BR112016016356B1 - Lipossoma, usos dos mesmos, e composição farmacêutica ou veterinária - Google Patents
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Abstract
imunoterapia baseada em lipossomas. a presente invenção refere-se a um lipossoma que encapsula um autoantígeno, em que o lipossoma tem um tamanho compreendido de 500 a 15000 nm; e a membrana lipossomal compreende fosfatidilserina (fs) em uma quantidade compreendida de 10 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. composições farmacêuticas ou veterinárias que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito lipossoma também são fornecidas. além disso, a invenção fornece lipossomas e composições farmacêuticas ou veterinárias, conforme definido acima, para uso como um medicamento, particularmente para o tratamento de doenças autoimunes. finalmente, a presente invenção fornece lipossomas e composições farmacêuticas ou veterinárias, conforme definidos acima, para uso na restauração da autotolerância em um paciente que sofre de uma doença autoimune.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina. Em particular, a presente invenção fornece lipossomas que encapsulam autoantígenos para a prevenção ou tratamento de doenças autoimunes.
[002] Autoimunidade é a incapacidade de um organismo em reconhecer suas próprias partes constituintes como suas, levando, dessa forma, a uma resposta imune contra suas próprias células e tecidos. Qualquer doença que resulta de uma resposta imune aberrante é denominada uma doença autoimune. Exemplos importantes incluem diabetes tipo 1 (DT1), lúpus eritematoso, artrite reumatoide, esclerose múltipla (EM), doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, tiroidite de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, síndrome de Sjogren.
[003] Calcula-se que 7 a 10% da população nos países desenvolvidos da população sofre com essas doenças, que são frequentemente crônicas, debilitantes e fatais. Os custos de tratamentos médicos associados às doenças autoimunes continuam a aumentar em escala, a medida que as doenças autoimunes aumentam em todo o mundo e não há tratamentos eficazes disponibilizados.
[004] Os tratamentos para doenças autoimunes têm sido, tradicionalmente, imunossupressores, anti-inflamatórios (esteroides), ou paliativos. As terapias não imunológicas, como a reposição hormonal na tireoidite de Hashimoto ou no diabetes mellitus tipo 1, tratam os resultados da resposta autoagressora, então, estes são tratamentos paliativos. A manipulação dietética limita a gravidade da doença celíaca. O tratamento com esteroides ou AINEs limita os sintomas inflamatórios de muitas doenças.
[005] Pesquisa extensiva tem sido investida no desenvolvimento de terapias imunomoduladoras que reduzam ou evitem a resposta imune indesejada. Entretanto, a compreensão limitada dos intrincados detalhes das diferentes doenças autoimunes substancialmente desacelera o progresso neste campo. As estratégias correntes baseiam-se, em geral, na qualidade de fármacos imunossupressores de ampla atuação que, a fim de manter a imunossupressão, são geralmente tratamentos permanentes. Além disso, o uso de imunossupressores de ampla atuação está associado a um risco de efeitos colaterais graves, como tumores, infecções, nefrotoxicidade e distúrbios metabólicos.
[006] Apesar dos esforços realizados até agora, ainda existe a necessidade de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de doenças autoimunes que sejam eficazes e desprovidas de efeitos colaterais indesejáveis.
[007] Os inventores desenvolveram uma nova terapia específica para autoantígeno, que é altamente eficaz no tratamento de doenças autoimunes. Em particular, os inventores descobriram que uma doença autoimune pode ser tratada eficazmente pelo encapsulamento do(s) autoantígeno(s) associado(s) à doença autoimune que se pretende tratar, em um lipossoma com tamanho específico e compreendendo o lipídio fosfatidilserina.
[008] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se, dessa forma, a um lipossoma que encapsula um autoantígeno, em que (i) o lipossoma tem um tamanho compreendido de 500 a 15000 nm; e (ii) a membrana lipossomal compreende fosfatidilserina (FS) em uma quantidade compreendida de 10 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal.
[009] Os presentes inventores descobriram que as características particulares do lipossoma da invenção, ou seja, um tamanho compreendido de 500 a 15000 nm e a presença de 10 a 40% de FS, permitem a apresentação tolerogênica do autoantígeno encapsulado por células apresentadoras de antígeno, restaurando dessa modo a tolerância ao autoantígeno.
[0010] Sem o desejo de se vincular à teoria, os inventores hipotetizaram que as características específicas dos presentes lipossomas asseguram que sejam efetivamente engolfados por células dendríticas e o autoantígeno encapsulado seja processado e apresentado aos linfócitos T CD4+ através de moléculas de MHC classe II (apresentação exógena) e aos linfócitos T CD8+ (apresentação cruzada) em formas tolerogênicas, induzindo, dessa forma, a tolerância ao antígeno e bloqueando a cascata autoimune. Dito de outro modo, o lipossoma que encapsula o autoantígeno da presente invenção induz tolerância ao autoantígeno em vez de autoimunidade, o que resulta no tratamento eficaz da doença autoimune.
[0011] O efeito tolerogênico do lipossoma que encapsula o autoantígeno da invenção e seu efeito surpreendente no tratamento da doença autoimune, em particular, no tratamento de DT1 e EM, são demonstrados nos exemplos abaixo.
[0012] Conforme mostrado nas Figuras 2, 3 e 4, os lipossomas-FS que encapsulam peptídeos de insulina são capturados pelas células dendríticas, de modo que estas células dendríticas adquirem características tolerogênicas: a diminuição da expressão de moléculas coestimulatórias, a produção de PGE2 induzida e a diminuição da proliferação de células T no contexto de diabetes. Os resultados indicam que os lipossomas, em alguma extensão, promovem a tolerogenicidade de células dendríticas (CD) similar a corpos apoptóticos. Além disso, o efeito não foi diminuído após um estímulo pró-inflamatório, uma característica importante a ser considerada, pois demonstra que a terapia é eficaz, uma vez que a cascata autoimune está em curso e os estímulos pró-estimulatórios estão presentes.
[0013] Tudo acima, resulta no tratamento eficaz da doença autoimune, conforme mostrado nos exemplos abaixo. As Figuras 5 e 6 demonstram que o tratamento de camundongos NOD pré-diabéticos é alcançado em uma única administração dos lipossomas da invenção, enquanto que a Figura 8, A, mostra que os lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina podem reverter o diabetes em camundongos NOD quando administrados após o início da doença. Além disso, a Figura 9 mostra que os lipossomas-FS contendo o peptídeo da glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) pode evitar o desenvolvimento da doença encefalomielite autoimune experimental (EAE) em camundongos C57BL/6 imunizados. Dessa forma, em contraste com os tratamentos com imunomoduladores ou anti-inflamatórios conhecidos para doenças autoimunes, a terapia à base de lipossomas desenvolvida pelos inventores não é exigida permanentemente. Em vez disso, a restauração de longa duração da tolerância é alcançada, o que resulta na prevenção ou tratamento eficazes da doença autoimune. Este efeito pode ser obtido após uma administração única, ou, alternativamente, em 2 a 4 administrações, de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de lipossomas que encapsulam autoantígenos.
[0014] Pode também ser observado nas Figuras 5, 6 e 8, B, que nenhum efeito foi obtido sobre a incidência de DT1 quando os camundongos receberam lipossomas vazios. Dessa forma, o tratamento somente é eficaz quando os lipossomas encapsulam um autoantígeno adequado, o que demonstra a especificidade antigênica da nanoterapia.
[0015] Apesar de ser uma terapia baseada na especificidade para o antígeno, o lipossoma que encapsula o autoantígeno da invenção tem a vantagem de não apresentar efeitos colaterais indesejados. Conforme mencionado acima, outras abordagens imunomodulatórias para o tratamento de doenças autoimunes envolvem imunossupressores, que conduzem frequentemente à alta suscetibilidade a infecções e, por vezes, também promovem o desenvolvimento de tumores, nefrotoxicidade ou distúrbios metabólicos.
[0016] Com a prioridade de produzir uma apresentação tolerogênica, encapsular os autoantígenos nos lipossomas especificamente projetados da invenção é um objetivo altamente desejável devido à proteção da carga contra a degradação e a diminuição/ausência de toxicidade. Isto é devido ao fato de que o autoantígeno está confinado no lipossoma até a absorção pelas células apresentadoras de antígeno e, consequentemente, não pode induzir uma resposta imune adversa.
[0017] Um segundo aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, em conjunto com outros excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou veterinários adequados.
[0018] A composição farmacêutica à base de lipossomas da presente invenção tem várias vantagens em termos de estabilidade, uniformidade e facilidade de produção em larga escala.
[0019] Em primeiro lugar, a produção dos presentes lipossomas que encapsulam o autoantígeno pode ser obtida usando reagentes e equipamentos comuns na indústria farmacêutica a um baixo custo.
[0020] Os lipossomas da invenção, devido ao seu tamanho, são altamente estáveis em solução e fáceis de obter, em contraste com os lipossomas menores, que tendem a se agregar e a sua produção exige processos de extrusão repetida através de membranas caras com poros de tamanhos pequenos.
[0021] Além disso, a uniformidade do produto pode ser garantida, ao mesmo tempo que o aumento em escala para volumosa produção industrial é acessível.
[0022] Outra grande vantagem está no fato de a presente composição farmacêutica à base de lipossomas ser uma composição definida, que é desprovida de contaminantes indesejáveis ou subprodutos. Os lipossomas que encapsulam o autoantígeno não se degeneram em produtos secundários tóxicos, como corpos necróticos, e não causam rejeições, como no caso de terapias à base de células autólogas ou heterólogas.
[0023] Graças ao seu efeito tolerogênico, o lipossoma que encapsula o autoantígeno da invenção produz uma prevenção eficaz de doenças autoimunes (isto é, evita que a autoimunidade seja desencadeada), bem como o tratamento eficaz da doença autoimune, tanto no estágio pré- clínico (isto é, em um estágio em que a autoimunidade já está acionada, mas os danos nos tecidos e os sintomas clínicos são baixos) e no estágio clínico (isto é, em um estágio em que o dano tecidual é mais elevado e os sintomas clínicos são evidentes).
[0024] Dessa forma, em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma que encapsula o autoantígeno, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, para uso como um medicamento. Este aspecto também pode ser formulado como um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença que compreende a administração a um mamífero que necessita de tal tratamento, incluindo um humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do lipossoma que encapsula o autoantígeno da presente invenção, em conjunto com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados.
[0025] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, para uso na prevenção ou no tratamento de uma doença autoimune. Este aspecto pode ser formulado na forma de uso de um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de uma doença autoimune. Este aspecto também pode ser formulado na forma de um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença autoimune compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, em conjunto com excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, em um indivíduo que necessite do mesmo, incluindo um ser humano.
[0026] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, para uso na restauração da autotolerância em um paciente que sofre de uma doença autoimune. Este aspecto pode ser formulado na forma de uso de um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, para a fabricação de um medicamento para a restauração da autotolerância em um paciente que sofre de uma doença autoimune. Este aspecto também pode ser formulado na forma de um método para a restauração da autotolerância em um paciente que sofre de uma doença autoimune compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um lipossoma que encapsula o autoantígeno, conforme definido acima, em conjunto com excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, em um indivíduo que necessite do mesmo, incluindo um humano.
[0027] Finalmente, outros aspectos da invenção fornecem um lipossoma ou uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, para suprimir uma resposta autoimune; e um lipossoma ou uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, para uso na prevenção ou no tratamento de uma doença autoimune, em que o dito lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária restaura a tolerância ao autoantígeno encapsulado.
[0028] Figura 1. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (microscópio crio-MET, JEOL-JEM 1400) do lipossoma-FS carregado com o autoantígeno derivado de insulina. Barra = 0,2 μm.
[0029] Figura 2. Análise de citometria de fluxo (FACS) de CDs de controle (A), CDs cocultivadas durante 30 minutos com lipossomas-FS marcados com Oregon Green 488 DHPE (lipo-FS OG488) a 4°C (B) e a 37°C (C). As coordenadas x representam lipo-FS OG488; as coordenadas y representam CDs marcadas com CD11c-PECy7.
[0030] Figura 3. Efeitos da captura de lipossomas-FS em CDs. As coordenadas y representam (A) a viabilidade de CDs (%) avaliada por marcação com anexina V e 7AAD, (B) a mediana da intensidade de fluorescência para expressão de CD40 e CD86 na membrana e (C) a quantificação da produção de prostaglandina E2 (PGE2) por ELISA nos sobrenadantes de cultura para CDs imaturas e maduras. Os símbolos brancos representam as CDs imaturas, antes (triângulos) e após a captura de lipossomas-FS (quadrados) ou lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (círculos), 24 horas após a cultura. Os símbolos pretos representam a viabilidade das CDs maduras, antes (triângulos) e após a captura de lipossomas-FS (quadrados) ou lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (círculos), 24 horas após estímulos pró-inflamatórios (lipopolissacarídeo, LPS). Os dados de ELISA são representados como pg/106 células.
[0031] Figura 4. Capacidade prejudicada das CDs de estimular a proliferação de células T autólogas após a captura de lipossomas-FS, mesmo após estímulos pró-inflamatórios. A coordenada y representa a proliferação autóloga de células T (c.p.m por ensaio de 3H timidina) após a estimulação induzida por CDs imaturas, antes (triângulos brancos) e após a captura de lipossomas-FS (quadrados brancos) ou lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (20 μg/ml) em uma razão de 1:10 (círculos brancos) durante 7 dias. Os símbolos pretos representam a proliferação induzida por CDs maduras, antes (triângulos pretos) e após a captura de lipossomas-FS (quadrados pretos) ou lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (círculos pretos), previamente ativados com o estímulo pró-inflamatório do LPS (100 ng/ml).
[0032] Figura 5. A imunoterapia usando peptídeos de insulina encapsulados pelo lipossoma-FS diminui a incidência de DT1. (A) a coordenada y representa a incidência cumulativa (porcentagem) de diabetes em camundongos NOD tratados com lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (círculos, n = 12), lipossomas- FS vazios (quadrados, n = 18), e no grupo de controle que recebeu solução salina (triângulos, n = 16). (A) a coordenada y representa a evolução do peso corporal (porcentagem) em camundongos tratados com lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (círculos, n = 12-6), lipossomas-FS vazios (quadrados, n = 18-3), e no grupo de controle tratado com solução salina (triângulos, n = 16). As coordenadas x indicam a idade dos camundongos em semanas.
[0033] Figura 6. A classificação de insulite é menos grave em camundongos imunizados. Efeito de lipossomas-FS sobre a insulite em camundongos NOD. As coordenadas y representam (A) a classificação de insulite para diferentes grupos de camundongos NOD e (B) a porcentagem de ilhotas classificadas em cada uma das cinco categorias de infiltração em diferentes grupos de camundongos NOD. Categorias de infiltração: 0, sem insulite; 1, peri-insular; 2, insulite moderada (<25% das ilhotas infiltradas); 3, 25 a 75% das ilhotas infiltradas; 4, infiltração total das ilhotas. Os grupos de camundongos NOD são: camundongos de controle tratados com solução salina (S), camundongos tratados com lipossomas-FS vazios (FS) e camundongos tratados com lipossomas-FS contendo autoantígenos (FSAB). Os pâncreas de 4 a 6 camundongos não diabéticos/grupo foram analisados no final do período de estudo (30 semanas). Os resultados são médias ± EPM. *Diferenças significativas (p <0,05) em relação ao grupo de controle (teste t não pareado).
[0034] Figura 7: Rastreamento de lipossomas-FS. Histograma de sinal fluorescente (RFU, Unidades de Fluorescência Relativa/g de tecido) em vários órgãos intraperitoneais de camundongos NOD (i.p.) injetados com lipossomas-FS marcados com fluorescência (Alexa Fluor 750) em 24 horas. TAP, tecido adiposo perigonadal; R, rim; B, baço; P, pâncreas; LNP, linfonodos pancreáticos; LNM, linfonodos mesentéricos; F, fígado; LNMD, linfonodos mediastinais; T, timo. Os resultados de um experimento representativo de três experimentos independentes são mostrados. A coordenada Y indica RFU/g de tecido.
[0035] Figura 8. Os níveis de glicemia nos camundongos diabéticos tratados com lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina (A) ou lipossomas vazios (B) nos dias 1, 5 e 8 após o início da doença (dia 0). A coordenada Y indica a glicemia sanguínea (mg/dl). A zona cinza indica uma faixa glicêmica de valor diagnóstico. A coordenada X indica o tempo expresso em dias a partir do início da doença. Os círculos indicam dias sem a administração de insulina.
[0036] Figura 9. A classificação clínica de EAE realizada diariamente por camundongos C57BL/6 imunizados tratados com lipossomas contendo o peptídeo MOG (círculos brancos) ou lipossomas vazios (triângulos brancos). A coordenada Y indica a classificação clínica média. A coordenada X indica o tempo expresso em dias pós-imunização.
[0037] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece lipossomas que encapsulam autoantígenos.
[0038] O termo "lipossoma" é para ser entendido como uma estrutura de automontagem que compreende uma ou mais membranas compostas por bicamadas lipídicas, cada uma das quais compreende duas monocamadas de lipídios anfipáticos contendo moléculas orientadas de forma oposta. Lipídios anfipáticos compreendem uma região polar (hidrofílica) ligada covalentemente a um grupo cabeça de uma ou duas cadeias acila não polares (hidrofóbicas). Contatos energeticamente desfavoráveis entre as cadeias acila hidrofóbicas e o meio aquoso circundante induzem as moléculas lipídicas anfipáticas a se arranjarem de modo que seus grupos cabeça polares sejam orientados para a superfície da bicamada, enquanto as cadeias acila reorientam-se para o interior da bicamada. Uma estrutura energeticamente estável é formada dessa forma, em que as cadeias acila são eficazmente protegidas de entrarem em contato com o ambiente aquoso.
[0039] Os lipossomas podem ter uma única bicamada de membrana (pequenas vesículas unilamelares "SUVs" e grandes vesículas unilamelares "LUV"), ou membrana de bicamada múltipla (grandes vesículas multilamelares "MLVs"). Os lipossomas também podem ser preparados como vesículas multivesiculares "MVVS", que são lipossomas que envolvem, ou encapsulam, múltiplas câmaras aquosas não concêntricas. Em contraste, as MLVs têm várias membranas concêntricas como uma "casca de cebola", cada uma das quais encapsula um compartimento aquoso. Dada esta encapsulação do volume aquoso no interior de uma barreira de proteção de moléculas de lipídios, os lipossomas são capazes de sequestrar moléculas encapsuladas, por exemplo, peptídeos, afastadas dos efeitos degradantes de fatores, por exemplo, enzimas peptidase presentes no meio externo.
[0040] O tamanho dos lipossomas da invenção é compreendido de 500 a 15000 nm, um tamanho que aumenta a sua absorção pelas células apresentadoras de antígeno. Além disso, os lipossomas da presente invenção têm, preferencialmente, a morfologia de MVV, conforme mostrado na Figura 1. Estes grandes lipossomas MVV têm significativamente uma maior eficiência de carregamento, quando comparados com MLVs ou SUVs convencionais, e também favorecem que o agente ativo encapsulado, neste caso, o autoantígeno, seja, de preferência, dissolvido em compartimentos aquosos (em vez de se precipitar ou ser ancorado às membranas). Tudo isto tem vantagens em termos de biodisponibilidade do autoantígeno na célula apresentadora de antígeno, o que resulta em uma atividade imunomoduladora mais elevada.
[0041] Em uma modalidade, o lipossoma da presente invenção tem um tamanho compreendido de 500 a 12.000 nm. Em uma outra modalidade, o tamanho do lipossoma está compreendido de 500 a 10.000 nm. Em uma outra modalidade, a dimensão do lipossoma está compreendida de 600 a 8000 nm, mais particularmente de 700 a 7000 nm, ou de 800 a 5000 nm, ou de 900 a 3000 nm, ou de 900 a 2000 nm, ou de 900 a 1500 nm, ou de 1000 a 1400 nm. Em uma modalidade específica, o lipossoma tem um tamanho compreendido de 1000 a 1300 nm, por exemplo, 1000 nm, 1050 nm, 1100 nm, 1150 nm ou 1200 nm.
[0042] Em uma modalidade, o lipossoma da presente invenção tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 500 a 12.000 nm. Em uma outra modalidade, o lipossoma da presente invenção tem uma morfologia MVV e tem um tamanho compreendido de 500 a 10.000 nm. Em uma outra modalidade, o lipossoma da invenção tem morfologia MVV e tem um tamanho compreendido de 600 a 8000 nm, mais particularmente de 700 a 7000 nm, ou de 800 a 5000 nm, ou de 900 a 3000 nm, ou de 900 a 2000 nm, ou de 900 a 1500 nm, ou de 1000 a 1400 nm. Em uma modalidade específica, o lipossoma tem uma morfologia MVV e tem um tamanho compreendido de 1000 a 1300 nm, por exemplo, 1000 nm, 1050 nm, 1100 nm, 1150 nm ou 1200 nm.
[0043] A membrana lipossomal pode incluir, sem limitação, fosfolipídeos como fosfatidilcolina ("FS"), fosfatidilserina ("FS"), fosfatidiletanolamina ("FE"), fosfatidilglicerol ("FG"), fosfatidilinositol ("FI") e ácido fosfatídico ("FA"). Outros lipídios que podem constituir a membrana da nanopartícula incluem, mas não se limitam a colesterol ("COL") e colesterol-PEG, e fosfatidilcolinas marcadas fluorescentes. A membrana lipossomal pode conter moléculas adicionais de natureza não lipídica, como proteínas, carboidratos, anticorpos ou cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os lipossomas podem incluir porções específicas as quais são projetadas para direcionar o lipossoma para um local específico ou célula-alvo, ou proteger o lipossoma contra um ambiente hostil (por exemplo, o trato gastrointestinal). A composição do lipossoma é relevante para a entrega do autoantígeno tolerogênico. Dessa forma, conforme mencionado acima, a membrana lipossomal compreende FS em uma quantidade compreendida de 10 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. A FS contida na membrana lipossomal constitui um sinal "engolfe-me" que conecta o reconhecimento de FS por células apresentadoras de antígeno com as consequências na indução de tolerância. É notável que o lipossoma da invenção não requer receptores ou ligantes adicionais para ser engolfado por CDs eficazmente e alcançar uma entrega tolerogênica do autoantígeno. Entretanto, outros receptores e/ou ligantes podem ser montados no lipossoma, de modo a melhorar a absorção e/ou o processamento tolerogênico.
[0044] O termo "porcentagem (%) em peso" refere-se à porcentagem de cada componente da membrana lipossomal em relação ao peso total da composição lipossomal da membrana.
[0045] Em "composição lipossomal da membrana", refere-se à totalidade de bicamadas de membrana contidas no lipossoma, por exemplo, quando é um lipossoma MVV compreendendo mais do que uma bicamada de membrana (conforme mostrado na Figura 1). O mesmo é compreendido quando se usa os termos "membrana do lipossoma" ou "membrana lipossomal", ambos os quais referem-se à totalidade de bicamadas da membrana contida no lipossoma da presente invenção (e não só da membrana externa).
[0046] Em uma modalidade, a membrana lipossomal compreende FS em uma quantidade compreendida de 15 a 37% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. Em modalidades adicionais, a FS da membrana é compreendida de 20 a 35%, ou de 22 a 35%, ou de 22 a 33%, ou de 25 a 32%, ou de 26 a 31%, ou de 27 a 30% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal, por exemplo, 27%, 28%, 29% ou 30%. De preferência, a FS da membrana é 30% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal.
[0047] O lipossoma, de acordo com a presente invenção, pode compreender, em adição à FS, concentrações variáveis de outros lipídios. Em algumas modalidades, a membrana lipossomal compreende também FS. Em algumas modalidades, a membrana lipossomal compreende também COL. Em modalidades específicas, a membrana lipossomal compreende FS e COL.
[0048] Em uma modalidade, a membrana lipossomal compreende FS em uma quantidade compreendida de 10 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. Em uma outra modalidade, a membrana lipossomal compreende FS em uma quantidade compreendida de 12 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. Em modalidades adicionais, a FS da membrana é compreendida de 15 a 37%, ou de 20 a 35%, ou de 22 a 33%, ou de 25 a 32%, ou de 26 a 31%, ou de 27 a 30% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal, por exemplo, 27%, 28%, 29% ou 30%.
[0049] A quantidade de COL pode estar compreendida de 13 a 53% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. Em uma modalidade, a membrana lipossomal compreende COL em uma quantidade compreendida de 20 a 50% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal. Em modalidades adicionais, o COL da membrana é compreendido, de preferência, de 27 a 46%, ou de 30 a 44%, ou de 33 a 42%, ou de 36 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal, por exemplo, 36%, 37%, 38%, 39% ou 40%.
[0050] A proporção dos diversos lipídios contidos na membrana lipossomal deve ser equilibrada de forma a obter um lipossoma com propriedades físicas e químicas adequadas em termos de estabilidade, permeabilidade e morfologia. Em geral, a membrana lipossomal pode compreender FS, FS e COL em uma razão molar FS:FS:COL que é compreendida de 0,6:0,6:0,7 a 1,5:1,5:1,8. O termo "razão" é entendido no sentido habitual como a magnitude de quantidades relativas entre si. Especificamente, a razão entre duas quantidades indica quantas vezes a primeira quantidade (X) está contida na segunda quantidade (Y), e é expressa como X:Y. O termo "razão molar" é usado quando a referida magnitude é a molaridade. Alternativamente, a razão pode ser expressa como "razão em peso" quando a referida magnitude é peso. Neste pedido, as faixas de razões molares são dadas para os três lipídios particulares (FS, FS e COL). Em uma modalidade, a membrana compreende uma razão molar FS:FS:COL que é compreendida de 0,7:0,7:0,7 a 1,4:1,4:1,6. Em uma outra modalidade, a membrana compreende uma razão molar FS:FS:COL que é compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5. Em uma outra modalidade, a membrana compreende uma razão molar FS:FS:COL que é compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1: 1,1:1,4. Em uma modalidade preferencial, a membrana compreende uma razão molar FS:FS:COL que é em torno de 1:1:1,33:
[0051] Conforme mencionado acima, o lipossoma da presente invenção encapsula um autoantígeno. O termo "autoantígeno" refere-se a uma proteína normal ou um complexo de proteínas que são reconhecidos pelo sistema imune de pacientes que sofrem de uma doença autoimune específica. Estes antígenos devem, sob condições normais, não ser o alvo do sistema imunológico, mas, devido principalmente a fatores genéticos e ambientais, a tolerância imunológica normal para tal antígeno foi perdida nesses pacientes. Em certas modalidades, o lipossoma encapsula outros autoantígenos associados com a mesma doença autoimune. Por exemplo, o lipossoma pode encapsular dois, três, quatro ou cinco autoantígenos, de preferência associados com DT1.
[0052] Em algumas modalidades, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 50:1 a 2:1. Em uma outra modalidade, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 30:1 a 3:1. Em uma outra modalidade, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1. Em uma outra modalidade, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1. Em uma outra modalidade, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 12:1 a 3:1. Em uma outra modalidade, a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) é selecionada do grupo consistindo em: 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 e 4:1.
[0053] Em uma modalidade, o lipossoma tem um tamanho compreendido de 500 a 10.000 nm, a membrana lipossomal compreende 20 a 35% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,7:0,7:0,8 a 1,4:1,4:1,6, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 50:1 a 3:1.
[0054] Em uma modalidade, o lipossoma tem um tamanho compreendido de 700 e 7.000 nm, a membrana lipossomal compreende 22 a 33% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
[0055] Em uma outra modalidade, o lipossoma tem um tamanho compreendido de 800 e 5000 nm, a membrana lipossomal compreende 25 a 32% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:CO que está compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1:1,1:1,4, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1.
[0056] Em uma outra modalidade, o lipossoma tem um tamanho compreendido de 900 a 3000 nm, a membrana lipossomal compreende 30% em peso de FS, 30% em peso de FS e 40% em peso de CO, e a razão molar entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 12:1 a 3:1, de preferência, a razão em peso é selecionada do grupo consistindo em: 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 e 4:1.
[0057] Em uma outra modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 800 a 5000 nm, a membrana lipossomal compreende 25 a 32% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:CO que está compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1:1,1:1,4, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1. Em uma outra modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 900 a 3000 nm, a membrana lipossomal compreende 30% em peso de FS, 30% em peso de FS e 40% em peso de CO, e a razão molar entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 12:1 a 3:1, de preferência, a razão em peso é selecionada do grupo consistindo em: 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 e 4:1. Em uma modalidade preferencial, o lipossoma tem morfologia MVV, 1000 nm, a membrana lipossomal compreende 30% em peso de FS, 30% em peso de FS e 40% em peso de CO, e a razão molar entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 12:1 a 3:1, de preferência, a razão em peso é selecionada do grupo consistindo em: 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 e 4:1.
[0058] O(s) autoantígenos(s) encapsulado(s) é(são) associado(s) com uma doença autoimune específica. Em certas modalidades, o(s) autoantígeno(s) é(são) associado(s) a uma doença autoimune selecionada do grupo consistindo em DT1, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, esclerose múltipla, doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, tiroidite de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, anemia hemolítica autoimune, neutropenia autoimune, doença de Graves, psoríase, artrite psoriática e síndrome de Sjogren. Em uma modalidade específica, o lipossoma encapsula um autoantígeno associado com DT1. Autoantígenos não limitadores, que são conhecidos por estarem associados ao DT1, são insulina, pró- insulina, proteína tirosina fosfatase (IA2, também conhecida como antígeno 512 de células de ilhota), glutamato descarboxilase (GAD), cromogranina e proteína relacionada à subunidade da glicose-6-fosfatase da ilhota (IGRP) (Roep BO, Peakman M. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, vol. 2(4):a007781. oi: 10.1101/cshperspect.a007781.). Dessa forma, em uma modalidade, o lipossoma da invenção encapsula um autoantígeno selecionado do grupo que consiste em insulina, pró-insulina, IA2, GAD, cromogranina e IGRP.
[0059] Além disso, no sentido da presente invenção, o autoantígeno que está encapsulado no lipossoma não precisa ser a proteína antigênica completa. Com efeito, regiões específicas das proteínas relevantes foram isoladas e descritas como particularmente antigênicas. Dessa forma, em certas modalidades, o lipossoma encapsula um autoantígeno que é um peptídeo antigênico, em particular, um peptídeo antigênico associado com DT1, por exemplo, os peptídeos antigênicos derivados de insulina, pró-insulina, IA2, GAD, cromogranina e IGRP. Por exemplo, os peptídeo definidos pela SEQ ID N°: 1 (21 aa, GIVDQCCTSICSLYQLENYCN) derivados da cadeia A da insulina e pela SEQ ID N°: 2 (30 aa, FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS) derivados da cadeia B da insulina, foram revelados como particularmente autoantigênicos em DT1. Dessa forma, em uma modalidade, o lipossoma encapsula um autoantígeno associado com DT1 e é derivado de insulina, preferencialmente selecionado dos peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2. Em uma modalidade específica, o lipossoma encapsula os peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2.
[0060] Outras proteínas ou peptídeos autoantigênicos que estão associados a doenças autoimunes e podem ser encapsulados nos lipossomas da presente invenção são, por exemplo, os peptídeos de mielina para esclerose múltipla, como os peptídeos derivados da glicoproteína da mielina de oligodendrócitos (MOG), os peptídeos do receptor de acetilcolina para miastenia gravis, transglutaminase para doença celíaca, tireoglobulina para tiroidite autoimune (Lernmark A. J. Clin Invest, 2001, vol. 108, p. 1091-1096). Em uma modalidade específica, o lipossoma da presente invenção encapsula um autoantígeno que é um peptídeo antigênico associado com EM, por exemplo, peptídeos antigênicos derivados de MOG, como o peptídeo definido pela SEQ ID N°: 3.
[0061] Os peptídeos autoantigênicos contidos nos lipossomas da presente invenção são, vantajosamente, de um tamanho que permite a apresentação direta dos ditos antígenos pelas moléculas de superfície do complexo de histocompatibilidade principal. Por "apresentação direta", entende-se que nenhum processamento principal destes peptídeos pela célula apresentadora de antígeno é necessário antes da exposição da superfície. Em algumas modalidades, o tamanho dos peptídeos autoantigênicos nos lipossomas da invenção é compreendido de 5 a 100 aminoácidos, em particular, de 5 a 70 aminoácidos, ou de 8 a 50 aminoácidos, ou de 8 a 35 aminoácidos, ou de 8 a 30 aminoácidos. Tais autoantígenos fornecem vantagens em termos de biodisponibilidade, eficácia da terapia à base de lipossomas e facilidade de processamento (o encapsulamento de tais pequenos peptídeos é mais fácil e mais barato quando comparado com proteínas inteiras ou peptídeos maiores).
[0062] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 700 a 7000 nm, a membrana lipossomal compreende 22 a 33% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5, o lipossoma encapsula pelo menos um autoantígeno que está associado com DT1, de preferência, um autoantígeno que é um peptídeo derivado de insulina, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
[0063] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 700 a 7000 nm, a membrana lipossomal compreende 22 a 33% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5, pelo menos um autoantígeno é um peptídeo selecionado da SEQ ID N°: 1 e da SEQ ID N°: 2, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
[0064] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 800 a 5000 nm, a membrana lipossomal compreende 25 a 32% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1:1,1:1,4, pelo menos um autoantígeno é um peptídeo selecionado da SEQ ID N°: 1 e da SEQ ID N°: 2, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1.
[0065] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 800 a 5000 nm, a membrana lipossomal compreende 25 a 32% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1:1,1:1,4, pelo menos um autoantígeno é o peptídeo com a SEQ ID N°: 1, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1.
[0066] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 800 a 5000 nm, a membrana lipossomal compreende 25 a 32% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,9:0,9:1 a 1,1:1,1:1,4, pelo menos um autoantígeno é o peptídeo com a SEQ ID N°: 2, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 15:1 a 3:1.
[0067] Em uma modalidade, o lipossoma tem uma morfologia MVV e um tamanho compreendido de 700 a 7000 nm, a membrana lipossomal compreende 22 a 33% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5, o lipossoma encapsula pelo menos um autoantígeno que está associado com EM, de preferência, um autoantígeno que é um peptídeo derivado de MOG, como o peptídeo definido pela SEQ ID N°: 3, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
[0068] Várias metodologias bem conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para preparar lipossomas que encapsulam um ou mais peptídeos. Por exemplo, os lipossomas da invenção podem ser formados diretamente por aprisionamento do autoantígeno durante a formação do lipossoma pelo método de hidratação do filme lipídico.
[0069] Em uma modalidade, os lipossomas da invenção são preparados por um processo compreendendo: (A) a preparação de uma mistura de lipídios em um solvente adequado, por exemplo, clorofórmio, (b) a remoção do solvente, por exemplo, por evaporação sob vácuo, (c) a hidratação da mistura de lipídios com um tampão adequado, por exemplo, salina tamponada com fosfato, contendo, pelo menos, um autoantígeno, (d) a remoção opcional do peptídeo não encapsulado, por exemplo, por centrifugação, e (e) a purificação ou homogeneização dos lipossomas contendo autoantígenos resultantes, por tamanho. De preferência, a extrusão pode ser usada para homogeneizar os lipossomas em tamanho, ou seja, para produzir lipossomas com um tamanho médio predeterminado forçando os lipossomas, sob pressão, através de poros de filtro de um tamanho selecionado definido. A filtração de fluxo tangencial pode também ser usada para purificar e regularizar o tamanho dos lipossomas, isto é, para produzir uma população de lipossomas com menos impurezas, menos heterogeneidade de tamanho e uma distribuição de tamanho mais homogênea e uniforme. Quando o lipossoma encapsula mais de um autoantígeno, a etapa de hidratação (c) é realizada na presença de um tampão que contém uma mistura dos ditos autoantígenos na proporção desejada. Essa proporção considera a eficiência de encapsulamento específica para cada autoantígeno.
[0070] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um lipossoma que encapsula o autoantígeno obtido pelo método descrito acima.
[0071] Outros métodos conhecidos na técnica também podem ser usados para a obtenção dos lipossomas que encapsulam os autoantígenos da invenção. Por exemplo, algumas modalidades contemplam primeiro a obtenção dos lipossomas e, em seguida, o encapsulamento do autoantígeno. Existem métodos bem conhecidos no estado da técnica para encapsular um composto dentro de um lipossoma (ver Maurer N. et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, vol. 1(6), p. 923-47; Waterhouse D. N. et al., Methods Enzymol., 2005; vol. 391, p. 40-57; Urbán P. et al., Nanosc. Res. Lett., 2011, vol. 6, p. 620).
[0072] Outro aspecto da invenção fornece uma composição farmacêutica ou veterinária compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do lipossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, em conjunto com outros excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou veterinários adequados.
[0073] De preferência, as composições da invenção compreendem os lipossomas com uma distribuição de tamanho de partículas restrita, isto é, baixa heterogeneidade de tamanho. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica ou veterinária da invenção compreende lipossomas tendo um tamanho compreendido de 700 a 7000 nm, em que a membrana lipossomal compreende 22 a 33% em peso de FS e uma razão molar FS:FS:COL que está compreendida de 0,8:0,8:0,9 a 1,2:1,2:1,5, e a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal em função da quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
[0074] De preferência, os lipossomas compreendidos na composição da invenção encapsulam pelo menos um autoantígeno que está associado ao DT1. Com mais preferência, o autoantígeno é um peptídeo derivado de insulina. Ainda com mais preferência, o autoantígeno é um peptídeo selecionado da SEQ ID N°: 1 e da SEQ ID N°: 2.
[0075] Em uma uma modalidade, os lipossomas compreendidos na composição da invenção encapsulam pelo menos um autoantígeno que está associado à EM. De preferência, o autoantígeno é um peptídeo derivado de MOG. Ainda com mais preferência, o autoantígeno é um peptídeo com a SEQ ID N°: 3.
[0076] A presente invenção contempla também composições em que os lipossomas encapsulam mais de um autoantígeno e as composições compreendendo diferentes lipossomas, cada uma encapsulando um autoantígeno diferente. De preferência, todos os autoantígenos encapsulados em lipossomas nas composições da presente invenção estão relacionados com a mesma doença autoimune, de preferência, DT1 ou EM. Em uma modalidade específica, a composição compreende lipossomas que encapsulam ambos peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e a SEQ ID N°: 2. Em uma outra modalidade, a composição compreende lipossomas que encapsulam o peptídeo com a SEQ ID N°: 1 e lipossomas que encapsulam o peptídeo com a SEQ ID N°: 2. Em uma outra modalidade, a composição compreende lipossomas que encapsulam o peptídeo com a SEQ ID N°: 1 e lipossomas que encapsulam o peptídeo com a SEQ ID N°: 2 em um lipossoma com a SEQ ID N°: 1 para o lipossoma com a SEQ ID N°: 2, a razão em peso compreendida entre 10:1 e 1:10, particularmente de 5:1 a 1:5, mais particularmente entre 2:1 e 1:2, e de preferência 1:1.
[0077] Na presente invenção, o termo "excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a materiais, composições ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Cada componente precisa ser farmaceuticamente aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição farmacêutica. Também deve ser adequado para uso em contato com o tecido ou órgão de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outros problemas de imunogenicidade ou complicações comensuráveis com uma razão benefício/risco razoável. Da mesma forma, o termo "componente veterinário aceitável" significa apropriado para uso em contato com um animal não humano.
[0078] A formulação das composições da invenção depende em grande parte da via de administração. Em uma modalidade da invenção, o lipossoma que encapsula o autoantígeno é administrado a um paciente por via oral. As composições orais incluem comprimidos, pós, cápsulas, sachês, xaropes, bem como líquidos, suspensões e elixires, todos os quais podem ser formulados por métodos bem conhecidos na técnica. O lipossoma que encapsula o autoantígeno pode também ser administrado a um paciente por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal (i.p.), subcutânea, intramuscular ou intradérmica. Composições adequadas para estas vias de administração são bem conhecidas na técnica e incluem soluções para injeção, soluções para perfusão, pó para reconstituição de injeções líquidas e seringas pré-carregadas. No sentido da presente invenção, também podem ser adequados para formular o lipossoma que encapsula o autoantígeno para administração intranasal ou por inalação, administração retal ou para administração tópica sob a forma de, por exemplo, um creme, um gel, uma pomada ou um adesivo dérmico. Os métodos para a preparação destas formulações são conhecidos na técnica. Além disso, o lipossoma que encapsula o autoantígeno pode ser formulado como uma forma de dosagem de liberação controlada. As formas de dosagem de liberação controlada são conhecidas na técnica e particularmente desejáveis para o tratamento de doenças crônicas ou para a administração de agentes ativos que podem ser tóxicos em doses elevadas ou que mostram um padrão de meia-vida curta, quando administrados ao paciente.
[0079] A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz", como usada aqui, refere-se à quantidade de um composto que, quando administrado, é suficiente para impedir o desenvolvimento, ou aliviar em certa medida, de um ou mais dos sintomas da doença à qual é visada. A dose particular de composto administrada, de acordo com esta invenção, obviamente, será determinada pelas circunstâncias particulares que circundam o caso, incluindo o composto administrado, a eficiência de encapsulação, a via de administração, e considerações similares.
[0080] A condição autoimune particular a ser tratada desempenha um papel importante na dose particular de composto a ser administrada. Em uma modalidade, a doença autoimune a ser evitada ou tratada é selecionada do grupo consistindo em DT1, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, esclerose múltipla, doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, tiroidite de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, anemia hemolítica autoimune, neutropenia autoimune, doença de Graves, psoríase, artrite psoriática e síndrome de Sjogren. Em uma modalidade preferencial, a condição autoimune é DT1.
[0081] Além disso, o estágio clínico da doença autoimune a ser tratada também pode precisar ser considerado para a determinação de uma dose apropriada de lipossoma que encapsula o autoantígeno a ser administrado. Conforme já mencionado, os lipossomas da invenção são úteis tanto para a prevenção quanto para o tratamento de uma doença autoimune. Por "prevenção" compreende-se evitar a resposta imune anormal a um autoantígeno, através da qual os eventos patogênicos subjacentes à resposta imune anormal não são acionados. Por "tratamento" compreende-se lidar com eventos patogênicos contínuos subjacentes à resposta imune anormal e subsequentemente melhorar quaisquer sintomas clínicos que estejam presentes. Isto inclui o tratamento da doença autoimune em pacientes que, apesar de ter uma resposta autoimune e alguns danos teciduais, não apresentam sintomas clínicos ou apresentam apenas poucos sintomas clínicos da doença autoimune. Este estágio é frequentemente chamado de estágio "pré-clínico" e é típico da maioria das doenças autoimunes, por exemplo, em DT1, onde é chamado de pré-diabetes. Em pré-diabetes, as células B pancreáticas são danificadas, até certo ponto, mas apenas alguns dos critérios de diagnóstico para diabetes são satisfeitos. A doença neste estágio pode ser eficazmente tratada com a imunoterapia à base de lipossomas da presente invenção, como suportado pelos resultados obtidos nos experimentos descritos abaixo. Adicionalmente, os estágios avançados da doença autoimune onde o dano tecidual é elevado e os sintomas clínicos são aparentes, podem também ser eficazmente tratados pela administração de uma quantidade eficaz do lipossoma que encapsula o autoantígeno da invenção.
[0082] Uma modalidade da invenção é direcionada para a prevenção da doença autoimune, enquanto uma outra modalidade é direcionada para o tratamento da doença. Uma outra modalidade específica é direcionada ao tratamento de uma doença autoimune durante o estágio pré-clínico.
[0083] Em uma modalidade preferencial, a invenção fornece um lipossoma ou uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, para uso na prevenção de DT1. Em uma outra modalidade preferencial, o lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, é para uso no tratamento de DT1. Em ainda uma outra modalidade preferencial, o lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, é para uso no tratamento de DT1 em um indivíduo pré-diabético.
[0084] Em uma modalidade, a invenção fornece um lipossoma ou uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, para uso na prevenção de EM. Em uma outra modalidade, o lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, é para uso no tratamento de EM.
[0085] De modo geral, a dose de lipossoma que encapsula o autoantígeno a ser administrada é determinada tendo em consideração diversas circunstâncias. Apenas como um exemplo ilustrativo, quando se utiliza lipossomas MVV, de acordo com a invenção, contendo FS, FS e COL na razão molar de lipídios 1:1:1,33 (FS: FS:COL) que encapsulam o autoantígeno associado a TD1 com a SEQ ID N°: 1 em uma razão em peso de lipídios para autoantígeno 11,6:1 (quantidade total de lipídios total contra quantidade total de autoantígeno), a quantidade terapeuticamente eficaz para tratar um indivíduo humano que sofre de DT1 no estágio pré-diabético pode variar de 0,05 a 50 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal, de preferência, de 0,5 a 5 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal. Quando a SEQ ID N°: 2 é encapsulada em lipossomas, conforme definido acima, em uma razão em peso de lipídios para autoantígeno de 3,8:1, a quantidade terapeuticamente eficaz para tratar um indivíduo humano que sofre de DT1 no estágio pré-diabético pode variar de 0,05 a 50 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal, de preferência, de 0,5 a 5 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal. Quando se utiliza uma composição compreendendo ambos os tipos de lipossomas, conforme definido acima, de preferência, em uma razão em peso de lipossoma com a SEQ ID N°: 1 para o lipossoma com a da SEQ ID N°: 2 de 1:1, a quantidade terapeuticamente eficaz para tratar um indivíduo humano que sofre de DT1 no estágio pré-diabético pode também variar de 0,05 a 50 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal, de preferência, de 0,5 a 5 mg de lipossomas que encapsulam o autoantígeno/kg de peso corporal.
[0086] Além disso, o médico especialista determinará o número de doses do medicamento que serão administradas ao paciente a fim de evitar ou tratar a doença autoimune. Sobre esse assunto, os inventores verificaram que uma única dose de lipossomas que encapsulam o autoantígeno da presente invenção pode tratar eficazmente DT1 em camundongos pré-diabéticos. Entretanto, o médico especialista pode decidir que mais doses serão necessárias para tratar estágios avançados da doença. Em uma modalidade, o lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, são para o uso na prevenção ou no tratamento de uma doença autoimune, de preferência, DT1, por meio da administração de uma a cinco doses do dito lipossoma ou composição farmacêutica ao paciente. Em uma modalidade específica, a prevenção ou o tratamento são obtidos através da administração de uma, duas, três ou quatro doses. Em uma outra modalidade, o lipossoma ou a composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, são para o uso na prevenção ou no tratamento de DT1, por meios da administração de uma, duas, três, quatro ou cinco doses do dito lipossoma ou composição farmacêutica a um paciente. Em uma modalidade preferencial, o paciente é um paciente pré-diabético.
[0087] Uma vez que o efeito preventivo ou terapêutico é obtido através da apresentação tolerogênica do autoantígeno encapsulado e posterior supressão da resposta autoimune, os aspectos finais da invenção referem-se a um lipossoma ou uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme definido acima, para a restauração da autotolerância e para suprimir uma resposta autoimune. Em modalidades específicas destes aspectos da invenção, a restauração da autotolerância e a supressão da resposta autoimune estão no contexto de DT1, mais particularmente, no contexto de pré-diabetes.
[0088] Ao longo do relatório descritivo e das reivindicações, o termo "compreender" e variações da palavra, não têm a intenção de excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Além disso, a palavra "compreender" abrange o caso de "consistindo em". Objetos, vantagens e características adicionais da invenção tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica após análise do relatório descritivo ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os exemplos e os desenhos a seguir são fornecidos a título de ilustração, e não se destinam a serem limitadores da presente invenção. Os sinais de referência relacionados com desenhos e colocados entre parênteses em uma reivindicação, são exclusivamente para tentar aumentar a inteligibilidade da reivindicação, e não devem ser interpretados como limitadores do escopo da reivindicação. Além disso, a presente invenção cobre todas as combinações possíveis das modalidades particulares e preferenciais aqui descritas.
[0089] A fosfatidilserina (FS) e a fosfatidilcolina (FC) foram adquiridas junto à Lipoid, Steinhausen, Suíça. O colesterol (Col) foi adquirido junto à Sigma Aldrich, Saint Louis, EUA. O corante fluorescente Oregon Green 488 DHPE conjugado aos lípidos foi adquirido junto à Invitrogen, Califórnia, EUA. O Alexa Fluor 750 foi obtido junto à Invitrogen, na sua forma de éster de succinimidila e foi conjugado com o lipídeo DOPE fornecido pela Avanti Polar Lipids (Alabaster, EUA). Os peptídeos com a SEQ ID N°: 1 (GIVDQCCTSICSLYQLENYCN) e a SEQ ID N°: 2 (FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS), que derivam da cadeia A da insulina e da cadeia B da insulina, respectivamente, foram obtidos junto à Genosphere Biotechnologies (Paris, França) e foram > 95% puros e removidos por ácido trifluoroacético (TFA). O peptídeo com a SEQ ID N°: 3 (YRSPFSRVVHLYRNGK) derivado da glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) foi obtido junto ao Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona, IRBB, Barcelona, Espanha.
[0090] Os lipossomas foram preparados usando o método de hidratação de filme fino a partir de uma mistura lipídica de FS, FC e COL em uma razão molar de 1: 1: 1,33, respectivamente (Harel-Adar T, 2011). A quantidade de lípido total foi de 30 mM. Os lípidos e os corantes fluorescentes conjugados aos lípidos foram dissolvidos em clorofórmio e o solvente foi removido por evaporação sob vácuo e nitrogênio. Os lípidos foram hidratados com o tampão adequado (PBS, 0,5 mg/mL de solução de peptídeo com a SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 ou a SEQ ID N°: 3 em PBS separadamente), e os lipossomas assim obtidos foram homogeneizados a 1 μm, por meio de um extrusor (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canadá). O peptídeo não- encapsulado foi removido da formulação lipossomal por centrifugação. As distribuições de tamanho de partícula e a estabilidade dos lipossomas, expressa como potencial zeta (Z), foram medidas por dispersão de luz dinâmica (DLS) usando um Malvern Zetasizer, (Malvern Instruments, UK) em amostras não diluídas. A morfologia e a lamelaridade dos lipossomas foram examinadas usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica (crio-MET) em um microscópio JEOL-JEM 1400.
[0091] Camundongos NOD selvagens foram obtidos junto ao Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA) e mantidos sob condições específicas isentas de patógenos. Apenas fêmeas com 8 semanas de idade foram usadas.
[0092] Os camundongos foram adquiridos junto ao Harlan Laboratories (Itália) e alojados em condições convencionais. Apenas fêmeas com 8 a 10 semanas de idade foram usadas. Para a indução de EAE, camundongos C57BL/6 fêmeas (Harlan) com a idade de oito semanas, receberam injeções subcutâneas em ambos os flancos de 50 μg de peptídeo MOG em PBS, emulsionadas em um volume igual de adjuvante completo de Freund (CFA) contendo 4 mg/ l de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Difco, Detroit, MI, EUA), sob cetamina (50 mg/kg de peso corporal) e xilazina (5 mg/kg de peso corporal). Além disso, 250 ng de toxina Pertussis (Sigma Chemical) foram injetados por via intravenosa nos dias 0 e 2.
[0093] Este estudo foi executado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Generalitat de Catalunya, Governo catalão. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Germans Trias i Pujol Research Institute (número de autorização: DAAM 5157).
[0094] As CDs foram geradas a partir de progenitores de medula óssea de camundongos NOD em meio de cultura contendo GM-CSF (1000 U/ml; Prospec, Rehovot, Israel) como anteriormente relatado (Marin-Gallen, Clinicai and Experimental Immunology 2010). A pureza das CDs foi avaliada por meio da marcação com CD11c-PECy7 (BD Pharmingen) conforme descrito (Pujol-Autinell I, et al. PLOS ONE 2013). A viabilidade foi determinada por marcação com anexina e 7AAD, conforme previamente relatado (Pujol-Autonell I et al. PLOS ONE, 2013), e as células foram contadas por citometria de fluxo (Perfect Count Microspheres, Cytognos, Salamanca, Espanha). A captura de lipossomas foi realizada por CDs cocultivadas com micropartículas lipossomais (vazias ou carregadas com peptídeos de insulina), durante duas horas. A solução estoque de micropartículas lipossomais (30 mM) diluída para 100 a 1000 μM foi empregada para estes experimentos. As CDs de controle foram cultivadas quer em condições basais para se obter CDs imaturas (iCDs) ou estimuladas com LPS (100 ng/ml; Sigma) durante 24 horas para se obter CDs maduras (mCDs). A absorção in vitro dos lipossomas-FS pelas CDs foi determinada com lipossomas-FS marcados com fluorescência (Oregon green 488 DHPE, Invitrogen). Após lavagem em PBS extensivamente para remover os lipossomas ligados à membrana celular, a captura de lipossoma foi determinada por citometria de fluxo (FACSCanto II, BD Biosciences).
[0095] A expressão de moléculas de membrana coestimuladoras de CDs CD40 e CD86 foram determinadas por análise de citometria de fluxo (FACSCanto II). As CDs foram marcadas com anticorpos monoclonais para CD11c/PE-Cy7, CD40/APC, CD86/PE de camundongo (BD Pharmingen). A marcação de controle isotípico foi usada como um controle. Os dados foram analisados usando o software CellQuest (BD Biosciences). Com base em resultados anteriores do papel de PGE2 na indução de tolerância de células apoptóticas (Pujol-Autonell PLoS ONE 8: e63296, 2013), a produção de PGE2 após a captura de lipossoma-FS por CDs em sobrenadantes de culturas diferentes foi avaliada por ELISA (PGE2 EIA Kit- monoclonal; Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI). Limite de detecção: 80% B/B0: 15 pg/ml. Sensibilidade: 50% B/B0: 50 pg/ml. Os resultados foram expressos como um índice (pg de PGE2/106 células).
[0096] As CDs foram carregadas com 1 mM de lipossomas (vazios ou carregados com peptídeos de insulina), durante duas horas, com 20μg/m de insulina (Sigma, St Louis, MO, EUA) e, em seguida, usadas para determinar a proliferação de células T. As células T foram obtidas após a ruptura mecânica do baço de NOD e purificadas por seleção negativa usando anticorpos para CD19-PE, CD16/ 32-PE, CD11c- PECy7 (BD Pharmingen), CD11b-PE (ImmunoTools GmbH, Friesoythe, Alemanha), e Ly -6G (Gr-1)-eFluor660 (eBioscience, CA, EUA) e triagem (FACSAria II, BD Biosciences), conforme descrito (Pujol- Autonell, PLOS ONE 2013). As CDs (10.000 células) sozinhas ou pulsadas com lipossomas-FS vazios ou lipossomas que encapsulam autoantígeno foram cultivadas com 105 linfócitos T (razão 1:10). Após 6 dias, as células foram pulsadas com 1 μCi de (3H)-timidina (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) durante 16 h adicionais. As células foram colhidas (Harvester 96, Tomtec Inc., Hamden, CT, EUA) e analisadas usando um contador de cintilação (1450 Microbeta, TriluxWallac, Turku, Finlândia). A proliferação das células T foi expressa como c.p.m. x 103 células.
[0097] A camundongos NOD pré-diabéticos (8 semanas de idade) foi dada uma dose única intraperitoneal de 3 mg de lipossomas-FS (vazios ou que encapsulam os peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e a SEQ ID N°: 2 na razão de 1: 1) em 200 μl de solução salina. Um grupo de controle com intervenção simulada que recebeu apenas solução salina também foi incluído. Um total de 12 a 18 animais por grupo, foi usado. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à glicose na urina usando tiras Glucocard (Menarini, Barcelona, Espanha), e semanalmente quanto ao peso corporal durante um período de 30 semanas. Animais com glicosúria foram confirmados diabéticos quando o nível de glicose sanguínea era > 300 mg/dl.
[0098] Os camundongos NOD pré-diabéticos (>25 semanas de idade) foram tratados por via i.p. com 3 doses de 3,5 mg de lipossomas-FS (vazios ou que encapsulam os peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e a SEQ ID N°: 2 na razão de 1:1) em 200 μl de solução salina nos dias 1, 5 e 8 após o início da doença. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto à glicose na urina usando tiras Glucocard (Menarini, Barcelona, Espanha), durante um período de 30 semanas. Animais com glicosúria foram confirmados diabéticos e o início da doença foi determinado quando sucessivos níveis de glicose sanguínea foram maiores do que 200 mg/dL ou quando uma medida foi maior do que 300 mg/dL. Os níveis de glicose sanguínea foram monitorados semanalmente (AccuCheck, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA). Insulina, injetada diariamente por via subcutânea (s.c.) (1U, Insulatard Flex-Pen, Novo-Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca), foi administrada a partir do início da doença, a menos que a normoglicemia fosse obtida. A glicemia foi monitorada 3 vezes por semana (AccuCheck, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA), após duas horas de jejum.
[0099] O grau de infiltração das ilhotas por leucócitos -insulite- foi determinada no final do estudo. Resumidamente, os pâncreas de todos os camundongos de cada grupo foram rapidamente congelados em um banho de acetona gelada/isopentano. Crioseções de 5 μm foram obtidas em 5 níveis sem sobreposição. As seções foram coradas com Hematoxilina/Eosina, codificados e analisados por 2 observadores independentes que foram cegos para as condições experimentais. Cada observador avaliou um mínimo de 40 ilhotas por animal. A insulite foi classificada conforme descrito em outro lugar (Alba A, J Immunol 2004; 173: 6667-75): 0, sem insulite; 1, peri-insular; 2, insulite moderada (<25% das ilhotas infiltradas); 3, 25-75% das ilhotas infiltradas; 4, infiltração total das ilhotas.
[00100] C57BL/6 imunizados são frequentemente usados como modelo para a doença EAE, que está intimamente relacionada com EM e muitas vezes servem para testar terapias e tratamentos contra a EM. Para evitar o desenvolvimento de EAE, camundongos C57BL/6 imunizados foram tratados por via i.p. com duas doses de 1,75 mg de lipossomas-FS carregados com MOG40-55 em 100 μl de solução salina nos dias 5 e 9 após a imunização. Como controle, os camundongos foram tratados com lipossomas vazios (lipossomas-FS) ou PBS (intervenção simulada).
[00101] Todos os animais foram pesados e examinados diariamente quanto ao bem estar e estado clínico dos camundongos tratados, bem como sinais neurológicos. A classificação clínica da EAE foi realizada de acordo com os seguintes critérios (Espejo C, et al., Exp Neurol 2001.): 0, assintomática; 0,5, perda da metade distal do tônus da cauda; 1, perda de todo o tônus da cauda; 1,5, fraqueza dos membros posteriores; 2, paralisia dos membros posteriores; 2,5, paraplegia dos membros posteriores; 3, fraqueza dos membros anteriores; 4, quadriparesia; 4,5, quadriparesia grave; 5, quadriplegia; e 6 morte, conforme descrito em outro local [Espejo 2001, supra]. Análises de acompanhamento clínico foram executadas de forma cega por dois observadores diferentes.
[00102] Para experimentos de bioimageamento, lipossomas-FS marcados por fluorescência (Alexa Fluor 750) foram injetados i.p. em camundongos NOD pré-diabéticos e observados durante 3 dias. Os camundongos foram fotografados sob anestesia (Pearl Imager, Li-Cor) no momento da administração e 6, 24, 48 e 72 horas após a injeção. O sinal de fluorescência foi quantificado. No final do experimento, foram obtidos vários órgãos, pesados e fotografados para determinar a distribuição de fluorescência.
[00103] As estatísticas foram realizadas utilizando o programa Prism 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA). Para dados pareados, foi realizado um teste não paramétrico de Wilcoxon. Caso contrário, foi utilizado o teste de Mann Whitney. Um valor de p <0,05 foi considerado significativo.
[00104] Lipossomas apresentando FS que encapsulam peptídeos de insulina são capturados por CDs
[00105] Lipossomas-FS foram preparados com PS:PC:COL em razão molar de 1:1:1,33, para apresentar o ‘sinal de morte’ FS em sua superfície. Lipossomas vazios apresentam um tamanho médio de partícula de 1,014 μm, que é um tamanho ótimo para uma absorção eficiente pelas células dendríticas (Ulrich AS, Bioscience Reports 22: 129-150, 2002) com um índice de polidispersidade (PdI) de 0,321. Além disso, as medições do potencial zeta revelou uma carga de superfície líquida de -30,66 mV em lipossomas-FS. Por outro lado, quando os peptídeos encapsulados com lipossomas-FS com a SEQ ID N°: 1 ou a SEQ ID N°: 2 do camundongo Insulin2, os lipossomas apresentam um diâmetro médio de 1,062 μm (PdI = 0,324) e 0,954 μm (PdI = 0,309) para peptídeos com a SEQ ID N°: 1 e a SEQ ID N°: 2, respectivamente (Figura 1). Em relação ao potencial zeta, ambos os lipossomas encapsulados apresentam uma carga de superfície negativa de -29,5 mV. A % de encapsulação foi de 44,63 ± 23,68% para o peptídeo com a SEQ ID N°: 1 e 88,48 ± 3,97% para o peptídeo com a SEQ ID N°: 2 (média±DP). lipossomas-FS que encapsulam os peptídeos com a SEQ ID N°: 3 tinha diâmetro médio de 942,2 nm e potencial zeta de -33,66 mV. Eficiência de encapsulação para a SEQ ID N°: 3 foi 89,34 ± 4,69%. Por análise em crio-MET, observou-se que a maioria dos lipossomas (vazios ou que encapsulam o peptídeo) são vesículas multivesiculares (MVV). Após a cocultura, os lipossomas-FS foram engolfados por CDs (Figura 2).
[00106] A viabilidade após a cocultura de CDs era sempre similar para controlar as CDs, mesmo após um estímulo pró-inflamatório (Figura 3A), independentemente da dose (intervalo de 100 a 2000mM, dados não mostrados).
[00107] A expressão de duas moléculas coestimuladoras, CD40 e CD86, foi avaliada na superfície de CDs. (Figura 3B). Observou-se que a expressão de CD40 e CD86 na membrana da célula não aumenta após a captação dos lipossomas, permanecendo em níveis baixos. Após a exposição de LPS, as CDs aumentam significativamente CD40 e CD86 e a expressão de CDs carregadas com lipossomas-FS aumentam significativamente CD86 (p <0,001), mas não CD40. Em contraste, lipossomas-FSAB não aumentam significativamente CD40 nem a expressão da membrana de CD86.
[00108] Com base nos resultados anteriores (Pujol-Autonell, PLOS ONE 2013), foi examinada a produção de PGE2 induzida por lipossomas em CDs. A concentração de PGE2 foi significativamente aumentada no sobrenadante das CDs cocultivadas com lipossomas (vazios ou carregados com peptídeos de insulina) quando comparada com iCDs (p <0,05) (Figura 3C).
[00109] As CDs geradas a partir de progenitores de medula óssea de camundongos NOD foram >80% puras, com base na marcação para CD do marcador CD11c, e a viabilidade era sempre >90%. A pureza e viabilidade de células T foram sempre superiores a 90% e 95%, respectivamente (dados não mostrados). Observou-se que a captura de lipossomas-FS ou -FSAB por iCDs não aumentam a proliferação de células T autólogas, quando comparada com iCDs sozinhas (Figura 4). Após estímulo com LPS, a proliferação de células T induzida por mCDs foi maior do que a proliferação induzida por iCDs (p <0,05). Em contraste, a proliferação de células T induzida por CDs carregadas com lipossomas-FS ou -FSAB não aumenta, mesmo após o efeito destes estímulos pró-inflamatórios. Os resultados indicam que a proliferação de células T induzidas por lipossomas-FS-CDs não aumenta, nem mesmo após o efeito destes estímulos pró-inflamatórios.
[00110] Para avaliar a eficácia de lipossomas para a prevenção de DM1, tratamos camundongos NOD com uma única dose da imunoterapia, durante o período pré-diabético (8 semanas de idade). Como esperado, os animais do grupo de controle simulado desenvolveram diabetes de 13 semanas de idade e com uma incidência final de 81,3% (n = 16) (Figura 5A). O tratamento com lipossomas-FS vazios resultou em uma incidência da doença de 83,3% (n = 18) iniciando a doença em 15 semanas de idade. O tratamento com lipossomas-FS que encapsulam os peptídeos de insulina autoantigênicos resultou na melhora da doença, com uma incidência de 50% (n = 12) iniciando também em 15 semanas de idade. Não foram encontradas diferenças significativas no peso corporal (Figura 5B) dos camundongos que receberam a imunoterapia quando comparado com o grupo de intervenção simulada ou grupo tratado com lipossomas vazios.
[00111] Insulite foi classificada para 3 a 6 animais não diabéticos de cada grupo no final do período de acompanhamento (30 semanas) para determinar os efeitos do tratamento na infiltração leucocitária da ilhota (Figura 6A). Como esperado, os animais do grupo de intervenção simulada mostraram classificações elevadas de insulite (2,34 ± 0,18). Os camundongos tratados com lipossomas-FS vazios mostraram um grau similar de insulite (2,12 ± 0,46). A imunoterapia com lipossomas- FS que encapsulam peptídeos de insulina exibiu uma redução biológica, embora não significativa, da classificação de insulite (1,69 ± 0,58) quando comparada ao grupo de intervenção simulada. Além disso, a análise da porcentagem de ilhotas classificadas em cada uma das cinco categorias de infiltração mostraram que, em camundongos tratados com imunoterapia, 47% das ilhotas permaneceram isentas de insulite ou com peri-insulite ao passo que no grupo de intervenção simulada e no grupo de lipossomas-FS, 26% e 34% das ilhotas foram não destruídas, respectivamente (Figura 6B).
[00112] Lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina podem reverter diabetes em camundongos NOD quando administrados após o início da doença.
[00113] Lipossomas-FS carregados com peptídeos de insulina reverteram o diabetes em camundongos NOD quando administrados após o início da doença (Figura 8 A). Estes camundongos sobreviveram sem administração exógena de insulina alcançando níveis normais de glicemia. Em contraste, os camundongos tratados com lipossomas-FS vazios não alcançam a normoglicemia (Figura 8 B), apesar da administração contínua de insulina.
[00114] Lipossomas-FS contendo o peptídeo MOG (autoantígeno específico para EM). Estes lipossomas, quando injetados i.p. em camundongos C57BL/6 imunizados, impediram o desenvolvimento da doença (Figura 9). O tratamento com lipossomas carregados com o peptídeo MOG induziu um aumento de células T reguladoras clássicas, uma população de células envolvidas na manutenção da tolerância periférica, no baço de camundongos imunizados (resultados não mostrados). Tanto os lipossomas-FS quanto a encapsulação do peptídeo eram críticos para o efeito terapêutico, uma vez que os lipossomas vazios não tiveram efeito. Dessa forma, os lipossomas-FS que encapsulam o peptídeo MOG podem melhorar a EAE, fornecendo um primeiro ataque menos grave e rápida recuperação da exacerbação. Consequentemente, os lipossomas-FS que encapsulam o peptídeo MOG podem ser úteis para o tratamento de EM.
[00115] O sinal fluorescente dos lipossomas foi detectado em diferentes órgãos do sistema imune. Como esperado, os lipossomas foram localizado nos linfonodos pancreáticos, baço, pâncreas e linfonodos mediastinais ou paratímicos. (Figura 7). REFERÊNCIAS CITADAS NO PEDIDO DE PATENTE Marin-Gallen S, Clemente-Casares X, Planas R, Pujol-Autonell I, Carrascal J, et al. "Dendritic cells pulsed with antigen-specific apoptotic bodies prevent experimental type 1 diabetes". Clin Exp Immunol 2010, vol. 160, pp. 207-214. Alba A, Puertas MC, Carrillo J et al. "IFN beta accelerates autoimmune type 1 diabetes in nonobese diabetic mice and breaks the tolerance to beta cells in nondiabetes-prone mice". J Immunol 2004, vol. 173, pp. 6667-75. Pujol-Autonell I, Planas R, Ampudia R, Marín-Gallén S, Sanchez A, Carrascal J, , Marin A, Puig-Domingo M, Pujol-Borrell R, Verdaguer J, Vives-Pi M. "Efferocytosis promotes suppresive effects in dendritic cells through prostaglandin E2 production in the context of autoimmunity". PLOS ONE 8:e63296, 2013. Ulrich AS. "Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles". Bioscience Reports 2002, vol. 22, pp. 129-150. Maurer N. et al., "Developments in liposomal drug delivery Systems", Expert Opin Biol Ther, 2001, vol. 1(6), pp. 923-47. Waterhouse D. N. et al., "Preparation, characterization, and biological analysis of liposomal formulations of vincristine", Methods Enzymol., 2005; vol. 391, pp. 40-57. Urbán P. et al., "Study of the efficacy of antimalarial drugs delivered inside targeted immunoliposomal nanovectors", Nanoscale Research Letters, 2011, vol. 6, p. 620 Roep BO, Peakman M. "Antigen Targets of Type 1 Diabetes Autoimmunity". Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, vol. 2(4):a007781. oi: 10.1101/cshperspect.a007781. Review. PMID:22474615. Lernmark A. "Series introduction: Autoimmune diseases: are markers ready for prediction?". J. Clin Invest, 2001, vol. 108, pp. 1091-1096. Espejo C, et al. "Treatment with anti-interferon-gamma monoclonal antibodies modifies experimental autoimmune encephalomyelitis in interferon-gamma receptor knockout mice". Exp Neurol 2001, vol. 172, pp. 460-468.
Claims (14)
1. Lipossoma que encapsula um autoantígeno, caracterizado pelo fato de que (i) o lipossoma tem um tamanho compreendido de 500 a 15000 nm; e (ii) a membrana lipossomal compreende fosfatidilserina (FS) em uma quantidade compreendida de 10 a 40% em peso em relação à composição total da membrana lipossomal, e compreende ainda fosfatidilcolina (FC) e colesterol (COL), em que a membrana lipossomal compreende FS, FC e COL em uma razão molar FS:FC:COL que é compreendida de 0,6:0,6:0,7 a 1,5:1,5:1,8.
2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é uma vesícula multivesicular (MVV).
3. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a porcentagem em peso de FS é compreendida de 22 a 33% em relação à composição total da membrana lipossomal.
4. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a razão em peso entre a quantidade total de lipídios que formam a membrana lipossomal versus a quantidade total de autoantígeno(s) está compreendida de 20:1 a 3:1.
5. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o autoantígeno tem um tamanho compreendido de 5 a 50 aminoácidos.
6. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o autoantígeno é um peptídeo associado a uma doença autoimune selecionada do grupo consistindo em diabetes tipo 1 (DT1), lúpus eritematoso, artrite reumatoide, esclerose múltipla (EM), doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, tiroidite de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, anemia hemolítica autoimune, neutrofenia autoimune, doença de Graves, psoríase, artrite psoriática e síndrome de Sjogren.
7. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o autoantígeno está associado ao DT1 e é selecionado do grupo que consiste nos peptídeos da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 2.
8. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o autoantígeno está associado à EM e compreende a SEQ ID NO: 3.
9. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que encapsula autoantígenos adicionais, em que todos os autoantígenos encapsulados estão associados à mesma doença autoimune.
10. Composição farmacêutica ou veterinária, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do lipossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em conjunto com outros excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou veterinários adequados.
11. Uso de um lipossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica e/ou veterinária e/ou medicamento para a prevenção ou o tratamento de uma doença autoimune
12. Uso de um lipossoma, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica e/ou veterinária e/ou medicamento para a restauração da auto-tolerância em um paciente que sofre de uma doença autoimune.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é selecionada do grupo consistindo em DT1, lúpus eritematoso, artrite reumatoide, esclerose múltipla, doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, tiroidite de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, anemia hemolítica autoimune, neutrofenia autoimune, doença de Graves, psoríase, artrite psoriática e síndrome de Sjogren.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é diabetes tipo 1 ou EM.
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