JP6283809B2 - I型糖尿病の予防又は治療のための製剤 - Google Patents
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Description
項1. (A)プロインスリン、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種と、(B)α-ガラクトシルセラミドとを含む、I型糖尿病の予防又は治療のための製剤。
項2. 前記(A)成分が、プロインスリン、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種である、項1に記載の製剤。
項3. 前記(B)成分が、KRN7000である、項1又は2に記載の製剤。
項4. 前記(B)成分が、リポソームに包含されている、項1〜3のいずれかに記載の製剤。
項5. 前記(A)成分及び(B)成分が、リポソームに包含されている、項1〜4のいずれかに記載の製剤。
項6. I型糖尿病の予防に使用される、項1〜5のいずれかに記載の製剤。
項7. 皮下投与又は腹腔内投与形態で投与される、項1〜6のいずれかに記載の製剤。
項8. I型糖尿病の予防又は治療方法であって、
(A)プロインスリン、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種と、(B)α-ガラクトシルセラミドとを含む製剤を用い、
前記製剤のI型糖尿病の予防又は治療に有効量を、I型糖尿病の予防又は治療が必要とされるヒトに投与する、I型糖尿病の予防又は治療方法。
項9. 前記(A)成分が、プロインスリン、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種である、項8に記載の予防又は治療方法。
項10. 前記(B)成分が、KRN7000である、項8又は9に記載の予防又は治療方法。
項11. 前記(B)成分が、リポソームに包含されている、項8〜10のいずれかに記載の予防又は治療方法。
項12. 前記(A)成分及び(B)成分が、リポソームに包含されている、項8〜11のいずれかに記載の予防又は治療方法。
項13. 前記ヒトが、I型糖尿病の予防が必要とされるヒトである、項8〜12のいずれかに記載の予防又は治療方法。
項14. 前記製剤が、皮下投与又は腹腔内投与形態で投与される、項8〜13のいずれかに記載の予防又は治療方法。
項15. I型糖尿病の予防又は治療剤の製造のための、(A)プロインスリン、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種と(B)α-ガラクトシルセラミドとを含む製剤の使用。
本発明の製剤は、(A)成分として、プロインスリン、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種を含有する。
本発明の製剤は、I型糖尿病の予防又は治療のために使用される医薬である。(A)成分はこの目的達成のためにターゲットとなる分子であり、インスリンだけでなく、GAD65、IA-2といった別の膵島由来タンパク質も考えられるし、さらにT細胞エピトープの探索研究から発見されたIGRPやZnT8等も考えられたところである。しかしながら本発明者らは、このなかでもプロインスリン、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体が(A)成分として極めて有用であり、後述するα-GalCer含有リポソームに内包されることで、顕著にI型糖尿病の予防又は治療効果を発揮することを発見したのである。
本発明において、(B)成分として用いられるα-GalCerとは、ガラクトースとセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、具体的には、WO94/09020、WO94/02168、WO94/24142、WO98/44928、Science, 278, p.1626-1629, 1997等に開示されているものが例示される。本発明において、I型糖尿病の予防又は治療効果を一層高めるという観点から、α-GalCerとして、KRN7000、即ち、(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-ヘキサコサノイルアミノ-1,3,4-オクタデカントリオールが好適に使用される。
本発明の製剤において、上記(A)成分と(B)成分の比率としては、特に制限されないが、例えば、上記(A)成分の総量100重量部当たり、上記(B)成分の総量(α-GalCer重量に換算)が0.1〜10,000重量部、好ましくは1〜1,000重量部、更に好ましくは10〜500重量部が挙げられる。
本発明の製剤は、上記(A)成分と(B)成分が同一製剤として含まれるものであってもよく、また上記(A)成分と(B)成分がそれぞれ別々に製剤化されており、用時に混合してから投与されるか、又はこれらを別々に順次投与されるように設計されていてもよい。使用簡便性の観点から、上記(A)成分と(B)成分が同一製剤として含まれるものが好適である。
本発明の製剤は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、関節内投与、粘膜投与等で投与される。これらの投与形態の中でも、好ましくは、皮下投与、筋肉内投与及び腹腔内投与が挙げられ、最も好ましくは、皮下投与または腹腔内投与である。とりわけ、本発明の製剤は、皮下投与又は腹腔内投与することによって、I型糖尿病の予防又は治療効果がより一層効果的になる。
本発明の製剤によって誘導される免疫抑制系サイトカインは、本発明の製剤によって誘導される抗原特異的な調節性T細胞(regulatory T Cell)による分泌に起因していると推測される。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC:和光純薬)、1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt)(DOPG: 和光純薬)、Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして5:2:3の割合で混合した後10 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒1000 μlに溶解した。また、α-GalCer 0.2 mgは別にクロロホルム/メタノール溶媒100 μlに溶解した。両者を混合した後エバポレーターで有機溶媒を除去しナス型フラスコ底面にα-GalCerを含む脂質の薄膜を形成した。さらに真空デシケーター内で一晩乾燥させることにより有機溶媒を完全に除去した。これに、ヒトインスリンB鎖のフラグメント(B:9-23)(以下、インスリンBペプチドと表記することもある)1 mg/mlを含む50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)を加え、ボルテックス処理によって脂質薄膜を完全に水和させた。凍結融解処理を4回以上行った後、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に複数回通した。最後に、透析によって非内包ペプチドを完全に除去し、インスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームを含む溶液(以下、インスリンBペプチドGalCerリポソーム溶液)を調製した。当該インスリンBペプチドGalCerリポソーム溶液は、α-GalCerの最終濃度が200 μg/ml且つインスリンBペプチド(B:9-23)の最終濃度が500 μg/mlである。
1.材料と方法
1−1.インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソームの作製と投与サンプル調製
実施例1で作製したインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームを使用した。実施例1で作製したインスリンBペプチドGalCerリポソーム溶液10 μl(α-GalCer換算で2μg、インスリンBペプチド換算で5μg)と生理食塩水90 μlを混合して、投与サンプルを調製した。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC:和光純薬)、1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt)(DOPG: 和光純薬)、Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして5:2:3の割合で混合した後10 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒1000 μlに溶解し、エバポレーターで有機溶媒を除去しナス型フラスコ底面に脂質薄膜を形成した。さらに真空デシケーター内で一晩乾燥させることにより有機溶媒を完全に除去した。これに、インスリンB鎖のフラグメント(B:9-23)(以下、インスリンBペプチドと表記することもある)3 mg/mlを含む50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.5)1 mlを加え、ボルテックス処理によって脂質薄膜を完全に水和させた。凍結融解処理を4回以上行った後、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に複数回通した。最後に、透析によって非内包ペプチドを完全に除去し、インスリンBペプチド内包型リポソームを含む溶液(以下、インスリンBペプチドリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、インスリンBペプチド(B:9-23)の最終濃度が500 μg/mlである。
斯して得られたリポソーム溶液10 μl(ペプチド換算で5μg)と生理食塩水90 μlを混合して投与サンプルを調製した。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC:和光純薬)、1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt)(DOPG: 和光純薬)、Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして5:2:3の割合で混合した後10 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒1000 μlに溶解した。また、α-GalCer 0.2 mgは別にクロロホルム/メタノール溶媒100 μlに溶解した。両者を混合した後エバポレーターで有機溶媒を除去しナス型フラスコ底面にα-GalCerを含む脂質の薄膜を形成した。さらに真空デシケーター内で一晩乾燥させることにより有機溶媒を完全に除去した。OVAペプチド(Ovalbumin peptide, 323-339)1 mg/mlを含む滅菌蒸留水を加え、ボルテックス処理によって脂質薄膜を完全に水和させた。凍結融解処理を4回以上行った後、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に複数回通した。最後に、透析によって非内包ペプチドを完全に除去し、OVAペプチド内包型α-GalCerリポソームを含む溶液(以下、OVAペプチドGalCerリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、α-GalCerの最終濃度が200 μg/ml且つOVAペプチドの最終濃度が500 μg/mlである。
斯して得られたリポソーム溶液10 μl(α-GalCer換算で2 μg、OVAペプチド換算で5μg)と生理食塩水90 μlを混合して投与サンプルを調製した。
I型糖尿病のモデルマウスであるNODマウス(NOD/ShiLtJ, The Jackson Laboratory, CA, USA)に対して、I型糖尿病の発症前である4週齢から8週齢の間に週2回ずつ投与サンプル100μlを腹腔内投与し、隔週で血中のグルコース濃度を測定した。試験群は、1)薬剤非投与群(生理食塩水投与群)、2)インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群、3)インスリンBペプチド内包型リポソーム投与群、及び4)OVAペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群の5群に分けて、1群あたり10匹のマウスを用いた。グルコース濃度測定には糖尿病患者が使用する市販の血糖値測定装置(ACCU-CHEK Aviva、ロッシュ社)を使用した。糖尿病発症の判定方法は、血中グルコース濃度が250mg/dL以上示した場合に発症とし、発症率は同一のサンプルを投与したマウス群の中で発症した個体の占める割合(%)で示した。なお、試験に使用した各投与サンプルの模式構造を図1に示す。
I型糖尿病の発症率を経時的に評価した結果を図2に示す。図2から分かるように、薬剤非投与群(三角)は、11週から12週にかけて症状を呈し始め、16週から17週には約半数が発症し、24週目には約8割のマウスが糖尿病を発症した。これに対して、インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群(四角)は血糖値の上昇を示さず、24週を経過した時点において100%の発症予防効果を示した。他方、インスリンBペプチド内包型リポソーム投与群(白抜き丸)は、薬剤非投与群よりも発症遅延に寄与したが、24週目には約4割のマウスが糖尿病を発症した。また非インスリンペプチドであるOVAペプチドを内包したOVAペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群(米印)は薬剤非投与群よりも発症遅延に寄与したものの、その後は薬剤非投与群よりも発症を早め、24週目には約6割のマウスが糖尿病を発症した。以上の結果から、I型糖尿病の発症予防にはインスリンペプチドとα-GalCerの組み合せが重要であり、インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソームは有効的かつ効果的なI型糖尿病発症予防薬になり得ることが確認された。
1.材料と方法
1−1.インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソームの作製と投与サンプル調製
実施例2で作製したインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームを使用した。インスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームを含むリポソーム溶液10μl(α-GalCer換算で2μg、インスリンBペプチド換算で5μg)と生理食塩水90μlを混合して、投与サンプルを調製した。
実施例で作製したインスリンBペプチド内包型リポソームを使用した。インスリンBペプチド内包型リポソームを含むリポソーム溶液10μl(インスリンBペプチド換算で5μg)と生理食塩水90μlを混合して、投与サンプルを調製した。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC:和光純薬)、1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)](Sodium Salt)(DOPG: 和光純薬)、Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして5:2:3の割合で混合した後10 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒1000 μlに溶解した。また、α-GalCer 0.2 mgは別にクロロホルム/メタノール溶媒100 μlに溶解した。両者を混合した後エバポレーターで有機溶媒を除去しナス型フラスコ底面にα-GalCerを含む脂質の薄膜を形成した。さらに真空デシケーター内で一晩乾燥させることにより有機溶媒を完全に除去した。蒸留水を加えボルテックス処理と超音波処理によって脂質薄膜を完全に水和させた。最後に、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に複数回通し、α-GalCer含有リポソームを含む溶液(以下、GalCerリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、α-GalCerの最終濃度が200 μg/mlである。
斯して得られたリポソーム溶液10 μl(α-GalCer換算で2 μg)と生理食塩水90 μlを混合して投与サンプルを調製した。
α-GalCer(KRN7000粉末)3 mgにジメチルスルホキシド(DMSO)3 mlを加え、80℃の高温層中にて溶解した。ここに0.5 % Tween 80を含むPBS(-) 12 mlを加え混合した。これによりα-GalCerの最終濃度を200μg/mlとし、これをストック溶液とした。斯して得られたストック溶液10μl(α-GalCer換算で2μg)と生理食塩水 90μlを混合して投与サンプルを調製した。
I型糖尿病自然発症モデルであるNODマウス(NOD/ShiJcl, CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan)に対して、I型糖尿病の発症前である5週齢から10週齢の間に週2回ずつ投与サンプル100μlを腹腔内投与し、13週齢マウスより脾臓を摘出後、脾臓細胞を調製し細胞培養を行った。試験薬投与群は、1)薬剤非投与群(生理食塩水投与群)、2)インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群、3)インスリンBペプチド内包型リポソーム投与群、4)α-GalCerリポソーム投与群、5)α-GalCer溶液投与群の5群とし、N = 2〜3で行った。各投与群から脾臓細胞を調製した後、各細胞に対して細胞増殖を調べる際に用いるCFSE(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)色素を加え常法に従い反応と洗浄除去を行った。最後に抗原特異性を調べるためCFSE標識した各細胞に対して、a) 抗原なし、b)インスリンBペプチド、c)非インスリンペプチド(OVAペプチド)をそれぞれ添加しCO2インキュベーター内で4日間培養した。培養の後、培養細胞と培養上清を回収し、細胞に対してはCD4(+)Foxp3(+)細胞中のCFSE増加をFACS解析し、上清については上清中のサイトカイン産生量を測定した。また、培養上清中のIL-2及びIL-10の濃度についても測定した。
各種薬剤を投与したNODマウスより脾臓細胞を調製し、インスリンBペプチド添加培養による抗原特異的なTreg細胞の増殖を解析した。薬剤非投与群では、培養後のCD4(+)Foxp3(+)細胞中のCFSE増殖細胞の割合は、抗原非添加で約55%、インスリンBペプチド添加で約51%であり、インスリンBペプチド特異的Treg細胞の増殖は認められなかった(図3A上段)。これに対しインスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群は、抗原非添加で約45%、インスリンBペプチド添加で約64%であり、インスリンBペプチドの添加によるTreg細胞の抗原特異的な増殖が認められた(図3A下段)。抗原非添加による増殖細胞の割合とインスリンBペプチド添加による増殖細胞の割合を比率で表したところ(図3B)、薬剤非投与群が0.93であったのに対し、インスリンBペプチド内包型α-GalCerリポソーム投与群は1.43と薬剤非投与群に対して1.5倍以上も多くTreg細胞の増殖が惹起されることが示された。また、インスリンBペプチド含有リポソーム投与群は薬剤非投与群に対して0.90、α-GalCerリポソーム投与群が1.02、α-GalCer溶液投与群が1.04であり、いずれも抗原特異的なTreg細胞の増殖は認められなかった。
1.材料と方法
1−1.インスリン内包型α-GalCerリポソームの作製と投与サンプル調製
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC: Avanti Polar Lipids, Inc.)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC: Avanti)、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DOPG: Avanti)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DPPG: Avanti), Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして1.5:1.5:1.5:1.5: 4の割合で混合した後、当該混合物50 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒に溶解した。窒素ガス気流下でエバポレーターを用い有機溶媒を除去し、更に残留有機溶媒を凍結乾燥法にて完全に除去した。乾燥した脂質混合物を50℃の90% tert-ブタノールに溶解し、α-GalCerを5重量%となるように加え溶解し凍結後、凍結乾燥により乾燥させた。次いで、インスリン溶液(recombinant human insulin, インビトロジェン社製、10 mM HCl/2% glycine) 2.5 mlを乾燥した脂質混合物に加え完全に水和した後、凍結融解処理を3回行った。この溶液を800 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通した後、引き続き、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通し粒子径を揃えた。ここに5倍量のPBSを加えpHを7付近にすることで内包されなかったインスリンの沈殿物を生じさせ、10,000 rpm 15分間の遠心分離に供し、内包されなかったインスリンを分離除去した。最後に、PBSで10倍に希釈しインスリン内包型α-GalCer含有リポソームを含む溶液(以下、インスリンGalCerリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、α-GalCerの最終濃度が20 μg/ml且つインスリンの最終濃度が200 μg/mlである。
NODマウス(NOD/ShiLtJ, The Jackson Laboratory, CA, USA)に対して、I型糖尿病の発症前である4週齢から8週齢の間に週2回ずつ、上記1−1で調製したインスリン内包型α-GalCerリポソーム溶液 50μlを皮下投与、尾静脈投与、または腹腔内投与し、隔週で血中のグルコース濃度を測定した。血中のグルコース濃度測定には糖尿病患者が使用する市販の血糖値測定装置(ACCU-CHEK Aviva、ロッシュ社)を使用した。糖尿病発症の判定方法は、血中グルコース濃度が250 mg/dL以上示した場合に発症とし、発症率は同一のサンプルを投与したマウス群の中で発症した個体の占める割合(%)で示した。
I型糖尿病の発症率を経時的に評価した結果を図4に示す。薬剤非投与群(黒丸)は、9週から10週にかけて症状を呈し始め、14週から15週には約半数が発症し、24週目には70%のマウスが糖尿病を発症した。これに対して、インスリン内包型α-GalCerリポソームを皮下投与した群(四角)では、発症が18週から19週になり(発症遅延)、また24週目において発症したマウスは25%であり発症率が有意に低下することが示された。同様の効果は腹腔内投与群(白抜き丸)でも認められ、発症は11週から12週、発症率は24週目の時点で25%に低下した。一方、尾静脈投与群(白抜き四角)では、若干の発症遅延と発症率低下(24週目発症率62%)を示したものの、皮下投与と腹腔内投与に比べると効果が弱いことが明らかとなった。
1.材料と方法
1−1.インスリン内包型α-GalCerリポソームの作製と投与サンプル調製
実施例4で作製したインスリン内包型α-GalCer含有リポソームを投与サンプルとして使用した。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC: Avanti Polar Lipids, Inc.)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC: Avanti)、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DOPG: Avanti)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DPPG: Avanti)、及びCholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして1.5:1.5:1.5:1.5: 4の割合で混合した後50 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒に溶解した。窒素ガス気流下でエバポレーターを用い有機溶媒を除去し、更に残留有機溶媒を凍結乾燥法にて完全に除去した。インスリン溶液(recombinant human insulin, インビトロジェン社製、10 mM HCl/2% glycine) 2.5 mlを乾燥した脂質混合物に加え完全に水和した後、凍結融解処理を3回行った。この溶液を800 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通した後、引き続き、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通し粒子径を揃えた。ここに5倍量のPBSを加えpHを7付近にすることで内包されなかったインスリンの沈殿物を生じさせ、10,000 rpm 15分間の遠心分離に供し、内包されなかったインスリンを分離除去した。最後にPBSで10倍に希釈しインスリン内包型リポソームを含む溶液(以下、インスリンリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、インスリンの最終濃度が200 μg/mlである。
L-α-Phosphatidylcholine, Dioleoyl(DOPC: Avanti Polar Lipids, Inc.)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC: Avanti)、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DOPG: Avanti)、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, sodium salt(DPPG: Avanti), Cholesterol (plant derived)(Avanti)をモル比にして1.5:1.5:1.5:1.5: 4の割合で混合した後50 mgをクロロホルム/メタノール(容量比1:1)溶媒に溶解した。窒素ガス気流下でエバポレーターを用い有機溶媒を除去し、更に残留有機溶媒を凍結乾燥法にて完全に除去した。乾燥した脂質混合物を50℃の90% tert-ブタノールに溶解し、α-GalCerを5重量%となるように加え溶解し凍結後、凍結乾燥により乾燥させた。10 mM HCl/2% glycine溶液2.5 mlを乾燥した脂質混合物に加え完全に水和した後、凍結融解処理を3回行った。この溶液を800 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通した後、引き続き、200 nmポリカーボネイト膜(Avanti)に5回通し粒子径を揃えた。ここに5倍量のPBSを加えpHを7付近にし、最後にPBSで10倍に希釈しα-GalCer含有リポソームを含む溶液(以下、GalCerリポソーム溶液)を調製した。当該リポソーム溶液は、α-GalCerの最終濃度が20 μg/mlである。
I型糖尿病は、インスリンを産生する膵島が自己免疫系によって攻撃・破壊され発症するが、この破壊には膵β細胞を特異的に認識し攻撃する細胞傷害性T細胞(CTL)が関与する。従って、当該CTLの産生抑制及び不活性化は膵島破壊を防ぐことと同義であり、I型糖尿病の発症予防や進行抑制に繋がる。そこで本試験では、各製剤投与による膵β細胞特異的CTLの産生抑制効果を評価した。測定方法には、膵β細胞特異的CTLの産生を定量的に分析することが可能なテトラマー法(参考文献:Prediction of spontaneous autoimmune diabetes in NOD mice by quantification of autoreactive T cells in peripheral blood. Trudeau JD, Kelly-Smith C, Verchere CB, Elliott JF, Dutz JP, Finegood DT, Santamaria P, Tan R. J Clin Invest. 2003 Jan;111(2):217-23.)を用い、各製剤を投与したNODマウスから単離した末梢血単核球(PBMC)中に存在する当該CTLを細胞解析(FACS解析)によって評価した。
PBMC中のB220(-)CD8(+)細胞中に存在するNRP-V7(+)細胞、即ち膵β細胞特異的CTLの割合(%)を求めた結果を図5に示す。薬剤非投与群は当該CTLの割合が1.25%以上であったのに対し、インスリン内包型α-GalCerリポソーム投与群は約0.6%と有意な産生抑制効果を示した。この割合はI型糖尿病を発症する前のNODマウスの測定値と同値であることから、インスリン内包型α-GalCerリポソームの投与は膵β細胞特異的CTLの産生を完全に抑制し得ることが明らかとなった。一方、インスリン内包リポソーム投与群とα-GalCerリポソーム投与群は、それぞれ1.0%と1.25%と、薬剤非投与群とほぼ同値であった。このことは、インスリン又はα-GalCerの単体投与では当該CTLの産生を十分に抑制することは出来ず、薬効には両者の組み合わせが重要であることを示している。
(1)ヒトインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソーム製剤
実施例1で得られたヒトインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームと生理食塩水とを混合し、ヒトインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソーム製剤を調製する。
(2)ヒトインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤
上記(1)におけるヒトインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソームを実施例4で製造したヒトインスリン内包型α-GalCer含有リポソームにした以外は上記(1)と同様の方法で、ヒトインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤を調製する。
(3)ヒトプロインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤
実施例4において、ヒトインスリンをヒトプロインスリンに変更した以外は実施例4と同様の方法で製造したヒトプロインスリン内包型α-GalCer含有リポソームを生理食塩水と混合し、ヒトプロインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤を得る。
実施例6で得られるヒトインスリンBペプチド内包型α-GalCer含有リポソーム製剤、ヒトインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤、ヒトプロインスリン内包型α-GalCer含有リポソーム製剤のいずれかは、対象患者に対し通常、α-GalCerとして1回体重1kgあたり0.01〜1.0mgを週1〜3回、1〜6週間、皮下投与の条件で投与する。
Claims (4)
- (A)プロインスリン、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種と、(B)KRN7000とを含み、
前記(A)成分及び(B)成分が、リポソームに包含されている、I型糖尿病の予防又は治療のための製剤。 - I型糖尿病の予防に使用される、請求項1に記載の製剤。
- 皮下投与又は腹腔内投与形態で投与される、請求項1又は2に記載の製剤。
- I型糖尿病の予防又は治療剤の製造のための、(A)プロインスリン、インスリンB鎖、これらのフラグメント、及びこれらの変異体よりなる群から選択される少なくとも1種と(B)KRN7000とを含み、前記(A)成分及び(B)成分がリポソームに包含されている製剤の使用。
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