BR112018068230B1 - Ligantes de direcionamento, compostos, composição que compreende os ditos ligantes, uso terapêutico dos compostos, da composição e dos ligantes de direcionamento e ainda método que utiliza os ditos ligantes - Google Patents

Ligantes de direcionamento, compostos, composição que compreende os ditos ligantes, uso terapêutico dos compostos, da composição e dos ligantes de direcionamento e ainda método que utiliza os ditos ligantes Download PDF

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Abstract

São descritos novos ligantes de direcionamento que podem ser ligados a compostos, tais compostos terapêuticos, que são úteis em direcionar os compostos ao alvo in vivo. Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem servir para direcionar compostos oligoméricos inibidores de expressão, tais como agentes RNAi, às células do fígado para modular a expressão genética. Os ligantes de direcionamento aqui divulgados, quando conjugados a um composto oligomérico inibidor de expressão, podem ser utilizados em uma variedade de aplicações, incluindo o uso em aplicações terapêuticas, diagnósticas, validação de alvo e descoberta genômica. Composições incluindo os ligantes de direcionamento aqui divulgados quando ligados a compostos oligoméricos inibidores de expressão são capazes de mediar a expressão de sequências de ácido nucleico alvo em células do fígado, tais como hepatócitos, que podem ser úteis no tratamento de doenças ou condições que respondem a inibição de expressão genética ou atividade em uma célula, tecido ou organismo.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados
[001]Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No de Série 62/304.652, depositado em 7 de março de 2016, e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No de Série 62/370754, depositado em 4 de agosto de 2016, e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No de Série 62/426.916, depositado em 28 de novembro de 2016, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
Fundamentos
[002]Muitos compostos precisam ser administrados em um sítio específico (por exemplo, na(s) célula(s) desejada(s)) para ter um efeito terapêutico ou para ser úteis para fins de diagnóstico. Este é frequentemente o caso quando se tenta entregar um composto terapêutico in vivo. Além disso, ser capaz de distribuir eficientemente um composto para um sítio específico pode limitar ou potencialmente eliminar consequências não intencionais (tais como efeitos fora do alvo) que podem ser causadas pela administração do composto. Um método para facilitar a entrega de um composto, tal como um composto terapêutico, a um sítio desejado in vivo, é ligando- se ou anexando-se o composto a um ligante de direcionamento.
[003]Uma classe de compostos terapêuticos que podem ser direcionados usando ligantes de direcionamento sãos compostos oligoméricos. Os compostos oligoméricos que incluem sequências nucleotídicas pelo menos parcialmente complementares a um ácido nucleico alvo mostraram alterar a função e a atividade do alvo tanto in vitro quanto in vivo. Quando entregues a uma célula contendo um ácido nucleico alvo (tal como mRNA), os compostos oligoméricos mostraram modular a expressão do alvo, resultando na transcrição ou translação alterada do ácido nucleico alvo. Em certos casos, o composto oligomérico pode reduzir a expressão do gene inibindo-se o ácido nucleico alvo e/ou desencadeando a degradação do ácido nucleico alvo.
[004]Se o ácido nucleico alvo for o mRNA, um mecanismo pelo qual um composto oligomérico inibidor de expressão pode modular a expressão do mRNA alvo é por meio da interferência de RNA. A interferência de RNA é um processo biológico pelo qual as moléculas de RNA ou semelhantes ao RNA (tais como as moléculas de RNA quimicamente modificadas) são capazes de silenciar a expressão genética por meio de degradação. O processo de silenciamento gênico pós-transcricional é considerado como sendo um mecanismo de defesa celular evolutivamente conservado utilizado para prevenir a expressão de genes estranhos.
[005]O RNA sintético e as moléculas semelhantes ao RNA mostraram provocar interferência de RNA in vivo. Por exemplo, Elbashir et al. (Nature 2000, 411, 494-98) descreve RNAi induzido por introdução de duplicações de moléculas de RNA de 21 nucleotídeos sintéticas em células de mamíferos cultivadas. Os tipos de moléculas semelhantes ao RNA ou RNA sintético que podem desencadear o mecanismo de resposta de RNAi podem ser compreendidos por nucleotídeos modificados e/ou uma ou mais ligações não fosfodiéster.
[006]Adicionalmente, as moléculas semelhantes ao RNA e RNA de fita simples, que também podem incluir nucleotídeos modificados e têm uma ou mais ligações não fosfodiéster, podem também alterar a expressão de um ácido nucleico alvo, tal como um mRNA alvo.
Sumário
[007]São aqui divulgados ligantes de direcionamento que podem aumentar a entrega de compostos terapêuticos para um sítio alvo específico, por exemplo, um órgão ou tecido específico, dentro de um sujeito, tal como um paciente humano ou animal. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento descritos aqui podem aumentar a entrega direcionada de compostos oligoméricos inibidores de expressão. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento podem aumentar a entrega de compostos oligoméricos inibidores de expressão ao fígado.
[008]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados incluem ou consistem de uma ou mais porções de direcionamento, um ou mais tethers, um ou mais grupos de ponto de ramificação e um ou mais ligantes.
[009]São aqui divulgados ligantes de direcionamento que incluem, consistem da, ou consistem essencialmente da estrutura geral da Fórmula A: , em que n é um número inteiro de 1 a 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4).
[010]Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados incluem, consistem da, ou consistem essencialmente da estrutura da Fórmula B: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20); X é O, S ou NH; e a Porção de Direcionamento é selecionada a partir do grupo que consiste em: N-acetil-galactosamina, galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n- butanoilgalactosamina e N-iso-butanoilgalactosamina.
[011]Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados incluem, consistem da, ou consistem essencialmente da seguinte estrutura: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (Estrutura 1).
[012] Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento divulgados incluem, consistem da, ou consistem essencialmente da estrutura selecionada de: (Estrutura 101); (Estrutura 102); e (Estrutura 103).
[013]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados incluem uma ou mais porções de direcionamento. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados incluem N-acetil-galactosamina como a porção de direcionamento.
[014]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem ser ligados, direta ou indiretamente, a um composto, tais como um composto terapêutico, por exemplo, um composto oligomérico inibidor de expressão, por exemplo, à extremidade terminal 3’ ou 5’ do composto oligomérico inibidor de expressão. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão inclui um ou mais nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi, tal como um agente RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados estão ligados à extremidade terminal 5’ da fita senso de um agente RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados estão ligados ao agente RNAi através de um grupo fosfato, fosforotioato ou fosfonato na extremidade terminal 5’ da fita senso de um agente RNAi de fita dupla.
[015]São divulgadas aqui composições incluindo um ligante de direcionamento e um composto oligomérico inibidor de expressão. São divulgadas aqui composições incluindo um ligante de direcionamento e um agente RNAi.
[016]Em algumas modalidades, as composições divulgadas aqui incluindo um ligante de direcionamento e um agente RNAi têm a estrutura representada por: , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101a); , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102a); e , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103a).
[017]São aqui divulgados compostos fosforamidita incluindo ligantes de direcionamento.
[018]Em algumas modalidades, os compostos fosforamidita incluindo ligantes de direcionamento aqui divulgados têm a estrutura representada por: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) (Estrutura 1d); (Estrutura 101d); (Estrutura 102d); ou (Estrutura 103d).
[019]Também são divulgadas composições farmacêuticas que incluem os ligantes de direcionamento aqui divulgados.
[020]São divulgados métodos de tratamento de uma doença ou transtorno que se beneficiaria da administração de um composto oligomérico terapêutico, o método incluindo administrar a um sujeito um composto oligomérico terapêutico ligado a um ligante de direcionamento aqui divulgado.
[021]São aqui divulgados métodos de inibição de expressão de um ácido nucleico alvo em um sujeito, o método incluindo administrar uma quantidade terapêutica de um composto oligomérico inibidor de expressão ligados aos ligantes de direcionamento aqui divulgados.
[022]São aqui divulgados métodos de entregar um composto oligomérico inibidor de expressão ao fígado in vivo, compreendendo administrar um composto oligomérico inibidor de expressão ligados a um ligante de direcionamento aqui divulgado a um sujeito.
[023]Como utilizado aqui, o termo “ligado” quando se refere à conexão entre duas moléculas significa que duas moléculas estão unidas por uma ligação covalente ou que duas moléculas estão associadas através de ligações não covalentes (por exemplo, ligações de hidrogênio ou ligações iônicas). Em alguns exemplos, onde o termo “ligado” refere-se à associação entre duas moléculas através de ligações não covalentes, a associação entre as duas moléculas diferentes possui uma KD menor do que 1 x 10-4 M (por exemplo, menos que 1 x 10-5 M, menos que 1 x 10-6 M ou menor do que 1 x 10-7 M) em tampão fisiologicamente aceitável (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato).
[024]Como utilizado aqui, o termo “diretamente ligado” refere-se a um primeiro composto ou grupo sendo ligado a um segundo composto ou grupo sem quaisquer átomos ou grupos de átomos intervenientes. Como utilizado aqui, o termo “indiretamente ligado” refere-se a um primeiro composto sendo ligado a um segundo composto ou grupo através de um grupo intermediário, composto ou molécula, tal como, por exemplo, um grupo de ligação. A menos que de outro modo estabelecido, o termo “ligado”, como utilizado aqui, inclui tanto “diretamente ligado” quanto “indiretamente ligado”, como esses termos são definidos aqui.
[025]Como utilizado aqui, um “composto oligomérico” é uma sequência de nucleotídeos contendo cerca de 10 a 50 nucleotídeos ou pares de base de nucleotídeo. Em algumas modalidades, um composto oligomérico possui uma sequência de nucleobase que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de codificação em um ácido nucleico alvo expressado ou gene alvo dentro de uma célula. Em algumas modalidades, os compostos oligoméricos, sobre a entrega a uma célula que expressa um gene, são capazes de inibir a expressão do gene subjacente, e são referidos aqui como “compostos oligoméricos inibidores de expressão”. A expressão genética pode ser inibida in vitro ou in vivo. Os “compostos oligoméricos” incluem, mas não estão limitados a: oligonucleotídeos, oligonucleotídeos de fita simples, oligonucleotídeos anti-senso de fita simples, RNAs de interferência curtos (siRNAs), RNAs de fita dupla (dsRNA), micros RNAs (miRNAs), RNAs de grampo de cabelo curtos (shRNA), ribozimas, moléculas de RNA de interferência e substratos de dicer.
[026]Como utilizado aqui, o termo “oligonucleotídeo” significa um polímero de nucleosídeos ligados, cada um dos quais pode ser independentemente modificado ou não modificado.
[027]Como utilizado aqui, o termo “oligonucleotídeo de fita simples” significa um composto oligomérico de fita simples possuindo uma sequência pelo menos parcialmente complementar a um mRNA alvo, que é capaz de hibridizar com um mRNA alvo através de ligação de hidrogênio sob condições fisiológicas de mamíferos (ou condições comparáveis in vitro). Em algumas modalidades, um oligonucleotídeo de fita simples é um oligonucleotídeo anti-senso de fita simples.
[028]Como utilizado aqui, um “agente RNAi” significa um agente que contém uma molécula de oligonucleotídeo de RNA ou semelhante ao RNA (por exemplo, RNA quimicamente modificado) que é capaz de degradar ou inibir a translação de transcritos de RNA mensageiro (mRNA) de um mRNA alvo em uma maneira específica da sequência. Como utilizado aqui, agentes de RNAi podem operar através do mecanismo de interferência de RNA (isto é, induzir interferência de RNA através de interação com a maquinaria da via de interferência de RNA (complexo de silenciamento induzido por RNA ou RISC) de células de mamíferos), ou por qualquer mecanismo(s) alternativo(s) ou via(s). Embora acredite-se que os agentes de RNAi, como o termo que é utilizado aqui, operam principalmente através do mecanismo de interferência de RNA, os agentes de RNAi divulgados não estão vinculados ou limitados a qualquer via ou mecanismo particular de ação. Os agentes de RNAi incluem, mas não estão limitados a: oligonucleotídeos de fita simples, oligonucleotídeos anti-senso de fita simples, RNAs de interferência curtos (siRNAs), RNAs de fita dupla (dsRNA), micros RNAs (miRNAs), RNAs de grampo de cabelo curtos (shRNA) e substratos de dicer. Os agentes de RNAi aqui descritos são compreendidos de um oligonucleotídeo possuindo uma fita que é pelo menos parcialmente complementar ao mRNA sendo direcionado. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi aqui descritos são de fita dupla, e são compreendidos de uma fita anti-senso e uma fita senso, que é pelo menos parcialmente complementar à fita anti- senso. Os agentes de RNAi podem ser compreendidos de nucleotídeos modificados e/ou uma ou mais ligações não fosfodiéster. Em algumas modalidades, os agentes de RNAi aqui descritos são de fita simples.
[029]Como utilizado aqui, os termos “silenciar”, “reduzir”, “inibir”, “infra-regular” ou “knockdown” quando se refere à expressão de um dado gene, significam que a expressão do gene, como medida pelo nível de RNA transcrito do gene ou o nível de polipeptídeos, proteína ou subunidade de proteína traduzidos do mRNA em uma célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito em que o gene é transcrito, é reduzida quando a célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito é tratado com compostos oligoméricos ligados aos ligantes de direcionamento aqui descritos em comparação com uma segunda célula, grupo de células, tecido, órgão ou sujeito que não foi ou não tenha sido assim tradado.
[030]Como utilizado aqui, o termo “sequência” ou “sequência de nucleotídeos” significa uma sucessão ou ordem de nucleobases ou nucleotídeos, descritas com uma sucessão de letras usando a nomenclatura de nucleotídeo padrão.
[031]Como utilizado aqui, e a menos que de outro modo indicado, o termo “complementar”, quando utilizado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos (por exemplo, fita senso do agente de RNAi ou mRNA direcionado) em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeo anti-senso de fita simples ou um fita anti-senso do agente de RNAi de fita dupla), significa a capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo incluindo a primeira sequência de nucleotídeos para hibridizar (formar ligações de hidrogênio de pares de base sob condições fisiológicas de mamíferos (ou condições comparáveis in vitro)) e forma uma estrutura duplicada ou helicoidal dupla sob certas condições, com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo incluindo a segunda sequência de nucleotídeos. As sequências complementares incluem pares de bases de Watson-Crick ou pares de bases de não Watson-Crick e incluem nucleotídeos naturais ou modificados ou mimitizadores de nucleotídeo, pelo menos na medida em que os requisitos acima com respeito à capacidade para hibridizar são cumpridos.
[032]Como utilizado aqui, “perfeitamente complementar” ou “completamente complementar” significa que todas (100 %) das bases em uma sequência contígua de um primeiro polinucleotídeo irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo polinucleotídeo. A sequência contígua pode compreender a totalidade ou uma parte de uma primeira ou segunda sequência de nucleotídeos.
[033]Como utilizado aqui, “parcialmente complementar” significa que em um par hibridizado de sequências de nucleobases, pelo menos 70 %, mas não todas, das bases em uma sequência contígua de um primeiro polinucleotídeo irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo polinucleotídeo.
[034]Como utilizado aqui, “substancialmente complementar” significa que em um par hibridizado de sequências de nucleobases, pelo menos 85 %, mas não todas, das bases em uma sequência contígua de um primeiro polinucleotídeo irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo polinucleotídeo. Os termos “complementar”, “completamente complementar” e “substancialmente complementar” aqui podem ser utilizados com respeito à correspondência de bases entre a fita senso e a fita anti-senso de um agente de RNAi de fita dupla, entre a fita anti-senso de um agente de RNAi de fita dupla e uma sequência de um mRNA alvo, ou entre um oligonucleotídeo anti-senso de fita simples e uma sequência de um mRNA alvo.
[035]Como utilizado aqui, os termos “tratar”, “tratamento” e semelhantes, significa os métodos ou etapas tomadas para fornecer alívio ou mitigação do número, severidade e/ou frequência de um ou mais sintomas de uma doença em um sujeito.
[036]Como utilizado aqui, a frase “introdução em uma célula”, quando se refere a um composto oligomérico, significa entregar funcionalmente o composto oligomérico a uma célula. A frase “entrega funcional”, significa a entrega do composto oligomérico para a célula em uma maneira que permita que o composto oligomérico tenha a atividade biológica esperada, por exemplo, inibição da sequência específica da expressão genética.
[037]A menos que estabelecido de outro modo, o uso do símbolo como utilizado aqui, significa que qualquer grupo ou grupos podem estar ligados a este que está de acordo com o escopo das invenções aqui descritas.
[038]Como utilizado aqui, o termo “isômeros” refere-se a compostos que têm fórmulas moleculares idênticas, mas que diferem na natureza ou na sequência de união de seus átomos ou na disposição de seus átomos no espaço. Os isômeros que diferem na disposição de seus átomos no espaço são denominados “estereoisômeros”. Os estereoisômeros que não são images espelhadas um do outro são denominados “diastereoisômeros”, e os estereoisômeros que são images espelhadas não superponíveis são denominados “enantiômeros” ou, algumas vezes, de isômeros ópticos. Um átomo de carbono ligado a quatro substituintes não idênticos é denominado um “centro quiral”.
[039]Como utilizado aqui, a menos que especificamente identificado em uma estrutura como possuindo uma conformação particular, para cada estrutura em que os centros assimétricos estão presentes e assim dão origem a enantiômeros, diastereômeros ou outras configurações estereoisoméricas, cada estrutura aqui divulgada é intencionada a representar todos esses possíveis isômeros, incluindo as suas formas opticamente puras e racêmicas. Por exemplo, as estruturas aqui divulgadas são intencionadas a abranger misturas de diastereômeros assim como estereoisômeros isolados.
[040]O termo “substituído”, como utilizado aqui, significa que qualquer um ou mais hidrogênios no átomo designado, usualmente um átomo de carbono, oxigênio ou nitrogênio, é substituído por qualquer grupo como aqui definido, desde que a valência normal do átomo designado não seja excedida, e que a substituição resulte em um composto estável. Exemplos não limitantes de substituintes incluem alquila C1-C6, alquenila C2-C6, alquinila C2-C6, ciano, hidroxila, oxo, carboxila, cicloalquila, cicloalquenila, heterociclila, heteroarila, arila, ceto, alcoxicarbonila, ariloxicarbonila, heteroariloxicarbonila ou halo (por exemplo, F, Cl, Br, I). Quando um substituinte é ceto ou oxo (isto é, =O), então dois (2) hidrogênios no átomo são substituídos. Ligações duplas no anel, como utilizado aqui, são ligações duplas que são formadas entre dois átomos de anel adjacentes (por exemplo, C=C, C=N, N=N, etc.).
[041]Alguns compostos da presente divulgação podem existir em uma forma tautomérica, que é também intencionada a ser abrangida dentro do escopo da presente divulgação. “Tautômeros” sãos compostos cujas estruturas diferem-se marcadamente na disposição de átomos, mas que existem em equilíbrio fácil e rápido. Deve ser entendido que os compostos da presente divulgação podem ser representados como diferentes tautômeros. Deve também ser entendido que quando os compostos têm formas tautoméricas, todas as formas tautoméricas são intencionadas a estarem dentro do escopo da divulgação, e a denominação dos compostos não exclui qualquer forma tautomérica.
[042]Os compostos e sais farmaceuticamente aceitáveis da presente divulgação podem existir em uma ou mais formas tautoméricas, incluindo tautomerismo de cetona - enol, amida - nitrila, lactama - lactim, amida - ácido imídico em anéis heterocíclicos (por exemplo, nas nucleobases guanina, timina e citosina), amina - enamina e enamina - enamina e isômeros geométricos e misturas destes. O tautomerismo de cadeia anelar, exibido pela glicose e outros açúcares, surge como um resultado do grupo aldeído (-CHO) em uma molécula de cadeia de açúcar reagindo com um dos grupos hidróxi (-OH) na mesma molécula para dar-lhe uma forma cíclica (forma de anel). Todas essas formas tautoméricas estão incluídas dentro do escopo da presente divulgação. Os tautômeros existem como misturas de um conjunto tautomérico em solução. Na forma sólida, usualmente um tautômero predomina. Ainda que um tautômero possa ser descrito, a presente divulgação inclui todos os tautômeros dos compostos aqui divulgados. O conceito de tautômeros que são interconvertíveis por tautomerizações é chamado de tautomerismo. No tautomerismo, ocorre um deslocameto simultâneo de elétrons e um átomo de hidrogênio.
[043]As tautomerizações são catalizadas por: Base: 1. desprotonação; 2. formação de um ânion deslocalizado (por exemplo, um enolato); 3. protonação em uma posição diferente do ânion; Ácido: 1. protonação; 2. formação de um cátion deslocalizado; 3. desprotonação em uma posição diferente adjacente ao cátion.
[044]Como utilizado aqui, o termo “alquila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifático saturado, cadeia reta ou ramificada, possuindo de 1 a 10 átomos de carbono, a menos que de outro modo especificado. Por exemplo, “alquila C1-C6” inclui grupos alquila possuindo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 carbonos em um arranjo linear ou ramificado. Como utilizado aqui, o termo “aminoalquila” refere-se a um grupo alquila como definido acima, substituído em qualquer posição com um ou mais grupos amina conforme permitido pela valência normal. Os grupos amina podem ser não substituídos, monossubstituídos ou dissubstituídos.
[045]Como utilizado aqui, o termo “cicloalquila” significa um grupo de anel de hidrocarboneto não aromático saturado ou insaturado possuindo de 3 a 14 átomos de carbono, a menos que de outro modo especificado. Exemplos de ciclogrupos alquila incluem, mas não estão limitados a ciclopropila, metil-ciclopropila, 2,2-dimetil- ciclobutila, 2-etil-ciclopentila, ciclo-hexila, etc. Cicloalquilas podem incluir múltiplos anéis spiros ou fundidos. Os ciclogrupos alquila são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[046]Como utilizado aqui, o termo “alquenila” refere-se a um radical hidrocarboneto não aromático, reto ou ramificado, contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, e possuindo de 2 a 10 átomos de carbono a menos que de outro modo especificado. Até cinco ligações duplas carbono-carbono podem estar presentes em tais grupos. Por exemplo, alquenila “C2-C6” é definida como um radical alquenila possuindo de 2 a 6 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila incluem, mas não estão limitados a etenila, propenila, butenila e ciclo-hexenila. A porção reta, ramificada ou cíclica do grupo alquenila pode conter ligações duplas e é opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-substituída em qualquer posição conforme permitido pela valência normal. O termo “cicloalquenila” significa um grupo hidrocarboneto monocíclico possuindo o número especificado de átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono.
[047]Como utilizado aqui, o termo “alquinila” refere-se a um radical hidrocarboneto, reto ou ramificado, contendo de 2 a 10 átomos de carbono, a menos que de outro modo especificado, e contendo pelo menos uma ligação tripla carbono- carbono. Até 5 ligações triplas carbono-carbono podem estar presentea. Assim, “alquinila C2-C6” significa um radical alquinila possuindo de 2 a 6 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquinila incluem, mas não estão limitados a etinila, 2-propinila e 2-butinila. A porção reta ou ramificada do grupo alquinila pode conter ligação triplas conforme permitido pela valência normal, e pode ser opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-substituída em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[048]Como utilizado aqui, “alcoxila” ou “alcóxi” refere-se a um grupo alquila como definido acima com o número indicado de átomos de carbono ligados através de uma ponte de oxigênio. Alcóxi C1-6, é intencionado a incluir os grupos alcóxi C1, C2, C3, C4, C5 e C6. Alcóxi C1-8, é intencionado a incluir os grupos alcóxi C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 e C8. Exemplos de alcóxi incluem, mas não estão limitados a metóxi, etóxi, n- propóxi, i-propóxi, n-butóxi, s-butóxi, t-butóxi, n-pentóxi, s-pentóxi, n-heptóxi, e n- octóxi.
[049]Como utilizado aqui, “ceto” refere-se a qualquer grupo alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, heterociclila, heteroarila ou arila como aqui definido, ligados através de uma ponte de carbonila. Exemplos de grupos ceto incluem, mas não estão limitados a alcanoila (por exemplo, acetila, propionila, butanoila, pentanoila, hexanoila), alquenoila (por exemplo, acriloila) alquinoila (por exemplo, etinoila, propinoila, butinoila, pentinoila, hexinoila), ariloila (por exemplo, benzoila), heteroariloila (por exemplo, pirroloila, imidazoloila, quinolinoila, piridinoila).
[050]Como utilizado aqui, “alcoxicarbonila” refere-se a qualquer grupo alcóxi como definido acima ligados através de uma ponte de carbonila (isto é, -C(O)O- alquila). Exemplos de grupos alcoxicarbonila incluem, mas não estão limitados a metoxicarbonila, etoxicarbonila, iso-propoxicarbonila, n-propoxicarbonila, t- butoxicarbonila, benziloxicarbonila ou n-pentoxicarbonila.
[051]Como utilizado aqui, “ariloxicarbonila” refere-se a qualquer grupo arila como aqui definido ligados através de uma ponte de oxicarbonila (isto é, -C(O)O-arila). Exemplos de grupos ariloxicarbonila incluem, mas não estão limitados a fenoxicarbonila e naftiloxicarbonila.
[052]Como utilizado aqui, “heteroariloxicarbonila” refere-se a qualquer grupo heteroarila como aqui definido ligados através de uma ponte de oxicarbonila (isto é, - C(O)O-heteroarila). Exemplos de grupos heteroariloxicarbonila incluem, mas não estão limitados a 2-piridiloxicarbonila, 2-oxazoliloxicarbonila, 4-tiazoliloxicarbonila ou pirimidiniloxicarbonila.
[053]Como utilizado aqui, “arila” ou “aromático” significa qualquer anel de carbono monocíclico ou policíclico estável de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático. Exemplos de grupo arilas incluem, mas não estão limitados a fenila, naftila, antracenila, tetra-hidronaftila, indanila e bifenila. Em casos onde o substituinte arila é bicíclico e um anel não é aromático, entende-se que a ligação é através do anel aromático. Os grupos arilas são opcionalmente mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[054]Como utilizado aqui, o termo “heteroarila” representa um anel monocíclico ou policíclico estável de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático e contém de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N e S. Exemplos de grupos heteroarilas incluem, mas não estão limitados a acridinila, carbazolila, cinolinila, quinoxalinila, parrazolila, indolila, benzotriazolila, furanila, tienila, benzotienila, benzofuranila, benzimidazolonila, benzoxazolonila, quinolinila, isoquinolinila, di-hidroisoindolonila, imidazopiridinila, isoindolonila, indazolila, oxazolila, oxadiazolila, isoxazolila, indolila, pirazinila, piridazinila, piridinila, pirimidinila, pirrolila, tetra-hidroquinolina. “Heteroarila” é também entendido incluindo a derivado N-óxido de qualquer heteroarila contendo nitrogênio. Em casos onde o substituinte heteroarila é bicíclico e um anel não é aromático ou não contém heteroátomos, entende-se que a ligação é através do anel aromático ou por meio do anel contendo heteroátomo. Os grupos heteroarilas são opcionalmente mono, di-, tri-, tetra- ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[055]Como utilizado aqui, o termo “heterociclo”, “heterocíclico” ou “heterociclilo” significa um heterociclo aromático ou não aromático de 3 a 14 membros contendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N e S, incluindo grupos policíclicos. Como utilizado aqui, o termo “heterocíclico” é também considerado sinônimo com os termos “heterociclo” e “heterociclilo” e é entendido como também possuindo as mesmas definições apresentadas aqui. “Heterociclilo” inclui as heteroarilas mencionadas acima, assim como seus análogos di-hidro e tetra-hidro. Exemplos de grupos heterociclila incluem, mas não estão limitados a azetidinila, benzoimidazolila, benzofuranila, benzofurazanila, benzopirazolila, benzotriazolila, benzotiofenila, benzoxazolila, carbazolila, carbolinila, cinolinila, furanila, imidazolila, indolinila, indolila, indolazinila, indazolila, isobenzofuranila, isoindolila, isoquinolila, isotiazolila, isoxazolila, naftpiridinila, oxadiazolila, oxo-oxazolidinila, oxazolila, oxazolina, oxopiperazinila, oxopirrolidinila, oxomorfolinila, isoxazolina, oxetanila, piranila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridopiridinila, piridazinila, piridila, piridinonila, pirimidila, pirimidinonila, pirrolila, quinazolinila, quinolila, quinoxalinila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotiopiranila, tetra-hidroisoquinolinila, tetrazolila, tetrazolopiridila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, triazolila, 1,4-dioxanila, hexa- hidroazepinila, piperazinila, piperidinila, piridin-2-onila, pirrolidinila, morfolinila, tiomorfolinila, di-hidrobenzoimidazolila, di-hidrobenzofuranila, di-hidrobenzotiofenila, di-hidrobenzoxazolila, di-hidrofuranila, di-hidroimidazolila, di-hidroindolila, di-hidroiso- oxazolila, di-hidroisotiazolila, di-hidro-oxadiazolila, di-hidro-oxazolila, di- hidropirazinila, di-hidropirazolila, di-hidropiridinila, di-hidropirimidinila, di-hidropirrolila, di-hidroquinolinila, di-hidrotetrazolila, di-hidrotiadiazolila, di-hidrotiazolila, di- hidrotienila, di-hidrotriazolila, di-hidroazetidinila, dioxidotiomorfolinila, metilenedioxibenzoila, tetra-hidrofuranila e tetra-hidrotienila, e N-óxidos destes. A ligação de um substituinte heterociclila pode ocorrer através de um átomo de carbono ou através de heteroátomo. Os grupos heterociclila são opcionalmente mono-, di-, tri, tetra- ou penta-substituídos em qualquer posição conforme permitido pela valência normal.
[056]A pessoa de habilidade comum na técnica compreenderá prontamente e apreciará que os compostos e composições divulgadas aqui podem ter certos átomos (por exemplo, átomos N, O ou S) em um estado protonado ou desprotonado, dependendo do ambiente em que o composto ou a composição é colocada. Consequentemente, como utilizado aqui, as estruturas aqui divulgadas consideram que certos grupos funcionais, tais como, por exemplo, OH, SH ou NH, podem ser protonados ou desprotonados. A divulgação aqui é intencionada para abranger os compostos e composições divulgados independentemente do seu estado de protonação com base no pH do ambiente, como seria prontamente entendido pela pessoa de habilidade comum na técnica.
[057]Como utilizada em uma reivindicação aqui, a frase “consiste de” exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. Quando utilizada em uma reivindicação aqui, a frase “consiste essencialmente de” limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados e àqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada.
[058]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedido de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não intencionados a serem limitativos.
[059]Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos
[060]A FIG. 1 é um espectro de RMN de 1H do composto 3 (que é descrito abaixo no Exemplo 1).
[061]A FIG. 2 é um espectro de RMN de 1H do composto 4 (que é descrito abaixo no Exemplo 1).
[062]A FIG. 3 é um espectro de RMN de 1H do composto 6 (que é descrito abaixo no Exemplo 1).
[063]A FIG. 4 é um espectro de RMN de 1H do composto 7 (que é descrito abaixo no Exemplo 1).
[064]A FIG. 5 é um espectro de RMN de 1H do composto 9 (que é descrito abaixo no Exemplo 1).
[065]A FIG. 6 é um espectro de RMN de 1H do composto 10 (que é Estrutura 101d aqui, e é descrito abaixo no Exemplo 1).
[066]A FIG. 7 é um espectro de RMN de 1H do composto 13 (que é aqui a Estrutura 103d, e é descrita abaixo no Exemplo 2).
[067]A FIG. 8 é um espectro de RMN de 1H do composto 16 (que é aqui a Estrutura 102d, e é descrita abaixo no Exemplo 3).
[068]A FIG. 9 é uma cromatografia HPLC para AM03704 conjugado com a Estrutura 103d (que é descrita abaixo no Exemplo 5).
[069]A FIG. 10 é uma cromatografia HPLC para AM03704 conjugado com a Estrutura 101d (que é descrita abaixo no Exemplo 5).
[070]A FIG. 11 é uma cromatografia HPLC para AM03704 conjugado com a Estrutura 102d (que é descrita abaixo no Exemplo 5).
[071]A FIG. 12 é um gráfico que ilustra os níveis de proteína do Fator 12 normalizados de camundongo (mF12) em camundongos de tipo selvagem (que são descritos abaixo no Exemplo 6).
[072]A FIG. 13 é um gráfico que ilustra os níveis de proteína do Fator 12 normalizados de camundongo (F12) em camundongos de tipo selvagem (que são descritos abaixo no Exemplo 7).
[073]A FIG. 14 é um gráfico que ilustra os níveis de partículas de lipoproteína(a) (Lp(a)) normalizados em camundongos transgênicos (Tg) Lp(a) (que são descritos abaixo no Exemplo 8).
[074]A FIG. 15 é um gráfico que ilustra os níveis de partículas de lipoproteína(a) (Lp(a)) normalizados em camundongos Tg Lp(a) (que são descritos abaixo no exemplo 9).
[075]A FIG. 16 é um gráfico que ilustra os níveis de apo(a) normalizados em camundongos transgênicos (Tg) apo(a) (que são descritos abaixo no Exemplo 10).
[076]A FIG. 17 é um gráfico que ilustra os níveis de proteína cF12 normalizados em macacos cynomolgus (que são descritos abaixo no Exemplo 12).
[077]A FIG. 18 é um gráfico que ilustra os níveis de proteína AAT (Z-AAT) normalizados em camundongos transgênicos PiZ (que são descritos abaixo no Exemplo 13).
[078]A FIG. 19 é um gráfico que ilustra os níveis de proteína do Fator 12 normalizados de camundongo (F12) em camundongos de tipo selvagem (que é descrito abaixo no Exemplo 14).
Descrição Detalhada
[079]São descritos aqui novos ligantes de direcionamento que são ligados a compostos, tais comos compostos oligoméricos inibidores de expressão terapêuticos ou de diagnóstico. Em algumas modalidades, os compostos que são ligados aos ligantes de direcionamento aqui descritos incluem ou consistem dos compostos terapêuticos que sãos agentes de RNAi. Os ligantes de direcionamento podem ser utilizados para direcionar compostos terapêuticos para um sítio desejado de um ácido nucleico alvo ou gene alvo. Também são descritas aqui composições incluindo ligantes de direcionamento e compostos terapêuticos, tais como composições incluindo ou consistindo de ligantes de direcionamento e compostos oligoméricos inibidores de expressão.
[080]Os novos ligantes de direcionamento aqui divulgados fornecem direcionamento ou bio-distribuição eficientes, estabilidade suficiente in vivo e in vitro, e são adequados para síntese como fosforamiditas, o que reduz o custo e despezas indiretas de fabricação, e pode aumentar a eficácia sobre ligantes de direcionamento previamente considerados ligados a um composto oligomérico inibidor de expressão, tal como um agente RNAi.
Ligantes de Direcionamento
[081]Os ligantes de direcionamento são compreendidos de um ou mais grupo de direcionamento ou porções de direcionamento, que podem servir para realçar as propriedades farmacocinéticas ou de bio-distribuição do composto ao qual eles são ligados, e melhorar a distribuição específica para célula ou tecido e captação específica para célula da composição conjugada. Em geral, um ligante de direcionamento ajuda a dirigir a entrega do composto terapêutico ao qual está ligado ao sítio alvo desejado. Em alguns casos, a porção de direcionamento pode se ligar a um receptor de célula ou célula, e iniciar a endocitose para facilitar a entrada do composto terapêutico na célula. Porções de direcionamento podem incluir compostos com afinidade para receptores de célula ou moléculas de superfície celular ou anticorpos. Uma variedade de ligantes de direcionamento que contêm porções de direcionamento podem ser ligadoa a agentes terapêuticos e outros compostos para direcionar os agentes para células e receptores celulares específicos. Os tipos de porções de direcionamento incluem carboidratos, grupos colesterol e colesterilo, e esteroides. Porções de direcionamento que podem ligar-se a receptores de célula incluem sacarídeos, tais como galactose, derivados de galactose (tais como N-acetil- galactosamina), manose e derivados de manose; outros carboidratos; glicanos; haptenos; vitaminas; folato; biotina; aptâmeros e peptídeos, tais como peptídeos contendo RGD, insulina, EGF e transferrina.
[082]Porções de direcionamento que são conhecidas por se ligarem ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPR) são particularmente úteis em dirigir a entrega dos compostos oligoméricos ao fígado. Os receptores de asialoglicoproteínas são abundantemente expressados em células do fígado, incluindo hepatócitos. As porções de direcionamento ao receptor da célula que direcionam o ASGPR incluem galactose e derivados de galactose. Em particular, clusters de derivados de galactose, incluindo clusters compostos por duas, três, ou quatro N-acetil-galactosaminas (GalNAc ou NAG), podem facilitar a captação de certos compostos em células do fígado. Os clusters de GalNAc conjugado com os compostos oligoméricos servem para dirigir a composição ao fígado, onde os açúcares de N-acetil-galactosamina são capazes de se ligar aos receptores de asialoglicoproteínas na superfície da célula do fígado. Acredita-se que a ligação a um receptor de asialoglicoproteína inicia uma endocitose mediada por receptores, facilitando desse modo a entrada do composto no interior da célula.
[083]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro porções de direcionamento. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro porções de direcionamento ligadas a um grupo de ponto de ramificação. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro porções de direcionamento ligadas a um grupo de ponto de ramificação em que cada porção de direcionamento é ligada ao grupo de ponto de ramificação através de um tether.
[084]Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro porções de direcionamento para receptores de asialoglicoproteína (ASGPR) ligadas a um grupo de ponto de ramificação. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro porções de direcionamento para ASGPR ligadas a um grupo de ponto de ramificação em que cada porção de direcionamento de ASGPR é ligada ao grupo de ponto de ramificação através de um tether.
[085]Os ligantes de direcionamento aqui descritos são representados pela seguinte Fórmula I:, em que n é um número inteiro de 1 a 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) (Fórmula I). Em algumas modalidades, n em Fórmula I é um número inteiro de 1-3, 1-2, 2-4, 2-3 ou 3-4.
[086]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem ser ligados a compostos terapêuticos, tais comos compostos oligoméricos. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado ao composto terapêutico através de um linker adicional e/ou uma porção clivável, que é então ligado ao composto terapêutico. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento são ligados ao próprio composto terapêutico.
[087]Em algumas modalidades, o composto terapêutico é um composto oligomérico inibidor de expressão. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente de RNAi de fita dupla.
[088]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento é ligado direta ou indiretamente à extremidade 5’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado direta ou indiretamente à extremidade 3’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado direta ou indiretamente à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ da fita anti-senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado direta ou indiretamente à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ de um agente de RNAi de fita simples.
[089]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento é ligado a um agente de RNAi de fita dupla através de um fosfato, fosfonato, fosforotioato, ou outro grupo de ligação internucleosídeo, na extremidade 5’ do nucleosídeo terminal da fita senso do agente de RNAi de fita dupla.
[090]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui divulgado inclui uma porção clivável. Em algumas modalidades, uma porção clivável inclui ou consiste de um fosfato ou outro grupo de ligação internucleosídeo que pode ser clivado. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto terapêutico através de uma porção clivável.
[091]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui divulgado é ligado a um grupo ou grupos adicionais que incluem uma porção clivável. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a uma porção clivável, que é então ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão.
[092]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto fosforamidita (também referido aqui como um “composto contendo fosforamidita”). Um composto fosforamidita incluindo um ligante de direcionamento aqui descrito pode ser útil para ligar prontamente o ligante de direcionamento ao composto terapêutico ou a outros grupos, usando métodos geralmente conhecidos na técnica para a síntese de fosforamidita. Em algumas modalidades, o composto fosforamidita incluindo o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão usando métodos geralmente conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a fosforamidita contendo ligante de direcionamento é ligada à extremidade 5’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla.
[093]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão ligados a um ligante de direcionamento inclui um oligonucleotídeo de fita simples. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo de fita simples é um oligonucleotídeo anti-senso de fita simples. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado diretamente a um oligonucleotídeo anti-senso de fita simples. Em algumas modalidades, os grupos adicionais são inseridos entre um ligante de direcionamento e um oligonucleotídeo de fita simples.
[094]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento ligado a um agente de RNAi inclui um ou mais açúcares de N-acetil-galactosamina como uma porção de direcionamento ou porções de direcionamento.
[095]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão inclui um tether que inclui polietilenoglicol (PEG). Em algumas modalidades, um tether consiste de PEG. Em algumas modalidades, um tether inclui um PEG possuindo 1 a 10 unidades de etileno glicol. Em algumas modalidades, um tether inclui um PEG possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de etileno glicol.
[096]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento ligado ao agente de RNAi compreende polietilenoglicol (PEG) como o linker. Em algumas modalidades, o linker compreende PEG. Em algumas modalidades, o linker consiste de PEG. Em algumas modalidades, um linker compreende um PEG possuindo 1 a 20 unidades de etileno glicol. Em algumas modalidades, um tether compreende um PEG possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades de etileno glicol.
[097]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão ligados a qualquer um dos ligantes de direcionamento aqui divulgados inclui um agente RNAi. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui divulgado é ligado, direta ou indiretamente, a um agente RNAi.
[098]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui divulgado é ligado diretamente a um agente RNAi. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui divulgado é ligado indiretamente a um agente RNAi, conforme os grupos adicionais são inseridos entre o agente de RNAi e o linker do ligante de direcionamento. Em algumas modalidades, um segundo linker é incluído entre o linker e o composto terapêutico.
Estruturas de Ligante de Direcionamento e Compostos Fosforamidita Incluindo Ligantes de Direcionamento.
[099]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem ser compreendidos de uma ou mais porções de direcionamento, tethers, grupos de ponto de ramificação e ligantes. Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem conter uma, duas, três, quatro ou mais do que quatro porções de direcionamento.
[0100]Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados são sintetizados para ser na forma de um composto fosforamidita. Fosforamiditas são amplamente utilizadas na síntese química de RNA e DNA. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento contendo fosforamidita aqui divulgados são adicionados à extremidade 5’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Pode ser especialmente vantajoso preparar o ligante de direcionamento como uma fosforamidita quando o ligante de direcionamento está para ser ligado à extremidade terminal 5’ de um composto oligomérico inibidor de expressão. Não querendo ser limitado pela teoria, é entendido que preparar o ligante de direcionamento como uma fosforamidita quando o ligante de direcionamento é ligado à extremidade terminal 5’ de um composto oligomérico inibidor de expressão não apenas permite a ligação do ligante de direcionamento como o último componente (reduzindo assim os custos de fabricação), assim como permite potencialmente o ligante de direcionamento bloquear o carregamento da fita senso em RISC quando o ligante de direcionamento é ligado à extremidade terminal 5’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Quando um composto oligomérico inibidor de expressão é um agente de RNAi de fita dupla, o ligante de direcionamento pode ser preparado como um composto fosforamidita quando o ligante de direcionamento está para ser ligado à extremidade terminal 5’ da fita senso do agente RNAi.
[0101]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é representado pela seguinte Fórmula B: , em que n é um número inteiro de 1 a 20; X é O, S ou NH; e a Porção de Direcionamento é selecionada do grupo que consiste em galactose, galactosamina, N-formil- galactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n- butanoilgalactosamina ou N-iso-butanoilgalactosamina. (Fórmula B). Em algumas modalidades, n é igual a 6. Em algumas modalidades, n é igual a 8. Em algumas modalidades, n é igual a 4.
[0102]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) (Estrutura 1).
[0103]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada por Estrutura 1, em que n = 6. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada por Estrutura 1, em que n = 8. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada por Estrutura 1, em que n = 4.
[0104]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 1a).
[0105]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 1b).
[0106]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 1c).
[0107]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) (Estrutura 1d).
[0108]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento compreende ou consiste da estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 101).
[0109]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101a).
[0110]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101b).
[0111]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101c).
[0112]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 101d).
[0113]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento compreende ou consiste da estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 102).
[0114]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102a).
[0115]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102b).
[0116]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102c).
[0117]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte:(Estrutura 102d).
[0118]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento compreende ou consiste da estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 103).
[0119]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z inclui ou consiste de um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103a).
[0120]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103b).
[0121]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103c).
[0122]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 103d).
[0123]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 2)
[0124]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é ligado ao ligante de direcionamento e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A’ é O-, S- ou NH- (Estrutura 2b).
[0125]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 2d).
[0126]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 3)
[0127]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é ligado ao ligante de direcionamento e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A’ é O-, S- ou NH- (Estrutura 3b).
[0128]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 3d).
[0129]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 4).
[0130]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é ligado ao ligante de direcionamento e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A’ é O-, S- ou NH- (Estrutura 4b).
[0131]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 4d).
[0132]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 5).
[0133]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é ligado ao ligante de direcionamento e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A’ é O-, S- ou NH- (Estrutura 5b).
[0134]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 5d).
[0135]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento possui a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 6).
[0136]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é ligado ao ligante de direcionamento e possui a estrutura representada pela seguinte: , em que Z consiste de ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A’ é O-, S- ou NH- (Estrutura 6b).
[0137]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é um composto contendo fosforamidita possuindo a estrutura representada pela seguinte: (Estrutura 6d).
[0138]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento está na forma de um cluster de galactose. Como utilizado aqui, um cluster de galactose inclui um ligante de direcionamento possuindo de dois a quatro derivados terminais de galactose. Como utilizado aqui, o termo derivado de galactose inclui a galactose e os derivados de galactose possuindo afinidade para o receptor de asialoglicoproteína igual ou maior que da galactose. Um derivado de galactose é um açúcar sacarídeo que é um tipo de porção de direcionamento. Um derivado de galactose terminal pode ser ligado a um tether através de carbono C-1 do sacarídeo.
[0139]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é compreendido por três galactosaminas terminais ou derivados de galactosamina (tais como N-acetil- galactosamina) possuindo cada afinidade para o receptor de asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui três N-acetil-galactosaminas terminais (GalNAc ou NAG) como as porções de direcionamento.
[0140]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é compreendido por quatro galactosaminas terminais ou derivados de galactosamina (tais como N- acetil-galactosamina) possuindo cada afinidade para o receptor de asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui quatro N-acetil-galactosaminas terminais (GalNAc ou NAG) como as porções de direcionamento.
[0141]Em algumas modalidades, cada porção de direcionamento inclui um derivado de galactosamina que é N-acetil-galactosamina. Outros sacarídeos possuindo afinidade para o receptor de asialoglicoproteína que podem ser utilizados como porções de direcionamento podem ser selecionados a partir da lista incluindo: galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-acetil-galactosamina, N- propionil-galactosamina, N-n-butanoilgalactosamina e N-iso-butanoilgalactosamina. As afinidades de numerosos derivados de galactose para o receptor de asialoglicoproteína foram estudadas (ver, por exemplo: Iobst, S.T. e Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686) ou são prontamente determinadas usando métodos bem conhecidos e comumente utilizados na técnica.
[0142]Os termos comumente utilizados na técnica quando se referem a três N-acetil-galactosaminas terminais incluem triantenário, trivalente e trímero.
Ligantes
[0143]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados compreendem um linker.
[0144]O linker é um grupo de átomos ligados a um grupo de ponto de ramificação em uma extremidade, e ligado a um composto terapêutico (ou ao átomo de fósforo de uma fosforamidita através de uma reação de fosfitilação com um reagente de formação de fosforamidita, quando o ligante de direcionamento é sintetizado como um composto fosforamidita) na outra extremidade. Em algumas modalidades, o linker é ligado a um grupo de ponto de ramificação em uma extremidade, e é ligado na outra extremidade a um grupo ou grupos, que são então ligados a um composto oligomérico inibidor de expressão. Em algumas modalidades, o linker é diretamente ligado a um composto oligomérico. Em algumas modalidades, o linker é ligado a uma porção clivável, que é então ligada a um composto oligomérico. Exemplos de porções cliváveis incluem, por exemplo, grupos fosfato, grupos incluindo uma porção dissulfeto, e/ou outras ligações internucleosídicas que podem ser clivadas. Em algumas modalidades, o linker não está ligado a uma porção clivável. Em algumas modalidades, o linker está ligado a um grupo fosforotioato ou fosfonato.
[0145]Em algumas modalidades, o linker consiste de ou inclui uma porção polietilenoglicol (“PEG”). A incorporação de uma porção PEG no linker confere certas propriedades benéficas sobre certos outros ligantes, tais como ligantes que consistem de ou incluem cadeias alquila substituídas ou não substituídas. Por exemplo, a incorporação de uma porção PEG no linker aumenta a solubilidade do composto fosforamidita contendo ligante de direcionamento em solventes comumente utilizados na síntese de nucleotídeos em comparação com compostos que contêm ligantes de cadeia alquila, que podem levar a processos de fabricação simplificados.
[0146]Em Algumas Modalidades, Um Ligante De Direcionamento Compreende Um Linker Possuindo A Seguinte Estrutura:, Em Que N É Um Número Inteiro De 1 A 20 (Por Exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Ou 20) (Estrutura 1001).
[0147]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento compreende um linker ligado a um grupo fosfato possuindo a seguinte estrutura:, em que n é um número inteiro selecionado de 1 a 20. (Estrutura 1002).
[0148]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento compreende um linker ligado a um grupo fosforotioato possuindo a seguinte estrutura:, em que n é um número inteiro selecionado de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) (Estrutura 1003).
[0149]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento compreende um linker possuindo a seguinte estrutura: (Estrutura 1004).
[0150]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento compreende linker ligado a um grupo fosfato possuindo a seguinte estrutura: (Estrutura 1005).
[0151]Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento compreende linker ligado a um grupo fosforotioato possuindo a seguinte estrutura: (Estrutura 1006).
[0152]Em algumas modalidades, o linker é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão que é um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o linker é ligado à extremidade 5’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o linker é ligado à extremidade 3’ da fita senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades o linker é ligado à extremidade 3’ da fita anti-senso de um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o linker é ligado à extremidade 5’ da fita anti-senso de um agente de RNAi de fita dupla.
[0153]Em algumas modalidades, o linker é ligado a uma porção clivável. Em algumas modalidades, um grupo fosfato terminal de um composto oligomérico inibidor de expressão pode servir como uma porção clivável. Em algumas modalidades, uma porção clivável independentemente selecionada é ligada a um linker. Como utilizado aqui, uma porção clivável é um grupo que é estável fora da célula, mas ao entrar na célula alvo é clivado. As porções cliváveis são suscetíveis de clivagem sob certas condições, tal como pH, ou certos agentes de clivagem, tal como moléculas que promovem agentes de degradação ou redox.
[0154]Em algumas modalidades, a porção clivável pode ser suscetível ao pH. Por exemplo, os endossomos e lisossomos são conhecidos por geralmente terem um pH mais ácido (pH de aproximadamente 4,5 a 6,5) do que o sangue humano (pH de aproximadamente 7,35 a 7,45), e como tal podem promover a clivagem de uma porção clivável.
[0155]Em algumas modalidades, uma porção clivável é um grupo fosfato. Os grupos fosfato podem ser clivados por agentes que são conhecidos por degradar ou hidrolizar grupos fosfato.
Grupos de Ponto de Ramificação
[0156]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados compreendem pelo menos um grupo de ponto de ramificação. O grupo de ponto de ramificação dos ligantes de direcionamento aqui divulgados é ligado a um linker. Em algumas modalidades, o grupo de ponto de ramificação dos ligantes de direcionamento aqui divulgados é ligado a um linker em uma extremidade, e o grupo de ponto de ramificação é ligado a um ou mais tethers nas outras extremidades. Em algumas modalidades, o grupo de ponto de ramificação é ligado a um linker e um ou mais tethers. Em algumas modalidades, o grupo de ponto de ramificação é ligado indiretamente (por exemplo, através do linker) a um composto oligomérico inibidor de expressão. Em algumas modalidades, o grupo de ponto de ramificação é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão através de um grupo ou grupos adicionais.
[0157]Os grupos de ponto de ramificação aqui divulgados podem ser de qualquer grupo que permita a ligação de uma ou mais porções de direcionamento e ainda permita a ligação a um linker.
[0158]Os grupos de ponto de ramificação aqui divulgados podem ser de qualquer grupo que permita a ligação de dois, três ou quatro derivados de galactose e ainda permita a ligação do ponto de ramificação a um linker.
[0159]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento compreende um ponto de ramificação possuindo as seguintes estruturas: (Estrutura 2001), (Estrutura 2002).
Tethers
[0160]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados compreendem um ou mais tethers. Um tether é ligado entre o grupo de ponto de ramificação e cada porção de direcionamento. Em algumas modalidades, o tether é ligado diretamente ao ligante de direcionamento em uma extremidade e diretamente ao grupo de ponto de ramificação na outra extremidade. Em algumas modalidades, o tether é ligado diretamente ao ligante de direcionamento em uma extremidade, e indiretamente ao grupo de ponto de ramificação na outra extremidade. Em algumas modalidades, o tether é ligado indiretamente ao ligante de direcionamento em uma extremidade e indiretamente ao grupo de ponto de ramificação na outra extremidade. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui descrito inclui três tethers e três porções de direcionamento. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui descrito inclui quatro tethers e quatro porções de direcionamento. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui descrito inclui um tether e uma porção de direcionamento. Em algumas modalidades, um ligante de direcionamento aqui descrito inclui múltiplos tethers e múltiplas porções de direcionamento.
[0161]Em algumas modalidades, tethers adicionais ou outros grupos são inseridos entre o tether e a porção de direcionamento. Em algumas modalidades, um segundo tether é inserido entre um tether e uma porção de direcionamento. Em algumas modalidades, um segundo tether e um terceiro tether são inseridos entre um tether e uma porção de direcionamento. Em algumas modalidades, um segundo, terceiro e quarto tether são inseridos entre um tether e uma porção de direcionamento. Como aqui divulgado, existe pelo menos um tether presente para cada porção de direcionamento. Em algumas modalidades, existe mais que um tether presente para cada porção de direcionamento. Os ligantes de direcionamento aqui divulgados são intencionados a cobrir tais composições.
[0162]Em algumas modalidades, os grupos adicionais podem ser inseridos entre o tether e o grupo de ponto de ramificação.
[0163]Como aqui divulgado, o tether serve como um espaçador que pode ainda adicionar flexibilidade e/ou comprimento à ligação entre a porção de direcionamento e o grupo de ponto de ramificação, linker, e o composto terapêutico. Em algumas modalidades, o tether inclui grupos alquila (incluindo ciclogrupos alquila), grupos alquenila (incluindo ciclogrupos alquenila), grupos alquinila, grupo arilas, grupos aralquila, grupos aralquenila ou grupos aralquinila. Em algumas modalidades, o tether inclui um ou mais heteroátomos, heterociclos, heteroarilas, aminoácidos, nucleotídeos ou sacarídeos.
[0164]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura:, em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e X é O, S ou NH (Estrutura 301).
[0165]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura:, em que X é O, S ou NH (Estrutura 302).
[0166]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura: (Estrutura 302a).
[0167]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e X é O, S ou NH. (Estrutura 303).
[0168]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether, em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e X é O, S ou NH. (Estrutura 304).
[0169]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura:, em que X é O, S ou NH (Estrutura 305).
[0170]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui um tether possuindo a seguinte estrutura: , em que X é O, S ou NH (Estrutura 306).
[0171]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui mais que um tipo de tether. Em algumas modalidades, o tether atua como um espaçador hidrofílico flexível (Ver, por exemplo, U.S. 5.885.968; e Biessen et al. J. Med. Chem. 1995, 39, 1538-1546, ambos os quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade), e inclui um PEG espaçador. Em outras modalidades, o PEG espaçador possui 1 a 20 unidades de etileno (PEG1 a PEG20). Por exemplo, o PEG espaçador possui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades de etileno.
Porções de Direcionamento:
[0172]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem incluir uma a quatro, ou mais do que quatro, porções de direcionamento.
[0173]Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento podem ser um cluster de galactose. Como utilizado aqui, um cluster de galactose inclui um ligante de direcionamento possuindo de dois a quatro derivados terminais de galactose. Como utilizado aqui, o termo derivado de galactose inclui a galactose e os derivados de galactose possuindo afinidade para o receptor de asialoglicoproteína igual ou maior que da galactose. Um derivado de galactose é um açúcar sacarídeo que é um tipo de porção de direcionamento. Um derivado de galactose terminal é ligado a um tether através do carbono C-1 do sacarídeo.
[0174]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é compreendido por três galactosaminas terminais ou derivados de galactosamina (tais como N-acetil- galactosamina) possuindo cada afinidade para o receptor de asialoglicoproteína. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui três N-acetil-galactosaminas terminais (GalNAc ou NAG) como as porções de direcionamento. Por exemplo, cada uma das Estruturas 1, 101, 102, e 103 são ligantes de direcionamento possuindo três N-acetil-galactosaminas terminais como as porções de direcionamento.
[0175]Em algumas modalidades, cada porção de direcionamento inclui um derivado de galactosamina que é N-acetil-galactosamina. Outros sacarídeos possuindo afinidade para o receptor de asialoglicoproteína que podem ser utilizados como porções de direcionamento podem ser selecionados da lista incluindo: galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n- butanoilgalactosamina e N-iso-butanoilgalactosamina. As afinidades de numerosos derivados de galactose para o receptor de asialoglicoproteína foram estudadas (ver, por exemplo, Iobst, S.T. e Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade) ou são prontamente determinadas usando métodos bem conhecidos e comumente utilizados na técnica.
[0176]Em algumas modalidades, a porção de direcionamento é uma porção de direcionamento de célula.
[0177]Em algumas modalidades, a porção de direcionamento inclui um N- acetil-galactosamina:
[0178]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui três porções de direcionamento. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui quatro porções de direcionamento. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui uma porção de direcionamento. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui duas porções de direcionamento. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento inclui quatro ou mais porções de direcionamento.
[0179]Em algumas modalidades, a porção de direcionamento inclui uma ou mais de galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoilgalactosamina ou N-iso- butanoilgalactosamina.
[0180]Por exemplo, em algumas modalidades, as porções de direcionamento para N-acetil-galactosamina em qualquer uma das Estruturas 1 a 6 podem ser substituídas por porções de direcionamento alternativas. Em algumas modalidades, as porções de direcionamento para N-acetil-galactosamina em qualquer uma das Estruturas 101, 102 ou 103 podem ser substituídas por porções de direcionamento alternativas. Tais porções de direcionamento alternativas incluem, por exemplo, galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-acetil-galactosamina, N- propionil-galactosamina, N-n-butanoilgalactosamina ou N-iso-butanoilgalactosamina.
[0181]Adicionalmente, em algumas modalidades, as porções de direcionamento das Estruturas 1 a 6 podem ser substituídas por, por exemplo, outros carboidratos; glicanos; haptenos; vitaminas; folato; biotina; aptâmeros e/ou peptídeos, tais como peptídeos contendo RGD, insulina, EGF e/ou transferrina. Em algumas modalidades, as porções de direcionamento das Estruturas 101, 102 ou 103 podem ser substituídas por, por exemplo, outros carboidratos; glicanos; haptenos; vitaminas; folato; biotina; aptâmeros e/ou peptídeos, tais como peptídeos contendo RGD, insulina, EGF e/ou transferrina.
[0182]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento está na forma de um trímero de N-acetil-galactosamina. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento está na forma de um tetrâmero de N-acetil-galactosamina.
Compostos Oligoméricos
[0183]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados podem ser ligados a um composto oligomérico. Em algumas modalidades, o composto oligomérico é um composto oligomérico inibidor de expressão. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente de RNAi de fita dupla. Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um oligonucleotídeo de fita simples. Os compostos oligoméricos inibidores de expressão podem ser sintetizados usandos métodos comumente utilizados na técnica.
[0184]Os compostos oligoméricos inibidores de expressão podem incluir um ou mais nucleotídeos modificados. Uma base de nucleotídeos (ou nucleobase) é um composto pirimidina ou purino heterocíclico que é um constituinte de todos os ácidos nucleicos e inclui adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) e uracila (U). Como utilizado aqui, o termo “nucleotídeo” pode incluir um nucleotídeo modificado ou mimitizador de nucleotídeo, sítio abásico ou uma porção de substituição substituída. Como utilizado aqui, um “nucleotídeo modificado” é um nucleotídeo, mimitizador de nucleotídeo, sítio abásico ou uma porção de substituição substituída exceto um ribonucleotídeo (nucleotídeo de 2’-hidroxila). Em algumas modalidades, um nucleotídeo modificado inclui um 2’-nucleotídeo modificado (isto é, um nucleotídeo com um grupo exceto um grupo hidroxila na posição 2’ do anel de açúcar de cinco membros). Nucleotídeos modificados incluem, mas não estão limitados a: 2’- nucleotídeos modificados, nucleotídeos de 2’-O-metila (representados aqui como uma letra minúscula ‘n’ em uma sequência de nucleotídeos), nucleotídeos de 2’-desóxi-2’- fluoro (representados aqui como Nf, também representados aqui como nucleotídeos de 2’-fluoro), nucleotídeos de 2’-desóxi (representados aqui como dN), nucleotídeos de 2’-metoxietila (2’-O-2-metoxiletila), (representados aqui como NM ou 2’-MOE), nucleotídeos de 2’-amino, nucleotídeos de 2’-alquila, nucleotídeos de ligações 3’ a 3’ (invertidos) (representados aqui como invdN, invN, invn, invX), base não natural incluindo nucleotídeos, nucleotídeos bloqueados, nucleotídeos ligados em ponte, ácidos nucleicos peptídicos, mimitizadores de nucleotídeos de 2’,3’-seco (analogos de nucleobase não bloqueados, representados aqui como NUNA ou NUNA), nucleotídeos bloqueados (representados aqui como NLNA ou NLNA), nucleotídeos de 3’-O-metóxi (2’ internucleotídes ligados) (representados aqui como 3’-OMen), nucleotídeos de 2’- F-arabino (representados aqui como NfANA ou NfANA), nucleotídeos de morfolino, desoxirribonucleotídeo de fosfonato de vinila (representado aqui como vpdN), nucleotídeos de fosfonato de vinila e nucleotídeos abásicos (representados aqui como X ou Ab). Não é necessário que todas as posições em um determinado composto sejam modificadas uniformemente. Reciprocamente, mais do que uma modificação pode ser incorporada em um único composto oligomérico inibidor de expressão ou mesmo em um único nucleotídeo deste. Os compostos oligoméricos inibidores de expressão podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos conhecidos na técnica. Modificação em cada nucleotídeo é independente da modificação dos outros nucleotídeos.
[0185]Nucleobases modificadas incluem nucleobases sintéticas e naturais, tais como pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas, purinas N-2-, N-6- e O-6- substituídas (por exemplo, 2-aminopropiladenina), 5-propiniluracila, 5-propinilcitosina, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina, 2- tiocitosina, 5-halouracila, 5-halocitosina, 5-propinil uracila, 5-propinil citosina, 6-azo- uracila, 6-azo-citosina, 6-azo-timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, uracilas e citosinas 5-substituídas (por exemplo, 5-halo uracilas e citosinas (por exemplo, 5-bromouracila e 5-bromocitosina), 5-trifluorometil uracila, 5-trifluorometil citosina), 7-metilguanina, 7-metiladenina, 8-azaguanina, 8-aza-adenina, 7-deazaguanina, 7-deaza-adenina, 3-deazaguanina e 3-deazaadenina.
[0186]Para os compostos oligoméricos inibidores de expressão aqui descritos, quaisquer nucleotídeos modificados podem ser ligados por ligações internucleosídeos covalentes contendo fosfato ou não contendo fosfato. As ligações ou cadeias principais de internucleosídeo modificado incluem, mas não estão limitadas a grupo 5’-fosforotioato (representado aqui como ‘s’ minúsculo antes de um nucleotídeo, como em sN, sn, sNf, ou sdN), fosforotioatos quirais, tiofosfato, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, metila e outros alquil fosfonatos incluindo fosfonatos de 3’-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3’- amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquil- fosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, ligações de morfolino, boranofosfatos não possuindo ligações 3’-5’ normais, análogos ligados a 2’-5’ de boranofosfatos, e boranofosfatos possuindo polaridade invertida em que os pares adjacentes de unidades de nucleosídeo são ligados 3’-5’ a 5’-3’ ou 2’-5’ a 5’-2’. Em algumas modalidades, uma ligação ou cadeia principal de internucleosídeo modificado falta um átomo de fósforo. Ligações de internucleosídeo modificado que faltam um átomo de fósforo incluem, mas não estão limitadas a ligações inter-açúcar de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomo misto e ligações inter-açúcar de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações inter-açúcar heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Em algumas modalidades, as cadeias principais de internucleosídeo modificado incluem, mas não estão limitadas a cadeias principais de siloxano, cadeias principais de sulfeto, cadeias principais de sulfóxido, cadeias principais de sulfona, cadeias principais de formacetila e tioformacetila, cadeias principais de metileno formacetila e tioformacetila, cadeias principais contendo alceno, cadeias principais de sulfamato, cadeias principais de metileneimino e metileno-hidrazino, cadeias principais de sulfonato e sulfonamida, cadeias principais amida, e outras cadeias principais possuindo componentes de N, O, S e CH2 mistos.
[0187]Em algumas modalidades, um composto oligomérico inibidor de expressão é um agente de RNAi de fita dupla, e inclui uma fita senso e uma fita anti- senso que são pelo menos parcialmente complementares (pelo menos 70 % complementar) entre si. A fita anti-senso contém uma região possuindo uma sequência que é perfeitamente complementar (100 % complementar) ou pelo menos substancialmente complementar (pelo menos 85 % complementar) a uma sequência em um mRNA alvo. O comprimento de uma fita senso e fita anti-senso de agente de RNAi de fita dupla pode ser 16 a 30 nucleotídeos em comprimento. As fitas senso e anti-senso podem ter o mesmo comprimento ou elas podem ter compimentos diferentes. Em algumas modalidades, a fita senso é cerca de 19 nucleotídeos em comprimento enquanto que a fita anti-senso é cerca de 21 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, a fita senso é cerca de 21 nucleotídeos em comprimento enquanto que a fita anti-senso é cerca de 23 nucleotídeos em comprimento. Em outras modalidades, as fitas senso e anti-senso são independentemente 17 a 21 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, ambas as fitas senso e anti-senso são 21 a 26 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, ambas as fitas senso e anti-senso são 26 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, as fitas senso e anti-senso são independentemente 17 a 26 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, um agente de RNAi de fita dupla possui um comprimento de duplicação de cerca de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos. Esta região de complementaridade perfeita ou substancial entre a fita senso e a fita anti-senso é tipicamente 15 a 25 (por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos em comprimento) nucleotídeos em comprimento e ocorre na ou próxima à extremidade 5’ da fita anti-senso.
[0188]Os compostos oligoméricos inibidores de expressão que são conjugados aos ligantes aqui divulgados opcionalmente e independentemente incluem um adicional 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos (como uma extensão) na extremidade 3’, na extremidade 5’ ou em ambas as extremidades 3’ e 5’ das sequências de núcleo. Estes nucleotídeos adicionais, se presentes, podem ou não ser complementares à sequência correspondente no mRNA alvo.
[0189]Em algumas modalidades, quando um agente de RNAi de fita dupla é conjugado aos ligantes de direcionamento aqui divulgados, os nucleotídeos adicionais de fita senso adicional, se presentes, podem ou não ser idênticos à sequência correspondente no mRNA alvo. Os nucleotídeos adicionais de fita anti-senso adicional, se presentes, podem ou não ser complementares aos nucleotídeos da fita senso adicional correspondentes, se presentes.
[0190]Agentes de RNAi de fita dupla podem ser formados anelando-se uma fita anti-senso com uma fita senso.
[0191]Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado a um agente de RNAi na extremidade 3’ ou 5’ da fita senso ou da fita anti-senso do agente RNAi. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado à extremidade 5’ da fita senso. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado à extremidade 3’ da fita senso. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento é ligado ao agente de RNAi através de uma ligação lábel, clivável ou reversível. Em algumas modalidades, a ligação lábel, clivável ou reversível é incluída em uma porção clivável adicionada entre o agente de RNAi e o ligante de direcionamento.
[0192]Em algumas modalidades, o composto oligomérico inibidor de expressão é um oligonucleotídeo de fita simples. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo de fita simples utiliza o mecanismo de interferência de RNA para inibir a expressão do mRNA alvo. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos de fita simples são ativos em reduzir a expressão do ácido nucleico alvo através de um mecanismo exceto interferência de RNA.
[0193]Em algumas modalidades, o nível de expressão genética e/ou nível de mRNA de um alvo em um sujeito ao qual um ligante de direcionamento descrito conjugado a um composto oligomérico inibidor de expressão é administrado é reduzido por pelo menos cerca de 5 %, por exemplo, por pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % em relação ao sujeito antes da administração ou a um sujeito não recebendo o ligante de direcionamento conjugado. O nível de expressão genética e/ou nível de mRNA no sujeito pode ser reduzido em uma célula, grupo de células e/ou tecido do sujeito. Em algumas modalidades, o nível de proteína em um sujeito ao qual um ligante de direcionamento descrito conjugado a um composto oligomérico inibidor de expressão foi administrado é reduzido por pelo menos cerca de 5 %, por exemplo, por pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % em relação ao sujeito antes de ser administrado o ligante de direcionamento conjugado ou a um sujeito não recebendo o ligante de direcionamento conjugado. O nível de proteína no sujeito pode ser reduzido em uma célula, grupo de células, tecido, sangue e/ou outro fluido do sujeito. Uma redução nos níveis de expressão genética, mRNA ou proteína pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Redução ou diminuição do nível de mRNA e/ou nível de proteína são coletivamente referidas aqui como inibição, diminuição ou redução da expressão do gene alvo.
[0194]Compostos oligoméricos inibidores de expressão específicos que podem ser utilizados com os ligantes de direcionamento divulgados são conhecidos na técnica. Em particular, numerosas referências divulgam compostos oligoméricos inibidores de expressão que podem ser conjugados aos ligantes de direcionamento aqui divulgados para a entrega da composição ao fígado. Exemplos não limitantes incluem Pedido de Patente U.S. No de Série 15/281.309, intitulado Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of LPA, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, divulga vários compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla que alvejam o gene apolipoproteína(a) humano [LPA] (para inibir a expressão da proteína apo(a) que é parte da partícula de lipoproteina(a), e assim a partícula de lipoproteina(a) (Lp(a))), que são adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados. O gene apo(a) [LPA] é expressado predominantemente no fígado em seres humanos e primatas não humanos. Similarmente, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No de Série 15/229.314, intitulado RNAi Therapy for Hepatitis B Virus Infection, que é também incorporado aqui por referência em sua totalidade, divulga vários compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla que alvejam o vírus da hepatite B, que são adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados. O vírus da hepatite B é um vírus contendo DNA de fita dupla de hepatotrofia estrita e é classificado como um membro dos Hepadnavírus, pertencente à família de Hepadnaviridae. Além disso, como um outro exemplo, Pedido de Patente U.S. No de Série 15/229.314, intitulado Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of Factor XII, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, divulga vários compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla que alvejam o gene Fator XII (ou Fator 12, F12), que são adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados. Fator XII é uma serina protease expressada predominantemente no fígado e encontrado no sangue. Adicionalmente, como um outro exemplo, Pedido de Patente U.S. No de Série 14/740.307, intitulado Compositions and Methods for Inhibiting Gene Expression of Alpha-1 AntiTrypsin, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, divulga vários compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla que alvejam o gene alfa-1 antitripsina (ou AAT), que são adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados. AAT é um inibidor de protease pertencente à superfamília serpina, e proteína AAT normal é principalmente sintetizada no fígado por hepatócitos e secretada no sangue. Além disso, WO 2016/01123, intitulado Organic Compositions to Treat APOC3-Related Diseases, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, divulga vários compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla que alvejam apolipoproteína III humana (APOC3), que são adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados. Apolipoproteína C-III é um constituinte de lipoproteínas que acredita inibir captação hepática de partículas ricas de triglicerídeo. Referências adicionais que divulgam vários compostos terapêuticos, incluindo compostos oligoméricos inibidores de expressão, que podem ser adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados, também podem ser encontrados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a composições onde direcionamento ao fígado seria desejável.
Composições Farmacêuticas e Formulações
[0195]Os ligantes de direcionamento aqui divulgados, quando ligados a um composto oligomérico, podem ser utilizados para tratar um sujeito (por exemplo, um ser humano ou mamífero) possuindo uma doença ou transtorno que se beneficiaria da administração do composto. Em algumas modalidades, os ligantes de direcionamento aqui divulgados, quando ligados a um composto oligomérico inibidor de expressão, podem ser utilizados para tratar um sujeito (por exemplo, um ser humano) possuindo uma doença ou transtorno que se beneficiaria de redução ou inibição em expressão do mRNA alvo. O sujeito é administrado com uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais compostos oligoméricos inibidores de expressão, tais como um agente RNAi, que é ligado a um ligante de direcionamento aqui divulgado. O sujeito pode ser um ser humano, paciented ou paciente humano. O sujeito pode ser um adulto, adolescente, criança ou bebê. As composições farmacêuticas descritas incluindo um ligante de direcionamento ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão podem ser utilizadas para fornecer métodos para o tratamento terapêutico de doenças. Tais métodos incluem administração de uma composição farmacêutica aqui descrita a um ser humano ou animal.
[0196]As composições farmacêuticas e métodos aqui divulgados podem diminuir o nível do mRNA alvo em uma célula, grupo de células, tecido, ou sujeito, incluindo: administração ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto oligomérico inibidor de expressão aqui descrito que é ligado a um ligante de direcionamento, desse modo inibindo a expressão de um mRNA alvo no sujeito. Em algumas modalidades, o sujeito foi previamente identificado como possuindo uma suprarregulação patogênica do gene alvo na célula ou tecido direcionado.
[0197]Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas incluem pelo menos um composto oligomérico inibidor de expressão ligado a um ligante de direcionamento. Estas composições farmacêuticas são particularmente úteis na inibição da expressão do mRNA alvo em uma célula alvo, um grupo de células, um tecido ou um organismo. As composições farmacêuticas podem ser utilizadas para tratar um sujeito possuindo uma doença ou transtorno que se beneficiaria de redução no nível do mRNA alvo, ou inibição na expressão do gene alvo. As composições farmacêuticas podem ser utilizadas para tratar um sujeito em risco de desenvolver uma doença ou transtorno que se beneficiaria de redução do nível do mRNA alvo ou uma inibição na expressão do gene alvo. Em uma modalidade, o método inclui administrar uma composição incluindo um ligante de direcionamento como aqui descrito ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, tais como um agente RNAi, a um sujeito a ser tratado. Em algumas modalidades, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis (incluindo veículos, portadores, diluentes e/ou polímeros de entrega) são adicionados às composições farmacêuticas incluindo um ligante de direcionamento ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, desse modo formando uma formulação farmacêutica adequada para a entrega in vivo a um ser humano.
[0198]Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas incluindo um ligante de direcionamento ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão são utilizadas para tratar ou manejar apresentações clínicas associadas com expressão de um mRNA alvo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma ou mais composições farmacêuticas é administrada a um sujeito em necessidade de tal tratamento, prevenção ou manejo. Em algumas modalidades, a administração de qualquer um dos ligantes covalentemente ligados conjugados a um composto oligomérico pode ser utilizada para diminuir o número, severidade e/ou frequência de sintomas de uma doença em um sujeito.
[0199]As composições farmacêuticas descritas incluindo um ligante de direcionamento ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, podem ser utilizadas para tratar pelo menos um sintoma em um sujeito possuindo uma doença ou transtorno que se beneficiaria de redução ou inibição na expressão de um mRNA alvo. Em algumas modalidades, o sujeito é administrado uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais composições farmacêuticas incluindo um composto oligomérico inibidor de expressão, tais como um agente RNAi, ligado a um ligante de direcionamento aqui descrito, desse modo tratando o sintoma. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com uma quantidade profilaticamente eficaz de um ou mais dos compostos oligoméricos inibidores de expressão desse modo prevenindo o pelo menos um sintoma.
[0200]Em algumas modalidades, a expressão ou nível de um mRNA alvo em um sujeito ao qual um composto oligomérico inibidor de expressão ligado a um ligante de direcionamento aqui divulgado é administrado é reduzida por pelo menos cerca de 5 %, por exemplo, mas pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % em relação ao sujeito não que recebe a composição farmacêutica. O nível de expressão genética no sujeito pode ser reduzido em uma célula, grupo de células e/ou tecido do sujeito. Em algumas modalidades, o nível de mRNA é reduzido. Em outras modalidades, o nível expressado de proteína é reduzido. Em algumas modalidades, o nível de proteína em um sujeito ao qual um composto oligomérico inibidor de expressão ligado a um ligante de direcionamento aqui divulgado é administrado é reduzido por pelo menos cerca de 5 %, por exemplo, mas pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % em relação ao sujeito não recebendo a composição farmacêutica. Redução em expressão, níveis de mRNA, ou níveis de proteína podem ser avaliados por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Redução ou diminuição no nível de mRNA e/ou nível de proteína são coletivamente referidos aqui como uma redução ou diminuição no RNA alvo ou inibição ou redução da expressão de mRNA alvo.
[0201]A via de administração é o caminho pelo qual um composto oligomérico inibidor de expressão é trazido em contato com o corpo. Em geral, os métodos de fármacos de administração e ácidos nucleicos para o tratamento de um mamífero são bem conhecidos na técnica e podem ser aplicados à administração das composições aqui descritas. O composto oligomérico inibidor de expressão ligado aos ligantes de direcionamento aqui descritos pode ser administrado através de qualquer via adequada em uma preparação apropriadamente feita para a via particular. Assim, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas por injeção, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, intracutaneamente, subcutaneamente, intra-articularmente ou intraperitonealmente. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas são administradas através de inalação.
[0202]As composições farmacêuticas incluindo um composto oligomérico inibidor de expressão ligado a um ligante de direcionamento aqui descrito podem ser entregues a uma célula, grupo de células, tumor, tecido, ou sujeito usando tecnologias de entrega de oligonucleotídeo conhecidas na técnica. Em geral, qualquer método adequado reconhecido na técnica para liberar uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para o uso com as composições aqui descritas. Por exemplo, a entrega pode ser por administração sítio, (por exemplo, injeção direta, implantação ou administração tópica), administração sistêmica ou via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal ou parenteral, incluindo intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimatoso e intratecal), intramuscular, transdérmica, via aérea (aerossol), administração nasal, oral, retal ou tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão subcutânea ou intravenosa ou injeção.
[0203]Consequentemente, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas podem compreender um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser formuladas para administração a um sujeito.
[0204]Como utilizado aqui, uma composição farmacêutica ou medicamento inclui uma quantidade farmacologicamente eficaz de pelo menos um dos compostos terapêuticos descritos e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis (excipientes) são substâncias exceto o ingrediente farmacêutico ativo (API, produto terapêutico, por exemplo, agente RNAi F12) que são intencionalmente incluídas no sistema de entrega de fármaco. Excipientes não exercem ou não são intencionados a exercer um efeito terapêutico na dosagem intencionada. Excipientes podem agir a a) ajudar no processamento do sistema de entrega de fármaco durante a fabricação, b) proteger, suportar ou realçar a estabilidade, biodisponibilidade ou aceitabilidade do paciente do API, c) ajudar na identificação do produto, e/ou d) realçar qualquer outro atribuo da segurança global, efetividade, de entrega do API durante o armazenamento ou uso. Um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ou não ser uma substância inerte.
[0205]Excipientes incluem, mas não estão limitados a: realçadores de absorção, anti-aderentes, agentes anti-formação de espuma, anti-oxidantes, aglutinantes, agentes tamponantes, portadores, agentes de revestimento, colorantes, realçadores de entrega, polímeros de entrega, dextrano, dextrose, diluentes, disintegrantes, emulsificadores, extensores, enchedores, flavorizantes, deslizantes, umectantes, lubrificantes, óleos, polímeros, preservantes, solução salina, sais, solventes, açúcares, agentes de suspensão, matrizes de liberação sustentada, adoçantes, agentes espessantes, agentes de tonicidade, veículos, agentes repelentes de água e agentes umectantes.
[0206]Composições farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, os portadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro- organismos tais como bactéria e fungos. O portador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido) e misturas adequadas destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol e cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo-se na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0207]Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido por esterilização de filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação incluem secagem a vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução estéril filtrada previamente deste.
[0208]Formulações adequadas para administração intra-articular pode ser na forma de uma preparação aquosa estéril do fármaco que pode ser na forma microcristalina, por exemplo, na forma de uma suspensão microcristalina aquosa. Formulações lipossômicas ou sistemas de polímero biodegradável também podem ser utilizados para apresentar o fármaco para administração tanto intra-articular quanto oftálmica.
[0209]Formulações adequadas para administração tópica, incluindo tratamento ocular, incluem preparações líquidas ou semi-líquidas tais como linimentos, loções, géis, aplicantes, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo tais como cremes, unguentos ou pastas; ou soluções ou suspensões tais como gotas. Formulações para administração tópica à superfície da pele podem ser preparadas dispersando-se o fármaco com um portador dermatologicamente aceitável tais como uma loção, creme, unguento ou sabão. São úteis portadores capazes de formar uma película ou camada sobre a pele para localizar a aplicação e inibir a remoção. Para administração tópica às superfícies de tecido interno, o agente pode ser disperso em um adesivo de tecido líquido ou outra substância conhecida por realçar a adsorção a uma superfície de tecido. Por exemplo, as soluções de hidroxipropilcelulose ou fibrinogênio/trombina podem ser utilizadas com vantagem. Alternativamente, soluções de revestimento de tecido, tais como formulações contendo pectina podem ser utilizadas.
[0210]Para tratamentos por inalação, a inalação de pó (formulações de pulverização autopropulsoras) dispensada com uma lata de pulverização, um nebulizador ou um atomizador pode ser utilizado. Tais formulações podem ser na forma de um pó fino para administração pulmonar a partir de um dispositivo de inalação de pó ou formulações dispensadoras de pó autopropulsoras. No caso de solução autopropulsora e formulações de pulverização, o efeito pode ser obtido pela escolha de uma válvula possuindo as características de pulverização desejadas (isto é, sendo capaz de produzir uma pulverização possuindo o tamanho de partícula desejado) ou incorporando-se o ingrediente ativo como um pó colocado em suspensão em tamanho de partícula controlado. Para administração por inalação, os compostos também podem ser entregues na forma de uma pulverização por aerossol de recipiente ou dispensador pressurizado que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono ou um nebulizador.
[0211]Administração sistêmica também pode ser por via transmucosa ou transdérmica. Para administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados à barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes geralmente são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes e sais biliares. Administração transmucosa pode ser realizada através do uso de pulverizadores nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos tipicamente são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes como geralmente são conhecidos na técnica.
[0212]Os compostos ativos podem ser preparados com portadores que protegerão o composto contra a rápida eliminação a partir do corpo, tais como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser utilizados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes àqueles habilitados na técnica. Suspensões lipossômicas também podem ser utilizadas como portadores farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica, por exemplo, como descrito em Patente U.S. No 4.522.811.
[0213]Composições orais ou parenterais podem ser formuladas na forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico exigido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da divulgação é ditada por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico a ser obtido, e as limitações inerentes na técnica de composição tais como um composto ativo para o tratamento de indivíduos. Além disso, a administração pode ser por injeções periódicas de um bolus, ou pode ser feita mais contínua por administração intravenosa, intramuscular ou intraperitoneana a partir de um reservatório externo (por exemplo, um saco intravenoso).
[0214]Em conjunção com os métodos da presente divulgação, pode ser considerada a farmacogênica (isto é, o estudo do relacionamento entre um genótipo do indivíduo e a resposta indivíduo a um composto ou fármaco estranho). Diferênças em metabolismo de terapêuticos podem levar à toxicidade severa ou falha terapêutica alterando-se a relação entre a dose e concentração sanguínea do fármaco farmacologicamente ativo. Assim, um médico ou clínico pode considerar aplicando o conhecimento obtido em estudos farmacogenômicos relevantes em determinar se deve administrar um fármaco assim como adaptar a dosagem e/ou regime terapêutico de tratamento com o fármaco.
[0215]Uma composição farmacêutica pode conter outros componentes adicionais comumente encontrados em composições farmacêuticas. Tais componentes adicionais incluem, mas não estão limitados a: anti-pruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios (por exemplo, anti- histamínico, difenidramina, etc.). Também é considerado que as células, tecidos ou órgãos isolados que expressam ou compreendem os agentes de RNAi aqui definidos podem ser utilizados como “composições farmacêuticas”. Como utilizado aqui, “quantidade farmacologicamente eficaz”, “quantidade terapeuticamente eficaz”, ou simplesmente “quantidade eficaz” refee-se àquela quantidade de um agente de RNAi para produzir um resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo.
[0216]Geralmente, uma quantidade eficaz de um composto ativo será na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo/dia, por exemplo, de cerca de 1,0 a cerca de 50 mg/kg de peso corpóreo/dia. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um composto ativo será na faixa de cerca de 0,25 a cerca de 5 mg/kg de peso corpóreo por dose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um ingrediente ativo será na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 3 mg/kg de peso corpóreo por dose. A quantidade administrada dependerá também provavelmente de tais variáveis como o estado geral de saúde do paciente, a eficácia biológica relativa do composto administrado, a formulação do fármaco, a presença e tipos de excipientes na formulação, e a via de administração. Também, deve ser entendido que a dosagem inicial administrada pode ser aumentada para além do nível superior acima de modo a obter rapidamente o nível de sangue ou tecido desejado, ou a dosagem inicial pode ser menor do que a ideal.
[0217]Para o tratamento de doença ou para a formação de um medicamento ou composição para o tratamento de uma doença, as composições farmacêuticas aqui descritas incluindo um composto oligomérico inibidor de expressão, tais como um agente RNAi, ligado a um ligante de direcionamento, podem ser combinadas com um excipiente ou com um segundo agente terapêutico ou tratamento incluindo, mas não limitado a: um segundo ou outro composto oligomérico inibidor de expressão, um fármaco de molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de anticorpo e/ou uma vacina.
[0218]Os ligantes de direcionamento descritos, quando ligados aos compostos oligoméricos inibidores de expressão, e quando adiconados aos excipientes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empacotados em kits, recipientes, pacotes ou dispensadores. As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser empacotadas em seringas ou frascos pré-cheios.
[0219]As modalidades proporcionadas acima são agora ilustradas com os seguintes exemplos não limitantes.
Exemplos
[0220]Os exemplos seguintes não são limitativos e são intencionados a ilustrar certas modalidades aqui divulgadas.
[0221]Algumas das abreviações utilizadas nos seguintes detalhes experimentais da síntese dos exemplos são definidos abaixo: h ou hr = hora(s); min = minuto(s); mol = mol(s); mmol = milimol(s); M = molar; μM = micromolar; g = grama(s); μg = microgroma(s); rt ou RT = temperatura ambiente; L= litro(s); mL = mililitro(s); wt = peso; Et2O = éter dietílico; THF = tetra-hidrofurano; DMSO = dimetil sulfóxido; EtOAc = acetato de etila; Et3N ou TEa = trietilamina; i-Pr2NEt ou DIPEA ou DIEA = di- isopropiletilamina; CH2Cl2 ou DCM = cloreto de metileno; CHCl3 = clorofórmio; CDCl3 = clorofórmio deuterado; CCl4 = tetracloreto de carbono; MeOH = metanol; EtOH = etanol; DMF = dimetilformamida; BOC = t-butoxicarbonila; CBZ = benziloxicarbonila; TBS = t-butildimetilsilila; TBSCl = cloreto de t-butildimetilsilila; TFA = ácido trifluoroacético; DMAP = 4-dimetilaminopiridina; NaN3 = azida sódica; Na2SO4= sulfato de sódio; NaHCO3 = bicarbonato de sódio; NaOH = hidróxido de sódio; MgSO4 = sulfato de magnésio; K2CO3 = carbonato de potássio; KOH = hidróxido de potássio; NH4OH = hidróxido de amônio; NH4Cl = cloreto de amônio; SiO2 = sílica; Pd-C = paládio em carbono; HCl = cloreto de hidrogênio ou ácido clorídrico; NMM = N- metilmorfolina; H2 = gás hidrogênio; KF = fluoreto de potássio; EDC-HCl = cloridreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodi-imida; MTBE = éter metil-terc-butílico; MeOH = metanol; Ar = argônio; SiO2 = sílica; RT = tempo de retenção.
[0222]Adicionalmente, os compostos oligoméricos inibidores de expressão exemplares adequados para o uso com os ligantes de direcionamento aqui divulgados são apresentados em várias Tabelas nos Exemplos que seguem. As seguintes notações são utilizadas para indicar os nucleotídeos modificados para as sequências apresentadas nas Tabelas aqui divulgadas: N = ribonucleotídeo (não modificado) com 2’-OH (letra maiúscula sem indicação de f ou d) n = nucleotídeo modificado com 2’-OMe Nf = nucleotídeo modificado com 2’-fluoro dN = 2’-desóxi nucleotídeos NUNA = mimetizadores de nucleotídeos 2’,3’-secos (análogos de nucleobase desbloqueados) NLNA = nucleotídeo bloqueado NfANA = nucleotídeo 2’-F-Arabino NM = nucleotídeo 2’-metoxietila X ou Ab = ribose abásica R = ribitol (invdN) = desoxirribonucleotídeo invertido (nucleotídeo ligado a 3’-3’) (invAb) = nucleotídeo abásico invertido (invX) = nucleotídeo abásico invertido (invn) = nucleotídeo 2’-OMe invertido s = nucleotídeo ligado a fosforotioato vpdN = desoxirribonucleotídeo fosfonato de vinila (3’OMen) = nucleotídeo 3’-OMe (5Me-Nf) = nucleotídeo 5’-Me, 2’-fluoro cPrp = fosfonato de ciclopropila
[0223]Os compostos da presente divulgação podem ser fabricados usando técnicas químicas sintéticas conhecidas àqueles de habilidade no ramo. Exemplo 1. Síntese de Fosforamidita Composta por Ligante de Direcionamento da Estrutura 101b. Preparação de N-[N-(Benziloxicarbonil)-L-γ-glutamil]-L-glutamato de Tri-tercbutila (3)
[0224]A um frasco de fundo redondo de 3 pescoços de 250 mL fluxado com nitrogênio equipado com um termopar, barra agitadora magnética, entrada de nitrogênio e funil de pó foi adicionado 1 (10,00 g, 29,64 mmol) seguido por THF (100 mL). A solução resultante foi agitada, e N-metilmorfolina (7,82 mL, 71,15 mmol) foi adicionada.
[0225]O funil de pó foi substituído com um septo de borracha, e a mistura foi esfriada usando um banho de gelo a 0 °C. Cloroformiato de isobutila (iBuCOCl, 3,85 mL, 29,64 mmol, 1,0 equivalentes) foi adicionado à mistura de reação às gotas durante 10 minutos, mantendo uma temperatura do recipiente menor do que 4,0 °C. Após a adição, a mistura foi agitada mais 40 minutos, e o septo foi substituído com um funil de pó. À mistura de reação foi adicionado 2 (8,767 g, 29,64 mmol, 1,0 equivalentes) às porções durante 15 minutos, mantendo uma temperatura do recipiente menor do que 4,0 °C. Após a adição de 2, o banho de gelo e funil de pó foram removidos, e a reação foi deixada aquecer até a temperatura a ambiente ao longo do curso das etapas remanescentes. A solução límpida e incolor foi envelhecida 25 minutos após a adição de 2.
[0226]Uma amostra da reação (98 μL diluídos em 5,0 mL de ACN em um frasco volumétrico de 5 mL) foi tomada 40 minutos depois do início da adição de 2 e analisada para a conversão percentual por RP-HPLC. Verificou-se que restava 23 % de 1, assim depois de 60 minutos de reação, iBuCOCl adicional (1,16 mL, 30 % em mol) e 2 (2,63 g, 30 % em mol) foram adicionados sequencialmente. A solução foi envelhecida por um adicional de 60 minutos, até que uma amostra mostrou uma conversão maior do que 99 % por HPLC. Tempo de reação total foi de 02,5 horas a partir do início da adição inicial de 2.
[0227]A solução de reação foi vertida em uma solução de agitação de HCl(aq) 0,5 M resfriada em um banho de gelo a 3 °C e agitada cerca de 5 minutos. A mistura de reação resfriada rapidamente foi transferida a um funil separador de 500 mL, e acetato de etila (100 mL) foi adicionado. As camadas foram separadas, e a fase orgânica foi lavada com salmoura (100 mL), seca sobre MgSO4, filtrada em um frasco de fundo redondo de 500 mL, e concentrada a vácuo, proporcionando um óleo incolor espesso. O óleo foi dissolvido em MTBE (100 mL) e concentrado a vácuo, mais uma vez produzindo um óleo incolor espesso.
[0228]Ao óleo de agitação foram adicionados hexanos (100 mL). Névoa branca apareceu na solução, que desapareceu depois de mais agitação. Cristais semeadores foram adicionados, e a mistura foi deixada agitar por 40 minutos, tempo durante, o qual os cristais brancos formaram-se lentamente.
[0229]Dentro de 20 minutos, a suspensão foi espessa o suficiente para impedir a agitação, e hexanos adicionais (50 mL) foram adicionados. Depois de 40 minutos, a suspensão foi filtrada através de um funil de frita grossa, lavada três vezes com hexanos (~10 mL cada), e seca ao ar no funil por 1 hora, proporcionando 3 como um pó branco fino (15,64 g, 91 %). RMN de 1H do composto 3 é mostrada na Figura 1. Na escala de 75 gramas, o rendimento foi de 917 % com pureza de 99 %. Preparação de ácido N-[N-(benziloxicarbonil)-L-Y-glutamil]-L-glutâmico (4)
[0230]A um frasco de fundo redondo de 3 pescoços de 3.000 mL equipado com um agitador suspenso, funil de pó, termopar e manta de aquecimento foram adicionados 3 (72,57 g, 125,4 mmol) e ácido fórmico (grau de reagente, >95 %, 1,45 L, 20 vol. equiv.). O funil de pó foi substituído por uma rolha/N2, e a solução resultante foi aquecida a 45 °C e agitada por 1 hora, com monitoramento por RP-HPLC. A reação foi considerada completa quando menos do que 2,0 % em área de ésteres mono-t- butílicos permaneceu.
[0231]Uma amostra da reação (50 μL diluídos em 950 μL de H2O) foi tomada 60 minutos depois da adição de ácido fórmico, e a amostra foi analisada por RP-HPLC para o percentual de ésteres mono-t-butílicos remanescentes. A análise mostrou que 1,8 % de ésteres mono-t-Bu permaneceu; portanto, a 90 minutos, o calor foi removido.
[0232]A reação foi diluída com tolueno e acetonitrila (ACN, 1500 mL cada), e a mistura foi concentrada a vácuo. Ácido fórmico foi azeotropicamente removido com ACN:tolueno 1:1 (~600 mL), e duas vezes com ACN (~500 mL cada). O material foi seco em alto vácuo durante a noite para proporcionar um composto sólido espumoso branco 4 (54,3 g, rendimento quantitativo). RMN de 1H do composto 4 (L/N 1321-063B) é mostrado na Figura 2. Preparação de ácido N-[N-(benziloxicarbonil)-L-Y-glutamil]-L-glutâmico, tri- [NAG-PEG2]-amida (6)
[0233]A um frasco de fundo redondo de 1 litro foram adicionados sal de p- tosilato de NAG-amina (5, 59,19 g, 97,6 mmol, 4,13 equiv.) e triácido Z-bis-Glu (4, 10,01 g, 23,6 mmol, 1,0 equiv.). A mistura foi dissolvida em acetonitrila (500 mL) e concentrada a vácuo para remover a água azeotropicamente. O resíduo foi dissolvido em acetonitrila fresca (400 mL) e transferido a um frasco de fundo redondo de 1 litro de 3 pescoços fluxado com nitrogênio contendo uma barra agitadora e equipado com um termopar. Teor de água foi medido por KF (257 ppm).
[0234]À solução de agitação sob nitrogênio foi adicionado TBTU (28,20 g, 87,8 mmol, 3,7 equiv.) através de um funil de pó. TBTU residual no funil foi enxaguado na reação usando acetonitrila adicional (100 mL). DIPEA (34,0 mL, 25,2 g, 8,0 equiv.) foi adicionado às gotas por intermédio de seringa durante 20 minutos, mantendo uma temperatura de reação abaixo de 25 °C. A mistura foi agitada por 2 horas a partir do início da adição de DIPEA, com monitoramento por HPLC. A análise a 78 minutos mostrou consumo completo de material de partida.
[0235]Depois de duas horas, o solvente foi removido a vácuo. O óleo espesso resultante foi dissolvido em diclorometano (1000 mL) e lavado com HCl(aq) 1,0 N (3 x 500 mL) e NaHCO3(aq) saturado (3 x 500 mL). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada a vácuo para proporcionar um sólido ceroso esbranquiçado (33,5 g).
[0236]Cromatografia em coluna instantânea foi realizada em um sistema de purificação automatizado CombiFlash ISCO usando clorofórmio e metanol como eluentes. Todas as frações suspeitas de conter produto com base no cromatograma UV (220 nm) foram analisadas por HPLC, e todas as frações contendo pelo menos 97,0 % de AUC de produto foram agrupadas e concentradas para proporcionar 18,75 g (97,0 % de pureza) de 6. Frações impuras foram agrupadas para produzir um adicional de 12,2 g (78,8 % de pureza) de 6. Rendimento total de 6 foi de 70,9 %. RMN de 1H do composto 6 é mostrada na Figura 3. Preparação de sal de tosilato de Tri-NAG-bis-Glu-NH2 (7).
[0237]Composto 6 (5,737 g, 3,46 mmol) em MeOH (155 mL) com p-TsOH- H2O (0,657 g, 3,46 mmol) foi hidrogenado na presença de Pd/C a 10 % (688 mg) por 6 h. TLC (CHCl3:MeOH = 8,5:1,5) confirmou que a reação foi concluída por esse tempo. O frasco de reação foi enchido com Ar, EtOH foi adicionado (200 mL) e a solução foi filtrada através da torta de celite. O produto foi concentrado e seco a vácuo. Rendimento de 4,81 g do produto sal de tosilato 7. RMN de 1H do composto 7 é mostrado na Figura 4. Preparação de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG6-OH (9):
[0238]Procedimento A (se sal de amina tri-NAG 7 for menos do que 96 % puro): sal de amina NAG 7 (~90 % puro, 18,50 g, 10,90 mmol) e éster de HO-PEG6- CO2TFP 8 (6,57 g, 13,08 mmoI) foram dissoIvidos em dicIorometano (185 mL) e esfriados a 0 °C. A esta solução foi adicionada trietilamina (6,10 mL, 43,59 mmol). A solução foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada por 18 horas com monitoramento por HPLC. A reação foi resfriada rapidamente com NaHCO3 aquoso saturado e salmoura (1:1, 140 mL), agitada por 30 min na RT, e as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com NaHCO3 aquoso saturado (3 x 140 mL) e salmoura (1:1) e seca com Na2SO4. O agente de secagem foi filtrado e a solução foi concentrada e purificada por intermédio de cromatografia instantânea, que forneceu 9 (13,56 g, 67 %) como um material sólido branco. RMN de 1H do composto 9 é mostrado na Figura 5.
[0239]Cromatografia em coluna instantânea foi realizada em um sistema de purificação automatizado CombiFlash ISCO usando diclorometano e metanol como eluentes. Frações puras foram agrupadas e concentradas para proporcionar 13,56 g de 9 (99 % de pureza). Frações impuras foram agrupadas para produzir 4,9 g de 9 (~95 % de pureza).
[0240]Procedimento B (se sal de amina tri-NAG 7 for maior do que 96 % puro): Produto 7 (1,94 g, 1,272 mmol) em DCM (40mL) foi agitado sob Ar com éster de HO- PEG6-CO2TFP 8 (767 mg, 1,526 mmol) e DIPEA (443 μL, 2,544 mmol) por 16 h. A mistura de reação foi concentrada a vácuo, dissolvida em CHCl3 e adicionada às gotas a Et2O de agitação (90 mL). O precipitado foi separado, enxaguado com Et2O (3 x 35 mL) e seco a vácuo. Rendimento de 2,275 g (96 %).
Preparação de fosforamidita de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG6 (10):
[0241]Composto 9 (6,62 g, 3,56 mmol) e 4,5-dicianoimidazol (0,11 g, 0,89 mmol) foram dissolvidos em diclorometano anidro (230 mL) e colocado sob atmosfera de nitrogênio. A esta mistura, uma solução de 2-cianoetil-N,N,N’,N’- tetraisopropilfosforodiamidita (“reagente Phos”, 1,46 mL, 4,62 mmol) em diclorometano anidro (5 mL) foi adicionado às gotas durante 5 minutos. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 3 h com monitoramento de HPLC (<1 % de SM remanescente).
[0242]A mistura de reação foi lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 150 mL), DMF a 3 % em H2O (v/v, 2 x 150 mL), H2O (3 x 150 mL) e salmoura (1 x 150 mL), e a camada orgânica foi seca com Na2SO4. O agente de secagem foi filtrado, e a solução foi concentrada a vácuo para fornecer o produto bruto. Produto bruto foi colocado em suspensão em tolueno a 5 %-hexano (50 mL) e agitada por 5 minutos, depois de que o solvente foi decantado. O processo foi repetido com tolueno a 5 %- hexano (1 x 50 mL) e hexano (2 x 50 mL). Os sólidos foram secos sobre vácuo resultando 6,69 g de 10 como um material sólido branco (91 %) (composto 10). RMN de 1H do composto 10 (Estrutura 101d aqui) é mostrada na Figura 6. Exemplo 2. Síntese de Composto Fosforamidita de Ligante de Direcionamento da Estrutura 103d. 1) Preparação de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG4-OH (12):
[0243]Produto 7 (2,44 g, 1,44 mmol), do Exemplo 1 acima, foi dissolvido em DCM (30 mL) e colocado sob atmosfera de argônio. À solução foram adicionados éster de HO-PEG4-CO2TFP 11 (717 mg, 1,73 mmol) e DIPEA (502 μL, 2,88 mmol). A mistura resultante foi agitada por 16 h. A mistura de reação foi concentrada a vácuo e redissolvida em CHCl3. A solução depois foi adicionada às gotas ao Et2O de agitação (90 mL). O precipitado foi separado, enxaguado com Et2O e seco a vácuo para produzir 2,60 g (102 %) do produto 12 que foi utilizado sem purificação adicional.
2) Preparação de fosforamidita de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG4 (13):
[0244]Produto 12 (1,80 g, 1,01 mmol) foi coevaporado com piridina duas vezes antes de ser dissolvido em diclorometano anidro (25 mL) e colocado sob atmosfera de argônio. À solução foram adicionados di-isopropilamônio tetrazolida (87 mg, 0,51 mmol) e 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropilfosforodiamidita (458 mg, 1,52 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 5 h com monitoramento por TLC (CHCl-3:MeOH:Et3N 95:5:2). Uma vez que todo o material de partida foi consumido, a mistura de reação foi diluída com DCM (250 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (100 mL) e salmoura aquosa saturada (100 mL). A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada. O bruto foi purificado por cromatografia em coluna (DCM:MeOH:Et3N 97:3:2) para produzir 1,04 g (53 %) do composto 13. RMN de 1H do composto 13 (Estrutura 103d aqui) é mostrada na Figura 7. Exemplo 3. Síntese do Composto Fosforamidita de Ligante de Direcionamento da Estrutura 102d. 1) Preparação de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG8-OH (15):
[0245]Produto 7 (3, 09 g, 1,82 mmol), do Exemplo 1 acima, foi dissolvido em DCM (30 mL) e colocado sob atmosfera de argônio. À solução foram adicionados éster de HO-PEG8-CO2TFP 14 (1,29 g, 2,18 mmol) e DIPEA (634 μL, 3,64 mmol). A mistura resultante foi agitada por 16 h. A mistura de reação foi concentrada a vácuo e redissolvida CHCl3. A solução depois foi adicionada às gotas ao Et2O de agitação (180 mL). O precipitado foi separado, enxaguado com Et2O e seco a vácuo para produzir 3,54 g (99 %) do produto 15 que foi utilizado sem purificação adicional.
2) Preparação de fosforamidita de Tri-NAG-bis-Glu-NH-PEG8 (16):
[0246]Produto 15 (1,79 g, 0,92 mmol) foi coevaporado com piridina duas vezes antes de ser dissolvido em diclorometano anidro (25 mL) e colocado sob atmosfera de argônio. À solução foram adicionados di-isopropilamônio tetrazolida (79 mg, 0,46 mmol) e 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraisopropilfosforodiamidita (416 mg, 1,38 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 3 h com monitoramento por TLC (CHCl-3:MeOH:Et3N 95:5:2). Uma vez que todo o material de partida foi consumido, a mistura de reação foi concentrada a vácuo e redissolvida em DCM. A solução depois foi adicionada às gotas ao Et2O de agitação (90 mL). O precipitado foi separado, enxaguado com Et2O e seco. O bruto foi purificado por cromatografia em coluna (CHCl-3:MeOH:Et3N 97:3:2) para produzir 950 mg (48 %) do composto 16. RMN de 1H do composto 16 (Estrutura 102d aqui) é mostrada na Figura 8. Exemplo 4. Síntese da Composição de Oligonucleotídeo. A. Síntese. Agentes RNAi foram sintetizados de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada em síntese de oligonucleotídeo. Dependendo da escala, um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation) foi utilizado. Sinteses foram realizadas em um suporte sólido feito de vidro de poro controlado (CPG, 500 A ou 600A, obtido pela Prime Synthesis, Aston, PA, EUA). Todas as fosforamiditas de RNA e RNA modificado por 2’ foram adquiridas pela Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, EUA). Especificamente, as seguintes 2’-O- metil fosforamiditas foram utilizadas: (5’-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil)-2’-O-metil- adenosina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropil-amino) fosforamidita, 5’-O-dimetóxi-tritil- N4-(acetil)-2’-O-metil-citidina-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropil-amino) fosforamidita, (5’-O-dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2’-O-metil-guanosina-3’-O-(2-ciano-etil-N,N-di- isopropil-amino)fosforamidita e 5’-O-dimetóxi-tritil-2’-O-metil-uridina-3’-O-(2-cianoetil- N,N-di-isopropil-amino)fosforamidita. As 2’-desóxi-2’-fluoro-fosforamiditas carregaram os mesmos grupos de proteção como as amiditas de RNA de 2’-O-metila. Ligante de direcionamento contendo fosforamiditas foram dissolvidos em diclorometano anidro ou acetonitrila anidra (50 mM), ambora todas as outras amiditas foram dissolvidas em acetonitrila anidra (50 mM) e peneiras moleculares (3A) foram adicionadas. 5- Benziltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM em acetonitrila) ou 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT, 250 mM em acetonitrila) foi utilizado como solução ativadora. Tempos de acoplamento foram de 10 min (RNA), 15 min (ligante de direcionamento), 90 s (2’OMe) e 60 s (2’F). De modo a introduzir as ligações de fosforotioato, uma solução 100 mM de 3-fenil 1,2,4-ditiazolina-5-ona (POS, obtido pela PoliOrg, Inc., Leominster, MA, EUA) em acetonitrila anidra foi utilizada. B. Clivagem e desproteção de oligômero de ligação de suporte. Depois da finalização da síntese de fase sólida, o suporte sólido seco foi tratado com uma solução de volume 1:1 de metilamina a 40 % em peso em água e solução de hidróxido de amônio a 28 % (Aldrich) por duas horas a 30 °C. A solução foi evaporada e o resíduo sólido foi reconstituído em água (ver abaixo). C. Purificação. Oligômeros brutos foram purificados por HPLC de troca aniônica usando uma coluna TKSgel SuperQ-5PW 13u e sistema Shimadzu LC-8. Tampão A foi de Tris 20 mM, EDTA 5 mM, pH 9,0 e continha Acetonitrila a 20 % e o tampão B foi o mesmo como tampão A com a adição de cloreto de sódio 1,5 M. Traços de UV a 260 nm foram registrados. Frações apropriadas foram agrupadas, depois conduzidas em HPLC por exclusão de tamanho usando uma coluna GE Healthcare XK 16/40 empacotada com meio Sephadex G-25 com um tampão de administração de bicarbonato de amônio 100 mM, pH 6,7 e Acetonitrila a 20 %. D. Anelamento. Fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em 0,2x PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar os agentes RNAi. Esta solução foi colocada em um termomixador a 70 °C, aquecida a 95 °C, mantida a 95 °C por 5 min, e esfriada lentamente até a temperatura ambiente. Alguns agentes RNAi foram liofilizados e armazenados entre -15 a -25 °C. Concentração de duplicação foi determinada medindo-se a absorvância da solução em um espectrômetro UV-Vis em PBS 0,2x. A absorvância da solução a 260 nm depois foi multiplicada por um fator de conversão e o fator de diluição para determinar a concentração de duplicação. A menos que de outro modo estabelecido, todo o fator de conversão foi 0,037 mg/(mLcm). Para alguns experimentos, um fator de conversão foi calculado a partir de um coeficiente de extinção experimentalmente determinado.
Exemplo 5. Propriedades do Composto Contendo Fosforamiditas que Incluem Ligantes de Direcionamento com Comprimentos Variados de Ligantes de PEG.
[0247]Os seguintes compostos fosforamidita de ligante de direcionamento foram sintetizados de acordo com os métodos divulgados acima nos Exemplos 1 a 4: (Estrutura 103d).
[0248]Cada um dos compostos fosforamidita da Estrutura 101d, 102d e 103d, foi entregue a 16 equivalentes para a conjugação na extremidade 5’ do oligonucleotídeo de fita simples AM03704-SS, que é uma fita senso que pode ser utilizada na sintetização de um agente RNAi de fita dupla que alveja F12. AM03704 possui a sequência de nucleotídeos mostrada na tabela abaixo: Tabela 1. Sequência de Fita Senso do Exemplo 5.
[0249]As composições foram solubilizadas em diclorometano (DCM) e secas sobre peneiras. O composto fosforamidita da Estrutura 103d (isto é, possuindo um ligante de PEG-4) apresentou problemas de gelificação tanto para 0,05M quanto para 0,25M. Como mostrado na Figura 9, sob estas condições apenas uma quantidade muito pequena do ligante de direcionamento da Estrutura 103d foi capaz de conjugar à extremidade terminal 5’ de oligonucleotídeo AM03704-SS.
[0250]Estruturas 101d e 102d mostraram conjugação do ligante de direcionamento ao oligonucleotídeo. A Figura 9 mostrou a cromatografia HPLC para AM03704 conjugado à Estrutura 101d. Foi determinado que para o ligante de direcionamento da Estrutura 101, aproximadamente 78 % do oligonucleotídeo conjugado com ligante de direcionamento (FLP = produto de comprimento total) foi formado. A Figura 10 mostra a cromatografia HPLC para AM03704 conjugado à Estrutura 102d. Aproximadamente 40 % do oligonucleotídeo conjugado com ligante de direcionamento foi formado, enquanto que aproximadamente 60 % do oligonucleotídeo permaneceu não conjugado.
[0251]Surpreendentemente e inesperadamente, em 16 equivalentes, a Estrutura 101d substancialmente superou tanto a Estrutura 102d quanto a Estrutura 103d com respeito a conjugação ao oligonucleotídeo na extremidade 5’ da sequência. Adicionalmente, ambas as Estruturas 101d e 102d mostraram maior solubilidade comparadas à Estrutura 103d. Como observado acima, a Estrutura 103d foi difícil de dissolver usando concentrações padrão e condições de solvente típicas para a síntese de oligonucleotídeo. A fabricação dos ligantes de direcionamento ligados aos compostos oligoméricos inibidores de expressão possuindo o ligante de direcionamento da Estrutura 103 (usando-se o composto fosforamidita da Estrutura 103d) exigiu a adição de solventes polares mais agressivos.
Exemplo 6. Comparação de Sítios de Ligação de Fita Senso 3’ e 5’ para Ligantes de Direcionamento GalNAc Usando Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão F12 em Camundongos de Tipo Selvagem.
[0252]Para avaliar as diferênças no sítio de ligação de ligantes GalNAc entre a extremidade terminal 3’ e 5’ da fita senso, os compostos oligoméricos inibidores de expressão (agentes RNAi de fita dupla) dirigidos a F12 (referidos como agentes RNAi F12 aqui) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 2: Tabela 2. Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 6.
[0253]Na Tabela 2, acima, as seguintes notações são utilizadas: (NAG18) possui a estrutura química representada pela Estrutura 2 aqui.
[0254]Cada fita dos agentes RNAi F12 foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0255]Os agentes RNAi F12 ligados ao respectivo ligante GalNAc (isto é, (NAG15) ou (NAG18)) foram combinados em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0256]Os agentes RNAi F12 ligados aos respectivos ligantes GalNAc foram entregues através da injeção SC. No dia 1, injeção SC foi feita nas costas entre os ombros de 200 μl de solução/20 g do camundongo contendo solução salina ou uma dose de 3 mg/kg (mpk) de um de dois agentes RNAi F12 (AD02803 ou AD02807) em solução salina tamponada. Haviam três (3) camundongos do tipo selvagem por grupo de tratamento. Como mostrado acima, AD02803 inclui (NAG15) ligado à extremidade terminal 3’ da fita senso, enquanto que AD 2807 inclui (NAG18) ligado à extremidade 5’ da fita senso.
[0257]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias 8, 15, 22 e 29 para monitorar knockdown. Knockdown foi medido quantificando-se os níveis de proteína F12 de camundongo (mF12) circulantes no soro por uma mF12 internamente desenvolvida alphaLISA® (Perkin Elmer). Expressão a uma data de sangramento específica foi normalizada para a média do grupo controle de solução salina para esta mesma data.
[0258]A Figura 12 mostra os resultados a partir deste estudo. No nadir (dia 22), AD02803 mostrou aproximadamente 70 % de redução em níveis de F12 circulantes, enquanto que AD02807 mostrou uma redução maior do que 80 %. Os dados também mostram uma diferença em comprimento do efeito knockdown, como no dia 29, os camundongos tratados com AD02803 mostraram um retorno mais rápido ao valor de referência em comparação com camundongos tratados com AD2807.
[0259]Estes dados suportam que a ligação de um ligante GalNAc na extremidade 5’ da fita senso supera a ligação na fita senso 3’.
Exemplo 7. Outra Comparação de Sítios de Ligação de Fita Senso 3’ e 5’ para Ligantes de Direcionamento GalNAc usando Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão F12 em Camundongos do Tipo Selvagem.
[0260]Para avaliar adicionalmente o sítio de ligação de ligantes GalNAc nas extremidades terminais 3’ e 5’ da fita senso de compostos oligoméricos inibidores de expressão de fita dupla (agentes RNAi de fita dupla), composições dirigidas ao gene F12 foram preparadas possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 3: Tabela 3. Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 7.
[0261]Na Tabela 3, acima, as seguintes notações são utilizadas: (NAG20) possui a estrutura química representada pela Estrutura 4 aqui.
[0262]Cada fita dos agentes RNAi F12 foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0263]Os agentes RNAi F12 ligados ao respectivo ligante GalNAc (isto é, (NAG20)) foram combinados em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0264]Os agentes RNAi F12 ligados ao respectivo ligante GalNAc foram entregues através da injeção SC. No dia 1, injeção SC foi feita nas costas entre os ombros de 200 μl de solução/20 g do camundongo contendo solução salina ou uma dose de 3 mg/kg (mpk) de um dos dois agentes RNAi (AD02815 ou AD02816) em solução salina tamponada. Haviam três (3) camundongos do tipo selvagem por grupo de tratamento. Como mostrado acima na Tabela 3, AD02815 inclui (NAG20) ligado à extremidade 5’ da cadeia senso, enquanro que AD02816 inclui (NAG20) ligado à extremidade terminal 3’ da fita senso.
[0265]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias 8, 15, 22 e 29 para monitorar knockdown. Knockdown foi medido quantificando-se os níveis de proteína F12 de camundongo (mF12) circulantes no soro por uma mF12 internamente desenvolvida alphaLISA® (Perkin Elmer). Expressão em uma data de sangramento específica foi normalizada para a média do grupo controle de solução salina para esta mesma data.
[0266]A Figura 13 mostra os resultados para este experimento. No nadir (dia 22), AD02816 mostrou aproximadamente 60 % de redução em níveis de proteína F12 circulantes, enquanro que AD02815 mostrou uma redução de 79 %. Os dados também mostram uma diferença em comprimento do efeito knockdown. No dia 29, camundongos tratados com AD02816 mostram 40 % de knockdown enquanro que os camundongos tratados com AD02815 mostram 71 % de knockdown a partir dos níveis de solução salina. Estes dados suportam a ligação de um ligante GalNAc na extremidade terminal 5’ da fita senso.
[0267]Exemplo 8. Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão Lp(a) (Agentes de RNAi de Fita Dupla) Ligados aos Ligantes de Direcionamento da Estrutura 101 em Camundongos Transgênicos (Tg) Lp(a).
[0268]Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (agentes RNAi Lp(a) de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 5: Tabela 4. Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 8.
[0269]Na Tabela 4, acima, as seguintes notações são utilizadas: (NAG25) possui a estrutura química representada pela Estrutura 101 aqui.
[0270]Cada fita dos agentes RNAi Lp(a) foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0271]Camundongos transgênicos (Tg) Lp(a) (Frazer KA et al. 1995, Nature Genética 9:424-431) foram utilizados para avaliar a eficácia de agentes RNAi de fita dupla com ligantes de N-acetil-galactosamina conjugados in vivo. Este camundongo expressa apo(a) humana de um YAC contendo o gene LPA total (proteína apo(a) codificante) com sequências adicionais tanto para 5’ quanto para 3’, assim como a apoB-100 humana, desse modo produzindo partículas de Lp(a) humanizadas (em seguida referido como “camundongos Tg Lp(a)”.) (Callow MJ et al. 1994, PNAS 91:2130-2134).
[0272]Os agentes RNAi Lp(a) ligados aos respectivos ligantes GalNAc (isto é, (NAG25) ou (NAG29)) foram combinados em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0273]Os agentes RNAi Lp(a) ligados ao respectivos ligantes GalNAc (isto é, (NAG25) ou (NAG29)) na extremidade 5’ da fita senso foram entregues através da injeção SC. No dia 1, a injeção SC foi feita nas costas entre os ombros de 200 μl solução/20 g do camundongo contendo solução salina ou uma dose de 1 mg/kg (mpk) do respectivo agente RNAi Lp(a) (AD03547 ou AD03549) em solução salina tamponada. Haviam quatro (4) camundongos Tg Lp(a) por grupo de tratamento.
[0274]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias -1 (pré-dose), 5, 11, 16, 22, 29, e 36. Knockdown foi determinado calculando-se níveis de partícula Lp(a) circulantes em soro. Níveis de partícula Lp(a) foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics) de acordo com as recomendações do fabricante. Para a normalização, o nível de Lp(a) para cada animal em um ponto no tempo foi dividido pelo nível de pré-dose de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de expressão “normalizada ao dia -1”. Expressão em um ponto no tempo específico depois foi normalizada ao grupo controle de solução salina dividindo-se a razão “normalizada ao dia -1” para um animal individual pela razão média “normalizada ao dia -1” de todos os camundongos no grupo controle de solução salina. Este resultado na expressão para cada ponto no tempo normalizado àquela no grupo controle. Erro experimental é fornecido como desvio padrão.
[0275]Os resultados são mostrados na Figura 14. AD03549 (NAG25) mostrou 71 % de knockdown no nadir (dia 16), e AD03547 (NAG29) mostrou 81 % de knockdown no nadir (dia 11). Ambos os ganchos mostraram curvas de recuperação similares depois de nadir, com knockdown menor do que 26 % no dia 36. Estes dados suportam que os ligantes GalNAc mostrados são comparáveis tanto na atividade de knockdown inicial quanto na duração de knockdown em camundongos Tg Lp(a) com uma única dose de 1 mg/kg.
Exemplo 9. Knockdown Lp(a) em Camundongos Transgênicos (Tg) Lp(a) Após a Administração de Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão Lp(a) (Agentes RNAi de Fita Dupla) Ligados ao Ligante de Direcionamento da Estrutura 101.
[0276]Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (agentes RNAi Lp(a) de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 5: Tabela 5. Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 9.
[0277]Na Tabela 5, (NAG25) é a mesma estrutura como mostrado no Exemplo 8, acima, e possui a estrutura química representada pela Estrutura 101 aqui.
[0278]Cada fita dos agentes RNAi Lp(a) foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0279]Camundongos Tg Lp(a) foram utilizados para avaliar a eficácia de agentes RNAi de fita dupla com ligantes de N-acetil-galactosamina conjugados in vivo.
[0280]O agente RNAi Lp(a) ligado ao ligante de direcionamento da Estrutura 101 foi combinado em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0281]O agente RNAi Lp(a) ligado ao ligante de direcionamento na extremidade 5’ da fita senso foi entregue através da injeção SC. No dia 1, uma injeção SC foi administrada nas costas entre os ombros a 200 μl de solução/20 g do camundongo de solução salina ou uma dose de 1 mg/kg (mpk) de agente RNAi AD03272 em solução salina tamponada. Haviam quatro (4) camundongos Tg Lp(a) por grupo de tratamento.
[0282]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias -1 (pré-dose), 8, 15, 22, 29, 36, e 43. Knockdown foi determinado calculando-se os níveis de partícula Lp(a) circulantes em soro. Níveis de partícula Lp(a) foram medidos em um Cobas® Integra 400 (Roche Diagnostics) de acordo com as recomendações do fabricante. Para a normalização, o nível de Lp(a) para cada animal em um ponto no tempo foi dividido pelo nível de pré-dose de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de expressão “normalizada ao dia -1”. Expressão em um ponto no tempo específico depois foi normalizada ao grupo controle de solução salina dividindo-se a razão “normalizada ao dia -1” para um animal individual pela razão média “normalizada ao dia -1” de todos os camundongos no grupo controle de solução salina. Este resultado na expressão para cada ponto no tempo normalizado àquela no grupo controle. Erro experimental é fornecido como desvio padrão.
[0283]Resultados são mostrados na Figura 15. AD03272 mostrou 88 % de knockdown no nadir (dia 15), e knockdown mantido de 75 % no dia 29. Estes dados suportam que o ligante de direcionamento da Estrutura 1008 pode direcionar agentes RNAi direcionados por LPA ao fígado e obter >85 % de knockdown com uma única dose de 1 mg/kg em camundongos transgênicos.
Exemplo 10. Knockdown de Apolipoproteína(a) (apo(a)) em Camundongos Transgênicos (Tg) apo(a) Após a Administração de Compostos oligoméricos Inibidores de Expressão Lp(a) (Agentes de RNAi de Fita Dupla) Ligados ao Ligante de Direcionamento das Estruturas 101, 102, e 103.
[0284]Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (agentes RNAi Lp(a) de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 4: Tabela 6. Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 10.
[0285]Na Tabela 6, acima, as seguintes notações são utilizadas:
[0286]Adicionalmente, (NAG25) é a mesma estrutura como mostrado no Exemplo 8, acima, e possui a estrutura química representada pela Estrutura 101 aqui. (NAG26) possui a estrutura química representada pela Estrutura 102 aqui. (NAG27) possui a estrutura química representada pela Estrutura 103 aqui. Como mostrado acima na Tabela 7, exceto o ligante de direcionamento diferente selecionado, as composições são idênticas.
[0287]Cada fita dos agentes RNAi Lp(a) foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 10 aqui.
[0288]Camundongos transgênicos (Tg) apo(a) foram utilizados para avaliar a eficácia de agentes RNAi de fita dupla com ligantes de N-acetil-galactosamina conjugados in vivo. Camundongos Tg apo(a) (Frazer KA et al. 1995, Nature Genetics 9:424-431) expressam apo(a) humana a partir de um YAC contendo o gene LPA total (proteína apo(a) codificante) com sequências adicionais tanto para 5’ quanto para 3’ (em seguida referido como “camundongos Tg apo(a)”).
[0289]Os agentes RNAi Lp(a) ligados ao respectivos ligantes GalNAc (isto é, (NAG25), (NAG26) ou (NAG27)) foram combinados em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0290]Os agentes RNAi Lp(a) ligados ao respectivos ligantes GalNAc (isto é, (NAG25), (NAG26) ou (NAG27)) na extremidade 5’ da fita senso foram entregues através da injeção SC. No dia 1, uma injeção SC foi administrada nas costas entre os ombros de 200 μl de solução/20 g do camundongo contendo solução salina ou uma dose de 1 mg/kg (mpk) do respectivo agente RNAi (AD03275, AD03341 ou AD03421) em solução salina tamponada. Haviam três (3) camundongos Tg apo(a) por grupo de tratamento.
[0291]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias -1 (pré-dose), 8, 15, 22, 29, 36 e 43. Knockdown foi determinado monitorando-se os níveis de proteína apo(a) circulantes em soro usando um ELISA para apo(a) (Abcam). Para a normalização, o nível de apo(a) para cada animal em um ponto no tempo foi dividido pelo nível de pré-tratamento de expressão naquele animal (neste caso no dia -1) para determinar a razão de expressão “normalizada ao dia -1”. Expressão em um ponto no tempo específico depois foi normalizada ao grupo controle de solução salina dividindo-se a razão “normalizada ao dia -1” para um animal individual pela razão média “normalizada ao dia -1” de todos os camundongos no grupo controle de solução salina. Isto resultou na expressão para cada ponto no tempo normalizado àquela no grupo controle. Erro experimental é fornecido como erro padrão da média.
[0292]Resultados são mostrados na Figura 16. Agente RNAi Lp(a) AD03275, contendo ligante de direcionamento da Estrutura 101 (NAG25), mostrou 82 % de knockdown no nadir (dia 22), e knockdown mantido de 72 % no dia 29. Agente RNAi Lp(a) AD03341, contendo ligante de direcionamento da Estrutura 102 (NAG26), mostrou 87 % de knockdown no nadir (dia 15), entretanto, knockdown no dia 29 foi 45 %, indicando um retorno aumentado aos níveis de apo(a) de pré-dose. Agente RNAi Lp(a) AD03421, contendo ligante de direcionamento da Estrutura 103 (NAG27), mostrou 70 % de knockdown no nadir (dia 15), e knockdown no dia 29 foi de 50 %. Estes dados suportam que a Estrutura 101 (NAG25), Estrutura 102 (NAG26) e Estrutura 103 (NAG27), todos inicialmente mostram atividade de knockdown similar. Entretanto, estes dados também mostram que AD03275 (Estrutura 101 (NAG25)) possui duração superior e mantém knockdown (72 % de knockdown no dia 29) melhor do que a Estrutura 102 (NAG26) e Estrutura 103 (NAG27).
Exemplo 11. Compostos oligoméricos inibidores de expressão Lp(a) (Agentes RNAi de Fita Dupla) Ligados ao Ligante de Direcionamento da Estrutura 101 em Macacos Cynomolgus.
[0293]Cinco agentes RNAi LPA diferentes ligados ao ligante de direcionamento representado pela Estrutura 101 foram preparados para avaliar seu desempenho em primatas cynomolgus (Macaca fascicularis): AD03460, AD03536, AD03851, AD03853 e AD04110.
[0294]Cada fita dos agentes RNAi Lp(a) foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0295]Os ligantes de direcionamento para todos os cinco (5) agentes RNAi Lp(a) foram adicionados à extremidade terminal 5’ da fita senso, usando síntese de fosforamidita não nucleosídica geralmente aqui descrita e conhecida na técnica. O ligante de direcionamento para cada um dos agentes RNAi Lp(a) foi ligado à extremidade terminal 5’ do respectivo agente RNAi usando o seguinte composto fosforamidita: (Estrutura 101d).
[0296]AD03460 e AD03536 incluído ligante de direcionamento (NAG25) conjugado à extremidade 5’ da fita senso do respectivo agente RNAi. (NAG25) possui a mesma estrutura como mostrado no Exemplo 8, acima.
[0297]AD03851, AD03853 e AD04110 continham ligantes de direcionamento (NAG25) conjugados à extremidade 5’ da fita senso do respectivo agente RNAi.
[0298]Amostras de sangue foram tiradas e analisadas quanto os níveis de Lipoproteína(a) no dia 8 e dia 15. Níveis de Lp(a) foram normalizados à média de três valores de pré-dose. Níveis de Lp(a) normalizados são relatados na seguinte tabela:
[0299]Estes dados mostram que knockdown significativo foi obtido em macacos cynomolgus em doses de 2 mg/kg (mpk) de múltiplos agentes RNAi Lp(a) diferentes conjugados ao mesmo ligante de direcionamento da Estrutura 101 aqui.
Exemplo 12: Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão F12 (Agentes RNAi de Fita Dupla) Ligados aos Ligantes de Direcionamento da Estrutura 101 em Macacos Cynomolgus.
[0300]Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (agentes RNAi F12 de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 7: Tabela 7. Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 12.
[0301]Na Tabela 7, acima, (NAG25) representa a mesma estrutura como mostrado no Exemplo 8, acima, e é representado pela Estrutura 101 aqui.
[0302]Cada fita dos agentes RNAi Lp(a) foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 4 aqui.
[0303]O agente RNAi F12 conjugado ao ligante de direcionamento na extremidade 5’ da fita senso foi feita e combinada em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0304]No dia 1, os primatas cynomolgus (Macaca fascicularis) foram injetados subcutaneamente com 3 mg/kg de AD03635. Três (3) macacos foram doseados por grupo de tratamento.
[0305]Amostras séricas de macacos cynomolgus tratados foram tomadas no dia -7 e dia 1 (pré-dose), e nos dias 8, 15 e 22 para monitorar knockdown. Knockdown foi medido quantificando-se os níveis de proteína F12 de cino (cF12) circulantes no soro por um kit ELISA de F12 humana (Molecular Innovations). Os níveis de cF12 para cada animal em um respectivo ponto no tempo foi dividido pelo nível de pré-tratamento (média do dia -7 e dia 1) de expressão naquele animal para determinar a razão de expressão “normalizada à pré-dose”. Erro experimental é fornecido como desvio padrão.
[0306]A Figura 17 mostra os resultados. O agente RNAi F12 ligado a (NAG25) (Estrutura 101 aqui) mostrou knockdown em macacos cynomolgus.
Exemplo 13: Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão Alfa-1 Antitripsina (Agentes RNAi de Fita Dupla) Ligados aos Ligantes de Direcionamento da Estrutura 101 em Camundongos Transgênicos PiZ.
[0307]Para avaliar os agentes RNAi dirigidos ao gene alfa-1 antitripsina (AAT) in vivo, um modelo de camundongo PiZ transgênico (camundongos PiZ) foi utilizado. PiZ mice harbor the human PiZ AAT mutant allele and model human AATD (Carlson et al., Journal of Clinical Investigation 1989).
[0308]Compostos oligoméricos inibidores de expressão AAT (agentes RNAi de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 8: Tabela 8. Compostos oligoméricos inibidores de expressão AAT (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 13.
[0309]Na Tabela 8, (NAG25)s possuem a estrutura química como mostrado no Exemplo 11, acima.
[0310]O agente RNAi AAT foi preparado em um tampão de solução salina farmaceuticamente aceitável e administrado por injeção subcutânea (SC) nas costas entre os ombros de 200 μl de solução/20 g do camundongo aos camundongos PiZ para avaliar knockdown de expressão genética de AAT. Cada camundongo rebeu uma única dose de SC de 5 mg/kg (mpk) de AD04454. Três camundongos foram doseados com o agente RNAi AAT (n = 3).
[0311]Amostras de plasma foram tiradas e analisadas quanto aos níveis de proteína AAT (Z-AAT) nos dias -1, dia 1 (pré-dose), dia 8 e dia 15. Níveis de AAT foram normalizados aos níveis plasmáticos de AAT do dia 1 (pré-dose). Níveis de proteína foram medidos quantificando-se os níveis de Z-AAT humana circulantes no plasma por um kit ELISA.
[0312]Os níveis de AAT (Z-AAT) normalizados médios são mostrados na Figura 18. O agente RNAi AAT ligado ao ligante de direcionamento da Estrutura 101 aqui mostrou knockdown em camundongos transgênicos PiZ.
Exemplo 14: Knockdown F12 em Camundongos de Tipo Selvagem Após a Administração de F12 Compostos Oligoméricos Inibidores de Expressão (Agentes RNAi de Fita Dupla) Ligados aos Ligantes de Direcionamento da Estrutura 101.
[0313]Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (agentes RNAi F12 de fita dupla) foram preparados possuindo as sequências apresentadas na seguinte Tabela 9: Tabela 9. Compostos oligoméricos inibidores de expressão F12 (duplicações de agente RNAi) do Exemplo 14.
[0314]Na Tabela 9, (NAG25) possui a estrutura química como mostrado no Exemplo 8, acima, e é representado pela Estrutura 101 aqui divulgada.
[0315]Cada fita dos agentes RNAi F12 foi sintetizada de acordo com a tecnologia de fosforamidita em fase sólida utilizada na síntese de oligonucleotídeo usando um MerMade96E® (Bioautomation) ou um MerMade12® (Bioautomation), e fitas complementares foram misturadas combinando-se soluções de RNA equimolares (senso e anti-senso) em PBS 0,2x (Solução Salina Tamponada com Fosfato, 1x, Corning, Cellgro) para formar as duplicações, seguindo os métodos geralmente descritos no Exemplo 10 aqui.
[0316]Os agentes RNAi F12 conjugados ao respectivo ligante de direcionamento GalNAc (isto é, (NAG25)) foi combinado em um tampão farmaceuticamente aceitável conforme conhecido na técnica para injeção subcutânea (SC).
[0317]A composição foi entregue através da injeção SC. No dia 1, uma injeção SC foi administrada nas costas entre os ombros de 200 ul de solução/20 g do camundongo contendo solução salina ou uma dose de 3 mg/kg (mpk) de AD03632 em solução salina tamponada. Haviam três (3) camundongos do tipo selvagem por grupo de tratamento. Como mostrado acima, AD03632 inclui a estrutura (NAG25) ligado na extremidade terminal 5’ da fita senso.
[0318]Amostras séricas de camundongos tratados foram tomadas nos dias -1 (pré-dose), 8, 15 22, 29 e 36 para monitorar knockdown. Knockdown foi medido quantificando-se os níveis de proteína F12 de camundongo (mF12) circulantes no soro por uma mF12 internamente desenvolvida alphaLISA® (Perkin Elmer). Níveis de mF12 para cada animal em um respectivo ponto no tempo foram divididos pelo nível de pré- tratamento de expressão naquele animal para determinar a razão de expressão “normalizada à pré-dose”. Expressão em um ponto no tempo específico depois foi normalizada ao grupo controle de solução salina dividindo-se a razão “normalizada ao dia de pré-dose” para um animal individual pela razão média “normalizada ao dia de pré-dose” de todos os camundongos no grupo controle de solução salina. Isto resultou na expressão para cada ponto no tempo normalizado àquela no grupo controle. Erro experimental é fornecido como desvio padrão.
[0319]Resultados a partir deste estudo são mostrados na Figura 19. AD03632, que inclui ligante de direcionamento da Estrutura 101 aqui divulgado, mostra knockdown significativo além de todos os pontos no tempo.
Outras Modalidades
[0320]Deve ser entendido que embora a invenção foi descrita em conjunção com a descrição detalhada desta, a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (33)

1. Ligante de direcionamento ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a estrutura de Fórmula B: Fórmula B, em que n é um número inteiro de 1 a 20; X é O, S ou NH; e a Porção de Direcionamento é selecionada do grupo que consiste em: N-acetil-galactosamina, galactose, galactosamina, N-formil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n- butanoilgalactosamina, e N-iso-butanoilgalactosamina.
2. Ligante de direcionamento ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a seguinte estrutura:, em que n é um número inteiro de 1 a 20 (Estrutura 1).
3. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de direcionamento compreende uma estrutura selecionada a partir de:
4. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a Porção de Direcionamento é, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 6.
6. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 8.
7. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão.
8. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi.
9. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente RNAi é de fita dupla.
10. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente RNAi compreende um ou mais nucleotídeos modificados.
11. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um agente RNAi, em que o ligante de direcionamento é ligado a uma extremidade terminal do agente RNAi.
12. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente RNAi é de fita dupla e o agente RNAi é ligado ao ligante de direcionamento em uma extremidade terminal 5’ de uma fita senso do agente RNAi.
13. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente RNAi é ligado ao ligante de direcionamento através de um grupo fosfato, grupo fosforotioato, ou um grupo fosfonato.
14. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ligante de direcionamento, como definido na reivindicação 1, em que o ligante de direcionamento é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, em que a estrutura do ligante de direcionamento e composto oligomérico inibidor de expressão é representada pela estrutura selecionada do grupo que consiste em: , em que Z inclui ou consiste em um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101a); , em que Z inclui ou consiste em um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura , em que Z inclui ou consiste em um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103a), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi de fita dupla.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente RNAi de fita dupla é ligado ao ligante de direcionamento em uma extremidade 5’ de uma fita senso do agente RNAi.
17. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que possui a estrutura de: , em que n é um número inteiro de 1 a 20 (Estrutura 1d).
18. Composto, de acordo com a reivindicação 17, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que possui a estrutura selecionada do grupo que consiste em: (Estrutura 101d); (Estrutura 102d); e (Estrutura 103d).
19. Composto, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é um estereoisômero de estrutura 101d designado como Composto 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: Composto 10.
20. Uso de um composto oligomérico inibidor de expressão conjugado a qualquer um dos ligantes de direcionamento, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para inibir a expressão de um ácido nucleico alvo em um sujeito.
21. Método in vitro para introduzir um composto oligomérico inibidor de expressão em uma célula de mamífero CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende colocar em contato uma célula de mamífero com o ligante de direcionamento, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ligado ao composto oligomérico inibidor de expressão.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi.
23. Uso do ligante de direcionamento, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou transtorno que se beneficiaria da administração de um composto oligomérico inibidor de expressão em um sujeito em necessidade de tratamento do mesmo.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto oligomérico inibidor de expressão é um agente RNAi.
25. Uso da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou transtorno que se beneficiaria da administração de um composto oligomérico inibidor de expressão em um sujeito em necessidade de tratamento do mesmo.
26. Ligante de direcionamento, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a estrutura de:
27. Ligante de direcionamento, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de direcionamento é ligado ainda a um composto oligomérico inibidor de expressão.
28. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou 26, CARACTERIZADO pelo fato de que é ligado a um composto oligomérico inibidor de expressão, para uso como um medicamento.
29. Ligante de direcionamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou 26, CARACTERIZADO pelo fato de que é ligado a um agente terapêutico, para uso na introdução de um agente terapêutico em uma célula de mamífero, para a inibição de expressão de um ácido nucleico alvo em um sujeito, ou para tratar uma doença ou transtorno que se beneficiaria da administração de um agente terapêutico.
30. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: em que n é um número inteiro de 1 a 20 e Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 1b); em que n é um número inteiro de 1 a 20 e Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor da expressão (Estrutura 1c); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101b); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 101c); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102b); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 102c); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103b); e em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão (Estrutura 103c).
31. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A' é O-, S-, ou NH- (Estrutura 2b); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A' é O-, S-, ou NH- (Estrutura 3b); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A' é O-, S-, ou NH- (Estrutura 4b); em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A' é O-, S-, ou NH- (Estrutura 5b); e em que Z consiste em ou inclui um composto oligomérico inibidor de expressão; A é O ou S; e A' é O-, S-, ou NH- (Estrutura 6b).
32. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em:
33. Ligante de direcionamento ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma estrutura selecionada do grupo que consiste em:
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