BR112017003938B1 - Método para armazenar um ou mais embriões, dispositivo - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos para obter material genético de embriões vegetais enquanto preservam sua viabilidade. nos métodos, a preservação da viabilidade pode ser mantida pela suspensão dos embriões em uma solução aquosa circundada por uma matriz oleosa. o material genético pode ser obtido a partir de uma alíquota da solução aquosa e pode ser usado diretamente para análise molecular, ou uma amplificação do genoma completo pode ser feita antes da análise molecular.

Description

Referências remissivas aos pedidos de depósito correlatos

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido nacional US n° 14/473183, depositado em sexta-feira, 29 de agosto de 2014, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.Referência à listagem de sequências enviada eletronicamente

Antecedentes da invenção

[0002] É prática convencional no melhoramento vegetal o cultivo de plantas a partir de sementes de origem conhecida. As sementes são plantadas em canteiros experimentais, câmaras de cultivo, ou outras condições de cultivo e as plantas geradas das sementes são polinizadas de modo cruzado com outras plantas de origem conhecida ou são autopolinizadas. As sementes resultantes são o fruto da polinização das duas plantas de origem ou da planta autopolinizada e são colhidas, processadas e plantadas para continuar o ciclo de reprodução de plantas. Testes laboratoriais ou de campo específicos podem ser feitos nas plantas, no tecido vegetal, na semente ou nos tecidos da semente de modo a auxiliar ao processo de melhoramento.

[0003] Gerações de plantas baseadas em cruzamentos conhecidos ou autopolinizações são plantadas e então testadas para ver se estas linhagens ou variedades estão se movendo em direção a características que são desejáveis no mercado. Exemplos de características desejáveis incluem, mas não se limitam a, rendimento aumentado, homozigosidade melhorada, resistência recém-conferida ou melhorada e/ou tolerância a herbicidas específicos e/ou pestes e patógenos, teor de óleo melhorado, teor de amido alterado, composição nutracêutica, tolerância à secura e intensificação das características de base morfológica específicas.

[0004] Conforme pode ser entendido e tal como é bem conhecido na técnica, estes experimentos podem ser em grande escala Eles envolvem uma enorme força de trabalho de cientistas a pessoal de campo para projetar, plantar, manter e conduzir os experimentos, que podem envolver milhares ou dezenas de milhares de plantas individuais. Eles também exigem recursos de terra substanciais. Canteiros ou estufas podem ocupar milhares de acres de terra. Isto não apenas ocupa grandes quantidades de terra por meses enquanto as plantas germinam, crescem, e produzem sementes, e durante este tempo elas podem ser testadas no laboratório ou no campo, mas então as enormes quantidades de sementes devem ser etiquetadas individualmente, coletadas e processadas.

[0005] Uma complicação adicional é que muitos dos experimentos são invalidados. Foi relatado na literatura que algumas empresas descartam 80 a 90% das plantas logo no início do experimento. Dessa forma, muito da terra, dos recursos laborais e de materiais gastos para o cultivo, colheita e processamento pós-colheita são por fim desperdiçados para uma grande porcentagem das sementes.

[0006] As pressões com a cronologia também são um fator. Avanços significativos no melhoramento vegetal têm colocado pressão sobre empresas de sementes para avançar rapidamente as linhagens ou variedades de plantas que têm mais traços e características e características melhores. Os melhoristas de plantas e trabalhadores associados estão, então, sob pressão crescente para processar de modo mais eficiente e eficaz estas gerações e fazer seleções significativas logo no início do processo de melhoramento.

[0007] Portanto, surgiu movimento para a identificação precoce de traços de interesse através de testes laboratoriais de sementes. A semente é testada de forma não destrutiva para derivar informações genéticas, bioquímicas ou fenotípicas. Se traços de interesse forem identificados, a semente selecionada a partir de plantas específicas é usada para experimentos e avanços adicionais ou para produzir quantidades comerciais. O teste da semente evita a necessidade de cultivar a semente em plantas imaturas, que são, então, testadas. Isto economiza tempo, espaço e esforços. Se eficaz, a identificação precoce dos traços desejáveis em sementes pode levar a uma grande redução na quantidade de terra necessária para testes experimentais, na quantidade de sementes que precisam ser testadas e na quantidade de tempo necessário para obter as informações necessárias para fazer decisões sobre ir a frente. Por exemplo, ao invés de milhares de plantio e o subsequente manuseio e processamento de todas estas plantas, uma fração de acres e plantas podem ser suficientes. Entretanto, pelo fato de o tempo ainda ser importante, está ainda é uma tarefa substancial porque mesmo tal redução envolve processamento, por exemplo, de milhares de sementes por dia.

[0008] Um método convencional para tentar fazer testes não letais em sementes é o seguinte: uma única semente de interesse é mantida com alicates acima de uma folha de papel colocada sobre uma superfície; uma pequena broca é usada para perfurar um pequeno local na semente; os detritos são removidos pela broca e coletados sobre uma folha de papel; o papel é levantado; e os detritos são transferidos para um tubo de ensaio ou outro recipiente para subsequente análise laboratorial. Este método pretende ser não letal para a semente. Entretanto, o processo é lento e seu sucesso e efetividade dependem muito da atenção e da precisão do profissional. Cada semente individual deve ser selecionada manualmente e segurada pelos alicates. A perfuração também é manual. Deve-se tomar cuidado com a perfuração e o manuseio dos detritos. Recipientes individuais, por exemplo, tubos de teste individuais, devem ser então manuseados e marcados ou rastreados e identificados de outro modo. Adicionalmente, os alicates e a broca devem ser limpos entre o teste de cada semente. Pode haver um risco substancial de contaminação pelo transporte de semente para semente e pelo manuseio manual. Além disso, muitas vezes é desejável obter material de sementes de um certo tecido fisiológico da semente. Por exemplo, com a semente de milho, pode ser desejável genotipar o endosperma. Nestes casos, não é trivial, mas é demorado e difícil, segurar manualmente uma pequena semente de milho de forma tal a permitir ao endosperma ser orientado para ser exposto para perfuração. O teste de outras estruturas da semente, como o germe da semente é, de preferência, evitado porque a remoção deste material destas regiões da semente afeta negativamente as taxas de germinação. Algumas vezes é difícil obter uma quantidade útil de material com este método.

[0009] Um outro exemplo de obtenção não letal de tecido de semente de milho para análise laboratorial é revelado em V. Sangtong, E. C. Mottel, M. J. Long, M. Lee, and M. P. Scott, Serial Extraction of Endosperm Drillings (SEED)—A Method for Detecting Transgenes and Proteins in Single Viable Maize Kernels, Plant Molecular Biology Reporter 19: 151-158, junho de 2001, que está aqui incorporado a título de referência. Ele descreve o uso de um moedor giratório de mão para moer partículas, chamadas “perfurações,” do grão e coleta das partículas para testar a presença de certos genes. Entretanto, este método também exige que se segure e oriente manualmente cada semente individual em relação ao triturador. Ele também é demorado e pouco prático. Ele também depende da perícia do trabalhador. Este método levanta questões relacionadas à velocidade, precisão, se uma quantidade útil de material é obtida, e contaminação O triturador deve ser muito bem limpo entre os grãos de modo a evitar contaminação.

[0010] Conforme mostrado por estes exemplos, os presentes métodos de análise de sementes convencionais usados em análises genéticas, bioquímicas ou fenotípicas exigem que ao menos uma parte da semente seja removida e processada. Ao remover parte do tecido da semente, vários objetivos precisam ser satisfeitos. Esses podem incluir um ou mais dos seguintes objetivos:(a) manter a viabilidade da semente após a coleta do tecido da semente, caso seja necessário.(b) obter ao menos uma quantidade mínima necessária de tecido, sem afetar a viabilidade.(c) obter tecido de um local específico na semente, frequentemente exigindo a capacidade de orientar a semente em uma posição específica. (d) manter um determinado nível de produtividade, por motivos de eficiência,(e) reduzir ou praticamente eliminar a contaminação e(f) permitir o rastreamento de tecidos separados e a correlaçãodeles com as sementes, das quais os tecidos foram obtidos.(a) Viabilidade

[0011] Com relação à manutenção da viabilidade da semente, pode ser crítico em alguns casos, que o método e o aparelho para remoção do tecido da semente não danifique a semente de forma tal que a viabilidade da semente seja reduzida. É frequentemente desejável que tal análise seja não letal para a semente, ou ao menos resulte em uma probabilidade substancial de que a semente germine (por exemplo, não ocorra uma redução significativa no potencial de germinação) para que ela possa ser cultivada em uma planta madura. Para algumas análises, a viabilidade da semente não precisa ser mantida, e neste caso, quantidades maiores de tecido podem ser frequentemente consideradas. A necessidade de viabilidade da semente dependerá do uso pretendido das sementes.(b) Quantidade de tecido

[0012] É desejável obter uma quantidade útil de tecido. Para ser útil, ela deve estar acima de uma certa quantidade mínima necessária de modo a se fazer um dado teste e obter umresultado significativo. Diferentes testes ou ensaios exigem diferentes quantidades de tecido. Pode ser igualmente importante evitar pegar tecido demais para evitar reduzir o potencial de germinação de uma semente, o que pode ser indesejável. Portanto, é desejável que o aparelho e os métodos para remover o tecido da semente permitam uma variação na quantidade de tecido retirado de qualquer dada semente.(c) Localização do tecido

[0013] Uma quantidade útil de tecido também pode envolver a precisão da localização do tecido. Por exemplo, em algumas aplicações, o tecido deve vir somente de um certo local da semente ou de um tecido específico. Adicionalmente, é difícil manusear pequenas partículas como muitas sementes. Também é difícil posicionar e orientar a semente com precisão. Em uma semente de milho, por exemplo, pode ser importante testar o tecido do endosperma, e orientar a semente de milho para remoção ótima do tecido do endosperma. Portanto, é desejável que o aparelho e os métodos para remover o tecido da semente sejam adaptados para permitir uma remoção local-específica, que pode incluir métodos de orientação específico da semente.(d) Produtividade

[0014] Um aparelho e uma metodologia para a remoção de tecido da semente deve considerar o nível de produtividade quesustenta o número necessário de tecidos a serem retirados rapidamente. Por exemplo, algumas situações envolvem a potencial necessidade de testar milhares, centenas de milhares ou até mesmo milhões de sementes por ano. Tomando-se o exemplo hipotético de um milhão de sementes por ano, e uma semana de trabalho de 5-dias, seriam necessários quase quatro mil testículos por dia para cada dia de trabalho de um ano. É difícil satisfazer esta demanda com métodos de menor produtividade. Consequentemente, métodos de maior produtividade, automáticos ou até mesmo semiautomáticos para a remoção de tecido de semente podem ser desejáveis.(e) Evitando contaminação

[0015] É desejável que um aparelho e uma metodologia para remoção do tecido da semente não sejam propensos a contaminação cruzada de modo a manter a pureza para procedimentos de testes analíticos subsequentes. Isto pode envolver não apenas a precisão da localização do tecido, de modo que o tecido de um dado local não seja contaminado com tecido de um local diferente, mas também métodos envolvidos na remoção e no manuseio do tecido a ser testado, assegurando que não haja contaminação.(f) Rastreamento do tecido a ser testado

[0016] O processamento eficiente das sementes e do tecido removido das sementes apresenta uma variedade de desafios, especificamente quando é importante fazer o acompanhamento de cada semente, do tecido removido dela e de sua correlação uma com a outra ou com outros tecidos. Consequentemente, é desejável que aparelhos e métodos para a remoção e teste de tecidos permitam um fácil rastreamento da semente e do tecido removido dela.

[0017] As tecnologias de testes de semente convencionais não abordam estas necessidades de forma suficiente, resultando em pressões nos recursos de capital e laborais e, dessa forma, ilustram a necessidade de um aprimoramento no estado da técnica. Os métodos atuais têm relativamente baixa produtividade, têm risco substancial de contaminação cruzada, e tendem a ser inconsistentes pois dependem de manuseio, orientação e remoção manual significativas do tecido da semente. Isto pode afetar o tipo de tecido retirado da semente e a probabilidade de que a semente germine. Existe uma necessidade de eliminar os recursos que os métodos atuais exigem para a limpeza entre a remoção de porções individuais do tecido da semente. Existe uma necessidade de reduzir ou minimizar a contaminação cruzada entre porções de tecido únicas a serem testadas por transporte ou outros motivos, ou qualquer contaminação a partir de qualquer fonte de qualquer outro tecido. Também há uma necessidade por mais confiança e precisão. Consequentemente, existe uma necessidade por metodologias e seus aparelhos correspondentes, os quais forneçam remoção e teste do tecido da semente e satisfaçam um ou mais dos seguintes objetivos:(a) manter a viabilidade da semente após remoção do tecido dasemente.(b) obter ao menos uma quantidade mínima necessária de tecido,sem afetar a viabilidade.(c) obter tecido de um local específico na semente.(d) manter um determinado nível de produtividade, por motivos de eficiência.(e) reduzir ou praticamente eliminar a contaminação.(f) permitir o rastreamento de tecidos separados e a correlaçãodeles com as sementes, das quais os tecidos foram obtidos.

[0018] Alguns destes objetivos podem ser conflitantes e até mesmo antagônicos. Por exemplo, a obtenção de uma quantidade útil de tecido enquanto se mantém a viabilidade da semente exige pegar algum tecido da semente, mas não muito. Além disso, metodologias de alta produtividade envolvem operações rápidas, mas podem ser acompanhadas por reduções na precisão e maior risco de contaminação, de modo que os métodos devem ser feitos mais lentamente do que é tecnicamente possível de modo a superar as limitações. Estes múltiplos objetivos, portanto, existiram na técnica e não foram satisfatoriamente satisfeitos ou equilibrados pelos métodos e aparelhos atualmente disponíveis. Existe uma necessidade na técnica de superar os tipos de problemas descritos acima de modo que o número máximo de objetivos seja obtido em qualquer dada modalidade.

Sumário

[0019] A invenção inclui métodos para analisar o material de origem vegetal, e especificamente, tecido de semente, enquanto preserva a viabilidade da semente ou do embrião (isto é, pode formar uma planta). O método pode incluir as etapas de coletar material celular liberado de um ou mais embriões; obter material genético como DNA do material celular liberado; executar uma análise molecular do material genético; e germinar ao menos um dos ditos um ou mais embriões. O um ou mais embriões podem ser imaturos. Em uma modalidade, o material celular liberado é coletado de um embrião por agitação do embrião em um meio não destrutivo como água ou outra solução aquosa. Em algumas modalidades, o DNA pode ser obtido a partir do material celular liberado por exposição do material celular liberado ao frio e então ao calor, seguido de agitação; as etapas podem ser repetidas. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido a partir do material celular liberado por aquecimento do material celular liberado e agitação; as etapas podem ser repetidas. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido pela incubação do material celular liberado com uma enzima; a enzima pode ser Viscozyme® L, um complexo multienzimático contendo uma ampla faixa de carboidrases, incluindo a arabanase, celulase, β-glucanase, hemicelulase e xilanase. (Ver o catálogo de produtos da Sigma Aldrich). Em ainda outras modalidades, o DNA pode ser obtido com uso de técnicas de extração de DNA, como, por exemplo, mas não se limitando ao uso de partículas magnéticas que se ligam ao material genético ou qualquer método conhecido pelo versado na técnica.

[0020] Os métodos da invenção incluem obter material genético a partir de embriões e executar uma análise molecular do material genético enquanto se preserva a capacidade de os embriões germinarem. Em algumas modalidades, os embriões são suspensos em uma solução aquosa circundada por uma matriz de um ou mais óleos. De preferência, pelo menos um dentre esses um ou mais óleos tem uma densidade maior do que a da solução aquosa. O um ou mais embriões podem ser imaturos. Em algumas modalidades, os agentes antimicrobianos e/ou meios de crescimento mínimos podem ser adicionados à solução aquosa. Em algumas modalidades, os embriões podem ser armazenados em condições de frio e/ou escuro para evitar a germinação prematura. Em uma modalidade preferencial, os embriões são armazenados a uma temperatura de cerca de 4°C. Em algumas modalidades, os embriões podem ser transferidos para fins de armazenamento prolongado. Em outras modalidades, os embriões podem ser transferidos para o meio de germinação, e um ou mais dos embriões podem ser germinados. Em ainda outras modalidades, uma alíquota da solução aquosa pode ser removida, material genético pode ser obtido do material celular na alíquota e o material genético pode ser usado para análise molecular (por exemplo, para genotipar os embriões armazenados). A análise molecular pode ser genotipagem, que pode ocorrer por meio de: detecção de polimorfismo de nucleotídeo único, identificação de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, detecção polimórfica aleatória amplificada, detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado, reação em cadeia de polimerase, sequenciamento de DNA, sequenciamento de genoma inteiro, sondas de oligonucleotídeo específicas de alelo ou hibridização de DNA para micromatrizes ou esferas de DNA. A amplificação do genoma completo pode ser feita antes da análise molecular. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas descritas acima podem ser automatizadas.

[0021] Os métodos da invenção incluem obter DNA embrionário (quer a dita obtenção de DNA embrionário inclua extração ou não), armazenar o embrião a partir do qual o DNA foi extraído de uma forma que preserve a capacidade de o embrião germinar e crescer como uma planta, genotipar o embrião com o uso do DNAembrionário, e determinar se o embrião será germinado ou cultivado (isto é, selecionar) ou descartar o embrião com base no seu genótipo (isto é, contrasseleção). Um embrião que é selecionado para germinar e ser cultivado com base no seu genótipo pode ser cultivado como uma planta e fenotipado, usado para melhoramento genético, ou usado para aumentar o volume de sementes com o mesmo genótipo. Em modalidades preferenciais, uma ou mais etapas do método podem ser automatizadas.

[0022] Uma modalidade da invenção permite a determinação dalinhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; centrifugação da solução homogenizada para obter um sobrenadante; e execução de uma análise molecular usando DNA do sobrenadante. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A dissociação e homogeneização do tecido do pericarpo pode ser feita usando-se um dissociador de células (como o gentleMACS™, da Miltenyi Biotec). O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0023] Uma outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais partículas sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; extração do DNA de células contidas na solução homogenizada; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de dissociação e homogenização pode ser executada usando um dissociador de células (como gentleMACS™, Miltenyi Biotec). A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract-N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0024] Uma outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais partículas sementes; lavagem do tecido da semente materna; ruptura do tecido da semente materna em nitrogênio líquido; extração do DNA do tecido da semente materna rompido; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract-N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0025] Uma outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais partículas sementes; lavagem do tecido da semente materna; extração do DNA diretamente do tecido da semente materna lavado; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser feita com o uso de Extract-n-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0026] Em qualquer das modalidades mencionadas acima, a análise molecular pode ser genotipagem. Quando o tecido da semente materna de mais de uma réplica de semente é coletado, um genótipo de consenso pode ser obtido.

Breve descrição dos desenhos

[0027] Nas Figuras 1 a 11, triângulos invertidos representam amostras tendo um estado homozigoto; os triângulos apontando para cima representam amostras que tem o outro estado homozigoto; triângulos apontando para a esquerda representam o controle heterozigoto; os círculos representam dados ausentes ou controle negativo; e os losangos representam calos não quantificáveis. Quanto mais apertada estiver a aglomeração de pontos ao longo de uma linha paralela a qualquer um dos eixos, menor é a variação com o método sendo testado.

[0028] A Figura 1 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas, e centrifugação) em cada um dentre quatro volumes de incubação diferentes (10 μL:, 20 μL, 50 μL, e 75 μL).

[0029] A Figura 2 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL.

[0030] A Figura 3 mostra os dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido a partir de choque térmico frio- quente, choque térmico, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método de Sbeadex. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL.

[0031] A Figura 4 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL.

[0032] A Figura 5 mostra os dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido a partir de choque térmico frio- quente, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método de Sbeadex. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um volume de incubação de 50 μL.

[0033] A Figura 6 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL.

[0034] A Figura 7 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam três tratamentos (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um volume de incubação de 150 μL.

[0035] A Figura 8 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 150 μL.

[0036] A Figura 9 mostra dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido com o tratamento térmico frio-quente ou sem nenhum tratamento após lavagem do material celular liberado. Os dados representam três tratamentos (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um dentre dois volumes de incubação (50 μL e 100 μL).

[0037] A Figura 10 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL.

[0038] A Figura 11 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento de choque térmico frio- quente e amplificação do genoma completo (usando o kit REPLI-g Single Cell) para obter rendimento suficiente do DNA antes da genotipagem. Os dados representam quatro tratamentos (apenas incubação; turbilhonamento na velocidade 3 durante 5 segundos; turbilhonamento na velocidade 10 durante 5 segundos; e turbilhonamento na velocidade 10 durante 30 segundos) em um volume de incubação de 10 μL.

[0039] A Figura 12 retrata os resultados de germinação para embriões de uma primeira linhagem de milho, sendo que os embriões foram armazenados com o uso dos métodos da invenção.

[0040] A Figura 13 retrata os resultados de germinação para embriões de uma segunda linhagem de milho, sendo que os embriões foram armazenados com o uso dos métodos da invenção.

[0041] A Figura 14 representa as etapas envolvidas no desprendimento do tecido do pericarpo.

[0042] A Figura 15 compara o ensaio de genotipagem ILLUMINA® GoldenGate® usando DNA obtido a partir de a) o método de extração de DNA com CTAB convencional com o uso de múltiplas sementes e b) o método de extração de DNA SBEADEX® com o uso de uma semente (com lavagem de tecido) seguido da amplificação do genoma total.

[0043] A Figura 16 demonstra que dados de marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de um único pericarpo.

[0044] A Figura 17 demonstra o alto grau de similaridade entre o genótipo medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido.

Descrição detalhada das modalidades preferenciais

[0045] A genotipagem de embriões ou outras partes da semente permite a caracterização molecular precoce no desenvolvimento da planta, permitindo que seleções de um genótipo desejado sejam feitas semanas ou meses antes do que outros métodos, por exemplo, fenotipagem ou genotipagem da planta. Consequentemente, os recursos podem ser focados mais cedo nos embriões que possuem a maior probabilidade de se desenvolverem como plantas desejáveis. Técnicas para caracterizar geneticamente o tecido da semente podem aprimorar muito um programa de melhoramento genético molecular e eliminar grandes esforços e recursos por permitir aos melhoristas só cultivarem plantas com a genética desejada. Além disso, a capacidade de caracterizar geneticamente um embrião com segurança, sem impedir sua capacidade de germinar, particularmente em um embrião imaturo, pode reduzir substancialmente a quantidade de tempo necessária entre as gerações de plantas.

[0046] A genotipagem não destrutiva em um programa de melhoramento vegetal pode exigir uma ou mais das seguintes etapas:1. Separar fontes vegetais viáveis de outro material de origem vegetal;2. Preservar as fontes vegetais viáveis;3. Obter material genético correspondente a múltiplas fontes vegetais viáveis, porém mantendo a viabilidade das múltiplas fontes vegetais viáveis;4. Obter material genético para caracterização molecular;5. Caracterizar molecularmente o material genético a partir demúltiplas fontes vegetais viáveis;6. Selecionar uma ou mais fontes vegetais viáveis com base nascaracterizações moleculares; e7. Cultivar as fontes vegetais viáveis selecionadas.

[0047] As fontes vegetais viáveis podem ser sementes, embriões vegetais, tecido vegetal ou plantas inteiras, por exemplo. Mais tipicamente, as fontes vegetais viáveis são capazes de se desenvolverem em plantas, embora não necessariamente. O material genético pode ser bruto, isto é, misturado com outras porções de tecido vegetal, incluindo materiais celulósicos e proteicos, ou pode ser purificado (como, por exemplo, por métodos de extração de DNA conhecidos do versado na técnica). O material genético pode ser tirado diretamente das fontes vegetais viáveis, ou pode ser tirado de outro material de origem vegetal. A etapa de preservação pode incluir manter as fontes vegetais viáveis de uma forma que preserve a capacidade de ser cultivada em uma planta. A etapa de preservação pode incluir manter as fontes vegetais viáveis de uma forma que impeça a germinação. A etapa de caracterização molecular pode envolver genotipagem, sequenciamento genético, sequenciamento de RNA, detecção de marcador de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, detecção de polimorfismo de nucleotídeo único, amplificação do genoma inteiro, detecção de uma proteína específica, medição do teor de óleo, medição do teor de proteína, ou qualquer outra análise molecular que possa servir como uma base para selecionar ou rejeitar fontes vegetais viáveis. A etapa de cultivo pode envolver quaisquer meios para cultivar plantas, inclusive plantar em um campo ou uma estufa, cultivar hidroponicamente, cultivar aeroponicamente ou qualquer outro método de cultivo de uma planta. Em algumas modalidades, a planta é cultivada até a maturidade e produz pólen e/ou sementes. Em algumas modalidades, um ou mais etapas são automatizadas.

Separação de fontes vegetais viáveis.

[0048] Em uma modalidade que envolve milho, as coberturas dos grãos de milho são fatiadas enquanto ainda estão presas à espiga do milho. As coberturas dos grãos do milho são tipicamente a parte mais distante do grão em relação ao embrião, que está mais próximo da ponta do grão, que está preso à espiga. Cada embrião pode, então, ser removido, por exemplo, com o uso de uma pequena espátula ou qualquer outro dispositivo adequado. Em uma modalidade, este processo é automatizado com o uso de um fatiador de cobertura robótico, uma espátula manipulada roboticamente, e uma plataforma de visão de máquina para o corte preciso e controle da remoção do embrião.

[0049] Em uma outra modalidade, os grãos de milho podem ser removidos da espiga antes da remoção do embrião. Os grãos podem, então, ser orientados da mesma forma, por exemplo, por flutuação dos grãos em água ou em uma solução. Os grãos podem, então, ser imobilizados, com preservação de suas orientações, por exemplo, por drenagem dos mesmos em um recipiente com múltiplos poços, cada poço contendo um grão orientado. Pedaços pequenos das pontas dos grãos podem, então, ser removidos; de preferência, pedaços suficientemente pequenos da ponta dos grãos são removidos para evitar danificar os embriões. Os embriões podem, então, ser extraídos pressionando-se suavemente os grãos desde os lados de cobertura dos grãos.

[0050] Após a remoção do embrião, cada embrião pode ser colocado em um recipiente com múltiplos poços, sendo que a localização de cada embrião em cada poço é registrada, associada, ou correlacionada com a localização do material genético obtido em uma etapa subsequente.

Preservação das fontes vegetais viáveis

[0051] Quando as fontes vegetais viáveis são sementes, a preservação das sementes pela quantidade de tempo necessária para executar uma análise molecular tipicamente não exige atenção específica. Quando as fontes vegetais viáveis são embriões, no entretanto, cuidados especiais devem ser tomados para preservar a viabilidade. Os embriões podem ser armazenados em uma placa de múltiplos poços, onde cada poço corresponde a um poço no qual o tecido extraído a ser testado é colocado.

[0052] Em um método preferencial, os embriões são suspensos em uma solução aquosa, circundada por uma matriz de um ou mais óleos. Óleo com uma densidade inferior à da água cobrirá o(s) embrião/embriões na solução aquosa, enquanto o óleo que tem umadensidade maior que a água irão sustentar o(s) embrião/embriõesna solução aquosa. Em algumas modalidades, o um ou mais embriões é/são suspenso(s) em uma solução aquosa, circundada por uma matriz de dois ou mais óleos, sendo que pelo menos um dos dois ou mais óleos é mais denso que a solução aquosa e pelomenos um dos dois ou mais óleos é menos denso do que a soluçãoaquosa, adicionalmente sendo que a solução aquosa é circundada pelo óleo, que é mais denso do que a solução, e o óleo, o qual é menos denso que a solução aquosa. Em algumas modalidades, osagentes antimicrobianos e/ou meios de crescimento mínimos podemser adicionados à solução aquosa. Em algumas modalidades, os embriões podem ser armazenados em condições de frio e/ou escuro para evitar a germinação prematura. Em uma modalidade preferencial, os embriões são armazenados a uma temperatura de cerca de 4°C. Em algumas modalidades, os embriões podem ser transferidos para fins de armazenamento prolongado. Em outras modalidades, os embriões podem ser transferidos para o meio de germinação, e os embriões podem ser germinados. Em uma modalidade preferencial, uma alíquota da solução aquosa pode ser removida; material genético pode ser obtido a partir do material celular na alíquota; e o material genético pode ser usado para análise molecular (por exemplo, para genotipar os embriões armazenados).

[0053] O óleo de alta densidade que pode ser usado neste método inclui, mas não se limita, aos compostos perflúor com 12 compostos (por exemplo, os óleos KRYTOX® de baixa viscosidade da DuPont). O óleo de baixa densidade que pode ser usado nesse método inclui, mas não se limita, ao fenilmetilpolissiloxano. Outros óleos não tóxicos conhecidos dos versados na técnica podem ser usados em vez de ou juntamente com estes compostos.

Obtenção do material genético.

[0054] A invenção inclui muitas opções diferentes para a etapa de obter o material genético (por exemplo, DNA). O material genético pode ser obtido a partir de qualquer “material celular liberado”, que se refere a qualquer material de origem vegetal remanescente após a separação das fontes vegetais viáveis. O material celular liberado pode incluir material de embrião e/ou de endosperma. Se informações genéticas para a planta parental forem desejadas, o material genético pode ser obtido a partir do pericarpo.

[0055] Em uma modalidade, um pequeno pedaço do escutelo pode ser cortado com o uso de qualquer método conhecido na técnica, inclusive corte com uma lâmina ou laser. De preferência, o pedaço do escutelo é suficientemente pequeno de modo a não comprometer a viabilidade do embrião. O embrião e o pedaço correspondente de escutelo podem, então, ser colocados em recipientes separados com poços, nos quais o poço contendo o embrião no recipiente para embrião e o poço contendo o escutelo correspondente no recipiente para escutelo são correlacionados de modo que quaisquer informações obtidas do escutelo sejam associadas com o embrião a partir do qual o tecido de escutelo foi obtido.

[0056] Em uma outra modalidade, quando uma espátula (ou qualquer outro implemento ou dispositivo usado para cortar um pedaço do escutelo) for usada para remover o embrião de uma semente, a espátula pode, então, ser imersa em um poço em um recipiente que corresponde a um poço em um segundo recipiente que contém o embrião. De preferência, a espátula é imersa em um poço contendo uma solução aquosa. Quando a espátula é usada para remover o embrião, quantidades suficientes de tecido de endosperma permanecem sobre a espátula (isto é, material celular liberado), e a espátula não precisa entrar em contato com o grão a partir do qual o embrião foi removido após a extração do embrião. A espátula pode ser imersa no poço contendo solução aquosa imediatamente após o embrião ter sido removido. Se a mesma espátula for usada para a remoção de múltiplos embriões e/ou tecido de endosperma, ela será, de preferência, limpa entre cada uso para remover qualquer material genético que poderia levar à contaminação.

[0057] Em uma outra modalidade, o embrião pode ser lavado, por exemplo, com água, para remover qualquer endosperma preso ao embrião. O embrião lavado pode, então, ser imerso em água fresca ou outra solução aquosa e agitado para remover um pequeno número de células embrionárias do embrião para dentro da água fresca ou outra solução aquosa (isto é, material celular liberado). O embrião pode, então, ser transferido para um recipiente com vários poços, e alguma ou toda a água fresca ou solução aquosa contendo o pequeno número de células embrionárias pode ser transferida para um poço correlacionado em um recipiente separado com múltiplos poços.

[0058] Em uma outra modalidade que não necessariamente exige extração do embrião ou outra separação das fontes vegetais viáveis, um pedaço do revestimento externo de um grão de milho, o pericarpo, pode ser cortado de modo a conduzir uma análise molecular da planta parental. Nessa modalidade, os grãos podem ser imersos em água antes que sejam feitos cortes no pericarpo. A parte posterior do grão (mais distante do embrião) pode ser cortada com uma lâmina afiada, conforme mostrado na Figura 14a. De preferência, a lâmina é esterilizada após o primeiro corte antes que a borda externa do grão possa ser cortada com a lâmina afiada, tendo início a partir de uma extremidade do primeiro corte, ao redor da borda do grão e para baixo até a outra extremidade do primeiro corte, conforme mostrado na Figura 14b. Um fórceps esterilizado pode ser usado para desprender o tecido do pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 14c. Embora o corte possa ser feito no lado frontal do grão (mais próximo ao embrião), o corte é, de preferência, feito na parte posterior, para reduzir a possibilidade de que o pericarpo seja contaminado com o tecido do endosperma. Para reduzir ainda mais a possibilidade de contaminação, o tecido do pericarpo pode ser lavado após ser excisado. O pericarpo pode ser colocado na cavidade de um recipiente e a semente a partir da qual o pericarpo foi removido (ou embrião dessa semente) pode ser colocada em uma cavidade correspondente de um recipiente separado. Como será compreendido pelos versados na técnica, há outros métodos comparáveis para isolar o tecido do pericarpo, e, em algumas modalidades da invenção, o DNA do pericarpo pode ser extraído sem remoção do pericarpo.

[0059] O tecido a ser analisado é, de preferência, associado ou correlacionado à sua fonte vegetal viável correspondente, de modo que a fonte vegetal viável correspondente possa ser selecionada com base nos resultados da análise de tecidos.

Obtenção de material genético para caracterização molecular

[0060] A fim de que o material genético seja analisado, ele deve ser isento de células, de modo a ser acessível para análise molecular. Isto pode envolver tratamentos físicos, como exposição ao frio-ao calor ou apenas ao calor, incubação com enzimas ou até mesmo técnicas de extração de DNA (embora seja importante notar que a extração não é uma etapa necessária para a obtenção de DNA por análise molecular). Essencialmente, qualquer processo que rompe o tecido e quebra as células abertas, liberando, assim, o DNA, que pode ser usado para caracterização molecular, pode ser usado nos métodos aqui fornecidos.

[0061] Em algumas modalidades, o DNA pode ser obtido a partir do material celular liberado por exposição do material celular ao frio-ao calor ou ao calor, agitação da mistura e, opcionalmente, por repetição. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido pela incubação do material celular liberado com uma enzima; a enzima pode ser Viscozyme® L, um complexo multienzimático contendo uma ampla faixa de carboidrases, incluindo a arabanase, celulase, β- glucanase, hemicelulase e xilanase. (Ver o catálogo de produtos da Sigma Aldrich). Em ainda outras modalidades, a obtenção de DNA pode compreender a extração de DNA, como mediante o uso de partículas magnéticas que se ligam ao material genético ou qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Entretanto, não é necessária a extração para obter o DNA.

[0062] Em outras modalidades que envolvem tecido de semente materno como o tecido do pericarpo, o tecido pode ser dissociado com o uso de um dissociador de células (como gentleMACS™, Miltenyi Biotec), opcionalmente seguido de extração de DNA. Em uma outra modalidade, o tecido de semente materno pode ser rompido em nitrogênio líquido antes da extração do DNA. Em ainda outra modalidade, o DNA pode ser extraído diretamente do tecido de semente materno lavado (por exemplo, com o uso de Extract-N-Amp™).

Caracterização molecular do material genético a partir de múltiplas fontes vegetais viáveis

[0063] Nos casos em que o rendimento do DNA obtido a partir de tecido embrionário não é suficiente para algumas análises moleculares (por exemplo, genotipagem de alta densidade), as técnicas de amplificação de genoma inteiro podem ser usadas. O kit REPLI-g da Qiagen, o kit SeqPlex da Sigma-Aldrich ou qualquer outra técnica conhecida pelos versados na técnica pode ser usado para amplificar DNA a partir do tecido embrionário.

[0064] Outras caracterizações moleculares úteis podem envolver o sequenciamento total ou parcial do genoma do tecido extraído da semente, ou com o uso de marcadores moleculares e sondas fluorescentes para genotipagem. A caracterização molecular não precisa focar no genótipo do tecido extraído, mas em vez disso, ela pode medir outras propriedades, como o teor de óleo, a composição de óleo, o teor de proteína ou a presença ou ausência de moléculas particulares no tecido.

[0065] Em uma modalidade preferencial, o material genético é colocado em uma cavidade de uma placa com múltiplas cavidades contendo uma bicamada de óleo, uma camada tendo uma densidade maior do que a água e uma camada com uma densidade menor do que a água. Múltiplas cavidades contêm vários materiais genéticos diferentes. As sondas marcadas fluorescentemente são adicionadas aos materiais genéticos, e a termociclagem para causar a amplificação e a hibridização das sondas é realizada na placa de múltiplas cavidades. As cavidades são irradiadas e a fluorescência é detectada a partir dos marcadores para gerar os dados genotípicos. Alternativamente, o material genético pode ser sequenciado, em parte ou totalmente, na placa de múltiplas cavidades.

Selecionar uma ou mais fontes vegetais viáveis com base nas caracterizações moleculares

[0066] Em um programa de melhoramento genético molecular, as plantas ou plantas em potencial são selecionadas para participar nas gerações subsequentes, com base nos seus genótipos. Tipicamente, isto envolve determinar se a planta herdou uma ou mais características desejáveis indicadas por marcadores genéticos, cuja presença ou ausência pode ser determinada com base na genotipagem. Os melhoristas de plantas selecionam aquelas plantas que têm as características desejadas para participar no melhoramento genético adicional, para realizar cruzamentos puros ou como parte de um processo para criar linhagens puras por meio de técnicas de duplicação de haploides.

Cultivar as fontes vegetais viáveis selecionadas;

[0067] As plantas que são selecionadas com base na presença de características desejáveis, como determinado pelo seu genótipo, podem se desenvolver em plantas maduras, para obter material haploide para criar uma linhagem pura haploide dupla, para gerar consigo mesma ou para gerar com outras plantas e diversificar o germoplasma.

[0068] Em uma modalidade, um genótipo de consenso pode ser derivado pela consideração de dados genotípicos de múltiplas amostras de tecido obtidas a partir de uma ou mais sementes, cada amostra de tecido sendo uma réplica. Em um experimento de genotipagem que identifica múltiplos nucleotídeos nas múltiplas posições em um genoma, não é incomum que um experimento específico falhe na identificação de um ou mais dos nucleotídeos a serem identificados. Dessa forma, identificações ausentes de nucleotídeos para cada posição ausente podem ser observadas em cada uma das amostras. Se a identificação de um nucleotídeo de apenas uma amostra estiver disponível para uma posição de nucleotídeo específica, então, essa identificação de nucleotídeo é designada como um dado de consenso para essa posição. Se duas ou mais identificações de nucleotídeos estiverem disponíveis para uma posição de nucleotídeo específica, então, a maioria das identificações de nucleotídeos para essa posição é designada como um dado de consenso dessa posição. Se não houver uma identificação da maioria para uma posição, essa posição é designada como dado faltante do genótipo de consenso. As probabilidades para a precisão de consenso para uma dada posição de nucleotídeo é dada na Tabela 1 para os casos de 1, 2, 3 e 4 réplicas, onde f representa a taxa de erro na genotipagem (por exemplo, calo marcador).

[0069] Embora os exemplos aqui fornecidos se refiram à obtenção e genotipagem de tecidos de uma monocotiledônea, especificamente de milho, os elementos versados na técnica entenderiam como aplicar os mesmos métodos, ou similares, a outras monocotiledôneas e dicotiledôneas; os métodos podem ser adaptados a qualquer planta. Por exemplo, a planta pode incluir, mas sem se limitar, ao milho, feijão soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, milheto, cana-de- açúcar ou painço amarelo. Adicionalmente, os métodos de genotipagem apresentados na presente invenção podem ser usados para a genotipagem de qualquer tecido vegetal. Os métodos de genotipagem de consenso podem também ser usados para gerar um genótipo de consenso para múltiplas amostras de qualquer material genético obtido a partir de qualquer fonte, sem que se afaste das etapas reveladas.Exemplo 1: Genotipagem do embriãoA. Coleta do material de embrião:

[0070] Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 mL de água estéril. Os embriões do milho foram incubados em um tubo contendo 10 μL, 20 μL, 50 μL, 75 μL ou 150 μL de água estéril durante 10 minutos, 20 minutos ou de um dia para o outro. Verificou-se que os dados de genotipagem adequados podem ser obtidos com qualquer um dos volumes de diluição, e que 10 minutos era um tempo de incubação suficiente. Todos os protocolos de lavagem e incubação dos embriões foram usados com todos os três métodos de coleta de tecido descritos a seguir.

[0071] Método 1: Os tubos contendo os embriões foram agitados batendo levemente 10 vezes e foram, em seguida, decantados por centrifugação em uma centrífuga de bancada durante 5 segundos. A água foi, em seguida, removida de cada tubo para análise. Verificou-se que este método alcançou os melhores resultados para a genotipagem.

[0072] Método 2: Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 mL de água estéril. Os embriões foram incubados em um tubo contendo 50 μL de água estéril durante 10 minutos. A água foi, em seguida, removida do tubo para análise.

[0073] Método 3: Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 mL de água estéril. Os embriões foram incubados em um tubo contendo 50 μL de água estéril durante 10 minutos. Os tubos contendo os embriões foram agitados batendo-se levemente 10 vezes nos mesmos. A água foi, em seguida, removida de cada tubo para análise.B. Métodos para obter DNA:Choque frio-calor:

[0074] O material embrionário obtido usando todos os três métodos descritos acima foi colocado em um congelador a -80°C durante 20 min; ele foi, em seguida, colocado em um termociclador a 100°C durante 10 min, e pipetado para cima e para baixo para misturar. Ao todo, o processo foi repetido duas vezes. As misturas resultantes foram armazenadas a -20°C. Verificou-se que os melhores resultados para a genotipagem foram obtidos a partir do DNA obtido usando esse método.

Apenas choque térmico:

[0075] Os tecidos de embrião foram colocados em um termociclador a 100°C durante 10 min, e pipetados para cima e para baixo para misturar. Ao todo, o processo foi repetido duas vezes. As misturas foram armazenadas a -20°C.

Método enzimático:

[0076] As misturas da etapa anterior foram incubadas em uma estufa a 95°C para remover por evaporação a água restante. 18,0 μL de solução de PBS e 2,0 μL de VISCOZYME® L diluída (disponível comercialmente junto à Sigma-Aldrich; diluído 1:200 em solução de PBS, em pH 7,4; vol. total: 20 μL) foram adicionados, e as misturas foram incubadas a 37°C durante 2 horas. Uma quantidade de 2,0 μL de proteinase k diluída (disponível comercialmente junto à Sigma-Aldrich; diluída 1:20 em solução de PBS, pH 7,4) foi adicionada, e as misturas foram incubadas a 55°C durante 50 minutos, em seguida, aquecida até 95°C durante 10 min. As misturas foram armazenadas a - 20°C.Extração de DNA:

[0077] As misturas dos métodos do exemplo 1B foram incubadas em uma estufa a 95°C para remover por evaporação a água restante. 45 μL de tampão de lise (LGC Genomics) foram adicionados a cada mistura, e cada uma delas foi brevemente centrifugada e incubada a 65°C durante 1 hora. Foi adicionado aos novos tubos 60 μL de tampão de ligação PN, 5 μL de partículas Sbeadex (partículas magnéticas que se ligam ao material genético, que estão disponíveis comercialmente junto à LGC Genomics) seguidopor misturas de lisado, que foram, em seguida, incubadas em temperatura ambiente durante 4 minutos para permitir a ligaçãode DNA às partículas, submetidos brevemente ao vórtice e colocados em uma prateleira magnética para concentrar as esferas. O tampão de lise foi removido e 100 mL de tampão de lavagem PN1 (LGC Genomics) foram adicionados para ressuspender as esferas. A lavagem foi repetida com o uso de 100 μL de tampão de lavagem PN2 (LGC Genomics) seguido por uma lavagem com 100 μL de água pura. 10 μL de tampão de eluição PN foram adicionados, e as misturas foram incubadas a 55°C durante 10 minutos, sob turbilhonamento a cada 3 minutos. O suporte magnético foi usado para concentrar as esferas e o eluído foi transferido para tubos novos e armazenado a -20°C.C. Amplificação do genoma completo

[0078] Quando a amplificação do genoma completo é necessária, o seguinte protocolo foi seguido utilizando o kit celular REPLI- g®Single (disponível comercialmente junto à Qiagen). A amplificação do genoma completo foi realizada para obter um maior rendimento de DNA e para facilitar a detecção dos conjuntos de marcadores de alta densidade.

[0079] 2,5 μL de DNA molde foram combinados com 2,5 μL detampão D1 (disponível comercialmente junto à Qiagen; volume total 5,0 μL) e incubados em temperatura ambiente durante 3 minutos. 5,0 μL de tampão N1 (disponível comercialmente junto à Qiagen; volume total 10,0 μL) foram adicionados, e as misturas foram submetidas ao vórtice e brevementecentrifugadas. Uma mistura mestre contendo 9,0 μL de nuclease isenta de água, 29,0 μL de tampão reacional REPLI-g® (disponível comercialmente junto à Qiagen) e 2,0 μL de DNA polimerase REPLI-g® (disponível comercialmente junto à Qiagen) foi usada por reação para produzir 50,0 μL de volume total. Asmisturas foram testadas em um termociclador usando 30°C durante 8 horas e, posteriormente, 4°C. A quantificação do DNAfoi realizada usando um ensaio Qubit (comercialmente disponível junto à Life Technologies). O produto de DNA foi usado diretamente na etapa de genotipagem.D. Análise molecularAnálise do marcador TAQMAN®

[0080] A análise do marcador foi realizada utilizando os ensaios TAQMAN® (comercialmente disponíveis junto à Life Technologies). O DNA foi diluído até uma concentração alvo de 20 ng/μL. Uma placa de 384 cavidades contendo o DNA foi carregada em um termociclador de PCR em tempo real LC480 e analisada usando o seguinte programa: pré-incubação: 1 ciclo (95°C por 5 minutos); amplificação: 45 ciclos, (-95°C durante 30 segundos, -60°Cdurante 45 segundos (captura única), -72°C durante 1 minuto (captura única); resfriamento: 1 ciclo, (-72°C durante 10minutos, -40°C durante 30 segundos). Os calos foram lidos usando o software LightCycler® LC480 da Roche (disponívelcomercialmente junto à Roche Diagnostics).Resultados

[0081] Todos os métodos anteriormente mencionados produziram resultados de genotipagem aceitáveis. Os dados genotípicos são mostrados nas Figuras 1 a 11 que incluíram dados de todas as permutações dos métodos apresentados neste exemplo. A Figura 1 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas, e centrifugação) em cada um dentre quatro volumes de incubação diferentes (10 μL, 20 μL, 50 μL, e 75 μL) . A Figura 2 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 3 mostra os dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido a partir de choque térmico frio- quente, choque térmico, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método de Sbeadex. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 4 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 5 mostra os dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido a partir de choque térmico frio- quente, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método de Sbeadex. Os dados representam três tratamentos diferentes (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 6 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 7 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam três tratamentos (apenas incubação; incubação e batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cadaum em um volume de incubação de 150 μL. A Figura 8 retrata dadosde genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dados representam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 150 μL. Um dos calos homozigotos estava incorreto. A Figura 9 mostra dados de genotipagem de um marcador usando DNA obtido com o tratamento térmico frio-quente ou sem nenhum tratamento após lavagem do material celular liberado. Osdados representam três tratamentos (apenas incubação; incubaçãoe batidas; e incubação, batidas e centrifugação), cada um em um dentre dois volumes de incubação (50 μL e 100 μL). A Figura 10 retrata dados de genotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento com choque térmico frio-quente. Os dadosrepresentam um tratamento (incubação, batidas e centrifugação) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 11 retrata dados degenotipagem de um marcador com o uso do DNA obtido com o tratamento de choque térmico frio-quente e amplificação do genoma completo (usando o kit REPLI-g Single Cell) para obter rendimento suficiente do DNA antes da genotipagem. Os dados representam quatro tratamentos (apenas incubação;turbilhonamento na velocidade 3 durante 5 segundos; turbilhonamento na velocidade 10 durante 5 segundos; e turbilhonamento na velocidade 10 durante 30 segundos) em um volume de incubação de 10 μL.Exemplo 2: Armazenamento do embrião

[0082] Duas linhas de germoplasma de milho foram selecionadas para testar os impactos do armazenamento de embrião prolongado em uma matriz oleosa sobre as taxas de germinação. Embriões de cada linhagem foram isolados com a mão antes de serem colocados em suas respectivas condições de armazenamento. Todos os embriões foram plaqueados em meio de germinação, para avaliar as taxas de germinação em uma câmara de crescimento controlado. Seis embriões de cada linhagem foram imediatamente plaqueados em meio de germinação, sem qualquer exposição ao armazenamento para agir como um controle para a germinação em uma câmara de crescimento controlado. Setenta e dois (72) embriões de cada linhagem foram isolados e divididos uniformemente em três condições de armazenamento, com um tubo de armazenamento dedicado para cada embrião:Condição de armazenamento 1: 24 embriões foram colocados em50 μL de uma solução aquosa, circundados por duas camadas de óleo com densidades significativamente diferentes, uma com uma densidade significativamente maior do que a água e uma com uma densidade significativamente menor do que a da água.Condição de armazenamento 2: 24 embriões foram colocados em uma gota de solução aquosa de 50 μL com um agente antimicrobiano adicionado, e circundados pelos dois óleos da condição 1.Condição de armazenamento 3: 24 embriões foram colocados em uma gota de meio de crescimento mínimo de 50 μL com um agente antimicrobiano adicionado, e circundados pelos dois óleos da condição 1.

[0083] Todos os tubos foram colocados em um refrigerador a 4 graus centígrados, durante a duração do experimento. Depois de quatro (4) pontos de tempo, 6 embriões de cada linhagem foram removidos das suas condições de armazenamento e foram plaqueados em meio de germinação em uma câmara de crescimento controlada para avaliar as taxas de germinação. Os pontos no tempo foram os seguintes:Ponto de tempo 1: 15 minutos após colocação no armazenamento.Ponto de tempo 2: 1 dia após a colocação em armazenamento.Ponto de tempo 3: 5 dias após a colocação em armazenamento.Ponto de tempo 4: 10 dias após a colocação em armazenamento.

[0084] As taxas de germinação do embrião foram, em seguida, monitoradas para determinar as condições ideais dearmazenamento. Os resultados destes testes são mostrados nas Figuras 12 e 13 (resultados para duas linhagens de milho diferentes). Verificou-se que as taxas de germinação eram excelentes em cada um dos três métodos de armazenamento.Exemplo 3: Genotipagem do pericarpoA. Desprendimento do pericarpo

[0085] Grãos de milho foram removidos da espiga e imersos durante 60 minutos em água deionizada. Uma lâmina de bisturi foi esterilizada com o uso de um esterilizador com microesferas. O bisturi foi usado para cortar o lado posterior das sementes (na direção contrária ao embrião) próximo às pontas, conforme mostrado na Figura 14a. O bisturi foi novamente esterilizado com o uso de um esterilizador com microesferas e resfriado em água estéril. O bisturi foi, então, usado para cortar ao longo da borda externa do grão, conforme mostrado na Figura 14b. O fórceps foi esterilizado em um esterilizador com microesferas e, então, usado para desprender o pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 14c. O tecido do pericarpo de cada grão foi, então, colocado em tubos de microcentrífuga.B. Lavagem do pericarpo

[0086] Três soluções diferentes foram testadas. Os melhores resultados foram obtidos com 1% de solução de dodecil sulfato de sódio (SDS), embora resultados adequados foram alcançáveis com o uso de água e etanol. Um método de lavagem alternativo com o uso de ultrassom também forneceu resultados adequados. O protocolo de lavagem usado começou com a adição de 1 ml de solução de lavagem aos tubos de microcentrífuga, que foram colocados em um inversor durante 1 minuto. A solução de lavagem foi removida e substituída por 1 ml de solução de lavagem fresca, então, os tubos para microcentrífuga foram novamente colocados em um inversor, desta vez, durante 4 minutos. O tecido do pericarpo foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga. O protocolo de sonicação colocou o tecido do pericarpo em um ultrassom durante 1 minuto. O tecido foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga.C. Obtenção de DNA

[0087] Cinco métodos de obtenção de DNA foram testados. Os melhores resultados foram obtidos com o protocolo gentleMACS™ com sobrenadante em água ou TE.

[0088] gentleMACS™/sobrenadante em água ou TE: Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo de gentleMACS™ M. 300 ul de água ou tampão TE foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas no tubo de GentleMACS™ e transferidas para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml. O tuboEppendorf foi então centrifugado a 14.000 rpm durante 2 minutos, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml para análise molecular. Nenhuma extração do DNA foi necessária nesse método.

[0089] GentleMACS™ / SBEADEX® Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo M de gentleMACS™. 300 μl de tampão de lise PN SBEADEX® foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas e incubadas a 65°C durante 1 hora com agitação ocasional. 360 μl de tampão de ligação PN e 30 μl de partículas SBEADEX® foram adicionados a novos tubos Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos com o tecido do pericarpo foram centrifugados e o lisado foi transferido para novos tubos. Esses tubos foram então incubados à temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. Os tubos foram, então, submetidos ao vórtice e, depois, colocados em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 600 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as esferas de vidro foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 600 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 600 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 40 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 20 minutos, e submetidos ao vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as esferas, e o eluato foi transferido para novos tubos e armazenados a -20°C até a caracterização molecular.

[0090] gentleMACS™/Extract-N-Amp™: Neste método, o tecido do pericarpo foi novamente colocado diretamente sobre o rotor de um tubo M gentleMACS™. 300 μl de água esterilizada foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. O homogenizado foi transferido para um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugado a 10.000 rpm durante 1 minuto. O sobrenadante foi removido sem que o pélete do tecido no fundo do tubo fosse tocado. 30 μl de solução de extração/solução de preparação de sementes (kit de PCR de sementes Extract-N-Amp™) foram adicionados e a mistura resultante foi completamente misturada. A mistura foi transferida para tubos de PCR em fileira para uso no termociclador, que foi programado para se manter a 55°C durante 10 minutos, depois, a 95°C durante 3 minutos e, então, para se manter indefinidamente a 4°C. 30 μlde solução B de neutralização foram adicionados.

[0091] Nitrogênio líquido/ SBEADEX®: Maceradores para de tubo de microtubos de 1,5 ml foram colocados em nitrogênio líquido para resfriar. O tecido do pericarpo foi colocado em tubos de microcentrífuga juntamente com os maceradores resfriados e o tubo inteiro foi colocado em nitrogênio líquido. Nitrogênio líquido foi adicionado aos tubos. O tecido do pericarpo foi lentamente e cuidadosamente triturado com o uso do macerador. Os tubos foram ocasionalmente imersos novamente em nitrogênio líquido para manter o tecido frio. Após a trituração, 90 μl de tampão de lise PN foram adicionados a cada tubo, que foram rapidamente brevemente centrifugados e depois incubados a 65°C durante 1 hora. 120 μl de tampão de ligação PN e 10 μl de partículas de SBEADEX® foram adicionadas a novos tubos, e o lisado da etapa de trituração foi adicionado a tubos novos. Esses tubos foram então incubados à temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. As misturas foram brevemente submetidas ao vórtice e colocadas em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 200 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as esferas de vidro foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 200 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 200 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 20 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 10 minutos, e submetidos ao vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as esferas, e o eluato foi transferido para novos tubos e armazenados a -20°C até a caracterização molecular.

[0092] Extract-N-Amp™: Uma mistura mestre de 18 partes desolução de extração e 2 partes de solução de preparação de sementes foi preparada, e 20 μl da solução foram adicionados ao tecido do pericarpo em tubos de PCR em fileira de 0,2 ml. As misturas foram colocadas em um termociclador configurado a 55°C durante 10 minutos, a 95°C durante 3 minutos e, então, a 4°C indefinidamente. 20,0 μl de solução de neutralização B foram adicionados e a porção líquida da mistura foi transferida para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.D. Teste molecular

[0093] Kit de ensaio HS de dsDNA Qubit®: O reagente Qubit® foi diluído em tampão Qubit® em uma razão de 1:200 para fazer uma solução de trabalho. 1 μl dos produtos de PCR da etapa 2B foitransferido para tubos de ensaio Qubit® de 0,5 ml e 199 μl dasolução de trabalho. Os padrões foram produzidos pela adição de 10 a 190 μl de solução de trabalho Qubit®. Os produtos dePCR e os padrões foram submetidos a vórtice durante 2 a 3 segundos e, em seguida, eles foram rapidamente centrifugados. Os tubos foram, então, incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. Os tubos foram, então, inseridos em um fluorímetro Qubit® 2.0 e as leituras foram registradas.

[0094] Amplificação de genoma total (Seqplex): O métodopreferencial para amplificação de genoma total é o método Seqplex que utiliza o kit de amplificação de DNA melhorado Seqplex. Para 1 μl de cada solução de DNA gerada na etapa C foram adicionados 2 μl de tampão de preparação de biblioteca e 11 μl de água pura. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente, incubada em um termociclador a 95°C durante 2 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. Após o resfriamento 1 μl de enzima de preparação de biblioteca foi adicionado. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente e, então, incubada em um termociclador a 16°C durante 20 minutos, a 24°C durante 20 minutos, a 37°C durante 20 minutos, a 75°C durante 5 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. A solução foi brevemente centrifugada. 15 μl dessa solução foram adicionados à 15 μl de mistura de amplificação 5x (A5112), 1,5 μl de DNA polimerase para SeqPlex,42,5 μl de água esterilizada e 1 μl de SYBR Green, diluído a 1:1000. Essa solução foi misturada completamente, e cada mistura reacional foi dividida em cinco alíquotas de 15 μl em uma placa de 384 poços. O termociclo de amplificação começou com uma desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos, seguida de um número suficiente de ciclos para alcançar o platô em 2 a 3 ciclos (tipicamente cerca de 24 ciclos): desnaturação a 94°C durante 15 segundos, 70°C para hibridização/extensão durante 5 minutos, leitura da fluorescência e repetição. Após a ciclagem, a mistura de reação foi mantida a 70°C durante 30 minutos, então mantida a 4°C. Após o resfriamento, as amostras foram purificadas por purificação de PCR QIAquick.

[0095] Amplificação de genoma total (kit de célula única REPLI- g): O tampão de desnaturação D1 foi preparado pela adição de3,5 μL de tampão de reconstituição DLB 12,5 de água livre denuclease. O tampão de neutralização N1 foi preparado através da adição de 4,5 μl de solução de bloqueio e 25,5 μl de águalivre de nuclease. 2,5 μl do tampão de desnaturação foram adicionados a cada alíquota de 2,5 μl da solução de DNA preparada na etapa C. Essa solução foi incubada à temperatura ambiente durante 3 minutos. 5,0 μl do tampão de neutralização N1 foram adicionados, e a solução foi submetida ao vórtice e, em seguida, centrifugada brevemente. A mistura mestre foi preparada com 9,0 de água livre de nuclease, 29,0 μl de tampão de reação REPLI-g e de 2,0 μl de DNA polimerase REPLI-g por reação. 40,0 μl dessa mistura mestre foram adicionados à cada solução, que é, então, realizada em um termociclador a 30°C durante 8 horas, depois resfriada a 4°C.

[0096] Os produtos de amplificação de genoma total foram avaliados com o uso do ensaio Qubit® para determinar a quantidade de DNA.

[0097] Testes de genotipagem. Ambas as análises de marcadores de alta densidade (o chip 3072X ILLUMINA®) e do marcador Taqman foram usadas com êxito para genotipar os materiais genéticos descritos neste exemplo. Os dados demonstrando a eficácia das técnicas anteriormente mencionadas são apresentados nas Figuras 2 a 4. A Figura 15 compara a qualidade dos dados obtidos usando métodos de extração de DNA em relação àqueles obtidos com o uso de amplificação do genoma total. Enquanto ambos os métodos proporcionam resultados aceitáveis, o método de amplificação do genoma total fornece, de preferência, resultados, com cada um dos três haplótipos bem resolvidos. A Figura 16 é um gráfico de dispersão de marcador fluorescente que demonstra que dados do marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de uma única amostra de tecido do pericarpo. De fato, os métodos da invenção permitem a genotipagem com o uso de muitos marcadores, dezenas ou, potencialmente, centenas, com o uso de um tecido de pericarpo extraído a partir de uma única semente. A Figura 17 demonstra a confiabilidade dos métodos da invenção, devido ao alto grau de similaridade entre o genótipo do tecido medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente extraída (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido.

Claims (13)

1. Método para armazenar um ou mais embriões vegetais, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar o um ou mais embriões vegetais em uma solução aquosa circundada por uma matriz de dois óleos, sendo que um dos dois óleos é mais denso do que a solução aquosa e um dos dois óleos é menos denso do que a solução aquosa, sendo que a solução aquosa é circundada pelo óleo que é mais denso do que a solução aquosa e o óleo que é menos denso do que a solução aquosa.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais embriões vegetais compreendem um ou mais embriões vegetais imaturos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os agentes antimicrobianos e/ou meio de crescimento mínimo são adicionados à solução aquosa.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais embriões vegetais são armazenados sob condições de escuridão.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais embriões vegetais são armazenados a aproximadamente 4 graus Celsius.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente transferir o um ou mais embriões vegetais para armazenamento continuado.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente transferir o um ou mais embriões vegetais para um meio de germinação.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente germinar ao menos um do um ou mais embriões vegetais.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o método de armazenamento é CARACTERIZADO pelo fato de ser automatizado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende remover uma alíquota da solução aquosa, obter material genético do material celular contido dentro da alíquota e executar uma análise molecular do material genético.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita análise molecular é genotipagem.

12. Dispositivo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um recipiente com uma primeira camada de óleo, uma camada aquosa contendo um embrião vegetal e uma segunda camada de óleo, sendo que a primeira camada de óleo é mais densa do que a camada aquosa e a segunda camada de óleo é mais densa do que a camada aquosa.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente múltiplos recipientes, cada um dos recipientes tendo uma primeira camada de óleo, uma camada aquosa contendo um embrião vegetal e uma segunda camada de óleo, sendo que a primeira camada de óleo é mais densa do que a camada aquosa e a segunda camada de óleo é mais densa do que a camada aquosa.

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