BR112016009701A2 - Métodos para a produção de um líquido e para a produção de uma substância química - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE OLIGOSSACARÍDEOS DE SOJA PURIFICADO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO QUÍMICO.
A presente invenção se refere a um método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada a partir da soja e/ou um produto de soja processada, que compreende: a etapa (1) da mistura da soja e/ou do produto de soja processada com um solvente orgânico polar que contém a água que contém um solvente orgânico polar e água e, em seguida, removendo um precipitado gerado para obter um líquido de oligossacarídeos de soja que contém o solvente orgânico polar que contém a água; a etapa (2) da remoção do solvente orgânico polar a partir do líquido de oligossacarídeos de soja para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja; a etapa (3) da mistura da suspensão de oligossacarídeos de soja com a celulase para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase; e a etapa (4) da submissão da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase de separação sólido-líquido para se obter um líquido de oligossacarídeos de soja purificada.
Description
[001] A presente invenção se refere a um método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada a partir da soja ou de um extrato de soja.
[002] Um oligossacarídeo de soja é um termo geral para os oligossacarídeos que estão contidos em uma soja tais como a sacarose, rafinose e estaquiose; estas possuem uma atividade de ativação de bactérias úteis no intestino e, por conseguinte, a sua utilização principalmente como um produto alimentar de saúde tem atraído muita atenção. Os oligossacarídeos de soja abundantes também estão contidos nos materiais residuais tais como o soro de leite de soja e o melaço de soja que são gerados em grandes quantidades em uma etapa de processamento de soja industrial; por conseguinte, é esperado que o material residual, tal como o soro de leite de soja ou o melaço de soja também seja utilizado como materiais brutos de açúcar não dispendiosos.
[003] Como um método para a produção de monossacarídeos ou álcool utilizando o oligossacarídeo de soja que está contido nos materiais residuais, tais como o soro de leite de soja ou o melaço de soja, o que foi descrito, por exemplo, são um método para possibilitar que a galactosidase possa agir nos oligossacarídeos de soja para se obter os monossacarídeos (vide Documento não patentário 1) e um método que compreende submeter o melaço de soja diretamente para a fermentação para a produção de etanol ou butanol (vide Documento não patentário 2).
[004] Além disso, um método que utiliza o soro de leite de soja ou uma soja sem gordura como material bruto é conhecido como um método para a produção convencional de oligossacarídeo de soja. O soro de leite de soja é um líquido residual que permanece após a soja ser submetida ao cozimento por vapor para a produção do caldo, isto é, o leite de soja e, em seguida, as proteínas são precipitadas e removidas através da adição de um ácido ou similar, e é conhecido por conter os oligossacarídeos de soja, lipídeos, proteínas solúveis e similares. Como um método para a produção de oligossacarídeos de soja, utilizando o soro de leite de soja como um material bruto, o que foi descrito, por exemplo, são um método que compreende a adição de hidróxido de cálcio para o soro de leite de soja, o aquecimento da mistura, e a precipitação e remoção de impurezas para a obtenção de oligossacarídeos (vide Documento de Patente 1) e um método que compreende o aquecimento do soro de leite de soja, a adição de ácido fosfórico, para reduzir o pH, e a precipitação e remoção de impurezas para a obtenção de oligossacarídeos (vide Documento de Patente 2).
[005] Além disso, a soja sem gordura é um resíduo obtido através da remoção de lipídeos de soja utilizando um solvente tal como o hexano. Como um método para a produção de oligossacarídeos de soja, utilizando a soja sem gordura como material bruto, o que foi descrito, por exemplo, são um método que compreende a extração de um concentrado que contém as substâncias proliferativas de Bifidobacterium a partir da soja sem gordura, utilizando uma solução aquosa de álcoois para a obtenção de oligossacarídeos (vide Documento de Patente 3) e um método que compreende a extração de oligossacarídeos através da adição de água para a obtenção da soja sem gordura e dos oligossacarídeos de soja a partir de um extrato líquido (vide Documento de Patente 4).
[006] Documento de Patente 1: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 59-179064; - Documento de Patente 2: Publicação Aberta do Pedido de
Patente Japonesa 4-187695; - Documento de Patente 3: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 62-155082; - Documento de Patente 4: Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 3-287594.
[007] Documento não patentário 1: Arquivos Brasileiros de biologia e tecnologia, 2010; 53 (3): 719-729; - Documento não patentário 2: Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2001; 26 (5): 290-295
[008] No entanto, a pureza do oligossacarídeo de soja em um líquido de oligossacarídeos de soja obtido através dos métodos convencionais era baixa. Além disso, a sua capacidade de manuseio na separação líquido- sólido, tratamento da membrana, fermentação, ou similar foi significativamente fraca. Uma vez que o líquido de oligossacarídeos de soja obtido através do método tradicional de produção de oligossacarídeos de soja contém as substâncias suspensas que são difíceis de ser separadas, era difícil realizar o tratamento da membrana utilizando uma membrana de separação ou similar.
Além disso, a agitação é difícil nos casos em que o líquido de oligossacarídeos de soja obtido através do método convencional é utilizado como um material bruto de fermentação (fonte de carbono), em comparação com o caso em que um meio líquido comum é utilizado e, por conseguinte, se acredita ser uma possibilidade gerar os agregados precipitados durante a fermentação ou realizando a purificação dos produtos de fermentação difícil.
[009] Em face de tal situação, um objeto da presente invenção é fornecer um método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, o método é capaz de produzir um líquido de oligossacarídeos de soja com pureza elevada e uma capacidade excelente de manuseio.
[010] A fim de resolver os problemas mencionados acima, os presentes Depositantes intensivamente estudaram os métodos para a produção de oligossacarídeos de soja. Como resultado, foi descoberto que um líquido de oligossacarídeos de soja com pureza elevada e uma capacidade excelente de manuseio pode ser obtido através da mistura de celulase em uma suspensão de oligossacarídeos de soja para promover a precipitação de agregação das substâncias em suspensão que permanecem na suspensão de oligossacarídeos de soja e, em seguida, a remoção das substâncias em suspensão na suspensão de oligossacarídeos de soja. A presente invenção foi alcançada com base em tais descobertas.
[011] Isto é, um método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, é um método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada a partir da soja e/ou um produto de soja processada, o método que compreende: a etapa (1) da mistura da soja e/ou do produto de soja processada com um solvente orgânico polar que contém a água que contém um solvente orgânico polar e água e, em seguida, removendo um precipitado gerado para obter um líquido de oligossacarídeos de soja que contém o solvente orgânico polar que contém a água; a etapa (2) da remoção do solvente orgânico polar a partir do líquido de oligossacarídeos de soja para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja; a etapa (3) da mistura da suspensão de oligossacarídeos de soja com a celulase para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase; e a etapa (4) da submissão da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase de separação sólido-líquido para se obter um líquido de oligossacarídeos de soja purificada.
[012] Na presente invenção, de preferência, a celulase compreende um tipo ou dois ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em: β-
glicosidase, celobioidrolase e endoglucanase.
[013] Na presente invenção, de preferência, o líquido de oligossacarídeos de soja é submetido ao aquecimento e/ou redução de pressão para a remoção do solvente orgânico polar na etapa (2).
[014] Na presente invenção, de preferência, a concentração dos sólidos totais da suspensão de oligossacarídeo de soja é ajustada em um intervalo de 10 a 35% (p/p) antes da mistura com a celulase na etapa (3).
[015] Na presente invenção, de preferência, compreende a etapa (5) de purificação adicional do líquido de oligossacarídeos de soja purificada, utilizando um tipo ou dois ou mais tipos de membranas de separação selecionados a partir do grupo que consiste em: uma membrana de microfiltração, uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de nanofiltração, e uma membrana de osmose inversa.
[016] Na presente invenção, de preferência, o pH da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase é ajustado em um intervalo de 1,0 a 6,0 na etapa (4).
[017] Na presente invenção, de preferência, um sal de metal alcalino terroso é misturado na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase na etapa (4).
[018] Na presente invenção, de preferência, a esterase ainda é misturada na suspensão de oligossacarídeos de soja na etapa (3).
[019] Na presente invenção, de preferência, o etanol é utilizado como o solvente orgânico polar.
[020] Na presente invenção, de preferência, quando a soja e/ou o produto de soja processada são/é misturado(s) com o solvente orgânico polar que contém a água na etapa (1), a concentração de solvente orgânico polar, que é calculada pela seguinte Equação (I) está no intervalo a partir de 50 a 90% (p/p); - Concentração do solvente orgânico polar = massa de solvente orgânico polar, em um solvente orgânico polar que contém a água / (massa de água contida na soja e/ou produto de soja processada + massa total de solvente orgânico polar que contém a água) ··· (I)
[021] Um método para a produção de um produto químico de acordo com outro modo da presente invenção é caracterizado através da produção de um produto químico utilizando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido, utilizando qualquer um dos métodos acima para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada como um material bruto de fermentação.
[022] Na presente invenção, a precipitação de agregação das substâncias suspensas que permanecem em uma suspensão de oligossacarídeos de soja é promovida na etapa (3), e a substância suspensa na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase é submetida a uma separação sólido-líquido para remover com antecedência a substância suspensa a partir da suspensão de oligossacarídeos de soja na etapa (4). Por conseguinte, de acordo com a presente invenção, um líquido de oligossacarídeos de soja com pureza elevada e uma capacidade excelente de manuseio pode ser produzido a partir de uma soja e/ou um produto de soja processada. Por conseguinte, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada pode ser facilmente submetido á separação por membrana e, quando utilizado como uma fermentação de materiais brutos, pode ser facilmente agitado. Além disso, os produtos de fermentação podem ser mais facilmente purificados sem nenhuma ocorrência da precipitação de agregação.
[023] A Figura 1 mostra uma alteração na concentração de etanol com o tempo; - A Figura 2 mostra uma alteração na concentração de etanol com o tempo;
- A Figura 3 mostra uma alteração na concentração de etanol com o tempo; e - A Figura 4 mostra uma alteração na concentração de ácido láctico com o tempo.
[024] Os modos para a realização da presente invenção serão descritos em detalhes a seguir.
[025] Cada uma das etapas do método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, será descrita.
ETAPA (1) RECUPERAÇÃO DO OLIGOSSACARÍDEO DE SOJA, COM UM SOLVENTE ORGÂNICO
[026] Na etapa (1), uma soja e/ou um produto de soja processada são/é adicionado(s) a um solvente orgânico polar que contém a água que contém um solvente orgânico polar e água; a soja e/ou o produto de soja processada são/é misturado(s) com o solvente orgânico polar que contém a água que contém o solvente orgânico polar e água. Por conseguinte, um precipitado com uma proteína derivada da soja e/ou o produto de soja processada como um componente principal é formado no solvente orgânico polar que contém a água.
[027] Deve ser observado que, na presente especificação, a soja se refere à soja bruta e pode ser a soja com a casca ou a soja a partir da qual a casca foi removida. Além disso, a soja pode ser moída com antecedência.
Qualquer produto de soja processada pode ser utilizado, desde que contenha os oligossacarídeos de soja. De preferência são utilizados, por exemplo, aqueles obtidos por imersão de soja em água, leite de soja obtido submetendo a soja à extração com água quente, okara (polpa de soja), que é um resíduo sólido quando a soja é submetida à extração com água quente, soro de leite de soja obtido através da precipitação e remoção de proteínas e outros similares a partir de leite de soja através da precipitação de ácido, soja sem gordura que é o resíduo que é obtido através da extração e remoção de lipídeos de soja através da extração com o solvente, e similares. Além disso, um oligossacarídeo é um composto em que de 2 a 10 monossacarídeos estão ligados por uma ligação glicosídica. Além disso, um oligossacarídeo de soja é um termo geral para os oligossacarídeos que estão contidos na soja; principalmente inclui e é composto por sacarose, rafinose, estaquiose, e similares. Um líquido de oligossacarídeos de soja se refere a uma solução que contém os oligossacarídeos de soja.
[028] Um solvente orgânico polar que contém a água se refere a uma mistura em solução do solvente orgânico polar e água acima. Qualquer solvente orgânico polar pode ser utilizado, desde que ele seja capaz de dissolver os oligossacarídeos de soja e não dissolve a maioria das proteínas; o que pode ser utilizado como o solvente orgânico polar, por exemplo, é o etanol, metanol, acetona, acetonitrila, propanol, butanol, isobutanol, propanodiol, butanodiol, ou similares. Considerando que o oligossacarídeo de soja é utilizado para a aplicação do produto alimentar ou similar, é especialmente, de preferência, a utilização de etanol como o solvente orgânico polar.
[029] Quando uma soja e/ou um produto de soja processada são/é misturado(s) com um solvente orgânico polar que contém a água, a concentração do solvente orgânico polar é calculada pela Equação (I); - Concentração do solvente orgânico polar = massa de solvente orgânico polar no solvente orgânico polar que contém a água / (massa de água / umidade na soja e/ou produto de soja processada + massa total de solvente orgânico polar que contém a água) ··· (I)
[030] De preferência a concentração de solvente orgânico polar,
cuja concentração é calculada pela Equação (I) acima, está em um intervalo de 50 a 90% (p/p). Isso é devido a que, nos casos em que a concentração de solvente orgânico polar não é superior a 90% (p/p), a deposição e precipitação de oligossacarídeos de soja podem ser inibidas e, nos casos em que a concentração de solvente orgânico polar é não inferior a 50% (p/p), os precipitados de impurezas principalmente compostos de proteínas são suficientemente formados.
[031] Em relação à quantidade de solvente orgânico polar que contém a água adicionada, a quantidade adicionada na qual a concentração de oligossacarídeos de soja em um líquido de oligossacarídeos de soja que contém um solvente orgânico polar que contém a água, que está descrito posteriormente (a seguir, também referido como "líquido de oligossacarídeo que contém o solvente polar orgânico"), de preferência, está em um intervalo de 1 a 30% (p/p) e, de maior preferência, em um intervalo de 10 a 25% (p/p). Nos casos em que a concentração dos oligossacarídeos de soja em um líquido de oligossacarídeos que contém o solvente orgânico polar não é inferior a 1% (p/p), a energia ou os custos para concentrar o oligossacarídeo de soja nas etapas posteriores podem ser reduzidos. Além disso, nos casos em que a concentração dos oligossacarídeos de soja em um líquido de oligossacarídeos que contém o solvente orgânico polar não é superior a 30% (p/p), a deposição e a precipitação de oligossacarídeos de soja podem ser inibidas e uma redução na produtividade de oligossacarídeos de soja pode ser inibida. Deve ser observado que a concentração de oligossacarídeos de soja pode ser medida utilizando um dispositivo conhecido convencionalmente e, por exemplo, pode ser quantificada e determinada através da comparação com uma amostra padrão, utilizando a cromatografia líquida de eficiência elevada (HPLC).
[032] Além disso, na presente especificação, a concentração dos oligossacarídeos de soja se refere, salvo indicado de outra maneira, a uma soma das concentrações de sacarose, rafinose e estaquiose.
[033] Um tempo de mistura de uma soja e/ou um produto de soja processada com um solvente orgânico polar que contém a água, de preferência, é de um minuto a 10 horas e, de maior preferência, de 10 minutos a três horas.
Se o tempo de mistura não for inferior a um minuto, os precipitados de impurezas principalmente compostos de proteínas são suficientemente formados. Além disso, um tempo de mistura de 10 horas é suficiente para maximizar a quantidade de precipitação de impurezas principalmente compostas de proteínas, e um tempo extra pode ser reduzido.
[034] A temperatura no momento da mistura de uma soja e/ou um produto de soja processada com um solvente orgânico polar que contém a água, de preferência, é de 10º C a 90º C e, de preferência, 20º C a 40º C. Nos casos em que a temperatura no momento da mistura é igual ou superior a 10º C, a deposição de oligossacarídeos de soja em que o solvente orgânico polar que contém a água pode ser inibida. Além disso, nos casos em que a temperatura no momento da mistura não é superior a 90º C, a degradação de oligossacarídeos pode ser inibida. Além disso, nos casos em que a temperatura no momento da mistura não é superior a 90º C, a possibilidade de escurecimento através da reação de Maillard é capaz de ser reduzida.
[035] Em seguida, após a mistura de uma soja e/ou um produto de soja processada com um solvente orgânico polar que contém a água, um solvente orgânico polar que contém a água que contém os oligossacarídeos de soja e um precipitado formado no solvente orgânico polar que contém a água são submetidos à separação sólido-líquido para a remoção do precipitado.
[036] Um método para a separação sólido-líquido não está especialmente limitado; um método comum convencionalmente conhecido para a separação sólido-líquido pode ser utilizado. Os exemplos do método para a separação sólido-líquido incluem a centrifugação, prensagem de filtro, filtro de banda, a separação através da sedimentação espontânea, filtração através da tela de malha, filtração através do tecido não tecido, e filtração através do papel de filtro. Um método para a separação sólido-líquido entre um solvente orgânico polar e um precipitado pode ser utilizado isoladamente e os métodos plurais podem ser utilizados em combinação. Destes, a prensagem de filtro é de maior preferência utilizada do ponto de vista de que os sólidos em partículas podem ser removidos de maneira eficiente e uma maior quantidade de líquido de oligossacarídeos que contém o solvente orgânico polar pode ser recuperado através da compressão do sólido removido.
[037] Após a remoção de um precipitado a partir de um solvente orgânico polar que contém os oligossacarídeos de soja, utilizando um método para a separação sólido-líquido, um líquido de oligossacarídeos que contém um solvente orgânico polar (líquido de oligossacarídeos que contém o solvente polar orgânico) é recuperado.
ETAPA (2)
[038] Na etapa (2), um solvente orgânico polar é removido do líquido de oligossacarídeos de soja que contém o solvente orgânico polar recuperado na etapa (1) acima para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja.
[039] Como um método para a remoção de um solvente orgânico polar a partir de um líquido de oligossacarídeos de soja que contém o solvente orgânico polar, um método compreende o aquecimento e/ou redução da pressão de um líquido de oligossacarídeos que contém o solvente orgânico polar e a evaporação de um solvente orgânico polar para a remoção é adequadamente utilizado. Um dispositivo utilizado em um método de evaporação do solvente orgânico polar para a remoção não é especialmente limitado; que pode ser utilizado, por exemplo, são um evaporador, um evaporador de calor, um evaporador de efeito, um evaporador de efeito múltiplo, e similares, por exemplo,
podem ser utilizados.
[040] De preferência, uma temperatura que quando um solvente orgânico polar é evaporado está em um intervalo a partir de 10 a 60º C. Isto é devido a que a quantidade de solvente orgânico polar é evaporada o suficiente para não inferior a 10º C e a possibilidade de provocar um escurecimento através da reação de Maillard pode ser reduzida em não superior a 60º C.
[041] Qualquer concentração de solvente orgânico polar que permanece em uma suspensão de oligossacarídeos de soja pode ser empregada, desde que as enzimas não sejam inibidas ou desativadas na etapa (3) descrita posteriormente; a concentração, de preferência, é não superior a 10% (vol/vol) e, de maior preferência, não superior a 1% (vol/vol).
[042] Além disso, nos casos em que um solvente orgânico polar é removido de um líquido de oligossacarídeos de soja que contém o solvente orgânico polar através da evaporação, nesta etapa, o solvente orgânico polar evaporado é capaz de ser recuperado em uma armadilha fria ou similar, e novamente pode ser reutilizado como o solvente orgânico polar na etapa (1).
[043] Em comparação com o soro de leite de soja e similares, a suspensão de oligossacarídeos de soja obtida nesta etapa reduziu as quantidades de lipídeos e proteínas e também é possível dizer que é um líquido parcialmente purificado de oligossacarídeos de soja. No entanto, uma vez que a pureza de oligossacarídeos de soja ainda é baixa e que as substâncias suspensas são difíceis de serem separadas estão contidas, é difícil aplicar os métodos de purificação ou concentração da suspensão de oligossacarídeos de soja, utilizando a filtração através da membrana ou similares. Em vista disto, a substância suspensa na suspensão de oligossacarídeos de soja ainda é removida pela etapa (3) e a etapa (4) descritas abaixo na presente invenção.
[044] Deve ser observado que um valor obtido, de acordo com a seguinte Equação (1), dividindo o valor total (g) da massa de cada oligossacarídeo tais como a sacarose, rafinose ou estaquiose pela massa (g) do dos sólidos totais (a seguir, também referidos como TS) em uma solução aquosa é considerado como a pureza do oligossacarídeo de soja na presente invenção.
Deve ser observado que os sólidos totais correspondem aos resíduos após a evaporação; - Pureza de oligossacarídeo (%) = Valor total (g) da massa de cada oligossacarídeo (sacarose, rafinose, estaquiose) / massa (g) de sólidos totais ··· (1).
ETAPA (3)
[045] Na etapa (3), a celulase é misturada na suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2), e a suspensão de oligossacarídeos de soja é submetida ao tratamento com a celulase, e, por conseguinte, obtendo uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase. Na etapa (3), permitindo que a celulase possa agir sobre as impurezas em suspensão do oligossacarídeo de soja, é possível promover a precipitação de agregação das substâncias suspensas que permanecem na suspensão de oligossacarídeos de soja. Deve ser observado que, na presente especificação, a mistura de celulase na suspensão de oligossacarídeos de soja, seguido por permitir que a celulase possa agir sobre as impurezas em suspensão do oligossacarídeo de soja é denominado tratamento com a celulase.
[046] Na suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2) mencionada acima, além do oligossacarídeo de soja, está contida uma variedade de impurezas. Como impurezas, os lipídeos são mais abundantemente contidos e, além disso, as substâncias anfipáticas, tais como a saponina, isoflavona, e lecitina são suficientes. Além disso, a suspensão de oligossacarídeos de soja ainda contém uma quantidade muito pequena de proteínas. Uma vez que estas impurezas, tais como os lipídeos, as substâncias anfipáticas, e proteínas multiplicam para agir para formar as substâncias suspensas micelares muito estáveis na suspensão de oligossacarídeo de soja, é difícil separar essas impurezas de oligossacarídeos. Na presente invenção, é possível promover a precipitação de agregação da substância suspensa que permanece na suspensão de oligossacarídeos de soja através da adição de celulase para a suspensão de oligossacarídeos de soja, misturando e permitindo que a celulase possa agir sobre as impurezas em suspensão de oligossacarídeos de soja nesta etapa. Devido a isso, é possível aprimorar consideravelmente o desempenho de separação sólido-líquido entre o oligossacarídeo de soja e a substância suspensa na suspensão de oligossacarídeos de soja. Acredita-se, por exemplo, ser devido a que as cadeias de açúcar em saponina ou isoflavona nas impurezas serem decompostas pela celulase de maneira que as impurezas perdem a sua propriedade como uma substância anfipática.
[047] Deve ser observado que, na presente invenção, a celulase é um termo geral para as enzimas que catalisam a hidrólise de uma ligação β- glucósido em uma cadeia de carboidratos e se refere a uma enzima ou a um agente enzimático que contém um tipo ou dois ou mais tipos de componentes selecionados a partir do grupo que consiste em: β-glicosidase, celobioidrolase e endoglucanase.
[048] A β-glicosidase se refere a uma enzima que possui uma atividade de hidrólise de celobiose. Uma atividade para degradar a celobiose (a seguir, também referida como "atividade BGL") pode ser medida com base na quantidade de glicose liberada quando a enzima é deixada a atuar na celobiose como um substrato. A atividade BGL pode ser medida de acordo, por exemplo, com um método para a "análise de celobiase" descrita em "Pure & Appl. Chem., Volume 59, No. 2, páginas 257-268". Para ser mais específico, a atividade pode ser medida, por exemplo, sob condições de reação de 50º C e pH 5,0 e calculada como a atividade BGL por um mL de líquido de enzima (a unidade é U/mL) ou similares. Deve ser observado que, na presente invenção, uma unidade (U) de atividade BGL é definida como uma "atividade enzimática que degrada um µmol de celobiose em uma reação de degradação de celobiose durante um minuto (ou gera dois µmol de glicose para um minuto)".
[049] Além disso, na presente invenção, mesmo quando uma enzima, em geral, é classificada como outras enzimas, tal como a β- galactosidase, se a enzima possui a atividade BGL acima, deve ser considerada como um tipo de β-glicosidase.
[050] A celobioidrolase se refere a uma enzima que possui uma atividade para degradar a celulose cristalina a partir da extremidade terminal.
Uma atividade para degradar a celulose cristalina pode ser medida com base na quantidade de glicose liberada quando a enzima é deixada a atuar sobre a celulose cristalina como um substrato. Como um método específico para a medição da atividade para degradar a celulose cristalina, um método descrito em "Filter Paper Assay For Saccharifying Cellulase" em "Pure & Appl. Chem., Volume 59, No. 2, páginas 257-268" ou similar, pode ser utilizado.
[051] A endoglucanase se refere a uma enzima que possui uma atividade de clivagem de celulose não cristalina a partir do centro. Uma atividade para degradar a celulose não cristalina pode ser medida com base na quantidade de açúcares redutores liberados quando a enzima é deixada a atuar em carboximetilcelulose (CMC) como um substrato. Como um método específico para medição da atividade para degradar a celulose não cristalina, um método descrito em "Carboxyl Cellulase Assay For Endo-Β-1,4-Glucanase" em "Pure & Appl. Chem., Volume 59, No. 2, páginas 257-268" ou similar, pode ser utilizado.
[052] Quando as quantidades de celulases utilizadas na presente invenção são produzidas da mesma maneira que as suas quantidades de proteínas são equalizadas, quanto mais elevada for uma atividade específica de β-glicosidase (atividade específica de BGL), mais elevado será o efeito para promover a precipitação de agregação das substâncias em suspensão. Deve ser observado que a atividade específica de BGL se refere a uma atividade de BGL por quantidade de proteínas contidas em um agente enzimático. Na presente invenção, a atividade específica de BGL é calculada como um valor obtido dividindo um valor de medição (U/mL) da atividade de BGL por um mL de líquido de enzima por um valor da concentração (mg/mL) das proteínas em uma enzima líquida medida através do método de Bradford (a unidade é U/mg).
[053] De preferência, a atividade específica da celulase BGL utilizada na presente invenção, por exemplo, é não inferior a um U/mg. Se a atividade específica da celulase BGL não for inferior a um U/mg, é possível produzir um efeito para promover a precipitação de agregação das substâncias em suspensão suficientemente elevada.
[054] Além disso, na presente invenção, quando um produto purificado que contém a β-glicosidase isoladamente é comparado com uma preparação de celulase que contém, além da β-glicosidase, outros componentes, tais como a celobioidrolase ou endoglucanase, mesmo quando a atividade BGL é a mesma, a preparação de celulase que contém a β-glicosidase e outros componentes exibe um efeito muito superior para promover a precipitação de agregação das substâncias em suspensão. Isto é, presumivelmente, devido a que a β-glicosidase e outros componentes de celulase funcionam concertadamente para intensificar o efeito da etapa (3).
[055] Na presente invenção, uma vez que um efeito para promover a precipitação de agregação das substâncias suspensas se locomove para o nível mais elevado, quando o pH no momento do tratamento com a celulase é o pH ideal da enzima, de preferência, adota o pH ideal da enzima, como o pH o tempo de tratamento com a celulase. Deve ser observado que, uma vez que o pH ideal de preparação de celulase, em geral, é de cerca de 4 a 6 e o pH da suspensão obtida através do processo mencionado acima, em geral, é de cerca de 4,5 a 5,5, o ajuste do pH apenas pode ser realizado conforme adequado apenas caso necessário.
[056] Na presente invenção, a temperatura da suspensão de oligossacarídeos de soja no momento do tratamento com a celulase, de preferência, é ajustada para a temperatura ideal de celulase a ser utilizada. A temperatura ideal de celulase é de cerca de 50º C, em muitos casos e, de preferência, é ajustada, conforme adequado, de acordo com o tipo de celulase a ser utilizado.
[057] Na presente invenção, a concentração de sólidos totais (concentração TS) em uma suspensão de oligossacarídeos de soja de preferência, é ajustada em um intervalo a partir de 10 a 35% (p/p) antes da mistura de celulase. Se a concentração de sólidos total não for superior a 35% (p/p), a precipitação de agregação das substâncias em suspensão é suficientemente promovida, o que possibilita que a quantidade necessária de celulase adicionada seja reduzida. Acredita-se ser devido a que, através do ajuste da concentração dos sólidos totais não superiores a 35% (p/p), a atividade da água da suspensão de oligossacarídeo de soja seja intensificada em que a atividade de celulase aprimora. Além disso, se a concentração dos sólidos totais não for inferior a 10% (p/p), uma redução na concentração de oligossacarídeos que é eventualmente alcançada pode ser reduzida.
[058] Deve ser observado que a concentração de TS é um valor obtido dividindo a massa de sólidos totais (ST) em uma solução aquosa pela massa de solução aquosa total (a unidade é % (p/p)). Além disso, a massa de TS em uma solução aquosa pode ser medida utilizando um dispositivo convencionalmente conhecido, tal como uma balança de determinação de umidade por infravermelhos (FD-720, fabricado por Kett).
[059] Na presente invenção, a quantidade de celulase adicionada e o período de tempo para o tratamento de celulase não são especialmente limitados e apenas podem ser exigidos para serem ajustados de maneira que a precipitação da agregação das substâncias em suspensão é suficientemente promovida. Em geral, se a quantidade de celulase adicionada for aumentada, o custo de celulase aumenta, mas o período de tempo necessário para o tratamento é reduzido e, por conseguinte, os custos de equipamento podem ser reduzidos. Por outro lado, se a quantidade de celulase adicionada for reduzida, o custo de celulase pode reduzir, mas o período de tempo necessário para o tratamento se torna mais longo e, por conseguinte, os custos do equipamento aumentam. Devido a isso, de preferência, é que a quantidade de celulase adicionada e o período de tempo para o tratamento sejam ajustados de maneira adequada, dependendo da situação incluindo a programação da produção de oligossacarídeos de soja.
[060] Na etapa (3) da presente invenção, de preferência, ainda se mistura a esterase com uma suspensão de oligossacarídeos de soja, no momento do tratamento com a celulase. Ao adicionar também a esterase a uma suspensão de oligossacarídeo de soja, a precipitação de agregação das substâncias em suspensão ainda pode ser mais significativamente promovida.
Isto é, presumivelmente, devido a que uma ligação de éster é degradada por esterase, a ligação de éster está presente em uma parte da cadeia de carboidrato de lecitina, saponina, ou isoflavonas, que está contida na suspensão de oligossacarídeos de soja. O tipo de esterase não é especialmente limitado; a lipase, que pode ser utilizada industrialmente a um preço relativamente baixo ou similar é adequadamente utilizada.
ETAPA (4)
[061] Na etapa (4) da presente invenção, a suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3) acima é submetida a uma separação sólido-líquido para remover as substâncias em suspensão, obtidas através da precipitação a agregação na suspensão de oligossacarídeos de soja na etapa (3) e, por conseguinte, obtendo um líquido de oligossacarídeos de soja purificada. Este líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtida apresenta a pureza elevada de oligossacarídeo, turbidez baixa, e uma taxa de filtração elevada na passagem através de uma membrana de filtração; por conseguinte, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtida apresenta a pureza elevada e bom manuseio.
[062] Um método para a separação sólido-líquido não está especialmente limitado; o mesmo método para a separação sólido-líquido, conforme descrito na etapa (1) acima pode ser utilizado. Destes, de preferência, é a centrifugação e, especialmente de preferência, é a utilização de uma centrífuga contínua capaz de continuamente realizar a recuperação do sobrenadante da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase.
À medida que a centrífuga contínua, um decantador de parafuso, uma centrífuga do tipo De Laval, e similares, são adequadamente utilizados.
[063] O pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase quando uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase é submetida a uma separação sólido-líquido, de preferência, está em um intervalo de 1,0 a 6.0 e, de maior preferência, de 2,0 a 3,0. Nos casos em que o pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase é não inferior a 1,0, a hidrólise dos oligossacarídeos é difícil de ocorrer. Por outro lado, nos casos em que o pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase é não superior a 6,0, a separação sólido-líquido da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase também pode ser realizada, o que, por conseguinte, é de preferência. Além disso, um líquido de oligossacarídeos que possui a limpidez ainda mais significativa e pode ser facilmente submetido à filtração de membrana pode ser obtido realizando a separação sólido-líquido em um intervalo a partir de pH de 2 a 3;, por conseguinte, é de maior preferência ajustar o pH em um intervalo de 2 a 3. Deve ser observado que, devido a que o pH da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase obtida na etapa anterior (3), em geral, é de cerca de 4,5 a 5,5, o ajuste de pH apenas pode ser exigido para ser realizado sempre que necessário.
[064] Um ácido ou um álcali utilizado no ajuste de pH de uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase não é especialmente limitado. Os exemplos do ácido incluem o ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, e ácido fosfórico. De preferência, é o ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e do ponto de vista de que a inibição no momento da fermentação é difícil de ocorrer; de maior preferência, é o ácido sulfúrico a partir do ponto de vista da eficiência econômica. Como o álcali, de preferência, são a amônia, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, e uma solução aquosa que contém aqueles do ponto de vista da eficiência econômica; de maior preferência, são a amônia e hidróxido de sódio, que são os íons monovalentes, do ponto de vista de entupimento da membrana; de maior preferência ainda, é a amônia a partir do ponto de vista de que a inibição de fermentação é difícil de ocorrer.
[065] O ajuste do pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase pode ser realizado imediatamente antes da separação sólido-líquido ou ao mesmo tempo que a separação sólido-líquido. A suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase pode ser submetida ao ajuste do pH antes da separação sólido-líquido e deixada em repouso durante um determinado período de tempo até que a separação sólido-líquido seja iniciado, por conseguinte, aumentando ainda mais os efeitos. Um método exemplar envolve a realização da separação sólido-líquido, após o pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase ser ajustado e é deixado em repouso durante uma hora.
[066] Na presente invenção, de preferência, um sal de metal alcalino terroso é adicionado a uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase. Ao misturar o sal de metal alcalino terroso antes ou ao mesmo tempo que a separação sólido-líquido da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase, um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, com ainda maior limpidez pode ser obtido. Isto é provavelmente devido a que os sais de ácidos graxos nos cátions de troca da suspensão do oligossacarídeo de soja tratada com a celulase com o metal alcalino terroso formam os sais insolúveis. Ao obter o líquido de oligossacarídeos de soja purificada, com ainda maior limpidez, uma taxa de filtração quando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada é submetido ao processo de filtração de membrana ainda pode ser mais aprimorada.
[067] Como um sal de metal alcalino terroso, o carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, e similares, de preferência, podem ser utilizados. Além disso, a concentração de metal alcalino terroso adicionado não está especialmente limitada; a concentração final do sal de metal alcalino terroso em uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase após a adição do sal de metal alcalino terroso, de preferência, está em um intervalo de 5 a 20 g/L. Nos casos em que a concentração final do sal de metal alcalino terroso na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase é não inferior a 5 g/L, as impurezas são suficientemente removidas; nos casos em que a concentração final na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase não é superior a 20 g/L, os efeitos correspondentes para o metal alcalino terroso adicionado são suficientemente alcançados e um aumento nos custos de reagentes simultaneamente pode ser suprimido, o que, por conseguinte, economicamente é de preferência.
[068] Desta maneira, o método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção,
compreende da etapa (1) acima a etapa (4); um líquido de oligossacarídeos de soja purificada com a pureza e limpidez elevada pode ser obtido através da promoção da precipitação de agregação das substâncias suspensas que permanecem na suspensão de oligossacarídeos de soja na etapa (3) e através da remoção da substância suspensa na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase na etapa (4).
[069] Uma vez que o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4) é um líquido de oligossacarídeos de soja com limpidez que quase não contém as substâncias suspensas, a separação por membrana pode ser facilmente realizada. Além disso, nos casos em que o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4) é utilizado como material bruto de fermentação, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada pode ser facilmente agitado e os produtos de fermentação também são prontamente adicionalmente purificados sem nenhuma ocorrência da precipitação de agregação. Por conseguinte, em virtude do método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, é possível produzir um líquido de oligossacarídeos de soja com pureza elevada e uma capacidade excelente de manuseio de uma soja e/ou um produto de soja processada.
[070] Além disso, quando comparado com a suspensão de oligossacarídeo de soja obtido na etapa (2) ou a suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3) como um material bruto de fermentação, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4) torna possível aumentar a taxa de crescimento dos microrganismos ou uma concentração de taxa de produção e acumulação de produtos químicos.
Acredita-se ser devido a que algum tipo das substâncias que inibe a proliferação e o metabolismo de microrganismos (daqui em diante, também referido como inibidores da fermentação), as substâncias que estão contidas nas matérias em suspensão na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase, são removidas da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase na etapa (4).
[071] O líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4) pode ser utilizado tal e qual em uma variedade de aplicações, incluindo os materiais brutos alimentares, os materiais brutos de produtos farmacêuticos, e os materiais brutos de fermentação (fontes de carbono) na produção de fermentação dos produtos de fermentação, tais como os produtos químicos por microrganismos e podem aprimorar a eficiência da produção destes produtos alimentares, produtos farmacêuticos, e produtos de fermentação, tais como os produtos químicos por microrganismos. Os exemplos da química incluem os álcoois tais como o etanol, propanol e butanol; ácido acético; ácido láctico; e amino ácidos. Além disso, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada pode ser transformado oligossacarídeos em pó através da evaporação de água do líquido de oligossacarídeos de soja purificada. Além disso, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada também pode ser facilmente submetido à filtração através da membrana e, por conseguinte, também pode ser utilizado como um material bruto para a produção de um oligossacarídeo de soja mais altamente purificado.
[072] Além disso, ao possibilitar que uma enzima tal como a α- galactosidase, invertase, ou sacarase possa agir sobre o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4), um oligossacarídeo de soja pode ser rompido em monossacarídeos, tais como a galactose, glicose ou frutose. O monossacarídeo obtido pode ser utilizado em materiais brutos de açúcar. O material bruto de açúcar pode ser adequadamente utilizado em produtos alimentares, alimentos para animais, e materiais brutos de fermentação na produção de produtos químicos de fermentação por microrganismos, e outros similares. Deve ser observado que, na produção de produtos químicos de fermentação acima por microrganismos, a degradação do oligossacarídeo para o monossacarídeo pela enzima acima pode ser realizada antes ou ao mesmo tempo que a fermentação de produção.
OUTRA ETAPA ETAPA (5)
[073] Conforme descrito acima, a presente invenção pode compreender a etapa (5) de filtração do líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4) para posterior purificação. Como uma membrana de separação utilizada na filtração para a purificação adicional do líquido de oligossacarídeos de soja purificada, uma membrana de microfiltração, uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de nanofiltração, uma membrana de osmose reversa, e outros similares são utilizados. Como para a membrana utilizada na filtração, um tipo daqueles pode ser isoladamente utilizado, ou dois ou mais tipos podem ser utilizados em combinação. Nos casos em que a membrana de microfiltração é utilizada, impurezas de partículas com um tamanho de mícron podem ser removidas a partir do líquido de oligossacarídeos de soja purificada. Além disso, nos casos em que a membrana de ultrafiltração é utilizada, as impurezas de peso molecular elevado tais como as proteínas podem ser removidas. Além disso, nos casos em que a membrana de nanofiltração ou a membrana de osmose reversa é utilizada, parte das impurezas de peso molecular baixo pode ser removida e, ao mesmo tempo, o oligossacarídeo de soja pode ser concentrado.
[074] A suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2) da presente invenção e a suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3) apresentam a capacidade de filtração de membrana fraca e imediatamente provocam o entupimento das diversas membranas de filtração acima; por conseguinte, a purificação por membrana de filtração utilizando as diversas membranas de filtração acima, é muito difícil. Em contraste, o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na presente invenção apresenta uma boa capacidade de filtração da membrana; por conseguinte, as partículas com um tamanho de mícron, moléculas de peso molecular elevado, íons e similares podem ser removidos por meio de tratamento através da membrana de separação acima para se obter um líquido de oligossacarídeos de soja mais altamente purificado com limpidez elevada.
[075] Os exemplos de um método de filtração incluem a filtração sob pressão, filtração sob vácuo, filtração de centrifugação; o método não é especialmente limitado. Além disso, a operação de filtração é grosseiramente dividida em pressão constante de filtração, filtração de taxa de fluxo constante, e filtração de taxa de fluxo não constante e pressão não constante, e não é especialmente limitado. Além disso, como para a operação de filtração, a filtração de múltiplos estágios utilizando qualquer uma das membranas de separação de duas vezes ou mais acima pode ser empregada; os materiais e as propriedades da membrana naquele tempo não são especialmente limitados.
[076] Além disso, em casos em que um líquido de oligossacarídeos de soja purificada é filtrado utilizando qualquer uma ou mais de uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de nanofiltração, e uma membrana de osmose inversa, é de preferência, passar o líquido de oligossacarídeos de soja purificada através de uma membrana de microfiltração antecipadamente. Quando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada é passado através de uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de nanofiltração, e uma membrana de osmose inversa, o entupimento destas membranas pode ser removido por meio do tratamento preliminar do líquido de oligossacarídeos de soja purificada passando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada através de uma membrana de microfiltração para remover a partículas de tamanho mícron contidas no líquido de oligossacarídeos de soja purificada.
[077] Além disso, em casos em que um líquido de oligossacarídeos de soja purificada é filtrado utilizando uma membrana de nanofiltração e/ou uma membrana de osmose inversa, é de preferência, passar o líquido de oligossacarídeo purificado através de uma membrana de ultrafiltração com antecedência. Quando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada é passado através de uma membrana de nanofiltração e/ou uma membrana de osmose inversa, o entupimento destas membranas pode ser removido por meio de tratamento preliminar do líquido de oligossacarídeos de soja purificada passando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada através de uma membrana de ultrafiltração para remover os componentes de peso molecular elevado tais como as proteínas que estão contidas no líquido de oligossacarídeos de soja purificada.
[078] Deve ser observado que a membrana de microfiltração utilizada na presente invenção se refere a uma membrana com um diâmetro de poro fino média de 0,01 µm a 10 µm e é abreviado como uma membrana de MF (microfiltração), ou similares. Além disso, uma membrana de ultrafiltração utilizada na presente invenção é uma membrana com um peso molecular de cisalhamento de 1.000 a 200.000 e é abreviado como uma membrana de UF (ultrafiltração), ou similares. No presente, o diâmetro dos poros da membrana de ultrafiltração é tão pequeno que é difícil medir o diâmetro dos poros finos na superfície da membrana por um microscópio eletrônico ou similar; um valor denominado como o peso molecular de cisalhamento, em vez do diâmetro médio de poro fino, é utilizado como um índice para o tamanho de diâmetro de poro. O peso molecular de cisalhamento se refere a um peso que é bem conhecido dos técnicos no assunto como um índice que representa o desempenho da membrana da membrana de ultrafiltração, conforme está descrito que "uma curva obtida através da representação gráfica de dados com o peso molecular do soluto ao longo do eixo horizontal e a taxa de bloqueio ao longo do eixo vertical é denominada uma curva do peso molecular de cisalhamento; o peso molecular em que a taxa de bloqueio é 90% é denominado o peso molecular de cisalhamento da membrana ". Na ediçãoThe Membrane Society of Japan, Membrane Experiment Series, Volume III, Artificial Membrane, editado por Shoji Kimura, Shinichi Nakao, Haruhiko Ohya, e Tsutomu Nakagawa (1993 Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.), página 92.
[079] Os materiais destas membranas de microfiltração ou membranas de ultrafiltração não são especialmente limitados, desde que o material possa alcançar o objeto mencionado acima da presente invenção da remoção de partículas finas; os seus exemplos incluem os materiais orgânicos tais como a celulose, ésteres de celulose, polissulfona, sulfona de poliéter, polietileno clorado, polipropileno, poliolefina, álcool polivinílico, polimetacrilato de metila, fluoreto de polivinilideno, ou tetrafluoreto de polietileno, os metais tais como o aço inoxidável, e os materiais inorgânicos tal como a cerâmica. O material da membrana de microfiltração ou da membrana de ultrafiltração pode ser selecionado conforme adequado em face das características do hidrolisado ou custos de execução. De preferência, é um material orgânico; o polietileno clorado, polipropileno, fluoreto de polivinilideno, polissulfona, ou sulfona de poliéter é de maior preferência.
[080] Além disso, a filtração utilizando uma membrana de microfiltração e uma membrana de ultrafiltração pode ser realizada de acordo, por exemplo, com um método descrito na publicação WO 2010/067785.
[081] A membrana de nanofiltração utilizada na presente invenção também é denominada uma membrana NF e é uma membrana de separação que, em geral, é definida como uma "membrana de permeação de íons monovalentes, enquanto bloqueia os íons bivalentes". A membrana de nanofiltração é uma membrana que se acredita possuir aberturas microscópicas de cerca de diversos nanômetros e principalmente utilizada para o bloqueio de partículas finas ou moléculas, íons, sais ou outros similares, em água.
[082] Como materiais que formam a membrana de nanofiltração, os materiais poliméricos tais como os polímeros de celulose à base de acetato, poliésteres, poliamidas, poliimidas, ou polímeros de vinila podem ser utilizados; a membrana não está limitada a uma membrana que consiste em um tipo de material mencionado acima e pode ser uma membrana que contém os materiais de membrana plurais. Além disso, em relação à estrutura da membrana da membrana de nanofiltração, a membrana pode ser uma membrana assimétrica que possui uma camada densa, pelo menos, em um lado e microporos que possuem tamanhos de poros que gradualmente aumentam na direção a partir da camada densa para a parte interna da membrana ou do outro lado da membrana, ou uma membrana compósita que possui uma camada funcional muito fina formada por um outro material sobre a camada densa de uma membrana assimétrica. Como a membrana compósita, uma membrana compósita que possui um nanofiltro composto por uma camada funcional de poliamida em uma membrana de suporte que compreende a polissulfona como um material de membrana, por exemplo, pode ser utilizada. Essa membrana compósita está descrita, por exemplo, na Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 62-201606 ou similar.
[083] Destes, preferida é uma membrana compósita com uma poliamida como uma camada funcional que apresenta resistência elevada à pressão, permeabilidade elevada à água, e desempenho elevado de remoção de soluto em combinação, e possui potencial excelente. A fim de ser capaz de manter a durabilidade contra a pressão de operação, a permeabilidade elevada à água, e o desempenho de bloqueio, o que é adequado é um que possui uma poliamida como uma camada funcional e uma estrutura que retém a camada funcional, com um suporte composto por uma membrana porosa ou um tecido não tecido. Além disso, como uma membrana semipermeável de poliamida, uma membrana semipermeável compósita é adequada, essa membrana semipermeável compósita possui, como um suporte, uma camada funcional de poliamida de ligação cruzada obtida através de uma reação de policondensação entre uma amina polifuncional e um halogeneto de ácido polifuncional.
[084] Em uma membrana de nanofiltração com uma poliamida como uma camada funcional, os exemplos de preferência de um componente de ácido carboxílico de um monômero que consiste em uma poliamida incluem os ácidos carboxílicos aromáticos, tais como o ácido trimésico, ácido carboxílico tetrabenzofenona, ácido trimelítico, ácido piromelítico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, ácido dicarboxílico naftalínico, ácido carboxílico difenílico, e ácido piridinocarboxílico. Tendo em vista a solubilidade em um solvente de formação de membrana, de maior preferência, são o ácido trimésico, ácido isoftálico, ácido tereftálico, e uma sua mistura.
[085] Os exemplos de preferência de um componente de amina do monômero composto por apoliamida incluem as diaminas primárias com um anel aromático, tais como a m-fenilenodiamina, p-fenilenodiamina, benzidina, metlenbisdianilina, éter de 4,4'-diaminodifenila, dianisidina, éter de 3,3’,4- triaminodifenila, éter 3,3’,4,4'-tetraaminodifenila, 3,3'-dioxibenzidina, 1,8- naftalenodiamina, fenilenodiamina de m(p)monometila, éter de 3,3'- diaminodifenil-4,4'monometilamino, 4,N,N'-(4-aminobenzoil)- p(m)fenilenodiamina-2,2'-bis(4-aminofenil benzoimidazol), 2,2'-bis(benzoxazol 4-aminofenil), e 2,2'-bis(4-aminofenilbenzotiazolo), e diaminas secundárias, tais como a piperazina, piperidina, ou seus derivados. Destes, uma membrana de nanofiltração, como uma camada funcional, com uma poliamida de ligação cruzada que contém a piperazina ou piperidina como monômero, de preferência, é utilizada uma vez que possui, além da resistência à pressão e durabilidade, a resistência térmica e resistência química. De preferência é uma poliamida que possui uma poliamida de piperazina de ligação cruzada ou uma poliamida de piperidina de ligação cruzada como um componente principal e contém um componente constituinte mostrado na seguinte Fórmula química (I). de maior preferência, é uma poliamida que possui uma poliamida de piperazina de ligação cruzada como um componente principal e contém um componente constituinte mostrado na seguinte Fórmula química (I). Além disso, uma com n = 3 na seguinte Fórmula química (I), de preferência, é utilizada. Os exemplos de uma membrana de nanofiltração, como uma camada funcional, com uma poliamida que possui uma poliamida de piperazina de ligação cruzada como um componente principal e contém um componente constituinte mostrado na seguinte Fórmula química (I) incluem aquela descrita na Publicação Aberta do Pedido de Patente Japonesa 62-201606; seus exemplos específicos incluem uma membrana de nanofiltração à base de poliamida da piperazina de ligação cruzada, UTC60 fabricada por Toray Industries, Inc., que possui, como uma camada funcional, uma poliamida que possui uma poliamida de piperazina de ligação cruzada como um componente principal e contém uma com n = 3 na seguinte Fórmula química (I) na forma de um componente constituinte.
[086] (i) (n é um número inteiro que é não inferior a 1)
[087] As membranas de nanofiltração, em geral, são utilizadas como um módulo de membrana de tipo espiral; a membrana de nanofiltração utilizada na presente invenção também, de preferência, é utilizada como um módulo de membrana de tipo espiral. Os exemplos específicos de um módulo de membrana de nanofiltração, de preferência, incluem: (a) uma membrana de nanofiltração fabricada por GE Osmonics, GEsepa, que é uma membrana de nanofiltração à base de acetato de celulose; (b) uma membrana de nanofiltração fabricada por Alfa Laval, NF99 ou NF99HF, que possui uma poliamida como uma camada funcional; (c) uma membrana de nanofiltração fabricada por Filmtec, NF- 45, NF-90, NF-200, NF-270, ou NF-400, que possui a poliamida de piperazina de ligação cruzada como uma camada funcional; e (d) um módulo de membrana de nanofiltração fabricado por Toray Industries, Inc., SU-210, SU-220, SU-600, ou SU-610, que contém o UTC-60 fabricado pela mesma empresa, esse UTC- 60 possui, como uma camada funcional, uma poliamida que possui uma poliamida de piperazina de ligação cruzada como um componente principal e contém um componente constituinte mostrado na Fórmula química mencionada acima (i). De maior preferência, é a membrana (b), (c), ou (d) acima; de maior preferência ainda, é a membrana (d) acima.
[088] De preferência o pH do líquido de oligossacarídeos de soja purificada para ser submetido à membrana de nanofiltração está em um intervalo de pH de 1 a 5. Isto é devido a que, nos casos em que o pH é igual ou superior a 1, é possível suprimir uma deterioração significativa de desempenho da membrana, tal como o fluxo ou permeabilidade provocado por desnaturação da membrana mediante a utilização a longo prazo; nos casos em que o pH não é superior a 5, é possível suprimir uma redução significativa na taxa de remoção das substâncias que inibem a proliferação e o metabolismo de microrganismos, isto é, os inibidores da fermentação. Por esse motivo, o ajuste do pH do líquido de oligossacarídeos de soja purificada dentro do intervalo acima e a realização de filtração com uma membrana de nanofiltração, uma eficiência de remoção de inibidor da fermentação pode ser aprimorada. Além disso, quando o pH do líquido de oligossacarídeos de soja purificada está dentro do intervalo acima, a membrana de nanofiltração pode ser utilizada de maneira estável durante um longo período de tempo devido a um efeito de reduzir as incrustações de membrana de nanofiltração.
[089] A temperatura de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada que é passado através de uma membrana de nanofiltração pode ser adequadamente ajustada a partir do ponto de vista de aumentar a capacidade da membrana de nanofiltração utilizada para a remoção dos inibidores da fermentação no momento da filtração. Para ser mais específico, nos casos em que a filtração é realizada com a membrana de nanofiltração, se a temperatura do líquido de oligossacarídeos de soja purificada for de 40º C a 80º C, o desempenho da membrana de nanofiltração na remoção do inibidor da fermentação é aumentado, o que, por conseguinte, é de preferência. Nos casos em que a temperatura do líquido de oligossacarídeos de soja purificada quando a filtração é realizada com a membrana de nanofiltração for não inferior a 40º C, o desempenho na remoção do inibidor de fermentação contido no líquido de oligossacarídeos de soja purificada aumenta; nos casos em que a temperatura do líquido de oligossacarídeos de soja purificada é não superior a 80º C, a desnaturação da membrana de nanofiltração pode ser inibida e, por conseguinte, as propriedades da membrana podem ser mantidas. Devido a isso, ajustando a temperatura do líquido de oligossacarídeos de soja purificada dentro do intervalo acima, o desempenho da membrana de nanofiltração na remoção do inibidor da fermentação pode ser aprimorado.
[090] Além disso, para ser mais específico, a nanofiltração pode ser realizada de acordo, por exemplo, com um método descrito na publicação WO 2010/067785.
[091] Nos casos em que um líquido de oligossacarídeos de soja purificada é filtrado utilizando uma membrana de nanofiltração, os inibidores da fermentação podem ser mais eficientemente removidos através da adição de água para o líquido de oligossacarídeos de soja purificada. Além disso, a quantidade de água adicionada pode ser utilizada para o controle do teor dos inibidores da fermentação contidos no líquido de açúcar purificado após a nanofiltração. Para ser mais específico, quanto maior for a quantidade de água adicionada, menor será o teor do inibidor de fermentação contido em um líquido de açúcar purificado após a nanofiltração.
[092] A membrana de osmose inversa utilizada na presente invenção também é denominada uma membrana de RO e, em geral, é definida como uma "membrana que possui uma função de remoção de sais, incluindo os íons monovalentes". Acredita-se que a membrana possua aberturas microscópicas que variam de cerca de diversos angstroms a diversos nanômetros e principalmente é utilizada para a remoção dos componentes de íons, por exemplo, a dessalinização da água do mar ou a produção de água ultrapura.
[093] Além disso, a filtração utilizando uma membrana de osmose inversa pode ser realizada de acordo com, por exemplo, um método descrito na publicação WO 2010/067785.
[094] Desta maneira, a purificação adicional do líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4), utilizando qualquer uma ou mais das membranas de separação acima na etapa (5) torna possível obter um líquido de oligossacarídeos de soja purificada que ainda é purificado e possui a pureza elevada e limpidez elevada.
[095] Para os propósitos de descrição mais detalhada, o método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, especificamente será descrito por meio dos Exemplos abaixo, mas a presente invenção não está limitada a eles.
[096] Nos seguintes Exemplos e Exemplos Comparativos, a concentração de açúcares, pureza dos oligossacarídeos, turbidez, capacidade de filtração do líquido de oligossacarídeos, concentração de proteínas, atividade de β-glicosidase (BGL), preparação de celulase derivada de Trichoderma, concentração de etanol, e fermentação de etanol e ácido láctico utilizando um líquido de oligossacarídeos de soja foram medidos como a seguir.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1
[097] A concentração de cada um dos monossacarídeos (glicose, galactose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose) contido no líquido de açúcar (solução aquosa), obtido em cada um dos Exemplos e Exemplos Comparativos foi analisada sob as condições da cromatografia líquida de eficiência elevada (HPLC) descrita abaixo e quantificados através da comparação com uma amostra padrão.
CONDIÇÕES DE HPLC - Instrumento: ACQUITY UPLC sistema (fabricado por Waters); - Coluna: Amida ACQUITY UPLC BEH 1,7 µm 2,1 × 100 mm (fabricada por Waters); - Fase móvel: Líquido A; 80% de acetonitrila + 0,2% de TEA, Líquido B; 30% de acetonitrila + 0,2% de TEA; -Taxa de fluxo: 0,12 mL/min; - Temperatura: 35º C EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2
[098] Um valor obtido, com base na seguinte Equação (1), dividindo o valor total da massa (g) de cada oligossacarídeo (sacarose, rafinose e estaquiose), medido através do método descrito acima no Exemplo de Referência 1 pela massa (g) dos sólidos totais (TS) na solução aquosa utilizada como a pureza dos oligossacarídeos (%). A massa dos sólidos totais na solução aquosa foi medida utilizando uma balança de determinação de umidade por infravermelhos (FD-720, fabricado por Kett);
- Pureza de oligossacarídeos (%) = Valor total (g) da massa de cada oligossacarídeo (sacarose, rafinose e estaquiose) / massa (g) de TS em solução aquosa ··· (1).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3
[099] A turbidez da solução aquosa foi medida utilizando um medidor de turbidez (turbidímetro portátil, 2100P, fabricado por Hach) (unidade: NTU). Deve ser observado que o limite superior da medição da turbidez por este dispositivo é de 1.000 NTU e, por conseguinte, a turbidez acima do limite superior da medição, nos seguintes Exemplos e Exemplos Comparativos é indicada como "não inferior a 1.000 (NTU)".
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4
[0100] A fim de avaliar se um processo de filtração através da membrana foi ou não aplicável para cada líquido de oligossacarídeos de soja utilizado nos seguintes Exemplos e Exemplos Comparativos, uma taxa de filtração MF (mL/min) foi medida. A medição foi realizada submetendo 100 mL de líquido de oligossacarídeos para a filtração por sucção utilizando uma membrana de microfiltração (Durapore hidrófilo, fabricado por Millipore) com um tamanho de poro fino de 0,45 µm e um diâmetro de 47 mm a 25º C e -50 kPa(G).
Nessa altura, o tempo (min.) necessário para a filtração foi medido. Um valor obtido dividindo o volume de líquido (100 mL) por este valor foi utilizado como a taxa de filtração MF. Deve ser observado que nos casos em que o tempo necessário para a filtração de 100 mL de líquido de oligossacarídeos era superior a 30 minutos, isto é, a taxa de filtração era abaixo de 3,3 mL/min., o líquido foi considerado não ser adequado para a utilização prática e foi considerado como "impossível de ser filtrado"; - Deve ser observado que, como referência, quando a água pura foi submetida à filtração utilizando o método acima, a taxa de filtração da água pura MF era de 390 mL/min.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5
[0101] A concentração de proteínas na solução aquosa foi medids utilizando um conjunto de medição de acordo com o método de Bradford (Quick Start Bradford Protein Assay, fabricado por Bio-Rad).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE Β-GLICOSIDASE (BGL) E ATIVIDADE ESPECÍFICA DE BGL
[0102] A medição da atividade de BGL de uma solução aquosa foi realizada de acordo com um método para a "análise de celobiase" descrito em "Pure & Appl. Chem., Volume 59, No. 2, páginas 257-268". As condições de reação foram de 50º C e pH 5,0; a atividade de BGL foi calculada como uma atividade por 1 mL de líquido de enzima (unidade: U/mL). Além disso, com base na concentração de proteínas medida através do método descrito no Exemplo de Referência 5 acima, a atividade de BGL por mg de proteína foi calculada (isto é, daqui em diante referida como "atividade específica de BGL", unidade: U/mg).
Deve ser observado que 1 unidade (U) de atividade de BGL é definida como uma atividade enzimática que degrada 1 µmol de celobiose em uma reação de degradação de celobiose durante um minuto (ou gera 2 µmol de glicose durante um minuto).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7
[0103] A celulase derivada de Trichoderma foi preparada através do método seguinte.
[0104] Para a água destilada, a maceração de milho a 5% (p/v), glicose a 2% (p/v), tartarato de amônio a 0,37% (p/v), sulfato de amônio a 0,14
(p/v), fosfato de diidrogenofosfato de potássio a 0,2% (p/vol), cloreto de cálcio diidratado a 0,03% (p/v), sulfato de magnésio heptaidratado a 0,03% (p/v), cloreto de zinco a 0,02% (p/v), cloreto de ferro (III) hexaidratado a 0,01% (p/v), sulfato de cobre (II) pentaidratado a 0,004% (p/v), cloreto de manganês tetraidratado a 0,0008% (p/v), ácido bórico a 0,0006% (p/v), e heptamolibdato de hexamônio tetraidratado a 0,0026% (p/v) foram adicionados, de forma que cada concentração indicada foi alcançada. Em seguida, 100 mL de água destilada que contém cada um dos componentes acima foram colocados em um balão Erlenmeyer de 500 mL com chicanas seguidas da esterilização por autoclave a 121º C durante 15 minutos. Após a mistura resultante ser resfriada, o PE-M e Tween 80, cada um dos quais haviam sido submetidos separadamente para a esterilização em autoclave a 121º C durante 15 minutos, foram cada um adicionados ao frasco Erlenmeyer de 500 mL acima com chicanas a 0,01% (p/v).
A este meio de pré-cultura, a Trichoderma reesei PC3-7 foi inoculada de maneira a ser de 1 × 105 células microbianas / mL e foi cultivada a 28º C com agitação a 180 rpm durante 72 horas utilizando um dispositivo de agitação (BIO-Shaker BR- 40LF fabricado por TAITEC Corporation), e a cultura resultante foi utilizada como uma pré-cultura.
[0105] Para a água destilada, a maceração de milho a 5% (p/v), glicose a 2% (p/v), celulose (Avicel) a 10% (p/v), tartarato de amônio a 0,37% (p/v), sulfato de amônio a 0,14% (p/v), fosfato de diidrogenofosfato de potássio a 0,2% (p/v), cloreto de cálcio diidratado a 0,03% (p/v), sulfato de magnésio heptaidratado a 0,03% (p/v), cloreto de zinco a 0,02% (p/v), cloreto de ferro (III) hexaidratado a 0,01% (p/v), sulfato de cobre (II) pentaidratado a 0,004% (p/v), cloreto de manganês tetraidratado a 0,0008% (p/v), ácido bórico a 0,0006% (p/v), e heptamolibdato de hexamônio tetraidratado a 0,0026% (p/v) foram adicionados, de forma que cada concentração indicada foi alcançada. Em seguida, 2,5 L de água destilada que continham cada um dos componentes acima foram colocados em um recipiente do frasco de agitação de 5 L (DPC-2A fabricado por ABLE Corporation) seguido de esterilização por autoclave a 121º C durante 15 minutos. Após a mistura resultante ser resfriada, o PE-M e Tween 80, cada um dos quais haviam sido submetidos separadamente para a esterilização em autoclave a 121º C durante 15 minutos, foram cada um adicionados ao frasco Erlenmeyer de 500 mL acima com chicanas a 0,1% (p/v) e 250 mL de Trichoderma reesei PC3-7 que tinham sido previamente pré-cultivados em meio líquido através do método mencionado acima foram inoculados. A Trichoderma reesei acima, em seguida, foi cultivada a 28º C com agitação a 300 rpm durante 87 horas utilizando um dispositivo de agitação (BIO-Shaker BR-40LF fabricado por TAITEC Corporation) com um volume de aeração de 1 vvm. Em seguida, a cultura resultante foi centrifugada a 3.000 G durante 10 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi submetido à filtração através da membrana (STERICUP-GV, material: PVDF, fabricada por Milipore). Esta solução de cultura preparada na condição mencionada acima foi utilizada nos Exemplos abaixo como a celulase derivada de Trichoderma.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 8
[0106] A concentração de etanol em uma solução aquosa foi detectada e calculada por um detector de ionização de chama sob as condições da cromatografia gasosa (GC) indicadas a seguir e quantificada através da comparação com uma amostra padrão; - Instrumento: Shimadzu GC-2010 (fabricado por Shimadzu Corporation); - Coluna: TC-1 (diâmetro interno de 0,53 mm, comprimento de 15 m, espessura da membrana de 1,50 µm (produzido por GL Sciences Inc.);
- Método de detecção: detector de ionização de chama (FID) EXEMPLO DE REFERÊNCIA 9
[0107] A concentração de ácido láctico na solução aquosa foi quantificada por HPLC sob as condições mostradas a seguir, através da comparação com uma amostra padrão; - Coluna: Shim-pack SPR-H (fabricada por Shimadzu Corporation); - Fase móvel: ácido p-toluenossulfônico a 5 mM (taxa de fluxo de 0,8 mL/min); - Solução da reação: ácido p-tolueno-sulfônico a 5 mM, bis Tris a 20 mM, EDTA · 2Na a 0,1 mM (taxa de fluxo: 0,8 mL/min); - Método de detecção: condutividade elétrica; - Temperatura: 45º C EXEMPLO DE REFERÊNCIA 10
[0108] Em um tubo de teste, 2 mL de meio YPD descrito a seguir foram colocados e submetidos a esterilização em autoclave a 121º C durante 20 minutos. Após a cultura resultante ser deixada a resfriar, uma das colônias de levedura formadas por placa de cultura (30º C, 24 horas) em meio de ágar YPD descrito abaixo foi inoculada utilizando um circuito de platina em uma bancada limpa. Isto foi cultivado a 30º C com agitação a 120 rpm durante 24 horas utilizando um dispositivo de agitação (BIO-Shaker BR-40LF fabricado por TAITEC Corporation) e, por conseguinte, obtendo um líquido de pré-cultura; - meio YPD: extrato de levedura a 1% (p/v), Bactopeptona (Difco fabricado) a 2% (p/v), glicose a 2% (p/v); - meio de ágar YPD: ágar que contém o% (p/v) em adição à composição de meio YPD acima CULTURA PRINCIPAL 1
[0109] Uma solução aquosa de hidróxido de potássio (5 mol/L) foi adicionada a um líquido de oligossacarídeos de soja, que serviu como um material bruto de fermentação de maneira que o pH foi ajustado para 5,5. A partir deste, 10 mL foram colocados em um tubo de teste em conjunto com 0,5 mL do líquido de pré-cultura acima e misturados. Este tubo de teste foi cultivado a 30º C com agitação a 120 rpm durante 43 horas.
CULTURA PRINCIPAL 2
[0110] Uma solução de hidróxido de potássio aquoso (5 mol/L) foi adicionada a um líquido de oligossacarídeos de soja, que serviu como um material bruto de fermentação de maneira que o pH foi ajustado a 5,5; o carbonato de cálcio ainda foi adicionado a isto de maneira a alcançar uma concentração final de 2% (p/v). A partir deste, 10 mL foram colocados em um tubo de teste em conjunto com 0,5 mL do líquido de pré-cultura acima e misturados. Este tubo de teste foi cultivado a 30º C com agitação a 120 rpm durante 68 horas.
EXEMPLO 1
PRODUÇÃO DE LÍQUIDO DE OLIGOSSACARÍDEOS DE SOJA PURIFICADA ETAPA (1)
[0111] Após o leite puro de soja comercialmente disponível e 96% (vol/vol) de etanol serem misturados em uma proporção de volume de líquido, de 3:7, a mistura líquida foi completamente agitada. Este foi centrifugado a 8.000 G durante 1 minuto, utilizando um dispositivo de centrifugação; após a centrifugação, um líquido de oligossacarídeos que contém um solvente orgânico polar foi recuperado como sobrenadante.
ETAPA (2)
[0112] Do sobrenadante obtido na etapa (1) acima, 600 mL foram colocados em um balão de recuperação de 1 L e concentrado sob pressão reduzida a 50º C e 230 hPa, utilizando um evaporador rotativo (NVC-2100, fabricado por Tokyo Rikakikai Co., Ltd./EYELA) e um banho de água quente (SB- 1000, fabricado por Tokyo Rikakikai Co., Ltd./EYELA). Após a concentração ser realizada até que o volume de líquido se tornar 150 mL, o líquido restante foi recuperado como uma suspensão de oligossacarídeos de soja. Deve ser observado que esta etapa foi repetida até que foi obtida uma quantidade necessária de suspensão de oligossacarídeos de soja. A concentração de açúcar, pureza dos oligossacarídeos, turbidez e concentração de sólidos totais (concentração TS) na suspensão de oligossacarídeos de soja obtida foram medidos através do método descrito nos Exemplos de Referência de 1 a 3. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
TABELA 1 Suspensão de oligossacarídeos de soja Glicose 0 Galactose 0 Concentração Fructose 7,2 de açúcar (g/L) Sacarose 129,4 Rafinose 14,1 Estaquiose 79,1 Pureza dos oligossacarídeos 50% em peso
Suspensão de oligossacarídeos de soja Não inferior a 1.000 Turbidez
NTU Concentração dos sólidos totais 45% em peso (concentração TS) ETAPA (3)
[0113] A suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2) acima foi diluída em água de maneira que a concentração dos sólidos totais foi ajustada para cerca de 35%. O pH foi ajustado a cerca de pH 5,0 utilizando o ácido sulfúrico (3 mol/L) e o produto resultante foi bem agitado. Em seguida, cerca de 1 mL da preparação de celulase comercialmente disponível (Accellerase DUET (daqui em diante também referido como DUET), fabricado por Genencor) foi adicionado a 1 L de volume de líquido e misturado; a mistura foi agitada a cerca de 50º C durante 24 horas, e, por conseguinte, obtendo uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase.
ETAPA (4)
[0114] O pH da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3) acima foi ajustado a cerca de pH 2,5 utilizando o ácido sulfúrico (3 mol/L) e agitado; em seguida, o resultante foi separado em alíquotas para um tubo de centrífuga e deixado em repouso no tubo de centrifugação. Uma hora mais tarde, o tubo de centrífuga foi diretamente fixado a um dispositivo de centrifugação; a centrifugação foi realizada a 8.000 G durante um minuto. Após a centrifugação, um líquido de oligossacarídeos de soja purificada foi recuperado como sobrenadante. A pureza dos oligossacarídeos,
turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidos de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4.
Os resultados são mostrados na Tabela 2.
EXEMPLO COMPARATIVO 1 CASOS EM QUE A ETAPA (3) (TRATAMENTO DE CELULASE) NÃO FOI EXECUTADA
[0115] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1 foi realizado exceto que o tratamento de celulase na etapa (3) do Exemplo 1 foi omitido. Isto é, em vez da solução tratada com a celulase, a suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2) foi utilizada na etapa (4) do Exemplo 1 (observe que a suspensão foi diluída em água de maneira que a concentração dos sólidos totais da mesma era de cerca de 35%). Como resultado, mesmo após a suspensão de oligossacarídeo de soja ser centrifugada na etapa (4), quase nenhuma precipitação foi gerada e nenhuma matéria em suspensão foi incapaz de ser separada. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF desta suspensão de oligossacarídeos de soja em que a matéria em suspensão permaneceu foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
EXEMPLO COMPARATIVO 2
[0116] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1 foi realizado exceto que as etapas (1) e (2) foram omitidas. Isto é, em vez de utilizar a suspensão de oligossacarídeos de soja, o leite de soja puro foi diretamente utilizado na etapa (3) do Exemplo 1. Como resultado, mesmo após a centrifugação na etapa (4), quase nenhuma precipitação foi gerada e nenhuma matéria em suspensão foi incapaz de ser separada. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF deste leite de soja em que a matéria em suspensão permaneceu foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
TABELA 2 Etapa * Pureza dos Taxa de Turbidez oligossacarídeos filtração MF 1 2 3 4 (NTU) (%) (mL/min) Exemplo 1 + + + + 84 6 218 Exemplo Não inferior a Impossível de Comparativo + + - + 51
1.000 ser filtrada 1 Exemplo Não inferior a Impossível de Comparativo - - + + 38
1.000 ser filtrada 2
[0117] Conforme é evidente a partir da Tabela 2, no Exemplo Comparativo 2, em que as etapas (1) e (2) não foram realizadas e as etapas (3) e (4) foram realizadas, a pureza de oligossacarídeos foi baixo; a turbidez era acima do limite superior de medida; a filtração MF era impossível. No Exemplo Comparativo 1, em que as etapas (1), (2), e (4) foram realizadas e a etapa (3) não foi realizadas, a pureza dos oligossacarídeos foi superior àquela do Exemplo Comparativo 2. No entanto, a turbidez foi acima o limite superior da medição e a filtração MF também era impossível. Por outro lado, no Exemplo 1, em que todas as etapas de (1) a (4) foram realizadas, a pureza dos oligossacarídeos foi muito mais elevada do que aquela no Exemplo Comparativo 2; além disso, a turbidez foi reduzida acentuadamente; a filtração MF também foi possível. Por conseguinte, pela realização do método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, um líquido de oligossacarídeos de soja que possui a pureza elevada e limpidez elevada é fácil de ser submetido à membrana de filtração foi capaz de ser obtido.
E XEMPLO 2
[0118] Como preparações de celulase que contém diversos componentes, o DUET utilizado no Exemplo 1, Novo 188 (fabricado por Sigma Aldrich), foi utilizado no meio de cultura de Trichoderma (descrito no Exemplo de Referência 7). Em primeiro lugar, a sua concentração de proteína e atividade de proteína BGL foram por cada medida de acordo com os Exemplos de Referência 5 e
6. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
TABELA 3 Atividade específica de BGL Proteína (g/L) (U/mg) DUET 38,5 14,0 Novo 188 27,0 5,2 Meio de cultura de 24,2 1,1 Trichoderma
[0119] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1, cada um foi realizado exceto que estas preparações foram utilizadas como preparações de celulase e a sua quantidade adicionada foi de 1,4 mL para Novo 188 e 1,6 mL para o meio de cultura de Trichoderma de maneira que a quantidade adicionada foi igual àquela do Exemplo 1 em termos de proteínas. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF de cada um dos líquidos de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de
2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 4.
TABELA 4 Pureza dos Taxa de Turbidez Exemplo 2 oligossacarídeos filtração MF (NTU) (%) (mL/min) Novo 188 84 10 177 Meio de cultura 83 12 148 de Trichoderma
[0120] Conforme é evidente a partir da Tabela 2 a Tabela 4, não existia muita diferença na pureza e turbidez de oligossacarídeos entre os casos em que nenhuma preparação de celulase foi utilizada. Por outro lado, nos casos em que foi utilizada a preparação de celulase com maior atividade específica de BGL, a taxa de filtração MF era superior. Por conseguinte, de preferência, se utiliza uma maior atividade específica de BGL como a celulase utilizada no método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção.
EXEMPLO 3 CASOS EM QUE FOI UTILIZADA A Β-GLICOSIDASE (PRODUTO PURIFICADO)
[0121] Como uma preparação de celulase que apenas contém a β- glicosidase, foi utilizada a β-glicosidase derivada de Aspergillus niger (E-BGLUC, fabricada por Megazyme). Em primeiro lugar, a concentração de proteína e a sua atividade BGL foram, cada uma medida de acordo com os Exemplos de Referência 5 e 6. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
TABELA 5 Atividade específica de Proteína (g/L) BGL (U/mg) β-glicosidase 2,1 127,6
[0122] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1 foi realizado exceto que a quantidade de preparação de celulase que possui a atividade específica de BGL mostrada na Tabela 5 adicionada foi 2,0 mL de maneira que a atividade de BGL foi igual àquela do Exemplo 1 (valor absoluto) (cerca de 540 unidades, calculado com base em um valor de atividade específica de BGL na Tabela 3) e este foi utilizado como a celulase. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
TABELA 6 Pureza dos Taxa de Turbidez Exemplo 3 oligossacarídeos filtração MF (NTU) (%) (mL/min) β-glicosidase 84 9 138
[0123] Conforme é evidente a partir da Tabela 2, Tabela 4, e Tabela 6, os resultados quase compatíveis da pureza dos oligossacarídeos e turbidez foram obtidos mesmo a partir da preparação de celulase que apenas contém a β- glicosidase (Exemplo 3), em comparação com outras preparações de celulase. Além disso, como para a taxa de filtração MF, foi obtida uma taxa suficiente. Por conseguinte, na etapa (3) do método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, presume- se que a β-glicosidase na celulase principalmente promove a precipitação de agregação das substâncias em suspensão, por conseguinte, contribuindo para aprimorar a capacidade de filtração MF. Além disso, embora a atividade BGL adicional seja a mesma, a taxa de filtração MF do Exemplo 3 foi mais baixa, em comparação com aquela do Exemplo 1. Por conseguinte, presume-se que o efeito para aprimorar a capacidade de filtração MF é concertadamente intensificado por outros componentes de celulase. Por conseguinte, acredita-se que uma enzima que contém diversos componentes é de maior preferência como a celulase utilizada no método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção.
EXEMPLO COMPARATIVO 3
[0124] Como uma preparação de enzima celulase diferente, foi utilizada a protease (derivada de Aspergillus oryzae, fabricada por Sigma-Aldrich). Em primeiro lugar, a sua concentração de proteína foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 5, como um resultado, foi descoberto ser de 1,100 g/L. O mesmo tratamento, conforme descrito no Exemplo 1, cada um foi realizado exceto que esta protease foi utilizada em vez de DUETO como uma preparação enzimática e, além disso a sua quantidade adicionada foi de 35 uL, de maneira a ser a mesma em termos de proteínas, conforme descrito no Exemplo 1.
[0125] Como resultado, mesmo após a centrifugação na etapa (4), quase nenhuma precipitação foi gerada e nenhuma matéria em suspensão foi incapaz de ser separada. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF neste líquido de oligossacarídeos de soja em que a matéria em suspensão permaneceu foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 7.
TABELA 7 Pureza dos Taxa de Exemplo Turbidez oligossacarídeos filtração MF Comparativo 3 (NTU) (%) (mL/min) Não Impossível Protease 52 inferior a de ser
1.000 filtrada
[0126] Conforme é evidente a partir da Tabela 7, quando a protease foi utilizada em vez de celulase, nenhuma da pureza de oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF era boa.
E XEMPLO 4
[0127] Como a esterase, a lipase 1 (lipase AS Amano, fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e lipase 2 (lipase de Aspergillus niger, fabricada por Sigma-Aldrich) foram utilizadas. Em primeiro lugar, 0,1 g de pó de cada esterase foram dissolvidos em 0,5 mL de tampão de acetato de sódio a 50 mmol/L (pH 5,2). Como um resultado da medição das suas concentrações de proteína de acordo com o Exemplo 5 de Referência, as concentrações de proteína das lipases 1 e 2 foram de 9,3 g/L e 8,7 g/L, respectivamente. O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1 foi realizado exceto que estas esterases ainda foram adicionadas, além do DUET. Deve ser observado que a quantidade de lipase 1 adicionada foi de 410 mL e a quantidade de lipase 2 adicionada foi de 440 uL de maneira que a quantidade de lipase 1 e lipase 2 adicionada foi cada igual a 1/10 da quantidade de proteínas de DUETO adicionado. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 8.
TABELA 8 Taxa de Pureza dos Turbidez Exemplo 4 filtração MF oligossacarídeo s(%) (NTU) (mL/min) DUET + lipase 1 84 2 264 DUET + lipase 2 84 4 248
[0128] Conforme é evidente a partir da Tabela 2 e Tabela 8, quando a esterase ainda foi adicionada, além de celulase, a turbidez foi capaz de ser ainda mais reduzida e a taxa de filtração MF ainda foi aprimorada, em comparação com o caso da utilização de celulase isoladamente.
EXEMPLO 5
[0129] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1, cada um foi realizado exceto que o pH da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase na etapa (4) foi de 6,0, 5,0, 4.0, 3,5, 3.1, 3.0,
2.5, ou 2,0 (deve ser observado que no caso de um pH de 2,5 foi a mesma condição conforme descrita no Exemplo 1 e, por conseguinte, os resultados do Exemplo 1 foram efetivamente utilizados). Deve ser observado que o ajuste do pH foi realizado através da adição de hidróxido de sódio a 1 mol/L ou 3 mol/L de ácido sulfúrico. A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são apresentados na Tabela 9.
TABELA 9 Exemplo 5 Pureza dos Turbidez Taxa de filtração pH oligossacarídeos (%) (NTU) MF (mL/min) 6,0 83 43 106 5,0 82 36 112 4,0 83 31 129 3,5 83 34 132 3,1 83 26 150 3,0 84 13 200 2,5 84 6 218 2,0 84 7 220
[0130] Conforme é evidente a partir da Tabela 2 e Tabela 9,
independentemente do pH, a pureza dos oligossacarídeos foi igual àquela do Exemplo 1. Por outro lado, foi descoberto que, em comparação com aquela nos Exemplos Comparativos 1 e 2, a turbidez foi amplamente reduzida a qualquer pH da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase, e ainda mais reduzida, no caso em que o pH não foi superior a 3,0. De maneira similar, foi descoberto que, em comparação com aquela nos Exemplos Comparativos de 1 a 3, a taxa de filtração MF foi amplamente aprimorada em qualquer pH, e ainda aprimorada no caso em que o pH era não superior a 3,0.
EXEMPLO 6
[0131] O mesmo tratamento conforme descrito no Exemplo 1 foi realizado exceto que 10 g de carbonato de cálcio ou cloreto de cálcio foram adicionados em vez de utilizar o ácido sulfúrico para realizar o ajuste do pH na etapa (4). A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
TABELA 10 Pureza dos Taxa de Turbidez Exemplo 6 oligossacarídeos filtração MF (NTU) (%) (mL/min) Adição de carbonato de 80 9 205 cálcio Adição de cloreto 79 6 190 de cálcio
[0132] Conforme é evidente a partir da Tabela 10, a mesma pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF que aquelas do Exemplo
1 foram alcançadas, mesmo no caso em que, ou o carbonato de cálcio ou o cloreto de cálcio foi adicionado.
EXEMPLO 7
[0133] Para os casos em que, na etapa (3), a concentração dos sólidos totais após a adição de água foi ajustada para quatro tipos, isto é, 45% (p/p), 40% (p/p), 35% (p/p), e 30% (p/p), e ainda a quantidade de preparação de celulase (DUET) adicionada foi, para cada tipo, definida como três tipos, isto é, 0,1 mL, 1 mL, e 10 mL, isto é, para 12 casos no total, o mesmo tratamento que aquele descrito no Exemplo 1, foi realizado, exceto para a concentração dos sólidos totais e a quantidade de celulase (deve ser observado que as condições empregadas quando a concentração dos sólidos totais era de 35% (p/p) e a quantidade de celulase adicionada foi de 1 mL foram as mesmas que aquelas descritos no Exemplo 1 e, por conseguinte, os resultados do Exemplo 1 foram efetivamente utilizados).
[0134] A pureza dos oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF do líquido de oligossacarídeos de soja purificada recuperada foram medidas de acordo com os Exemplos de Referência de 2 a 4. Os resultados são mostrados na Tabela 11.
TABELA 11 Concentração Quantidade de Taxa de Pureza dos dos sólidos enzima Turbidez filtração oligossacarídeos totais adicionada (NTU) MF (%) (% (p/p)) (mL) (mL/min) Não Impossível 0,1 54 inferior a de ser 45
1.000 filtrada 1 54 Não Impossível
Concentração Quantidade de Taxa de Pureza dos dos sólidos enzima Turbidez filtração oligossacarídeos totais adicionada (NTU) MF (%) (% (p/p)) (mL) (mL/min) inferior a de ser
1.000 filtrada 10 81 12 108 Não Impossível 0,1 50 inferior a de ser 40 1.000 filtrada 1 80 58 119 10 82 9 225 0,1 83 10 209 35 1 84 6 218 10 84 3 230 0,1 81 7 231 30 1 84 4 240 10 82 7 247
[0135] Conforme é evidente a partir da Tabela 11, quando a concentração de sólidos totais não era superior a 35%, não existia muita diferença na pureza de oligossacarídeos, turbidez, e taxa de filtração MF em nenhum dos casos em que a quantidade de celulase utilizada foi de 0,1 mL, 1 mL e 10 mL. Por outro lado, no caso em que a concentração de sólidos total foi superior a 40% (p/p), 0,1 mL não foi suficiente para a quantidade de celulase utilizada. A partir disto, a fim de alcançar os mesmos resultados conforme descritos no Exemplo 1, foi descoberto que a quantidade de celulose utilizada é necessária ser de 10 mL. Por conseguinte, pode-se dizer que, se o método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada, de acordo com a presente invenção, é utilizado, a quantidade de enzima utilizada é capaz de ser bastante reduzida, ajustando a concentração de sólidos totais da suspensão de oligossacarídeos de soja para não superior a 35%.
E XEMPLO 8
[0136] Para casos em que, no método para a produção de fermentação para etanol descrito no Exemplo de Referência 8, foram utilizadas três tipos de levedura, isto é, a cepa Saccharomyces cerevisiae OC2 (ATCC 46276), cepa Candida tropicalis NBRC0199, e cepa Candida utilis NBRC0988 e três tipos de materiais brutos, isto é, a suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2), a suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3), e o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4), conforme descrito no Exemplo 1, foram utilizados para cada levedura, isto é, para nove casos no total, a produção de etanol de fermentação foi realizada. Uma alteração na concentração de etanol em cada solução de reação com o tempo é mostrada na Figura 1 à Figura 3. Deve ser observado que: a Figura 1 mostra o caso da utilização da cepa Saccharomyces cerevisiae OC2 (ATCC 46276) como levedura; a Figura 2 mostra o caso da utilização da cepa Candida tropicalis NBRC0199 como levedura; e a Figura 3 mostra o caso da utilização da cepa Candida utilis NBRC0988 como levedura.
[0137] Conforme é evidente a partir da Figura 1 à Figura 3, no caso em que qualquer levedura foi utilizada, a taxa de produção e a acumulação da concentração final de etanol apenas aumentaram quando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada foi utilizado como material bruto.
E XEMPLO 9
[0138] Para os casos em que, no método para a produção de fermentação do ácido láctico descrito no Exemplo de Referência 8, a levedura produtora de ácido D-láctico preparado através de um método descrito na publicação WO 2010/140602 foi utilizada como levedura e três tipos de líquidos de oligossacarídeos de soja, isto é, a suspensão de oligossacarídeos de soja obtida na etapa (2), a suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase obtida na etapa (3), e o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido na etapa (4), conforme descrito no Exemplo 1, foram, cada um utilizado para a levedura, isto é, para três casos no total, a produção de fermentação do ácido láctico foi realizada. Uma alteração na concentração de ácido láctico em cada solução de reação com o tempo é mostrada na Figura 4. Conforme é evidente a partir da Figura 4, a taxa de produção e a acumulação da concentração final de ácido láctico apenas aumentaram quando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada foi utilizado como material bruto.
Claims (11)
1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM LÍQUIDO DE OLIGOSSACARÍDEOS DE SOJA PURIFICADO, a partir de uma soja e/ou um produto de soja processada, caracterizado por compreender: - a etapa (1) da mistura da soja e/ou do produto de soja processada, com um solvente orgânico polar que contém a água que contém um solvente orgânico polar e água e, em seguida, remoção de um precipitado gerado para obter um líquido de oligossacarídeos de soja que contém um solvente orgânico polar que contém a água; - a etapa (2) da remoção do solvente orgânico polar a partir do líquido de oligossacarídeos de soja para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja; - a etapa (3) da mistura da suspensão de oligossacarídeos de soja com a celulase para se obter uma suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase; e - a etapa (4) da submissão da suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase para a separação sólido-líquido para se obter um líquido de oligossacarídeos de soja purificada.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela celulase compreender um tipo ou dois ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em: β-glicosidase, celobioidrolase e endoglucanase.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo líquido de oligossacarídeos de soja ser submetido ao aquecimento e/ou redução de pressão para a remoção do solvente orgânico polar na etapa (2).
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela concentração dos sólidos totais na suspensão de oligossacarídeos de soja ser ajustada em um intervalo de 10 a 35% (p/p) antes da mistura com a celulase na etapa (3).
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a etapa (5) de purificação adicional do líquido de oligossacarídeos de soja purificada utilizando um tipo ou dois ou mais tipos de membranas de separação selecionado a partir do grupo que consiste em: uma membrana de microfiltração, uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de nanofiltração, e uma membrana de osmose inversa.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo pH da suspensão de oligossacarídeo de soja tratada com a celulase ser ajustado em um intervalo de 1,0 a 6,0 na etapa (4).
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por um sal de metal alcalino terroso ser misturado na suspensão de oligossacarídeos de soja tratada com a celulase na etapa (4).
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela esterase ser adicionalmente misturada na suspensão de oligossacarídeos de soja na etapa (3).
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo etanol ser utilizado como o solvente orgânico polar.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 9, caracterizado por quando a soja e/ou o produto de soja processada são/é misturado(s) com o solvente orgânico polar que contém a água na etapa (1), a concentração do solvente orgânico polar, que é calculado pela Equação seguinte (I), estar no intervalo de 50 a 90% (p/p); - concentração do solvente orgânico polar = massa de solvente orgânico polar, em um solvente orgânico polar que contém a água / (massa de água contida na soja e/ou produto de soja processada + massa total de solvente orgânico polar que contém a água) (I).
11. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO
QUÍMICO, caracterizado por compreender a produção de um produto químico utilizando o líquido de oligossacarídeos de soja purificada obtido utilizando o método para a produção de um líquido de oligossacarídeos de soja purificada,
conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, como um material bruto de fermentação.
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