BR112019005633A2 - tcrs específicos para antigênio ha-1 de histocompatibilidade (h) menor e usos dos mesmos - Google Patents

tcrs específicos para antigênio ha-1 de histocompatibilidade (h) menor e usos dos mesmos Download PDF

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Abstract

a presente divulgação fornece composições e métodos para direcionar um antígeno de histocompatibilidade (h) menor (ha-1h?) para, por exemplo, prevenir ou controlar a recaída de uma malignidade hematológica após transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (hct). são também fornecidos construtos transgênicos que codificam as proteínas de ligação manipuladas, tais como um receptor de células t ou um receptor de antígeno quimérico, que codifica opcionalmente componentes adicionais tais como um co-receptor e/ou comutação de segurança. tais construtos de transgenes podem ser transduzidos em uma célula imune, tal como uma célula t, e usados como imunoterapia num indivíduo com uma malignidade hematológica ou em risco de recorrência da malignidade hematológica (por exemplo, leucemia, linfoma, mieloma).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para TCRS ESPECÍFICOS PARA ANTIGÊNIO HA-1 DE HISTOCOMPATIBILIDADE (H) MENOR E USOS DOS MESMOS
ANTECEDENTES
DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0001] A listagem de sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel, e é aqui incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é 360056_455WO_SEQUENCE_LISTING.txt. O arquivo de texto é de 200 KB, criado em 22 de setembro de 2017, e está sendo submetido eletronicamente via EFS-Web.
DECLARAÇÃO DE INTERESSE DO GOVERNO [0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob CA154532 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.
ANTECEDENTES [0003] Pacientes com neoplasias hematológicas podem ser tratados com transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (HCT). Nos Estados Unidos, por exemplo, os transplantes alogênicos de HCT aumentaram de forma constante nos últimos 35 anos, com aproximadamente 8.000 transplantes por ano desde 2013 (ver Resumo do CIBMTR 2016). No entanto, a recaída da malignidade hematológica pode ocorrer a partir de então. Atualmente, um número significativo de pacientes
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2/140 que recebem HCT para o tratamento da recaída da leucemia aguda (aproximadamente 2.000 pacientes recaem após o HCT a cada ano apenas nos EUA, ou cerca de 25 a 50%; ver SuchestonCampbell et al. , Curr. Hematol, Malig. Rep. 10: 45-58, 2015) . As taxas de recaída são especialmente altas em pacientes que não conseguem atingir remissões completas profundas e/ou são incapazes de tolerar regimes de condicionamento intensivo antes do HCT. O prognóstico para pacientes com recaída pósHCT é abismai: taxas de sobrevida de dois anos para pacientes com recaída a <100, 100-200 e > 200 dias após o HCT são de 3%, 9% e 19%, respectivamente. Os pacientes que recebem um segundo HCT podem ter melhores resultados, mas para serem elegíveis para um segundo HCT, o paciente deve primeiro alcançar a remissão, o que geralmente ocorre apenas em cerca de 30% dos pacientes.
[0004] Recaídas de leucemia aguda podem, em alguns casos, ser tratadas com infusões de linfócitos doadores de doador original de células-tronco. Esse efeito de enxerto versus leucemia (GVL) da infusão de linfócitos do doador, no entanto, é muitas vezes acompanhado pela doença do enxerto versus o hospedeiro (GVHD), causando mortalidade e morbidade graves e nem sempre é eficaz. Se o GVL pudesse ser seletivamente aumentado sem aumentar as respostas imunes contra os tecidos normais (doença do enxerto versus hospedeiro, GVHD), recaídas pós-HCT poderíam ser prevenidas.
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3/140 [0005] Certos antígenos H menores são expressos em células-tronco leucêmicas e blastos (ver, por exemplo, Bleakley e Riddell, Nat. Rev. Cancer 4: 371-380, 2004;
Bleakley et al., Blood 115: 4923-4933, 2010; Bleakley e Riddell) . Immunol, Cell Biol 89: 396-407, 2011, van der Harst et al., Blood 83: 1060- 1066, 1994, Bonnet et al., Proc. Natl. Acad. USA 96: 8639-8644, 1999; Hambach et al., Leukemia
20: 371-374, 2006), e foram alvos de uso de células T
específicas de câncer. Em um pequeno ensaio clínico de
imunoterapia com células T dirigidas ao antigeno H menor em
pacientes com recaída pós-HCT, foram observadas respostas clínicas em alguns pacientes (Warren et al, Blood 115: 38693878, 2010) . Avanços técnicos na modificação genética de células T e conhecimento crescente da biologia de células T significam que doses terapêuticas de células T específicas para antígenos podem agora ser preparadas eficientemente, administradas a pacientes, e persistir e exercer efeitos antitumorais In vivo (Heemskerk et al. , J. Exp. Med. 199:885894, 2004; Morgan et al., Science 314:126-129, 2006; Griffioen et al. , Haematologica 93:1535-131543, 2008; Ochi et al. , J. Blomed. 20 Blotechnol. 2010:5212248, 2010; Schmitt etal., Hum. Gene Ther. 20:1240-1248, 2009; Stromnes et al., Immunol Rev. 257:145-164, 2014) . No entanto, existe a necessidade de terapias baseadas em células que atinjam antígenos associados à leucemia. Atualmente, as modalidades
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4/140 divulgadas respondem a estas necessidades e fornecem outras vantagens relacionadas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0006] A Figura 1 mostra um processo usado para isolar e caracterizar clones de células T especificas de HA1H da presente divulgação, (parte superior esquerda da Figura 1) Para isolar células T especificas de HA-1H, as células CD8+ foram iniciadas com células dendriticas (DCs) pulsadas com peptideo HA1H (VLHDDLLEA; SEQ ID NO: 1) e expandido em microculturas. (Meio esquerda). Após 12 dias de incubação em meio de CTL contendo IL-12 e IL-15, alíquotas das células T foram avaliadas num ensaio de microcitotoxicidade em cavidades divididos, em que as células T2 foram pulsadas ou não com o peptideo VLHDDLLEA. (parte menor que esquerda). As células que reagiram especificamente contra o T2+ VLHDDLLEA foram clonadas por diluição limitante, reavaliadas quanto à citotoxicidade e rapidamente gastas para posterior avaliação (8 clones). (parte superior direita). Dados de citometria de fluxo apresentando especificidade de HA-1H dos sete (7) clones indicados. Coloração para coloração com dextrâmero HLA-A2-HA-1H (eixo y) e CD8 (eixo x) . (parte inferior direita). Dados de um experimento de ensaio de liberação de cromo (CRA) em que os clones de CTL indicados foram testados quanto à lise específica de células T2 marcadas com 51CR pulsadas com o peptideo cognato nas titulações indicadas.
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5/140 [0007] As Figuras 2A-2C mostram a caracterização de clones de células T citotóxicas isoladas que foram obtidos usando o método mostrado na Figura 1. (A) multímero HLAA2/HA-1H e coloração de anticorpo monoclonal CD8+ de sete (7) de clones específicos representativos de HA-1H (1, 2, 10, 13, 4, 16 e 5) e um clone de controle específico para outro antígeno tumoral. (B) Dados de um ensaio de liberação de cromo no qual os sete clones específicos de HA-1H foram testados para matar células alvos pulsadas com peptídeo HA1. (C) Dados de ensaios de citotoxicidade em que os clones de CTL específicos para HA-1H foram incubados com células T2 pulsadas com peptídeo, linhagem de células AML HA-1H+ THP-1, AML primária HA-1H+ ou HA-1- AML.
[0008] A Figura 3 representa um construto lentiviral que codifica TCR HA-1H representativa da presente divulgação.
[0009] A Figura 4 mostra um procedimento para avaliar células T transduzidas para expressar TCR HA-1.
[0010] As Figuras 5A-5C mostram expressão e atividade de células T CD8+ transduzidas com HA-1H. (A) Dados de citometria de fluxo mostrando ligação de dextrâmero HA1H e expressão de CD8 de células T transduzidas com TCR2 ou TCR16. (B) Atividade de morte de células T CD8+ transduzidas com TCR2 ou TCR16, bem como dos 'clones parentais' correspondentes, ou seja, os clones de células T dos quais foram isolados TCR2 e TCR16 e de um clone de controle
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6/140 específico para um controle antígeno diferente (SMCY). À esquerda, lise de células T2 pulsadas com HA-1H. Direita, células T2 pulsadas com peptídeo SMCY irrelevante. (C) Lise específica de células T2 pulsadas com a quantidade indicada de peptídeo HA-1H (eixo x) por HA-1H TCR2 (linha tracejada com círculos), HA-1H TCR16 (linha tracejada com quadrados), clone de TCR2 parental (linha sólida com círculos), clone parental de TCR16 (linha sólida com quadrados), e um clone heterólogo ou parental específico para o peptídeo SMCY (duas linhas inferiores no gráfico).
[0011] As Figuras 6A-6E mostram a transdução e a atividade de TCRs HA-1H em células T CD8+ utilizando um vetor lentiviral. (A) Citometria de fluxo mostrando coloração multimérica de HLA-A2/HA-1h de células T CD8+ transduzida para conter um polinucleotídeo codificando um TCR específico de HA-1H (especificamente, clones de TCR 1, 2, 10, 16 e 5), que foram liberados com um vetor lentiviral (LV), ou com um TCR específico para um antígeno H menor diferente (controle). (B-E) Um ensaio de liberação de cromo (CRA) foi usado para avaliar a atividade lítica específica. (B) Lise de células alvos T2 pulsadas com antígeno de peptídeo HA-1 a várias concentrações por células T CD8+ transduzidas com TCR (linhas sólidas e símbolos-círculos TCR2, quadrados TCR16), clones de células T específicos de HA-1H (linhas tracejadas, símbolos abertos - clone 2=círculos, clone 16=quadrados) ou
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7/140 controle de clones de células T (losangos). (C) Lise de HLAA2+ HA-1H+ LCL por células T CD8+ transduzidas com TCR2 específico de HA-1H (círculos) ou TCR16 específicos de HA-1H (quadrados) no efetor indicado: razões alvos (E:T). (D) Lise de HLA-A2+/HA-1+ homozigótico (H/H) (círculos n=7), HLAA2+/HA1H+ heterozigótico (H/R) (quadrado n=22), HLA-A2+/HA~1H~ (R/R) (triângulos n=17) ou células hematopoiéticas (LCL) (triângulos invertidos n=41) negativas para HLA-A2 alvos de células T CD8+ transduzidas com HA-1H TCR2. (Ε) Lise de LCL com alelos HLA comuns por células T CD8+ transduzidas com HA-1H TCR2. Uma razão E:T de 20:1 foi usada, a menos que
especificado de outra forma. Dados comparáveis àqueles
mostrados em (D) e (E) também obtidos com HA-1H TCR16 (não
mostrado).
[0012] A Figura 7 fornece dados de experimentos de
citotoxicidade em que células alvos que expressam endogenamente HA-1 (HA-1H+ LCL (H/H ou H/R) e HA-1H~ LCL (R/R) foram incubadas com células transduzidas com TCR2 ou com células de clone 2 parentais. Além disso, é mostrado um clone de controle específico para um antígeno H menor associado ao cromossoma Y (FIDSYICQV).
[0013] As Figuras 8A-8E mostram a morte específica de células de leucemia HA-1+ por células T CD8+ transduzidas com HA-1H -TCR2-. (A) expressão específica de HA~1H de CD107a em células T CD8+ transduzidas com HA-1H -TCR2 mostrando
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8/140 degranulação após 5h de co-cultura (1:1) com um painel de amostras primárias de AML. (B-E) CRA mostrando lise de alvos de leucemia e linfoma por células T CD8+ transduzidas com TCR de HA-1; (B) Lise de HA-1H+ AML primária ou HA-1~ AML por células T CD8+ transduzidas por TCR com HA-1H (barras cinzentas escuras) e clone 2 de células T específico para HA-1H (barras cinzentas claras); (C) HLA-A2+/HÁ-1h+ AML primária (AML1) em várias razões de E:T; (D) linhagens de BALL (1) BALL-1, (2) RS4; 11, linhagens T-ALL (1) MOLT4, (2) CEM (3) RPMI-8402 (4) HSB-2 e linhagem AML NB-4; Linfoma das células T (E) (SUP-M2 HLA-A2 + , HA-1 + ; SU-DHL-1 HLA-A2+ HA-1~ ) . Em (D) HLA-A2~ e/ou as linhagens de células HA-1H- (WT) foram transduzidas (TD) com LV que codifica o minigene *HLAA2 ou **HLA-A2 e HA-1H, se o WT foi HLA-A2- ou teve um genótipo HA-1H. Foi usada uma razão de E:T de 20:1, a menos que especificado de outro modo.
[0014] As Figuras 9A e 9B mostram citotoxicidade de células T transduzidas com TCR2 ou TCR16 (bem como dos clones parentais correspondentes) contra células de leucemia primária HA-1H+ ou HA-1H~. 9A: lise especifica (4h CRA) das linhagens de células indicadas 9B: lise especifica de células alvos nas razões de efetor:alvo indicadas.
[0015] A Figura 10 mostra dados de um ensaio de citotoxicidade no qual células transduzidas com TCR2 e TCR16 (e clones parentais) foram incubadas com fibroblastos
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9/140 dérmicos genotipicamente positivos para HA-1H, com ou sem exposição dos fibroblastos ao interferon faixa (ΙΕΝγ).
[0016] As Figuras 11A-11C mostram a caracterização de células T CD4+ transduzidas com as variantes do coreceptor CD8 e HA-1H TCR2. (A) (i, ii) Intensidade de fluorescência média (MFI) de coloração de multimero de HA1H/HLA-A2 de células T CD4+ transduzidas com cadeias CD8a e/ou cadeias βΜ1-Μ5 (como indicado), (ill) MFI das vários construtos de co-receptor de CD8 está resumido no gráfico. (B) CRA mostrando lise de T2 pulsada com peptideo HA-1H a várias concentrações por células T CD8+ especificas de HA_1 (círculos sólidos), células T CD4+ transduzidas com as cadeias CD8 α e β (quadrados, losangos, triângulos descendentes), cadeias a CD8 apenas (triângulos ascendentes) ou TCR HA-1H apenas (circulo aberto) . (C) Ensaio de proliferação mostrando a diluição do corante de carboxifluoresceina (CFSE) com divisão celular em células T CD4+ transduzidas com (de cima para baixo) o TCR HA-1H sozinho, com uma cadeia CD8 a, CD8 a e βΜΙ, ou cadeia CD8 α e βΜ4, em resposta a estimulo com HLA-A2+ HA-1H+ LCL, HA-1H~ LCL ou apenas meio.
[0017] As Figuras 12A e 12B mostram uma caracterização funcional adicional de células T CD4+ transduzidas com o HA-1H -TCR2 e um co-receptor de CD8. (A) Ensaio de citocina intracelular mostrando produção de IL-2
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10/140 e IFN-γ por células T CD8+ (esquerda) e células T CD4+ (direita) transduzidas com HA-1H TCR2 LV (painéis superiores) ou co-receptor LV de HA-1H TCR2-CD8 (painéis inferiores) em resposta a HLA-A2+/HA-1H+ AML ou HLA-A2+/HA-1h~ AML; (B) ensaio CFSE mostrando proliferação de células T CD8+ (à esquerda) e células T CD4+ (à direita) transduzidas com TCR2 LV especifico de HÁ-1H (painéis superiores) co-receptor LV de HA-1H TCR2-CD8 (painéis inferiores) em resposta a AML primário HLA-A2+/HA- 1H+, HLA-A2 + /HA-1H- AML ou controle de meio.
[0018] A Figura 13 fornece diagramas representativos de construtos de genes de comutação de segurança da presente
divulgação (parte inferior) e esquema usando os construtos
de genes de comutação de segurança para matar células T
(parte superior).
[0019] A Figura 14 fornece dados de um ensaio de
citotoxicidade em que células T primárias foram transduzidas com construtos de transgene expressando genes de comutação de segurança e o TCR2 especifico de HA-1H (ou foram transduzidos apenas com TCR2) e incubadas com células T2 pulsadas com peptideo HA-1H.
[0020] A Figura 15 mostra a porcentagem de sobrevivência dos TCRs transduzidos na presença ou ausência de um fármaco suicida que ativa o comutador de segurança codificado.
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11/140 [0021] A Figura 16 mostra a sobrevivência de células T CD8+ transduzidas com genes de segurança com HA-1H TCR2 e após exposição ao fármaco de ativação de segurança cognata nas concentrações indicadas. A sobrevivência das células T transduzids com CD8+ iCasp9-TCR2, tEGFR-TCR2, RQR8-TCR2 e Myc-TCR2 foi medida após 24 horas de incubação com as concentrações indicadas do respectivo fármaco ativador de comutação de segurança: AP1903; mAb anti-EGFR (Cetuximab)+ complemento; anti-CD20 Mab (Rituximab)+ complemento; antimyc mAb+ complemento. As células T transduzidas com HA-1 TCR2 residuais foram quantificadas por citometria de fluxo. As setas indicam as concentrações de fármaco que podem ser alcançadas e toleradas em humanos ín vivo.
[0022] A Figura 17 mostra cinco (5) tipos diferentes de construtos para a avaliação de construtos de expressão de iCasp 9-HA-lH TCR-CD8+: (i) iCasp 9 e TCR2; (ii) co-receptor de CD8 e TCR 2; (iii) co-receptor de iCasp 9, TCR 2 e CD8; (iv) co-receptor de iCasp 9, TCR 2 e CD8 com tag RQR no coreceptor de CD8; e (v) co-receptor de iCasp 9, TCR 2 e CD8 com etiqueta Q (CD34) na cadeia alfa do TCR.
[0023] A Figura 18 representa um fluxograma para avaliar células transduzidas com TCR da presente divulgação.
[0024] A Figura 19 fornece dados de citometria de fluxo que mostram a expressão do TCR manipulado em cada um dos construtos transgênicos indicados antes (linha superior)
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12/140 e após (linha inferior) de enriquecimento com um dextrâmero
HA-1.
[0025] As Figuras 20A e 20B mostram a lise específica de células alvos pulsadas com peptídeo (20A) e linhagens de LCL (20B) por células T transduzidas com construtos de transgenes: iCasp-9-TCR (--; primeira barra); co-receptor CD8 e TCR (-A-; segunda barra); co-receptor iCasp-9-TCR-CD8 (- ♦ -; terceira barra); co-receptor iCasp9-TCR-RQR-CD8 (- - quarta barra); e co-receptor iCas9-CD 34tag-TCR-CD8 (-·-; quinta barra).
[0026] A Figura 21 mostra a elaboração de citocinas por células T transduzidas com os construtos de transgene indicados após estimulação com linhagens de células HA-1H+ (parte superior) ou HA-1H~ (parte inferior) .
[0027] A Figura 22 mostra a atividade citolítica (parte inferior) de células T transduzidas com os construtos transgênicos (parte superior) contra as linhagens de células alvos indicadas.
[0028] A Figura 23 mostra a ausência de atividade citolítica de células T transduzidas com os construtos transgênicos indicadas contra células não hematopoiéticas indicadas na presença ou ausência de interferon gama. As células de controle hematopoiético HA-1H+ foram mortas pelas células T.
[0029] A Figura 24 mostra a elaboração de citocinas
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13/140 por células transduzidas com os construtos de transgenes indicados quando expostas a células de leucemia primárias.
[0030] A Figura 25 fornece histogramas de citometria de fluxo mostrando a proliferação de células T transduzidas quando estimuladas com células de leucemia primária HA-1H+. Parte superior: esquema para medir a proliferação por coloração de células Fl com CFSE (esquerda), e dados de proliferação representativos de uma célula T transduzida com construtos transgênicos da presente divulgação. Parte inferior: proliferação de células T transduzidas com os construtos transgênicos indicados.
[0031] A Figura 26 mostra a sobrevivência (parte inferior) de células T transduzidas com construtos transgênicos como mostrado (parte superior) após introdução do fármaco suicida cognato nas concentrações indicadas.
[0032] A Figura 27 mostra um esquema de enriquecimento para células T manipuladas da presente divulgação. As células T são transduzidas com os construtos de transgene indicados (parte superior) e examinadas para expressão (meio). As células que expressam um marcador de transdução selecionável (epítopo CD34; dois gráficos de dispersão mais à direita) são selecionados utilizando microesferas magnéticas com anticorpo anti-CD34.
[0033] As Figuras 28A e 28B fornecem dados de citometria de fluxo (28A) mostrando a frequência de células
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T transduzidas antes (linha superior) e após (linha inferior) da seleção magnética. Quatro gráficos de dispersão à esquerda: coloração para marcador de seleção CD34 e CD8. Quatro gráficos de dispersão à direita: coloração para o dextrâmero HA-1H e CD8. Também são mostradas (28B) as contagens celulares de células expressando o marcador de seleção de CD34 (esquerda) ou sendo específicas para HA-1H (direita) antes e após a seleção.
[0034] A Figura 29 fornece um esquema mostrando várias funcionalidades de um construto de gene de segurança de TCR da presente divulgação.
[0035] A Figura 30 fornece um diagrama de um vetor de liberação lentiviral que codifica um construto iC9-HA-lHTCR-RQR-CD8 exemplificativa da presente descoloração.
[0036] A Figura 31 mostra a caracterização funcional de células CD8+ e CD4+ transduzidas com um construto transgênico de TCR2-CD8 da presente divulgação. Painel esquerdo: dados de citometria de fluxo mostrando a liberação de citocinas (IL-2; IFN-γ) em resposta ao antígeno de peptídeo HA-1H. Painel intermediário: quantificação dos dados de citometria de fluxo. Painéis à direita: proliferação de células transduzidas em resposta ao HA-1H.
[0037] As Figuras 32A-32E mostram a caracterização de células T CD4+ e CD8+ transduzidas com um (TCR específico de HA-1H)-(RQR)-(CD8) e expandidas para escala clínica. (A)
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Crescimento de células T transduzidas. (B) Ligação de multimeros de TCR de HA-1H e expressão de CD34 em células T transduzidas por citometria de fluxo com coloração de multimero de HA-1/HLA-A2. (C) Expressão de moléculas coestimuladoras e moléculas homing em células T no momento da aférese, após depleção de CD45RA e após transdução e expansão (N=5) . (D, E) Expressão de marcadores de 'exaustão' em TCR DE HA-1H CD8+ e CD4+ no produto final da célula (N=3) (D) e um exemplo representativo (E).
[0038] As Figuras 33A-E mostram dados de ensaios de reconhecimento funcional nos quais as células T transduzidas com HA-1H-TCR2-RQR-CD8 foram incubadas com células alvos. (A) Lise de células T2 alvoa pulsadas com uma faixa de concentrações de peptideo VLH (linhas sólidas, cinza escuro) e VLR (linha sólida, cinza claro) por células T CD8+ (linhas sólidas) e CD4+ (linhas tracejadas) em CRA na razão ET de 20:1. (B) Lise da linhagem de células HA-1H+ A2+ LCL, HA-1H~ A2+ LCL e AML HA-1H+ A2+ (THP-1) por CD8+ (linhas sólidas) na produção de CRA (C) IL-2, ΙΕΝ-γ e TNFa por células T em resposta ao estimulo por células T2 pulsadas com 10ng/ml de peptideo HA-1. (D) Gráficos de pizza exibindo o número de tipos de citocinas secretadas pelas células T. (E) Concentração de citocinas e granzima B em meios 24 horas após o estimulo de células T por células T2 pulsadas com peptideos VLH ou VLR, como medido por imunoensaio multiplex.
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16/140 [0039] A Figura 34A mostra a expressão (A) CD34 (gráfico à esquerda) e TCR DE HA-1H (gráfico à direita) em células T no produto final antes e após o enriquecimento por pérolas CD34 imunomagnéticas (N=3). A Figura 34B mostra a sobrevivência de células T no produto celular após 24 horas de incubação com 5 ng/mL de AP1903 ou apenas controle de meio.
[0040] A Figura 35 mostra a atividade citolitica de células T transduzidas com outro TCR HA-1H da presente divulgação (círculos) e de células de controle (triângulos) contra células T2 pulsadas com o antígeno HA-1H nas concentrações indicadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0041] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece composições e métodos para tratar doenças hiperproliferativas caracterizadas por expressão de antígeno de histocompatibilidade menor HA-1H. Por meio de antecedentes, o teste de antígeno de leucócito humano (HLA) é normalmente usado para corresponder a receptores de transplantes de órgãos, células e tecidos com doadores compatíveis. O teste de HLA identifica os principais genes HLA que uma pessoa herdou e os antígenos correspondentes, ou proteínas, que estão presentes na superfície de suas células. Esses antígenos ajudam o sistema imune do corpo a distinguir quais células são próprias e quais são estranhas ou não
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17/140 próprias. Quaisquer células reconhecidas como nãopróprias podem desencadear uma resposta imune, como citotoxicidade mediada por células T ou a produção de anticorpos. Deve-se observar que os testes para os principais genes HLA não identificam os genes HLA menores, que dão origem a outros antigenos. Consequentemente, mesmo células doadoras compatíveis com HLA podem atacar células receptoras saudáveis expressando uma proteína ou peptídeo HLA menor estranho. Antigenos H menores que são expressos nos tecidos epiteliais são alvos de células T alorreativas, levando à doença do enxerto versus hospedeiro. No entanto, alguns antigenos H menores estão associados a genes que são expressos predominantemente ou exclusivamente no sistema hematopoiético, incluindo células hematopoiéticas que podem ser afetadas por malignidades hematológicas. Assim, antigenos H menores com expressão restrita são alvos potenciais para terapias que buscam aumentar o efeito de enxerto versus leucemia e, assim, prevenir a recaída.
[0042] O antígeno de histocompatibilidade menor HA1H é codificado pelo gene HMHA1 polimérico (também denominado proteína ativadora da GTPase Rho 45) e é altamente expresso em células de leucemia e células hematopoiéticas normais (ver, por exemplo, Gríffíoen etal. , Front. Immunol. 7:100, 2016; Spierings et al. Biol. Blood Marrow Transpl. 19:12441253 2013, a revelação da expressão HA-1 da qual é aqui
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18/140 incorporada por referência), mas não em células normais não hematopoiéticas. As variantes HMHA1 (rsl801284 A/A ou A/G) presentes em 52% dos indivíduos dão origem a um peptídeo imunogênico contendo um resíduo de histidina no lugar de uma arginina (VLHDDLLEA; SEQ ID NO: 66) (polimorfismo R139H) e apresentação de HLA deste peptídeo ocorre em indivíduos com o alelo HLA-A*0201 (A2) comum (den Haan et al. , Science 279:1054-1057, 1998). As terapias com células T direcionadas para HA-1H são portanto aplicáveis a aproximadamente 25% dos indivíduos transplantados para malignidades hematológicas e requerem um doador de células T que seja negativo para HLAA2 negativo ou para HA-1H negativo (HA-1R; rsl801284 G/G VLRDDLLEA; SEQ ID NO: 65).
[0043] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece células imunes manipuladas que expressam proteínas de ligação, tais como TCRs e CARs, específicas para HA-1H. Estas células imunes manipuladas podem ser usadas como terapia independente para tratar uma malignidade hematológica ou para prevenir uma recaída ou recorrência da mesma, ou tais células podem ser usadas como parte de um regime terapêutico compreendendo terapias ou agentes adicionais (por exemplo, a seguir, ou em combinação com HCT alogênico).
[0044] Antes de apresentar esta divulgação em mais detalhe, pode ser útil para uma compreensão do mesmo fornecer
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19/140 definições de certos termos para serem usados aqui. Definições adicionais são estabelecidas ao longo desta divulgação.
[0045] Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de razão, ou faixa d inteiro deve ser entendido como incluindo o valor de qualquer inteiro dentro da faixa especificada e, quando apropriado, frações dos mesmos (tal como um décimo e um centésimo de um inteiro), salvo indicação em contrário. Além disso, qualquer intervalo de número aqui referido, relacionado com qualquer característica física, tal como subunidades de polímero, tamanho ou espessura, deve ser entendido como incluindo qualquer número inteiro dentro da faixa indicada, a menos que indicado de outro modo. Como usado aqui, o termo cerca de significa ± 20% da faixa, valor ou estrutura indicados, salvo indicação em contrário. Deve ser entendido que os termos um e uma como usado aquis referem-se a um ou mais dos componentes enumerados. O uso da alternativa (por exemplo, ou) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. Como usado aqui, os termos incluem, tem, e compreendem são usados como sinônimos, cujos termos e as suas variantes destinamse a ser interpretados como não limitativos.
[0046] Além disso, deve ser entendido que os compostos individuais, ou grupos de compostos, derivados das
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20/140 várias combinações das estruturas e substituintes aqui descritos, são divulgados pelo presente pedido na mesma extensão como se cada composto ou grupo de compostos fosse definido adiante individualmente. Assim, a seleção de estruturas particulares ou substituintes particulares está dentro do escopo da presente divulgação.
[0047] O termo consistindo essencialmente em não é equivalente a compreendendo e refere-se aos materiais especificados ou etapas de uma reivindicação, ou àqueles que não afetam materialmente as características básicas de uma matéria reivindicada. Por exemplo, um domínio de proteína, região, ou módulo (por exemplo, um domínio de ligação, região de dobradiça, módulo ligante) ou uma proteína (que pode ter um ou mais domínios, regiões ou módulos) consiste essencialmente em uma sequência particular de aminoácidos quando a sequência de aminoácidos de um domínio, região, módulo ou proteína inclui extensões, deleções, mutações ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, aminoácidos no terminal amino ou carbóxi ou entre domínios) que, em combinação, contribuem para no máximo 20% (por exemplo, no máximo 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) do comprimento de um domínio, região, módulo ou proteína e não afetam substancialmente (ou seja, não reduzem a atividade em mais de 50%, como não mais do que 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1%) da atividade do(s) domínio(s), região(ões),
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21/140 módulo(s) ou proteína (por exemplo, afinidade de ligação ao alvo de uma proteína de ligação).
[0048] Como usado aqui, uma célula do sistema imune significa qualquer célula do sistema imune que se origina de uma célula-tronco hematopoiética na medula óssea, que dá origem a duas linhagens principais, uma célula progenitora mieloide (que dá origem a células mieloides como monócitos, macrófagos, células dendríticas, meagacariócitos e granulócitos) e uma célula progenitora linfoide (que dá origem a células linfoides, tais como células T, células B e células assassinas naturais (NK)). Exemplos de células do sistema imune incluem uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, uma célula T CD4- CD8- duplo negativo, uma célula T γδ, uma célula T reguladora, uma célula assassina natural e uma célula dendrítica. Macrófagos e células dendríticas podem ser referidos como células apresentadoras de antígenos ou APCs, que são células especializadas que podem ativar células T quando um receptor complexo de histocompatibilidade principal (MHC) na superfície das APCs complexadas com um peptídeo interage com um TCR na superfície de uma célula T.
[0049] Uma célula T ou linfócito T é uma célula do sistema imune que amadurece no timo e produz receptores de células T (TCRs) . As células T podem ser naives (Tn; não expostas ao antígeno; aumento da expressão de CD62L,
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CCR7, CD28, CD3, CD127 e CD45RA e diminuição ou ausência de expressão de CD45RO em comparação com Tcm (descrita aqui)), células T de memória (Tm) (antígeno experimentado e de longa duração) e células efetoras (antígeno-experimentado, citotóxico) . As Tm podem ainda ser divididas em subconjuntos de células T de memória central (TCm expressa CD62L, CCR7, CD28, CD45RO) e células T efetoras de memória (Tem expressam CD45RO, expressão diminuída de CD62L, CCR7 e CD28). As células T efetoras (Te) referem-se a linfócitos T citotóxicos CD8+ experimentados em antígenos que expressam CD45RA, diminuíram a expressão de CD62L, CCR7 e CD28 em comparação com Tcm, e são positivos para granzima e perforina. Células T auxiliares (Th) são células CD4+ que influenciam a atividade de outras células imunes, liberando citocinas. As células T CD4+ podem ativar e suprimir uma resposta imune adaptativa, e qual dessas duas funções é induzida dependerá da presença de outras células e sinais. As células T podem ser recolhidas utilizando técnicas conhecidas e as várias subpopulações ou combinações destas podem ser enriquecidas ou esgotadas por técnicas conhecidas, tais como por ligação de afinidade a anticorpos, citometria de fluxo ou seleção imunomagnética. Outras células T exemplificativas incluem células T reguladoras, tais como células T reguladoras CD4+ CD25+ (Foxp3+) e células Tregl7, bem como células T restringidas com Trl, Th3, CD8+ CD28~ce Qa-1.
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23/140 [0050] Receptor de células T (TCR) refere-se a um membro da superfamia de imunoglobulina (tendo um domínio de ligação variável, um domínio constante, uma região transmembranar e uma cauda citoplasmática curta; (ver, por exemplo, Janeway el al. , Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3° Ed., Current Biology Publications, p. 433, 1997) capaz de se ligar especificamente a um peptideo antigênico ligado a um receptor de MHC. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel e geralmente é constituído por um heterodimero com cadeias a e β (também conhecidos como TCR a e TCR3, respectivamente) ou cadeias γ e δ (também conhecidas como TCRy e TCRõ, respectivamente).
[0051] Como outras imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos), a porção extracelular das cadeias de TCR (por exemplo, cadeia a, cadeia β) contém dois domínios de imunoglobulina, um domínio disponível (por exemplo, domínio variável de cadeia-α ou domínio variável de cadeia Va ou νβ; tipicamente aminoácidos 1 a 116 com base na numeração de Rabat (Rabat et al., Sequências de Proteínas de Interesse Imune, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Serviço de Saúde Pública National Institutes of Health, 1991, 5 (ed.) no terminal N, e um domínio constante (por exemplo, domínio constante de cadeia α ou Ca, tipicamente 5 aminoácidos 117 a 259 com base em Rabat, domínio constante
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24/140 de cadeia β ou C β tipicamente aminoácidos 117 a 295 com base em Kabat) adjacente à membrana celular. Igualmente, tal como as imunoglobulinas, os domínios variáveis contêm regiões determinantes complementares (CDR) separadas por regiões de trabalho de estrutura (FRs) (ver, por exemplo, lores et al. , Proc. Nat ' 1 Acad. Sei. USA 87:9138, 1990; Chothia et al. , EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003).
[0052] Antígeno ou Ag, como usado aqui, referese a uma molécula imunogênica que provoca uma resposta imune. Esta resposta imune pode envolver a produção de anticorpos, a ativação de células específicas imunologicamente competentes (por exemplo, células T), ou ambas. Um antígeno (molécula imunogênica) pode ser, por exemplo, um peptideo, glicopeptídeo, polipeptídeo, glicopolipeptídeo, polinucleotídeo, polissacarídeo, lipídeo ou semelhante. É evidente que um antígeno pode ser sintetizado, produzido recombinantemente, ou derivado de uma amostra biológica. Exemplos de amostras biológicas que podem conter um ou mais antígenos incluem amostras de tecido, amostras tumorais, células, fluidos biológicos ou combinações dos mesmos. Os antígenos podem ser produzidos por células que foram modificadas ou geneticamente manipuladas para expressar um antígeno, ou que endogenamente (por exemplo, sem modificação ou engenharia genética por intervenção humana) expressam uma
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25/140 mutação ou polimorfismo que é imunogênico.
[0053] Complexo de histocompatibilidade principal (MHC) refere-se a glicoproteinas que distribuem antigenos peptidicos para uma superfície celular de todas as células nucleadas. As moléculas de MHC de classe I são heterodimeros tendo uma membrana que abrange uma cadeia (com três domínios) e uma microglobulina β2 associada não covalentemente. As moléculas do MHC de classe II são compostas por duas glicoproteinas transmembrana, α e β, ambas abrangendo a membrana. Cada cadeia tem dois domínios. As moléculas MHC de classe I distribuem peptídeos originários do citossol paraba superfície celular, onde um complexo de peptídeo:MHC é reconhecido por células T CD8+. Moléculas de MHC de classe II liberam peptídeos originários do sistema vesicular para a superfície celular, onde são reconhecidos pelas células T CD4+. O MHC humano é referido como antígeno leucocitário humano (HLA).
[0054] O termo epítopo ou epítopo antigênico inclui qualquer molécula, estrutura, sequência de aminoácidos ou determinante proteico que é reconhecido e especificamente ligado por uma molécula de ligação cognata, tal como uma imunoglobulina, receptor de células T (TCR), receptor de antígeno quimérico, ou outra molécula de ligação, domínio ou proteína. Os determinantes epitópicos geralmente contêm agrupamentos de moléculas quiméricamente ativas, como
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26/140 aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga.
[0055] Como usado aqui liga-se especificamente ou específico para refere-se a uma associação ou união de uma proteína de ligação (por exemplo, receptor TCR) ou um domínio de ligação (ou uma proteína de fusão do mesmo) a uma molécula alvo com uma afinidade ou Ka (ou seja, uma constante de associação de equilíbrio de uma interação de ligação particular com unidades de 1/M) igual ou maior que 105 (que é igual à razão entre a taxa on [kon] e a taxa off [kOff] para esta reação de associação), embora não se associem ou se liguem significativamente a quaisquer outras moléculas ou componentes em uma amostra As proteínas de ligação ou domínios de ligação (ou proteínas de fusão dos mesmos) podem ser classificadas como proteínas de ligação ou domínios de ligação de alta afinidade (ou proteínas de fusão dos mesmos) Proteínas de ligação ou domínios de ligação de alta afinidade referem-se àquelas proteínas de ligação ou domínios de ligação com uma Ka de pelo menos 107 M_1, pelo menos 108 M_1, pelo menos 109 M_1, pelo menos IO10 M_1, pelo menos 1011 M_1, pelo menos 1012 M_1, ou pelo menos 1013 M_1. As proteínas de ligação ou domnios de ligação de baixa afinidade referem-se protenas de ligação ou domnios de ligação tendo uma Ka de até 107 M_1, até 106 M_1, até 105 M_1. Em alternativa,
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27/140 a afinidade pode ser definida como uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de uma interação de ligação particular com unidades de M (por exemplo, 10~5 M a 10~13 M) .
[0056] Em certas modalidades, um receptor ou domínio de ligação pode ter afinidade aumentada, que se refere a receptores ou domínios de ligação selecionados ou construídos com ligação mais forte a um antígeno alvo do que a um domínio de ligação de tipo selvagem (ou parental). Por exemplo, a afinidade aumentada pode ser devido a um Ka (constante de associação de equilíbrio) para o antígeno alvo que é maior do que o domínio de ligação do tipo selvagem, devido a um Kd (constante de dissociação) para o antígeno alvo que é menor que o do domínio de ligação do tipo selvagem, devido a uma taxa off (kOff) para o antígeno alvo que é menor que do domínio de ligação do tipo selvagem, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, os TCRs de afinidade melhorada podem ser codificados para aumentar a expressão numa célula hospedeira particular, tal como uma célula do sistema imune, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula T, uma célula T primária, uma linhagem de células T, um célula NK, ou uma célula T assassina natural (Scholten et al, Clin. Immunol. 119: 135, 2006). A célula T pode ser uma célula T CD4+ ou CD8+.
[0057] Diversos ensaios conhecidos para identificar domínios de ligação da presente divulgação que se ligam
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28/140 especificamente a um alvo particular, bem como determinar o domínio de ligação ou afinidades da proteína de fus, tal como coloração análise de multímero/tetrâmero, Western blot, ELISA, ultracentrifugação analítica, espectroscopia e ressonância de plásmons de superfície (Biacore®) (ver, por exemplo, Dolton et al. , Immunology 146:11-22, 2015, Scatchard et al. , Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 20295: 2103, 2002, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560, 1993, e Patentes US n°s. 5.283.173, 5.468.614, ou o equivalente, todos aqui incorporados por referência).
[0058] A fonte de um TCR como usado na presente divulgação pode ser de várias espécies animais, tais como um humano, camundongo, rato, coelho ou outro mamífero.
[0059] Como usado aqui, o termo co-receptor de CD8 ou CD8 significa a glicoproteína de superfície celular CD8, quer como um homodímero alfa-alfa ou um heterodímero alfa-beta. O co-receptor CD8 auxilia na função de células T citotóxicas (CD8+) e funciona através da sinalização através da sua via citoplasmática de fosforilação de tirosina (Gao e Jakobsen, Immunol. Today 21: 630-636, 2000; Cole e Gao, Cell. Mol. Immunol 1: 81-88, 2004) . Existem cinco (5) diferentes cadeias CD8 beta (ver identificador UniProtKB P10966) e uma única cadeia alfa CD8 (ver identificador UniProtKB P01732).
[0060] CD4 é uma glicoproteína co-receptora de
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29/140 imunoglobulina que ajuda o TCR a se comunicar com as células apresentação de antígeno (ver Campbell & Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, Sexta Ed., 2002)) . O CD4 encontra-se na superfície de células imunes, tais como células T auxiliares, monócitos, macrófagos e células dendríticas, e inclui quatro domínios de imunoglobulina (Dl a D4) que são expressos na superfície celular. Durante a apresentação do antígeno, CD4 é recrutado, juntamente com o complexo de TCR, para se ligar a diferentes regiões da molécula de MHCII (o CD4 liga-se a MHCII β2, enquanto o complexo de TCR liga-se a MHCIIal/βΙ). Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que a proximidade com o complexo TCR permite que as moléculas de cinase associadas a CD4 fosforila os motivos de ativação da tirosina imunorreceptora (ITAMs) presentes nos domínios citoplasmáticos de CD3. Acredita-se que esta atividade amplifique o sinal gerado pelo TCR ativado para produzir vários tipos de células T auxiliares [0061] Em certas modalidades, encontra-se um TCR na superfície de células T (ou linfócitos T) e associa-se a um complexo CD3. CD3 é um complexo multiproteico de seis cadeias (ver, Abbas e Lichtman, 2003; Janeway et al. , P. 172 e 178, 1999) que está associado à sinalização de antígeno em células T. Nos mamíferos, o complexo compreende uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3õ, duas cadeias CD3s e um homodímero de cadeias CD3ç. As cadeias CD3y, 3ϋ3β e CD3s são proteínas de
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30/140 superfície celular altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulinas contendo um único domínio de imunoglobulina. As regiões transmembranares das cadeias CD3y, CD3p e CD3s são carregadas negativamente, que é uma característica que permite que estas cadeias se associem com as cadeias receptoras de células T carregadas positivamente. As caudas intracelulares das cadeias CD3y, Οϋ3β e CD3s contêm, cada uma, um único motivo conservado conhecido como um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor ou ITAM, enquanto que cada cadeia CD3ç tem três. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que os ITAMs são importantes para a capacidade de sinalização de um complexo de TCR. O CD3, tal como usado na presente divulgação, pode ser de várias espécies animais, incluindo humanos, camundongo, rato ou outros mamíferos.
[0062] Como usado aqui, complexo de TCR refere-se a um complexo formado pela associação de CD3 com TCR. Por exemplo, um complexo de TCR pode ser composto por uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3p, duas cadeias CD3s, um homodímero de cadeias CD3/, uma cadeia de TCRa e uma cadeia TCRp. Alternativamente, um complexo de TCR pode ser composto por uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3p, duas cadeias CD3s, um homodímero de CD3ç, cadeias, uma cadeia de TCRy e uma cadeia de TCRp.
[0063] Um componente de um complexo de TCR, como
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31/140 usado aqui, refere-se a uma cadeia de TCR (isto é, TCRa, TCRp, TCRy ou TCRõ), uma cadeia CD3 (ou seja, CD3y, CD3õ, CD3s ou CD3ç) , ou um complexo formado por duas ou mais cadeias de TCR ou cadeias CD3 (por exemplo, um complexo de TCRa e TCRp, um complexo de TCRy e TCRõ, um complexo de CD3s e CD3õ, um complexo de CD3y e CD3s, ou um complexo sub-TCR de TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ e duas cadeias de CD3s) .
[0064] Como usado aqui, o termo antígeno HA-1H ou antígeno de peptídeo HA-1H ou antígeno de peptídeo contendo HA-1H menor (ou antígeno HA-1H menor ou antígeno de peptídeo HA-1H menor ou antígeno de peptídeo contendo HA-1H menor ou peptídeo de antígeno histocompatibilidade HA-1H menor) refere-se a uma porção de peptídeo produzida naturalmente ou sinteticamente de uma proteína HMHA1 variando em comprimento de cerca de 7 aminoácidos, cerca de 8 aminoácidos, cerca de 9 aminoácidos, cerca de 10 aminoácidos, até cerca de 20 aminoácidos, e compreendendo o polimorfismo de substituição R139H), que pode formar um complexo com uma molécula de MHC (por exemplo, HLA) e uma proteína de ligação desta descrição específica para um complexo de peptídeo HA-1 H:MHC (por exemplo, HLA) pode se ligar especificamente a tal como complexo. Um exemplo de antígeno de peptídeo HA-1H HA-1 compreende um peptídeo tendo o aminoácido VLHDDLLEA (SEQ ID NO: 66), em que a histidina em negrito na sequência representa o R139H polimorfismo.
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32/140 [0065] O termo proteína de ligação especifica de HA1H, como usado aqui, refere-se a uma proteína ou polipeptídeo, tal como um TCR ou CAR, que se liga especificamente a um antígeno de peptídeo HA-1H (ou a um complexo de antígeno de peptídeo HA-1h:HLA, por exemplo, em uma superfície celular) , e não se liga a um peptídeo HMHA que não contém o polimorfismo HA-1H (por exemplo, um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 65) e não se liga a um complexo HLA contendo tal peptídeo HMHA.
[0066] Em certas modalidades, uma proteína de ligação específica para HA-1H liga-se especificamente a um peptídeo contendo HA-1 (ou um complexo de peptídeo HA-1H: HLA) com um Kd de menos de cerca de 1CD8 M, menor que 1CD9 M, menor que cerca de 1CD10 M, menor que cerca de 10-11 M, menor que cerca de 1CD12 M ou menor que cerca de 1CD13 M, ou com uma afinidade que é aproximadamente a mesma, pelo menos aproximadamente a mesma, ou maior que a ou cerca da afinidade exibida por uma proteína de ligação específica de HA~1 H exemplar aqui fornecida, tal como qualquer um dos TCRs específicos para HA-1H aqui fornecidos, por exemplo, como
medidos pelo mesmo ensaio. Em certas modalidades, uma
proteína de ligação específica de HA-1 compreende uma
proteína de ligação à superfamilia de imunoglobulina
especifica de HA-1 ou uma porção de ligação da mesma.
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33/140 [0067] Princípios de processamento de antigenos por células apresentadoras de antigenos (APC) (como células dendríticas, macrófagos, linfócitos ou outros tipos de células) e de apresentação de antigenos por APC a células T, incluindo apresentação restrita ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) entre APCs imunocompatíveis (por exemplo compartilhando pelo menos uma forma alélica de um gene do MHC que é relevante para a apresentação de antígeno) e células T, estão bem estabelecidos (ver, por exemplo, Murphy, Janburg's Immunobiology (8°Ed) 2011 Garland Science, NY; capítulos 9 e 16) . Por exemplo, os peptídeos antigênicos processados originários do citosol (por exemplo, antígeno tumoral, patógeno intracelular) são geralmente de cerca de 7 aminoácidos a cerca de 11 aminoácidos de comprimento e irão se associar a moléculas de MHC de classe I (HLA), enquanto os peptídeos processados no sistema vesicular (por exemplo, bacteriano, viral) irão variar em comprimento de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos e se associar com moléculas de MHC de classe II (HLA).
[0068] Um domínio alterado ou proteína alterada refere-se a um motivo, região, domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína com uma identidade de sequência não idêntica a um motivo, região, domínio, peptídeo, polipeptídeo ou proteína de tipo selvagem (por exemplo, uma
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34/140 cadeia de TCRa de tipo selvagem, cadeia de TCRp, domínio constante de TCRa, domínio constante de TCRp) de pelo menos 85% (por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) .
[0069] Domínios alterados ou proteínas alteradas ou derivados podem incluir aqueles baseados em todas as escolhas de códon possíveis para as mesmas escolhas de aminoácidos e códons baseadas em substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, cada um dos seis grupos seguintes contém aminoácidos que são substituições conservativas um pelo outro: 1) alanina (ala; A), serina (ser; S), treonina (thr; T); 2) ácido aspártico (asp; D), ácido glutâmico (glu; E); 3) asparagina (asn; N), glutamina (gin; Q); 4) arginina (arg; R), lisina (lys; K); 5) Isoleucina (ile; I), leucina (L), metionina (met; M), valina (vai; V); e 6) fenilalanina (phe; F) , tirosina (tyr; Y) , triptofano (trp; W) . (Veja também, WO97/09433 na página 10, Lehninger, Biochemistry, 2° Edição, Worth Publishers, Inc., NY, NY, pp. 71-77, 1975; Lewin Genes TV, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA, p.8, 1990; Creighton, Proteins, W.H. Freeman e Company 1984) . Adicionalmente, as substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou deletam, um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos numa sequência codificada são também substituições
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35/140 conservativas.
[0070] Como usado aqui, ácido nucléico ou molécula de ácido nucléico refere-se a qualquer ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA), oligonucleotídeos, polinucleotídeos, fragmentos gerados dos mesmos, por exemplo, pela reação em cadeia com polimerase (PCR) ou por translação in vitro, e também por fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação de endonuclease ou ação exonuclease. Em certas modalidades, os ácidos nucléicos da presente divulgação são produzidos por PCR. Os ácidos nucléicos podem ser compostos de monômeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (como desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos) , análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas aenantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural) ou uma combinação de ambos. Os nucleotídeos modificados podem ter modificações ou substituição de porções de açúcar, ou porções de base de pirimidina ou purina. Os monômeros de ácido nucléico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os análogos das ligações de fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e semelhantes. As moléculas de ácido nucléico podem ser de fita simples ou de fita dupla.
[0071] O termo isolado significa que o material é
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36/140 removido do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um ácido nucléico ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo ácido nucléico ou polipeptídeo, separado de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Um tal ácido nucléico pode fazer parte de um vetor e/ou esse ácido nucléico ou polipeptídeo pode fazer parte de uma composição (por exemplo, um lisado celular), e ainda ser isolado pelo fato de tal vetor ou composição não fazer parte do ambiente natural para o ácido nucléico ou polipeptídeo. O termo gene significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; inclui regiões precedendo e seguindo a região de codificação (líder e trailer), bem como sequências intervenientes (introns) entre segmentos de codificação individuais (éxons).
[0072] Como usado aqui, os termos recombinante e manipulado referem-se a uma célula, microrganismo, molécula de ácido nucléico, polipeptídeo, proteína, plasmídeo ou vetor que foi modificado pela introdução de uma molécula de ácido nucléico exógeno, ou refere-se a uma célula ou microrganismo que foi geneticamente modificado por intervenção humana - isto é, modificado pela introdução de uma molécula de ácido nucléico heteróloga, ou se refere a uma célula ou microrganismo que foi alterado de tal modo que
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37/140 a expressão de uma molécula de ácido nucléico endógeno ou gene é controlada, desregulamentada ou constitutiva, quando tais alterações ou modificações puderem ser introduzidas por engenharia genética. As alterações genéticas geradas por humanos podem incluir, por exemplo, modificações na introdução de moléculas de ácido nucléico (que podem incluir um elemento de controle de expressão, como um promotor) que codifica uma ou mais proteínas ou enzimas, ou outras adições, deleções, substituições ou outra ruptura funcional ou adição ao material genético de uma célula. As modificações exemplares incluem aquelas em regiões codificantes ou fragmentos funcionais de polipeptídeos heterólogos ou homólogos de uma molécula de referência ou parental.
[0073] Como usado aqui, mutação refere-se a uma alteração na sequência de uma molécula de ácido nucléico ou molécula de polipeptídeo em comparação com uma molécula de ácido nucléico ou molécula de polipeptídeo de referência ou do tipo selvagem, respectivamente. Uma mutação pode resultar em vários tipos diferentes de alteração na sequência, incluindo substituição, inserção ou deleção de nucleotídeo(s) ou aminoácido(s). Em certas modalidades, uma mutação é uma substituição de um ou três códons ou aminoácidos, uma deleção de um a cerca de 5 códons ou aminoácidos, ou uma combinação dos mesmos.
[0074] Uma substituição conservativa é reconhecida
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38/140 na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades semelhantes. Substituições conservativas exemplares são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, WO 97/09433 na página 10; Lehninger, Biochemistry, 2a Edição; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp. 71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990).
[0075] O termo construto refere-se a qualquer polinucleotídeo que contém uma molécula de ácido nucléico recombinante. Um transgene ou construto de transgene refere-se a um construto que contém dois ou mais genes operacionalmente ligados em um arranjo que não é encontrado na natureza. O termo operacionalmente ligado (ou operativamente ligado aqui) refere-se à associação de duas ou mais moléculas de ácido nucléico num único fragmento de ácido nucléico, de modo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação quando pode afetar a expressão dessa sequência de codificação (isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor).
[0076] Não ligado significa que os elementos genéticos associados não estão intimamente associados uns com os outros e a função de um não afeta o outro. Em algumas modalidades, os genes presentes num transgene estão operacionalmente ligados a uma sequência de controle da
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39/140 expressão (por exemplo, um promotor).
[0077] Um construto (por exemplo, um transgene) pode estar presente em um vetor (por exemplo, um vetor bacteriano, um vetor viral) ou pode ser integrado em um genoma. Um vetor é uma molécula de ácido nucléico que é capaz de transportar outra molécula de ácido nucléico. Os vetores podem ser, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, vírus, um vetor de RNA ou uma molécula de DNA ou RNA linear ou circular que pode incluir moléculas de ácido nucléico cromossômicas, não cromossômicas, semissintéticas ou sintéticas. Vetores exemplares são aqueles capazes de replicação autônoma (vetor epissomal) ou expressão de moléculas de ácido nucléico as quais estão ligados (vetores de expressão). Os vetores úteis nas composições e métodos desta divulgação são aqui descritos mais detalhadamente.
[0078] O termo expressão, como usado aqui, referese ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de codificação de uma molécula de ácido nucléico, tal como um gene. O processo pode incluir transcrição, controle pós-transcricional, modificação póstranscricional, tradução, controle pós-translacional, modificação pós-translacional ou qualquer combinação dos mesmos .
[0079] O termo introduzido no contexto da inserção de uma molécula de ácido nucléico numa célula, significa
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40/140 transíecção ou transformação, ou transdução e inclui referência à incorporação de uma molécula de ácido nucléico numa célula eucariótica ou procariótica em que a molécula de ácido nucléico pode ser incorporada no genoma de uma célula (por exemplo, um cromossoma, um plasmídeo, um plastídeo ou um DNA mitocondrial), convertido num replicon autônomo, ou transitoriamente expresso (por exemplo, mRNA transfectado).
[0080] Como usado aqui, molécula, construto ou sequência de ácido nucléico heterólogo ou exógeno refere-se a uma molécula ou porção de ácido nucléico de uma molécula de ácido nucléico que não é nativa de uma célula hospedeira, mas pode ser homóloga a uma molécula de ácido nucléico ou porção de uma molécula de ácido nucléico da célula hospedeira. A fonte da molécula, construto ou sequência de ácido nucléico heterólogo ou exógeno pode ser de um gênero ou espécie diferente. Em certas modalidades, uma molécula de ácido nucléico heteróloga ou exógena é adicionada (isto é, não endógena ou nativa) a uma célula hospedeira ou genoma do hospedeiro, por exemplo, conjugação, transformação, transfecção, transdução, eletroporação ou semelhantes, em que a molécula pode de integrar no genoma do hospedeiro ou existir como material genético extracromossômico (por exemplo, como um plasmídeo ou outra forma de vetor autorreplicante) e pode estar presente em múltiplas cópias. Adicionalmente, heterólogo refere-se a
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41/140 uma enzima, proteína ou outra atividade não nativa codificada por uma molécula de ácido nucléico exógeno introduzida na célula hospedeira, mesmo se a célula hospedeira codificar uma proteína ou atividade homóloga.
[0081] Como descrito aqui, mais de uma molécula de ácido nucléico heteróloga ou exógena pode ser introduzida numa célula hospedeira como moléculas de ácido nucléico separadas, como uma pluralidade de genes controlados individualmente, como uma molécula de ácido nucléico policistrônico, como uma molécula de ácido nucléico única codificando uma proteína de fusão, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, como divulgado aqui, uma célula hospedeira pode ser modificada para expressar duas ou mais moléculas de ácido nucléico heterólogas ou exógenas que codificam o TCR desejado específico para um peptídeo HA-1H do antígeno de histocompatibilidade (H) menor (por exemplo, TCR α e TCR β) . Quando duas ou mais moléculas de ácido nucléico exógeno são introduzidas numa célula hospedeira, entende-se que as duas ou mais moléculas de ácido nucléico exógeno podem ser introduzidas como uma única molécula de ácido nucléico (por exemplo, num único vetor), em vetores separados, integrados no cromossomo hospedeiro em um único sítio ou em vários sítios, ou qualquer combinação dos mesmos. O número de moléculas de ácido nucléico heterólogas referenciadas ou atividades proteicas refere-se ao número de
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42/140 moléculas de ácido nucléico codificador ou ao número de atividades proteicas, e não ao número de moléculas de ácido nucléico separadas introduzidas numa célula hospedeira.
[0082] Como usado aqui, o termo endógeno ou nativo refere-se a um gene, proteína ou atividade que está normalmente presente numa célula hospedeira. Além disso, um gene, proteína ou atividade que é mutada, superexpressa, embaralhada, duplicada ou de outro modo alterada em comparação com um gene, proteína ou atividade parental é ainda considerada endógena ou nativa a essa célula hospedeira particular. Por exemplo, uma sequência de controle endógeno de um primeiro gene (por exemplo, um promotor, sequências de atenuação de tradução) pode ser usada para alterar ou regular a expressão de um segundo gene ou molécula de ácido nucléico nativo, em que a expressão ou regulação do segundo gene nativo ou a molécula de ácido nucléico difere da expressão ou regulação normal numa célula parental.
[0083] O termo homólogos ou homólogo refere-se a uma molécula ou atividade encontrada ou derivada de uma célula hospedeira, espécie ou cepa. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico heteróloga ou exógena pode ser homóloga a um gene de célula hospedeira nativa e pode opcionalmente ter um nível de expressão alterado, uma sequência diferente, uma atividade alterada ou quaisquer combinação dos mesmos.
[0084] Identidade de sequência, como usado aqui,
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43/140 refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em outra sequência de polipeptídeos de referência após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. Os valores de identidade de sequência percentuais podem ser gerados usando o software NCBI BLAST 2.0, conforme definido por Altschul et al. (1997) , Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, com os parâmetros definidos para valores padrões.
Proteínas de ligação específicas de HA-1H, Proteínas Acessórias e Células Hospedeiras Projetadas [0085] Em certos aspectos, a presente divulgação fornece células imunes manipuladas que compreendem um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação que se liga especificamente a um antígeno HA-1H. Em certas modalidades, a proteína de ligação codificada é um receptor de células T específicas de antígeno HA-1H (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico específico de antígeno HA1H (CAR). Em outras modalidades, uma proteína de ligação é expressa como parte de um construto de transgene que codifica proteínas acessórias adicionais, tais como uma proteína de alteração de segurança, uma etiqueta, um marcador de seleção, uma cadeia-β de co-receptor de CD8, uma cadeia-α ou ambos,
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44/140 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0086] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, um polipeptídeo codificado desta divulgação (por exemplo, iCasp9, cadeia-β de TCR, cadeia-α de TCR, cadeia-β de CD8, cadeia-α de CD8) pode compreender um peptídeo de sinal (também conhecido como uma sequência líder, peptídeo líder ou peptídeo de trânsito) . Os peptídeos de sinal direcionam os polipeptídeos sintetizados recentemente para a sua localização apropriada dentro ou fora da célula. Um peptídeo de sinal pode ser removido do polipeptídeo durante ou após a localização ou a secreção estar completa. Os polipeptídeos que têm um peptídeo sinal são aqui referidos como uma pré-proteína e os polipeptídeos que têm o seu peptídeo sinal removido são aqui referidos como proteínas ou polipeptídeos maduros. Os peptídeos de sinal representativos incluem os aminoácidos desde a posição 1 até a posição 21 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-3, 5-9 e 7075, ou os aminoácidos desde a posição 1 até a posição 19 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 4, 10 e 12.
[0087] As proteínas de ligação desta divulgação, tais como TCRs e CARs, vão conter um domínio de ligação específico para um alvo (neste caso, HA-1H) . Um domínio de ligação (também referido como uma região de ligação ou porção de ligação), como usado aqui, refere-se a uma molécula ou porção da mesma (por exemplo, peptídeo,
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45/140 oligopeptideo, polipeptideo, proteína) que possui a capacidade para especificamente e associar, unir ou combinar não covalentemente, com um alvo (por exemplo, o peptídeo HA1H ou o complexo de peptídeo HA-1h:MHC) . Um domínio de ligação inclui qualquer parceiro de ligação de ocorrência natural, sintético, semissintético ou produzido de forma recombinante para uma molécula biológica, um complexo molecular (isto é, complexo compreendendo duas ou mais moléculas biológicas), ou outro alvo de interesse. Domínios de ligação exemplares incluem regiões variáveis de imunoglobulina de cadeia simples (por exemplo, TCR de cadeia simples (scTCR), Fv de cadeia simples (scFv)), ectodomínios receptores, ligantes (por exemplo, citocinas, quimiocinas) ou polipeptídeos sintéticos selecionados pela sua capacidade específica de se ligarem a uma molécula biológica, um complexo molecular ou outro alvo de interesse.
[0088] Em certas modalidades, um domínio de ligação específico de HA-1H sozinho (isto é, sem qualquer outra porção de uma proteína de ligação específica de HA-1) pode ser solúvel e pode se ligar a HA-1H com um Kd menor que cerca de 1CU8 M, menor que cerca de 1CU9 M, menor que cerca de 1CU 10 M, menor que cerca de 10-11 M, menor que cerca de 1CU12 M, ou menor que cerca de 1CU13 M. Em modalidades particulares, um domínio de ligação específico para HA-1H inclui um scTCR específico para HA-1H (por exemplo, proteínas apTCR de cadeia
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46/140 simples, tais como Va-L-νβ, νβ-L-Va, Va-Ca -L-Va, ou Va-Lνβ-Οβ, em que Va e νβ são domínios variáveis de TCRa e β, respectivamente, Ca e Οβ são domínios constantes de TCRa e β, respectivamente, e L um ligante).
[0089] O termo região variável ou domínio variável refere-se ao domínio de uma proteína de ligação à superfamília de imunoglobulina (por exemplo, uma cadeia-α ou cadeia-β TCR (ou cadeia γ e cadeia δ para TCR γδ)) que está envolvida na ligação da proteína de ligação à superfamília de imunoglobulina (por exemplo, TCR) ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia-α e da cadeia-β (Va e Vp, respectivamente) de um TCR nativo geralmente possuem estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura (FRs) conservadas e três CDRs. O domínio Va é codificado por dois segmentos de DNA separados, o segmento do gene variável e o segmento do gene de junção (V-J); o domínio Vp é codificado por três segmentos de DNA separados, o segmento do gene variável, o segmento de gene da diversidade e o segmento de gene de junção (V-D-J). Um único domínio Va ou Vp pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os TCRs que se ligam a um determinado antígeno podem ser isolados utilizando um domínio de Va ou Vp de um TCR que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios de Va ou Vp complementares, respectivamente.
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47/140 [0090] Os termos região determinante de complementaridade e CDR são sinônimos com região hipervariável ou HVR, e são conhecidos na técnica como se referindo a sequências não contínuas de aminoácidos nas regiões variáveis de TCR, que conferem especificidade para o antígeno e/ou ou afinidade de ligação. Em geral, existem três CDRs em cada região variável de cadeia α (aCDRl, aCDR2,
aCDR3) e três CDRs em cada região variável de cadeia β
(βΟΏΕΙ, βΟΏΕ2, βCDR3). Acredita-se que a CDR3 seja a
principal CDR responsável por reconhecer o antígeno
processado. As CDR1 e CDR2 interagem principalmente com o MHC.
[0091] Em certas modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende: (a) um domínio variável de cadeia α (Va) de receptor de células T (TCR) tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRAV17, um gene TRAV21 ou um gene TRAV10 e um domínio variável de cadeia β (νβ) de TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86; (b) um domínio Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio νβ TCR tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRBV7-9; ou (c) um domínio de Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio de νβ
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TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86, em que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo contendo um antígeno HA-1H menor e não se liga a um peptídeo que não contenha um antígeno HA-1H menor.
[0092] Em outras modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende um domínio Va TCR e um domínio Vp TCR, em que: (a) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:87; (b) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:88; (c) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:89; (d) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:90; (e) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:91; ou (f) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 86, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID
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NO:92.
[0093] Em outras modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende um domínio V«, em que o domínio να codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, e 12. Em modalidades adicionais, uma proteína de ligação codificada compreende um domínio Vp, em que o domínio Vp codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência
com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID
NOS: 1, 3, 5, 7, 9, e 11.
[0094] Em algumas modalidades, o domínio Va
codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de
aminoácidos de CDR1, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR1, ou a CDR1 do domínio V« codificado e a CDR1 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos. Em modalidades adicionais, o domínio V« codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, ou a CDR2 do domínio V« codificado e a CDR2 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos.
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50/140 [0095] Em modalidades particulares, uma proteína de ligação codificada compreende um domínio Va TCR e um domínio Vp TCR, em que: (a) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2; (b) o domínio Vp compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:3, e o domínio να codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4; (c) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e o domínio V« codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6; (d) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7, e o domínio V« codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8; (e) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, e o domínio V« codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10; ou (f) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11, e o domínio V« codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.
[0096] As proteínas de ligação exemplares desta divulgação, expressas por uma célula, podem incluir um peptídeo de sinal (por exemplo, pré-proteínas de ligação) e
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51/140 a célula pode remover o peptídeo de sinal para gerar uma proteína de ligação madura. Em certas modalidades, uma proteína de ligação compreende dois componentes, tais como uma cadeia-α e uma cadeia-β, que pode se associar à superfície celular para formar uma proteína de ligação funcional. Os dois componentes associados podem compreender proteínas maduras. Em certas modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação compreende um domínio Vp maduro, em que o domínio Vp maduro compreende ou consiste em aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 98, 100, 102, 104, ou
106. Em outras modalidades, a proteína de ligação desta divulgação compreende um domínio Va maduro, em que o domínio να maduro compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 97, 99, 101, 103, 105, ou
107. Em ainda outras modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação compreende um domínio Vp maduro e um domínio V« maduro, em que o domínio Vp maduro compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 98, 100, 102, 104, ou 106, e um domínio V« maduro compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:97, 99, 101, 103, 105, ou 107. Em certas modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação compreende uma cadeia-β TCR madura, em que a cadeia-β TCR madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 108, 110, 112,
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114, 116, ou 118. Em outras modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação compreende uma cadeia-α TCR madura, em que a cadeia-α TCR madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 109, 111, 113, 115, 117, ou 119. Em ainda outras modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação compreende uma cadeia-β TCR madura e uma cadeia-α TCR madura, em que a cadeia-β TCR madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 108, 110, 112, 114, 116, ou 118, e a cadeia-α TCR madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 109, 111, 113, 115, 117, ou 119. Em certas modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação é expressa com uma cadeia-β de CD8 e a cadeia-β de CD8 compreende uma cadeia-β de CD8 madura, em que a cadeia-β de CD8 madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 121-125. Em outras modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação é expressa com uma cadeia-α de CD8 e a cadeia-α de CD8 compreende uma cadeia-α de CD8 madura, em que a cadeia-α de CD8 madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 120. Em mais modalidades, uma proteína de ligação desta divulgação é expressa com uma cadeia-β de CD8 e uma cadeia-α de CD8, em que a cadeia-β de CD8 e a cadeia-a compreendem a cadeia-β de CD8 madura e a cadeia-α, em que a
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53/140 cadeia-β de CD8 madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 121125, e a cadeia-α de CD8 madura compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 120.
[0097] Em outras modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende um domínio Va TCR maduro e um domínio Vp TCR maduro, em que: (a) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:96, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:97; (b) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:98, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:99; (c) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; (d) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (e) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; ou (f) o domínio Vp compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, e o domínio Va compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
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107 .
[0098] Uma proteína de ligação codificada contained em uma célula imune manipulada da presente divulgação pode, em algumas modalidades, compreender um domínio constante de TCR. Em certas modalidades, um domínio constante de TCR é modificado para melhorar o emparelhamento das cadeias de TCR desejadas. Por exemplo, melhorou o emparelhamento aprimorado entre uma cadeia-α de TCR heteróloga e uma cadeia-β de TCR heteróloga devido a uma modificação resulta no conjunto preferencial de um TCR compreendendo duas cadeias heterogas sobre um desemparelhamento indesejado de uma cadeia de TCR heteróloga com uma cadeia de TCR endógena (ver, por exemplo, Covers et al., Trends Mol. Med. 16(2):77 (2010), as modificações de TCR são aqui incorporadas por referência). Modificações exemplares para melhorar o emparelhamento de cadeias de TCR heterólogas incluem a introdução de resíduos de cisteína complementares em cada uma das cadeias-α de TCR e cadeia-β. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α de TCR heteróloga codifica uma cisteína na posição 48 de aminoácido (correspondendo a sequência de cadeia-α TCR humana madura, de comprimento total) e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR heteróloga que codifica uma cisteína na posição 57 de aminoácido (correspondendo a sequência de cadeia-β de TCR humana madura, de comprimento total).
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55/140 [0099] Em certas modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio constante (Ca) de cadeia-a TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19, 22, 24 e 26. Em outras modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio Ca TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19, 22, 24 e 26, desde que o domínio Ca TCR retenha o resíduo de cisteína na posição 48. Ainda em outras modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio Ca TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19, 22, 24 e 26.
[00100] Em certas modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio constante (Cp) de cadeia-β TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 18, 23 e 25. Em outras modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio Cp TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 18, 23 e 25, desde que o domínio Cp TCR retenha o o resíduo de cisteína introduzido na posição 57. Ainda em outras modalidades, a proteína de ligação codificada compreende um domínio Cp TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de
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56/140 qualquer uma das SEQ ID NOS: 18, 23 e 25.
[00101] Em certas modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR (por exemplo, um domínio Va TCR operacionalmente associado com um domínio Ca TCR) tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS :28, 30, 32, 34, 36 e 38, opcionalmente em que um domínio Ca TCR retêm a cisteína posição 47 (conforme contado a partir do começo do domínio Ca) . Em outras modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS :28, 30, 32,
34, 36 e 38. Em outras modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR (por exemplo, um domínio Vp TCR operacionalmente associado com domínio Cp TCR) tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:27, 29, 31, 33, 35, e 37, opcionalmente em que o domínio Cp TCR retêm uma cisteína posição 57 (conforme contado a partir do começo do domínio Cp) . Ainda em outras modalidades, a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS :27, 29, 31, 33,
35, e 37.
[00102] Uma proteína de ligação codificada por uma
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57/140 célula imune manipulada desta divulgação pode compreender qualquer uma das cadeias-α TCR presentemente divulgadas em associação com qualquer uma das cadeias-β TCR descritas. Por exemplo, em certas modalidades, uma proteína de ligação codificada compreende: (a) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:27, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:28; (b) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:29, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:30; (c) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:31, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:32; (d) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:33, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:34; (e) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:35, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 36; ou (f) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:37, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos
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58/140 mostrada na SEQ ID NO:38.
[00103] A célula imune manipulada da presente divulgação pode compreeder um polinucleotídeo único que codifica uma proteína de ligação como aqui descrito, ou a proteína de ligação pode ser codificada por mais do que um polinucleotídeo. Em outras palavras, os componentes ou partes de uma proteína de ligação podem ser codificados por dois ou mais polinucleotídeos, que podem estar contidos em uma única molécula de ácido nucléico ou podem estar contidos em duas ou mais moléculas de ácido nucléico.
[00104] Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica dois ou mais componentes ou porções de uma proteína de ligação da presente divulgação compreende as duas ou mais sequências de codificação operacionalmente associadas em uma estrutura de leitura aberta única. Tal arranjo pode de um modo vantajoso, permitir a expressão coordenada de produtos genéticos desejados, tais como, por exemplo, expressão contemporânea de cadeias alfa e beta de um TCR, de tal modo que são produzidos em cerca de razão de 1:1. Em certas modalidades, dois ou mais produtos genéticos substituintes de uma proteína de ligação desta divulgação, tal como um TCR (por exemplo, cadeias alfa e beta) ou CAR, são expressos como moléculas separadas e associados póstranslacionalmente. Em outras modalidades, dois ou mais produtos genéticos substituintes de uma proteína de ligação
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59/140 desta divulgação são expressos como um peptídeo único com as partes separadas por um segmento clivável ou removível. Por exemplo, peptídeos de autoclivagem úteis para expressão de polipeptídeos separáveis codificados por um único polinucleotídeo ou vetor são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, um peptídeo de porcino teschovirus-1 2A (P2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 76-81, um peptídeo de vírus Thoseaasigna 2A (T2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 82, peptídeo (ERAV) 2A (E2A) do vírus A da rinite Equina, tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 83, e um peptídeo do vírus da doença da febre aftosa 2A (F2A), tal como um peptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 84.
[00105] Em certas modalidades, uma proteína de ligação da presente divulgação compreende um ou mais aminoácidos de junção. Aminoácidos de junção ou resíduos de aminoácidos de junção se refere a um ou mais (por exemplo, 2 a cerca de 10) resíduos de aminoácidos entre dois motivos adjacentes, regiões ou domínios de um polipeptídeo, tal como entre um domínio de ligação e um domínio constante adjacente ou entre uma cadeia TCR e um peptídeo de
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60/140 autoclivagem adjacente. Os aminoácidos da junção podem resultar da concepção de um c que codifica uma proteína de fusão (por exemplo, resíduos de aminoácidos resultantes do uso de um sítio de enzima de restrição durante a construção de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão) ou da divagem de, por exemplo, um peptídeo autoclivante adjacente a um ou mais domínios de uma proteína de ligação codificada desta divulgação (por exemplo, um peptídeo P2A disposto entre uma cadeia α de TCR e uma cadeia β de TCR, cuja autoclivagem pode deixar uma ou mais aminoácidos de junção na cadeia a, na cadeia β de TCR ou em ambas).
[00106] As proteínas de ligação contidas nas células imunes manipuladas desta divulgação podem, em certas modalidades, ligar-se especificamente a um complexo de peptídeo HA-1H: HLA. Por exemplo, em modalidades específicas, uma proteína de ligação desta divulgação é capaz de se ligar especificamente a um complexo de peptídeo HA-1H: HLA, em que o HLA pode compreender HLA-A*0201. Em modalidades particulares, o peptídeo HA-1H compreende a sequência de aminoácidos VLHDDLLEA (SEQ ID NO: 66).
[00107] Em qualquer uma das modalidades acima mencionadas, uma proteína de ligação codificada contida em uma célula imune manipulada pode compreender um TCR, um fragmento de ligação ao antígeno de um TCR (por exemplo, um
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TCR de cadeia única (scTCR)) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR).
[00108] Em certas modalidades, um fragmento de ligação a um antígeno de um TCR compreende um TCR de cadeia única (scTCR), que compreende ambos os domínios TCR V« e TCR Vp, mas apenas um domínio constante de TCR único(C« ou Cp) . Em outras modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um TCR ou receptor de antígeno quimérico é quimérico (por exemplo, compreende resíduos de aminoácidos ou motivos a partir de mais de um doador ou espécie) , humanizado (por exemplo, compreende resíduos de um organismo não humano que são alterados ou substituídos de modo a reduzir o risco de imunogenicidade em um ser humano), ou humano.
[00109] O receptor de antígeno quimérico (CAR) se refere a uma proteína de fusão que é manipulada para conter duas ou mais sequências de aminoácidos de ocorrência natural ligadas entre si de uma maneira que não ocorre naturalmente ou não ocorrem naturalmente em uma célula hospedeira, proteína de fusão pode funcionar como um receptor quando presente em uma superfície de uma célula. Os CARs da presente divulgação incluem uma porção extracelular compreendendo um domínio de ligação ao antígeno (ou seja, obtido ou derivado a partir de uma imunoglobulina ou molécula semelhante a imunoglobulina, tal como um scFv derivado a partir de um anticorpo ou TCR específico para um antígeno de câncer ou um
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62/140 domínio de ligação ao antígeno derivado ou obtido de um imunoreceptor assassino a partir de uma célula NK) ligado a um domínio transmembranar e um ou mais domínios de sinalização intracelular (opcionalmente contendo domínio (s) co-estimulatório (s)) (ver, por exemplo, Sadelain et al, Cancer Díscov., 3(4):388 (2013); ver também Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016), and Stone et al, Cancer Immunol. Immunother., 63(11): 1163 (2014)).
[00110] Os métodos para a produção de TCR manipulados são descritos, por exemplo, em Bowerman et al , Mol. Immunol, 46(15): 3000 (2009), cujas técnicas são aqui incorporadas por referência. Os métodos para fabricar CARs são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente US 6.410.319; Patente US 7.446.191; Publicação de Patente US 2010/065818; Patente US 8.822.647; Publicação PCT n° WO 2014/031687; Patente US 7.514.537; e Brentjens et al, 2007, Clin. Cancer Res. 13: 5426, cujas técnicas são aqui incorporadas por referência.
[00111] As células imunes manipuladas desta divulgação podem ser administradas como terapias para, por exemplo, câncer. Em algumas circunstâncias, pode ser desejável reduzir ou interromper a atividade associada a uma imunoterapia celular. Assim, em certas modalidades, uma célula imune manipulada da presente divulgação compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação e uma
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63/140 proteína acessória, tal como uma proteína de comutação de segurança, que pode ser direcionada usando um fármaco cognato ou outro composto para modular seletivamente a atividade (por exemplo, diminuir ou dissolver) dessas células quando desejável. As proteínas de comutação de segurança usadas a este respeito incluem, por exemplo, um polipeptídeo receptor de EGF truncado (huEGFRt) que é desprovido de domínios de ligação ao ligante do terminal N extracelulares e atividade do receptor tirosina quinase intracelular, mas retém a sequência de aminoácidos nativa, localização da superfície da célula transmembranar tipo I e um epítopo de ligação conformacionalmente intacto para anticorpo monoclonal antiEGFR de grau farmacêutico, receptor tEGF de cetuximab (Erbitux) (tEGFr; Wang et al, Blood 118: 1255-1263, 2011), um polipeptídeo de caspase (por exemplo, iCasp9; Straathof et al., Blood 105: 4247-4254, 2005; Di Stasi et al., N. Engl. J. Med. 365: 1673-1683, 2011; Zhou e Brenner, Exp. Hematol pii: S0301-472X (16) 30513-6. doi: 10.1016/j. exphem.2016.07.011) , RQR8 (Philip et al, Blood 124: 1277-1287, 2014), um marcador de 10 aminoácidos da proteína c-myc humana (Myc) (Kieback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 623-628, 2008), tal como aqui discutido, e um polipeptídeo marcador/comutador de segurança, tal como RQR (CD20+CD34; Philip et al, 2014).
[00112] Outros componentes acessórios úteis para
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64/140 células terapêuticas compreendem um marcador de marcação ou de seleção que permite que as células sejam identificadas, separadas, isoladas, enriquecidas ou rastreadas. Por exemplo, células imunes marcadas com características desejadas (por exemplo, um TCR específico de antígeno e uma proteína de comutação de segurança) podem ser separadas a partir de células não marcadas em uma amostra e mais eficientemente ativadas e expandidas para inclusão em um produto terapêutico de pureza desejada.
[00113] Como aqui usado, o termo marcador de seleção compreende uma construto de ácido nucléico que confere uma alteração identificável a uma célula que permite a detecção e seleção positiva de células imunes transduzidas com um polinucleotídeo compreendendo um marcador de seleção. O RQR é um marcador de seleção que compreende uma alça extracelular principal de CD20 e dois locais de ligação mínimos a CD34. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica o RQR compreende um polinucleotídeo que codifica o epítopo mínimo de CD34 de 16 aminoácidos. Em algumas modalidades, tais como certas modalidades fornecidas nos exemplos aqui apresentados, o epítopo mínimo CD34 incorporado na posição terminal amino do domínio de haste CD8 (Q8) . Em outras modalidades, a sequência de locais de ligação mínima de CD34 pode ser combinada com um epítopo alvo para CD20 para formar um gene marcador compacto/suicida
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65/140 para células T (RQR8) (Philip et al. , 2014, aqui incorporado por referência). Este construto permite a seleção de células imunes que expressam o construto, por exemplo, anticorpo específico de CD34 ligado a esferas magnéticas (Miltenyi) e que usa anticorpo farmacêutico clinicamente aceitável, rituximab, que permite a deleção seletiva de um transgene expressando células T manipuladas. (Philip et al., 2014) .
[00114] Outros exemplos de marcadores de seleção incluem também várias proteínas transmembranares tipo I truncadas normalmente não expressas em células T: o fator de crescimento de nervo de baixa afinidade truncado, CD 19 truncado e CD34 truncado (ver, por exemplo, Di Stasi et al, N. Engl. J Med. 365: 1673-1683, 2011; Mavilio et al, Blood 83: 1988-1997, 1994; Fehse et al, Mol. Ther. 1: 448-456, 2000; cada um aqui incorporado na sua totalidade) . Uma característica particularmente atraente do CD 19 e do CD34 é a disponibilidade do sistema de seleção Miltenyi CliniMACs™, disponível no mercado, que pode direcionar esses marcadores para classificação em nível clínico. No entanto, CD19 e CD34 são proteínas de superfície relativamente grandes que podem sobrecarregar a capacidade de empacotamento de vetores e a eficiência de transcrição de um vetor de integração. Os marcadores de superfície contendo os domínios extracelulares, não sinalizantes ou várias proteínas (por exemplo, CD19, CD34, LNGFR) também podem ser empregues.
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Qualquer marcador de seleção pode ser empregado e deve ser aceitável para Boas Práticas de Fabricação. Em certas modalidades, os marcadores de seleção são expressos com um polinucleotídeo que codifica um produto genético de interesse (por exemplo, uma proteína de ligação da presente divulgação, tal como um TCR ou CAR) . Outros exemplos de marcadores de seleção incluem, por exemplo, repórteres tais como GFP, EGFP, β-gal ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT) . Em certas modalidades, um marcador de seleção, tal como, por exemplo, CD34 é expresso por uma célula e o CD34 pode ser usado para selecionar enriquecer ou isolar (por exemplo, por seleção imunomagnética) as células transduzidas de interesse para uso nos métodos aqui descritos. Como aqui usado, um marcador CD34 se distingue a partir de um anticorpo anti-CD34, ou, por exemplo, um scFv, TCR, ou outra fração de reconhecimento de antígeno que se liga a CD34.
[00115] Em certas modalidades, um marcador de seleção compreende um polipeptídeo RQR, um fator de crescimento de nervo de baixa afinidade truncado (tNGFR), um CD 19 truncado (tCD19), um CD34 truncado (tCD34) ou qualquer combinação dos mesmos .
[00116] Como antecedentes, a inclusão de células T CD4+ em um produto de célula imune pode fornecer a secreção de IL-2 induzida por antígeno e aumentar a persistência e função de células T CD8+ citotóxicas transferidas (ver, por
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67/140 exemplo, Kennedy et al. , Immunol. Rev. 222: 129 (2008); Nakanishi et al, Nature 462 (7272): 510 (2009)). Em certas circunstâncias, um TCR restrito de classe I em células T CD4+ pode requerer a transferência de um co-receptor de CD8 para aumentar a sensibilidade do TCR a complexos de peptídeo HLA de classe I. Os co-receptores de CD4 diferem em estrutura para CD8 e não podem efetivamente substituir os co-receptores de CD8 (ver, por exemplo, Stone & Kranz, Front. Immunol. 4: 244 (2013); ver também Cole et al., Immunology 137 (2): 139 (2012). Assim, outra proteína acessórias para uso nas composições e métodos desta divulgação compreende um coreceptor de CD8 ou um componente do mesmo.
[00117] As células imunes manipuladas compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação podem, em certas modalidades, compreender adicionalmente um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína co-receptora de CD8, ou um componente de cadeia beta ou cadeia alfa do mesmo. Um co-receptor de CD8 codificado inclui, em algumas modalidades, uma cadeia-β compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 71-75. Em outras modalidades, o co-receptor de CD8 codificado é um co-receptor de CD8 recombinante compreendendo adicionalmente um polipeptídeo RQR tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita-se que a distância a partir
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68/140 da superfície da célula hospedeira é importante para os polipeptídeos RQR funcionarem como marcadores de seleção/comutadores de segurança (Philip et al. , 2010 (supra)). Em algumas modalidades, o polipeptídeo RQR codificado está contido em uma cadeia-β, em uma cadeia a, ou em ambas, do co-receptor de CD8 codificado. Em modalidades específicas, uma célula imune manipulada compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica iCasp9 e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína coreceptora de CD8 recombinante que compreende uma cadeia-β contendo um polipeptídeo RQR e compreende ainda uma cadeiaα CD8 . Em modalidades particulares, a cadeia-α CD8 codificada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 70.
[00118] Em outras modalidades, uma célula imune manipulada compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica iCasp9 e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína co-receptora de CD 8 recombinante que compreende uma cadeia-α contendo um polipeptídeo RQR e compreende ainda uma cadeia-β CD8. Em algumas modalidades, tanto a cadeia-a CD8 codificada como a cadeia-β CD8 codificada contêm um polipeptídeo RQR.
[00119] Uma célula imune manipulada pode ser
eficientemente transduzida para conter, e pode
eficientemente expressar, um único polinucleotídeo que
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69/140 codifica a proteína de ligação, proteína de comutação de segurança, marcador de seleção e proteína co-receptor de CD8. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula imune manipulada da presente divulgação compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica, de 5' a 3', ([um polipeptídeo iCasp9]-[um peptídeo de porcino teschovirus 2A (P2A)]-[uma cadeia-β TCR] - [um peptídeo P2A]-[uma cadeia-a TCR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-β de CD8 compreendendo um polipeptídeo de RQR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-α de CD8]). Em modalidades específicas, o polinucleotídeo que codifica a cadeia-β TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 41 e o polinucleotídeo codificador da uma cadeia-α TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42.
[00120] Em modalidades particulares, uma célula imune manipulada contém um polinucleotídeo heterólogo que compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 85.
[00121] Qualquer célula imune adequada pode ser manipulada para incluir um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação desta divulgação, incluindo, por exemplo, uma célula T, uma célula NK ou uma célula NK-T. Em algumas modalidades, uma célula imune manipulada compreende uma célula T CD4+, uma célula T CD8+, ou ambas. Foram descritos métodos para
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70/140 transfectar/transduzir células T com ácidos nucleicos desejados (por exemplo, pedido de patente publicado US2004/0087025) como procedimentos de transferência adotiva usando células T de especificidade de alvo desejada (por exemplo, Schmitt et al, Hum. Gen. 20: 1240, 2009; Dossett et al, Mol. Ther. 17: 742, 2009; Till et al, Blood 112: 2261, 2008; Wang e outros, Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al, Blood 109:2331, 2007; US 2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al, Ann. Rev. Immunol. 25: 243, 2007), de tai forma que a adaptação destas metodologias às modalidades presentemente divulgadas é contemplada, com base nos ensinamentos aqui apresentados.
[00122] Qualquer método apropriado pode ser usado para transfectar ou transduzir as células, por exemplo, as células T, ou para administrar os polinucleotídeos ou composições dos presentes métodos. Métodos conhecidos para distribuição de polinucleotídeos a células hospedeiras incluem, por exemplo, uso de polímeros catiônicos, moléculas semelhantes a lipídeo e certos produtos comerciais tais como, por exemplo, IN-VIVO-JET PEL Outros Métodos incluem transdução ex vivo, injeção, eletroporação, DEAE-dextrano, carga de sonicação, transfecção mediada por lipossomas, transdução mediada por receptor, bombardeamento de microprojéteis, transferência mediada por transposon e semelhantes. Ainda outros métodos de transfecção ou
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71/140 transdução de células hospedeiras empregam vetores, descritos aqui com mais detalhe.
[00123] Em qualquer uma das modalidades anteriores, uma célula imune manipulada pode ser uma célula doadora universal que modificada para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes endógenos que codificam um polipeptideo envolvido na sinalização imune ou outras atividades relacionadas. Exemplos de nocautes de gene incluem aqueles que codificam PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, uma molécula de HLA, uma molécula de TCR ou semelhantes. Sem querer estar limitado pela teoria, certas proteínas da célula imune expressas endogenamente podem ser reconhecidas como estranhas por um hospedeiro alogênico que recebe as células imunes manipuladas, o que pode resultar na eliminação das células imunes manipuladas (por exemplo, um alelo HLA) ou pode a atividade imune das células imunes manipuladas (por exemplo, PD-1, LAG-3, CTLA4) ou pode interferir com a atividade de ligação de uma proteína de ligação expressa de forma heteróloga da presente divulgação (por exemplo, um TCR endógeno que se liga a um antígeno nãoHA-lH e, portanto, interfere com a célula imune manipulada que se liga a uma célula que expressa o antígeno HA-1H) . Consequentemente, a diminuição ou eliminação da expressão ou atividade de tais genes ou proteínas endógenos pode melhorar a atividade, a tolerância e a persistência das células imunes manipuladas
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72/140 dentro de um hospedeiro alogênico, e permite células offthe-shelf universais para administração (por exemplo, para qualquer destinatário, independentemente do tipo de HLA).
[00124] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada desta divulgação compreende um nocaute de gene cromossomal de um ou mais de um gene que codifica PD-1, LAG3, CTLA4, TIM3, um componente HLA (por exemplo, um gene que codifica gene de macroglobulina al, um gene de macroglobulina a2, um gene de macroglobulina a3, um gene de macroglobulina βΐ, ou gene de microglobulina β2) ou um componente TCR (por exemplo, um gene que codifica uma região variável de TCR ou uma região constante de TCR) (ver, por exemplo, Torikai et al. , Natureza Sei. Rep. (6: 21,757 (2016); Torikai et al. , Blood 119 (24): 5697 (2012) e Torikai et al , Blood 122 (8): 1341 (2013), as técnicas de edição de genes e composições as
quais são aqui incorporadas por referência na sua
totalidade). Como aqui usado, o termo nocaute do gene
cromossômico se refere a uma alteração genética em uma
célula imune manipulada que impede a produção, pela célula imune manipulada, de um produto de polipeptídeo endógeno funcionalmente ativo. As alterações que resultam em um nocaute do gene cromossômico podem incluir, por exemplo, mutações sem sentido (incluindo a formação de códons de parada prematuros), mutações com troca de sentido, deleção gênica e quebras de cadeias, bem como a expressão heteróloga
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73/140 de moléculas de ácido nucléico inibidoras que inibem a expressão de genes endógenos na célula imune manipulada.
[00125] Um nocaute de gene cromossomal pode ser introduzido pela edição cromossômica da célula imune. Em certas modalidades, o nocaute do gene cromossômico é feito por edição cromossômica da célula imune. A edição cromossômica pode ser realizada usando, por exemplo, endonucleases. Como aqui usado, endonuclease se refere a uma enzima capaz de catalisar a clivagem de uma ligação fosfodiéster dentro de uma cadeia polinucleotidica. Em certas modalidades, uma endonuclease é capaz de clivar um gene alvo, inativando desse modo ou eliminando o gene alvo. Uma endonuclease pode ser uma endonuclease de ocorrência natural, recombinante, geneticamente modificada ou de fusão. As rupturas da fita de ácido nucléico causadas pela endonuclease são normalmente reparadas através dos mecanismos distintos de recombinação homóloga ou junção final não homóloga (NHEJ). Durante a recombinação homóloga, pode ser usada uma molécula de ácido nucléico doadora para o gene de nocaute para inativar um gene alvo. O NHEJ é um processo de reparo propenso a erros que muitas vezes resulta em alterações na sequência de DNA no local da clivagem, por exemplo, uma substituição, deleção ou adição de pelo menos um nucleotideo. O NHEJ pode ser usado para nocautear um gene alvo. Os métodos de ruptura ou nocaute de genes ou
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74/140 expressão de genes em células imunes usando endonucleases são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na publicação PCT n° WO 2015/066262; WO 2013/074916; e WO 2014/059173; métodos de cada um dos quais é incorporado por referência. Exemplos de endonucleases incluem nucleases de dedos de zinco, nucleases TALE, nucleases CRISPR-Cas e meganucleases.
[00126] Como aqui usado, uma nuclease do dedo de zinco (ZFN) se refere a uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco fundido com um domínio de divagem de DNA não específico, tal como uma endonuclease Fokl. Cada motivo de dedo de zinco de cerca de 30 aminoácidos se liga a cerca de 3 pares de bases de DNA e os aminoácidos em certos resíduos podem ser alterados para alterar a especificidade da sequência tripla (ver, por exemplo, Desjarlais et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. 90:22562260, 1993; Wolfe et al, J. Mol. Biol. 285: 1917-1934, 1999). Múltiplos motivos de dedos de zinco podem ser ligados em série para criar especificidade de ligação às sequências de DNA desejadas, tais como regiões com um comprimento que varia de cerca de 9 a cerca de 18 pares de bases. Por meio de antecedentes, as ZFNs mediam a edição do genoma catalisando a formação de uma ruptura de fita dupla de DNA específico de um local (DSB) no genoma e integração direcionada de um transgene compreendendo sequências flanqueadoras homólogas
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75/140 ao genoma no local de DSB facilitada por reparo direcionado por homologia. Alternativamente, um DSB gerado por um ZFN pode resultar em nocaute do gene alvo via reparo por junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que é uma via de reparo celular propensa a erro que resulta na inserção ou deleção de nucleotídeos no sítio de clivagem. Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma mutação ou uma combinação dos mesmos, feita usando uma molécula de ZFN.
[00127] Como aqui usado, uma nuclease efetora do tipo ativador da transcrição (TALEN) se refere a uma proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação ao DNA de TALE e um domínio de clivagem de DNA, tal como uma endonuclease Fokl. Um domínio de ligação ao DNA de TALE ou TALE é composto por um ou mais domínios/unidades de repetição TALE, cada um tendo geralmente uma sequência de 33-35 aminoácidos altamente conservada com 12 e 13 aminoácidos divergentes. Os domínios de repetição TALE estão envolvidos na ligação do TALE a uma sequência de DNA alvo. Os resíduos de aminoácidos divergentes, referidos como o diresíduo variável repetido (RVD), correlacionam-se com o reconhecimento específico de nucleotídeos. O código natural (canônico) para o reconhecimento de DNA desses TALEs foi determinado de tal forma que uma sequência HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação à citosina (C), NG se liga a T,
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NI a A, NN se liga a G ou A e NG se liga a T e a RVDs não canônicos (atípicos) são também conhecidos (ver, por exemplo, a publicação de patente US2011/0301073, que RVDs atípicos são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Os TALENs podem ser usados para direcionar as rupturas de fita dupla (DSB) específicas de sítio no genoma das células T. A junção de extremidade não homóloga (NHEJ) liga o DNA a partir de ambos os lados de uma ruptura de cadeia dupla, na qual há pouca ou nenhuma sobreposição de sequência para o recozimento, introduzindo assim erros que eliminam a expressão genética. Alternativamente, o reparo dirigido por homologia pode introduzir um transgene no local de DSB, fornecendo sequências flanqueadoras homólogas que estão presentes no transgene. Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma mutação ou uma combinação dos mesmos, feita usando uma molécula de TALEN.
[00128] Como usado aqui, um conjunto de repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas/Cas (CRISP /Gas) se refere a um sistema que emprega uma nuclease Gas guiada por CRISPR RNA (crRNA) para reconhecer sítios alvo dentro de um genoma (conhecido como protoespaçador) via complementaridade de emparelhamento de bases e depois clivar o DNA se um motivo curto associado ao protoespaçador (PAM) conservado seguir imediatamente a 3' da sequência alvo
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77/140 complementar. Os sistemas CRISPR/Cas são classificados em três tipos (ou seja, tipo I, tipo II e tipo III) com base na sequência e estrutura das nucleases Cas. Os complexos de vigilância guiados por crRNA nos tipos I e III necessitam de múltiplas subunidades Cas. O sistema tipo II, o mais estudado, compreende pelo menos três componentes: uma nuclease Cas9 guiada por RNA, um crRNA e um crRNA transacting (tracrRNA). O tracrRNA compreende uma região de formação de dúplex. Um crRNA e um tracrRNA formam um duplex que é capaz de interagir com uma nuclease Cas9 e guiar o complexo Cas9/crRNA:tracrRNA para um sítio específico no DNA alvo através do pareamento de bases de Watson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo a montante de um PAM. A nuclease Cas9 cliva uma ruptura de fita dupla dentro de uma região definida pelo espaçador crRNA. O reparo pelo NHEJ resulta em inserções e/ou deleções que interrompem a expressão do locus alvo. Alternativamente, um transgene com sequências flanqueadoras homólogas pode ser introduzido no sítio da DSB por meio de reparo dirigido por homologia. O crRNA e tracrRNA podem ser manipulados em um RNA de guia único (sgRNA ou gRNA) (ver, por exemplo, Jinek et al , Science 337: 816-21, 2012) . Além disso, a região complementar do RNA guia ao sítio alvo pode ser alterada ou programada para atingir uma sequência desejada (Xie et al, PLOS One 9: el00448, 2014; pedido de patente US 2014/0068797, pedido de
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78/140 patente US 2014/0186843; patente US 8.697.359, e Publicação PCT n°W0 2015/071474; as técnicas e composições de cada um dos quais são incorporadas por referência). Em certas modalidades, um nocaute de gene compreende uma inserção, uma deleção, uma mutação ou uma combinação dos mesmos, e feita usando um sistema de nuclease CRISPR/Cas.
[00129] Como aqui usado, uma meganuclease, também referida como endonuclease de origem, refere-se a uma endodesoxirribonuclease caracterizada por um grande local de reconhecimento (sequências de DNA de fita dupla de cerca de 12 a cerca de 40 pares de bases) . As meganucleases podem ser divididas em cinco famílias baseadas em motivos de sequência e estrutura: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys box e PD(D/E)XK. As meganucleases exemplificadoras incluem I-Scel, I-Ceul, PI-PspI, ΡΙ-Sce, I-SceIV, I-Csml, I-Panl, I-SceII, I-Ppol, I-SceIII, I-Crel, I-TevI., I-TevII e I-TevIII, cujas sequências de reconhecimento são conhecidas (ver, por exemplo, Patentes US5.420.032 e 6.833.252; Belfort et al. , Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al, Gene 82: 115-118, 1989; Perler et al, Nucleic Acids Res. 22: 11251127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al, J. Mol. Biol. 263: 163-180, 1996; Argast et al, J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998).
[00130] Em certas modalidades, as meganucleases de ocorrência natural podem ser usadas para promover a
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79/140 modificação do genoma específico do sítio de um alvo selecionado de PD-1, LAG3, TIM3, CTLA4, um gene que codifica HLA ou um gene que codifica um componente TCR. Em outras modalidades, uma meganuclease manipulada possuindo uma nova especificidade de ligação para um gene alvo usada para a modificação do genoma específico do sítio (ver, por exemplo, Porteus et al, Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman et al , J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al , Nucleic Acids Res. 37:2952-62, 2003; Chevalier et al, Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al, Nature 441 :656-659, 2006; Paques et al, Curr. Gene Ther. 7: 49-66, 2007; publicação de patente US 2007/0117128; US 2006/0206949; US 2006/0153826; US 2006/0078552; e US 2004/0002092) .
[00131] Em certas modalidades, um nocaute do gene cromossômico compreende uma molécula de ácido nucléico inibidor que introduzida em uma célula imune manipulada compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um receptor específico de antígeno que se liga especificamente a um antígeno associado a tumor, em que a molécula de ácido nucléico inibidora codifica um inibidor específico de alvo e em que o inibidor específico do alvo codificado inibe a expressão genética endógena (ou seja, de PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, um componente HLA, um componente TCR ou qualquer combinação dos mesmos) na célula imune manipulada.
[00132] Um nocaute do gene cromossômico pode ser
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80/140 confirmado diretamente por sequenciação de DNA da célula imune manipulada após uso do processo ou agente de nocaute. Os nocautes de gene cromossômicos também podem ser inferidos a partir da ausência de expressão genética (por exemplo, a ausência de um produto de mRNA ou polipeptídeo codificado pelo gene) após o nocaute.
[00133] Em outro aspecto, são aqui fornecidas composições que compreendem uma célula imune manipulada da presente divulgação e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Também são fornecidas aqui doses unitárias que compreendem uma quantidade eficaz de uma célula imune manipulada ou de uma composição compreendendo a célula imune manipulada. Em certas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%), pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de células T CD4 + manipuladas, combinadas com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%), pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou
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81/140 substancialmente nenhuma células T nativa (ou seja, tem menos de cerca de 50%), menos de cerca de 40%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 10 %), menos de cerca de 5%, ou menos de cerca de 1%, da população de células T nativas presentes em uma dose unitária em comparação a uma amostra de paciente com um número comparável de PBMCs).
[00134] Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 50% de células T CD4+ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 50% de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1:1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa. Em outras modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 60% de células T CD4+ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 60% de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1: 1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa. Ainda em outras modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70% de células T CD4 + manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70% de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1: 1, em que a dose unitária contém uma
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82/140 quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa. Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 80%) de células T CD4+ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 80%) de células T CD8 + modificadas, em razão de cerca de 1: 1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa. Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 85% de células T CD4+ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 85% de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1: 1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa. Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90%) de células T CD4+ manipuladas, combinada com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90%) de células T CD8+ modificadas, em razão de cerca de 1: 1, em que a dose unitária contém uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhuma célula T nativa.
[00135] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, uma dose unitária compreende números iguais ou aproximadamente iguais de células CD45RA~CD3+CD8 + manipuladas, CD45RA~CD3+CD4+ Tm manipuladas por engenharia genética.
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Pollnucleotídeos, transgenes e vetores [00136] Em outros aspectos, a presente divulgação fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação como aqui descrito {por exemplo, um TCR, scTCR, ou CAR específico de HA-1H que compreende e domínios να e Vp TCR como aqui descrito (e opcionalmente compreende ainda domínios ou outros componentes como descrito aqui)), e pode adicionalmente codificar uma proteína de comutação de segurança, um marcador de seleção, uma cadeia-α de coreceptor CD8, ou uma cadeia-β de co-receptor CD8, ou qualquer combinação dos mesmos, desde que menos uma porção do polinucleotídeo isolado seja otimizada por códon para expressão em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune manipulada como aqui divulgado).
[00137] Em particular, gualquer um dos polinucleotídeos heterólogos acima mencionados compreendidos nas células imunes manipuladas (por exemplo, que codifica qualquer uma das proteínas de ligação da presente divulgação) pode também ou alternativamente ser fornecidas em uma forma isolada, em que o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em uma célula hospedeira. Por exemplo, em certas modalidades, um polinucleotídeo isolado codifica uma cadeiaβ TCR de uma proteína de ligação específica de HA-1H e compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 49 ou 51.
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Em outras modalidades, um polinucleotídeo isolado codifica uma cadeia-α TCR de uma proteína de ligação específica de HA-lHe compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 40, 42, 46, 48, 50 ou 52.
[00138] Em certas modalidades, um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma cadeia-α TCR e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma cadeia-β TCR está contido em uma estrutura de leitura aberta compreendida na célula imune manipulada, em que a estrutura de leitura aberta única compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um peptídeo autoclivante disposto entre o polinucleotídeo que codifica a cadeia-α e o polinucleotídeo que codifica cadeia-β. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de autoclivagem compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS :7 6-84.
[00139] Em outras modalidades, a estrutura de leitura aberta única compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 80% idêntica a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59-63. Em modalidades específicas, a estrutura de leitura aberta única compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59-63. Ainda em outras modalidades, o codificado ([uma cadeia-β TCR]- [peptídeo autoclivante]-[uma cadeia-a TCR]) compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 53-57, que existe antes da
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85/140 célula remover o peptídeo de sinalização, e antes da cadeiaβ e da cadeia-α serem separadas pelo peptídeo de autoclivagem.
[00140] Um polinucleotídeo isolado desta divulgação pode ainda compreender um polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança, um marcador de seleção, uma cadeia beta de co-receptor CD8 (por exemplo, SEQ ID NOs: 71-75) , ou uma cadeia alfa de co-receptor CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 70) como aqui divulgado, ou pode compreender um polinucleotídeo que codifica qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, um isolado compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica iCasp9 e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína coreceptora CD8 recombinante que compreende uma cadeia-β ou cadeia-α que contém um polipeptídeo RQR [00141] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado compreende uma estrutura de leitura aberta única contendo, de 5' a 3', ([um polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança]-[um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem]-[o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR]-[um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α TCR]-[um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β de CD8 que contém um polipeptídeo de
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RQR]_[um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-a de CD8]) .
[00142] Em outras modalidades, um polinucleotídeo isolado compreende uma única estrutura de leitura aberta que codifica de 5' a 3', ([um polipeptídeo iCasp9]-[um peptídeo de porcino teschovirus 2A (P2A)]-[uma cadeia-β TCR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-α TCR]-[um peptídeo P2A]- [uma cadeia-β de CD8 compreendendo um polipeptídeo de RQR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-α de CD8]). Em certas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 41 e em que o um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 42.
[00143] Em modalidades específicas, um polinucleotídeo isolado compreende ou consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 85.
[00144] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, um polinucleotídeo isolado é otimizado por códon para expressão em uma célula imune, tal como uma célula T.
[00145] Em outro aspecto, construtos de transgene são fornecidos aqui, em que um construto de transgene que compreende uma sequência de controle de expressão (por exemplo, uma sequência promotora) operacionalmente ligada a
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87/140 uma estrutura de leitura aberta única compreendendo (a) um polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança; (b) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR; (c) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α TCR;
(b) um polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção;
(c) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β de coreceptor de CD8; e (d) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α de co-receptor de CD8.
[00146] A construção de um construto de transgenes para manipulação genética e produção de um polipeptídeo de interesse pode ser realizada usando qualquer técnica de engenharia de biologia molecular adequada conhecida na técnica. Para obter transcrição e tradução eficientes, um polinucleotídeo em cada constructo de transgene da presente divulgação inclui, em certas modalidades, pelo menos uma sequência de controle de expressão apropriada (também designada sequência reguladora) , tal como uma sequência líder e particularmente um promotor operacionalmente (ou seja, operacionalmente) ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, um constructo de transgene compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança, em que a proteína de comutação de segurança codificada compreende: (i) um receptor de EGF truncado (tEGFR) ; (ii) iCasp9; (iii) um polipeptídeo RQR; (iv) um
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88/140 epítopo myc; ou (v) qualquer combinação dos mesmos.
[00147] Em outras modalidades, o marcador de seleção codificado compreende: (i) um polipeptídeo RQR; (ii) um fator de crescimento de nervo de baixa afinidade truncada (tNGFR); (iii) um CD 19 truncado (tCD 19); (iv) um CD34 truncado (tCD34); ou (v) qualquer combinação dos mesmos.
[00148] Em algumas modalidades, o co-receptor de CD8 codificado é um co-receptor de CD8 recombinante compreendendo um polipeptídeo RQR tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 69. Em modalidades particulares, um constructo de transgene inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo RQR que está contido em uma cadeia-β de CD8 codificada. Em outras modalidades particulares, um constructo de transgene inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo RQR que está contido em uma cadeia-α de CD8 codificada.
[00149] Por exemplo, uma constructo de transgene da presente divulgação compreende, em certas modalidades, uma estrutura de leitura aberta contendo (a) um polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança; (b) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR; (c) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α TCR; (d) m polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β de CD8 que contém um polipeptídeo de RQR; e (e) um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α de CD8. Qualquer arranjo dos polinucleotídeos
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89/140 componentes é aqui contemplado, incluindo, por exemplo, uma estrutura de leitura aberta única que compreende, de 5' a 3', ([o polinucleotídeo que codifica uma proteína de comutação de segurança]-[um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem]-[o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β TCR]-[o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-α TCR]-[um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β de CD8 que contém um polipeptídeo de RQR]_[um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de autoclivagem]-[o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-a de CD8]) .
[00150] Em modalidades específicas, uma construto transgene da presente divulgação compreende estrutura de leitura aberta única codifica, de 5' a 3', ([um polipeptídeo iCasp9]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-β de TCR]-[um peptídeo P2A] -[uma cadeia-α TCR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-β de CD8 compreendendo um polipeptídeo de RQR]-[um peptídeo P2A][uma cadeia-α de CD8]).
[00151] Em outras modalidades, um construto de transgene pode compreender uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada a um polinucleotídeo como aqui descrito. Por exemplo, uma construto transgene pode compreender uma sequência de controle de expressão
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90/140 operacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação da presente divulgação, em que a proteína de ligação inclui (a) um receptor de células T (TCR) um de cadeia-α (να) uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRAV17, um gene TRAV21, ou um gene TRAV10, e um domínio variável de cadeia-β de TCR (Vp) compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 como mostrado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 13-17 e 86; (b) um domínio να de TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 como mostrado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp de TCR com uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRBV7-9; ou (c) um domínio Va de TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp de TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86, em que a proteína de ligação codificada capaz de se ligar especificamente a um peptídeo contendo um antígeno HA-1H e não se liga a um peptídeo que não contenha um antígeno HA-1H.
[00152] Também são aqui fornecidos vetores que compreendem um construto de transgene da divulgação instantânea. Alguns exemplos de vetores incluem plasmídeos, vetores virais, cosmídeos e outros. Alguns vetores podem ser capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos
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91/140 tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos), enquanto outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira ou promover integração da inserção do polinucleotídeo após introdução na célula hospedeira e, assim, replicar-se juntamente com o genoma do hospedeiro (por exemplo, vetor lentiviral, vetor retroviral). Adicionalmente, alguns vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão ligados operacionalmente (estes vetores podem ser referidos como vetores de expressão). De acordo com modalidades relacionadas, é ainda entendido que, se um ou mais agentes (por exemplo, polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação como aqui descrito) são coadministrados a um indivíduo, que cada agente pode residir em vetores separados ou iguais e múltiplos vetores (cada um contendo um agente diferente ou o mesmo agente) pode ser introduzido a uma célula ou população de células ou administrado a um indivíduo.
[00153] Em certas modalidades, os polinucleotídeos da presente divulgação podem estar operacionalmente ligados a certos elementos de um vetor. Por exemplo, as sequências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento de sequências de codificação, nas quais estão ligadas, podem ser ligadas operacionalmente. As sequências de controle de expressão podem incluir
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92/140 sequências de iniciação, terminação, promotor e potenciador de transcrição apropriados; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de junção e poliadenilação ; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que melhoram a eficiência da tradução (ou seja, sequências de consenso de Kozak); sequências que aumentam a estabilidade proteica; e possivelmente sequências que melhoram a secreção de proteínas. As sequências de controle de expressão podem estar operacionalmente ligadas se forem contíguas com o gene de interesse e sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a distância para controlar o gene de interesse.
[00154] Em certas modalidades, o vetor compreende um vetor plasmídico ou um vetor viral (por exemplo, um vetor selecionado a partir do vetor lentiviral ou um vetor retroviral-γ). Os vetores virais incluem retrovirus, adenovirus, parvovirus (por exemplo, vírus adenoassociados), coronavirus, vírus de RNA de fita negativa, como ortomixovírus (por exemplo, vírus influenza), rabdovírus (por exemplo, vírus da raiva e estomatite vesicular), paramixovirus {por exemplo, sarampo e Sendai), vírus de fita positiva de RNA como picornavírus e alfavírus, e vírus de DNA de fita dupla incluindo adenovirus, herpesvirus (por exemplo, vírus Herpes Simplex tipos 1 e 2, vírus EpsteinBarr, citomegalovírus) e poxvirus (por exemplo, vaccinia, varicela e canarypox). Outros vírus incluem vírus Norwalk,
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93/140 togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus e virus da hepatite, por exemplo. Exemplos de retrovirus incluem sarcoma de leucose aviária, virus de tipo C de mamífero, virus do tipo B, virus do tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus e spumavirus (Coffin, JM, Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, Β. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
[00155] 0 Retrovirus são vírus tendo um genoma de RNA, que é transcrito reversamente em DNA usando uma enzima transcriptase reversa, o DNA transcrito reversamente é então incorporado ao genoma da célula hospedeira. O Gammaretrovirus se refere a um gênero da família retroviridae. Exemplos de gammaretrovirus incluem o vírus de células tronco de camundongo, o vírus da leucemia murina, o vírus da leucemia felina, o vírus do sarcoma felino e o vírus da reticuloendoteliose aviária. O vetor lentiviral, como aqui usado, significa vetores lentivirais baseados em HIV para entrega de genes, que podem ser integrativos ou não integrativos, têm capacidade de empacotamento relativamente grande e podem transduzir uma faixa de tipos de células diferentes. Os vetores lentivirais geralmente são gerados após a transfecção transiente de três (empacotamento, envelope e transferência) ou mais plasmídeos em células produtoras. Como o HIV, os vetores lentivirais entram na
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94/140 célula alvo através da interação da glicoproteinas da superfície viral com receptores na superfície celular. Na entrada, o RNA viral sofre transcrição reversa, que é mediada pelo complexo transcriptase reversa viral. O produto da transcrição reversa é um DNA viral linear de fita dupla, que é o substrato para a integração viral no DNA das células infectadas.
[00156] Em certas modalidades, o vetor viral pode ser um gammaretrovirus, por exemplo, vetores derivados de vírus de leucemia murina de Moloney (MLV). Em outras modalidades, o vetor viral pode ser um vetor derivado de retrovirus mais complexo, por exemplo, um vetor derivado de lentivírus. Os vetores derivados do HIV-1 pertencem a esta categoria. Outros exemplos incluem vetores de lentivírus derivados de HIV-2, FIV, vírus da anemia infecciosa equina, SIV e vírus MaediVisna (lentivírus ovinos). Os métodos de uso de vetores virais retrovirais e lentivirais e de células de empacotamento para transduzir células hospedeiras de mamífero com partículas virais contendo transgenes de TCR ou CAR são conhecidos na técnica e foram descritos anteriormente, por exemplo, em: Patente US 8.119.772; Walchli et al. , PLoS One (6:327930, 2011; Zhao et al, J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al, Hum. Gene Ther. 14: 1155, 2003; Frecha et al, Mol. Ther. 18: 1748, 2010; e Verhoeyen et al, Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. Construções
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95/140 de vetores retrovirais e lentivirais e sistemas de expressão também estão comercialmente disponíveis. Outros vetores virais podem também ser usados para distribuição de polinucleotídeos incluindo vetores virais de DNA, incluindo, por exemplo, vetores baseados em adenovirus e vetores baseados em vírus adenoassociados (AAV); vetores derivados de vus herpes simplex (HSV), incluindo vetores de amplificação, HSV com replicação deficiente e HSV atenuado (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).
[00157] Outros vetores recentemente desenvolvidos para uso de terapia gênica também podem ser usados com as composições e métodos desta divulgação. Tais vetores incluem aqueles derivados de baculovírus e a-vírus. (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors, pp. 209-40 em Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. Nova york: Cold Spring Harbor Lab) , ou vetores de plasmideos (tal como a Bela Adormecida ou outros vetores de transposon).
[00158] Quando um genoma de vetor viral compreende uma pluralidade de polinucleotídeos a serem expressos em uma célula hospedeira como transcritos separados, o vetor viral também pode compreender sequências adicionais entre os dois (ou mais) transcritos, permitindo a expressão bicistrônica ou multicistrônica. Exemplos de tais sequências usadas em vetores virais incluem locais de entrada de ribossomo internos (IRES), locais de divagem de furina, peptídeo 2A
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96/140 viral ou qualquer combinação dos mesmos.
[00159] Em certas modalidades, um vetor é capaz de entregar o construto de transgene a uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula progenitora hematopoiética ou uma célula do sistema imunológico humano). Em modalidades especificas, um vetor é capaz de entregar um construto de transgene à célula do sistema imunológico humano, tal como, por exemplo, uma célula T CD4 + , uma célula T CD8 + , uma célula T negativa dupla CD4~CD8~, uma célula T γδ uma célula assassina natural, uma célula dendritica ou qualquer combinação das mesmas. Em outras modalidades, um vetor capaz de entregar um construto de transgene a uma célula T nativa, uma célula T de memória central, uma célula T de memória efetora ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, um vetor que codifica um construto de polinucleotideo ou de transgene da presente divulgação pode compreender adicionalmente um polinucleotideo que codifica uma nuclease que pode ser usada para realizar um nocaute cromossômico em uma célula hospedeira (por exemplo, uma endonuclease CRISPR-Cas ou outra endonuclease conforme divulgado no presente pedido) ou que pode ser usada para distribuir um transgene terapêutico ou porção do mesmo a uma célula hospedeira em uma terapia de reposição genética ou terapia de reparo genético.
[00160] Alternativamente, uma nuclease usada para um
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97/140 nocaute cromossômico ou uma terapia de reposição ou terapia de reparo genético pode ser entregue a uma célula hospedeira independente de um vetor que codifica um construto de polinucleotídeo ou de transgene desta divulgação.
Usos [00161] Ainda em outros aspectos, a presente divulgação fornece métodos para tratar ou para prevenir uma recaída de um distúrbio hiperproliferativo caracterizado pela expressão de um antígeno HA-1 em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma dose unitária compreendendo uma célula imune manipulada desta divulgação (ou uma composição compreendendo uma célula imune manipulada), tratando, desse modo, o distúrbio hiperproliferativo.
[00162] Tratar ou tratamento ou melhorar refere-se ao tratamento médico de uma doença, distúrbio ou condição de um indivíduo (por exemplo, um mamífero humano ou não humano, tal como um primata, cavalo, gato, cão, cabra, camundongo ou rato) . Em geral, uma dose apropriada ou regime de tratamento compreendendo uma célula imune manipulada da presente divulgação, e opcionalmente um adjuvante, é administrada em uma quantidade suficiente para induzir um benefício terapêutico ou profilático. Benefício terapêutico ou profilático/preventivo inclui melhor resultado clínico; diminuição ou alívio dos sintomas associados a uma doença;
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98/140 diminuição da ocorrência de sintomas; melhoria da qualidade de vida; estado mais livre de doença; diminuição da extensão da doença, estabilização do estado de doença; atraso da progressão da doença; remissão; sobrevivência; sobrevida prolongada; ou qualquer combinação dos mesmos.
[00163] Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficaz, conforme usado no presente pedido, refere-se a uma quantidade de células imunes manipuladas suficiente para resultar em um efeito terapêutico, incluindo um resultado clínico melhorado; diminuição ou alívio dos sintomas associados a uma doença; diminuição da ocorrência de sintomas; melhoria da qualidade de vida; estado mais livre de doença; diminuição da extensão da doença, estabilização do estado de doença; atraso da progressão da doença; remissão; sobrevivência; ou sobrevida prolongada de forma estatisticamente significativa. Quando se refere a um ingrediente ativo individual ou a uma célula que expressa um único ingrediente ativo, administrado isoladamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se aos efeitos desse ingrediente ou célula que expressa esse ingrediente sozinho. Quando se refere a uma combinação, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se às quantidades combinadas de ingredientes ativos ou ingrediente ativo adjuvante combinado com uma célula que expressa um ingrediente ativo que resulta em um efeito terapêutico, quer seja administrado
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99/140 em série ou simultaneamente. Uma combinação também pode ser uma célula que expresse mais de um ingrediente ativo.
[00164] O termo excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente ou veículo fisiologicamente aceitável refere-se a veículos biologicamente compatíveis, por exemplo, solução salina fisiológica, que são descritos no presente pedido mais detalhadamente, que são adequados para administração a um indivíduo humano ou outro mamífero não humano e geralmente reconhecido como seguro ou não causando um evento adverso grave.
[00165] Conforme usado no presente pedido, estatisticamente significativo refere-se a um valor de p de 0,050 ou inferior quando calculado usando o teste t de Student e indica que é improvável que um determinado evento ou resultado a ser medido tenha surgido por acaso.
[00166] Os métodos presentemente divulgados podem ser úteis para, por exemplo, tratar ou prevenir uma recaída de um distúrbio hiperproliferativo caracterizado pela expressão do antígeno HA-1 em um indivíduo, em que o antígeno HA-1H está presente em um complexo HLA expresso por células hiperproliferativas no indivíduo.
[00167] Exemplos de distúrbios hiperproliferativos caracterizados por complexos HA-1h:HLA incluem malignidades hematológicas. Em certas modalidades, a malignidade
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100/140 hematológica compreende uma leucemia (por exemplo, uma leucemia aguda ou uma leucemia crônica). Em modalidades específicas, a leucemia compreende leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia aguda de fenótipo misto (MPAL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia prolinfocítica de células B, leucemia de células pilosass ou leucemia linfocítica crônica (CLL). Em certas modalidades, a malignidade hematológica compreende um linfoma. Em certas modalidades, o linfoma compreende linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), um linfoma do sistema nervoso central, linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células dendríticas CD37+, linfoma linfoplasmocitário, linfoma da zona marginal esplênica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma extraósseo, linfoma de células B extranodal da zona marginal de tecido linfóide associado à mucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodular, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de grandes células B mediastinal (tímico), linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de grandes células imunoblásticas, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferação de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante. Em certas modalidades, a malignidade
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101/140 hematológica compreende um distúrbio mielodisplásico, tal como, por exemplo, citopenia refratária com displasia de unilinhagem (anemia refratária, neutropenia refratária e trombocitopenia refratária), anemia refratária com sideroblastos em anel (RARS), anemia refratária com sideroblastos em anel - trombocitose (RARS-t), citopenia refratária com displasia multiargeme (RCMD), citopenia refratária com displasia multiargeme e sideroblastos em anel (RCMD-RS), anemia refratária com excesso de blastos (RAEB), mielodisplasia inclassificável e citopenia refratária da infância. Em outras modalidades, a malignidade hematológica compreende um mieloma. Os indivíduos que podem ser tratados pela presente invenção são, em geral, seres humanos e outros indivíduos primatas, tais como macacos e símios para fins de medicina veterinária. Em qualquer uma das modalidades acima mencionadas, o indivíduo pode ser um indivíduo humano. Os indivíduos podem ser do sexo masculino ou feminino e podem ter qualquer idade adequada, incluindo indivíduos infantis, juvenis, adolescentes, adultos e geriátricos. As células, de acordo com a presente divulgação podem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença, condição ou distúrbio a ser tratado como determinado por especialistas na técnica médica. Em qualquer uma das modalidades acima, uma célula imune manipulada ou dose unitária como descrito no presente pedido é administrada intravenosamente,
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102/140 intraperitonealmente, intratumoralmente, na medula óssea, em um linfonodo, ou no fluido cerebrospinal, de modo a encontrar células alvo (por exemplo, células de leucemia) . Uma dose apropriada, duração adequada e frequência de administração das composições serão determinadas por tais fatores como uma condição do paciente; tamanho, tipo e gravidade da doença, condição ou distúrbio; a forma particular do ingrediente ativo; e o método de administração.
[00168] A quantidade de células em uma composição ou dose unitária é pelo menos uma célula (por exemplo, uma subpopulação de células T CD8+ manipuladas; uma subpopulação de células T CD4+ manipuladas) ou é mais tipicamente superior a 102 células, por exemplo, até 106, até para 107, até 108 células, até 109 células ou mais de IO10 células. Em certas modalidades, as células são administradas em uma faixa de cerca de 106 a cerca de 1010 células/m2, de um modo preferencial, em uma faixa de cerca de 105 a cerca de 109 células/m2. O número de células dependerá do uso final a que se destina a composição, bem como o tipo de células ai incluídas. Por exemplo, as células modificadas para conter uma proteína de fusão específica para um antígeno particular irá compreender uma população de células contendo pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais dessas células. Para usos aqui fornecidos, as células são geralmente em um volume de um litro ou menos,
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500 mis ou menos, 250 mis ou menos, ou 100 mis ou menos. Em modalidades, a densidade das células desejadas é tipicamente maior que 104 células/ml e geralmente é maior que a 107 células/ml, geralmente 108 células/ml ou maior. As células podem ser administradas como uma infusão única ou em múltiplas infusões ao longo de uma faixa de tempo. Um número clinicamente relevante de células imunes pode ser distribuído em múltiplas infusões que cumulativamente são iguais ou superiores a 106, 107, IO8, 109, 1010 ou 1011 células. Em certas modalidades, uma dose unitária da célula imune manipulada pode ser co-administrada com células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, simultaneamente ou contemporaneamente) a partir de um doador alogênico (por exemplo, um doador que é negativo para HA1H negativo, HLA-A2 negativo ou ambos).
[00169] São também contempladas composições farmacêuticas (ou seja, composições) que manipulam células imunes como aqui divulgadas e um veículo, diluentes ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes adequados incluem água, solução salina, dextrose, glicerol ou semelhantes e combinações dos mesmos. Em modalidades, composições compreendendo proteínas de fusão ou células hospedeiras como aqui divulgadas compreendem ainda um meio de infusão adequado. Os meios de infusão adequados podem ser qualquer formulação de meio isotônico, solução salina
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104/140 tipicamente normal, Normosol R (Abbott) ou Plasma-Lyte A (Baxter), 5% de dextrose em água, lactato de Ringer pode ser usado. Um meio de infusão pode ser suplementado com albumina de soro humano ou outros componentes do soro humano.
[00170] As composições farmacêuticas podem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença, condição a ser tratada (ou prevenida) como determinado por especialistas na técnica médica. Uma dose apropriada e uma duração adequada e frequência de administração das composições serão determinadas por fatores tais como o estado de saúde do paciente, tamanho do paciente (ou seja, peso, massa ou área do corpo) , o tipo e gravidade do paciente, condição do paciente, a forma particular do ingrediente ativo e o método de administração. Em geral, uma dose e regime de tratamento apropriados fornecem a (s) composição (ões) em uma quantidade suficiente para fornecer benefício terapêutico e/ou profilático (tal como descrito no presente pedido, incluindo um resultado clínico melhorado, tal como remissões completas ou parciais mais frequentes ou mais sobrevida livre de doença e/ou global, ou diminuição da gravidade dos sintomas).
[00171] Uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica se refere a uma quantidade suficiente, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar os resultados clínicos desejados ou tratamento benéfico,
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105/140 conforme descrito no presente pedido. Uma quantia eficaz pode ser entregue em uma ou mais administrações. Se a administração for para um indivíduo já conhecido ou confirmado com uma doença ou estado de doença, o termo quantidade terapêutica pode ser usado em referência ao tratamento, enquanto quantidade profilaticamente eficaz pode ser usado para descrever a administração de uma quantidade eficaz para um indivíduo que é suscetível ou em risco de desenvolver uma doença ou estado de doença (por exemplo, recorrência) como um curso preventivo.
[00172] As composições farmacêuticas descritas no presente pedido podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, tais como ampolas ou frascos selados. Tais recipientes podem ser congelados para preservar a estabilidade da formulação até a infusão no paciente. Em certas modalidades, uma dose unitária compreende uma célula imune manipulada, tal como descrita no presente pedido, em uma dose de cerca de 107 células/m2 a cerca de 1011 células/m2. O desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para usar as composições particulares descritas no presente pedido em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo, por exemplo, administração ou formulação parentérica ou intravenosa.
[00173] Se a composição em questão for administrada parentericamente, a composição também pode incluir solução
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106/140 ou suspensão aquosa ou oleaginosa estéril. Os diluentes ou solventes parentericamente aceitáveis não tóxicos adequados incluem água, solução de Ringer, solução salina isotônica, 1,3-butanodiol, etanol, propilenoglicol ou polietilenoglicóis em misturas com água. As soluções ou suspensões aquosas podem compreender adicionalmente um ou mais agentes tamponantes, tais como acetato de sódio, citrato de sódio, borato de sódio ou tartarato de sódio. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer formulação unitária de dosagem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades usadas. Além disso, os compostos ativos podem ser incorporados em preparações e formulações de libertação sustentada. A forma de unitária de dosagem, conforme usado no presente pedido, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade pode conter uma quantidade predeterminada de células imunes manipuladas ou composto ativo calculado para produzir o efeito desejado em associação com um veículo farmacêutico apropriado.
[00174] Em geral, uma dosagem e regime de tratamentos apropriados fornecem as moléculas ou células ativas em uma quantidade suficiente para fornecer um benefício. Tal resposta pode ser monitorada ao estabelecer um resultado clínico melhorado (por exemplo, remissões mais frequentes,
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107/140 sobrevida completa ou parcial, ou mais livre da doença) em indivíduos tratados em comparação com indivíduos não tratados. Aumentos nas respostas imunes preexistentes a uma proteína tumoral geralmente se correlacionam com um resultado clínico melhorado. Tais respostas imunes podem geralmente ser avaliadas usando ensaios padrão de proliferação, citotoxicidade ou citocina, que são rotineiros.
[00175] Para uso profilático, uma dose deve ser suficiente para prevenir, retardar o início ou diminuir a gravidade de uma doença associada a doença ou distúrbio. O benefício profiláctico das composições imunogênicas administradas de acordo com os métodos descritos no presente pedido pode ser determinado realizando estudos pré-clínicos (incluindo estudos animais in vitro e in vivo) e clínicos e analisando os dados obtidos através de métodos e técnicas estatísticos, biológicos e clínicos apropriados, todos os quais podem ser prontamente praticados por uma pessoa versada na técnica.
[00176] Conforme usado no presente pedido, a administração de uma composição refere-se à entrega da mesma a um indivíduo, independentemente da via ou método de entrega. A administração pode ser efetuada de forma contínua ou intermitente e parentericamente. A administração pode ser para tratar um indivíduo já confirmado como tendo uma
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108/140 condição, doença ou estado de doença reconhecido, ou para tratar um indivíduo susceptível ou em risco de desenvolver tal condição, doença ou estado de doença. A coadministração com uma terapia adjuvante pode incluir a entrega simultânea e/ou sequencial de múltiplos agentes em qualquer ordem e em qualquer esquema de dosagem (por exemplo, células imunes manipuladas com uma ou mais citocinas; terapia imunossupressora tais como inibidores de calcineurina, corticosteróides, inibidores de microtúbulos, dose baixa de um pró-fármaco de ácido micofenólico ou qualquer combinação dos mesmos).
[00177] Em certas modalidades, uma pluralidade de doses de uma célula imune manipulada descrita no presente pedido é administrada ao indivíduo, que pode ser administrada em intervalos entre administrações de cerca de duas a cerca de quatro semanas.
[00178] Os métodos de tratamento ou prevenção desta divulgação podem ser administrados a um indivíduo como parte de um curso ou regime de tratamento, que pode compreender tratamentos adicionais antes ou depois da administração das doses, células ou composições unitárias divulgadas instantaneamente. Por exemplo, em certas modalidades, um indivíduo que recebe uma dose unitária da célula imune manipulada está a receber ou recebeu anteriormente um transplante de células hematopoiéticas (HCT; incluindo HCT
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109/140 mieloablativo e não mieloablativo) . Em modalidades específicas, o HCT compreende células doadoras que são HA1~, HLA-A2~, ou ambas, e o indivíduo que recebe as células doadoras de HCT é HA-1+/HLA-A2+. Em qualquer das modalidades anteriores, uma célula hematopoiética usada em um HCT pode ser uma célula doadora universal que é modificada para reduzir ou eliminar a expressão de um ou mais genes endógenos que codificam um produto polipeptídico selecionado a partir de uma molécula de HLA ou de uma molécula de TCR (por exemplo, por um nocaute de gene cromossomal de acordo com os métodos descritos no presente pedido). Técnicas e regimes para a realização de HCT são conhecidos na técnica e podem compreender o transplante de qualquer célula doadora adequada, tal como uma célula derivada do sangue do cordão umbilical, medula óssea ou sangue periférico, uma célula tronco hematopoiética, uma célula tronco mobilizada ou célula do líquido amniótico. Consequentemente, em certas modalidades, uma célula imune manipulada da presente divulgação pode ser administrada com, ou logo após, as células tronco hematopoiéticas em uma terapia de HCT modificado.
[00179] Em modalidades adicionais, o indivíduo tinha recebido anteriormente quimioterapia linfodepletora antes de receber as células imunes manipuladas ou HCT. Em certas modalidades, uma quimioterapia linfodepletora compreende um
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110/140 regime de condicionamento compreendendo ciclofosfamida, fludarabina, globulina anti-timócito ou uma combinação dos mesmos .
[00180] Os métodos de acordo com esta divulgação podem incluir adicionalmente a administração de um ou mais agentes adicionais para tratar a doença ou distúrbio em uma terapia de combinação. Por exemplo, em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende a administração de uma célula imune manipulada com (concorrentemente, simultaneamente, ou sequencialmente) um inibidor do ponto de verificação imunológico. Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende administrar uma célula imune manipulada com um agonista de um agente de ponto de verificação imunológico estimulador. Em modalidades adicionais, uma terapia de combinação compreende administrar uma célula imune manipulada com uma terapia secundária, tal como agente quimioterapêutico, uma terapia de radiação, uma cirurgia, um anticorpo ou qualquer combinação dos mesmos.
[00181] Conforme usado no presente pedido, o termo agente de supressão imune ou agente de imunossupressão refere-se a uma ou mais células, proteínas, moléculas, compostos ou complexos que fornecem sinais inibitórios para auxiliar no controle ou supressão de uma resposta imune. Por exemplo, agentes de supressão imune incluem aquelas moléculas que bloqueiam parcial ou totalmente a estimulação
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111/140 imune; diminuir, prevenir ou retardar a ativação imune; ou aumentar, ativar ou regular a supressão imune. Agentes de imunossupressão exemplificativos para o alvo (por exemplo, com um inibidor do ponto de verificação imune) incluem PD1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (GDI 12R), PVRL2, adenosina, A2aR, citocinas imunossupressoras (por exemplo, IL-10, IL-4, IL-IRA, IL-35), IDO, arginase, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM -1, CEACAM-3, CEACAM-5, células Treg ou qualquer combinação dos mesmos.
[00182] Um inibidor do agente de supressão imune (também referido como um inibidor do ponto de verificação imune) pode ser um composto, um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou polipeptideo de fusão (por exemplo, fusão de Fc, tal como CTLA4-Fc ou LAG3-Fc) , uma molécula antissentido, uma molécula de ribozima ou de RNAi, ou uma molécula orgânica de baixo peso molecular. Em qualguer das modalidades divulgadas no presente pedido, um método pode compreender uma célula imune manipulada com um ou mais inibidores de qualquer uma dos seguintes componentes de supressão imune, isoladamente ou em qualquer combinação.
[00183] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada usada em combinação com um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo especifico de PD-1 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como pidilizumab, nivolumab,
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112/140 pembrolizumab, MEDI0680 (anteriormente AMP-514), AMP-224, BMS-936558 ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, uma célula imune manipulada da presente divulgação (ou uma célula hospedeira manipulada que expressa a mesma) é usada em combinação com um anticorpo específico de PD-L1 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como BMS936559, durvalumab (MEDI4736), atezolizumab (RG7446), avelumab (MSB0010718C), MPDL3280A ou qualquer combinação dos mesmos .
[00184] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de LAG3, tal como LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00185] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de CTLA4. Em modalidades particulares, uma célula imune manipulada usada em combinação com um anticorpo específico de CTLA4 ou fragmento de ligação dos mesmos, tal como ipilimumab, tremelimumab, proteínas de fusão CTLA4-Ig (por exemplo, abatacept, belatacept) ou qualquer combinação dos mesmos.
[00186] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um anticorpo específico de B7-H3 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como enoplituzumab (MGA271), 376,96 ou ambos. Um fragmento de ligação ao anticorpo de B7-H4 pode ser um scFv ou proteína
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113/140 de fusão do mesmos, conforme descrito, por exemplo, em Dangaj et al, Cancer Res. 73:4820, 2013, bem como os descritos na Patente US No. 9.574.000 e na Patente PCTpublicação n° WO/201640724A1 e WO 2013/025779A1.
[00187] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de CD244.
[00188] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de BLTA,
HVEM, CD 160, ou qualquer combinação dos mesmos. Os anticorpos anti CD-160 são descritos, por exemplo, na
Publicação PCT n° WO 2010/084158.
Em certas modalidades uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de TIM3.
[00190]
Em certas modalidades uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de Gal9.
[00191]
Em certas modalidades uma célula imune manipulada usada em combinação com um inibidor da sinalização de adenosina tal como um receptor de adenosina chamariz.
[00192]
Em certas modalidades uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de A2aR.
[00193]
Em certas modalidades uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de KIR, tal como lirilumab (BMS-986015).
[00194]
Em certas modalidades, uma célula imune
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114/140 manipulada é usada em combinação com um inibidor de uma citocina inibidora (tipicamente, uma citocina diferente de TGFp) ou desenvolvimento ou atividade de Treg.
[00195] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de IDO, tal como levo-l-metil triptofano, epacadosatato (INCB024360; Liu et al , Blood 115:3520-30, 2010), ebselen (Terentis et al. Biochem. 49:591-600, 2010), indoximod, NLG919 (Mautino et al. , American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1-metil-tiiptofano (1-MT)tira-pazamine, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00196] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de arginase, tal como N(omega)-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), Nomega-hidroxi-nor-l-arginina (nor-NOHA), L-NOHA, 2(S)— amino-6-boronohexanóico ácido (ABH), S-(2-boronoetil)-Lcisteína (BEC) ou qualquer combinação dos mesmos.
[00197] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de VISTA, tal como CA-170 (Curls, Lexington, Mass.).
[00198] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de TIGIT, tal como, por exemplo, COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canada), um inibidor de CD155, tal como, por exemplo, COM701 (Compugen) ou ambos.
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115/140 [00199] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de PVRIG, PVRL2 ou ambos. Os anticorpos anti PVRIG são descritos, por exemplo, na Publicação PCT n° WO 2016/134333. Os anticorpos anti PVRL2 são descritos, por exemplo, na Publicação PCT n° WO 2017/021526.
[00200] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de LAIR1.
[00201] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada é usada em combinação com um inibidor de CEACAM1, CEACAM-3, CEACAM-5 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00202] Em certas modalidades, uma célula imune manipulada usada em combinação com um agente que aumenta a atividade (ou seja, é um agonista) de uma molécula de checkpoint imune estimulante. Por exemplo, uma célula imune manipulada pode ser usada em combinação com um agonista de CD137 (4-1BB) (tal como, por exemplo, urelumab), um agonista de CD134 (OX-40) (tal como, por exemplo, MEDI6469, MEDI6383 ou MEDI0562), lenalidomida, pomalidomida, um agonista de CD27 (tal como, por exemplo, CDX-1127), um agonista de CD28 (tal como, por exemplo, TGN1412, CD80 ou CD86), um agonista de CD40 (tal como, por exemplo, CP-870,893, rhuCD40L ou SGN40), um agonista de CD122 (tal como, por exemplo, IL-2) um agonista de GITR (tal como, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados descritos na publicação de patente
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116/140
PCT n° WO 2 016/054 638), um agonista de ICOS (CD278) (tai como, por exemplo, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 1451, Icos 314-8, ou qualquer combinação dos mesmos). Em qualquer uma das modalidades aqui divulgadas, um método pode compreender a administração de uma célula imune manipulada com um ou mais agonistas de uma molécula de checkpoint imune estimulante, incluindo qualquer uma das anteriores, isoladamente ou em qualquer combinação.
[00203] Em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma célula imune manipulada e uma terapia secundária compreendendo um ou mais dentre: um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que específico para um antígeno de câncer expresso pelo tumor sólido não inflamado, um tratamento de radiação, uma cirurgia, um agente quimioterapêutico, uma citocina, RNAi ou qualquer combinação dos mesmos.
[00204] Em certas modalidades, um método terapêutico de combinação compreende administrar uma proteína de fusão e administrar adicionalmente um tratamento com radiação ou uma cirurgia. A radioterapia é bem conhecida na técnica e inclui terapias de raios X, tais como irradiação gama e terapias radiofarmacêuticas. As cirurgias e técnicas cirúrgicas apropriadas para tratar um dado câncer em um indivíduo são bem conhecidas dos versados na técnica.
[00205] Em certas modalidades, um método terapêutico
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117/140 de combinação compreende a administração de uma célula imune manipulada e a administração adicional de um agente quimioterapêutico. Um agente quimioterapêutico inclui, mas
não se limita a, um inibidor da função de cromatina, um
inibidor de topoisomerase, um fármaco inibidor de
microtúbulos, um agente danificador de DNA, um
antimetabólito (como antagonistas de folatc j, análogos de
pirimidina, análogos de purina e análogos modificados com açúcar), um inibidor de síntese de DNA, um agente interativo de DNA um agente intercalante) e um inibidor de reparo de DNA. Os agentes quimioterapêuticos ilustrativos incluem, sem limitação, os seguintes grupos: agentes antimetabolitos/anti-câncer, tais como análogos de pirimidina (5-fluorouracila, floxuridina, capecitabina, gemcitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas do folato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluindo produtos naturais como os alcalóides da vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), disruptores de microtúbulos como o taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposídeo, teniposídeos), agentes danificadores de DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfan, camptotecina, carboplatina, clorambucil,
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118/140 cisplatina, ciclofosfamida, Citoxan, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hexametilmelaminaoxaliplatina, iposfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, temozolamida, teniposildeo, trietilenotiofosforamida e etoposideo (VP 16)); antibióticos como a dactinomicina (actinomicina D) , daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metabolizam sistemicamente a L-asparagina e privam as células que não tem a capacidade de sintetizar a asparagina da mesma); agentes antiplaquetários; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, tais como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), sulfonatos de alquilabussulfano, nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos- dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos do ácido fólico (metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônios (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de
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119/140 aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sals de heparina sintética e outros inibidores da trombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador do plasminogênio tecidular, estreptocinase e uroquinase), aspirina, dipiridamole, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratórios; agentes anti-secretores (breveldina); imunossupressores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetil); compostos anti-angiogênicos (TNP470, genisteína) e inibidores do fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), inibidores do fator de crescimento de fibroblastos (FGF)); bloqueador do receptor da angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos anti-sentido; anticorpos (trastuzumab, ntuximab); receptores de antigenes quiméricos; inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoína); inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorrubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, enosídeo, epirrubicina, etoposídeo, idarrubicina, irinotecano (CPT-11) e mitoxantrona, topotecano, irinotecano), corticosteróides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona e prenisolona); inibidores de cinase de transdução de sinal de fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial, toxinas tais como toxina da cólera,
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120/140 ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de adenilato ciclase de Bordetella pertussis ou toxina da difteria e ativadores de caspases; e disruptores de cromatina.
[00206] As citocinas são cada vez mais usadas para manipular a resposta imune do hospedeiro em relação à atividade anticancerígena. Ver, por exemplo, Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015. As citocinas úteis para promover uma resposta imune anticancerígena ou antitumoral incluem, por exemplo, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL24 e GM-CSF, isoladamente ou em qualquer combinação com uma célula imune manipulada desta divulgação.
[00207] São também aqui fornecidos métodos para modular uma imunoterapia adotiva, em que os métodos compreendem administrar, a um indivíduo que recebeu anteriormente uma célula imune manipulada da presente divulgação que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de comutação de segurança, um composto cognato da proteína de comutação de segurança em uma quantidade eficaz para ablar no indivíduo o anteriormente administrado com célula imune manipulada.
[00208] Como usado aqui, o termo terapia imune adotiva ou imunoterapias adotivas se refere à administração de células naturais ou geneticamente manipuladas, células do sistema imunológico específicas de
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121/140 doença ou antígeno (por exemplo, células T). A imunoterapia celular adotiva pode ser autóloga (as células imunitárias são do receptor), alogênicas (as células imunitárias são de um doador da mesma espécie) ou singênicas (as células imunitárias são de um doador geneticamente idêntico ao receptor).
[00209] Em certas modalidades, a proteína de comutação de segurança compreende tEGFR e o composto cognato é cetuximab, ou a proteína de comutação de segurança compreende iCasp9 e o composto cognato é AP1903 (por exemplo, AP1903 dimerizado) ou a proteína de comutação de segurança compreende um polipeptídeo RQR e o composto cognato é rituximab, ou a proteína de comutação de segurança compreende um domínio de ligação de myc e o composto cognato é um anticorpo específico para o domínio de ligação de myc.
[00210] Ainda em outros aspectos, são fornecidos métodos para fabricar uma composição, ou dose unitária da presente divulgação. Em certas modalidades, os métodos compreendem a combinação (i) de uma alíquota de uma célula hospedeira transduzida com um vetor da presente divulgação com (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, vetores da presente divulgação são usados para transfectar/transduzir uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula T) para uso em terapia de transferência adotiva (por exemplo, direcionamento para um antígeno de câncer).
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Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente, antes da alíquota, a cultura da célula hospedeira transduzida e a seleção da célula transduzida como tendo incorporado (isto é, expressando) o vetor. Em outras modalidades, os Métodos compreendem, após a cultura e seleção e antes da alíquota, expandir a célula hospedeira transduzida. Em qualquer uma das modalidades dos presentes métodos, a composição fabricada ou a dose unitária podem ser congeladas para uso posterior. Qualquer célula hospedeira apropriada pode ser usada para a fabricação de uma composição ou dose unitária de acordo com os métodos presentes, incluindo, por exemplo, uma célula tronco hematopoiética, uma célula T, uma célula T primária, uma linhagem de células T, uma célula NK ou célula K-T Em modalidades específicas, os métodos compreendem uma célula hospedeira que é uma célula T CD4+ ou uma célula T CD8+.
EXEMPLO
EXEMPLO 1
ISOLAMENTO E CLONAGEM DE TCRs ESPECÍFICOS DE HA-1H [00211] Clones de células T CD8+ específicos de HA-1H foram isolados utilizando métodos in vitro previamente descritos (Bleakley et al. , Blood 115: 4923-4933, 2010 (Figura 1). Especificamente, as células T CD8+ foram isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico do doador HLA-A2+ (2 dadores) (PBMC), utilizando um kit de
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123/140 isolamento de células T CD8+ e microesferas imunomagnéticas anti-CD45RO (Miltenyi Biotec). As células dendríticas autólogas (DCs) foram pulsadas com 1 pg/mL de peptídeo HA1H (VLHDDLLEA) durante 3-6 horas a 37 °C. CD8+ Tn purificados foram combinados em meio completo de linfócitos T (CTL) com DCs pulsadas com peptídeo na razãode Tn para DC de 30:1, e co-cultivados em placas de 96 cavidades a 6xl04 células T/cavidade, suplementadas com 10 ng/mL de IL-12 desde o início e lOng/mL de IL-15 a partir do dia 7. Nos dias 11-13, as células foram avaliadas quanto à citotoxicidade especifica para HA-1H em ensaios de liberação de micro-cromo de cavidades divididas (CRA; pCRA). Linhagens de células T que lisaram células T2 pulsadas com 1 pg/mL de peptídeo HA1H (> 20% de lise e > 5 vezes mais lise de alvos não pulsados versus não peptídeos pulsados) foram subsequentemente clonadas por diluição limitante utilizando anticorpo monoclonal anti-CD3. (mAb), interleucina-2 (IL-2) e células alimentadoras.
[00212] Os clones foram rastreados por pCRA no dia 11-13. Os clones de células T de cavidades apresentando citotoxicidade específica, utilizando os critérios anteriores, foram expandidos utilizando células de mAb antiCD3, IL-2 e células alimentadoras, pelo Protocolo de Expansão Rápida (REP). A especificidade dos clones expandidos foi avaliada por CRA, coloração de multímeros HA-1/HLA-A2 e
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124/140 coloração de citocinas intracelulares (ICC) . A especificidade de HA-1H dos clones de CTL foi verificada com multímeros de HA-1h/HLA A2. Em particular, o multímero HLAA2/HA-1H e o anticorpo monoclonal CD8+ (mAb) foram usados para corar os clones específicos de HA-1 (clones 1, 2, 10, 13, 14, 16 e 5) e um clone de controle específico para outro antígeno tumoral (Figura 2A).
[00213] Além disso, um ensaio de liberação de cromo (CRA) foi usado para testar 7 dos clones de CTL específicos de HA-1 (1, 2, 10, 13, 14, 16 e 5) para matar os alvos pulsadas com peptídeo HA-1H. Os clones de células T reconheceram células alvos pulsadas com peptídeo HA-1H (HLHDDLLEA) em concentrações de peptídeo muito baixas e observou-se uma lise meia máxima a uma concentração de peptídeo de 10 pM. (Figura 2B) (dados de ICC não mostrados) . A citotoxicidade dos clones isolados contra células com ou sem expressão de HA-1H endógena também foi examinada. Os ensaios mostram 7 clones de CTL específicos para HA-1H (TCR1, TCR2, TCR10, TCR13, TCR14, TCR16 e TCR5), lisando a linhagem de células (THP-1) de leucemia mieloide aguda (AML) e HA-1H+ e AML HA- 1H+ primária, mas não HA-1H~ AML (Figura 2C) .
[00214] Em seguida, os TCRs HA-1H isolados foram clonados. Os genes Va e Vp de TCR dos 8 CTL foram sequenciados e 6 TCRs distintos foram identificados (TCR1 e TCR13 foram considerados idênticos, assim como TCR2 e TCR14). Os genes
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125/140 (e alelos específicos) que codificam os 6 TCRs, bem como as sequências de aminoácidos de Vp CDR3 de TCRs, são mostrados na Tabela 1:
[00215] Tabela 1. Genes e Sequências βΟϋΚ3 de TCRs isolados
Alfa Beta
gene V gene J gene V gene D gene J CDR3 (aa)
TCR 1 TRAV17*0 TRAJ28*0 TRVB7- TRBD1* TRBJ21* CASSSTGGHNE
TCR TRAV17*0 TRAJ28*0 TRVB7- TRBD1* TRBJ21* CASSSTGGHNE
TCR 2 TRAV21*0 TRAJ40*0 TRVB7- TRBD1* TRBJ1- CAS SL
TCR TRAV21*0 TRAJ40*0 TRVB7- TRBD1* TRBJ1- CAS SL
TCR TRAV10*0 TRAG45*0 TRVB7- TRBD2* TRBJ27* CASSMLTNYEQ
TCR TRAV21*0 TRAF20*0 TRVB7- TRBD1* TRBJ21* CASSLWGNEQ
TCR 5 TRAV17 TRAJ29 TRVB7- TRBD1/ TRBJ2-7 CASSLTTLDE
TCR TRAV8-3 TRAJ27 TRBV15 TRBD1* TRBJ2-5 ATSKTRIAQET
[00216] Um sétimo TCR, TCR29 também foi identificado e sequenciado. Após o sequenciamento, os genes que codificam os TCRs HA-1H (com exceção do TCR24, que apresentava uma função ruim nas células T CD8+ transduzidas) foram códon otimizados para maximizar a expressão e as modificações de cisteína foram introduzidas e para reduzir o risco de erros de desemparelhamento com cadeias de TCR endógenas, conforme descrito abaixo. As sequências de nucleotídeos dos genes de TCRp e TCRa do clone de CTL após
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126/140 códon otimização e modificações de cisteína são fornecidas nas SEQ ID NOs 39-48 e 51-52.
[00217] O RNA foi extraído de cada clone de células T específico de HA-1H. A amplificação de cDNA de primeira fita 5' e amplificação rápida de PCR de extremidades de cDNA (RACE) foi realizada para identificar regiões de TCR de comprimento total, utilizando um Kit de Amplificação de cDNA de SMARTer RARA (Clontech Laboratories) . O cDNA foi sintetizado a partir de RNA utilizando Iniciador de 5' CDS A, oligo SMARTer IIA e Transcriptase Reversa SMARTScribe. Subsequentemente, o cDNA foi usado para realizar uma reação de RACE PCR, utilizando polimerase de DNA de alta fidelidade da Phusion® e iniciadores específicos de gene para o TCR alfa (a) - (5'-GGTGAATAGGCAGACAGACTT-3') (SEQ ID NO: 93) ou cadeia beta (β) TCR (GTGGCCAGGCACACCAGTGT) (SEQ ID NO: 94). O produto RACE PCR foi purificado e sequenciado para identificar as cadeias α e β de TCR. IMGT/V-QUEST foi usado para definir as regiões de variável (V), diversidade (D) e união (J) de TCR.
[00218] Os resíduos de cisteína complementares nas posições 48 (Thr para Cys) e 57 (Ser para Cys) foram incorporados nos domínios constantes dos genes α e β de TCR para aumentar o emparelhamento de TCR exógeno e diminuir o desemparelhamento com o TCR endógeno. Para assegurar a expressão gênica coordenada, as cadeias de TCR foram
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127/140 separadas por elementos 2A do teschovírus porcino (P2A). Os transgenes foram condon otimizados para aumentar a expressão e sintetizados por GeneArt (Life Technologies) e foram clonados no vetor pRRLSIN.cPPT.MSCV.WPRE LV por digestão de restrição e ligação. As sequências de aminoácidos dos construtos de TCR codificadas são fornecidas nas SEQ ID NOS: 53-57 .
EXEMPLO 2
EXPRESSÃO HETERÓLOGA E ATIVIDADE DE TCRS ESPECÍFICOS DE HA-1H [00219] Em seguida, os TCR modificados por cisteína e códon otimizados foram testados quanto à expressão e atividade.
[00220] Os vetores lentivais (LV) foram usados para transduzir as células T primárias para fornecer um polinucleotídeo codificando os construtos de TCR específicos de HA-1H. As células T transduzidas foram separadas, expandidas e testadas quanto à especificidade de HA-1H (Figura 4). Cinco dos seis TCR LVs de de HA-1H transduziram eficientemente as células T CD8+ e CD4+ primárias (Figuras 5A e 6A) e conferiram reconhecimento específico das células HLA-A2+ pulsadas com baixas quantidades de peptídeo HA-1H. TCR2 e TCR16 mostraram a atividade citotóxica mais forte e foram selecionados para outros experimentos. As células T transduzidas com estes TCRs mataram as células pulsadas com
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HA-1H (Figura 5Β, 5C, 6B e 35), as linhagens de células com expressão endógena de HA-1H (Figuras 6C-6E e Figura 7) e células de leucemia primárias com HA-1H endógena (Figuras 8A-8E, Figura 9) , mas estas células manipuladas não foram ativadas e não mataram as células negativas para HA-1H (Figura 7), células de leucemia primária (Figuras 8A, 8B e 9) ou fibroblastos (Figura 10). Além disso, as células T TCR de HA-1H CD8+ e CD4+ secretaram ΙΕΝγ e IL-2 em resposta à estimulação de peptideos HA-1H (dados não mostrados). As células HA-1 H TCR CD4+ eliminaram as células alvos pulsadas com elevadas concentrações de peptideos, embora a transdução de LV com o TCR HA-1H sozinho não tenha feito com que as células T CD4+ respondessem às células primárias de leucemia com níveis nativos de antígeno (dados não mostrados).
[00221] Em suma, estes dados demonstram que as células T expressam eficazmente HA-1H TCRs e têm atividade de eliminação específica de antígeno contra células linfoides.
EXEMPLO 3
FUNÇÃO DE CO-RECEPTOR DE CD8 EM CÉLULAS TCR CD4+ HA-1H [00222] A inclusão de células T CD4+ num produto de célula de imunoterapia pode fornecer a secreção de IL-2 induzida por antígeno e aumentar a persistência e a função de células T CD8+ citotóxicas transferidas (ver, por exemplo, Kennedy et al. , Immunol. Rev. 222.129 (2008); Nakanishi
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129/140 etal., Nature 462(7272):510 (2009)). No entanto, a função ótima de muitos TCR restritos de classe I em células T CD4+ requer a transferência de um co-receptor de CD8 para aumentar a sensibilidade do TCR a complexos de peptideos HLA de classe I. Os co-receptores CD4 diferem em estrutura de CD8 e não podem substituir eficazmente os co-receptores CD8 (ver, por exemplo, Stone & Kranz, Front. Immunol. 4:244 (2013); veja também, Cole etal., Immunology 137 (2) : 139 (2012) . Concentrações de HA-1H relativamente altas foram necessárias para induzir atividade citolitica em células T CD4+ transduzidas com um TCR HA-1H isolado, e as células T CD4 + TCR HA-1 não reconheceram linhagens de células ou leucemia, implicando a dependência do co-receptor CD8 do TCR (dados não mostrados).
[00223] Várias opções para incluir um co-receptor CD8 na construto do transgene foram exploradas. Os co-receptores CD8 existem na superfície de células T αβ TCR convencionais, tipicamente como dímeros de cadeias α e β de CD8, e existem cinco variantes da cadeia β com diferentes sequências de cauda intracitoplasmática (βΜ1-5) (ver, por exemplo, Thakral et al, J. Immunol. 180 (11): 7431 (2008); ver também Thakral et al. , PLoS One 8(3): e59374 (2013)). As sequências de aminoácidos das cadeias de co-receptores CD8 são fornecidas nas SEQ ID NOs: 48-53.
[00224] Construtos de HA-1H TCR2 foram gerados os
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130/140 quais incluem uma ou ambas as cadeias CD8 α e a cadeia CD8 β como variantes inteiras ou truncadas. Quando usadas para transduzir células T CD4+ primárias, as cadeias α e β foram expressas na superfície celular; os dímeros αβ e um monômero α aumentaram a ligação do multímero HA-1h/HLA-A2 por células T transduzidas com TCR em maior extensão do que os monômeros β (Figura 11 A (i-ii) ) . As cadeias α e β de CD8 com truncamentos dos componentes da cadeia intracelular não aumentaram a ligação do multímero acima do TCR sozinho (Figura 11 A(iii)). A transdução com variantes CD8 α e βΜΙ ou βΜ4 melhorou a função de TCR DE HA-1H em células T CD4 + mais do que as cadeias CD8 α e βΜ2 ou βΜ5 (Figura 11B). Nos ensaios funcionais, a incorporação da cadeia βΜΙ ou βΜ4 melhorou a função das células T CD4+ em maior extensão do que os monômeros CD8 «(Figuras 11B e 11C). βΜΙ forneceu maior especificidade de resposta do que βΜ4. A variante βΜΙ foi portanto selecionada e usada num LV multicistrônico que incluía sequências CD8a e βΜΙ bem como o HA-1H TCR. As células T CD4+ transduzidas com o vetor secretaram IL-2 e interferon gama (ΙΕΝγ) (Figura 12A) e se proliferaram quando cocultivadas com células HA-1H+AML (Figura 12B) .
EXEMPLO 4
INTRODUÇÃO DE UM COMUTAÇÃO DE SEGURANÇA NOS CONSTRUTOS
DE TCR DE HA-1H [00225] Para assegurar que as células T transduzidas
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131/140 com TCR de HA-1H possam ser rapidamente depletadas em caso de qualquer toxicidade inesperada, foram gerados quatro construtos de TCR de HA-1H de comutação de segurança condon otimizados: (1) A caspase induzivel 9 (iCasp9) baseia-se na fusão da caspase 9 humana com uma proteína de ligação a FK humana modificada, permitindo a dimerização condicional; quando exposto a um fármaco de dimerização sintético, a iCasp9 torna-se ativada e inicia a morte rápida de células que expressam este construto (ver, por exemplo, Straathof el al. , Blood 105 /11):4247 (2005)); (2) 0 EGFR humano truncado (tEGFR) é um polipeptídeo desprovido de domínios de ligação ao ligante N-terminal extracelular e atividade intracelular do receptor de tirosina cinase, mas retém a localização da superfície celular transmembranar tipo I e um epítopo de ligação para o mAb anti-EGFR de grau farmacêutico, cetuximab (ver Wang et al, Blood 118 (5) :4255 (2011) ) ; (3) RQR8 é um marcador combinado compacto e comutação de segurança para células T, combinando epítopos alvos de CD34 (um marcador reconhecido pelo anticorpo QBEndlO) e antígenos CD20 (mimótopos de alça extracelular) apresentados num talo de co-receptor CD8 truncado; o RQR8 está ligado ao mAb antiCD20 de grau farmacêutico, rituximab (ver Philip et al, Blood 124 (8): 1255 (2011)); (4) O TCR marcado com Myc incorpora uma etiqueta de 10 aminoácidos da proteína c-Myc humana que está ligada por um mAb específico de marcador (ver Kieback
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132/140 et al, PNAS 105 (2):623 (2008)).
[00226] A ligação dos mAbs respectivos a tEGFR, RQR8 ou etiqueta-myc fornece um alvo para citotoxicidade celular dependente de complemento ou dependente de anticorpo e eliminação de células transduzidas. As moléculas de comutação de segurança foram clonadas em construtos de TCR2 LV a montante e associadas operacionalmente com as sequências de codificação de TCRp e TCRa. As sequências de TCRp e TCRa foram separadas por elementos P2A do teschovírus porcino para assegurar a expressão gênica coordenada. As células T transduzidas com iCasp9-HA-lH TCR, tEGFR-HA-lH TCR, RQR8-HA1H TCR ou TCR HA-1H marcado com Myc demonstraram a expressão de TCR de HA-1H e reconhecimento de células alvos HA-1H+ semelhantes ao reconhecimento por células T transduzidas com o TCR de HA-1H sozinho (Figura 14) .
[00227] Para testar a capacidade dos comutadores de segurança para eliminar as células T, as células T transduzidas foram incubadas durante 24 horas com a concentração ótima (Figura 16) do respectivo fármaco cognato (o dimerizador AP1903 para iCasp9/HA-lH/TCR; complemento mais mAb apropriado (mAb anti-EGFR para tEGFR-HA-lH; TCR; mAb anti-CD20 mais TCR RQR8-HA-1H; e mAb etiquetado com antiMyc para HA-1H-TCR etiquetado com Myc em todos as outros construtos). Todas as células T transduzidas por comutadores de segurança eram suscetíveis ao respectivo acionador
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133/140 (Figura 16, veja também a Figura 15). No entanto, iCasp9 com AP1903 forneceu consistentemente a eliminação mais rápida e completa de células T transduzidas e foi selecionado para avaliação adicional.
EXEMPLO 5
PROJETO E SELEÇÃO DE UM CONSTRUTO DE TRANSGENE [00228] A seguir, os transgenes de TCR de HA-1H incorporando ambos iCasp9 e co-receptor ΕϋδαβΜΙ foram analisados quanto à funcionalidade. Para auxiliar na seleção e rastreamento de células T transduzidas, duas configurações de marcadores foram projetadas. Em uma, o epitopo CD34 mínimo (Q) do polipeptídeo RQR foi aninhado na cadeia α do TCR de HA-1H. No outro, o polipeptídeo RQR foi incorporado na cadeia β do co-receptor ΕϋδαβΜΙ funcional de comprimento total. Cinco construtos de transgene de LV foram então criados, usados para transduzir as células T CD8+ e comparados: (1) iCasp9-HA-lH TCR2; (2) co-receptor HA-1H-TCR2-CD8; (3) iCasp9-HA-lH TCR2-CD8; (4) iCasp9-HA-lH TCR2-RQR-CD8; e (5) iCasp9-CD34-HA-lH TCR2-CD8 (ver Figuras 17 e 18) .
[00229] Todos os construtos produziram células T que segregaram especificamente citocinas e mataram células HA1H+, mas não células ou fibroblastos HA-1H~ AML, e tiveram função similar (ver Figuras 19-26), exceto o iCasp9-CD34-HA1H-TCR2-CD8 (com o epitopo CD34 incorporado na cadeia TCRa), que teve um desempenho insatisfatório. O transgene TCR2
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RQR-CD8 iCasp9-HA-lH, que contém todos os elementos desejados. (incluindo a capacidade de seleção imunomagnética; ver Figuras 27-29) e funcionou bem como os construtos menos complexos, foi selecionado para estudos posteriores.Um diagrama esquemático deste construto é mostrado na Figura 30, e a sequência de nucleotídeos do construto é fornecida na SEQ ID NO: 85.
EXEMPLO 6 [00230] PRODUÇÃO EM ESCALA CLÍNICA E TESTAGEM DE CÉLULAS T TCR DE HA-1H [00231] A composição celular de produtos de imunoterapia de células T pode ter importantes efeitos a jusante na persistêcia e função de células T específicas de antígeno após transferência de células T adotivas (ver, por exemplo, Sommermeyer et ai, Leukemia 30 (2): 492 (2016); ver também Wang et al, Blood 117 (6): 1888 (2011) e Hinrichs et ai, PNAS 106 * 41): 17469 (2009)). Em geral, a infusão de células T específicas de antígeno derivadas de subconjuntos de células T mais jovens, incluindo células-tronco T de memória TN, (Tscm) e células T de memia central (TCm) , parece vantajosa. No contexto da imunoterapia com células T pósHCT, também é importante considerar o potencial de GVHD mediado pelo TCR nativo de células T do doador. Os Tn causam GVHD grave em modelos murinos e a depleção de CD45RA+ Tn de enxertos de PBSC reduz o risco de GVHD grave e/ou crônica em
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135/140 humanos (ver, por exemplo, Bleakley et al. , J. Clin. Invest. 125 (7) 2611 (2015) . É também desejável incluir células CD4 + e CD8+ específicas para o mesmo antígeno, uma vez que as células T helper CD4+ podem melhorar as respostas de CTL antitumorais aumentando a expansão clonal no local do tumor e evitando a morte celular induzida pela ativação (ver, por exemplo Giuntoli et ai., Clin. Câncer Res. 8 (3) : 922 (2002) ; ver também Kennedy e Celis, J. Immunol., 177 (5) 2862 (2006) ) . Portanto, o produto de células T (1-2 x 109 PBSC/PBMC) foi primeiro depletado de células Tn CD45RA+ para minimizar o risco de GVHD grave, e depletada de monócitos CD 14+ para otimizar a eficiência de transdução do LV, antes de separar as frações enriquecidas com CD8+ e CD4+ para garantir uma composição de CD4:CD8 consistente (aprox. 3xl06 células de cada tipo de célula) e estimulação (microesferas CD3/CD28) e transdução das células T com iCasp9 -HA1 TCR2-RQR-CD8 LV.
[00232] As células transduzidas foram selecionadas em fluxo utilizando os multímeros HA-1h/HLA-A2 e o mAb CD34 45 dias mais tarde, e cultivadas em frascos G-Rex utilizando REP (Protocolo de Expansão Rápida) compreendendo células OKT3, PBMC, HA-1+ LCL e IL-2. As células T de memória CD4+ e CD8+ HA-1HTCR expandiram-se eficientemente, com uma expansão média de 2000 vezes (Figura 32A; consulte também a Figura 31, painéis mais à esquerda). As células T transduzidas com CD4+ e CD8+ foram recolhidas e combinadas (total de 3-6xl09
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136/140 células nos dias 16-20), depois enriquecidas por seleção para CD34 para produzir uma população enriquecida deb l,5x 109 células. Os ensaios de liberação foram então realizados para testar a pureza (> 75%), viabilidade, função, especificidade, presença ou ausência de vírus e esterilidade. O produto de célula T final manteve a expressão do TCR de HA-1H (Figura 32B), tinha um fenótipo CD45RO+ CD28+ predominantemente com expressão variável de CD62L, CCR7 e CD27 (Figura 32C) e incluiu células que não expressam marcadores de exaustão como PD-1 (Figuras 32D, 32E).
[00233] As células T CD8+ e CD4+ HA-1H TCR expandidas mantiveram a capacidade de especificamente matar e secretar citocinas em resposta à estimulação com células pulsads com HA-1H (Figura 33A) ou linhagens de células de leucemia HA1H+ (Figura 33B) , e muitas células HA-1H TCR CD8+ e CD4 + secretaram múltiplas citocinas (Figura 33C; ver também os painéis central e à direita da Figura 31) . Além disso, as células poderíam ser enriquecidas usando microesferas imunomagnéticas anti-CD34 (Figura 34A) e foram eficientemente eliminadas por exposição ao fármaco dimerizador AP1903 (Figura 34B) . Finalmente, o TCR nativo em células T CD4+ e CD8+ TCR de HA-1H no produto celular foi avaliado utilizando imunossoquenciamento de TCR (Adaptative Biotecnologias) e uma população policlonal diversificada foi observada (dados não mostrados). Além disso, o produto
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137/140 continha numerosos TCR de frequência muito baixa, um achado que foi recentemente associado com o potencial de persistência e expansão após transferências de células T adotivas (Chapuis et al. , Sei. Immunol. 2 (8) (2017).
EXEMPLO 7
ESTUDO CLÍNICO COM O USO DO PRODUTO DA TERAPIA COM CÉLULAS T DE HA-1H [00234] Um estudo de praticabilidade e segurança é conduzido utilizando o produto de terapia celular HA-1H descrito no Exemplo 5 (células T de memória CD8+ e CD4 + transduzidas com pRRLSIN 1C9-HA-1H -TCR2-RQR-CD8; abreviado daqui em diante como TCR LV de HA-1H) . A amostra do paciente compreende crianças, adolescentes e adultos com leucemia recorrente (AML, ALL, outra leucemia aguda ou CML) . Especificamente, pacientes de 0 a 70 anos estão inscritos em duas faixas etárias de aproximadamente 12 indivíduos cada: um grupo com idade >16 anos, e um grupo com idade <16 anos. Todos os pacientes expressam HLA-A * 0201 e possuem o genótipo HA-1 (H) (RS_1801284: A/G, A/A). Os pacientes também têm um doador adulto para HCT que é adequadamente compatível com HLA por padrões institucionais, e estão atualmente passando ou já sofreram HCT alogênico para AML, ALL, outro tipo de leucemia aguda ou leucemia mieloide crônica.
[00235] Amostras de medula óssea são tomadas após uma suspeita de recaída. Os pacientes geralmente recebem
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138/140 quimioterapia de linfodepletação (fludarabina) antes da infusão com o produto de células T. Posteriormente, os pacientes recebem uma dose única de células T-LV-TCR HA-1H (aproximadamente 1: 1 CD4+: CD8+ Tm) quando três critérios são satisfeitos: (1) há evidência de doença recorrente ou refratária após HCT; (2) células T TCR de HA-1H foram geradas; e (3) quimioterapia linfodepletora foi administrada (se indicado) . As células T-LV TCR de HA-1H são administradas por infusão (tão rapidamente quanto tolerado através de um cateter venoso central por gravidade ou uma bomba de seringa) de acordo com o esquema de dosagem fornecido na Tabela 2.
Tabela 2. Cronograma Clinico de Dosagem
Nível de Dose (células T TCR de
-1 Até 3 x 105/kg
0 Até 1 x 106/kg
1 Até 3 x 106/kg Dose
2 Até 10 x 106/kg
3 Até 30 x 106/kg
[00236] Pelo menos 1-2 indivíduos > 16 anos são tratados antes do tratamento de um indivíduo no coorte mais jovem. Em cada faixa etária (> 16 e < 16 anos), os pacientes são tratados em coortes de três ou mais pacientes em um dos cinco níveis de dose de células T TCR de HA-1H, começando no nível de dose 1 (3 x 106 células T TCR de HA-lH/kg) . Um período de 28 dias entre a administração do agente
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139/140 investigacional a indivíduos consecutivos dentro de cada faixa etária é observado. Amostras de medula óssea são colhidas nos dias 4, 18 e 32 após a infusão do produto de células T. Outros aspectos do estudo incluem monitoramento: a persistência ín vivo de células T TCR de HA-1H transferidas no sangue periférico; a capacidade das células T TCR de HA1H migrarem para a medula óssea; a função das células T TCR de HA-1H antes e, se possível, após transferência de células T adoptivas; se a infusão de células T TCR de HA-1H é seguida por uma redução da carga de leucemia; se a infusão de células T TCR de HA-1H é seguida por uma redução do quimerismo hematopoiético receptor; e se a infusão de células T TCR de HA-1H é seguida pelo aparecimento ou recorrência de sinais ou sintomas da doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).
[00237] O Pedido de Patente Provisório US 62/399.291, depositado em 23 de setembro de 2016, ao qual o presente pedido reivindica prioridade, é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00238] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Todas as patentes US, publicações de pedidos de patentes US, pedidos de patentes US, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patenteadas referidas neste relatório descritivo e/ou listadas na Folha de Dados de Aplicação são aqui incorporadas por referência, na sua
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140/140 totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, aplicações e publicações para fornecer ainda outras modalidades.
[00239] Estas e outras alterações podem ser feitas às modalidades à luz da descrição acima detalhada. Em geral, nas reivindicações seguintes, os termos usados não devem ser construídos para limitar as reivindicações às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados para incluir todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo total de equivalentes aos quais tais reivindicações são destinadas. Assim, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Célula imune manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de ligação que inclui:
    (a) um domínio variável (να) de cadeia-α de receptor de células T (TCR) tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRAV17, um gene TRAV21, ou um gene TRAV10, e um domínio (Vp) variável de cadeia-β TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 8 6;
    (b) um domínio Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp TCR tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRBV7-9; ou (c) um domínio Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86, em que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo contendo um antígeno HA1H e e não se liga a um peptídeo que não contém um antígeno HA-1 H.
  2. 2. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que:
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    2/34 (a) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14, e the encoded Vc<CDR3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:88;
    (b) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:87;
    (c) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:89;
    (d) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:90;
    (e) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:91; ou (f) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 6, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:92.
  3. 3. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio Va codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, e 12.
  4. 4. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma
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    3/34 das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o domínio Vp codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência
    com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, e 11. 5. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o
    domínio να codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR1, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR1, ou a CDR1 do domínio Va codificado e a CDR1 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos.
    6. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que o domínio Va codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, ou a CDR2 do domínio Va codificado e a CDR2 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos.
    7. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que:
    (a) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e o domínio Va
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    4/34
    codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 4;
    (b) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 2;
    (c) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 6;
    (d) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 8;
    (e) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 10; ou
    (f) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de
    aminoácidos SEQ ID NO: 12
    8. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio
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  5. 5/34 constante de cadeia-α TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19-22, 24, e 26
    9. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR de domínio constante tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 18, 23, e 25.
    10. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:28, 30, 32, 34, 36, e 38.
    11. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:28, 30, 32, 34, 36, e 38.
    12. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das
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  6. 6/34
    SEQ ID NOS:27, 29, 31, 33, 35, e 37.
    13. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:27, 29, 31, 33, 35, e 37.
    14. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende:
    (a) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28;
    (b) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:29, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30;
    (c) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31, e a cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:32;
    (d) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:33, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:34;
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  7. 7/34 (e) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:35, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; ou (f) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:37, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:38.
    15. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que a (i) polinucleotídeo heterólogo que codifica a cadeia-α TCR e o (ii) polinucleotídeo heterólogo que codifica a cadeia-β TCR são contidos em uma estrutura de leitura aberta, em que a estrutura de leitura aberta única compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem disposto entre (i) e (ii).
    16. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de autoclivagem
    compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 76-84. 17. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a
    estrutura de leitura aberta única compreende uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos cerca de 80% idêntica à
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  8. 8/34 sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 5963 .
    18. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a estrutura de leitura aberta única compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 59-63.
    19. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato de que a estrutura de leitura aberta única codificada compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 53-57 .
    20. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo de HA-1h:HLA.
    21. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o HLA compreende HLA-A*0201.
    22. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de HA-1H compreende a sequência de aminoácidos VLHDDLLEA (SEQ ID NO:66).
    23. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um TCR, um
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  9. 9/34 fragmento de ligação ao antígeno de um TCR, ou um receptor de antígeno quimérico (CAR).
    24. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno do TCR compreende um TCR de cadeia única (scTCR).
    25. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende a CAR.
    26. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um TCR.
    27. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 6, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica:
    (a) uma proteína de comutação de segurança;
    (b) um marcador de seleção;
    (c) uma cadeia-β de co-receptor de CD8;
    (d) uma cadeia-α de co-receptor de CD8; ou (e) qualquer combinação dos mesmos.
    28. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a proteína de comutação de segurança codificada compreende:
    (i) um receptor de EGF truncado (tEGFR);
    (ii) iCasp9;
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  10. 10/34 (iii) um polipeptídeo RQR;
    (iv) um epítopo myc; ou (v) qualquer combinação dos mesmos.
    29. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção codificado compreende:
    (i) um polipeptídeo RQR;
    (ii) um fator de crescimento de nervo de baixa afinidade truncada (tNGFR);
    (iii) um CD19 truncada (tCD 19);
    (iv) um CD34 truncada (tCD34); ou (v) qualquer combinação dos mesmos.
    30. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo fato de que o co-receptor de CD8 codificado compreende uma cadeia-β compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS :71-75.
    31. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizada pelo fato de que o co-receptor de CD8 codificado é um co-receptor de CD8 recombinante compreendendo um polipeptídeo RQR tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69.
    32. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de RQR codificado está contido em uma cadeia-β
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  11. 11/34 do co-receptor de CD8 codificado.
    33. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de RQR codificado está contido em uma cadeia-a do co-receptor de CD8 codificado.
    34. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica iCasp9 e um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma proteína de coreceptor de CD8 que compreende uma cadeia-β contendo um polipeptídeo RQR.
    35. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 32 ou 34, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo que codifica, de 5' a 3', ([um polipeptídeo iCasp9]-[um peptídeo de porcino teschovirus 2A (P2A)]-[uma cadeia-β TCR]-[um peptídeo P2A] [uma cadeia-α TCR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-β de CD8 compreendendo um polipeptídeo de RQR]-[um peptídeo P2A]-[uma cadeia-α de CD8]).
    36. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 35, caracterizada pelo fato de que um polinucleotídeo que codifica uma cadeia-β de TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:41, e em que o polinucleotídeo que codifica uma cadeia-a de TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de
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  12. 12/34
    SEQ ID NO:42.
    37. Célula imune manipulada, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo transgene heterólogo compreendendo ou consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:85.
    38. Célula imune manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T, uma célula NK, ou uma célula NK-T.
    39. Célula imune manipulada, de acordo com a
    reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T CD4+ ou uma célula T CD8+.
    40. Célula imune manipulada, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a célula imune compreende um nocaute de gene cromossomal de um gene PD-1; um gene LAG3; um gene TIM3; um gene CTLA4; um gene de
    componente HLA; um gene de componente TCR, ou qualquer
    combinação dos mesmos.
    41. Célula imune manipulada, de acordo com a
    reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o gene de nocaute cromossomal compreende um nocaute de um gene de componente HLA selecionado de um gene de macroglobulina al,
    um gene de macroglobulina a2, um gene de macroglobulina a3, um gene de macroglobulina βΐ, ou gene de microglobulina β2. 42. Célula imune manipulada, de acordo com a
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 178/247
  13. 13/34 reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o gene de nocaute cromossomal compreende um nocaute de um gene de componente TCR selecionado de um gene da região variável TCR a, um gene da região variável TCR β, um gene da região constante de TCR, ou uma combinação dos mesmos.
    43. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula imune manipulada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
    44. Dose unitária, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de (i) célula imune manipulada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou (ii) uma composição conforme definida com a reivindicação 43.
    45. Dose unitária, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30% de células T CD4 + manipuladas, combinadas com (ii) uma composição compreendendo pelo menos cerca de 30% de células T CD8 + manipuladas, em cerca de uma razão de 1:1, em que a dose unitária não contém substancialmente nenhuma célula T naive.
    46. Método para tratar ou prevenir uma recaída de um distúrbio hiperproliferativo caracterizado pela expressão de um antígeno HA-1H em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 179/247
  14. 14/34 uma dose unitária conforme definida na reivindicação 44 ou 45, tratando assim o distúrbio hiperproliferativo.
    47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o antígeno HA-1H está presente em um complexo HLA expresso por células hiperproliferantes no indivíduo.
    48. Método, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que o distúrbio hiperproliferativo compreende uma malignidade hematológica.
    49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a malignidade hematológica compreende uma leucemia, um linfoma, um distúrbio mielodisplásico ou um mieloma.
    50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a malignidade hematológica compreende uma leucemia.
    51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a leucemia é selecionada de leucemia mieloide aguda (AML) , leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia aguda de fenótipo misto (MPAL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia pró-linfocítica de células B, leucemia de células capilares ou leucemia linfocítica crônica (CLL).
    52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o distúrbio hematológico
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 180/247
  15. 15/34 compreende um linfoma.
    53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o linfoma é selecionado de linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma do sistema nervoso central, linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células dendríticas CD37+, linfoma linfoplasmacítico, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma de células B da zona marginal extra-nodular do tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma de célula B da zona marginal nodular, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de células B grandes do mediastino (timo), linfoma linfoblástico B precursor, linfoma imunoblástico de células grandes, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusão primária ou linfoma de Burkitt.
    54. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a malignidade hematológica compreende um distúrbio mielodisplásico.
    55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o distúrbio mielodisplásico é selecionado como citopenia refratária com displasia de unilinhagem (anemia refratária, neutropenia refratária e trombocitopenia refratária) , anemia refratária com sideroblastos em anel (RARS), anemia refratária com sideroblastos em anel - trombocitose (RARS-t), citopenia
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  16. 16/34 refratária com displasia multilinhagem (RCMD), citopenia refratária com displasia multilinhagem e sideroblastos em anel (RCMD-RS), anemia refratária com excesso de blastos (RAEB), mielodisplasia inclassificável ou citopenia refratária da infância.
    56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 55, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está recebendo ou recebeu previamente um transplante de células hematopoiéticas (HCT).
    57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o HCT compreende uma célula hematopoiítica doadora compreendendo um nocaute cromossômico de um gene que codifica um componente HLA, um nocaute cromossômico de um gene que codifica um componente TCR, ou ambos.
    58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 57 , caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu previamente a quimioterapia linfodepletora. 59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a quimioterapia de
    linfodepletagem compreendia ciclofosfamida, fludarabina, globulina antitimocítica, ou uma combinação dos mesmos.
    60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 59, caracterizado pelo fato de que uma
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  17. 17/34 ou mais das células manipuladas compreendidas na dose unitária é alogênica ao indivíduo.
    61. Método para modular uma imunoterapia adotiva, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar, a um indivíduo que recebeu previamente uma célula imune manipulada conforme definida em qualquer um das reivindicações 27 a 42 e compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica a proteína de comutação de segurança em uma quantidade eficaz para ablacionar no indivíduo previamente administrado a célula imune manipulada.
    62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que:
    (a) a proteína de comutação de segurança compreende tEGFR e o composto cognato é cetuximab;
    (b) a proteína de comutação de segurança compreende iCasp9 e o composto cognato é AP1903;
    (c) a proteína de comutação de segurança compreende um polipeptídeo RQR e o composto cognato é rituximab;
    (d) a proteína de comutação de segurança compreende um domínio de ligação de myc e o composto cognato é um anticorpo específico para o domínio de ligação de myc; ou (e) qualquer combinação de (a)-(d)
    63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a comutação de segurança compreende iCasp9 e a AP1903 ligada a iCasp9.
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 183/247
  18. 18/34
    64. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de ligação, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende:
    (a) um domínio variável (να) de cadeia α de receptor de células T (TCR) tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRAV17, um gene TRAV21, ou um gene TRAV10, e um domínio variável (Vp) de cadeia-β TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86;
    (b) um domínio Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp TCR tendo uma sequência de aminoácidos codificada por um gene TRBV7-9; ou (c) um domínio Va TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 87-92, e um domínio Vp TCR compreendendo uma sequência de aminoácidos de CDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-17 e 86, em que a proteína de ligação codificada é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo contendo um antígeno HA1H e e não se liga a um peptídeo que não contém um antígeno HA-1H, e em que o polinucleotídeo é codon otimizada para expressão em uma célula hospedeira.
    65. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que:
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 184/247
  19. 19/34 (a) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14, e uma CDR3 να codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:88;
    (b) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:87;
    (c) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:89;
    (d) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 90; ou (e) uma CDR3 Vp codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e uma CDR3 Va codificada compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:91.
    66. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 64 ou 65, caracterizado pelo fato de que o domínio Va codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10, e 12.
    67. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 66, caracterizado pelo fato de que o domínio Vp codificado compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 185/247
  20. 20/34 sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, e 11.
    68. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato de que o domínio Va codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR1, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR1, ou a CDR1 do domínio Va codificado e a CDR2 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos.
    69. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 68, caracterizado pelo fato de que o domínio Va codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, o domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos de CDR2, ou a CDR2 do domínio Va codificado e a CDR2 do domínio Vp codificado não compreende nenhuma alteração na sequência de aminoácidos.
    70. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 69, caracterizado pelo fato de que:
    (a) o domínio Vp codifica ndo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4;
    (b) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na
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  21. 21/34 sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e o domínio να codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2;
    (c) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6;
    (d) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8;
    (e) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10;
    (f) o domínio Vp codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11, e o domínio Va codificado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.
    71. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 70, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende um domínio constante de cadeia-α TCR tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19-22, 24 e 26.
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  22. 22/34
    72. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 71, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR constant domain tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 18, 23, e 25.
    73. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 72, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:28, 30, 32, 34, 36 e 38.
    74. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 73, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:28, 30, 32, 34, 36 e 38.
    75. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a cadeia-α TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NQS:40, 42, 46, 48, 50, ou 52.
    76. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 75, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 188/247
  23. 23/34 tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:27, 29, 31, 33, 35, e 37.
    77. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 7 6, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:27, 29, 31, 33, 35, e 37.
    78. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a cadeia-β TCR compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 39, 41, 43, 45, 47, 49, ou 51.
    79. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 78, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação codificada compreende:
    (a) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28;
    (b) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:29, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30;
    (c) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na
    Petição 870190027357, de 21/03/2019, pág. 189/247
  24. 24/34 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31, e a cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:32;
    (d) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:33, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:34;
    (e) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:35, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; ou (f) uma cadeia-β TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:37, e uma cadeia-α TCR compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:38.
    80. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 7 9, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de autoclivagem disposto entre o polinucleotídeo que codifica a cadeia-β TCR e o polinucleotídeo que codifica a cadeia-a TCR.
    81. Polinucleotídeo isolado, de acordo com reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de autoclivagem codificado compreende ou consiste na sequência de nucleotídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 76-
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