BR112018077047B1 - Cassete e automato para cultura celular - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a um cassete de cultura celular (16) compreendendo: um invólucro (90) pelo menos parcialmente rígido e definindo internamente um espaço interno no qual é disposto e fixado um saco de cultura celular (100) definindo um volume interno; - condutos (36, 38) cada um conectado em uma extremidade ao volume; dentro do saco (100) e cada um tendo uma segunda extremidade localizada externa ao invólucro (90), válvulas (128, 130) para abrir/fechar o fluxo de fluido através dos condutos (36, 38) que são montados no invólucro (90).

Description

[001] A presente invenção refere-se a um cassete de cultura de células, bem como a uma máquina de cultura de células utilizando o referido cassete. A invenção refere-se assim a um dispositivo para cultura de células, em particular, referido como um cassete.

[002] Entre os domínios de cultura celular, a terapia celular é a menos avançada em termos de industrialização. Existe, portanto, uma necessidade importante de encontrar uma tecnologia capaz de produzir células em quantidade suficiente e sob condições ótimas e seguras para o uso dessas células para aplicações terapêuticas.

[003] Alguns métodos de terapia celular requerem uma cultura ou amplificação de células tronco antes de sua reinjeção em um paciente, porque as quantidades removidas são por vezes insuficientes para ter um efeito terapêutico. É essencial garantir a integridade das propriedades terapêuticas das células durante sua cultura. Na presente arte, as soluções propostas para cultivar células tronco ex vivo são artesanais, altamente empíricas e ineficientes.

[004] Além disso, a técnica atual não produz células tronco suficientes para aplicações terapêuticas. Existe, portanto, uma necessidade real de desenvolver um tipo de tecnologia de biorreator que tenha uma geometria compacta e que cultive as células em grandes quantidades.

[005] A automação de processos de expansão de células tronco para aplicações de produção em um ambiente terapêutico ou clínico requer dispositivos de produção de células capazes de operar em áreas de atividade controlada (sala limpa), minimizando intervenção humana. Os métodos de cultura de células tronco são relativamente complexos porque implementam múltiplos passos de obtenção destas células a partir de uma amostra retirada de uma amostra de paciente, isolamento celular, punir antes do cultivo e, finalmente, coleta, purificação e condicionamento após a cultura antes de enviar para centros de tratamento clínico.

[006] Todas essas etapas devem ser feitas em conformidade com os padrões de fabricação, impondo condições estritas de esterilidade e rastreabilidade. A multiplicação de etapas de fabricação, muitas vezes manuais, requer o uso de zonas de confinamento de classes diferentes, a fim de manter a esterilidade do processo. A preparação adequada pré e pós- cultura envolve frequentemente a transferência de intermediários de processo de uma área para outra, aumentando os riscos de perda de infertilidade e a mistura dos fluxos de produção.

[007] Por exemplo, um sistema de cultura de células tal como o descrito em US2012/0308531 é conhecido. A produção de culturas contínuas para a produção de células tronco é realizada por meio de um complexo sistema de subconjuntos trazendo os diversos reagentes, células e gases para o reator.

[008] O Requerente também propôs um dispositivo de cultura celular automatizado no documento WO/2013/135817. Se a cultura de células for realizada dentro de uma mesma bolsa, o seu manuseio pode ser difícil devido à sua estrutura flexível.

[009] A invenção visa, em particular, fornecer uma solução simples, eficaz e econômica para os problemas do estado da técnica descritos acima.

[0010] Para este propósito, propõe um cassete de cultura de células compreendendo: um invólucro pelo menos parcialmente rígido e definindo internamente um espaço interior no qual é disposta e fixada uma bolsa de cultura celular definindo um volume interior, condutas, cada uma ligada em uma extremidade ao volume interior da bolsa e tendo cada uma segunda extremidade localizada no exterior da bolsa e válvulas para abrir/fechar o fluxo de fluido através das condutas que são montadas no alojamento.

[0011] O manuseio da bolsa e das válvulas é feito através do invólucro do cassete. Apenas as segundas extremidades dos dutos exigem manipulação direta. De acordo com a invenção, o cassete ou dispositivo de cultura de células incorpora todos os elementos susceptíveis de apresentar um problema em termos de esterilidade e cujo manuseamento direto deve ser limitado. Estes elementos são pré-montados num cassete de cultura celular descartável. Após o uso, é possível eliminar de acordo com as regras de boas práticas todos os dutos, válvulas e sacos de cultura utilizados. De preferência, a integração de uma bolsa saco flexível em uma caixa pelo menos parcialmente rígida facilita muito o manuseamento do saco que é assim retido no alojamento. Da mesma forma, As válvulas da solução de integração no cassete de fluidos como meio das condutas do cassete de ocluir melhora a automação do uso do cassete num processo de cultura de células, evitando o uso de uma das mãos "braçadeiras" de plástico, frequentemente enfraquecidas durante um degrau de congelação, e manobráveis apenas à mão, ou por outro lado, válvulas solenóides de aperto que exijam a instalação manual das condutas na maxila da válvula solenóide. Esta solução permite, assim, evitar a manipulação das condutas e os erros relacionados com a má inserção das condutas nas válvulas solenóides.

[0012] O cassete na qual a bolsa compreende um meio de cultura de células pode ser congelado o tempo que for necessário.

[0013] De acordo com outra característica da invenção, os dutos são formados por tubos flexíveis e pelo menos algumas das válvulas compreendem um elemento de aperto móvel do tubo num elemento estrutural da caixa. Como descrito anteriormente, a integração das válvulas na caixa permite manter os caminhos fechados (tempo de armazenamento ou cultura) de forma independente e segura por um tempo desejado, sem que isso exija energia externa.

[0014] De acordo com ainda outra característica da invenção, cada membro móvel compreende um eixo de rotação e a periferia radialmente externa de cada membro móvel compreende pelo menos uma superfície em espiral em torno do eixo de rotação formando uma superfície de aperto da tubulação de a fim de variar uma seção da passagem do fluido através de um tubo e como a rotação do órgão.

[0015] Vantajosamente, as válvulas são capazes de manter uma determinada posição. Mais especificamente, as válvulas são moldadas de modo que os membros móveis possam manter uma determinada posição de abertura ou fechamento na ausência de entrada de energia. Ainda mais particularmente, isto pode ser conseguido assegurando que a perpendicular ao ponto de contato da superfície da espiral com um tubo esteja orientada para o eixo de rotação do elemento móvel, o que induz um binário zero em torno do referido eixo.

[0016] Em uma modalidade particular, os membros móveis são montados em caixas de uma placa integral com o alojamento, cada alojamento recebendo um membro móvel. Quando o invólucro é feito em duas meias-camadas inferior e superior, é assim possível montar o saco de cultura de células na metade da concha inferior, para montar o tubo móvel de aperto na meia concha inferior e depois montar a placa que garante uma manutenção simultânea das partes móveis. A placa pode ser, por exemplo, presa, por exemplo, por aparafusamento, à metade da concha inferior. A placa torna assim possível proteger e facilitar a montagem das várias partes acima mencionadas. Torna possível garantir a manutenção das válvulas.

[0017] Cada membro móvel compreende uma extremidade acessível a partir do exterior do alojamento e provida de primeiros meios de acoplamento rotativo para cooperar com os segundos meios de acoplamento em rotação de um atuador que pode ser eletromecânico.

[0018] O acesso aos elementos móveis das válvulas a partir do exterior torna possível montar o cassete num suporte adequado de uma incubadora compreendendo segundos meios de acoplamento, por exemplo, complementares, para acionar em rotação os primeiros meios de acoplamento do dispositivo de acoplamento. As válvulas para abrir/fechar o fluxo de líquido, conforme necessário. Esta acessibilidade externa torna possível manipular manualmente as válvulas em caso de falha dos meios de acionamento das válvulas.

[0019] De um modo preferido, os membros móveis são centrados e guiados rotativamente em uma extremidade num orifício do alojamento e em uma extremidade oposta num orifício da placa. Quando o invólucro é formado por duas meias conchas, a placa pode ser presa dentro do invólucro entre essas duas meias conchas.

[0020] De acordo com outra característica da invenção, a bolsa tem uma forma substancialmente paralelepipedal compreendendo uma primeira parede flexível e uma segunda parede flexível substancialmente paralelas uma a outra no estado vazio e no estado cheio de fluido.

[0021] A forma paralelepipédica é substancialmente plana, de modo que a espessura medida entre a primeira e a segunda parede, em uma primeira direção substancialmente perpendicular à primeira e segunda paredes, é muito pequena, ou seja, muito mais baixa do que as outras duas dimensões da bolsa medidas nas outras duas direções do espaço, perpendiculares entre si e à dita primeira direção. Nós entendemos por "muito claramente mais baixo" pelo menos 10 vezes mais baixo, como é comumente aceito em matemática.

[0022] De preferência, a razão entre a soma das superfícies da primeira parede e a segunda parede sobre o volume interno total do saco situa-se entre 500 e 690 centímetros2/L, de preferência é da ordem de 580 centímetros centímetros2/L. Esta relação garante a troca de calor ideal entre o saco flexível e o exterior quando o cassete é colocado em uma incubadora termostaticamente controlada.

[0023] A distância entre a primeira parede ou a segunda espessura de parede da bolsa, no estado cheio de líquido, tal como medida em uma direção perpendicular à primeira e segunda paredes, é vantajosamente inferior a 20 mm, de preferência entre 10 e 20 mm e mais preferencialmente da ordem de 14 mm. O uso de uma pequena espessura facilita ainda mais a difusão do calor dentro do líquido da bolsa. Isto também permite o congelamento e descongelamento uniforme dos vários constituintes do meio de cultura, que é mais rápido a uma temperatura constante.

[0024] A bolsa de acordo com a invenção permite manter a estabilidade do meio de cultura durante um passo de congelação por congelação. Na verdade, uma alta taxa de congelação de produtos biológicos derivados de sangue é uma garantia de preservação dos componentes, a homogeneidade do meio após a descongelação, e a falta de efeito da concentração de sais e proteínas em solução, no coração de massa congelada. A bolsa de acordo com o invento promove o congelamento rápido do meio de cultura devido à sua geometria particular que tem uma elevada relação área/volume superficial e uma espessura pequena.

[0025] De acordo com outra característica da invenção, as paredes do saco são permeáveis aos gases, em particular ao CO2, e de preferência têm propriedades que limitam tanto quanto possível a adesão das células às paredes do saco.

[0026] O bolso é de preferência flexível, isto é, deformável. De preferência, compreende paredes flexíveis permeáveis aos gases e capazes de reter o meio de cultura e a sua expansão celular que é líquida. Na prática, é para reter qualquer líquido contido no bolso. De preferência, tem uma boa permeabilidade ao oxigénio e ao dióxido de carbono, que permite uma boa ventilação do conteúdo da bolsa sem a sua abertura e, portanto, sem risco de contaminação do seu conteúdo. Em uma modalidade particular da invenção, o saco compreende as características de permeabilidade (em 3 cm por dia, sob uma pressão de uma atmosfera, ou seja, 1 bar a 37° C): para o dioxigênio 418 a 508, para dióxido de carbono 699 a 1200, para dinitrogênio 157 a 200 e para água 0,05 a 0,1.

[0027] A bolsa é, por exemplo, formada por uma película fina que pode ser feita de copolímero como o polímero fluorado e em especial o fluoro-etileno-propileno pode ter uma espessura de, por exemplo, o 120μm ordem. Em uma modalidade preferida, a bolsa tem uma forma substancialmente paralelepipedal de pequena espessura atuma largura de 230 a 250 mm no mimo plano e um comprimento de 230 a 250 mm no plano.

[0028] A utilização de um material pertencente à família dos fluoropolímeros tem a vantagem de ser permeável aos gases e também de ter uma baixa adesão em relação aos líquidos.

[0029] O invólucro tem, de preferência, uma forma correspondente substancialmente à de um paralelepípedo retangular e pode compreender uma meia concha inferior e uma metade da concha superior solidária entre si, sendo a meia concha inferior rígida e a meia concha superior sendo rígida ou flexível.

[0030] Assim, a caixa pode ter uma forma também substancialmente plana tendo uma espessura muito pequena em comparação com o seu comprimento e largura.

[0031] A caixa pode ser feita de qualquer material termoplástico elastomérico, como SEBS, que designa Estireno-Etileno- Butadieno-Estireno. A meia concha inferior pode ser rígida para assegurar a retenção ideal da bolsa flexível, enquanto a metade da concha superior pode ser parcialmente rígida e ter uma ou mais zonas flexíveis feitas de um material elastomérico, de modo a facilitar a pega e uma certa deformabilidade. Para facilitar a montagem do cassete nos meios de suporte e agitação que serão apresentados abaixo. Evidentemente, a meia concha superior também pode ser completamente rígida como a meia concha inferior.

[0032] As duas metades inferiores e superiores podem ser montadas cortando, colando ou soldando suas bordas periféricas. As meias-conchas podem ter a mesma espessura ou diferentes espessuras.

[0033] Em uma modalidade preferida da invenção, a metade da concha superior pode compreender uma abertura ou recesso central cuja forma e tamanho são determinados para permitir a propagação de uma ondulação do líquido da bolsa na abertura quando o cassete contém um líquido é oscilado em torno de um eixo horizontal, sendo a abertura disposta para cima. A formação de uma corrugação é desejável para conseguir uma rápida homogeneização do líquido da bolsa. A formação de um recesso, que ainda pode ser descrito como corte ou entalhe, evita ter que aumentar a espessura do alojamento. Este recesso também garante uma melhor difusão dos gases em contato com a bolsa. Pode ter uma dimensão de cerca de 210 mm de largura e de um modo preferido, a metade da concha inferior compreende uma pluralidade de orifícios, de preferência com um diâmetro, por exemplo, inferior a 20 mm. A integração dos orifícios torna possível facilitar a transferência de gás de maneira similar à abertura da metade da concha superior, mas também assegura que a bolsa seja mantida na meia concha inferior.

[0034] Em uma modalidade prática da invenção, a metade da concha inferior pode compreender cerca de 50 e 400 orifícios, tendo cada um deles um diâmetro entre 5 e 20 mm, por exemplo, da ordem de 10 mm. Os orifícios podem ser distribuídos de acordo com uma malha tendo um padrão básico que é o de um triângulo equilátero de comprimento unitário entre 5 e 40 mm e, por exemplo, 20 mm.

[0035] Em uma modalidade do cassete de acordo com a invenção, as condutas prolongam-se através de uma das bordas periféricas de uma das meias conchas inferiores ou superiores. Os condutos podem ser alojados em entalhes de uma das bordas periféricas das meias conchas inferiores ou superiores.

[0036] O cassete compreende, de preferência, uma barra de suporte de conduta, disposta no exterior do invólucro e atravessada por, pelo menos, algumas das condutas. Essa barra permite que os dutos de suporte se estendam para fora do revestimento do cassete, o que limita os movimentos inadvertidos das extremidades livres dos dutos. Além disso, o suporte destina-se a formar um elemento de passagem vedado da porta de uma incubadora, como aparecerá melhor na descrição seguinte.

[0037] O cassete compreende, de um modo preferido, um meio de cultura de células armazenado no saco, estando o meio de cultura de células num estado congelado.

[0038] O meio de cultura de células pode ser um meio de cultura de células cuja composição é adaptada à multiplicação de células de mamífero, em particular de células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas. O meio de cultura pode compreender, ou não compreender, células em cultura.

[0039] Estas células, em particular aquelas células humanas, excluindo células tronco embrionias humanas, podem ser vantajosamente, ou incluir, células CD34+(humanas), em particular células hematopoiéticas CD34+(humanas) ou células CD34+n hematopoiéticas ( humano). Estas células CD34+(humanas) podem ser, por exemplo, células do sangue periférico (humano) ou do cordão umbilical (humano) ou de tecido humano, em particular sangue periférico (humano).

[0040] Estas células, em particular as células humanas, excluindo as células tronco embrionárias humanas, podem ser vantajosamente ou compreender, células tronco ou progenitoras, especialmente células multipotentes ou pluripotentes.

[0041] Essas células não são, ou não compreendem, células embrionárias humanas.

[0042] Este meio de cultura de células pode em particular compreender componentes que permitem a multiplicação destas células, mais particularmente que permitem a sua multiplicação mantendo-as num estado indiferenciado, ou pelo menos enquanto não as fazem atingir um estado de diferenciação terminal.

[0043] Este meio de cultura de células pode compreender insulina, transferrina e plasma ou soro (humano).

[0044] Este meio de cultura de células pode compreender células alimentadoras, tais como fibroblastos, ou ser desprovido destas.

[0045] O meio de cultura celular pode ser, por exemplo, ou compreender, Iscove da Dulbecco modificado (Meio de Dulbecco Modificado de Iscove ou meio IMDM; ver, por exemplo, por Iscove, NN e Melchers, F. (1978) J. Exper Med., 147: 923), opcionalmente suplementado com glutamina ou péptidos contendo glutamina.

[0046] Mais particularmente, o meio de cultura celular pode ser ou compreender o meio IMDM, opcionalmente suplementado com glutamina ou péptidos contendo glutamina, sendo o referido meio desprovido de fibroblastos e compreendendo insulina (recombinante) humana, transferrina (humano) e plasma ou soro (humano).

[0047] Por exemplo, o meio de cultura pode compreender: - de 1 a 50 μg/ml, em especial de 8 a 12 μg/ml de insulina, -entre 100 e 2000 μg/ml, em especial de 300 a 500 μg/ml, de transferrina, e - de 1 a 30%, em particular de 4 a 12%, de soro ou plasma (humano).

[0048] O meio de cultura pode ainda compreender heparina, por exemplo, de 1,5 a 3,5 μl/ml de heparina.

[0049] O meio de cultura pode ainda compreender eritropoietina, incluindo eritropoietina (recombinante) humana.

[0050] O meio de cultura pode ainda compreender um ou mais fatores de crescimento, incluindo um ou mais fatores de crescimento selecionados de entre hidrocortisona, SCF (fator de células estaminais), interleucina 3 (IL-3), trombopoietina (TOP ), FLT3 (fms tirosina- quinase 3), BMP-4 (proteína morfogenética do osso 4), o fator VEGF-a 165 {crescimento endotelial vascular a 165), e IL-6.

[0051] O meio de cultura pode compreender - hidrocortisona ou - o SCF, ou - CFS e IL-3, ou - hidrocortisona e SCF, ou - hidrocortisona, SCF e IL-3, ou - SCF, TOP, FLT3, BMP4, VEGF-A165, IL-3 e IL-6.

[0052] O meio de cultura pode ser especialmente um meio de cultura como descrito em WO 201 1/101468 (ou em uma das aplicações de patentes dos EUA que são derivadas ou baseadas nesta aplicação internacional de PCT, como, em particular, a aplicação US 2013/0078721 A1, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência).

[0053] O cassete pode compreender o meio de cultura e/ou células como descrito acima.

[0054] De acordo com uma modalidade, o cassete compreende o meio de cultura na bolsa, mais particularmente na forma congelada, mas não inclui células.

[0055] De acordo com outra concretização, o cassete compreende o meio de cultura no saco, mais particularmente na forma não congelada, e além disso compreende células, em particular células em cultura, em particular células CD34+(humanas) tais como descrito acima.

[0056] A invenção também se refere a uma incubadora de cultura de células, compreendendo uma câmara termostatizada e um dispositivo para suportar e agitar um cassete de cultura de células conforme definido acima e meios para posicionar e bloquear o cassete de cultura de células em uma dada posição no dispositivo de suporte.

[0057] Em uma modalidade, o dispositivo de suporte e agitação compreende uma bandeja de suporte do cassete de cultura celular que está montada rotativamente em torno de um eixo horizontal em torno do qual a bandeja se destina a oscilar para agitar e homogeneizar o conteúdo do bolso.

[0058] O suporte e o dispositivo de agitação podem compreender uma biela cuja extremidade superior é conectada através de um oscilador à bandeja e cuja extremidade inferior é conectada a uma manivela acionada em rotação pelo eixo de um motor. cujo eixo é substancialmente horizontal.

[0059] A incubadora pode incluir meios para monitorizar a posição do cassete de cultura de células nos meios de suporte, para verificar que o cassete está adequadamente posicionada nos meios de suporte e que pode ser utilizada.

[0060] A bandeja pode transportar o atuador eletromecânicos para abrir/fechar as válvulas, uma saída transporta segundos meios de acoplamento para cooperar com os primeiros meios de acoplamento das válvulas do cassete quando o cassete está na referida posição dada.

[0061] De acordo com outra característica da invenção, a incubadora compreende uma porta para vedar uma abertura do invólucro, compreendendo esta abertura uma orla periférica na qual formada uma reentrância cuja forma adaptada para receber a barra de suporte de dutos, a barra formando um membro de vedação entre a porta e a borda periférica quando a porta está na posição fechada do invólucro.

[0062] A integração de uma barra de suporte de duto permite realizar de maneira simples e rápida a operação de posicionamento dos dutos ao nível da passagem da porta. De fato, ao contrário da técnica conhecida de integrar ranhuras de duto diretamente na borda periférica, e arranjá-las uma a uma em ranhuras, a invenção propõe montar todos os dutos em uma única etapa. Além disso, a vedação é feita na barra e não mais nos dutos, o que simplifica a implementação da vedação porque a barra pode ter uma estrutura rígida na qual a porta pode ficar em repouso.

[0063] A invenção também se refere a um autômato de cultura de células compreendendo pelo menos uma incubadora do tipo descrito acima, e um sistema de computador de controle incluindo meios de aquisição e registro de dados e destinados a regular as condições de cultura em um invólucro. Referida pelo menos uma incubadora e para controlar as válvulas do cassete alojado no invólucro.

[0064] A invenção também se refere a um método de cultura celular usando um autômato descrito acima, o método compreendendo as etapas de: a) colocar um cassete de cultura de células, como descrito acima, dentro do recinto da incubadora em uma posição de descongelação no dispositivo de suporte e agitação; b) alimentar o saco nas células a serem cultivadas; c) colocar o cassete no suporte e dispositivo de agitação em uma posição de cultura celular; d) agitar o cassete de cultura de células durante um determinado período de tempo para homogeneizar o seu conteúdo; e) manter o cassete de cultura de células sob condições de incubação durante um período de vários dias; e f) recuperar o conteúdo do cassete por meio de uma das tubulações do cassete.

[0065] O método compreende ainda: - durante o passo d), um ou mais passos de amostragem do conteúdo do saco, cada um dos quais é precedido por um passo de inclinação da bandeja de suporte de uma posição de colheita horizontal para uma posição inclinada em que a área de amostragem de bolso é o ponto mais baixo da bolsa.

[0066] A invenção será melhor compreendida e outros detalhes, vantagens e características da invenção aparecerão na leitura da seguinte descrição dada a título de exemplo não limitativo, com referência aos desenhos anexos nos quais: - A Figura 1 é uma vista esquemática em perspectiva do dispositivo de cultura de células de acordo com a invenção, compreendendo este dispositivo uma incubadora que define uma câmara termostatizada que está aberta; - A Figura 2 é uma vista esquemática em perspectiva e isolada da incubadora; - As Figuras 3A e 3B são vistas laterais esquemáticas dos meios de suporte e agitação e do cassete; - A Figura 4 é uma vista em perspectiva esquemática dos meios de suporte e agitação e do cassete; - A Figura 5 é uma vista superior esquemática do cassete que repousa sobre os meios de suporte e agitação; - As Figuras 6A a 6C representam posições diferentes de uso do cassete no compartimento termostado do dispositivo; - A Figura 7 é uma vista em perspectiva esquemática do cassete de acordo com a invenção, na direção da metade da concha superior; - A Figura 8 é uma vista esquemática em perspectiva do cassete de acordo com a invenção, na direção da metade da concha inferior; - A Figura 9 é uma vista diagramática em uma escala maior da zona delimitada em linha tracejada na Figura 8; - A Figura 10 é uma vista em perspectiva esquemática do cassete da Figura 7, sendo a metade da concha superior removida; - A Figura 11 é uma vista esquemática em perspectiva e isolada da meia concha inferior, - A Figura 12 é uma vista esquemática em perspectiva em uma escala maior da área delimitada ponteada na Figura 11; - As Figuras 13 e 14 são vistas em perspectiva esquemáticas da metade da concha superior; - A Figura 15A é uma vista esquemática em perspectiva de uma placa para receber as válvulas de abertura/fechamento das condutas do cassete; - As Figuras 15B e 15C são vistas esquemáticas em perspectiva e em uma escala maior de apenas uma porção da placa da Figura 15A; - As Figuras 16A, 16B e 16C mostram uma primeira variante de uma válvula que pode ser usada com a placa da Figura 15A; - As Figuras 17A e 17B mostram uma segunda variante de uma válvula que pode ser usada com a placa da Figura 15A; - A Figura 18 é uma vista esquemática em perspectiva de meios para rodar a válvula das Figuras 16A, 16B e 16C; - As Figuras 19A e 19B são vistas em perspectiva esquemática de um membro de atuação da válvula das Figuras 17A e 17B; - A Figura 20 é uma vista esquemática em perspectiva de um sistema de cultura de células formado por uma pluralidade de incubadoras e uma centrífuga. - A Figura 21 é um fluxograma mostrando as etapas de um método de cultura de células de acordo com a invenção.

[0067] É feita referência às Figuras 1 e 2, que representam uma modalidade exemplificativa do dispositivo de cultura celular 10 de acordo com a invenção, sendo este dispositivo 10, por exemplo, destinado à cultura de células tronco, com a exceção de células tronco embrionárias humanas.

[0068] Como mostrado, o controlador 10 compreende essencialmente três elementos: - uma incubadora 12 controlada termostaticamente compreendendo um dispositivo 14 de suporte e agitação de um cassete de cultura de células 16 de acordo com a invenção (FIGS. 1 e 3); - uma armação 18 para suportar a incubadora 12 e uma centrífuga 20, e - um sistema informático ligado à incubadora 12 e à centrífuga 20 para controlar válvulas e bombas e transportadas pela estrutura 18.

[0069] Tipicamente, o sistema informático compreende meios de aquisição e gravação de dados, meios de processamento de dados, meios de visualização e meios para transmitir sinais de controle e acionamento da incubadora e que válvulas do cassete 16 e bombas. De preferência, o sistema informático compreende uma tela tátil 22 e a entrada de dados por um operador ou utilizador.

[0070] O controle e rastreabilidade dos passos do protocolo biológico pode ser assegurado pelo sistema informático e por uma interface homem-máquina (IHM) adequada, que permita em particular: - para garantir a rastreabilidade completa do processo de fabricação de cada transplante de células tronco, etapas de intervenção do operador no autômato, parâmetros de cultura como temperatura, nível de CO2 e o tempo gasto para cada etapa e ações de validação necessárias para determinadas etapas do processo, - para garantir a rastreabilidade dos consumíveis e reagentes usados no processo, por meio de uma interface de entrada, meios para ler e armazenar dados de códigos de barras e rótulos RFID e uma verificação de consistência das informações coletadas em relação a um banco de dados interno. Esta rastreabilidade pode ser aplicada a toda a cadeia de produção, armazenamento e transporte de consumíveis e reagentes, - para sistematicamente indicar ao usuário os detalhes das etapas do protocolo através de animações e imagens que ilustram o progresso das etapas do processo, - para registrar com segurança os dados de identificação do paciente, dados biológicos relacionados à caracterização de enxertos de células tronco, - para controlar cada uma das funções de controle do atuador, - para gravar e interpretar os dados dos vários sensores presentes no autômato ou no cassete de fluidos.

[0071] Como representado na Figura 2, a incubadora 12 compreende duas portas, uma primeira porta interna 22 destinada a ser aplicada a uma primeira superfície de contato 24 envolvendo a abertura 26 do invólucro 28 da incubadora 12 e uma segunda a porta externa 30 destina-se a ser aplicada a uma segunda superfície de contato 31 envolvendo a primeira superfície de contato 24. As primeiras 22 e segundas 30 portas são, por exemplo, cada uma articulada em torno do mesmo eixo vertical. O invólucro 28 abriga meios de ventilação 33 que estão dispostos na parte superior do invólucro 28 (Figs. 1, 6A, 6B e 6C). Estes meios de ventilação 33 são dimensionados e configurados para permitir uma distribuição uniforme da temperatura e dos gases no invólucro da incubadora necessária para cultura celular eficiente e com temperatura adequada (Figuras 1, 6A, 6B e 6C). Durante o descongelamento do meio de cultura que está contido na bolsa, o calor na câmara é assim uniformemente distribuído para permitir o rápido descongelamento do meio de cultura celular.

[0072] A porta interna 22 pode ser feita de vidro transparente de modo a permitir a observação do conteúdo do invólucro 28 da incubadora 12 enquanto mantém a incubadora 12 na posição fechada. A abertura 26 do invólucro 28 compreende um bordo periférico 24, correspondente à primeira superfície de contato, a extremidade 24a inferior tem um recesso 32 para receber uma barra 34 para prender os tubos ou condutas 36, 38 do cassete 16, a qual irá ser descrita em detalhe mais tarde, em particular com referência às Figuras 7 e 8. A barra 34, que é visível nas Figuras 4, 5, 7 e 8, forma um invólucro rígido que pode ter uma forma substancialmente paralelepipédica. Também pode compreender dois flancos opostos 40 ligados um ao outro pelas faces inferior e superior 42. As condutas ou tubagens 36, 38 prolongam-se de forma estanque através dos orifícios da barra 34. Estes orifícios são formados nas paredes 44 substancialmente perpendiculares aos flancos 40 e às paredes inferior e superior 42. Cada lado 40 da barra 34 compreende uma ranhura 46 paralela às faces inferior e superior 42. As ranhuras 46 das paredes laterais 40 estão dispostas assimetricamente em relação ao outro em relação a um plano médio da barra 34 e em paralelo aos dois flancos 40. Estas ranhuras 46 são para receber nervuras (não visível) recesso dos flancos 32 da parte inferior do bordo circunferencial 24a da incubadora 12 de modo a garantir um posicionamento da faixa 34 no recesso 32. O posicionamento assimétrico das ranhuras 46 permite uma montagem à prova de falhas da barra 34 no recesso 32 da incubadora 12. Assim, mais geralmente, a barra pode incluir meios de chaveamento para a montagem em um recesso de uma borda periférica uma abertura da incubadora. A abertura pode, em seguida, ser fechada por um elemento móvel, tal como uma porta ou uma portinhola, que é móvel entre uma posição aberta da incubadora e uma posição de fecho da abertura da incubadora. A barra rígida ou carcaça 34 de um modo preferido de uma forma complementar ao recesso 32. Esta forma complementar pode ser tal que quando a barra 34 está em posição no recesso 32, a sua face inferior 42 entra em contato com a face inferior do recesso 32 e a face superior 42 é nivelada com o resto do bordo periférico 24 da abertura 26 do invólucro 28 de abertura da incubadora e uma posição de fecho da abertura da incubadora. A barra rígida ou carcaça 34 de um modo preferido de uma forma complementar ao recesso 32. Esta forma complementar pode ser tal que quando a barra 34 está em posição no recesso 32, a sua face inferior 42 entra em contato com a face inferior do recesso 32 e a face superior 42 é nivelada com o resto do bordo periférico 24 da abertura 26 do invólucro 28 de abertura da incubadora e uma posição de fecho da abertura da incubadora. A barra rígida ou carcaça 34 de um modo preferido de uma forma complementar ao recesso 32. Esta forma complementar pode ser tal que quando a barra 34 está em posição no recesso 32, a sua face inferior 42 entra em contato com a face inferior do recesso 32 e a face superior 42 é nivelada com o resto do bordo periférico 24 da abertura 26 do invólucro 28 de a incubadora 12 para formar uma superfície substancialmente plana na qual a primeira porta 22 pode vir a suportar a vedação. Desta maneira, a vedação da porta interna 22 na borda periférica 24 da abertura 26 do invólucro 28 da incubadora 12 pode ser realizada de uma maneira simples. Adicionalmente, a passagem dos tubos 36, 38 ou condutas através da primeira porta 22 pode ser conseguida de uma maneira simples sem a necessidade de manipular as condutas 36, 38 uma por uma. Finalmente, quando a primeira porta 22 é aplicada à barra 34, a força de fechamento é exercida na estrutura rígida da barra 34 e não nos tubos 36, 38, o que impede o esmagamento dos tubos 36, 38. e permite garantir sua seção de passagem de fluido.

[0073] Como pode ser visto na Figura 2, a frente do invólucro da incubadora 12 compreende outro recesso 48 que se abre para o recesso 32 do bordo periférico 24 da abertura 26 do invólucro 28. Este recesso 48 destina-se a permitindo a passagem das condutas 36, 38 ou tubagens para além da reentrância 32 da primeira porta 22 e da segunda porta 30 para a centrífuga. Na prática, este segundo recesso 48 pode ser fechado por uma portinhola (não mostrada), por exemplo, deslizamento.

[0074] Como representado na Figura 3A, a câmara 28 termostatizada compreende um dispositivo 14 de suporte e agitação de um cassete de cultura de células 16 de acordo com a invenção. Este dispositivo pode ser dividido em um dispositivo de suporte 50 e um dispositivo de agitação 52 conectado um ao outro. O dispositivo de suporte 50 compreende uma bandeja de suporte 54 ou berço de suporte do cassete 16 e uma base 60. A bandeja 54 tem uma primeira extremidade 56 disposta no fundo da câmara termostatizada 28 e uma segunda extremidade 58 oposta à primeira extremidade que está ligada de forma rotativa em torno de um eixo horizontal 63 para a base 60 que se estende substancialmente na vertical e que é suportada pela parede 62 que forma o chão da câmara de controle termostático 28 (Figuras 3A e 4). Mais precisamente e como mostrado na Figura 3B, a primeira extremidade 56 da placa 54 é suportada e rotativamente articulada em torno do eixo 63 em dois braços 65 que se estendem verticalmente a partir do piso 62 do invólucro 28 e formado por nos dois lados da bandeja 54.

[0075] O dispositivo de agitação 52 compreende um sistema do tipo vareta/manivela compreendendo uma biela 64, cuja extremidade superior está conectada a uma extremidade inferior de um oscilador ou haste vertical oscilante 66 que suporta na sua extremidade superior oposta a bandeja 54 pelo seu lado inferior. A extremidade inferior da biela (64) está ligada a uma manivela (68) acionada em rotação por um veio de um motor cujo eixo de rotação é substancialmente horizontal. Este eixo 70 é perpendicular ao eixo 63. A extremidade superior 66 do oscilador está ligada à bandeja de modo a permitir o deslocamento do oscilador num plano perpendicular ao eixo de rotação 70. Além disso, a extremidade superior do oscilador 66 é conectada de forma móvel à bandeja de suporte 54 na direção do eixo 70, esta conexão pode ser feita deslizando um dedo da extremidade superior do oscilador 66 em uma ranhura 71 ou ranhura na bandeja 54.

[0076] Como mostrado nas Figuras 3, 4 e 5, o oscilador 64 passa através da parede do pavimento 62 do invólucro 28 da incubadora 12. De preferência, os meios de vedação, tais como um fole, são fornecidos em torno de do oscilador 66, na zona de cruzamento da parede do pavimento 62 de modo a evitar transferências de calor e humidade no exterior da câmara 28 termostáticas que podem danificar os elementos mecânicos do dispositivo de agitação 52.

[0077] As Figuras 6A, 6B e 6C mostram três posições tomadas pela bandeja 54 durante o seu movimento pelos meios de agitação. Na Figura 6A está representada a posição alta da placa 54 e a Figura 6B representando a posição baixa da placa 54. Em qualquer uma destas duas posições, a placa está inclinada em relação a um plano horizontal. A Figura 6C mostra uma posição mediana na qual a placa 54 é substancialmente horizontal. Em funcionamento, a bandeja de suporte 54 do cassete pode assim realizar uma angulação entre as suas posições extremas (Figuras 6A e 6C) em torno do eixo 63 (Figura 4).

[0078] Como representado na Figura 2, a bandeja 54 para suportar o cassete 16 é formado por uma estrutura 72 tendo uma abertura 74 ou parte oca e uma parte sólida 76. A parte oca 74, disposta na vizinhança da primeira extremidade 56 da bandeja 54, pretende vir em frente à metade da concha inferior do cassete que será descrita abaixo. A porção sólida 76 está disposta na vizinhança da segunda extremidade 58 da placa 54. Esta parte sólida 76 compreende meios para posicionar e bloquear o cassete de cultura de células em uma dada posição na placa 54 correspondendo a uma posição na qual a O cassete 16 assenta na estrutura 72 e permite realizar uma fase de incubação. Os meios de posicionamento compreendem dois pinos 78 que se projetam para cima para cooperar com dois orifícios cegos do cassete 16 (descritos abaixo). Os meios de bloqueio do cassete 16 compreendem um gancho de aparar 80 ou encaixe com um gancho do cassete que será descrito abaixo de modo a bloquear o cassete 16 na placa 54. O gancho 80 da parte sólida 46 da armação 72 da placa 54 está disposta entre os dois pinos 78.

[0079] Como pode ser visto na Figura 2, a bandeja compreende três atuadores eletromecânicos 82 para válvulas de abertura/fecho, cada atuador 82 compreendendo uma saída compreendendo os segundos meios de acoplamento destinados a cooperar com os primeiros meios de ligação das válvulas de válvula. O cassete quando o cassete 16 repousa sobre a estrutura 72 da bandeja 54.

[0080] A estrutura 72 é encimada por uma estrutura 84 para suportar o cassete 16 afastado da estrutura 72. Esta estrutura de suporte 84 torna possível suportar a caixa 16 em uma segunda posição correspondente a uma fase de descongelação. Esta estrutura de suporte 84 compreende duas aletas laterais 86 ligadas uma à outra por uma parede plana 88 e juntas formam um plano de suporte comum da caixa 16 na segunda posição. Note-se que os planos de suporte do cassete 16 na primeira posição e na segunda posição estão inclinados em relação um ao outro. A segunda posição permite suportar o cassete 16, hermeticamente fechada sob vácuo num envelope, afastada da estrutura 72, para evitar qualquer rasgamento do envelope, geralmente feito de material plástico, pelos pinos 78 durante a fase de descongelamento.

[0081] É agora feita referência às Figuras 7 e 8 que mostram um cassete de cultura de células 16 de acordo com a invenção compreendendo um alojamento 90 tendo uma forma substancialmente correspondente à de um paralelepípedo retangular compreendendo uma primeira extremidade 92 e uma segunda extremidade 94 com referência à posicionar o cassete 16 na bandeja 54. A caixa 90 compreende uma meia concha inferior 96 (Figuras 9 a 12) e uma meia concha superior 98 (Figuras 13 e 14) solidárias uma com a outra, a metade o invólucro inferior 96 é rígido e o invólucro superior 98 é rígido ou parcialmente rígido, isto é, compreende partes flexíveis. As duas metades inferiores 96 e 98 definem em conjunto um alojamento no qual está fixado um saco flexível 100 de cultura celular que define um volume interior a ser preenchido com um meio de cultura de células.

[0082] As meias conchas inferiores 96 e 98 estão ligadas umas às outras por quatro flanges periféricas 102a, 102b. As duas metades inferiores 96 e 98 podem ser montadas cortando, colando ou soldando as suas bordas periféricas 102a, 102b. Em uma modalidade preferida, ambas as meia conchas inferiores 96 e superiores 98 são ambas rígidas.

[0083] A metade da concha inferior 96 compreende uma pluralidade de orifícios 104, de preferência com um diâmetro inferior a 20 mm. O cassete 16 tem por exemplo dimensões de 405 mm de comprimento, 305 mm de largura e uma espessura de 25 mm. Também compreende dois furos cegos 106 espaçados um do outro e flanqueando uma abertura de passagem 107 ou abertura. Os furos cegos 106 são formados por um recesso 109 da metade da concha inferior 96, estendendo-se para a meia concha superior 98 (Figuras 11 e 12). A meia concha superior 98 compreende uma abertura ou recesso 108 cuja forma e tamanho são determinados para permitir a propagação de uma ondulação do líquido do saco 100 na abertura quando o cassete que contém um líquido sofre oscilação em torno de o eixo horizontal 63, a abertura 108 ou abertura (ou corte) estando disposta para cima (FIGS. 7, 13, 14). Como mencionado acima, a formação de um recesso 108 torna possível formar uma corrugação da superfície da bolsa 100 localizada no interior da caixa quando o cassete 16 é montada na segunda posição na bandeja 54 e que é movido para oscilação como descrito com referência às Figuras 6A, 6B e 6C. A meia concha superior 98 compreende uma lingueta elétrica 1 10 que suporta um gancho de recorte 112 com o gancho 80 da estrutura 72 da bandeja 54, como já foi mencionado acima. O gancho 112 da meia concha superior 98 é assim configurado para passar através da abertura 107 da meia concha inferior 96. Por fim, a meia concha superior 98 também compreende um orifício de inserção circular 114 de uma tampa de acionamento manual 16 de uma válvula cuja utilização aparecerá mais claramente com referência às Figuras 17 e 18.

[0084] Note-se que 102a rebordo periférico da metade da concha inferior 96, localizada na primeira extremidade 92 do compartimento 90 inclui uma nervura linear 1 16 que se destina a cooperar com um entalhe 18 da 84 da estrutura da bandejade suporte 54 quando o cassete de cultura de células 16 é montada na sua primeira posição na placa 54 na câmara 28 da incubadora 12 (FIGS. 8, 9, 11, 12). Nesta primeira posição, o gancho de recorte 112 da meia concha superior 98 passa através da abertura 107 da meia concha inferior 96 e coopera com o gancho 80 da armação 72 da placa 54 para bloquear a caixa 16 nesta primeira posição (Figuras 3, 4 e 5). Para libertar o cassete 16 e removê-la da câmara de incubação 28, basta pressionar o gancho 110, isto leva a desengatar o gancho 110 da meia concha superior 98 do gancho 80 da placa 54.

[0085] Uma almofada 120 é encaixada à meia concha superior e é capaz de manter os tubos 36, 38 do cassete na posição dobrada na face externa da meia concha superior 98.

[0086] A Figura 10 mostra o interior do alojamento 90, a meia concha superior 98 não está a ser mostrada. Como pode ser visto, o saco de cultura de células 100 tem uma forma substancialmente paralelepipédica compreendendo uma primeira parede 122 e uma segunda parede (não visível) substancialmente paralelas umas às outras no estado vazio e no estado preenchido de líquido. A primeira parede 122 e a segunda parede estão ligadas e presas uma à outra pelos seus bordos periféricos 123, por qualquer meio, por exemplo, por soldadura ou colagem. Em uma modalidade particular da invenção, a relação entre a superfície de uma das primeiras paredes 122 ou segunda parede e o volume interno da bolsa é entre 540 e 600 cm2/L, e é preferencialmente de 580 cm2/L. A distância que separa a primeira parede 122 da segunda parede é inferior a 20 mm, de preferência entre 10 e 20 mm e ainda mais preferencialmente da ordem de 14 mm.

[0087] O saco 100 de cultura de células está fixado na metade da concha inferior 96 por meio do pino 124 que se projeta na face interna da metade da concha inferior 96. Estes pinos 124 passam através dos orifícios dos bordos periféricos 123 do saco 100 de cultura celular. O volume interno do saco 100 está em comunicação com o exterior através de uma pluralidade de condutas. Em particular, o cassete 16 pode compreender quatro condutas 36, 38 ou tubos flexíveis, três dos quais 36 são integrais com a barra 34 descrita acima e um quarto 38 é independente.

[0088] Mais particularmente, o cassete 16 compreende uma primeira 36a e um segundo tubo 36b denominada amostragem e um dreno de cano 36c. O tubo 38 corresponde a um tubo de injeção das células de interesse. Como pode ser visto nas Figuras 5, 7, 8, 9 e 10, o cassete também compreende um tubo 39 para enchimento inicial do saco 100 em meio de cultura. Em uma modalidade preferida do cassete 16 de acordo com a invenção, a quatro tubos 36a, 36b, 36c, 38 estão equipados com conectores que podem ser conectores de assepsia e/ou remoção sem uma agulha, estes conectores podem ainda compreender meios anti-retorno. No resto da descrição, quando o número de referência 36 é usado sozinho, ele designará indiferentemente pelo menos um dos tubos 36a, 36b ou 36c.

[0089] Como mostrado na Figura 10, os tubos 36, 38 prolongam-se através dos entalhes 126 do mesmo aro periférico 102a da metade da concha inferior 96, nomeadamente o aro periférico 102a formado na segunda extremidade 94 do O tubo de enchimento 39 estende-se num dos lados adjacentes ao lado através do qual os tubos 36, 38 passam e estão ligados na sua extremidade dispostos no interior do invólucro 90 em uma porção do tubo 36 disposta de modo fluido entre uma válvula 128 e o saco 100.

[0090] Cada um dos tubos 36, 38 atravessa as válvulas 128, 130a, 130b, 130c abrindo/fechando o fluxo de fluido através das condutas 36, 38, estando estas válvulas de aperto 128, 130 dispostas no invólucro 90. Por exemplo mostrado, os três coletores 36 por meio de um primeiro tipo de válvula 130, tubo 36a através de um tubo 36b através da válvula 130a 130b tubagem da válvula e através da válvula 36c 130c, enquanto que o quarto tubo 38 passa através de um segundo tipo válvula 128 (Figuras 10 e 15A). Mais especificamente, o alojamento 90 compreende uma placa 132 (FIGS. 15A, 15B e 15C) compreendendo uma pluralidade de caixa substancialmente cilíndrica 134, cada uma recebendo um membro móvel 136, 138 para agarrar um tubo 36, 38 (Figuras 16 e 17). Esta placa forma assim o corpo ou parte de estator das válvulas 128, 130. Cada alojamento 134 da placa 132 compreende uma parede de fundo anular 140 que delimita um orifício central 142 alinhado com um orifício 144 da meia concha inferior 96 quando a placa 132 está montada no alojamento 90 (Figuras 10 e 12).

[0091] Cada membro móvel 136, 138 compreende uma extremidade inferior 136a, 138a e uma extremidade superior 136b, 138b com referência às meia conchas inferiores 96 e superiores 98 e com referência à disposição da caixa em relação à vertical. Evidentemente, seria possível designar mais geralmente a extremidade inferior como sendo uma primeira extremidade e a extremidade superior como sendo uma segunda extremidade oposta à primeira extremidade. Assim, a extremidade superior 136b, 138b de cada elemento móvel 136, 138 inclui um ombro anelar 146b destinada a entrar em contato ao longo do eixo de rotação 136c, 138°C na circunferência de um furo 142 de um alojamento 134 da platina 132 e envolvente de uma parede cilíndrica 148b para inserção no orifício 142 da caixa. Neste caso, a superfície 146b do membro 136 é suportada na superfície inferior 140 de um alojamento 134 de uma válvula 130a, 130b, 130c. É assim possível realizar uma orientação de rotação e de centragem da segunda extremidades 136b, 136a dos membros móveis 136, 138 no alojamento 134 da placa 132. A extremidade inferior 136a, 138a de cada elemento móvel 136, 138 inclui um ombro anular 146a destinado a encostar no eixo de rotação 136c, 138c na periferia de um orifício 144 da meia concha inferior 96 e de uma parede cilíndrica 148a destinada a ser inserida no orifício 144 da metade No presente caso, a superfície 146b do membro 138 está apoiada na superfície inferior 140 de um alojamento 134 da válvula 128. Desta forma, assegura-se uma guia de rotação e uma centragem de cada um dos elementos móveis 136, 138 na meia-tampa inferior 96 e a placa 142 que é, por sua vez, fixada à meia concha inferior 96 através de orelhas 150 atravessadas por pernos 152 da face interna da meia concha inferior 96 e através da meia concha superior 98 cujos rebordos periféricos 102b são fixos às bordas periféricas 102a da meia concha inferior 96. As extremidades inferiores 136a, 138a dos membros móveis 136, 138 e abertos através da meia-concha inferior 96 e são assim acessíveis a partir da face externa da meia concha inferior 96, como se pode ver na Figura 9.

[0092] Os elementos móveis 136, como mostrado na FIG 16A, 16B, 16C associada com coletores 36, compreendem na sua extremidade inferior 136a do primeiro meio de acoplamento acessíveis a partir do exterior da caixa, de modo a cooperar com segundos meios de acoplamento atuadores 82 dos membros móveis 136, dispostos na incubadora. Os primeiros meios de acoplamento, formada no lado de baixo do membro 136, 151 compreendem aqui uma fenda radial que uma extremidade radialmente interior é atravessado pelo eixo de rotação 136c e uma ranhura semi-circular 153, centrado no eixo rotação 136cLes segundo meios de acoplamento dos atuadores 82 podem, por exemplo, compreender duas barras 155a, 155b, um primeiro 155a está centrada sobre o eixo de rotação do o atuador 82 e um segundo 155b estão radialmente afastados do primeiro 155a. Quando o cassete 16 é montado na estrutura 72 como na Figura 3A, a primeira haste 155a engata a extremidade interior radial da ranhura 151, segundo haste 155b 1a que engata na ranhura semi-circular 153. Entendido que a utilização de uma ranhura semi-circular 153 assegura a cooperação da segunda 153b da haste com a ranhura 153, independentemente da posição angular do elemento móvel 136 antes da montagem do cassete 16 na estrutura 72 a integração de uma ranhura radial 151 nos elementos mel 136 torna possível ativar manualmente o membro mel 136, se necessário.

[0093] No caso da válvula 138 das Figuras 17A e 17B associadas à tubagem 38, os primeiros meios de acoplamento são formados na extremidade superior 138b do elemento móvel 138. Ao contrário dos três membros móveis 136 das válvulas 130, o membro móvel 138 da válvula 128 não é atuado por um atuador eletromecânico, mas manualmente por um membro ou botão rotativo 154 como mostrado nas Figuras 18A e 18B. O acoplamento é feito aqui por um recesso 157 na extremidade superior 138b do membro móvel 138 no qual é engatado uma forma complementar 156 botão de acionamento transversal 154. O botão 154 é preso ameia concha superior 98 por meio de uma pluralidade de ganchos elasticamente deformáveis 158 que vêm para pendurar na periferia interna do orifício circular 1 14 da meia concha superior 98.

[0094] Para apertar os tubos 36, 38, cada membro móvel 136, 138 compreende uma protuberância em espiral 160 em torno do eixo de rotação 136c, 138c do membro móvel 136, 138. A superfície radialmente externa de cada protuberância 160 forma uma superfície de apoio num tubo 36, 38. Cada protuberâncias 160 tem um plano de simetria num plano perpendicular ao eixo de rotação 136c, 138c. Cada tubo 36, 38 está alojada parcialmente em uma ranhura linear 162 de secção semi-circular da metade da concha inferior 96 e por uma outra parte em uma ranhura retilínea 164 de secção semi-circular da placa 132 de modo a atravessar o periferia de um alojamento 134 da placa 132 em uma direção perpendicular ao eixo de rotação 136c, 138c do elemento mel (Figuras 11, 12, 15A, 15B, 15C). Assim, à medida que a rotação de um elemento móvel 136, 138 com uma válvula 128, 130 a saliência 160 proporciona uma abertura gradual ou fechando a secção de tubagem 36, 38 na direção de rotação do membro móvel 136, 138.

[0095] Cada parede anular inferior 140 de um alojamento da placa 132 transporta dois elementos de apoio salientes 166a, 166b no interior do alojamento 134 e os quais estão espaçados angularmente um do outro. Um recorte 167 é formado em cada parede anular inferior 140 de um alojamento 134 de modo a definir uma tira resiliente 168 que tem uma extremidade livre que leva uma saliência que se projeta para dentro do alojamento 134, esta saliência que tem uma porção convexa 171 para cooperar em deslizamento com os elementos móveis 136, 138 (Figuras 15B, 15C). A saliência 170 coopera de maneira deslizante com uma ranhura 172 que tem um círculo em forma de arco e um fundo curvo côncavo de cada um dos elementos móveis 136, 138. Em relação ao elemento móvel 136 das Figuras 16A, 16B e 16C a ranhura 172 é formada numa flange radial anular 174 axialmente disposta entre a saliência 160 e o 146b ombro anular superior e no lado virado para a extremidade superior 136b do elemento móvel 136. Da mesma forma, para os quais relaciona-se com o elemento móvel 138 de Figuras 17A e 17B, a ranhura 172 é formada numa flange radial anular 174 axialmente disposta entre a saliência 160 e o 146b ombro anular superior e no lado virado para a extremidade superior 138b da membro móvel 138.

[0096] Uma cavidade semi-esférica 176a, 176b é formada nas extremidades angulares de cada sulco 170, 172 de modo a formar posições de parada do membro móvel 136, 138 para uma correspondente à posição aberta onde o fluido pode fluir e para o outro correspondente a uma posição fechada onde o fluido não pode fluir. É também notado que cada elemento móvel 136, 138 compreende um dedo radial 178 que se estende lateralmente ao ombro superior 146b e está em contato com a face da flange 174 que suporta a ranhura 172. Assim, na posição de bloqueio do fluxo através dos tubos 36, 38, o membro móvel 136, 138 é posicionado de modo que a protuberância 170 da tira elástica 168 é engatada na cavidade ou alojamento 176a do membro móvel 136, 138, sendo o dedo radial 178 do elemento móvel 136, 138 disposto no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio em rotação, na Figura 15, contra o membro de encosto 166a. Na posição de fluxo dos tubos 36, 38, o membro móvel 136, 138 está posicionado de modo a que a protuberância 170 da lamela elástica 168 esteja engatada na cavidade ou no invólucro 176b do membro móvel 136, 138, estando o dedo radial 178 do elemento móvel 136, 138 disposto em rotação no sentido dos ponteiros do relógio, na Figura 15, contra o elemento de apoio 166b. Entende-se que a cooperação da protuberância 170 com as cavidades 176a, 176b torna possível assegurar um bloqueio elástico de travamento dos membros móveis 136, 138 na posição fechada ou na posição aberta.

[0097] É fácil entender que as válvulas descritas acima poderiam muito bem ser usado em outros dispositivos que requerem membros para abrir/fechar o fluxo de um fluido através de um tubo. Portanto, a presente descrição destina-se também a qualquer dispositivo que incorpore as válvulas descritas, tal como, por exemplo, um dispositivo que compreende uma placa 132 tendo uma pluralidade de alojamentos 134 nos quais os membros rotativos estão engatados.

[0098] Seria possível equipar a cassete 16 e/ou a incubadora com meios para verificar automaticamente o posicionamento correto da cassete 16 em cada uma das suas primeira e segunda posições. Para este fim, um íman pode ser disposto dentro do invólucro 90, na face interna da meia concha inferior 96, este íman cooperando com dois sensores de efeito Hall posicionados na placa adequadamente em relação aos primeiros. e segundas posições a serem detectadas.

[0099] A Figura 20 mostra um sistema de cultura de células 180 compreendendo uma pluralidade de incubadoras 12 como previamente descrito e uma centrífuga 20. As incubadoras 12 e a centrífuga 20 são controladas pelo sistema informático.

[00100] A Figura 21 é um fluxograma que mostra os passos do método de cultura de células de acordo com a invenção.

[00101] Antes do método descrito a seguir, o cassete de cultura de células 16 é cheio com um meio de cultura de células utilizando o tubo lateral 39. Este tubo 39 é depois de enchida imediatamente fechada, por soldadura, por exemplo. A fita 16 da cultura de células é então congelada, isto é, em uma posição horizontal, para armazenamento e uso subsequente.

[00102] Um primeiro passo 182 do método consiste em capturar e registrar, por meio do sistema computacional, parâmetros de cultura específicos para o protocolo biológico. A entrada é realizada por um operador, os parâmetros inseridos são, por exemplo, a identificação do paciente, a identificação do cassete, etc. Para facilitar a introdução destes parâmetros, o sistema informático pode estar equipado com um leitor de códigos de barras, o cassete pode incluir um código de barras informando diretamente o sistema do computador com o número e a natureza do cassete. É então possível entrar pela leitura do código de barras ou pela entrada manual através da tela tátil dos dados de identificação pessoal indicados em uma etiqueta de um recipiente, tal como uma bolsa, células a serem cultivadas.

[00103] Num segundo passo 184, o sistema de computador atribui uma determinada incubadora ao operador após verificação da disponibilidade da incubadora de acordo com um programa de cultura de células. O operador instala o cassete de cultura celular 16 compreendendo um líquido de cultura de células na referida incubadora designada, sendo as outras incubadoras então, de preferência, não acessíveis, isto é, as portas 22, 30 das outras incubadoras 12 sendo trancada.

[00104] Num terceiro passo 186, o método consiste em descongelar o meio de cultura alojado no saco flexível de um cassete de cultura, como descrito acima. Para este fim, o cassete de cultura celular 16, hermeticamente selada sob vácuo num invólucro protetor estéril, é montada na segunda posição no dispositivo 52 para suportar e agitar a incubadora designada pelo sistema informático. Isto é, na estrutura de suporte 84 (Figuras 3A e 3B). O operador fecha as duas portas 22 e 30 e o sistema de computador inicia o procedimento de descongelação, as portas 22, 30 sendo então automaticamente bloqueadas. O suporte e o dispositivo de agitação são acionados para posicionar o cassete 16 em uma posição horizontal.

[00105] Num quarto passo 188, após descongelamento, o cassete de cultura de células 16 removida da incubadora e o envelope exterior removido em uma regi de atividade controlada adequada.

[00106] Num quinto passo 190, células de interesse, excluindo células tronco embrionárias humanas, são injetadas no cassete. Para isto, a válvula manual 128 é posicionada na posição aberta. Recorde-se que os tubos 36, 38 estão equipados com meios de não retorno que impedem o líquido do saco 100 de fluir para fora. As células são injetadas no saco 100 por meio do tubo 38, depois a válvula 128 é posicionada na posição fechada e o tubo 38 é selado com uma tampa estanque.

[00107] Num sexto passo 192, o cassete 16 enche-se com meio de cultura e as células de interesse são montadas na sua primeira posição correspondendo à posição de incubação. A barra 34 estí^montada na abertura 32 da porta 22, as extremidades dos tubos 36 opostas ao saco 100 que se prolonga para a abertura 38 e estando ligadas ao circuito de fluido do sistema mostrado na Figura 20.

[00108] O método de acordo com a invenção compreende então um passo de incubação 194, que pode durar vários dias e, por exemplo, dez dias. Periodicamente, de acordo com os parâmetros do protocolo, o conteúdo do saco 100 pode ser homogeneizado, oscilando a bandeja 54 em torno do eixo 63 como explicado acima. Essa homogeneização (durações, frequência de repetição, amplitude) é determinada pelos parâmetros do protocolo escolhido.

[00109] Durante o passo de incubação, o operador pode levar uma ou mais amostras 196 no saco 100 (FIGS. 14 e 22). Algumas dessas taxas podem ser impostas pelo sistema de computador. As amostras são tomadas por meio dos tubos 36a e 36b.

[00110] Para executar uma primeira amostra, o sistema do computador atua o membro móvel 136 associado à válvula associada 130a de modo a permitir o fluxo de fluido através do tubo 36a. Quando a amostragem é realizada pelo sistema de computador, uma operação final de vedação da tubulação 36a é executada de modo a assegurar a assepsia e evitar qualquer uso subsequente do tubo de amostragem já usado. A segunda amostra é recolhida do mesmo modo, mas por meio do tubo 36b.

[00111] Após cada sub amostra de amostragem 196 de uma amostra no saco 100, o operador pode realizar análises da referida amostra, podendo os resultados destas análises serem introduzidos e registados no sistema informático pelo operador ou automaticamente.

[00112] Num último passo do método 198, o sistema informático procede a uma recuperação ou esvaziamento do conteúdo da bolsa 100 do cassete 16.

[00113] Finalmente, o conteúdo da bolsa é submetido a uma etapa de purificação e embalagem em seringas estéreis para uso posterior.

[00114] O pedido refere-se também a um método para cultura celular, em particular para cultura de células de mamífero, em particular células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas.

[00115] Estas células, em particular aquelas células humanas, excluindo células tronco embrionias humanas, podem ser vantajosamente, ou incluir, células CD34+(humanas), em particular células hematopoiéticas CD34+(humanas) ou células CD34+n hematopoiéticas ( humano). Estas células CD34+(humanas) pode ser, por exemplo, células do sangue periférico (humanos), ou do cordão umbilical (humano) ou tecido humano, particularmente de sangue periférico (humano).

[00116] Estas células, em particular as células humanas, excluindo as células tronco embrionárias humanas, podem ser vantajosamente ou compreender, células tronco ou progenitoras, especialmente células multipotentes ou pluripotentes.

[00117] Essas células não são, ou não entendem, células embrionárias humanas.

[00118] Essas células, em particular as células de origem humana, excluindo as células tronco embrionárias humanas podem, vantajosamente, ser ou compreender células ou progenitoras humanas CD34+(multipotentes ou pluripotentes) tronco mobilizadas de sangue periférico por meio de um fator de crescimento tal como G-CSF (Fator Estimulador de Colônias de Crescimento).

[00119] Estas células, particularmente aquelas células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, podem ser ou foram retiradas de um indivíduo ou paciente humano (recém-nascido, criança, adolescente, adulto ou idoso). A invenção é de facto especialmente adaptada a células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes) que podem ser retiradas do sangue periférico de um sujeito ou paciente humano. Se o paciente vai receber quimioterapia, essas células podem ter sido coletadas antes ou no início desta quimioterapia.

[00120] Uma amostra biológica contendo as células que devem ser cultivadas (por exemplo, uma amostra de sangue (humano), em particular uma amostra de sangue periférico (humano), sangue do cordão umbilical (humano) ou tecido humano, particularmente um amostra de sangue humano periférico) é ou foi retirada de um sujeito ou paciente humano.

[00121] Os meios da aplicação têm a vantagem de não requerer a aplicação de leucaférese: uma simples amostra de sangue, por exemplo, uma amostra de 200 a 250 ml de sangue, em particular 220 ml de sangue, é suficiente para obter um grande número de células, em particular um número de células que é suficiente para um tratamento terapêutico e/ou preventivo, mais particularmente para uma terapia celular autóloga ou alogênica de um indivíduo ou paciente (humano), mais particularmente para uma terapia celular autóloga de sujeito ou paciente (humano).

[00122] Este é particularmente o caso para células CD34+humanas destinadas a tratamento terapêutico e/ou preventivo, mais particularmente para terapia celular autóloga ou alogênica do sujeito ou paciente, mais particularmente para terapia celular autóloga do sujeito ou paciente. As células CD34+humanas podem ser células CD34+humanas não embrionárias, excluindo células tronco embrionárias humanas. As células CD34+humanas não são ou não incluem células CD34+embrionárias.

[00123] Os meios de cultura de células da aplicação permitem obter, a partir de um pequeno volume de sangue (por exemplo, uma amostra de 200 a 250 ml de sangue, em particular de 220 ml de sangue), uma população de pelo menos 107, ou pelo menos 108, as células que compreende pelo menos 70% de células CD34+humanas (células não embrionárias). Em comparação, para obter uma quantidade de células CD34+humanas diretamente (sem cultura celular) a partir do sangue de um indivíduo ou doente, seria necessário tratar um volume de 7 a 10 L de sangue por leucafese.

[00124] As células que se destinam a ser cultivadas, em particular células CD34+humanas (não embrionárias), podem ser purificadas ou isoladas a partir da amostra biológica recolhida, incluindo uma amostra de sangue, em particular uma amostra de sangue periférico (por exemplo, uma amostra de 200 a 250 mL de sangue periférico, em particular 220 mL de sangue periférico).

[00125] As células podem ser purificadas de forma a atingir um nível mínimo em um determinado tipo de célula. Por exemplo, podem ser purificados a pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (não embrionárias), particularmente células hematopoiéticas CD34+humanas (não embrionárias).

[00126] Este isolamento ou purificação pode ser feito utilizando qualquer meio conhecido pelos especialistas na técnica.

[00127] Por exemplo, para células CD34+humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, este isolamento ou purificação pode ser realizado utilizando um anticorpo monodonal anti-CD34 humano, por exemplo anticorpo anti-CD34 monodonal murino humano comercializado sob o nome de clone QBEnd-10 (cigo M7165) por DAKO DENMARK AS (Produktionsvej 42, DK-2600 Glostrup, Dinamarca). Sistemas de isolamento ou purificação de células CD34+(humanas) também estão comercialmente disponíveis, por exemplo, o separador de células magnéticas ISOLEX 300i comercializado pela BAXTER (Deerfield, IL, EUA), ou o kit de microesferas CD34 comercializado pela MILTENYI. BIOTECH (2303 Lindbergh Street, Auburn, CA 95602, EUA).

[00128] As células purificadas ou isoladas são colocadas em ou num meio de cultura cuja composição é adaptada à multiplicação destas células. Exemplos de tais meios de cultura, incluindo meios adequados para cultivar células CD34+humanas, foram descritos acima. Pode ser, por exemplo, um meio de cultura como descrito acima, incluindo um meio compreendendo insulina humana, transferrina humana e plasma ou soro humano. Este meio de cultura pode estar contido no bolso do cassete da aplicação.

[00129] As células são então colocadas em incubação, por exemplo, colocando o saco, ou o cassete contendo o saco, em uma incubadora, em particular em uma incubadora da aplicação. O tempo de incubação pode, por exemplo, ser vários dias, especialmente 8 a 10 dias, em particular 9 dias, especialmente quando é uma cultura de células CD34+humanas, excluindo células tronco embrionárias humana.

[00130] A aplicação também se refere a células, excluindo células tronco embrionias humanas, a uma população celular compreendendo estas células, bem como a uma composição farmacêutica compreendendo estas células ou esta população de células.

[00131] Estas células ou populações celulares podem ser obtidas por cultura de acordo com a aplicação como descrito acima.

[00132] As células da aplicação pode especialmente ser ou compreender células CD34+(humano), excluindo as células tronco embrionárias humanas, especialmente células CD34+hematopoiéticas (humanos) ou células CD34+não-hematopoiéticas (humano).

[00133] Estas células CD34+(humanas) podem ser, por exemplo, células do sangue periférico (humano) ou do cordão umbilical (humano) ou de tecido humano, em particular sangue periférico (humano).

[00134] Estas células podem, com vantagem, ser ou incluir células tronco ou progenitoras, em particular células multipotentes ou pluripotentes, excluindo células tronco embrionárias humanas.

[00135] Essas células não são, ou não entendem, células embrionárias humanas.

[00136] Estas células podem, nomeadamente, ser ou compreender células ou células CD34+progenitoras humanas (multipotentes ou pluripotentes) sangue periférico mobilizado por um fator de crescimento, tais como G-CSF (fator estimulador de colónias de crescimento) da haste.

[00137] A demanda (humana), excluindo as células tronco embrionárias humanas, pode estar em sua forma pura ou isolada, ou ser incluída em uma população de células.

[00138] Uma população de células da aplicação pode assim ser uma população de células humanas não embrionárias, que inclui células CD34+humanas da aplicação.

[00139] Mais particularmente, as células da aplicação podem em particular ser (uma população de) células humanas não embrionárias, as quais são caracterizadas por: - são pelo menos 107 células humanas, mais particularmente pelo menos 108, ou pelo menos 1,5.108 ou 107 a 1,7 x 108 células humanas, e - que compreendem pelo menos 70%+células humanas CD34 (multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes e não-embrionário).

[00140] Estas células humanas podem, além disso, todas terem a mesma tipificação de HLA, mais particularmente as mesmas tipagens de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR.

[00141] Por exemplo, as células da aplicação podem em particular ser (uma população de) células humanas hematopoiéticas não embrionárias, que são caracterizadas por: - que o número de pelo menos 107 células humanas hematopoiéticas, mais particularmente o número de pelo menos 108, ou, pelo menos, 1,5.108, ou 107 como 1,7.108 células hematopoiéticas humanas, e - que compreendem pelo menos 70%+células humanas CD34 (multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes e não-embrionário).

[00142] Estas células hematopoiéticas humanas podem, além disso, ter todas as mesmas tipificação de HLA, mais particularmente as mesmas tipagens de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR.

[00143] As células da aplicação podem ter uma ou mais características que as distinguem das células virgens.

[00144] O termo "ingênuo" neste contexto significa que estas são células que foram obtidas diretamente de um sujeito ou paciente humano, e que podem ter sido purificadas, mas não crescidas.

[00145] De fato, foi observado que após a cultura de acordo com o pedido (por exemplo, num meio de cultura e/ou em uma bolsa ou cassete como descrito acima), a população de células humanas obtida difere da população ingênua inicialmente colocados em cultura, por um ou mais dos seguintes aspectos: - um diâmetro médio maior (diâmetros de 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11,18 ± 0,49 μm), - uma maior proporção de células CD34- CD14+(monócitos, que podem ter um impacto positivo na eficiência de um transplante de células), - uma proporção maior (mas que não chega a 100%) de células CD34+CD33- (CD33 sendo o marcador da linhagem mieloide), - uma proporção menor (mas ainda assim maior que 10%) de células CD34+CD133+(marcador de progenitores endoteliais).

[00146] Mais particularmente, as células da aplicação podem ser células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, as quais exibem uma ou mais das seguintes características: 1/ numeram pelo menos 107 células humanas, mais particularmente de pelo menos 108, ou, pelo menos, 1,5.108, 10 ou 7 para 1,7.108 células humanas, 2/ todos eles têm a mesma tipagem de HLA, mais particularmente a mesma tipagem de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR, 3/ que inclui, pelo menos, 70% de células CD34+(multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes, não embrionária) 4/ eles têm um diâmetro de célula 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11,18 ± 0,49 μm, 5/ compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%, 6/ que incluem células CD34+CD33- (humana) em uma proporção de mais de 10% ou mais de 20% ou mais de 25% (e de preferência menos do que 100%, em particular menos do que 60% ou inferior a 50% ou inferior a 40% ou inferior a 35%), 7/ eles incluem CD34+CD133+(humana) em uma proporção de menos de 60% ou menos de 50% (e de preferência superior a 20%, em particular mais do que 25% ou mais de 30%).

[00147] De acordo com uma modalidade, as células da aplicação são células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, que têm pelo menos duas destas sete características, em particular pelo menos três, ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis dessas sete características, ou ter as sete características.

[00148] Por exemplo, as células da aplicação podem ser células hematopoiéticas humanas, as quais exibem uma ou mais das seguintes características: 1/ são pelo menos 107 células hematopoiéticas humanas, mais particularmente pelo menos 108, ou pelo menos 15,108, ou de 107 a 1, 7,108 células hematopoiéticas humanas, 2/ todos eles têm a mesma tipagem de HLA, mais particularmente a mesma tipagem de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR, 3/ que inclui, pelo menos, 70% de células CD34+(multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes, não embrionária) 4/ eles têm um diâmetro de célula 11, 2 ± 0,5 μm, em particular de 11, 18 ± 0,49 μm, 5/ compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%, 6/ que incluem células CD34+CD33- (humana) em uma proporção de mais de 10% ou mais de 20% ou mais de 25% (e de preferência menos do que 100%, em particular menos do que 60% ou inferior a 50% ou inferior a 40% ou inferior a 35%), 7/ eles incluem CD34+CD133+(humana) em uma proporção de menos de 60% ou menos de 50% (e de preferência superior a 20%, em particular mais do que 25% ou mais de 30%).

[00149] De acordo com uma modalidade, as células da aplicação são células hematopoiéticas humanas, que exibem pelo menos duas destas sete características, em particular pelo menos três ou pelo menos quatro ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis destas sete características. Características, ou ter as sete características.

[00150] Em particular, as células da aplicação podem ser células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, que exibem uma ou mais das seguintes características: 1/ numeram pelo menos 107 células humanas, mais particularmente de pelo menos 108, ou, pelo menos, 1, 5,108 , ou 107 para 1, 7,108 células humanas, 2/ todos eles têm a mesma tipagem de HLA, mais particularmente a mesma tipagem de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR, 3/ que inclui, pelo menos, 70% de células CD34+(multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes, não embrionária) 4/ eles têm um diâmetro de célula 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11, 18 ± 0,49 μm, 5/ compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.

[00151] De acordo com uma modalidade, as células da aplicação são células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, que têm pelo menos duas destas cinco características, em particular pelo menos três ou pelo menos quatro destas cinco características. ou tem as cinco características.

[00152] Por exemplo, as células da aplicação podem ser células hematopoiéticas humanas, as quais exibem uma ou mais das seguintes características: 1/ são pelo menos 107 células hematopoiéticas humanas, mais particularmente pelo menos 108, ou pelo menos 1, 5,108 , ou de 107 a 1,7.108 células hematopoiéticas humanas, 2/ todos eles têm a mesma tipagem de HLA, mais particularmente a mesma tipagem de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR, 3/ que inclui, pelo menos, 70% de células CD34+(multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes, não embrionária) 4/ eles têm um diâmetro de célula 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11,18 ± 0,49 μm, 5/ compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.

[00153] De acordo com uma modalidade, as células da aplicação são células hematopoiéticas humanas, que exibem pelo menos duas destas cinco características, em particular pelo menos três ou pelo menos quatro destas cinco características, ou têm as cinco características.

[00154] Mais particularmente, as células da aplicação podem ser células humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas, que possuem as seguintes características: - são pelo menos 107 células humanas, mais particularmente pelo menos 108, ou pelo menos 15,108 ou 107 a 1,7 x 108 células humanas, e - que compreendem pelo menos 70%+células humanas CD34 (multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células CD34+humanas (multipotentes ou pluripotentes e não-embrionário) e que, além disso, têm pelo menos uma das (ou ambas) das seguintes características: - têm um diâmetro de célula 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11, 18 ± 0,49 μm, - compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.

[00155] Por exemplo, as células da aplicação podem ser células hematopoiéticas humanas, que possuem as seguintes características: - que o número de pelo menos 107 células humanas hematopoiéticas, mais particularmente o número de pelo menos 108, ou, pelo menos, 1,5.108, ou 107 como 1,7.10 8 células hematopoiéticas humanas, e - compreendem pelo menos 70% de células CD34+humanas (Multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias), mais particularmente pelo menos 80%, ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% de células humanas CD34+(multipotentes ou pluripotentes e não embrionárias) e que, além disso, têm pelo menos uma das (ou ambas) das seguintes características: têm um diâmetro de célula 11,2 ± 0,5 μm, em particular de 11,18 ± 0,49 μm, compreendem células CD34-CD14+(humanas) em uma proporção de 1 a 12%, em particular de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.

[00156] Células nesta população podem todas ter a mesma tipagem de HLA-A, HLA-B, HLA-C e HLA-DR.

[00157] As células desta população podem ainda compreender: - +CD33- células CD34 (humana) em uma proporção de mais de 10% ou mais de 20% ou mais de 25% (e de preferência menos do que 100%, em particular menos do que 60% ou menos do que 50 % ou inferior a 40% ou inferior a 35%), - CD34+CD133+(humana) em uma proporção de menos de 60% ou menos de 50% (e de preferência superior a 20%, em particular mais do que 25% ou mais do que 30% de células CD34+CD133 +).

[00158] Alternativamente ou adicionalmente, as células da aplicação podem ter uma ou mais características que são idênticas (ou não significativamente diferentes) das células naive, especialmente células humanas naive, em particular células hematopoiéticas humanas naive.

[00159] De fato, observou-se que após a cultura de acordo com o pedido (por exemplo num meio de cultura e/ou num saco de cassetes como descrito acima), a população de células humanas obtida (em particular a população de células) humano hematopoiético obtido) pode ter características comuns àquelas da população ingênua de células (hematopoiéticas) inicialmente colocadas em cultura.

[00160] Especificamente, as células do aplicativo podem ser células (particularmente células hematopoiéticas), que, em comparação com células naive (particularmente células hematopoéticas naive), especialmente em comparação com as células (naive) inicialmente colocadas em exposição cultura uma ou mais das seguintes características: 1/ um número ou proporção idênticos ou não significativamente diferentes de epítopos CD34, 2/ uma capacidade idêntica (ou não significativamente diferente) de dividir, em particular um comprimento relativo idêntico de telômero (ou não significativamente diferente), 3/ a mesma ausência de anomalia cromossômica e poliploide (ou as mesmas anormalidades cromossômicas ou poliploides, nas mesmas proporções), 4/ viabilidade idêntica (ou não significativamente diferente), em particular uma viabilidade de células CD34+idêntica (ou não significativamente diferente), por exemplo uma viabilidade de pelo menos 90% ou+células, pelo menos, 95% de CD34, 5/ uma proporção idêntica (ou não significativamente diferente) de células CD34-CD2+/ CD3 +, 6/ uma proporção idêntica (ou não significativamente diferente) de células CD34-CD19+/ CD20 +, 7/ uma proporção idêntica (ou não significativamente diferente) de células CD34-CD56 +, 8/ uma proporção idêntica (ou não significativamente diferente) de células CD34-CD15 +.

[00161] De acordo com uma modalidade, as células da aplicação têm pelo menos duas ou pelo menos três ou pelo menos quatro ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, ou pelo menos sete dessas oito características, ou têm oito características.

[00162] Especificamente, as células do aplicativo podem ser células (particularmente células hematopoiéticas), que, em comparação com as células hematopoiéticas) (ingénuo, especialmente em comparação com as células (naive) inicialmente colocados em cultura, têm um ou mais de seguintes características: 1/ um número ou proporção idênticos ou não significativamente diferentes de epítopos CD34, 2/ uma capacidade idêntica (ou não significativamente diferente) de dividir, em particular um comprimento relativo idêntico de telômero (ou não significativamente diferente), 3/ a mesma ausência de anomalia cromossômica e poliploide (ou as mesmas anormalidades cromossômicas ou poliploides, nas mesmas proporções).

[00163] De acordo com uma modalidade, as células do pedido têm pelo menos duas destas três características, ou têm as três características.

[00164] A aplicação abrange explicitamente qualquer combinação de características celulares entre as aqui descritas e inclui, em particular, a combinação de: - características que diferem das células da demanda por células virgens, e - características idênticas às das células virgens.

[00165] Os meios de cultura de células da aplicação correspondem essencialmente a meios de amplificação celular ex vivo. Eles têm a vantagem de proporcionar um grande número (especialmente um número terapeuticamente suficiente) de células autólogas ou alogênicas, especialmente células autólogas (incluindo células CD34+autólogas ou alogênico, particularmente células CD34+autólogas de células) a partir de ' uma pequena amostra de sangue periférico de um paciente ou sujeito, sem introduzir alterações deletérias nessas células.

[00166] A Tabela 1 abaixo fornece uma ilustração das características de uma população de células obtidas do sangue periférico de um grupo de voluntários humanos saudáveis antes e depois da implementação de uma cultura em uma bolsa de cultura de acordo com a demanda (cultura 9 dias na IMDM suplementado com glutamina e desprovida de fibroblastos, e contendo 0,01 mg/ml de insulina, 330 μg/mL de transferrina, e 5% (VA /) de soro humana, células isoladas por sedimentação e purificado por imunoafinidade em esferas magnéticas anti-CD34):

[00167] Tabela 1:

*: valores de um grupo de 8 voluntários.

[00168] Uma vez completada a cultura, as células obtidas, mais particularmente as células CD34+(humanas) obtidas, podem ser recolhidas.

[00169] As células recolhidas podem ser purificadas ou isoladas, mais particularmente purificadas. Em particular, as células CD34+podem ser purificadas, por exemplo, por meio de purificações disponíveis para o especialista na técnica, como indicado acima.

[00170] As células recolhidas e opcionalmente purificadas podem ser colocadas em uma composição, em particular uma composição farmacêutica, em particular uma composição farmacêutica líquida, por exemplo, uma solução farmacêutica isotônica para humanos. A composição ou solução resultante é um objeto do aplicativo.

[00171] A composição pode compreender um veículo que é fisiologicamente aceitável para seres humanos.

[00172] A composição pode ser formulada para ser administrável, mais particularmente injetável, num ser humano. Por conseguinte, pode ser líquido e incluir compostos não tóxicos para seres humanos, preferencialmente compostos não tóxicos em uma concentração isotônica para humanos.

[00173] Assim, para além das células, a composição pode, por exemplo, compreender uma solução tampão não tóxica para humanos, tal como uma solução salina tamponada com fosfato (solução salina de tampão fosfato ou PBS), ou uma solução tampão de gluconato e/ou acetato.

[00174] A composição pode ainda compreender pelo menos um aditivo não tóxico para humanos, por exemplo uma proteína de soro humano ou plasma humano, especialmente albumina de soro humano (Human Serum Albumina ou H SA).

[00175] A composição ou solução da aplicação pode ser armazenada até ser utilizada, por exemplo, por armazenamento a frio (congelamento).

[00176] Os meios da aplicação podem ser utilizados para um tratamento celular (para fins terapêuticos e/ou preventivos), especialmente para um tratamento celular autólogo, vantajosamente um tratamento celular autólogo.

[00177] Este tratamento celular pode incluir a administração a um paciente ou sujeito: - células do pedido, em particular de células humanas compreendendo células CD34+(humanas), excluindo células tronco embrionias humanas, como descrito acima, ou - uma composição farmacêutica ou solução contendo estas células.

[00178] Este doente ou sujeito pode ser o mesmo em que as células foram inicialmente tomadas para cultura de células (tratamento ou terapia celular autóloga). Alternativamente, este paciente ou indivíduo pode ser diferente daquele em que as células foram inicialmente tomadas para cultura celular (tratamento ou terapia celular alogenética).

[00179] O tratamento celular, mais particularmente o tratamento de células autólogas ou alogênicas (em particular autólogas), pode ser especialmente o tratamento ou a prevenção de insuficiência cardíaca ou patologia não cardíaca.

[00180] A insuficiência cardíaca pode incluir: - insuficiência cardíaca que inclui insuficiência ventricular, mais particularmente insuficiência ventricular - mais particularmente insuficiência cardíaca com função sistólica prejudicada, - mais particularmente insuficiência cardíaca com alteração da função contrátil de um ventrículo, em particular do ventrículo esquerdo, - mais particularmente insuficiência cardíaca com aumento do volume tele sistólico associado à diminuição da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE).

[00181] Isso pode incluir insuficiência cardíaca de grau II ou superior, de acordo com a classificação da New York Heart Association (NYHA) [The Criteria Committee da New York Heart Association. 1994. Nomenclatura e Critérios para Diagnóstico de Doenças do Coração e Grandes Vasos. (9° edição). Boston: Little, Brown & Co., páginas 253-256], mais particularmente, uma insuficiência cardíaca nível II ou superior (de acordo com a classificação da NYHA) induzida por regurgitação mitral.

[00182] A insuficiência cardíaca pode incluir insuficiência cardíaca induzida por - hipertensão arterial - envolvimento valvular, - uma doença congênita, - uma angina de peito refratária (por exemplo, tratamento de angina de peito refratária por extracorporal Contrapulsação reforçada (CPECA) ou tratamento de estimulação dos nervos (TENS em particulares (NST) ou a estimulação da medula espinhal (EMS) ou terapia de quelação (particularmente tratamento com EDTA), - cardiomiopatia, especialmente cardiomiopatia isquêmica, em particular enfarte do miocárdio, mais particularmente um enfarte agudo do miocárdio, - cardiomiopatia dilatada, - cardiomiopatia hipertrófica, - cardiomiopatia restritiva, - cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (DDV).

[00183] A insuficiência cardíaca pode incluir insuficiência cardíaca induzida por cardiomiopatia, particularmente cardiomiopatia isquêmica, em particular enfarte do miocárdio, mais particularmente um enfarte agudo do miocárdio, - cardiomiopatia dilatada, - cardiomiopatia hipertrófica, - cardiomiopatia restritiva, - cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (DDV).

[00184] A insuficiência cardíaca pode incluir insuficiência cardíaca induzida por cardiomiopatia, particularmente cardiomiopatia isquêmica, particularmente enfarte do miocárdio, particularmente enfarte agudo do miocárdio.

[00185] A insuficiência cardíaca pode ser tratada ou evitada, inclusive diminuindo ou até mesmo eliminando a insuficiência cardíaca e/ou limitando o desenvolvimento de insuficiência cardíaca.

[00186] Insuficiência cardíaca induzida por cardiomiopatia isquêmica, especialmente infarto do miocárdio, mais particularmente por um enfarte agudo do miocárdio, pode ser tratado ou prevenido em particular reduzindo ou mesmo suprimindo a insuficiência cardíaca e/ou limitando o desenvolvimento de insuficiência cardíaca.

[00187] De fato, as células (em particular as células CD34 +) obtidas por cultura de acordo com a aplicação e possivelmente por purificação, ou uma composição ou solução farmacêutica contendo estas células, podem ser utilizadas para uma ou mais das seguintes finalidades: - reduzir ou mesmo eliminar o dano miocárdico pós- isquêmico, em particular a necrose pós-infarto e/ou o tamanho da cicatriz pós- infarto, - regenerar parcial ou completamente a estrutura e/ou revascularizar o miocárdio ou a área infartada, - aumento ou restauração da função ventricular, particularmente função ventricular esquerda, particularmente a contractilidade ventricular, particularmente contractilidade do ventrículo esquerdo, por exemplo, para diminuir o volume sistólico final, em associação com um aumento da fracção de ejecção do ventrículo esquerdo (Esquerda Fração de Ejeção Ventricular (LVEF) (especialmente para obter uma FEVE superior a 45%).

[00188] Em particular, o tratamento ou prevenção de insuficiência cardíaca induzida por enfarte do miocárdio (agudo), particularmente enfarte do miocárdio (agudo) devido a doença cardíaca coronária ou ataque cardíaco. Este uso é mais particularmente pretendido: - doentes com insuficiência ventricular esquerda ou contractilidade, e - para pacientes - que têm um enfarte agudo do miocárdio que ocorre de novo após um primeiro incidente ou síndrome cardíaca (este primeiro incidente ou síndrome cardíaca que pode ter resultado em implante (s) de stent e angioplastia coronária transluminal percutânea) (Angioplastia Coronariana Transluminal Percutânea ou PTCA) e/ou possivelmente em Cirurgia de Revascularização do Miocárdio (CABG) e - quem, pelo menos, 10 dias após este primeiro acontecimento cardíaco (por exemplo, pelo menos 3 meses ou pelo menos 6 meses após este primeiro incidente ou síndrome cardíaca) apresentar uma fração de ejecção do ventrículo esquerdo (FEVE) igual a ou inferior a 45%.

[00189] A administração de células, células ou uma composição ou solução farmacêutica da aplicação pode, por exemplo, ser realizada algumas semanas, em particular 3 a 6 semanas após, um acidente vascular cerebral isquêmico.

[00190] O tratamento ou prevenção de insuficiência cardíaca pode incluir cardiomioplastia celular (por implantação de células administradas na zona cardíaca infartada).

[00191] Este tratamento ou prevenção pode compreender a administração de uma população de células da aplicação (em particular de uma população de células humanas compreendendo células CD34 +, excluindo células tronco embrionárias humanas), de células (em particular células humanas CD34 +, excluindo células tronco embrionárias humanas) da aplicação, ou uma composição ou solução do aplicativo, injetando-as por cirurgia ou por cateter.

[00192] A injeção cirúrgica pode ser uma injeção diretamente na área infartada, por exemplo, por cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM).

[00193] A injeção por cateter pode ser, em particular, uma injeção transfemeral percutânea.

[00194] O cateter pode, em particular, ser uma injeção intracoronária, epicárdica ou transendocárdica ou um cateter de infusão.

[00195] O cateter de injeção ou infusão pode, por exemplo, ser fornecido com uma agulha helicoidal, tal como o cateter HELIX comercializado pela BIOCARDIA (125 Shoreway Road, Suite B, San Carlos, CA 94070, EUA), que pode ser acoplado a um sistema de orientação bidimensional (2D), como orientação fluoroscópica 2D.

[00196] O cateter para injeção ou infusão pode, por exemplo, ser o cateter MYOSTAR® comercializado pela BIOSENSE WEBSTER, INC. (15715 Arrow Highway, Irwindale, CA 91706, EUA).

[00197] A injeção ou infusão podem cateter, por exemplo, ser acoplado a um sistema de guia de 3 dimensões (3D) como o sistema de mapeamento cardíaca 3D eletromagnética NOGA® XP comercializados pela BIOLOGICS Delivery Systems GRUPO (Cordis Corp., de Diamond Bar, CA, EUA).

[00198] Um ou mais quimiocinas, em particular um ou mais quimiocinas da família CXC, especialmente o (ou pelo menos) quimiocina CXCL12 (estromais derivadas de celular fator-1 ou SDF-1), podem ser administrados, em particular injetado no paciente ou assunto. Esta administração ou injeção pode ser simultânea, conjunta ou atrasada no tempo em relação à administração, particularmente de uma injeção, uma população de células do pedido (em particular, uma população de células humanas compreendendo células CD34+, excluindo células tronco embrionárias humanas), células (em particular CD34+humanas, excluindo células tronco embrionárias humanas) da aplicação, ou uma composição ou solução da aplicação.

[00199] Os usos dos meios de demanda não estão limitados ao tratamento ou prevenção de insuficiência cardíaca induzida por cardiomiopatia isquêmica, ou insuficiência cardíaca induzida por um tratamento quimioterápico. Os meios do pedido (em particular os meios CD34+do pedido) podem, alternativamente, ser utilizados para tratar ou prevenir patologias não cardíacas.

[00200] Pode ser uma patologia não cardíaca, que não é induzida por intervenção cardíaca.

[00201] Os meios de aplicação podem, de facto, ser usada para tratar a mielossupressão, incluindo a mielossupressão induzidas por tratamento do linfoma, especificamente não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica podem então ser utilizados os meios de aplicação para a implantação no paciente, em especial na sua medula óssea, células hematopoiéticas por via intravenosa (autólogo ou de outro objeto), da aplicação, incluindo uma população de células hematopoiéticas (ou autólogo alogênica) compreendendo células CD34 +, como descrito acima. As células implantadas são então destinadas a regenerar a medula óssea do paciente.

[00202] Os meios da aplicação podem, em alternativa, ser utilizados para tratar ou prevenir uma patologia que induz a degeneração da cartilagem, tal como a osteoartrite. Os meios da aplicação podem então ser utilizados para implantar no doente, particularmente na zona osteoartrítica, células (autólogas ou de outro sujeito) da aplicação, em particular uma população de células compreendendo células CD34 +, tais como acima descrito. As células implantadas são então destinadas a regenerar a cartilagem do paciente.

[00203] Os meios da aplicação podem alternativamente ser utilizados para tratar ou prevenir a insuficiência hepática, incluindo insuficiência hepática crónica, particularmente insuficiência hepática crónica não alcoólica (por exemplo, para prevenir o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular). Os meios de aplicação podem, em seguida, ser utilizada para a implantação no paciente, em especial na área do fígado, as células (autólogas ou de outro objeto), da aplicação, incluindo uma população de células (autólogas), incluindo células CD34 +, como descrito acima. As células implantadas são então destinadas a regenerar o fígado do paciente.

[00204] O termo "compreendendo", com o qual "incluindo" ou "contêiner" é sinônimo, é um termo aberto e não exclui a presença de um elemento (s) múltiplo (s), ingrediente (s) ou etapa (s) de método (s) adicional (is) que não seriam explicitamente declarados, enquanto que o termo "consistente" ou "constituído" é um termo fechado, que impede a presença de qualquer elemento, etapa ou ingrediente adicional que não seja explicitamente declarado. O termo "consistindo substancialmente de" ou "consistindo essencialmente de" é um termo parcialmente aberto, que não exclui a presença de um ou mais elemento (s), ingrediente (s) ou passo (s) adicional (is) no na medida em que tal (s) elemento (s), ingrediente (s) ou etapa (s) adicional (ais) não afetem materialmente as propriedades básicas da invenção.

[00205] Portanto, o termo "compreendendo" (ou "compreende (inclui)") inclui os termos "consistindo", "consistindo", assim como os termos "consistindo essencialmente" e "consistindo essencialmente".

Claims (29)

1. Cassete de cultura celular (16) caracterizado pelo fato de que compreende: - um invólucro (90) pelo menos parcialmente rígido e definindo internamente um espaço interno no qual é disposto e fixado um saco de cultura celular (100) definindo um volume interno, - condutos (36, 38), cada um conectado em uma extremidade do volume interno do saco (100) e cada um tendo uma segunda extremidade localizada externa ao invólucro (90), - válvulas (128, 130) de abertura / fechamento de circulação de fluido através dos condutos (36, 38) que são montadas no invólucro (90).

2. Cassete, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os condutos (36, 38) são formados por tubos flexíveis e pelo menos algumas das válvulas (128, 130) compreendem um membro móvel (136, 138) para prender o tubo em um elemento de estrutura (132) do invólucro (90).

3. Cassete, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada membro móvel (136, 138) compreende um eixo de rotação (136c, 138c) e a periferia radialmente externa de cada membro móvel (136, 138) compreende pelo menos uma superfície (160) em espiral em torno do eixo de rotação (136c, 138c) formando uma superfície de pressão do tubo (36, 38) de modo a variar uma seção de passagem de fluido através de um tubo (36, 38) como e quando da rotação do membro (136, 138).

4. Cassete, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os membros móveis (136, 138) são montados em caixas (134) de uma placa (132) dispostas no interior do invólucro (90) e integradas no invólucro (90), cada uma das caixas (134) que recebe um membro móvel.

5. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que cada membro móvel (136, 138) compreende uma extremidade (136a, 138b) acessível do exterior do invólucro (90) e provida de primeiros meios de acoplamento (154) em rotação para cooperar com os segundos meios de acoplamento em rotação de um atuador.

6. Cassete, de acordo com a reivindicação 4 ou qualquer uma das reivindicações 4 e 5, caracterizado pelo fato de que os membros móveis são centrados e guiados rotativamente em uma extremidade em um orifício do invólucro e em uma extremidade oposta em um orifício da placa.

7. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o saco (100) tem uma forma substancialmente paralelepipédica tendo uma primeira parede flexível (122) e uma segunda parede flexível substancialmente paralela uma outra no estado vazio e no estado cheio de líquido.

8. Cassete, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a relação entre a soma das superfícies da primeira parede (122) e da segunda parede com o volume interno total do saco (100) está compreendida entre 500 et 690 cm2/L, preferencialmente é da ordem de 580 cm2/L.

9. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a distância que separa a primeira parede (122) da segunda parede é menor que 20 mm, preferencialmente entre 10 e 20 mm e ainda mais preferencialmente da ordem de 14 mm.

10. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as paredes do saco (100) são permeáveis a gases, em particular CO2, e preferencialmente têm propriedades que limitam ao máximo a adesão das células às paredes do saco (100).

11. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o invólucro (90) tem uma forma substancialmente correspondente a um paralelepípedo retangular e compreende uma meia concha inferior (96) e uma meia concha superior (98) em solidariedade uma com a outra, a meia-concha inferior (96) sendo rígida e a meia concha superior (98) rígida ou flexível.

12. Cassete, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a meia concha superior (98) compreende uma abertura (108) ou recesso central cujo formato e tamanho são determinados para permitir a propagação de uma ondulação do líquido do saco (100) na abertura (108) quando o cassete contendo líquido (16) oscila em torno de um eixo horizontal, sendo a abertura disposta para cima.

13. Cassete, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a meia concha inferior (96) compreende uma pluralidade de orifícios (104), preferencialmente tendo um diâmetro por exemplo menor que 20 mm.

14. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que os condutos (36, 38) se estendem através de uma das bordas periféricas (102a, 102b) de uma das meia concha inferior (96) ou superior (98).

15. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma barra (34) para suportar os condutos (36, 38), dispostas no exterior do invólucro (90) e atravessadas por pelo menos alguns dos condutos (36, 38).

16. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o saco compreende um meio de cultura celular.

17. Cassete, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido meio de cultura celular compreende insulina humana, transferrina humana e plasma ou soro humano.

18. Cassete, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura celular é congelado.

19. Cassete, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o saco compreende células CD34+.

20. Incubadora de cultura celular, caracterizada pelo fato de que compreende uma câmara termostatizada (28) e um dispositivo de suporte (14) para agitar um cassete de cultura celular definido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores e meios para posicionar e bloquear o cassete de cultura celular (16) em uma determinada posição no dispositivo de suporte, o dispositivo de suporte e agitação (14) compreende uma bandeja (54) para suportar o cassete de cultura de células (16), a bandeja (54) transportando atuadores eletromecânicos (82) para abrir/fechar as válvulas (128, 130), uma saída do qual transporta um segundo meio de acoplamento para cooperar com um primeiro meio de acoplamento (154) das válvulas (128, 130) do cassete quando o cassete (16) está na referida posição dada.

21. Incubadora, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a bandeja é montada rotativamente em torno de um eixo horizontal (63) que a bandeja (54) se destina a oscilar para agitação e homogeneização do conteúdo do saco (100).

22. Incubadora, de acordo com as reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o dispositivo (14) para suportar e agitar compreende uma biela (64) cuja extremidade superior está ligada através de um oscilador à bandeja (54) e cuja extremidade inferior está ligada a uma manivela (68) acionada em rotação pelo eixo de um motor cujo eixo (70) é substancialmente horizontal.

23. Incubadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que compreendendo uma porta (22) para vedar uma abertura (26) da câmara (28), compreendendo esta abertura (26) uma borda periférica (24) na qual é formado um recesso (32) cuja forma adaptada para receber a barra (34) para suportar os condutos de um cassete definido de acordo com a reivindicação 15, formando a barra (34) um elemento vedante entre a porta (22) e borda periférica quando a porta está na posição fechada do invólucro (28).

24. Incubadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que compreendendo meios para controlar a posição do cassete de cultura celular (16) nos meios de suporte.

25. Autômato de cultura celular, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma incubadora (12) conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24, e um sistema de controle por computador incluindo meios de aquisição e registo de dados e para regular as condições de cultura em uma câmara, referida pelo menos uma incubadora para controlar as válvulas do cassete alojado no invólucro.

26. Processo de cultura celular utilizando um autômato, definido de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) colocar de um cassete de cultura celular (16) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 no interior do invólucro da incubadora (12) em uma posição de descongelamento no dispositivo de suporte e agitação (14); b) alimentar o saco (100) nas células a serem cultivadas; c) colocar o cassete (16) no dispositivo de suporte e agitação (14) em uma posição de cultura celular; d) agitar o cassete (16) durante um determinado período de tempo para homogeneizar o seu conteúdo; e) manter o cassete (16) sob condições de incubação durante um período de vários dias; e f) recuperar o conteúdo do cassete (16) por meio de um dos tubos do cassete (16).

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende: durante a etapa d), um ou mais etapas de amostragem (196) para amostragem do conteúdo do saco, cada uma das quais é precedida por uma etapa de inclinação da placa de suporte (54) a partir de uma posição de cultura horizontal; para uma posição inclinada em que a zona de amostragem do saco (100) representa o ponto mais baixo do saco (100).

28. Processo, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que as células a serem cultivadas são células CD34+.

29. Uso da composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento da insuficiência cardíaca induzida por enfarte do miocárdio, em que compreende células que podem ser produzidas por cultura no cassete conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou em uma incubadora conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24, ou no autômato conforme definido na reivindicação 25, ou pelo processo de cultura celular conforme definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 28, as referidas células: - sendo células humanas, - sendo pelo menos 107 células, - compreendendo pelo menos 70% de células CD34 + humanas, compreendendo células humanas CD34-CD14 + em uma razão de 1 a 12%, e - com um diâmetro de célula de 11, 2 ± 0,5 μm.

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