BR112015029931B1 - composição imunogênica, e, processo para preparar uma composição imunogênica - Google Patents

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Ralph Leon Biemans
Philippe Denoel
Pierre Duvivier
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Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, PROCESSO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA A aplicação descreve um método de imunização contra infecção por Staphylococcus aureus compreendendo uma etapa de administrar a um paciente humano uma dose única de uma composição imunogênica compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de Staphylococcus aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 (Mi)g.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao campo das composições e vacinas imunogênicas de estafilococos, sua fabricação e ao uso de tais composições em medicina. Mais particularmente, ela refere-se ao uso de conjugados feitos de um sacarídeo capsular de S. aureus, conjugado a uma proteína carreadora. Tais conjugados podem ser combinados com antígenos de proteína de estafilococos selecionados para formar composições multivalentes.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Staphylococcus aureus (S. aureus) são bactérias Gram- positivas comensais que colonizam as narinas, axilas, faringe e outras superfícies da mucosa e pele de cerca de 30% de indivíduos humanos. Estima-se que S. aureus seja responsável por 20 a 25% de todas as infecções associadas a cuidados de saúde (Wisplinghoff et al Clin Infect. Dis. 2004; 39; 309-317), resultando em três vezes mais a estadia em hospital e um risco 5 vezes maior de morte hospitalar para pacientes infectados comparados aos pacientes sem tais infecções (Noskin et al Arch. Intern. Med. 2005; 165; 1756-1761). Infecções por S. aureus pode ser associada com taxas de mortalidade em hospitais de até 25%. Historicamente, S. aureus foi associado principalmente com infecções nosocomiais. A seriedade de tais infecções aumentou com o recente aumento drástico na infecção por S. aureus associada com resistência a antibiótico. Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções nosocomiais com uma morbidade e mortalidade significativas (Romero-Vivas et al 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Ele é a causa de alguns casos de osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome do choque tóxico.
[003] Imunoterapia passiva que envolve administração de antissoro policlonal contra antígenos de estafilococos foi investigada (WO 00/15238, WO 00/12132), bem como imunoterapia usando um anticorpo monoclonal contra ácido lipoteicoico (WO 98/57994). Entretanto ainda, nenhum foi licenciado para uso. Várias imunoterapias candidatas falharam em apresentar eficácia em humanos. Estas incluem; Altastaph (Nabi Biopharmaceuticals) contendo anticorpos CP5 e CP8 purificados de indivíduos vacinados com StaphVAX™ (vacina investigacional desenvolvida e comercializada por Nabi Biopharmaceuticals, Rockville, MD, USA; Veronate (Inhibitex), anticorpos policlonais que alvejam fator de aglutinação A de S. aureus (ClfA) e SdrG de adesão de S. epidermidis; Aurexis (Tefibazumab, Inhibitex), anticorpos monoclonais que alvejam ClfA; Aurograb (NeuTec Pharma), anticorpos de cadeia única contra um transportador de cassete que se liga a ATP; e Pagibaximab (Biosynexus), um anticorpo antiácido lipoteicoico monoclonal (Dejonge et al J. Paediatrics 2007; 151; 260-265, Rupp et al Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51; 4249-4254).
[004] Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa para gerar uma resposta imune policlonal contra estafilococos. Uma abordagem reportada em WO 03/61558 usa conjugados de polissacarídeos capsulares conjugados Tipo 5 e Tipo 8 de S. aureus a exoproteína A de Pseudomonas (StaphVAX - Nabi Biopharmaceuticals). Uma abordagem adicional usou uma proteína IsdB de S. aureus (V710 - Merck & Co), mas falhou em demonstrar eficácia (Fowler et al 2013; JAMA 309; 1368-1378).
[005] Existem muitos problemas associados com o desenvolvimento de uma vacina contra Infecção por S. aureus. A falha das vacinas que dependem de um único componente (polissacarídeo capsular ou a proteína de IsdB) sugere que uma vacina mais complexa contendo múltiplos componentes pode ser requerida para induzir imunidade protetiva. Entretanto, a combinação de diferentes antígenos em uma composição imunogênica pode levar a interferência na composição (Skurnik et al (2010) J. Clin. Invest. 120; 3220-3233). A identificação dos componentes para combinar em uma composição multivalente, desta forma, não é direta. Permanece uma necessidade de desenvolver uma vacina efetiva contra infecção por estafilococos, especialmente em vista da maior frequência de cepas resistentes a multidrogas.
[006] No caso de imunização contra infecção nosocomial por estafilococos, imunização pode frequentemente acontecer em um tempo curto logo antes da hospitalização ou cirurgia ou inserção de um cateter residente. Desta forma, seria vantajoso alcançar altos níveis de imunidade com uma única imunização. O uso de doses inferiores de conjugado também tem vantagens de eficiência relativa de produção de vacina e benefícios econômicos associados.
[007] Desta maneira, é fornecido um método de imunização contra infecção por Staphylococcus aureus compreendendo uma etapa de administrar a um paciente humano uma dose única de uma composição imunogênica compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de Staphylococcus aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 5 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg.
[008] Em um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de Staphylococcus aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 5 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg, para uso no tratamento ou prevenção de infecção por Staphylococcus aureus em que a um paciente humano é administrada uma dose única da composição imunogênica.
[009] Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma e um alfa toxoide.
[0010] Em um quarto aspecto da invenção, é fornecida uma vacina compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma e um alfa toxoide e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0011] Em um quinto aspecto da invenção, é fornecido um processo para preparar a composição imunogênica ou a vacina da invenção compreendendo as etapas de a) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, b) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado e c) combinar o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma e um alfa toxoide para formar a composição imunogênica.
Descrição das Figuras
[0012] Figura 1 - Porcentagem de indivíduos que experimentam dor depois de 1 ou 2 doses da vacina 4C. Em cada grupo de formulação, as primeiras três colunas fornecem a % de indivíduos que experimentam dor depois de uma única dose com a primeira coluna representando todos os reportes de dor, a segunda coluna representando dor acima ou igual ao grau 2 e a terceira coluna representando grau 3 de dor. As 4a, 5a e 6a colunas mostram a mesma informação depois da segunda dose.
[0013] Figura 2 - Porcentagem de indivíduos que experimentam vermelhidão depois de 1 ou 2 doses da vacina 4C. Em cada grupo de formulação, as primeiras três colunas fornecem a % de indivíduos que experimentam vermelhidão depois de uma única dose com a primeira coluna representando todos os reportes de vermelhidão, a segunda coluna representando mais de 50 mm de vermelhidão e a terceira coluna representando mais de 100 mm de vermelhidão. As 4a, 5a e 6a colunas mostram a mesma informação depois da segunda dose.
[0014] Figura 3 - Porcentagem de indivíduos que experimentam edema depois de 1 ou 2 doses da vacina 4C. Em cada grupo de formulação, as primeiras três colunas fornecem a % de indivíduos que experimentam edema depois de uma única dose com a primeira coluna representando todos os reportes de edema, a segunda coluna representando mais de 50 mm de edema e a terceira coluna representando mais de 100 mm de edema. As 4a, 5a e 6a colunas mostram a mesma informação depois da segunda dose.
[0015] Figura 4 - Resultados de imunogenicidade para anticorpos que surgiram contra polissacarídeo Tipo 5 de S. aureus capsular. O GMC resulta de um ensaio Luminex que detecta anticorpos contra Tipo 5 polissacarídeo capsular em vários pontos de tempo depois da primeira e segunda imunizações são mostrados. Os pontos de tempo escolhidos são dia 0 antes da imunização, dia 7 depois de uma imunização, dia 14 depois de uma imunização, dia 30 depois de uma imunização, dia 7 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 37 no gráfico), dia 14 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 44 no gráfico) e dia 30 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 60 no gráfico). Para cada ponto de tempo, os resultados são apresentados na ordem (esquerda para direita) de 5/10, 5/10AS, 10/30, 10/30AS e salina.
[0016] Figura 5 - Resultados de imunogenicidade para anticorpos que surgiram contra polissacarídeo Tipo 8 de S. aureus capsular. O GMC resulta de um ensaio Luminex que detecta anticorpos contra Tipo 8 polissacarídeo capsular em vários pontos de tempo depois da primeira e segunda imunizações são mostrados. Os pontos de tempo escolhidos são dia 0 antes da imunização, dia 7 depois de uma imunização, dia 14 depois de uma imunização, dia 30 depois de uma imunização, dia 7 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 37 no gráfico), dia 14 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 44 no gráfico) e dia 30 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 60 no gráfico). Para cada ponto de tempo, os resultados são apresentados na ordem (esquerda para direita) de 5/10, 5/10AS, 10/30, 10/30AS e salina.
[0017] Figura 6 - Resultados de imunogenicidade para anticorpos que surgiram contra S. aureus alfa toxoide. O GMC resulta de um ensaio Luminex que detecta anticorpos contra alfa toxoide em vários pontos de tempo depois da primeira e segunda imunizações são mostrados. Os pontos de tempo escolhidos são dia 0 antes da imunização, dia 7 depois de uma imunização, dia 14 depois de uma imunização, dia 30 depois de uma imunização, dia 7 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 37 no gráfico), dia 14 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 44 no gráfico) e dia 30 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 60 no gráfico). Para cada ponto de tempo, os resultados são apresentados na ordem (esquerda para direita) de 5/10, 5/10AS, 10/30, 10/30AS e salina.
[0018] Figura 7 - Resultados de imunogenicidade para anticorpos que surgiram contra S. aureus ClfA. O GMC resulta de um ELISA que detecta anticorpos contra ClfA em vários pontos de tempo depois da primeira e segunda imunizações são mostrados. Os pontos de tempo escolhidos são dia 0 antes da imunização, dia 7 depois de uma imunização, dia 14 depois de uma imunização, dia 30 depois de uma imunização, dia 7 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 37 no gráfico), dia 14 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 44 no gráfico) e dia 30 depois de duas imunizações (que corresponde ao dia 60 no gráfico). Para cada ponto de tempo, os resultados são apresentados na ordem (esquerda para direita) de 5/10, 5/10AS, 10/30, 10/30AS e salina.
[0019] Figura 8 - Resultados de imunogenicidade para polissacarídeo Tipo 5 de S. aureus capsular (painel A), sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus (painel B), alfa toxoide (painel C) e ClfA (Painel D) por um período de tempo mais longo de dia 0 a dia 540, depois de 1, 2 ou 3 imunizações.
Descrição Detalhada
[0020] A presente invenção descreve um método de imunização contra Infecção por Staphylococcus aureus compreendendo uma etapa de administrar a um paciente humano uma dose única de uma composição imunogênica compreendendo um sacarídeo capsular Tipo 5 de Staphylococcus aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 3 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 50 μg, 5 a 25 μg, 5 a 20 μg, 5 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg.
[0021] Em uma modalidade, a composição imunogênica adicionalmente compreende um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 3 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 50 μg, 5 a 25 μg, 5 a 20 μg, 5 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg.
[0022] Em uma modalidade, a mesma dose de sacarídeo de sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado e sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado está presente na composição imunogênica; por exemplo, uma dose de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 μg de sacarídeo de conjugados tanto do Tipo 5 e Tipo 8.
[0023] A maioria das cepas de S. aureus que causa infecção no homem contêm polissacarídeos Tipo 5 ou Tipo 8. Aproximadamente 60% das cepas humanas são Tipo 8 e aproximadamente 30% são Tipo 5. Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005) usou espectroscopia de RMN para identificar as estruturas dos polissacarídeos capsulares como: Tipo 5 A) β D ManNAcA (1 —4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 —3)- β - D-FucNAc-(1 — Tipo 8 -3)- β -D-ManNAcA(4OAc)-(1 -3)- α -L-FucNAc(1 -3)- α -D-FucNAc(1 -
[0024] Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S. aureus usando métodos bem conhecidos por versados, por exemplo, descritos em US6294177, WO 11/41003, WO 11/51917 ou Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367. Por exemplo, ATCC 12902 é uma cepa de S. aureus Tipo 5 e ATCC 12605 é uma cepa de S. aureus Tipo 8.
[0025] Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamente podem ser de tamanho menor, por exemplo, por microfluidização, irradiação ultrassônica ou por tratamento químico, tal como exposição a pH 5,0 a 3,0. A invenção também cobre oligossacarídeos derivados de polissacarídeos Tipo 5 e 8 de S. aureus. Em uma modalidade, o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus tem um peso molecular de mais de 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa ou 90 kDa ou entre 25 a 125 kDa, 90 a 125 kDa, 30 a 100 kDa, 35 a 75 kDa ou 40 a 70 kDa. Em uma modalidade, o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus tem um peso molecular de mais de 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa ou 90 kDa ou entre 25 a 125 kDa, 90 a 125 kDa, 30 a 100 kDa, 35 a 75 kDa ou 40 a 70 kDa.
[0026] Em uma modalidade, a proteína carreadora à qual o sacarídeo capsular Tipo 5 e/ou Tipo 8 é conjugado é selecionada do grupo consistindo em toxoide do tétano, toxoide da difteria, CRM197, alfa toxoide, ClfA e exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa.
[0027] Os polissacarídeos ou oligossacarídeos capsulares tipo 5 e/ou 8 incluídos na composição imunogênica da invenção são O-acetilados. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação de polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular Tipo 5 é 50 a 100%. 60 a 100%, 70 a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 50 a 90%, 60 a 90%, 70 a 90%, 70 a 80% ou 80 a 90%. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação de Tipo 8 polissacarídeo capsular ou oligossacarídeo é 10 a 100%, 20 a 100%, 30 a 100%, 40 a 100%, 50 a 100%. 60 a 100%, 70 a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 50 a 90%, 60 a 90%, 70 a 90%, 70 a 80% ou 80 a 90%. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação de Tipo 5 e Tipo 8 polissacarídeos capsulares ou oligossacarídeos é 10 a 100%, 20 a 100%, 30 a 100%, 40 a 100%, 50 a 100%. 60 a 100%, 70 a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 50 a 90%, 60 a 90%, 70 a 90%, 70 a 80% ou 80 a 90%. Em uma modalidade, o sacarídeo capsular Tipo 5 e/ou Tipo 8s são 80 a 100% ou 100% O- acetilados.
[0028] O grau de O-acetilação do polissacarídeo ou oligossacarídeo pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por RMN de próton (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical analysis 30; 1233 a 1247, WO 05/033148 ou WO 00/56357). Um método adicionalmente comumente usado é o descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261.
[0029] Grupos O-acetila podem ser removidos por hidrólise, por exemplo, por tratamento com uma base, tal como hidrazina anidra (Konadu et al 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) ou tratamento com NaOH 0,1 N por 1 a 8 horas. De maneira a manter altos níveis de O-acetilação no polissacarídeo ou oligossacarídeo Tipo 5 e/ou 8, tratamentos que poderiam levar à hidrólise dos grupos O-acetila são minimizados. Por exemplo, tratamento em pHs extremos são minimizados.
[0030] Entre os problemas associados com o uso de polissacarídeos em vacinação está o fato que polissacarídeos per se são fracos imunógenos. Estratégias, que foram designadas para superar esta falta de imunogenicidade, incluem a ligação do polissacarídeo a carreadores de proteína grandes, que fornecem ajudante de célula T espectador. Em uma modalidade, os polissacarídeos utilizados na invenção são ligados a um carreador de proteína que fornecem ajudante de célula T espectador. Exemplos destes carreadores que podem ser usados para acoplar o polissacarídeo ou oligossacarídeo imunógenos incluem os toxoides de difteria e tétano (DT, DT Crm197 e TT), hemocianina de lapa californiana (KLH), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e o derivado de proteína purificado de Tuberculina (PPD), proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer dos anteriores. Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos que englobam epítopos de ajudante T. Em particular, fragmento de proteína D opcionalmente conterá o N-terminal 1/3 da proteína. Proteína D é uma proteína que se liga a IgD de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1).
[0031] Uma nova proteína carreadora que poderia ser particularmente vantajosa para uso no contexto de uma vacina de estafilococos é alfa toxoide de estafilococos. A forma nativa pode ser conjugada a um polissacarídeo, uma vez que o processo de conjugação reduz a toxicidade. Opcionalmente, uma alfa toxina geneticamente detoxificada, tal como os variantes de His35Leu ou His 35 Arg é usada como carreador, uma vez que a toxicidade residual é inferior. Alternativamente, a alfa toxina é quimicamente detoxificada por tratamento com um reagente de reticulação, formaldeído ou glutaraldeído. O processo de conjugação é um tratamento químico alternativo que detoxifica alfa toxina. Uma alfa toxina geneticamente detoxificada é opcionalmente quimicamente detoxificada, opcionalmente por tratamento com um reagente de reticulação, formaldeído ou glutaraldeído para adicionalmente reduzir a toxicidade.
[0032] Os polissacarídeos podem ser ligados à proteína carreadora(s) por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, patente U.S. 4.372.945 por Armor et al., patente U.S. 4.474.757, Anderson et al WO 10/151544, Berti et al WO 11/138636 e Jennings et al., patente U.S. 4.356.170). Opcionalmente, química de conjugação CDAP é realizada (ver WO 95/08348, WO 07/113222).
[0033] Em CDAP, o reagente de cianilação tetrafluorborato de 1- ciano-dimetilaminopiridínio (CDAP) é opcionalmente usado para a síntese de conjugados polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser realizada em condições relativamente brandas, que evita hidrólise dos polissacarídeos sensíveis alcalinos. Esta síntese permite acoplamento direto a uma proteína carreadora.
[0034] O polissacarídeo pode ser solubilizado em água ou uma solução salina. CDAP pode ser dissolvido em acetonitrila e adicionado imediatamente à solução de polissacarídeo. O CDAP reage com os grupos hidroxila do polissacarídeo para formar um éster de cianato. Depois da etapa de ativação, a proteína carreadora é adicionada. Grupos amino de lisina reagem com o polissacarídeo ativado para formar um ligante covalente de isoureia. Depois da reação de acoplamento, um grande excesso de glicina é então adicionado para finalizar grupos funcionais ativados residuais. O produto é então passado através de uma coluna de permeação de gel para remover proteína carreadora não reagida e reagentes residuais.
[0035] Em uma modalidade, o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus e/ou o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus é diretamente conjugado na proteína carreadora. Entretanto, a invenção também engloba conjugados onde os sacarídeos capsulares Tipo 5 e/ou 8 são conjugados através de um ligante, por exemplo, um ligante ADH.
[0036] Em uma modalidade, o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus e/ou o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus é conjugado usando um reagente de cianilação, por exemplo, CDAP. Alternativamente, outros processos de conjugação, tal como química de aminação redutiva ou carbodi- imida (por exemplo, EDAC).
[0037] Em uma modalidade, a razão de polissacarídeo para proteína no sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é entre 1:5 e 5:1 (p/p), 1:1 e 1:5 (p/p), 1:2 e 1:5 (p/p), 1:3 e 1:5 (p/p) 1:2 e 2:1 (p/p) ou 1:1 e 1:2 (p/p). Em uma modalidade, a razão de polissacarídeo para proteína no sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado é entre 1:5 e 5:1 (p/p), 1:1 e 1:5 (p/p), 1:2 e 1:5 (p/p), 1:3 e 1:5 (p/p) 1:2 e 2:1 (p/p) ou 1:1 e 1:2 (p/p).
[0038] Fator de aglutinação A (ClfA) foi identificado como uma proteína que se liga ao fibrinogênio de S. aureus (US6008341) e foi identificado como uma proteína carreadora potencial para polissacarídeos que poderia ser usada para imunizar contra infecção por estafilococos (WO 04/80490). ClfA é uma proteína localizada na superfície e é um importante fator de virulência devido a sua propriedade de ligação ao fibrinogênio e contribuindo com a adesão de S. aureus. ClfA contém uma região de ligação ao fibrinogênio. Esta região, conhecida como o domínio A é localizada em direção ao N-terminal de ClfA e compreende três subdomínios separadamente dobrados conhecidos como N1, N2 e N3. O domínio A é seguido por uma região de repetição serina-aspartato e uma parede celular e região que abrange a membrana que contém o motivo LPXTG para ancoramento promovido por sortase na parede celular. ClfA se liga ao C-terminal da cadeia Y do fibrinogênio e é, assim, capaz de induzir aglutinação das bactérias na solução de fibrinogênio (McDevitt et al (1997) Eur. J. Biochem. 247; 416-424. Resíduos de aminoácido 221-559 de ClfA correspondem à região N2-N3 que retém a ligação ao fibrinogênio. Fragmentos contendo aminoácidos 221-559 de ClfA são fragmentos preferidos. Resíduos de aminoácido 532 a 538 correspondem à região do peptídeo de travamento de ClfA. Cada subdomínio compreende nove fitas β que formam uma dobra tipo IgG inédita. O sítio que se liga ao peptídeo de cadeia Y de fibrinogênio em ClfA é localizado em uma ranhura hidrofóbica na junção entre N2 e N3.
[0039] Recentemente, aminoácidos P336 e Y338 de ClfA foram reconhecidos como sítios de ligação ao fibrinogênio, cuja mutação leva à perda de ligação ao fibrinogênio (Josefsson et al 2008, PLOS A volume 3, Issue 5, página 1-7). SEQ ID NO: 8 a 12, 17 e 18 contêm mutações pontuais nas posições 336 e 338. A perda de ligação ao fibrinogênio nestas variantes leva a uma maior capacidade de proteger contra morte séptica em camundongos imunizados, levando à conclusão que a vacina potencial de ClfA recombinante é melhorada removendo sua capacidade de se ligar ao fibrinogênio (WO 09/95453). Entretanto, variantes com mutações pontuais em somente um de Y256, P336, Y338 ou K389 também perdem sua capacidade de se ligar ao fibrinogênio (Deivanayagam et al EMBO J, 21; 6660 a 6672 (2002)). Espera-se que estas mutações pontuais simples apresentem imunogenicidade similarmente melhorada, assim mutações simples também podem ser usadas na invenção. Em uma modalidade, a composição imunogênica adicionalmente compreende uma proteína ClfA ou fragmento da mesma, opcionalmente recombinante, isolada ou purificada.
[0040] Em uma modalidade, a proteína ClfA é pelo menos 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:3, 4, 5, 6 ou 7 ou 8 a 12 ao longo de todo o comprimento dos mesmos.
[0041] “Identidade”, conforme conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de nucleotídeos, como o caso pode ser, conforme determinado comparando as sequências. Na técnica, “identidade” também significa o grau de parentesco da sequência entre polipeptídeo ou sequências de nucleotídeos, como o caso pode ser, conforme determinado pela combinação entre tiras de tais sequências. “Identidade” pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos incluindo, mas sem limitações, os descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos para determinar a identidade são designados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Além do mais, métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador para determinar identidade entre duas sequências incluem, mas sem limitações, o programa GAP no pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) e FASTA (Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). A família BLAST dos programas é publicamente disponível da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.
[0042] Parâmetros para comparação da sequência de polipeptídeos incluem o seguinte: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915 a 10919 (1992) Penalidade do interstício: 8 Penalidade do comprimento do interstício: 2
[0043] Um programa usado com estes parâmetros é publicamente disponível como o programa de “interstício” da Genetics Computer Group, Madison WI. Os parâmetros mencionados anteriormente são os parâmetros base para comparações do peptídeo (juntamente sem nenhuma penalidade para interstícios finais).
[0044] Parâmetros para comparação de polinucleotídeo incluem o seguinte: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparação: paridades = +10, disparidade = 0 Penalidade do interstício: 50 Penalidade do comprimento do interstício: 3
[0045] Disponível como: O programa de “interstício” da Genetics Computer Group, Madison WI. Estes são os parâmetros para comparações de ácido nucleico.
[0046] Onde uma proteína é especificamente aqui mencionada, ela é opcionalmente uma referência a uma proteína nativa ou recombinante, de comprimento completo ou opcionalmente uma proteína madura em que qualquer sequência de sinais foi removida. A proteína pode ser isolada diretamente da cepa de estafilococos ou produzida por técnicas de DNA recombinante. Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição imunogênica da invenção. Estes são fragmentos compreendendo pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos, pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos, tomados contiguamente da sequência de aminoácidos da proteína. Além do mais, tais fragmentos imunogênicos são tipicamente imunologicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínas estafilocócicas ou com anticorpos gerados por infecção de um hospedeiro mamífero com estafilococos ou contêm epítopos de célula T. Em uma modalidade, fragmentos imunogênicos também incluem fragmentos que, quando administrados em uma dose efetiva, (tanto sozinho quanto como um hapteno ligado a um carreador), obtêm uma resposta imune protetora contra infecção por estafilococos, opcionalmente é protetivo contra infecção por S. aureus e/ou S. epidermidis. Um fragmento imunogênico pode incluir, por exemplo, a proteína que não tem uma sequência líder N-terminal, e/ou um domínio transmembrana e/ou um domínio âncora C-terminal. Para ClfA, fragmentos preferidos não têm o domínio de repetição de SD na direção do C-terminal de ClfA (por exemplo, usando um fragmento em que aminoácidos 555-927, 556-927, 557-927, 558-927, 559-927 ou 560 a 927 são deletados). Para ClfA e alfa toxoide, fragmentos preferidos têm o peptídeo sinal removido para formar a proteína madura, opcionalmente com um resíduo de metionina inicial no N-terminal para permitir expressão recombinante.
[0047] Em uma modalidade, composições imunogênicas da invenção podem conter proteínas ou fragmentos de fusão de ClfA. As proteínas de fusão opcionalmente contêm sequências heterólogas, tal como um fornecedor de epítopos de célula T ou marcas de purificação, por exemplo: β- galactosidase, glutationa-S-transferase, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcas de epítopo, tais como FLAG, myc tag, poli-histidina, ou proteínas da superfície viral, tal como hemaglutinina do vírus influenza ou proteínas bacterianas, tais como toxoide do tétano, toxoide da difteria, CRM197. As proteínas de fusão podem estar presentes na composição imunogênica da invenção como uma proteína livre ou elas podem ser uma proteína carreadora ligada a um sacarídeo.
[0048] Em uma modalidade, a invenção também fornece um fragmento imunogênico da proteína ClfA que é uma porção contígua do polipeptídeo de ClfA que tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade imunogênica como o polipeptídeo compreendendo a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO:3. Isto é, o fragmento (se necessário quando acoplado a um carreador) é capaz de aumentar uma resposta imune que reconhece polipeptídeo de ClfA. Um fragmento imunogênico como este pode incluir, por exemplo, o polipeptídeo de ClfA que não tem uma sequência líder N-terminal e/ou o domínio de repetição SD com direção ao C-terminal de ClfA. Em um aspecto preferido o fragmento imunogênico de ClfA compreende substancialmente toda a ligação ao domínio do fibrinogênio e tem pelo menos 85% de identidade, preferivelmente pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade, acima de tudo preferivelmente pelo menos 97 a 99% de identidade ou 100% de identidade para a sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO:4-12 durante todo o comprimento da dita sequência.
[0049] Fragmentos podem ser “próprios”, ou compreendidos em um polipeptídeo maior do qual eles formam uma parte ou região, acima de tudo preferivelmente como uma única região contínua em um único polipeptídeo maior.
[0050] Adicionalmente fragmentos de ClfA incluem um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3.
[0051] Em uma modalidade, a proteína ClfA é um fragmento de ClfA compreendendo o domínio N1, o domínio N2, o domínio N3, os domínios N1 e N2, os domínios N2 e N3 ou os domínios N1 e N2 e N3. Opcionalmente, o fragmento ClfA compreende os domínios N2 e N3 e tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 6, 7, 11 ou 12.
[0052] Em uma modalidade, a proteína ClfA ou fragmento da mesma contém uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido que reduz ou elimina a capacidade de ClfA de se ligar ao fibrinogênio. Em uma modalidade, a capacidade de ClfA de se ligar ao fibrinogênio é reduzida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99%. Uma mutação como esta é tipicamente na região de ligação ao fibrinogênio no N-terminal de ClfA. A mutação é opcionalmente uma substituição de aminoácido em pelo menos um, dois, três ou quatro dos aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Tyr474, Glu526 ou Val527. Em uma modalidade, aminoácido Pro336 de ClfA é mutado. Em uma modalidade aminoácido Tyr338 de ClfA é mutado. Em uma modalidade, tanto Pro336 quanto Tyr338 são mutados, opcionalmente para Alanina ou Serina. Em uma modalidade, ClfA contém duas mutações com Pro336 mutado para Ser e Tyr 338 mutado para Ala.
[0053] Em uma modalidade, a proteína ou fragmento ClfA está presente na composição imunogênica como uma proteína não conjugada. Alternativamente, ela está presente conjugada ao sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus ou ao sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus. Em tais casos, ClfA pode agir como uma proteína carreadora e um antígeno.
[0054] Em uma modalidade, a proteína ClfA ou fragmento da mesma está presente na composição imunogênica em uma dose de 5 a 50, 10 a 30, 5 a 15 ou 20 a 40 μg.
[0055] Alfa toxina é um importante determinante de virulência produzido pela maioria das cepas de S. aureus. Ela é uma toxina que forma poro com atividade hemolítica. Mostrou-se que anticorpos contra alfa toxina neutralizam os efeitos prejudiciais e letais da alfa toxina em modelos animais (Adlam et al 1977 Infect. Immun. 17; 250). Plaquetas humanas, células endoteliais e células mononucleares são suscetíveis aos efeitos da alfa toxina. De maneira tal que a alfa toxina seja usada em uma composição imunogênica, ela é tipicamente detoxificada por tratamento químico ou mutação para produzir alfa toxoide.
[0056] Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende uma alfa toxoide. Opcionalmente a alfa toxoide tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO:1 ou 2.
[0057] A alta toxicidade da alfa toxina requer que ela seja detoxificada antes de ser usada como um imunógeno. Isto pode ser alcançado por tratamento químico, por exemplo, tratando com formaldeído, glutaraldeído de outros reagentes de reticulação ou quimicamente conjugando aos polissacarídeos bacterianos conforme descrito anteriormente.
[0058] Uma maneira adicionalmente de remover toxicidade é introduzir mutações pontuais que removem a toxicidade, retendo ao mesmo tempo a imunogenicidade da toxina. A introdução de uma mutação pontual no aminoácido 35 da alfa toxina onde um resíduo de histidina é substituído por um resíduo de leucina resulta na remoção da toxicidade, retendo ainda a imunogenicidade (Menzies e Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Histidina 35 parece ser crítica para a oligomerização apropriada requerida para a formação de poro e mutação deste resíduo leva à perda da toxicidade. A modificação da histidina 35 pode ser uma substituição por Lys, Arg, Ala, Leu ou Glu. Mutação pontual de alfa toxina em Asp24, Lys37, His48, Lys58, Asp100, Ile107, Glu111, Met113, Asp127, Asp128, Gly130, Gly134, His144, Lys147, Gln150, Asp152, Phe153, Lys154, Val169, Asn173, Arg200, Asn214, Leu219 ou His259 opcionalmente pode ser usada para reduzir toxicidade.
[0059] Quando incorporada nas composições imunogênicas da invenção, alfa toxoide é opcionalmente detoxificada por mutação de His 35, por exemplo, substituindo His 35 por Leu ou Arg. Em uma modalidade alternativa, alfa toxoide é detoxificada por conjugação a outros componentes da composição imunogênica, por exemplo, a polissacarídeo Tipo 5 de S. aureus e/ou polissacarídeo Tipo 8 de S. aureus. Em uma modalidade, o alfa toxoide é detoxificado tanto pela introdução de uma mutação pontual quanto por conjugação ao polissacarídeo Tipo 5 de S. aureus e/ou polissacarídeo Tipo 8 de S. aureus.
[0060] Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende alfa toxoide que contém uma mutação pontual que diminui toxicidade da alfa toxina, por exemplo, no aminoácido 35. O alfa toxoide opcionalmente contém uma mutação pontual no aminoácido 35 onde histidina é substituído por um aminoácido arginina.
[0061] Em uma modalidade, o alfa toxoide está presente na composição imunogênica como uma proteína não conjugada. Alternativamente, o alfa toxoide é conjugado ao sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus e/ou ao sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus.
[0062] Em uma modalidade, o alfa toxoide está presente na composição imunogênica em uma dose de 5 a 50, 10 a 30, 5 a 15 ou 20 a 40 μg. Em uma modalidade, o ClfA e alfa toxoide estão presentes na mesma dose na composição imunogênica. Em uma modalidade a dose de sacarídeo de Tipo 5 e 8 sacarídeo capsular conjugados é maior que a dose de proteína da ClfA e alfa toxoide.
[0063] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente com um adjuvante para formar uma vacina.
[0064] As vacinas da presente invenção podem ser adjuvadas, particularmente quando destinadas para uso em populações idosas, imunocomprometidas ou cronicamente doentes (tais como diabetes, doença renal em estágio final ou outras populações em alto risco de infecção por estafilococos), mas também para uso em populações infantis. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou alúmen, mas também podem ser outros sais de metal, tais como os de cálcio, magnésio, ferro ou zinco. Emulsões óleo em água, por exemplo, compreendendo óleo metabolizável (por exemplo, esqualeno), agente emulsificante (por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano) e opcionalmente um tocol (por exemplo, alfa tocoferol) também são adequados (WO 09/95453).
[0065] Prefere-se que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo TH1 de resposta. Tais altos níveis de citocinas tipo Th1 tendem a favorecer a indução das respostas imunes mediadas por célula a um dado antígeno, enquanto altos níveis de citocinas tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.
[0066] A distinção da resposta imune tipo Th1 e Th2 não é absoluta. Na realidade, um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Th1 ou predominantemente Th2. Entretanto, é frequentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos da descrita em clones de célula T+ve CD4 murino por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) TH1 e TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, respostas tipo Th1 são associadas com a produção das citocinas INF-y e IL-2 por linfócitos T. Outras citocinas frequentemente diretamente associadas com a indução de respostas imunes tipo Th1 não são produzidas por células T, tal como IL-12. Ao contrário, respostas tipo Th2 são associadas com a secreção de Il-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas de adjuvante adequados que promovem uma resposta predominantemente Th1 incluem: Monofosforil lipídeo A ou um derivado do mesmo (ou lipídeo A detoxificado no geral - ver, por exemplo, WO2005107798), particularmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para sua preparação ver GB 2220211 A); e uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente monofosforil lipídeo A 3-de-O- acilado, junto tanto com um sal de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão óleo em água. Em tais combinações, antígeno e 3D-MPL são contidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo dispensação mais eficiente de sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos mostraram que 3D-MPL é capaz de adicionalmente melhorar a imunogenicidade de um antígeno adsorvido em alúmen [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].
[0067] Um sistema adicional envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL conforme descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é finalizado com colesterol, conforme descrito em WO 96/33739. Uma formulação de adjuvante adicional que envolve QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão óleo em água descrita em WO 95/17210. Em uma modalidade, a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). CpG não metilado contendo oligonucleotídeos (WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (WO0226757 e WO03507822) também são indutores preferenciais de uma resposta de TH1 e são adequados para uso na presente invenção.
[0068] Entretanto, os inventores observaram que em um experimento clínico, a adição de uma emulsão óleo em água adjuvante não produziu um aumento na imunogenicidade. Em vista da maior reatogenicidade, que pode ser associada com o uso de adjuvante, uma modalidade da invenção usa uma composição imunogênica não adjuvada, por exemplo, uma composição imunogênica em que nenhum dos componentes estafilocócicos presentes é adsorvido por um adjuvante ou uma composição imunogênica em que os componentes estafilocócicos não são misturados com uma emulsão óleo em água adjuvante. Os componentes estafilocócicos compreendem 1, 2, 3 ou 4 de um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, um fragmento de ClfA ou fragmento dos mesmos e um alfa toxoide.
[0069] Um aspecto adicional da invenção é uma vacina compreendendo a composição imunogênica descrita anteriormente e um excipiente farmaceuticamente aceitável. As preparações da vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um humano suscetível a infecção por S. aureus, pode meio da administração da dita vacina por meio da via sistêmica ou da mucosa. Estas administrações podem incluir injeção por meio das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por meio da administração mucosal nos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário.
[0070] Preparação da vacina é geralmente descrita em Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação em lipossomas é descrita por Fullerton, patente U.S. 4.235.877.
[0071] As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas. Opcionalmente a solução é liofilizada na presença de um açúcar, tal como sacarose, trealose ou lactose. É típico que elas sejam liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. Liofilização pode resultar em uma composição mais estável (vacina).
[0072] A invenção também engloba o método de preparar as composições e vacinas imunogênicas da invenção. Em uma modalidade, o processo da invenção é um método para preparar uma vacina compreendendo as etapas de a) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, b) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado e c) combinar o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma e um alfa toxoide para formar a composição imunogênica. Em uma modalidade, o processo compreende uma etapa adicional de adicionar um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0073] A invenção também engloba método de tratamento de infecção por estafilococos, particularmente infecções nosocomiais adquiridas em hospital.
[0074] Esta composição imunogênica ou vacina da invenção é particularmente vantajosa para uso em casos de cirurgia eletiva, particularmente quando os indivíduos são imunizados com uma única dose. Tais pacientes saberão a data da cirurgia antecipadamente e podem vantajosamente ser inoculados antes. Em uma modalidade, o indivíduo é imunizado com uma dose única da composição imunogênica da invenção 5 a 60, 6 a 40, 7 a 30 ou 7 a 15 dias antes da admissão no hospital. Em uma modalidade, o indivíduo é imunizado com uma dose única da composição imunogênica da invenção 5 a 60, 6 a 40, 7 a 30 ou 7 a 15 duas antes de um procedimento hospitalar planejado, por exemplo, um procedimento cirúrgico, tal como um procedimento cirúrgico cardiotorácico. Tipicamente, adultos acima de 16 esperando cirurgia eletiva são tratados com as composições e vacinas imunogênicas da invenção. Alternativamente, crianças com 3 a 16 anos esperando cirurgia eletiva são tratados com as composições e vacinas imunogênicas da invenção.
[0075] Também é possível inocular trabalhadores de cuidado da saúde com a vacina da invenção.
[0076] As preparações da vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um humano suscetível à infecção por S. aureus, por meio da administração da dita vacina por meio da via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluir injeção por meio de vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por meio de administração mucosal no trato oral/alimentar, respiratório, genitourinário.
[0077] Uma modalidade da invenção é um método de prevenir ou tratar infecção por estafilococos ou doença compreendendo a etapa de administrar a composição imunogênica ou vacina da invenção a um paciente em necessidade da mesma.
[0078] Uma modalidade adicional da invenção é um uso da composição imunogênica da invenção na fabricação de uma vacina para o tratamento ou prevenção de infecção por estafilococos ou doença, opcionalmente infecção pós cirurgia por estafilococos.
[0079] Os termos “compreendendo”, “compreender” e “compreende” aqui são destinados pelos inventores para ser opcionalmente substituíveis pelos termos “consistindo em”, “consistir em” e “consiste em”, respectivamente, em cada caso. Entretanto, os termos “compreendendo”, “compreender” e “compreende” retêm seu usual significado “em aberto” onde eles não foram substituídos.
[0080] Todas as referências ou pedidos de patente aqui citados nesta especificação de patente estão aqui incorporados pela referência.
[0081] De maneira que esta invenção possa ser mais bem entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são para propósitos de ilustração somente e não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção de nenhuma maneira. Exemplos Exemplo 1 Sequências de proteínas SEQ ID NO:1 MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTG DLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLT YGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKV GWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADN FLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQ LHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO:2 MADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDK NHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDN EVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVS IGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSW NPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITM DRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO:3 MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQS DSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPA QQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELV NQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESA PQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKEL NLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVK ATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYN LSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALI DQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYK VEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMS WDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGS DSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSASDSDSASDSDSASDSDSASD SDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS DSASDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSD SDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSDSDSSSDSDSESDSNSDSESVSNN NVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEANTSLIWGLLASI GSLLLFRRKKENKDKK SEQ ID NO:4 MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGE TSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSS NTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEA TPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVA GTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTF KITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYV NTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYE KYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITF PNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNS NIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:5 MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQS DSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPA QQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELV NQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESA PQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKEL NLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVK ATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYN LSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALI DQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYK VEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMS WDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:6 SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGF SVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDS DGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGS TTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDN VIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPEN FEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDL ALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPIPE SEQ ID NO:7 GTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTF KITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYV NTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYE KYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITF PNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNS NIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:8 MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQS DSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPA QQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELV NQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESA PQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKEL NLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVK ATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYN LSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALI DQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYK VEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMS WDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGS DSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSASDSDSASDSDSASDSDSASD SDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS DSASDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSD SDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSDSDSSSDSDSESDSNSDSESVSNN NVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEANTSLIWGLLASI GSLLLFRRKKENKDKK SEQ ID NO:9 MSENSVTQSDSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGE TSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSS NTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEA TPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVA GTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTF KITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYV NTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYE KYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITF PNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNS NIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:10 MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQS DSASNESKSNDSSSVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPA QQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTTTTNQANTPATTQSSNTNAEELV NQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTSTEATPSNNESA PQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQL TNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKEL NLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVK ATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYN LSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALI DQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYK VEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMS WDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:11 SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGF SVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDS DGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGS TTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDN VIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPEN FEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDL ALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDE PGEIEPIPE SEQ ID NO:12 GTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTF KITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYV NTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLVDYE KYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKP NTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITF PNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNS NIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:13 MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTG DLVTYDKENGMRKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLT YGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKV GWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADN FLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQ LHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO:14 MADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMRKKVFYSFIDDK NHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDN EVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVS IGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSW NPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITM DRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN SEQ ID NO:15 MASLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLN YGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANG VIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLAT GIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNP SGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFV NPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNS KGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPE QPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:16 MAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKG DTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFT DYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLV DYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGN LKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSV NITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYG YNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:17 MASLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLN YGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANG VIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLAT GIGSTTANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNP SGDNVIAPVLTGNLKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFV NPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNS KGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPE QPDEPGEIEPIPE SEQ ID NO:18 MAGTDITNQLTNVTVGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKG DTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAGDQVLANGVIDSDGNVIYTFT DYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTTANKTVLV DYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGN LKPNTDSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSV NITFPNPNQYKVEFNTPDDQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYG YNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGEIEPIPE Exemplo 2 Preparação de componentes da vacina
[0082] Uma vacina de estafilococos de quatro componentes foi preparada que continha polissacarídeo Tipo 5 de S. aureus capsular conjugado a um toxoide do tétano proteína carreadora, polissacarídeo Tipo 8 de S. aureus capsular conjugado a um toxoide do tétano proteína carreadora, um fragmento de ClfA contendo os domínios N2 e N3 e mutações pontuais nos resíduos 336 e 338 em que P336 é alterado para serina e Y338 é alterado para alanina e alfa toxoide que é detoxificado por uma mutação pontual no resíduo 35 com H35 sendo alterado para arginina. Os polissacarídeos capsulares foram conjugados a toxoide do tétano usando CDAP como o agente de acoplamento. Este processo de conjugação é descrito em WO 07/113222.
[0083] Quatro formulações da vacina de estafilococos foram preparadas: 5/10 continha: 5 μg de dose de sacarídeo de Tipo 5 - toxoide do tétano conjugado, 5 μg de dose de sacarídeo de Tipo 8 - toxoide do tétano conjugado, 10 μg de alfa toxoide e 10 μg de ClfA truncado descrito anteriormente.
[0084] 10/30 continha: 10 μg de dose de sacarídeo de Tipo 5 - toxoide do tétano conjugado, 10 μg de dose de sacarídeo de Tipo 8 - toxoide do tétano conjugado, 30 μg de alfa toxoide e 30 μg de ClfA truncado descrito anteriormente.
[0085] 5/10AS continha: 5 μg de dose de sacarídeo de Tipo 5 - toxoide do tétano conjugado, 5 μg de dose de sacarídeo de Tipo 8 - toxoide do tétano conjugado, 10 μg de alfa toxoide e 10 μg de ClfA truncado descrito anteriormente, adjuvado com uma emulsão óleo em água contendo esqualeno, alfa-tocoferol e mono-oleato de polioxietileno sorbitano.
[0086] 10/30AS continha: 10 μg de dose de sacarídeo de Tipo 5 - toxoide do tétano conjugado, 10 μg de dose de sacarídeo de Tipo 8 - toxoide do tétano conjugado, 30 μg de alfa toxoide e 30 μg de ClfA truncado descrito anteriormente, adjuvado com uma emulsão óleo em água contendo esqualeno, alfa-tocoferol e mono-oleato de polioxietileno sorbitano. Exemplo 3 Resultados do experimento clínico usando a vacina de estafilococos de 4 componentes
[0087] Um experimento clínico de fase I foi realizado usando um total de 88 adultos saudáveis de 18 a 40 anos de idade. O grupo de controle continha 30 indivíduos que foram inoculados com salina. Os indivíduos restantes foram divididos em quatro braços com 15/14 indivíduos sendo imunizados com cada das formulações descritas no exemplo 2 (5/10, 5/10AS, 10/30 e 10/30AS). Doses da vacina foram dadas no início do experimento e depois de um mês e em seis meses. Amostras de sangue para análise humoral foram retiradas no dia 0, 7, 14 e 30 depois de cada dose e no dia 360 e 540.
[0088] Detalhes dos indivíduos são fornecidos a seguir. Grupo N Idade média % de fêmeas 5/10 15 31.1 73.3 5/10AS 15 31.9 33.3 10/30 14 30.9 42.9 10/30AS 14 30.6 50 Salina 30 30,1 50
Reatogenicidade e Segurança
[0089] A vacina de estafilococos de 4 componentes foi geralmente segura e bem tolerada. Depois da primeira e segunda doses nenhum efeito adverso sério e nenhuma desordem mediada imune potencial foram observados. A porcentagem de indivíduos que reportam dor, vermelhidão e edema depois da dose 1 e dose 2 é mostrada nas figuras 1-3. Dor foi experimentada no sítio de injeção em 78,6 a 100% dos indivíduos nos grupos de vacina comparado aos 3 a 4% no grupo de controle (ver figura 1). Entretanto, somente um caso foi de grau 3. Resultados para incidência de vermelhidão e edema são mostrados nas figuras 2 e 3. Para ambos os parâmetros, houve uma tendência de uma maior incidência de vermelhidão/edema depois da administração da segunda dose comparada a depois de uma única dose para o braço 10/30 do estudo. Imunogenicidade
[0090] Amostras de sangue retiradas de indivíduos no dia 0 e 7, 14 e 30 dias depois da primeira, segunda terceira imunizações foram testadas por Luminex ou ELISA para estabelecer o nível de IgG produzido contra cada antígeno da vacina de estafilococos de quatro componentes.
[0091] Resultados para imunogenicidade são mostrados nas figuras 48 e nas tabelas 1-5 a seguir.
[0092] Pré-vacinação, houve 83,3 a 100% de soropositividade para todos os ensaios. A despeito dos níveis consideráveis de imunidade de fundo, a vacina de 4 componentes foi capaz de obter uma resposta imune robusta contra todos os 4 componentes.
[0093] Figuras 4-7 mostram que para CPS5, CPS8, alfa toxoide e ClfA, a primeira imunização produziu o maior aumento na imunogenicidade com fortes aumentos de GMC sendo aparentes no dia 14 e 30. A segunda imunização no dia 30 não produziu um aumento adicional na imunogenicidade e níveis de GMC permanecem em um nível similar entre dias 30 e 60. Figura 8 mostra que a terceira imunização depois de 6 meses não provocou um aumento adicional em GMC com níveis de GMC permanecendo aproximadamente o mesmo para os quatro componentes entre dia 30 e dia 540. Uma única imunização, desta forma, é uma forma eficiente de produzir uma resposta imune máxima.
[0094] Os resultados de imunogenicidade para a dosagem 10/30 parecem ser mais fortes que para a dosagem 5/10 com um aumento de aproximadamente 1-5-2 vezes de GMC para CPS5, CPS8 e alfa toxoide. No caso de ClfA o aumento em GMC foi cerca de 3,8 vezes na dose superior. A adição do adjuvante de emulsão óleo em água não aumentou a imunogenicidade da vacina de 4 componentes conforme demonstrado por uma comparação da resposta de anticorpo pelos braços 5/10 e 5/10AS e os braços 10/30 e 10/30AS. Tabela 1 Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos Ab.IgG Staph aureus.CPS 5 (coorte de ATP para imunogenicidade)
Figure img0001
Figure img0002
5/10 = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide 5/10AS = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide adjuvado com AS03B 10/30 = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide 10/30AS = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide adjuvado com AS03B SALINA = agrupamento de SALINA1 e SALINA2 GMC = concentração de anticorpo média geométrica calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/porcentagem de indivíduos com concentração na faixa especificada 95% CI = intervalo de confiança a 95 %; LL = Limite inferior, UL = Limite superior PRE = pré-dose 1 PI(D7) = 7 dias pós-dose 1 PI(D14) = 14 dias pós-dose 1 PI(D30) = 30 dias pós-dose 1 (amostra de sangue retirada nas visitas 5 ou 6) PII(D37) = 7 dias pós-dose 2 PII(D44) = 14 dias pós-dose 2 PII(D60) = 30 dias pós-dose 2 Tabela 2 Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos Staph aureus.CPS 8 Ab.IgG (coorte de ATP para imunogenicidade)
Figure img0003
Figure img0004
5/10 = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide 5/10AS = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide adjuvado com AS03B 10/30 = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide 10/30AS = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide adjuvado com AS03B SALINA = agrupamento de SALINA1 e SALINA2 GMC = concentração de anticorpo média geométrica calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/porcentagem de indivíduos com concentração na faixa especificada 95% CI = intervalo de confiança a 95 %; LL = Limite inferior, UL = Limite superior PRE = pré-dose 1 PI(D7) = 7 dias pós-dose 1 PI(D14) = 14 dias pós-dose 1 PI(D30) = 30 dias pós-dose 1 (amostra de sangue retirada nas visitas 5 ou 6) PII(D37) = 7 dias pós-dose 2 PII(D44) = 14 dias pós-dose 2 PII(D60) = 30 dias pós-dose 2 Tabela 3 Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos Staph aureus alfa-toxina Ab.IgG (coorte de ATP para imunogenicidade)
Figure img0005
5/10 = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide 5/10AS = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide adjuvado com AS03B 10/30 = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide 10/30AS = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide adjuvado com AS03B SALINA = agrupamento de SALINA1 e SALINA2 GMC = concentração de anticorpo média geométrica calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/porcentagem de indivíduos com concentração na faixa especificada 95% CI = intervalo de confiança a 95 %; LL = Limite inferior, UL = Limite superior PRE = pré-dose 1 PI(D7) = 7 dias pós-dose 1 PI(D14) = 14 dias pós-dose 1 PI(D30) = 30 dias pós-dose 1 (amostra de sangue retirada nas visitas 5 ou 6) PII(D37) = 7 dias pós-dose 2 PII(D44) = 14 dias pós-dose 2 PII(D60) = 30 dias pós-dose 2 Tabela 4 Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos Staph aureus ClfA Ab.IgG (coorte de ATP para imunogenicidade)
Figure img0006
Figure img0007
5/10 = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide 5/10AS = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide adjuvado com AS03B 10/30 = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide 10/30AS = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide adjuvado com AS03B SALINA = agrupamento de SALINA1 e SALINA2 GMC = concentração de anticorpo média geométrica calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/porcentagem de indivíduos com concentração na faixa especificada 95% CI = intervalo de confiança a 95 %; LL = Limite inferior, UL = Limite superior PRE = pré-dose 1 PI(D7) = 7 dias pós-dose 1 PI(D14) = 14 dias pós-dose 1 PI(D30) = 30 dias pós-dose 1 (amostra de sangue retirada nas visitas 5 ou 6) PII(D37) = 7 dias pós-dose 2 PII(D44) = 14 dias pós-dose 2 PII(D60) = 30 dias pós-dose 2 Tabela 5 Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos C tetani.Tox Ab.IgG (coorte de ATP para imunogenicidade)
Figure img0008
Figure img0009
5/10 = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide 5/10AS = 5 μg CPS5-TT, 5 μg CPS8-TT, 10 μg ClfA, 10 μg α-toxoide adjuvado com AS03B 10/30 = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide 10/30AS = 10 μg CPS5-TT, 10 μg CPS8-TT, 30 μg ClfA, 30 μg α-toxoide adjuvado com AS03B SALINA = agrupamento de SALINA1 e SALINA2 GMC = concentração de anticorpo média geométrica calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/porcentagem de indivíduos com concentração na faixa especificada 95% CI = intervalo de confiança a 95 %; LL = Limite inferior, UL = Limite superior PRE = pré-dose 1 PI(D7) = 7 dias pós-dose 1 PI(D14) = 14 dias pós-dose 1 PI(D30) = 30 dias pós-dose 1 (amostra de sangue retirada nas visitas 5 ou 6) PII(D37) = 7 dias pós-dose 2 PII(D44) = 14 dias pós-dose 2 PII(D60) = 30 dias pós-dose 2

Claims (13)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende i. um sacarídeo capsular Tipo 5 de Staphylococcus aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 5 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg, ii. um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, em que o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado é administrado a uma dose de sacarídeo de 3 a 50 μg, 5 a 25 μg, 3 a 20 μg, 3 a 12 μg, 5 a 10 μg, 7 a 20 μg, 7 a 15 μg ou 8 a 12 μg; e iii. uma proteína ClfA ou fragmento da mesma, em que a proteína ClfA ou fragmento da mesma possui a sequência de polipeptídeos de qualquer um de SEQ ID NO:3-12 ou 15-18 ao longo do comprimento total da mesma, e iv. um toxoide alfa para uso no tratamento ou prevenção de infecção por Staphylococcus aureus em que um paciente humano é imunizado com uma dose única da composição imunogênica.
2. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus tem um peso molecular de mais de 25 kDa, 40 kDa ou 50 kDa ou entre 25 a 300 kDa, 50 a 250 kDa, 70 a 150 kDa, 25 a 125 kDa, 90 a 125 kDa, 30 a 100 kDa, 35 a 75 kDa ou 40 a 70 kDa.
3. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus tem um peso molecular de mais de 25 kDa, 40 kDa ou 50 kDa ou entre 25 a 300 kDa, 50 a 250 kDa, 70 a 150 kDa, 25 a 125 kDa, 90 a 125 kDa, 30 a 100 kDa, 35 a 75 kDa ou 40 a 70 kDa.
4. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus e/ou o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus é 50 a 100% ou 75 a 100% O-acetilado.
5. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a razão de polissacarídeo para proteína no sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado é entre 1:5 e 5:1 (p/p) ou entre 1:2 e 2:1 (p/p), 1:2 a 1:5 (p/p) ou 1:1 e 1:2 (p/p).
6. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a razão de polissacarídeo para proteína no sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado é entre 1:5 e 5:1 (p/p) ou entre 1:2 e 2:1 (p/p), 1:2 a 1:5 (p/p) ou 1:1 e 1:2 (p/p).
7. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a mesma dose de sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus e sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus está presente na composição imunogênica.
8. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína ClfA ou fragmento da mesma contém uma substituição de aminoácido que reduz a capacidade de ClfA se ligar ao fibrinogênio.
9. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína ClfA ou fragmento da mesma contém uma substituição de aminoácido em pelo menos um dos aminoácidos Ala254, Tyr256, Pro336, Tyr338, Ile387, Lys389, Tyr474, Glu526 ou Val527.
10. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o toxoide alfa possui uma sequência de amino ácido da SEQ ID NO: 1-2.
11. Composição imunogênica para uso no tratamento ou prevenção de infecção por S. aureus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a dose única da composição imunogênica é administrada 5 a 60, 6 a 40, 7 a 30 ou 7 a 15 dias antes de um procedimento hospitalar planejado.
12. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma, em que a proteína ou fragmento da mesma possui a sequência de polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NO: 3-12 ou 15-18 ao longo de todo o comprimento da mesma e um alfa toxoide, em que o alfa toxoide está presente na composição imunogênica em uma dose de 5 a 50 μg, 10 a 30, 5 a 15 ou 20 a 40 μg.
13. Processo para preparar uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, b) conjugar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado a uma proteína carreadora para formar um sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado e c) combinar o sacarídeo capsular Tipo 5 de S. aureus conjugado, o sacarídeo capsular Tipo 8 de S. aureus conjugado, uma proteína ClfA ou fragmento da mesma, em que a proteína ou fragmento da mesma tem a sequência de polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID NO: 3-12 ou 15-18 ao longo de todo o comprimento da mesma e um alfa toxoide para formar uma composição imunogênica.
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