °C e 90 °C.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pela etapa (a) ser realizada durante 30 minutos a 24 horas.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pela concentração de amifostina estar compreendida entre 80 mg/ml e 500 mg/ml.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pela molaridade do ácido estar compreendida entre 1M e 4M.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizado pela razão molar entre a quantidade de amifostina e a quantidade de ácido estar compreendida entre 1:0,5 e 1:3.

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado por compreender ainda uma etapa (a1), após a etapa (a) e antes da etapa (b) para diluir a solução de 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol, com ou sem adição de excipientes na solução.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela etapa (a1) consistir na adição de uma solução aquosa compreendendo água ou pelo menos um poloxâmero na solução de 2- [(3- aminopropil)amino]etanotiol.

13. USO DA COMPOSIÇÃO DE TERMOGEL, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar ou proteger tecido mucoso ou cutâneo contra danos associados com terapia anticâncer, em particular com radiação e/ou tratamento quimioterápico de cânceres.

14. USO DA COMPOSIÇÃO DE TERMOGEL, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar mucosite oral induzida por radiação.

15. USO DA COMPOSIÇÃO DE TERMOGEL, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar eritema cutâneo induzido por radiação.