CN106061502A

CN106061502A - 基于脂质体的免疫疗法

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Publication number: CN106061502A
Application number: CN201580007978.3A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·马斯波奇科马玛拉; 安东尼娅·玛丽亚·卡诺萨拉比尔; 玛尔塔·维沃斯皮; 厄玛·普约尔奥特内尔; 胡安·维达格尔奥特内尔
Original assignee: Katalla Nano Science And Technology Research Institute Foundation; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Fundacio Institut dInvestigació en Ciencies de la Salut Germans Trias I Pujol IGTP
Current assignee: Katalla Nano Science And Technology Research Institute Foundation; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut Catala de Nanociencia i Nanotecnologia ICN2; Fundacio Institut dInvestigació en Ciencies de la Salut Germans Trias I Pujol IGTP
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: BR112016016356A2; PL3094345T3; EP3094345B1; ES2672247T3; CN106061502B; CA2939435C; EP3094345A1; BR112016016356B1; MX2016009217A; CA2939435A1; WO2015107140A1; TR201807778T4; JP2019196363A; JP2017507171A; JP6546195B2; AU2015206016B2; US20160338953A1; AU2015206016A1

Abstract

本发明提供了封装自身抗原的脂质体，其中所述脂质体具有500至15000nm的大小，并且所述脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的10重量％至40重量％的量的磷脂酰丝氨酸(PS)。还提供了包含治疗有效量的所述脂质体的药物组合物或兽用组合物。此外，本发明提供了特别是用于治疗自身免疫病的作为药物用途的如上所限定的脂质体和药物组合物或兽用组合物。最后，本发明提供了用于恢复患有自身免疫病的患者的自身耐受性的如上所限定的脂质体和药物组合物或兽用组合物。

Description

基于脂质体的免疫疗法

本发明涉及医学领域。具体而言，本发明提供了用于预防或治疗自身免疫性病症的封装自身抗原的脂质体。

背景技术

自身免疫是有机体自己识别其自身构成部分的故障，从而产生针对其自身细胞和组织的免疫应答。将由于异常免疫应答引起的任何疾病称为自身免疫病。突出的实例包括1型糖尿病(T1D)、红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化(MS)、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、干燥综合征(Sjogren syndrome)。

据计算，发达国家的人口中有7％至10％的人口患有这些疾病，其通常是慢性的、令人衰弱的且威胁生命的。自身免疫相关的医学护理费用持续增加，因为自身免疫性病症在全球范围内增加且无可用的有效治疗。

传统上，用于自身免疫病的治疗是免疫抑制剂、抗炎剂(类固醇)或缓和剂。非免疫学疗法，如在桥本氏甲状腺炎或1型糖尿病中的激素替代，治疗自身侵略性应答的后果，因此这些是姑息疗法。饮食控制限制了乳糜泻的严重程度。甾族或NSAID的治疗限制了许多疾病的炎性症状。

在发展减轻或避免不希望的免疫应答的免疫调节疗法中已投入了大量的研究。然而，对不同的自身免疫病的复杂细节的有限认识实质上放慢了该领域的进展。当前的策略通常基于广泛作用的免疫抑制药物，为了维持免疫抑制，所述药物通常是终生治疗。此外，广泛作用的免疫抑制剂的使用与严重的副作用的风险相关，如肿瘤、感染、肾毒性和代谢病症。

迄今为止，尽管做出了努力，但仍需要治疗自身免疫性病症的进一步治疗方法，所述治疗方法有效且无不希望的副作用。

发明概述

本发明的发明人开发了在自身免疫病的治疗中非常有效的新的自身抗原特异性疗法。具体而言，发明人发现，通过将与意图治疗的自身免疫病相关的自身抗原封装在具有特定大小且包含脂质磷脂酰丝氨酸的脂质体中可以有效地治疗自身免疫病。

因此，第一方面本发明涉及封装自身抗原的脂质体，其中(i)脂质体具有500至15000nm的大小；以及(ii)脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的10重量％至40重量％的量的磷脂酰丝氨酸(PS)。

本发明的发明人发现，本发明的脂质体的特定特征，即500至15,000nm的大小以及存在10％至40％的PS，使封装的自身抗原能够通过抗原递呈细胞进行致耐受性递呈，从而恢复对自身抗原的耐受性。

不希望受理论束缚，发明人假设，本发明的脂质体的特定特征确保它们能被树突状细胞有效吞食，并且加工封装的自身抗原，通过MHC II类分子递呈至CD4+T淋巴细胞(外源性递呈)且以致耐受性形式递呈至CD8+T淋巴细胞(交叉递呈)，从而诱导对抗原的耐受性并停滞自身免疫级联。除非另有说明，否则本发明的封装自身抗原的脂质体诱导对自身抗原的耐受性，而不是自身免疫性，这导致对自身免疫性病症的有效治疗。

在下文的实施例中展示了本发明的封装自身抗原的脂质体的致耐受性效果以及所述脂质体在自身免疫性病症的治疗中，尤其是在T1D和MS的治疗中的令人惊讶的效果。

如在图2、图3和图4中所示，通过树突状细胞捕获封装胰岛素肽的PS-脂质体，借此，这些树突状细胞获得致耐受性特征：在糖尿病的情况中，共刺激分子的表达减少、诱导PGE2的产生以及T细胞的增殖减少。结果表明，类似于凋亡小体，脂质体在某种程度上促进树突状细胞(DC)的致耐受性。此外，在促炎刺激之后，作用未减弱(要考虑的重要特征)，因为这证明了一旦自身免疫级联持续且促刺激的刺激物存在，疗法有效。

如在下文的实施例中所示，上述全部导致自身免疫病的有效治疗。图5和图6表明，在单次施用本发明的脂质体下，实现了NOD前驱糖尿病小鼠的治疗，而图8A显示，当在疾病发作之后施用时，载有胰岛素肽的PS-脂质体可以逆转NOD小鼠中的糖尿病。而且，图9显示，在C57BL/6免疫小鼠中，含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽的PS-脂质体可以防止实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)病的发展。因此，与用于自身免疫性病症的已知免疫调节或抗炎治疗相比，不会永久地需要由发明人开发的基于脂质体的疗法。相反，实现了耐受性的长期恢复，导致有效地预防或治疗自身免疫病。在单次施用包含有效量的封装自身抗原的脂质体的药物组合物之后或可选地将其施用2-4次可以实现该效果。

还可以在图5、图6和图8B中观察到，当小鼠接受空脂质体时，对T1D的发病率无影响。因此，只有当脂质体封装合适的自身抗原时，治疗才有效，这表明纳米疗法的抗原特异性。

虽然是基于抗原特异的疗法，但本发明的封装自身抗原的脂质体具有未呈现不希望副作用的优点。如上文所提到的，用于治疗自身免疫病的其它免疫调节方法涉及免疫抑制剂，其通常导致对感染的高度易感性并且有时还促进肿瘤、肾毒性或代谢病症的发展。

除了提供致耐受性递呈之外，由于保护货物免于降解以及毒性的降低/不存在，将自身抗原封装在本发明特别设计的脂质体中是非常期望的目标。这是由于这样的事实：将自身抗原限制在脂质体中直到被抗原递呈细胞摄取，因此不会引起不良的免疫应答。

本发明的第二方面提供药物组合物或兽用组合物，其包含治疗有效量的如上所限定的封装自身抗原的脂质体以及其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂或载体。

本发明的基于脂质体的药物组合物在稳定性、均匀性以及便于大规模生产方面具有若干优势。

首先，可以使用低成本的常见试剂以及药物工业中的设备来实现本发明的封装自身抗原的脂质体的生产。

相比于倾向聚集的较小脂质体且它们的生产需要通过具有小孔径的昂贵膜的反复挤压过程，本发明的脂质体，由于其大小，在溶液中非常稳定且易于获得。

而且，可以保证产物的均匀性，同时用于大型工业生产的按比例增加是负担得起的。

另一大优点在于这样的事实：本发明的基于脂质体的药物组合物是限定的组合物，其没有不希望的污染物或副产物。封装自身抗原的脂质体不会退化为有毒的副产物，如坏死小体，且不会引起如在基于自体或异体细胞疗法的情况下的排斥。

由于致耐受性效果，本发明的封装自身抗原的脂质体提供了自身免疫性病症的有效预防(即，避免引发自身免疫)，以及对临床前阶段(即，已经引发自身免疫但组织损伤和临床症状低的阶段)和临床阶段(即，组织损伤较高且临床症状明显的阶段)的自身免疫病的有效治疗。

因此，在第三方面，本发明提供了用作药物的本发明的第一方面的封装自身抗原的脂质体。还可将该方面表述为用于预防或治疗疾病的方法，其包括向需要此类治疗的哺乳动物(包括人)施用治疗有效量的本发明的封装自身抗原的脂质体，以及一种或多种合适的药学可接受的赋形剂或载体。

在第四方面，本发明提供了用于预防或治疗自身免疫病的如上限定的封装自身抗原的脂质体。可将该方面表述为如上限定的封装自身抗原的脂质体在制备用于预防或治疗自身免疫病的药物中的用途。还可将该方面表述为用于预防或治疗自身免疫病的方法，其包括向有此需要的对象(包括人)施用治疗有效量的如上所限定的封装自身抗原的脂质体，以及药学可接受的赋形剂或载体。

在第五方面，本发明提供了用于恢复患有自身免疫病的患者的自身耐受性的如上所限定的封装自身抗原的脂质体。可将该方面表述为如上所限定的封装自身抗原的脂质体在制备用于恢复患有自身免疫病的患者的自身耐受性的药物中的用途。还可将该方面表述为用于恢复患有自身免疫病的患者的自身耐受性的方法，其包括向有此需要的对象(包括人)施用治疗有效量的如上所限定的封装自身抗原的脂质体，以及药学可接受的赋形剂或载体。

最后，本发明的其它方面提供了用于抑制自身免疫应答的如上限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物；以及用于预防或治疗自身免疫病的如上限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物，其中所述脂质体或者药物组合物或兽用组合物恢复对封装的自身抗原的耐受性。

附图简述

图1.载有源于胰岛素的自身抗原的PS-脂质体的低温透射电子显微镜(cryo-TEM，JEOL-JEM 1400显微镜)图像。比例尺＝0.2μm。

图2.对照DC(A)、DC与俄勒冈绿488DHPE标记的PS-脂质体(OG488PS-lipo)于4℃(B)和37℃(C)共培养30分钟的流式细胞术(FACS)分析。x-坐标代表OG488PS-lipo；y-坐标代表CD11c-PECy7染色的DC。

图3.在DC中捕获PS-脂质体的影响。y-坐标代表(A)通过膜联蛋白V和7aad染色评估的DC的活力(％)，(B)CD40和CD86膜表达的荧光强度的中值以及(C)通过ELISA定量未成熟DC和成熟DC的培养上清液中前列腺素E2(PGE2)的产生。白色符号代表在捕获PS-脂质体(正方形)或载有胰岛素肽的PS-脂质体(圆圈)之前(三角形)和在培养后24小时，捕获PS-脂质体或载有胰岛素肽的PS-脂质体之后的未成熟DC。黑色符号代表在捕获PS-脂质体(正方形)或载有胰岛素肽的PS-脂质体(圆圈)之前(三角形)和在促炎刺激(脂多糖，LPS)之后24小时，捕获PS-脂质体或载有胰岛素肽的PS-脂质体之后成熟DC的活力。ELISA数据以pg/10⁶个细胞表示。

图4.在捕获PS-脂质体之后，即使在促炎刺激之后，DC刺激自体T细胞增殖的能力受损。y-坐标代表由在捕获PS-脂质体(白色正方形)或以1:10的比例载有胰岛素肽(20μg/ml)的PS-脂质体(白色圆圈)之前(白色三角形)和培养7天，捕获PS-脂质体或以1:10的比例载有胰岛素肽(20μg/ml)的PS-脂质体之后的未成熟DC诱导的刺激之后的T细胞的自体增殖(c.p.m.，3H胸苷分析)。黑色符号代表在捕获PS-脂质体(黑色正方形)或载有胰岛素肽的PS-脂质体(黑色圆圈)之前(黑色三角形)和之后被促炎刺激物LPS(100ng/ml)预先活化的成熟DC诱导的增殖。

图5.利用封装胰岛素肽的PS-脂质体的免疫疗法降低了T1D的发病率。(A)y-坐标代表在用载有胰岛素肽的PS-脂质体(圆圈，n＝12)、空PS-脂质体(正方形，n＝18)治疗的NOD小鼠中，以及在接受盐溶液的对照组(三角形，n＝16)中糖尿病的累积发病率(百分比)。(B)y-坐标代表在用载有胰岛素肽的PS-脂质体(圆圈，n＝12-6)、空PS-脂质体(正方形，n＝18-3)治疗的小鼠中，以及在用盐溶液治疗的对照组(三角形，n＝16-3)中体重(g)的追踪。x-坐标表示小鼠的周龄。

图6.胰岛炎得分在免疫小鼠中不太严重。PS-脂质体对NOD小鼠中的胰岛炎的影响。y-坐标代表(A)不同组的NOD小鼠的胰岛炎得分以及(B)在不同的NOD小鼠组中被归类在5个浸润类别的每一个中的胰岛的百分比。浸润类别：0，无胰岛炎；1，周边胰岛的；2，轻度胰岛炎(浸润胰岛<25％)；3，25-75％的胰岛浸润；4，全部胰岛浸润。NOD小鼠组是：用盐溶液(S)治疗的对照小鼠、用空PS-脂质体(PS)治疗的小鼠以及用含自身抗原的PS-脂质体(PSAB)治疗的小鼠。在研究期结束时(30周)，分析来自4-6只非糖尿病小鼠/组的胰腺。结果是平均值±SEM。*相对于对照组的显著性差异(p<0.05)(非配对t-检验)。

图7：PS-脂质体的追踪。来自腹膜内(i.p.)注射荧光标记的PS-脂质体(AlexaFluor 750)的NOD小鼠的几种器官在24小时的荧光信号(RFU，相对荧光单位/g组织)的直方图。PAT，周边生殖腺的脂肪组织；K，肾脏；S，脾脏；P，胰腺；PLN，胰淋巴结；MLN，肠系膜淋巴结；L，肝脏；MDLN，纵隔淋巴结；T，胸腺。示出了三次独立实验的一次代表性实验的结果。Y-坐标表示RFU/g组织。

图8.疾病发作(第0天)之后1天、5天和8天用载有胰岛素肽的PS-脂质体(A)或空脂质体(B)治疗的糖尿病小鼠中的血糖水平。Y-坐标表示血液的血糖(mg/dl)。灰色区表示诊断价值的血糖范围。X-坐标表示从疾病发作起的时间，用天数表示。圆圈表示无胰岛素施用的天数。

图9.针对用含MOG肽的脂质体(白色圆圈)或空脂质体(白色三角形)治疗的C57BL/6免疫小鼠每日进行EAE的临床得分。Y-坐标表示平均的临床得分。X-坐标表示免疫后的时间，用天数表示。

发明详述

在第一方面，本发明提供了封装自身抗原的脂质体。

术语“脂质体”应被理解为包含由脂质双层组成的一个或多个膜的自组装结构，所述脂质双层各自包含含有相对朝向的两亲性脂质分子的两个单层。两亲性脂质包含共价连接的极性(亲水性)头基区以及一条或两条非极性(疏水性)酰基链。疏水性酰基链和周围的水性介质之间的能量上不利的接触诱导两亲性脂质分子本身进行排列，使得它们的极性头基朝向双层的表面，而酰基链重定向朝向双层的内部。因此，形成能量上稳定的结构，在所述结构中，有效地防止酰基链与水性环境接触。

脂质体可以具有单一的双层膜(小单层囊泡“SUV”和大单层囊泡“LUV”)或多个双层膜(多层大囊泡“MLV”)。还可以将脂质体制备为多囊状囊泡“MVV”，其为包封或封装多个非同心水性室的脂质体。相反，MLV具有多个同心的“洋葱皮”样的膜，其各自封装水性隔室。考虑到脂质分子的保护屏障内水性体积的这种封装，脂质体能够使封装的分子(例如，肽)隔绝远离外部环境中存在的诸如肽酶的因子的降解作用。

本发明的脂质体的大小是500至15,000nm(促进脂质体被抗原递呈细胞摄取的大小)。此外，本发明的脂质体优选具有MVV的形态，如图1所示。当与常见的MLV或SUV相比时，这些大的MVV脂质体具有显著较高的装载功效，并且还有助于将封装的活性剂(在该情况下是自身抗原)优选溶于水性隔室(而不是沉淀或被锚定至膜)。所有这些在自身抗原在抗原递呈细胞内的生物利用度的方面具有优势，这导致更高的免疫调节活性。

在一个实施方案中，本发明的脂质体具有500至12,000nm的大小。在另一实施方案中，脂质体的大小是500至10,000nm。在另一实施方案中，脂质体的大小是600至8000nm，更具体地为700至7000nm、或800至5000nm、或900至3000nm，或900至2000nm、或900至1500nm、或1000至1400nm。在具体实施方案中，脂质体具有1000至1300nm的大小，例如1000nm、1050nm、1100nm、1150nm或1200nm。

在一个实施方案中，本发明的脂质体具有MVV的形态且具有500至12,000nm的大小。在另一实施方案中，本发明的脂质体具有MVV的形态且具有500至10,000nm的大小。在另一实施方案中，本发明的脂质体具有MVV的形态且具有600至8000nm的大小，更具体地为700至7000nm、或800至5000nm、或900至3000nm、或900至2000nm、或900至1500nm、或1000至1400nm。在具体实施方案中，脂质体具有MVV的形态且具有1000至1300nm的大小，例如1000nm、1050nm、1100nm、1150nm或1200nm。

脂质体的膜可以包含但不限于诸如磷脂酰胆碱(“PC”)、磷酯酰丝氨酸(“PS”)、磷酯酰乙醇胺(“PE”)、磷酯酰甘油(“PG”)、磷酯酰肌醇(“PI”)和磷酯酸(“PA”)的磷脂。可以构成纳米颗粒的膜的其它脂质包括但不限于胆固醇(“CHOL”)和胆固醇-PEG以及荧光标记的磷脂酰胆碱。脂质体的膜可以含有性质上非脂质的另外分子，如蛋白、碳水化合物、抗体或聚乙二醇(PEG)链。脂质体可以包含特定的部分，所述部分被设计成将脂质体靶向特异位点或靶细胞，或者保护脂质体抵抗有害环境(例如胃肠道)。对于自身抗原的致耐受性递送，脂质体的组分是相关的。因此，如上文所提到的，脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的10重量％至40重量％的量的PS。包含在脂质体的膜中的PS构成‘吃我(eat me)’信号，其连接抗原递呈细胞的PS识别与耐受性诱导的后果。值得注意的是，本发明的脂质体不需要其他受体或配体以被DC有效吞食并且实现自身抗原的致耐受性递送。然而，可以将其它受体和/或配体组装进脂质体，以便改善摄取和/或致耐受性加工。

术语“重量百分比(％)”指脂质体的膜的各成分相对于膜的脂质体组分的总重量的百分比。

“膜的脂质体组分”，例如，当为包含多于一个膜双层的MVV脂质体时(如图1中所示)，指包含在脂质体中的膜双层的全部。当使用术语“脂质体的膜(liposome membrane)”或“脂质体的膜(liposomal membrane)”时，应进行相同的理解，其二者均指包含在本发明的脂质体中的全部膜双层(不仅是外面的膜)。

在一个实施方案中，脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的15重量％至37重量％的量的PS。在其他实施方案中，膜的PS是全部膜的脂质体组分的20重量％至35重量％、或22重量％至35重量％、或22重量％至33重量％、或25重量％至32重量％、或26重量％至31重量％、或27重量％至30重量％，例如27％、28％、29％或30％。优选地，膜的PS是全部膜的脂质体组分的30％。

除PS之外，本发明的脂质体可以包含不同浓度的其它脂质。在一些实施方案中，脂质体的膜还包含PC。在一些实施方案中，脂质体的膜还包含CHOL。在具体实施方案中，脂质体的膜还包含PC和CHOL。

在一个实施方案中，脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的10重量％至40重量％的量的PC。在另一实施方案中，脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的12重量％至40重量％的量的PC。在其他实施方案中，膜的PS是全部膜的脂质体组分的15重量％至37重量％，或20重量％至35重量％、或22重量％至33重量％、或25重量％至32重量％、或26重量％至31重量％、或27重量％至30重量％，例如27％、28％、29％或30％。

CHOL的量可以是全部膜的脂质体组分的13重量％至53重量％。在一个实施方案中，脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的20重量％至50重量％的量的CHOL。在其他实施方案中，优选地，膜的CHOL是全部膜的脂质体组分的27重量％至46重量％、或30重量％至44重量％、或33重量％至42重量％、或36重量％至40重量％，例如36％、37％、38％、39％或40％。

包含在脂质体的膜中的不同脂质的比例必须是平衡的以便获得就稳定性、渗透性和形态学方面具有合适的物理化学特性的脂质体。通常，脂质体的膜可以包含PS:PC:CHOL的摩尔比为0.6:0.6:0.7至1.5:1.5:1.8的PS、PC和CHOL。术语“比值”以通常的含义理解为相对于彼此的数量的量级。具体地，两个数量的比值表示第二数量(Y)包含多少倍的第一数量(X)，且表示为X:Y。当提到的量级是摩尔浓度时，使用术语“摩尔比”。可选地，当提到的量级是重量时，将比值表述为“重量比”。此处，对于三种具体的脂质(PS、PC和CHOL)，给出了摩尔比的范围。在一个实施方案中，膜包含摩尔比为0.7:0.7:0.8至1.4:1.4:1.6的PS:PC:CHOL。在另一实施方案中，膜包含摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL。在另一实施方案中，膜包含摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CHOL。在优选实施方案中，膜包含摩尔比为大约1:1:1.33的PS:PC:CHOL。

如上文所提到的，本发明的脂质体封装自身抗原。术语“自身抗原”指被患有特异性自身免疫病的患者的免疫系统识别的正常蛋白或蛋白的复合体。在正常条件下，这些抗原不应当是免疫系统的靶标，但是，主要由于遗传和环境因素，在这些患者中丧失了此类抗原的正常免疫学耐受性。在某些实施方案中，脂质体封装与同一自身免疫病相关的其他自身抗原。例如，脂质体可以封装优选与T1D相关的两种、三种、四种或五种自身抗原。

在一些实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是50:1至2:1。在另一实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是30:1至3:1。在另一实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。在另一实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。在另一实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是12:1至3:1。在另一实施方案中，形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比选自：11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1和4:1。

在一个实施方案中，脂质体具有500至10,000nm的大小，脂质体的膜包含20重量％至35重量％的PS且包含摩尔比为0.7:0.7:0.8至1.4:1.4:1.6的PS:PC:CHOL，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是50:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有700至7,000nm的大小，脂质体的膜包含22重量％至33重量％的PS以及摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

在另一实施方案中，脂质体具有800至5000nm的大小，脂质体的膜包含25重量％至32重量％的PS以及摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CH，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。

在另一实施方案中，脂质体具有900至3000nm的大小，脂质体的膜包含30重量％的PS、30重量％的PS和40重量％的CH，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是12:1至3:1，优选地，重量比选自：11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1和4:1。

在另一实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及800至5000nm的大小，脂质体的膜包含25重量％至32重量％的PS以及摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CH，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。在另一实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及900至3000nm的大小，脂质体的膜包含30重量％的PS、30重量％的PS和40重量％的CH，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是12:1至3:1，优选地，重量比选自：11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1和4:1。在优选实施方案中，脂质体具有MVV的形态、1000nm的大小，脂质体的膜包含30重量％的PS、30重量％的PS和40重量％的CH，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是12:1至3:1，优选地，重量比选自：11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1和4:1。

封装的自身抗原与特异性自身免疫病相关。在某些实施方案中，自身抗原与选自以下的自身免疫病相关：T1D、红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、格雷夫斯病、银屑病、银屑病性关节炎以及干燥综合征。在具体实施方案中，脂质体封装与T1D相关的自身抗原。已知与T1D相关的非限制性自身抗原是胰岛素、胰岛素原、蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2，也被称作胰岛细胞抗原512)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、嗜铬粒蛋白和胰岛-葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)(Roep BO,PeakmanM.Cold Spring Harb Perspect Med,2012,vol.2(4):a007781.oi:10.1101/cshperspect.a007781.)。因此，在一个实施方案中，本发明的脂质体封装选自以下的自身抗原：胰岛素、胰岛素原、IA2、GAD、嗜铬粒蛋白和IGRP。

而且，在本发明的含义中，封装在脂质体中的自身抗原不需要是完整的抗原蛋白。事实上，相关蛋白的特异性区域已被分离并描述为特定抗原的。因此，在某些实施方案中，脂质体封装这样的自身抗原：其为抗原肽，特别是与T1D相关的抗原肽，例如，源自胰岛素、胰岛素原、IA2、GAD、嗜铬粒蛋白和IGRP的抗原肽。例如，已将由源自胰岛素A链的SEQ IDNO:1(21个氨基酸，GIVDQCCTSICSLYQLENYCN)和源自胰岛素B链的SEQ ID NO:2(30个氨基酸，FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS)定义的肽公开为T1D中的特定自身抗原。因此，在一个实施方案中，脂质体封装与T1D相关的自身抗原且所述自身抗原源自胰岛素，优选选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽。在具体实施方案中，脂质体封装具有SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的肽。

与自身免疫病相关且可被封装在本发明的脂质体中的其它自身抗原蛋白或肽是，例如，对于多发性硬化，来自髓磷脂的肽，如源自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的肽；对于重症肌无力，来自乙酰胆碱受体的肽；对于乳糜泻，为转谷氨酰胺酶；对于自身免疫性甲状腺炎，为甲状腺球蛋白(Lernmark A.J.Clin Invest,2001,vol.108,p.1091-1096)。在具体实施方案中，本发明的脂质体封装与MS相关的抗原肽的自身抗原，例如，源自MOG的抗原肽，如由SEQ ID NO:3定义的肽。

有利地，包含在本发明的脂质体中的自身抗原肽具有使所述抗原能够被主要组织相容性复合体表面分子直接递呈的大小。“直接递呈”意指在表面展示之前不需要抗原递呈细胞对这些肽进行主要的加工。在一些实施方案中，本发明的脂质体中的自身抗原肽的大小是5至100个氨基酸，特别是5至70个氨基酸、或8至50个氨基酸、或8至35个氨基酸、或8至30个氨基酸。此类自身抗原提供以下方面的优点：生物利用度、基于脂质体疗法的效力且便于加工(当与完整的蛋白或大肽相比时，此类小肽的封装更容易且成本更低)。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及700至7000nm的大小，脂质体的膜包含22重量％至33重量％的PS以及摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL，脂质体封装与T1D相关的至少一种自身抗原，优选源自胰岛素的肽的自身抗原，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及700至7000nm的大小，脂质体的膜包含22重量％至33重量％的PS以及摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL，至少一种自身抗原为选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及800至5000nm的大小，脂质体的膜包含25重量％至32重量％的PS以及摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CHOL，至少一种自身抗原是选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及800至5000nm的大小，脂质体的膜包含25重量％至32重量％的PS以及摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CHOL，至少一种自身抗原是SEQ ID NO:1的肽，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及800至5000nm的大小，脂质体的膜包含25重量％至32重量％的PS以及摩尔比为0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CHOL，至少一种自身抗原是SEQ ID NO:2的肽，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是15:1至3:1。

在一个实施方案中，脂质体具有MVV的形态以及700至7000nm的大小，脂质体的膜包含22重量％至33重量％的PS以及摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL，脂质体封装与MS相关的至少一种自身抗原，优选源自MOG的肽的自身抗原，所述肽如由SEQ IDNO:3定义的肽，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

本领域技术人员熟知的多种方法可用来制备封装一种或多种肽的脂质体。例如，通过脂质薄膜水化法，在脂质体形成期间将自身抗原直接截留可以形成本发明的脂质体。

在一个实施方案中，本发明的脂质体通过以下方法制备，所述方法包括：(a)在适当的溶剂(例如氯仿)中制备脂质混合物，(b)例如，通过在真空下蒸发将溶剂移除，(c)使脂质混合物与含有至少一种自身抗原的合适缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)水化，(d)任选地，例如通过离心将未封装的肽移除，以及(e)依据大小将所得到的含自身抗原的脂质体进行纯化或均质化。优选地，挤压可用来使脂质体的大小变均匀，即在压力下迫使脂质体通过确定的选定大小的滤孔来产生具有预定平均大小的脂质体。还可使用切向流过滤来纯化和调整脂质体的大小，即以产生具有较少杂质、较少大小异质性、以及更多均质且均匀大小分布的脂质体群。当脂质体封装多于一种自身抗原时，在含有期望比例的所述自身抗原混合物的缓冲液的存在下进行水化步骤(c)。此种比例考虑了各个自身抗原的具体封装效率。

在另一实施方案中，本发明涉及通过上述方法获得的封装自身抗原的脂质体。

本领域已知的其它方法也可用于获得本发明的封装自身抗原的脂质体。例如，一些实施方案涵盖了首先获得脂质体以及然后封装自身抗原。本领域存在熟知的方法以将化合物封装在脂质体内(参见Maurer N.et al.,Expert Opin Biol Ther,2001,vol.1(6),p.923-47；Waterhouse D.N.et al.,Methods Enzymol.,2005；vol.391,p.40-57；UrbánP.et al.,Nanosc.Res.Lett.,2011,vol.6,p.620)。

本发明的另一方面提供了药物组合物或兽用组合物，其包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所限定的脂质体，以及其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂或载体。

优选地，本发明的组合物包含窄粒径分布的脂质体，即，低的大小异质性(heterogeneity)。在具体实施方案中，本发明的药物组合物或兽用组合物包含具有700至7000nm大小的脂质体，其中脂质体的膜包含22重量％至33重量％的PS以及摩尔比为0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CHOL，以及形成脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

优选地，包含在本发明的组合物中的脂质体至少封装与T1D相关的自身抗原。更优选地，自身抗原是源自胰岛素的肽。更优选地，自身抗原是选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽。

在一个实施方案中，包含在本发明的组合物中的脂质体至少封装与MS相关的自身抗原。优选地，自身抗原是源自MOG的肽。更优选地，自身抗原是SEQ ID NO:3的肽。

本发明还涵盖了其中脂质体封装多于一种自身抗原的组合物以及包含各自封装不同自身抗原的不同脂质体的组合物。优选地，封装在本发明的组合物中的脂质体中的所有自身抗原与同一自身免疫病相关，优选T1D或MS。在具体实施方案中，组合物包含封装SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的两种肽的脂质体。在另一实施方案中，组合物包含封装SEQ IDNO:1的肽的脂质体和封装SEQ ID NO:2的肽的脂质体。在另一实施方案中，组合物以具有SEQ ID NO:1的脂质体与具有SEQ ID NO:2的脂质体的以下重量比包含封装SEQ ID NO:1的肽的脂质体和封装SEQ ID NO:2的肽的脂质体：10:1至1:10，特别是5:1至1:5，更特别是2:1至1:2，以及优选1:1。

在本发明中，术语“药学可接受的赋形剂或载体”指药学可接受的材料、组分或媒介物。从与药物组合物的其它成分相容的意义上来说，各组分必须是药学可接受的。还必须适合用于与人和动物的组织或器官接触，而没有与合理的效益/风险比相比过度的毒性、刺激性、过敏性应答、免疫原性或其它问题或并发症。同样地，术语“兽医学可接受的”意指适合用于与非人的动物接触。

本发明的组合物的剂型极大地取决于施用途径。在本发明的一个实施方案中，患者口服施用封装自身抗原的脂质体。口服组合物包括片剂、粉剂、胶囊、药囊以及液体糖浆剂、混悬剂和酏剂，其所有均可通过本领域熟知的方法配制。还可通过静脉内途径、动脉内途径、腹膜内(i.p.)途径、皮下途径、肌内途径或皮肤内途径向患者施用封装自身抗原的脂质体。适合这些施用途径的组分也是本领域熟知的，并且包括用于注射的溶液、用于灌注的溶液、用于液体注射的复溶粉剂以及预装注射器。从本发明的意义上来说，还适合于配制用于以下的封装自身抗原的脂质体：鼻内施用或吸入施用、直肠施用或例如，乳霜、凝胶、软膏或皮肤贴剂形式的局部施用。用于制备这些制剂的方法是本领域已知的。而且，可将封装自身抗原的脂质体配制为控释剂型。控释剂型是本领域已知的，并且对于治疗慢性疾病或施用在高剂量下可能有毒或当向患者施用时显示低半衰期模式的活性剂是特别可取的。

本文使用的表述“治疗有效量”，指当施用时，足以防止要处理的疾病的一个或多个症状的发展或在某种程度上减轻要处理的疾病的一个或多个症状的化合物的量。根据本发明施用的化合物的具体剂量当然应通过围绕病例的具体情况确定，包括施用的化合物、封装效率、施用的途径以及类似考虑因素。

正治疗的具体自身免疫性病况对待施用的化合物的具体剂量起重要作用。在一个实施方案中，待预防或治疗的自身免疫病选自：T1D、红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、格雷夫斯病、银屑病、银屑病性关节炎以及干燥综合征。在优选实施方案中，自身免疫性病况是T1D。

而且，正治疗的自身免疫性病况的临床阶段还需要将确定待施用的封装自身抗原的脂质体的合适剂量考虑在内。如已提到的，本发明的脂质体可用于预防和治疗自身免疫病。“预防”，应被理解为预防对自身抗原的异常免疫应答，由此不会触发异常免疫应答背后的致病事件。“治疗”，应被理解为处理异常免疫应答背后的持续致病事件且随后减轻存在的任何一个临床症状。这包括治疗尽管具有自身免疫应答和一些组织损伤，但不显示临床症状或仅显示自身免疫病的很少临床症状的患者中的自身免疫性病况。该阶段通常被称为“临床前”阶段，并且是大多数自身免疫病的典型阶段，例如在T1D中，将其称为前驱糖尿病。在前驱糖尿病中，胰腺B细胞在某种程度上受损，但仅满足糖尿病的某些诊断标准。可以用本发明的基于脂质体的免疫疗法有效治疗该阶段的疾病，如由下文所描述的实验中获得的结果所支持。此外，也可通过施用有效量的本发明的封装自身抗原的脂质体来有效治疗其中组织损伤高且临床症状明显的晚期自身免疫病。

本发明的一个实施方案涉及自身免疫病的预防，而另一实施方案涉及疾病的治疗。另一具体实施方案涉及临床前阶段的自身免疫病的治疗。

在优选实施方案中，本发明提供了用于预防T1D的如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物。在另一优选实施方案中，将如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物用于T1D的治疗。在另一优选实施方案中，将如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物用于前驱糖尿病对象中的T1D的治疗。

在一个实施方案中，本发明提供了用于预防MS的如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物。在另一实施方案中，将如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物用于MS的治疗。

总之，鉴于数种情况确定待施用的封装自身抗原的脂质体的剂量。仅作为示例性实例，当使用包含脂质摩尔比为1:1:1.33(PS:PC:CHOL)的PS、PC和CHOL的本发明的MVV脂质体时，用于治疗患有前驱糖尿病阶段的T1D的人对象的治疗有效量可以是0.05至50mg封装自身抗原的脂质体/kg体重，优选0.5至5mg封装自身抗原的脂质体/kg体重，所述MVV脂质体封装脂质与抗原重量比为11,6:1(脂质的总量相对自身抗原的总量)的SEQ ID NO:1的TD1相关自身抗原。当将SEQ ID NO:2以脂质与抗原重量比3.8:1封装在如上所限定的脂质体中封装时，用于治疗患有前驱糖尿病阶段T1D的人对象的治疗有效量可以是0.05至50mg封装自身抗原的脂质体/kg体重，优选0.5至5mg封装自身抗原的脂质体/kg体重。当使用包含如上所限定的两种类型脂质体的组合物时，优选SEQ ID NO:1的脂质体与SEQ ID NO:2的脂质体重量比为1:1，用于治疗患有前驱糖尿病阶段的T1D的人对象的治疗有效量还可以是0.05至50mg封装自身抗原的脂质体/kg体重，优选0.5至5mg封装自身抗原的脂质体/kg体重。

而且，为了预防或治疗自身免疫病，医学专家将会确定向患者施用多少剂量的药物。在该方面，发明人发现，仅一个剂量的本发明的封装自身抗原的脂质体就可以有效治疗前驱糖尿病小鼠中的T1D。然而，医学专家可以决定，需要更多剂量以治疗晚期疾病。在一个实施方案中，通过向患者施用一至五个剂量的所述脂质体或药物组合物，将如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物用于自身免疫病(优选T1D)的预防或治疗。在具体实施方案中，通过施用一个、两个，三个或四个剂量实现预防或治疗。在另一实施方案中，通过向患者施用一个、两个、三个、四个或五个剂量的所述脂质体或药物组合物，将如上所限定的脂质体或者药物组合物或兽用组合物用于T1D的治疗。在优选实施方案中，患者是前驱糖尿病患者。

因为通过封装的自身抗原的致耐受性递呈以及随后自身免疫性应答的抑制，实现了预防或治疗效果，本发明的最后方面涉及用于恢复自身耐受性以及用于抑制自身免疫应答的如上所限定的脂质体或药物组合物或兽用组合物。在本发明的这些方面的具体实施方案中，自身耐受性的恢复以及自身免疫性应答的抑制是在T1D的情况中，更具体地在前驱糖尿病的情况中。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”及其变体不是旨在排除其它技术特征、添加物、组分或步骤。而且，词语“包含”涵盖了“由……组成”的情况。当查阅说明书时，本发明的其他目标、优点和特征对本领域技术人员而言将是显而易见的或者可通过本发明的实践获悉。通过示例的方式提供下述实施例和附图，并且它们不是旨在限制本发明。涉及附图且置于权利要求书的圆括号中的参考标记只是试图增加权利要求书的可理解性，并且不应当被解释为限制权利要求书的范围。而且，本发明涵盖了本文所描述的具体实施方案和优选实施方案的所有可能组合。

实施例

材料和方法：

脂质体的制备

磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰胆碱(PC)购自Lipoid,Steinhausen,Switzerland。胆固醇(CHOL)购自Sigma Aldrich,Saint Louis,USA。缀合脂质的荧光染料俄勒冈绿488DHPE购自Invitrogen,California,USA。Alexa Fluor 750以其琥珀酰亚胺酯的形式获自Invitrogen并且与由Avanti Polar Lipids(Alabaster，USA)供应的脂质DOPE缀合。分别源自胰岛素A链和胰岛素B链的SEQ ID NO:1(GIVDQCCTSICSLYQLENYCN)和SEQ ID NO:2(FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS)的肽获自Genosphere Biotechnologies(Paris，France)，纯度>95％并且移除了三氟乙酸(tfa)。源自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的SEQID NO:3(YRSPFSRVVHLYRNGK)的肽获自Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona,IRBB,Barcelone,Spain。

利用薄膜水化法，从摩尔比为1:1:1.33的各PS、PC和CHOL的脂质混合物制备脂质体(Harel-Adar T，2011)。全部脂质的量是30mM。将脂质和缀合脂质的荧光染料溶于氯仿中并通过在真空和氮气下进行蒸发移除溶剂。将脂质与合适的缓冲液(PBS，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽分别于PBS中的0.5mg/mL溶液)水化，并通过挤压机(LipexBiomembranes,Vancouver,Canada)使由此获得的脂质体均质化至1μm。通过离心，将未封装的肽从脂质体制剂移除。在未稀释的样品中，利用Malvern Zetasizer(MalvernInstruments,UK)，通过动态光散射(DLS)测量脂质体的粒径分布和稳定性，被表述为ζ电势(ζ)。在JEOL-JEM 1400显微镜中，利用低温透射电子显微镜(cryo-TEM)检查脂质体的形态和片层。

小鼠

野生型NOD小鼠获自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)并在无特定病原的条件下饲养。使用仅8周龄的雌鼠。

小鼠购自Harlan Laboratories(Italy)并在常规条件下饲养。使用仅8-10周龄的雌鼠。为了诱导EAE，在氯胺酮(50mg/kg体重)和赛拉嗪(5mg/kg体重)下，使8周龄的C57BL/6雌性小鼠(Harlan)在两侧接受皮下注射50μg MOG肽，所述MOG肽在PBS中，在等体积的含4mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco，Detroit，MI，USA)的完全弗氏佐剂(CFA)中乳化。此外，在第0天和第2天，静脉内注射250ng百日咳毒素(SigmaChemical)。

严格根据加泰罗尼亚政府(Generalitat de Catalunya,Catalan Government)的实验动物管理和使用指南的推荐，进行该研究。方案经德国Trias i Pujol研究所的动物实验伦理委员会批准(许可号：DAAM5157)。

树突状细胞(DC)的产生和摄取实验

如之前所报道的(Marin-Gallen,Clinical and Experimental Immunology2010)，在含有GM-CSF(1000U/ml；Prospec,Rehovot,Israel)的培养基中，从NOD小鼠的骨髓祖细胞产生DC。通过如所述的CD11c-PECy7染色(BD Pharmingen)(Pujol-Autinell I,etal.PLOS ONE 2013)评估DC的纯度。通过如之前所报道的膜联蛋白和7aad染色(Pujol-Autonell I et al.PLOS ONE,2013)测定活力，并且通过流式细胞术(Perfect CountMicrospheres,Cytognos,Salamanca,Spain)对细胞进行计数。通过将DC与脂质体微粒(空的或载有胰岛素肽)共培养2小时进行脂质体的捕获。对于这些实验，采用被稀释至100-1000μM的脂质体微粒的储备液(30mM)。将对照DC在基础条件下培养以获得未成熟DC(iDC)或用LPS(100ng/ml；Sigma)刺激24小时以获得成熟DC(mDC)。用荧光标记的PS-脂质体(俄勒冈绿488DHPE，Invitrogen)测定被DC体外摄取的PS-脂质体。用PBS大量洗涤以移除附着于细胞膜的脂质体之后，通过流式细胞术(FACSCanto II,BD Biosciences)测定脂质体的捕获。

在脂质体捕获之后在DC中的致耐受性特征

通过流式细胞术分析(FACSCanto II)来测定DC共刺激膜分子CD40和CD86的表达。用针对小鼠CD11c/PE-Cy7、CD40/APC、CD86/PE的单克隆抗体(BD Pharmingen)对DC进行染色。将同种型对照的染色用作对照。利用CellQuest软件(BD Biosciences)对数据进行分析。基于PGE2在凋亡细胞的耐受性诱导中的作用的先前结果(Pujol-Autonell PLOS ONE8:e63296,2013)，在不同的培养物上清液中，通过ELISA评估在DC进行PS-脂质体捕获之后PGE2的产生(PGE2EIA Kit-Monoclonal；Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)。检测限：80％B/B0：15pg/ml。灵敏性：50％B/B0：50pg/ml。将结果表述为指数(pg PGE2/10⁶个细胞)。

T细胞增殖分析

在2小时期间，使DC载有1mM脂质体(空的或载有胰岛素肽(20μg/ml胰岛素(Sigma,St Louis,MO,USA))，然后用于测定T细胞增殖。如所描述的(Pujol-Autonell,PLOS ONE2013)，对NOD脾脏进行机械破碎之后获得T细胞，利用针对CD19-PE、CD16/32-PE、CD11c-PECy7(BD Pharmingen)、CD11b-PE(ImmunoTools GmbH,Friesoythe,Germany)和Ly-6G(Gr-1)-eFluor660(eBioscience,CA,USA)的抗体，通过负选择进行纯化，并进行分选(FACSAriaII,BD Biosciences)。将单独或者用空PS-脂质体或封装自身抗原的脂质体脉冲的DC(10,000个细胞)与10⁵个T淋巴细胞培养(1:10的比例)。6天之后，将细胞用1μCi(3H)-胸苷(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)脉冲另外16小时。将细胞收集(Harvester 96,TomtecInc.,Hamden,CT,USA)并利用闪烁计数仪(1450Microbeta,TriluxWallac,Turku,Finland)进行分析。将T细胞的增殖表述为c.p.m x 10³个细胞。

1型糖尿病免疫疗法(预防和治疗)

给予前驱糖尿病NOD小鼠(8周龄)含3mg PS-脂质体(空的或封装比例1:1的SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的肽)的200μl盐溶液的单一腹膜内剂量。还包括仅接受盐溶液的假对照组(sham-control group)。每组使用总计12-18只动物。在30周期间，利用Glucocard条(Menarini，Barcelona，Spain)每日监测小鼠的尿糖，以及每周监测小鼠体重。当血糖水平>300mg/dl时，具有糖尿的动物被确诊患有糖尿病。

在疾病发作之后1天、5天和8天，用含3.5mg PS-脂质体(空的或封装比例1:1的SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的肽)的200μl盐溶液的3个剂量腹膜内治疗糖尿病NOD小鼠(>25周龄)。在30周期间，利用Glucocard条(Menarini，Barcelona，Spain)每日监测小鼠的尿糖。当连续的血糖水平高于200mg/dL或当测量值高于300mg/dL时，具有糖尿的动物被确诊患有糖尿病，并且确定疾病的发作。每周监测血糖水平(AccuCheck,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)。从疾病发作起施用每日皮下(s.c.)注射胰岛素(1U,Insulatard Flex-Pen,Novo-Nordisk,Bagsvaerd,Denmark)，除非如果能实现正常的血糖。每周监测三次血糖(AccuCheck,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)，所述监测在禁食2小时之后进行。

胰岛炎得分

在研究结束时，通过白细胞–胰岛炎–确定胰岛浸润的程度。简言之，将来自各组的所有小鼠的胰腺在异戊烷/冷丙酮浴中速冻。在5个非重叠水平面获得5μm的冰冻切片。将切片用苏木精/伊红染色，编码并由对实验情况不知情的2个独立观察者进行分析。每个观察者评估每一动物的最少40个胰岛。如在别处所述(Alba A，J Immunol 2004；173:6667-75)，对胰岛炎进行评分：0，无胰岛炎；1，周边胰岛的；2，轻度胰岛炎(浸润的胰岛<25％)；3，25-75％的胰岛浸润；4，全部胰岛浸润。

EAE的免疫疗法

C57BL/6免疫小鼠经常被用作EAE疾病的模型，所述疾病与MS密切相关且常常用于检验针对MS的疗法和治疗。为了防止EAE的发展，在免疫后5天和9天，用含1.75mg载有MOG40-55的PS-脂质体的100μl盐溶液的2个剂量腹膜内治疗C57BL/6免疫小鼠。作为对照，用空脂质体(PS-脂质体)或PBS(假)治疗小鼠。

对所有动物进行称重，并且每日检查被治疗小鼠的福利和临床状态以及神经学体征。如在别处所描述的[Espejo 2001，同上]，根据下述标准(Espejo C,et al.,Exp Neurol2001)，进行EAE的临床评分：0，无症状；0.5，下半尾巴张力丧失；1，全部尾巴张力丧失；1.5，后肢无力；2，后肢麻痹；2.5，后肢截瘫；3，前肢无力；4，四肢轻瘫；4.5，严重的四肢轻瘫；5，四肢瘫痪；以及6，死亡。由两个不同的观察者，以盲的方式进行临床随访分析。

腹膜内施用之后追踪脂质体

为了生物成像实验，将荧光标记的PS-脂质体(Alexa Fluor 750)腹膜内注射进前驱糖尿病NOD小鼠并观察3天。在施用的时刻以及在注射后6小时、24小时、48小时和72小时，在麻醉的情况下(Pearl Imager,Li-Cor)使小鼠成像。对荧光信号进行定量。在实验结束时，获得数个器官、称重并成像以测定荧光分布。

统计学分析

利用Prism 5.0软件(GraphPad软件公司,San Diego,CA)进行统计。对于配对数据，进行非参数Wilcoxon检验。否则，使用曼惠特尼检验。p值<0.05被认为是显著的。

结果

通过DC捕获封装胰岛素肽的PS递呈脂质体

以摩尔比为1:1:1.33的PS:PC:CHOL制备PS-脂质体以在其表面呈现‘死亡信号’PS。空脂质体呈现1.014μm的平均粒径，所述粒径是为了被树突状细胞(Ulrich AS，Bioscience Reports 22：129-150，2002)有效摄取的最佳大小，具有0.321的多分散指数(PdI)。此外，ζ电势的测量揭示了PS-脂质体上-30.66mV的净表面电荷。另一方面，当PS-脂质体封装来自小鼠胰岛素2的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽时，对于SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的肽，脂质体分别显示1.062μm(PdI＝0.324)和0.954μm(PdI＝0.309)的平均直径(图1)。至于ζ电势，两种封装脂质体均呈现-29.5mV的负表面电荷。对于SEQ ID NO:1的肽，封装百分比是44.63±23.68％，对于SEQ ID NO:2肽，封装百分比是88.48±3.97％(平均值±SD)。封装SEQ ID NO:3肽的PS-脂质体具有942.2nm的平均直径和-33.66mV的ζ电势。SEQID NO:3的封装效率是89.34±4.69％。通过cryo-TEM分析，观察到大多数脂质体(空的或封装肽)是多囊状囊泡(MVV)。在共培养之后，PS-脂质体被DC吞食(图2)。

在捕获封装胰岛素肽的PS-脂质体之后DC的共刺激分子的表达减少且产生PGE2

即使在促炎刺激之后，共培养之后的DC的活力总是与对照DC类似(图3A)，与剂量无关(范围100-2000mM，数据未示出)。

评估DC的表面上两种共刺激分子CD40和CD86的表达(图3B)。观察到，在脂质体捕获之后，细胞膜上CD40和CD86的表达未增加，保持低的水平。LPS暴露之后，DC显著地增加了CD40和CD86的表达，以及载有PS-脂质体的DC显著地增加了CD86的表达(p<0.001)，但未增加CD40的表达。相比之下，PSAB-脂质体未显著地增加CD40或CD86的膜表达。

基于以前的结果(Pujol-Autonell,PLOS ONE 2013)，检查由在DC中的脂质体诱导的PGE2的产生。当与iDC比较时，在与脂质体(空的或载有胰岛素肽)共培养的DC的上清液中PGE2的浓度显著增加(p<0.05)(图3C)。

在捕获封装胰岛素肽的PS-脂质体之后DC刺激自体T细胞增殖的能力受损

基于DC标志物CD11c的染色，产生自NOD小鼠骨髓祖细胞的DC纯度>80％，并且活力总是>90％。T细胞的纯度和活力分别总是超过90％和95％(数据未示出)。观察到，当与单独的iDC相比时，通过iDC捕获PS-脂质体或PSAB-脂质体未能增加自体T细胞的增殖(图4)。在LPS刺激之后，由mDC诱导的T细胞增殖比由iDC诱导的增殖高(p<0.05)。相比之下，即使在这些促炎刺激物的作用之后，由载有PS-脂质体或PSAB-脂质体的DC诱导的T细胞增殖未能增加。结果表明，由PS-脂质体-DC诱导的T细胞的增殖未能增加，即使在这些促炎刺激物的作用之后，由PS-脂质体-DC诱导的T细胞的增殖也未能增加。

封装胰岛素肽的PS-脂质体有效治疗NOD前驱糖尿病小鼠中的T1D

为了评估脂质体在预防T1D中的功效，在前驱糖尿病期间，我们用单一剂量的免疫疗法治疗NOD小鼠(8周龄)。如所预期，来自假对照组的动物从13周龄起患上糖尿病并具有81.3％的最终发病率(n＝16)(图5A)。用空PS-脂质体进行治疗导致83.3％的疾病发生率(n＝18)，所述疾病在15周龄开始。用封装自身抗原胰岛素肽的PS-脂质体进行治疗导致疾病的缓解，具有50％的发病率(n＝12)，疾病也在15周龄开始。当与假对照组或空脂质体治疗组相比时，接受免疫疗法的小鼠的体重未发现显著差异(图5B)。

胰岛炎在用封装胰岛素肽的PS-脂质体治疗的小鼠中降低

在随访期结束时(30周)，对来自各组的3-6只非糖尿病动物进行胰岛炎的评分以测定治疗对胰岛白细胞浸润的任何效果(图6A)。如所预期，假对照组中的动物显示高的胰岛炎得分(2.34±0.18)。用空PS-脂质体治疗的小鼠显示类似的胰岛炎程度(2.12±0.46)。当与假对照组比较时，封装胰岛素肽的PS-脂质体的免疫疗法表现出胰岛炎得分的生物学减少(尽管不显著)(1.69±0.58)。而且，被归类在五个浸润类别的每一个中的胰岛的百分比的分析表明，在用免疫疗法治疗的小鼠中，47％的胰岛保持无胰岛炎或具有周边胰岛的，而在假对照组和PS-脂质体组中，分别有26％和34％的胰岛未被破坏(图6B)。

当在疾病发作之后施用时，载有胰岛素肽的PS-脂质体能逆转NOD小鼠中的糖尿病

当在疾病发作之后施用时，载有胰岛素肽的PS-脂质体逆转NOD小鼠中的糖尿病(图8A)。在无外源施用胰岛素的情况下，这些小鼠存活，实现正常水平的血糖。相比之下，尽管持续施用胰岛素，用空PS-脂质体治疗的小鼠未能达到正常血糖(图8B)。

封装MOG肽的PS-脂质体减轻了EAE

制备含有MOG肽(MS中的特异性自身抗原)的PS-脂质体。当在C57BL/6免疫小鼠中进行腹膜内注射时，这些脂质体防止疾病的发展(图9)。用装填MOG肽的脂质体进行治疗诱导免疫小鼠脾脏中的经典调节性T细胞(涉及维持外周耐受性的细胞群体)的增加(结果未示出)。PS-脂质体和肽的封装对于治疗效果均是关键的，因为空脂质体没有效果。因此，封装MOG肽的PS-脂质体可以减轻EAE，提供不太严重的首次攻击且从恶化中迅速恢复。因此，封装MOG肽的PS-脂质体对MS的治疗是有益的。

腹膜内施用之后追踪脂质体

在免疫系统的不同器官中检测来自脂质体的荧光信号。如所预期，脂质体位于胰淋巴结、脾、胰腺以及纵隔淋巴结或副胸腺淋巴结(图7)。

本申请中引用的参考文献

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Pujol-Autonell I,Planas R,Ampudia R,Marín-Gallén S,Sanchez A,Carrascal J,,Marin A,Puig-Domingo M,Pujol-Borrell R,Verdaguer J,Vives-Pi M.“Efferocytosis promotes suppresive effects in dendritic cells throughprostaglandin E2production in the context of autoimmunity”.PLOS ONE 8:e63296,2013.

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Claims

1.脂质体，其封装自身抗原，其中

(i)所述脂质体具有500至15000nm的大小；以及

(ii)所述脂质体的膜包含全部膜的脂质体组分的10重量％至40重量％的量的磷脂酰丝氨酸(PS)。

2.如权利要求1所述的脂质体，其为多囊状囊泡(MVV)。

3.如权利要求1-2中任一项所述的脂质体，其中所述PS的重量百分比是所述全部膜的脂质体组分的22％至33％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体的膜还包含磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CHOL)。

5.如权利要求4所述的脂质体，其中所述脂质体的膜包含PS:PC:CHOL摩尔比为0.6:0.6:0.7至1.5:1.5:1.8的PS、PC和CHOL。

6.如权利要求1-5中任一项所述的脂质体，其中形成所述脂质体的膜的脂质的总量相对自身抗原的总量之间的重量比是20:1至3:1。

7.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体，其中所述自身抗原具有5至50个氨基酸的大小。

8.如权利要求1-7中任一项所述的脂质体，其中所述自身抗原是与选自以下的自身免疫病相关的肽：1型糖尿病(T1D)、红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化(MS)、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、格雷夫斯病、银屑病、银屑病性关节炎以及干燥综合征。

9.如权利要求8所述的脂质体，其中所述自身抗原与T1D相关，并且选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的肽。

10.如权利要求8所述的脂质体，其中所述自身抗原与MS相关，并且包含SEQ ID NO:3。

11.如权利要求1-10中任一项所述的脂质体，其封装其他自身抗原，其中所有封装的自身抗原与同一自身免疫病相关。

12.药物组合物或兽用组合物，其包含治疗有效量的前述权利要求中任一项所限定的脂质体，以及其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂或载体。

13.用作药物的权利要求1-11中任一项所述的脂质体或权利要求12所述的药物组合物或兽用组合物。

14.用于预防或治疗自身免疫病的权利要求1-11中任一项所限定的脂质体或权利要求12所述的药物组合物或兽用组合物。

15.用于恢复患有自身免疫病的患者的自身耐受性的权利要求1-11中任一项所限定的脂质体或权利要求12所述的药物组合物或兽用组合物。

16.如权利要求14-15任一项中的用途的所述脂质体或药物组合物或兽用组合物，其中所述自身免疫病选自：T1D、红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、格雷夫斯病、银屑病、银屑病性关节炎以及干燥综合征。

17.如权利要求16中的用途的所述脂质体或药物组合物或兽用组合物，其中所述自身免疫病是1型糖尿病或MS。