BR112015004816B1

BR112015004816B1 - Cristal de um composto, e, medicamento

Info

Publication number: BR112015004816B1
Application number: BR112015004816-1A
Authority: BR
Inventors: Shoko Yoshida; Yuuichi Sugimoto
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2022-04-26
Also published as: ES2637150T3; US9718831B2; TW201410681A; BR112015004816A2; US20170081336A1; US9540386B2; US20170081334A1; US10023578B2; US9884871B2; IN2015MN00464A; CA2884238C; US9718830B2; JPWO2014038606A1; EP2894156A4; RU2015112098A; KR102217410B1; CN104812757B; WO2014038606A1; KR20150048140A; US20180155356A1

Abstract

CRISTAL DE UM COMPOSTO, E, MEDICAMENTO. Cristais de um composto de dispiropirrolidina ou um sal deste que inibe a aÁo de Mdm2 so fornecidos. A presente invenÁo fornece cristais de (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6- carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"- cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"- diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida ou um sal deste que inibe Mdm2 e tem atividade antitumor. A presente invenÁo tambÈm fornece um medicamento que compreende o mesmo.

Description

Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se aos cristais de um composto de dispiropirrolidina tendo atividade antitumor pela inibição de minuto duplo de murino 2 (Mdm2) ou um sal deste.

Técnica fundamental

[002] O p53 é conhecido como um fator importante para inibição da cancerização das células. O p53 é um fator de transcrição que induz a expressão dos genes envolvidos no ciclo celular e apoptose celular em resposta a várias tensões. O p53 é considerado para inibir a cancerização das células pela função de regulação de transcrição destes. De fato, a anulação ou mutação do gene p53 gene são observadas em torno da metade dos casos de cânceres humanos.

[003] Entretanto, a superexpressão do minuto duplo de murino 2 (Mdm2), um tipo de E3 ubiquitina ligase, é conhecido como um fator para a cancerização das células que são canceradas a despeito da presença de p53 normal. Mdm2 é uma proteína cuja expressão é induzida por p53. Mdm2 regula negativamente p53 pela mediação da degradação de p53 pela ligação ao domínio de atividade de transcrição de p53 para diminuir a atividade de transcrição de p53, exportar p53 fora do núcleo e ainda atua como uma ligase de ubiquitinação de p53. Portanto, é pensado que a inativação das funções de e degradação de p53 são promovidas em células em que Mdm2 é superexpressado, resultando em cancerização (Documento que não de Patente 1). Prestando atenção às funções de Mdm2, muitos métodos foram tentados usando-se substâncias que inibem a expressão de funções de p53 porMdm2, como agentes antitumorais candidatos. Os exemplos dos inibidores de Mdm2 que alvejam o local de ligação de Mdm2-p53 foram relatados, incluindo derivados de espirooxindol (Documentos de Patente 1-15, Documentos que não de Patente 1-3), derivados de indol (Documento da Patente 16), derivados de pirrolidino-2-carboxamida (Documento da Patente 17), derivados de pirrolidinona (Documento da Patente 18) e derivados de isoindolinona (Documento da Patente 19, Documento que não de Patente 4).

Lista de Citação Documentos da Patente

[004] Documento da Patente 1: WO2006/091646

[005] Documento da Patente 2: WO2006/136606

[006] Documento da Patente 3: WO2007/104664

[007] Documento da Patente 4: WO2007/104714

[008] Documento da Patente 5: WO2008/034736

[009] Documento da Patente 6: WO2008/036168

[0010] Documento da Patente 7: WO2008/055812

[0011] Documento da Patente 8: WO2008/141917

[0012] Documento da Patente 9: WO2008/141975

[0013] Documento da Patente 10: WO2009/077357

[0014] Documento da Patente 11: WO2009/080488

[0015] Documento da Patente 12: WO2010/084097

[0016] Documento da Patente 13: WO2010/091979

[0017] Documento da Patente 14: WO2010/094622

[0018] Documento da Patente 15: WO2010/121995

[0019] Documento da Patente 16: WO2008/119741

[0020] Documento da Patente 17: WO2010/031713

[0021] Documento da Patente 18: WO2010/028862

[0022] Documento da Patente 19: WO2006/024837

Documento que não de Patentes

[0023] Documento que não de Patente 1: J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 10130-1013

[0024] Documento que não de Patente 2: J. Med. Chem., 2006, 49, 3432-3435

[0025] Documento que não de Patente 3: J. Med. Chem., 2009, 52, 7970-7973

[0026] Documento que não de Patente 4: J. Med. Chem., 2006, 49, 6209-6221

Sumário da invenção Problema técnico

[0027] Um derivado de dispiropirrolidina exibe atividade de inibição de Mdm2 excelente e deste modo é esperado ser usado como um medicamento, particularmente, como um agente anticâncer. Além disso, é de importância industrialmente significante observar os cristais do derivado.

Solução para o problema

[0028] Os presentes inventores tem estudos extensivos conduzidos para intensificar a utilidade médica de um derivado de dispiropirrolidina que exibe a atividade de inibição de Mdm2 e tem atividade antitumor e para melhorar suas propriedades do estado sólido para este propósito. Como um resultado, os presentes inventores têm observado os cristais de um derivado de dispiropirrolidina representado pela seguinte fórmula (1) ou um sal deste.

[0029] Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao [1] a [14] dado abaixo. [1] Um cristal de (3'R, 4'S, 5'R)-N-[(3R, 6S)-6- carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4, 4-dimetil-2"-oxo-1", 2"-diidrodispiro[cicloexano-1, 2'-pirrolidino-3', 3"- indol]-5'-carboxamida representado pela seguinte fórmula (1) ou um sal deste:

[2] Um cristal de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na figura 1 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Kg"fg"eqdtg"*eqortkogpvq"fg" onda n = 1,54 angstroms). [3] Um cristal de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na figura 2 como um padrão fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq de onda n = 1,54 angstroms). [4] Um cristal de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na figura 3 como um padrão fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg onda n = 1,54 angstroms). [5] Um cristal de um cloridreto de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na fiiwtc 6 eqoq wo rcft«q fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg de cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms). [6] Um cristal de um metanossulfonato de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na fiiwtc 8 eqoq wo rcft«q fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg de cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms). [7] Um cristal de um etanossulfonato de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na fiiwtc 9 eqoq wo rcft«q fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg de cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms). [8] Um cristal de um benzenossulfonato de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na figura 8 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Mg fg eqdtg *eqortkogpvq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [9] Um cristal de um toluenossulfonato de um composto como definido em [1] tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na hkiwtc ; eqoq wo rcft«q fg fihtc>«q fg tciq Z pq r„ qdvifq rqt tcfic>«q Mg de cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms). [10] Um cristal de acordo com [2] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,78, 9,14, 10,06, 10,78, 12,18, 13,42, 14,34, 15,50, 16,62, 17,06, 17,66, 18,18, 18,74, 20,18, 22,46, 24,90, 25,54, 26,94, 27,58 e 28,90 em um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Kg fg eqdtg *eqortiogpvq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [11] Um cristal de acordo com [3] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,62, 13,06, 15,10, 17,22 e 21,98 go wo rcft«q fg fihtc>«q fg tciq Z pq r„ qdvifq rqt tcfic>«q Mg fg eqd re (comprimento de onda n = 1,54 angstroms). [12] Um cristal de acordo com [4] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 9,18, 12,18, 15,58, 16,22, 17,22, 18,42, 18,82 e 19,86 em um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Kg fg eqdtg *eqortiogpvq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [13] Um cristal de acordo com [5] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,46, 7,86, 9,12, 13,00, 14,42, 19,32, 20,34, 20,42 e 21,98 em um padrão de difração de raio X no pó obtido rqt tcfic>«q Mg fg eqdtg *eqortiogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [14] Um cristal de acordo com [6] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,56, 8,26, 14,00, 16,26, 16,78, 17,72, 18,42, 18,62, 20,28 e 23,06 em um padrão de difração de raio X no pó qdvifq rqt tcfic>«q Mg fg eqdtg *eqortiogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [15] Um cristal de acordo com [7] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,28, 7,72, 12,62, 14,06, 15,50, 16,62, 16,96, 19,68, 21,18 e 25,82 em um padrão de difração de raio X no pó qdvifq rqt tcfic>«q Mg fg eqdtg *eqortiogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [16] Um cristal de acordo com [8] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,22, 7,34, 7,90, 12,46, 13,60, 16.22, 15,56, 18,86, 19,04, 19,52, 19,72 e 20,54 em um padrão de difração de tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). [17] Um cristal de acordo com [9] que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,16, 7,18, 7,88, 12,38, 13,50, 13,88, 15,46, 18,46, 19,10, 19,28, 19,66, 20,28, 21,88 e 24,68 em um padrão fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg onda n = 1,54 angstroms). [18] Um medicamento que compreende um cristal de acordo com qualquer um de [1] a [17]. Efeitos vantajosos da invenção

[0030] A presente invenção fornece cristais de (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida ou um sal deste tendo atividade de inibição de Mdm2. Os cristais da presente invenção têm propriedades fisioquímicas excelentes no estado sólido e são úteis como agentes antitumor. Breve descrição dos desenhos

[0031] [Figura 1] A figura 1 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (forma livre) obtida no exemplo 1-1. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0032] [Figura 2] A figura 2 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (forma livre) obtida no exemplo 1-2. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0033] [Figura 3] A figura 3 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (forma livre) obtida no exemplo 1-3. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0034] [Figura 4] A figura 4 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (cloridreto) obtida no exemplo 2. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0035] [Figura 5] A figura 5 mostra um padrão de difração de raio X no pó do composto (sulfato) obtida no exemplo 3. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0036] [Figura 6] A figura 6 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (metanossulfonato) obtida no exemplo 4. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0037] [Figura 7] A figura 7 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (etanossulfonato) obtida no exemplo 5. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0038] [Figura 8] A figura 8 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (benzenossulfonato) obtida no exemplo 6. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0039] [Figura 9] A figura 9 mostra um padrão de difração de raio X no pó do cristal (toluenossulfonato) obtida no exemplo 7. No desenho, o eixo vertical representa intensidade da difração indicada nas unidades de contagens/segundos (cps) e o eixo horizontal representa o ângulo de difração indicados nos valores 2s.

[0040] [Figura 10] A figura 10 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (forma livre) obtidas no exemplo 1-1. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0041] [Figura 11] A figura 11 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (forma livre) obtidas no exemplo 1-2. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0042] [Figura 12] A figura 12 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (cloridreto) obtida no exemplo 2. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0043] [Figura 13] A figura 13 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (metanossulfonato) obtidas no exemplo 4. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0044] [Figura 14] A figura 14 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (etanossulfonato) obtidas no exemplo 5. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0045] [Figura 15] A figura 15 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (benzenossulfonato) obtidas no exemplo 6. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0046] [Figura 16] A figura 16 mostra as isotermias de adsorção- dessorção do cristal (toluenossulfonato) obtida no exemplo 7. No desenho, o eixo vertical representa mudança (%) no peso do composto e o eixo horizontal representa umidade (% de RH).

[0047] [Figura 17] A figura 17 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (forma livre) obtidos no exemplo 1-1. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (fl C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0048] [Figura 18] A figura 18 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (forma livre) obtidos no exemplo 1-2. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0049] [Figura 19] A figura 19 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (forma livre) obtidos no exemplo 1-3. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0050] [Figura 20] A figura 20 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (cloridreto) obtidos no exemplo 2. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0051] [Figura 21] A figura 21 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (metanossulfonato) obtidos no exemplo 4. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0052] [Figura 22] A figura 22 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (etanossulfonato) obtidos no exemplo 5. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0053] [Figura 23] A figura 23 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (benzenossulfonato) obtidos no exemplo 6. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

[0054] [Figura 24] A figura 24 é um diagrama mostrando os dados de análise térmica do cristal (toluenossulfonato) obtidos no exemplo 7. No desenho, o eixo vertical representa a diferença de temperatura (DTA) e mudança de peso (TG) e o eixo horizontal representa a temperatura (° C). A linha sólida descreve uma curva DTA e a linha quebrada descreve uma curva TG.

Descrição das formas de realização

[0055] A presente invenção refere-se aos cristais de (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida representados pela seguinte fórmula (1):

[0056] (em seguida, também referido como composto (1)) ou um sal deste. Neste contexto, os cristais referem-se a um sólido tendo repetições regulares tri-dimensionais de átomos (ou populações destes) constituindo a estrutura interna e são discriminados a partir dos sólidos amorfos, que não tem uma tal estrutura interna regular.

[0057] Exemplos de um sal do composto (1) incluem qualquer um daqueles descritos nos Exemplos. O composto (1) ou o sal destes podem estar presentes em uma forma livre ou solvato. O composto (1) ou o sal destes podem estar presentes em uma forma de hidrato, por exemplo, pela absorção de umidade no ar. O solvato não é particularmente limitado contanto que este é farmaceuticamente aceitável. Os exemplos específicos destes incluem um hidrato, um solvato de etanol e um solvato de 2-propanol.

[0058] Mesmos cristais derivados do mesmo composto podem ser gerados como uma pluralidade dos cristais (polimorfos cristais) diferindo na estrutura interna e propriedades fisicoquímicas dependendo das condições de cristalização. Os cristais da presente invenção podem ser qualquer um destes polimorfos cristalinos ou podem ser uma mistura de dois ou mais polimorfos cristalinos.

[0059] Os cristais da presente invenção podem ter água ligada como um resultado da absorção da mistura quando deixada no ar, ou podem formar um hidrato, por exemplo, pelo aquecimento a 25 a 150° C sob as condições atmosféricas comuns. Além disso, os cristais da presente invenção também podem ter um solvente residual ligado ou conter um solvente usado na cristalização em seu solvato.

[0060] Na presente especificação, os cristais da presente invenção podem ser definidos na base dos dados de difração de raio X no pó. A difração do raio X no pó pode ser realizada pelos métodos de medição e análise usualmente usados na técnica e podem ser realizados, por exemplo, pelo método descrito nos Exemplos. Em geral, os hidratos ou desidratos podem variar em suas constantes de treliça através da adsorção ou dessorção da água cristalina para causar as mudanças no ângulo de difração (2s) na difração do raio X no pó. Também, a intensidade do pico pode ser mudada dependendo, por exemplo, da diferença na face de desenvolvimento do cristal ou outros (habitat do cristal). Consequentemente, no caso onde os cristais da presente invenção são definidos na base dos dados da difração de raio X, cristais que igualam também em termos dos ângulos de difração dos picos na difração de raio X no pó e padrão de difração de raio X nos pós bem como hidratos e desidratos obtidos destes também são incluídos no escopo da presente invenção.

[0061] Em uma forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (forma livre) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 1 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,78, 9,14, 10,06, 10,78, 12,18, 13,42, 14,34, 15,50, 16,62, 17,06, 17,66, 18,18, 18,74, 20,18, 22,46, 24,90, 25,54, 26,94, 27,58 e 28,90 em um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Kg fg eqdtg *eqortkogpvq fg onda n = 1,54 angstroms).

[0062] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (forma livre) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 2 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,62, 13,06, 15,10, 17,22 e 21,98 em um padrão de difração de raio X no pó obtido pot tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms).

[0063] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (forma livre) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 3 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 9,18, 12,18, 15,58, 16,22, 17,22, 18,42, 18,82 e 19,86 em um padrão de dkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg onda n = 1,54 angstroms).

[0064] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (cloridreto) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 4 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,46, 7,86, 9,12, 13,00, 14,42, 19,32, 20,34, 20,42 e 21,98 em um padrão fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg onda n = 1,54 angstroms).

[0065] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (metanossulfonato) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 6 como um padrão de difração de raio X no pó qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 7,56, 8,26, 14,00, 16,26, 16,78, 17,72, 18,42, 18,62, 20,28 e 45.28 go wo rcft«q fg fkhtc>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms).

[0066] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (etanossulfonato) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 7 como um padrão de difração de raio X no pó qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,28, 7,72, 12,62, 14,06, 15,50, 16,62, 16,96,19,68,21,18 e 47.:4 go wo rcft«q fg fkfra>«q fg tckq Z pq r„ qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg cobre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms).

[0067] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (benzenossulfonato) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 8 como um padrão de difração de raio X no pó qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogpVq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,22, 7,34, 7,90, 12,46, 13,60, 14,22, 15,56, 18,86, 19,04, 19,52, 19,72 e 20,54 em um padrão de difração de raio X no pó obtido por tcfkc>«q Mg fg eqdre (comprimento de onda n = 1,54 angstroms).

[0068] Em outra forma de realização preferida, um cristal da presente invenção é um cristal (toluenossulfonato) tendo o padrão de difração de raio X no pó mostrado na Figura 9 como um padrão de difração de raio X no pó obtido por radiação Kg fg eqdtg *eqortkogpvq fg qpfc n = 1,54 angstroms). Também, o cristal é um cristal que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2s = 6,16, 7,18, 7,88, 12,38, 13,50, 13,88, 15,46, 18,46, 19,10, 19,28, 19,66, 20,28, 21,88 e 24,68 em um padrão de difração de raio X no pó qdvkfq rqt tcfkc>«q Mg fg eqdtg *eqortkogntq fg qpfc n = 1,54 angstroms).

[0069] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um medicamento que compreende um cristal da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0070] O medicamento compreende um cristal da presente invenção como um ingrediente ativo é preferivelmente fornecido na forma de uma composição farmacêutica que compreende um cristal da presente invenção e um ou dois ou mais carregadores farmaceuticamente aceitável. O medicamento da presente invenção não é particularmente limitado pela forma de dosagem e pode ser administrado de maneira oral ou parenteral. Preferivelmente, o medicamento da presente invenção é oralmente administrado.

[0071] A composição farmacêutica da presente invenção compreende um cristal da presente invenção como pelo menos uma porção do composto (I). A composição farmacêutica pode conter uma outra forma de cristal do composto (I) que não os cristais da presente invenção. O teor de um cristal da presente invenção em uma composição farmacêutica pode estar na faixa de 0,01 % em peso a 99,9 % em peso com respeito ao composto total (I) em uma composição farmacêutica, por exemplo, 0,01 % em peso ou maior, 0,05 % em peso ou maior, 0,1 % em peso ou maior, 0,5 % em peso ou maior, 1 % em peso ou maior, 2 % em peso ou maior, 3 % em peso ou maior, 4 % em peso ou maior, 5 % em peso ou maior, 10 % em peso ou maior, 20 % em peso ou maior, 30 % em peso ou maior, 40 % em peso ou maior, 50 % em peso ou maior, 60 % em peso ou maior, 70 % em peso ou maior, 80 % em peso ou maior, 90 % em peso ou maior, 95 % em peso ou maior, 96 % em peso ou maior, 97 % em peso ou maior, 98 % em peso ou maior, 99 % em peso ou maior, 99,5 % em peso ou maior, 99,6 % em peso ou maior, 99,7 % em peso ou maior, 99,8 % em peso ou maior ou 99,9 % em peso ou maior. A presença ou ausência de um cristal da presente invenção em uma composição farmacêutica podem ser confirmadas por um método de análise instrumental (por exemplo, difração de raio X no pó, análise térmica, ou espectro de adsorção infravermelha) descritos no presente relatório descritivo.

[0072] Os cristais da presente invenção podem ser usados como um inibidor de Mdm2 e podem ser usados como um medicamento, de maneira particularmente preferível, um agente anti-câncer, que compreende os cristais da presente invenção.

[0073] Em uma forma de realização da presente invenção, um cristal da presente invenção pode ser usado como um inibidor de ligação as a p53- Mdm2 e/ou um inibidor de Mdm2 ubiquitina ligase porque o composto (1) inibe a ligação de p53 com Mdm2 e a ubiquitinação de p53 por Mdm2.

[0074] A condição da ligação de p53-Mdm2 pode ser examinada por um método convencionalmente usado por aqueles habilitados na técnica para examinar as condições de ligação entre as proteínas (por exemplo, técnicas imunológicas, técnicas de ressonância de plasmon de superfície, etc.). Os exemplos dos métodos para examinar a condição de ligação de Mdm2-p53 usando-se uma técnica imunológica incluem um método de imuno- sedimentação e ensaio dessorvente imuno ligado por enzima (ELISA). Um anticorpo usado em tais técnicas imunológicas pode ser um anticorpo anti- Mdm2 e/ou um anticorpo anti-p53 que pode detectar diretamente Mdm2 e/ou p53. Quando Mdm2 e/ou p53 é rotulado com um rótulo (por exemplo, um rótulo GST ou um rótulo de histidina) ou semelhantes, um anticorpo adequado para rotular (por exemplo, um anticorpo anti-GST ou um anticorpo anti-histidina) pode ser usado. Os métodos para examinar uma condição da ligação de Mdm2-p53 usando-se uma técnica imunológica são descritos em, por exemplo, WO2003/51359, WO2003/51360, Publicação do Pedido de Patente U. S. N° 2004/259867 ou 2004/259884 e WO2005/110996. Os métodos para examinar a condição da ligação de Mdm2-p53 usando-se uma técnica de ressonância de plásmon de superfície são descritos em, por exemplo, Science, vol. 303, p. 844-848, 2004.

[0075] A atividade de ubiquitina ligase de Mdm2 contra p53 pode ser examinada por um ensaio de ubiquitina ligase convencionalmente usado por aqueles habilitados na técnica. A atividade de ubiquitina ligase pode ser detectada, por exemplo, pela comparação da ubiquitinação de p53 pela enzima de ativação de ubiquitina (E1), enzima de ligação de ubiquitina (E2) e ubiquitina ligase (E3) (Mdm2) na presença e ausência de um composto de teste (por exemplo, refere-se ao WO2001/75145 e WO2003/76608).

[0076] Em uma outra forma de realização, um cristal da presente invenção pode ser usado como um inibidor e supressão da atividade de transcrição de p53 porque o composto (1) restaura as funções de p53 como um fator de transcrição que é suprimido por Mdm2 pela inibição da ligação de Mdm2 ao domínio de ativação de transcrição de p53. O inibidor de supressão da atividade de transcrição de p53 pode ser obtido, por exemplo, pela medição do nível de mRNA ou o nível de proteína de uma proteína cuja transcrição é regulada por p53 (por exemplo, p21Waf1/Cip1) na presença ou ausência de um composto de teste por um método de medição de mRNA (por exemplo, Northern blot) ou um método de medição de proteína (por exemplo, Western blot) convencionalmente usado por aqueles habilitados na técnica e selecionar o composto de teste como um inibidor de supressão da atividade de transcrição de p53 quando o nível de mRNA ou o nível de proteína é aumentado na presença do composto de teste em comparação com aquele na ausência do composto de teste. Além disso, o inibidor da supressão da atividade de transcrição de p53 também pode ser identificado por um ensaio repórter usando-se a atividade repórter de um gene repórter incluindo um elemento responsivo p53 como um indicador.

[0077] Em uma outra forma de realização, um cristal da presente invenção pode ser usado como um inibidor de degradação de p53 porque o composto (1) inibe a ubiquitinação de p53 por Mdm2 e, desse modo, evita a degradação de p53 em proteassomos. O inibidor de degradação de p53 pode ser obtido por, por exemplo, pela medição do nível de proteína de p53 na presença ou ausência de um composto de teste por um método de medição de proteína (por exemplo, Western blot) convencionalmente usados por aqueles habilitados na técncia e seleção do composto de teste como um inibidor de degradação e seleção do composto de teste como um inibidor de degradação de p53 quando o nível de proteína é aumentado na presença do composto de teste em comparação com aquele na ausência do composto de teste.

[0078] Em uma outra forma de realização, um cristal da presente invenção pode ser usado como um agente antitumor porque o composto (1) normaliza as funções de p53 como um gene que restringe o câncer pela inibição da ligação de Mdm2-p53 e/ou ubiquitinação de p53 por Mdm2.

[0079] A atividade inibidora do desenvolvimento celular pode ser examinada pelos métodos para testar a inibição do desenvolvimento convencionalmente usada por aqueles habilitados na técnica. A atividade de inibição do desenvolvimento celular pode ser determinada, por exemplo, pela comparação dos níveis de desenvolvimento celular (por exemplo, células tumorais) na presença ou ausência de um composto de teste como descrito no seguinte Exemplo teste 2. Os níveis de desenvolvimento celular podem ser examinados usando-se, por exemplo, um sistema de teste para medir as células viventes. Os exemplos do método para medir células viventes incluem o teste de absorção de [3H]-timidina, o método de BrdU, o ensaio de MTT e assim por diante.

[0080] Além disso, a atividade antitumoral in vivo pode ser examinada pelos métodos para testar a atividade antitumoral convencionalmente usada por aqueles habilitados na técnica. A atividade antitumoral in vivo da presente invenção pode ser confirmada, por exemplo, pelo transplante de várias células tumorais a camundongos, ratos ou semelhante; após a confirmação do enxerto das células transplantadas, administrando-se de maneira oral ou intravenosa do composto da presente invenção aos animais; alguns dias ou algumas semanas depois, a comparação do desenvolvimento tumoral em um grupo não administrado com o medicamento com aquele no grupo administrado com composto.

[0081] Um cristal da presente invenção pode ser usado para o tratamento de tumores ou cânceres, por exemplo, câncer de pulmão, câncer do sistema digestivo, câncer de ovário, câncer uterino, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer na região de cabeça/pescoço, câncer sanguíneo, câncer renal, câncer de pele (melanoma maligno, etc.), retinoblastoma, tumores testiculares e sarcoma, mais preferivelmente, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, leucemia mielóide aguda, linfoma maligno, melanoma maligno, retinoblastoma, neuroblastoma e sarcoma. Entretanto, a presente invenção não é limitada a estes cânceres.

[0082] Um medicamento da presente invenção pode conter um cristal da presente invenção e um carregador farmaceuticamente aceitável e pode ser administrado como várias injeções, tais como injeção intravenosa, injeção intramuscular e injeção subcutânea ou por vários métodos, tais como administração oral ou administração percutânea. O carregador farmaceuticamente aceitável significa um material farmacologicamente aceitável (por exemplo, um excipiente, um diluente, um aditivo, um solvente, etc.) que está envolvido no transporte da composição contendo um cristal da presente invenção para um dado órgão a um outro órgão.

[0083] Uma formulação pode ser preparada pela seleção de uma forma de formulação adequada (por exemplo, formulação oral ou injeção) dependendo do método de administração e usando-se vários métodos convencionalmente usados para a preparação da formulação. Os exemplos de formulações orais incluem tabletes, pós, grânulos, cápsulas, pílulas, losangos, soluções, xaropes, elixires, emulsões, suspensões aquosas ou oleosas e assim por diante. Na administração oral, o composto livre ou uma forma de sal pode ser usada. uma formulação aquosa pode ser preparada pela formação de um aduto ácido com um ácido farmacologicamente aceitável ou pela formação de um sal de metal alcalino, tal como sódio. Como uma injeção, um estabilizante, um preservante, um auxiliar de dissolução e outros podem ser usados na formulação. Após o enchimento de uma solução que pode conter estes auxiliares e outros em um recipiente, uma formulação para o uso pode ser preparada como uma formulação sólida por liofilização ou semelhante. Além disso, uma dose pode ser enchida em um recipiente ou duas ou mais doses podem ser enchidas em um recipiente.

[0084] Os exemplos de formulações sólidas incluem tabletes, pós, grânulos, cápsulas, pílulas e losangos. Estas formulações sólidas podem conter aditivos farmaceuticamente aceitáveis junto com um cristal da presente invenção. Os exemplos de aditivos incluem enchedores, extensores, aglutinantes, agentes desintegrantes, agentes de promoção de dissolução, agentes umectantes da pele e lubrificantes e estes podem ser selecionados e misturados quando requerido para preparar uma formulação.

[0085] Os exemplos de formulações líquidas incluem soluções, xaropes, elixires, emulsões e suspensões. Estas formulações líquidas podem conter aditivos farmaceuticamente aceitáveis junto com um cristal da presente invenção. Os exemplos de aditivos incluem agentes de suspensão e emulsificadores e estes são selecionados e misturados como requerido para a preparação da formulação.

[0086] Um cristal da presente invenção pode ser usado no tratamento contra o câncer de mamíferos, em particular, seres humanos. A dose e o intervalo de administração pode ser adequadamente selecionada dependendo do local da doença, a altura do paciente, peso corporal, sexo ou histórico médico, de acordo com um julgamento médico. Quando o composto da presente invenção é administrado a um ser humano, a faixa de dose é de aproximadamente 0,01 a 500 mg/kg de peso corporal por dia, preferivelmente, aproximadamente de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal. Preferivelmente, o composto da presente invenção é administrado ao ser humano uma vez ao dia ou a dose é dividida de duas a quatro vezes e a administração é repetida em um intervalor apropriado. Além disso, a dose diária pode exceder a dose mencionada acima em um critério médico, se necessário.

[0087] Um cristal da presente invenção pode ser usado em combinação com um agente antitumor adicional. Os exemplos destes incluem antibióticos antitumor, constituintes vegetais antitumor, BRMs (modificadores de resposta biológica), hormônios, vitaminas, anticorpos antitumor, medicamentos alvos moleculares e outros agentes antitumor.

[0088] Mais especificamente, os exemplos de agentes alquilantes incluem: agentes alquilantes, tais como nitrogênio mostarda, N-óxido de nitrogênio mostarda e clorambucil; agentes alquilantes de aziridina, tais como carboquona e tiotepa; os agentes alquilantes de epóxido, tais como dibromomanitol e dibromodulcitol; agentes alquilantes de nitrosouréia, tais como carmustina, lomustina, semustina, cloridreto de nimustina, estreptozocina, clorozotocina e ranimustina e busulfan, tosilato de improssulfan e dacarbazina.

[0089] Os exemplos de vários antagonistas metabólicos incluem: antagonistas metabólicos de purina, tais como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina e tioinosina; antagonistas metabólicos de pirimidina, tais como fluorouracila, tegafur, tegafur-uracil, carmofur, doxifluridina, broxuridina, citarabina e enocitabina e antagonistas metabólicos de ácido fólico, tais como metotrexato e trimetrexato.

[0090] Os exemplos de antibióticos antitumores incluem: antibióticos de antraciclina antitumor, tais como mitomicina C, bleomicina, peplomicina, daunorubicina, aclarubicina, doxorrubicina, pirarubicina, THP-adriamicina, 4'-epidoxorrubicina e epirrubicina e cromomicina A3 e actinomicina D.

[0091] Os exemplos de constituintes vegetais antitumor incluem: vinca alcalóides, tais como vindesina, vincristina e vinblastina; taxanos, tais como paclitaxel e docetaxel e epipodofilotoxinas, tais como etoposídeo e teniposídeos.

[0092] Os exemplos de BRMs incluem fatores de necrose de tumor e indometacina.

[0093] Os exemplos de hormônios incluem hidrocortisona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, prasterona, betametasona, triamcinolona, oximetolona, nandrolona, metenolona, fosfestrol, etinilestradiol, clormadinona e medroxiprogesterona.

[0094] Os exemplos de vitaminas incluem vitamina C e vitamina A.

[0095] Os exemplos de antibióticos antitumor e medicamentos alvo moleculares incluem trastuzumab, rituximab, cetuximab, nimotuzumab, denosumab, bevacizumab, infliximab, imatinib mesilato, gefitinib, erlotinib, sunitinib, lapatinib e sorafenib.

[0096] Os exemplos de outros agentes antitumor incluem cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, tamoxifeno, camptotecina, ifosfamida, ciclofosfamida, melfalan, L-asparaginase, aceglatone, sizofiran, picibanil, procarbazina, pipobroman, neocarzinoestatina, hidroxiuréia, ubenimex e crestina.

[0097] A presente invenção também inclui um método para prevenir e/ou tratar o câncer, que compreende administrar um cristal da presente invenção.

[0098] O material de partida (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6- carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)- 4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"- indol]-5'-carboxamida ou um sal deste for os cristais da presente invenção podem ser produzidos, por exemplo, de acordo com os Exemplos mencionados abaixo.

[0099] A medição da difração de raio X no pó foi realizada no Exemplo 1 em um comprimento de onda Cu K de n = 1,54 angstroms por um método de transmissão usando-se D8 Discover com GADDS CST (Bruker Axs K.K.) (voltagem de tubo: 40 kV, corrente de tubo: 40 mA, faixa de varredura: 2 a 40, taxa de varredura: 20fl/min). A medição da difração de raio X no pó foi realizada nos outros Exemplos em um comprimento de onda Cu K de n = 1,54 angstroms usando-se um mecanismo de difração de raio X no pó tipo reflexão (RINT-TTR III, fabricado por Rigaku Corp.) e um suporte de amostra isento de reflexão para amostras (voltagem de tubo: 50 kV, corrente de tubo: 300 mA, faixa de varredura: 2 a 40fl, taxa de varredura: 20fl/min, largura da amostragem: 0,02fl, velocidade rotacional: 120 rpm).

[00100] Os mecanismos de medição de adsorção e dessorção usados foram TA instruments SGA-CX (Exemplos 2, 6 e 7) and TA instruments VTI-SA (Exemplos 1, 4 e 5) (temperatura: 25fl C, umidade: 40, 60, 70, 80, 90, 80, 70, 60, 40, 20, 10, 20, 40, 60, 70 % de RH).

[00101] A análise térmica (TG/DTA) utilizou TG/DTA6200 fabricado por SII Nanotechnology Inc. (taxa de aumento de temperatura: 10° C/minuto, gás ambiente: nitrogênio, taxa de fluxo de gás nitrogênio: 200 mL/minuto). Exemplos Exemplo 1

[00102] (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]- 6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"- diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida

[00103] O composto (35 mg, 0,24 mmol) obtido na etapa 3 do exemplo de referência 2, trietilamina (0,04 ml, 0,30 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (27 mg, 0,20 mmol) e cloridreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (46 mg, 0,24 mmol) foram adicionados a uma solução de N,N- dimetilformamida (4 ml) do composto (100 mg, 0,20 mmol) obtido na etapa 3 do exemplo de referência 1 e a mistura resultante foi agitada a 50° C por 1 hora. Após esfriamento, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila, lavada com água, solução de bicarbonato de sódio saturado e salmoura nesta ordem e então secada em sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, então o resíduo foi purificado pela cromatografia de coluna em gel de sílica-NH [clorofórmio:metanol = 50:1 (v/v)] e o produto purificado obtido foi dissolvido em metanol (10 ml) e agitado a 60° C por 24 horas. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar 94 mg (76 %) do composto do título como um sólido.

[00104] RMN1H (400 MHz, CDCl3) f: 0,68 (3H, s), 0,95 (3H, s), 1,111,27 (2H, m), 1,35-1,81 (8H, m), 2,10-2,17 (1H, m), 2,25-2,32 (1H, m), 3,15 (1H, t, J=10,5 Hz), 3,27 (1H, br s), 3,80 (1H, dd, J=11,0, 2,3 Hz), 3,85-3,95 (1H, m), 4,13 (1H, ddd, J=10,8, 4,5, 1,3 Hz), 4,44 (1H, d, J=9,2 Hz), 4,64 (1H, d, J=9,2 Hz), 5,46 (1H, d, J=3,7 Hz), 6,49 (1H, d, J=3,7 Hz), 6,74 (1H, d, J=1,8 Hz), 7,07 (1H, dd, J=8,2, 1,8 Hz), 7,31 (1H, dd, J=8,2, 2,3 Hz), 7,487,52 (2H, m), 7,62 (1H, s), 8,05 (1H, d, J=5,5 Hz). MS (ESI) m/z: 618 (M+H)+.

Exemplo 1-1

[00105] Uma mistura de tricloroetileno/etanol (95/5) (4,75 ml) foi adicionada ao composto (302 mg, 0,49 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi aquecida em aproximadamente 50° C por dissolução. A mistura de reação foi deixada repousar em temperatura ambiente para precipitar um cristal. O cristal precipitado foi coletado por filtração e secado em temperatura ambiente para dar um cristal. O cristal foi submetido à medição da difração de raio X no pó, análise de termogravimetria simultânea ou térmica diferencial (TG/DTA) e comportamentos de adsorção e dessorção.

[00106] Alternativamente, o cristal também pode ser obtido usando formato de etila e acetonitrila.

[00107] O padrão de difração de raio X no pó é mostrado na Figura 1, as isotermias de adsorção-dessorção são mostradas na Figura 10 e os dados de análise térmica (TG/DTA) são mostrados na Figura 17. [Tabela 1] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 22 ou mais)

Exemplo 1-2

[00108] O metanol (3,6 ml) foi adicionado ao composto (301 mg, 0,49 mmol) obtido no exemplo 1 e então a mistura resultante foi aquecida em aproximadamente 50° C por dissolução. A mistura de reação foi deixada repousar em temperatura ambiente para precipitar um cristal. O cristal precipitado foi coletado por filtração e secado em temperatura ambiente para dar um cristal. O cristal foi submetido à medição da difração de raio X no pó, TG/DTA e comportamentos de adsorção e dessorção.

[00109] Alternativamente, o cristal também pode ser obtido usando 2- butanona.

[00110] O padrão de difração de raio X no pó é mostrado na Figura 2, as isotermias de adsorção-dessorção são mostradas na Figura 11 e os dados de análise térmica (TG/DTA) são mostrados na Figura 18. [Tabela 2] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 14 ou mais)

Exemplo 1-3

[00111] O tricloroetileno (1,5 ml) foi adicionado ao composto (100 mg, 0,16 mmol) obtido no exemplo 1 e então a mistura resultante foi aquecida em aproximadamente 50° C por dissolução. A mistura de reação foi deixada repousar em temperatura ambiente para precipitar um cristal. O cristal precipitado foi coletado por filtração e secado em temperatura ambiente para dar um cristal. O cristal foi submetido à medição da difração de raio X no pó e TG/DTA.

[00112] O padrão de difração de raio X no pó é mostrado na Figura 3 e os dados de análise térmica (TG/DTA) são mostrados na Figura 19. [Tabela 3] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 44 ou mais)

Exemplo 2

[00113] Um cristal de cloridreto de (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6- carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)- 4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"- indol]-5'-carboxamida água/solvato de 2-propanol (IPA)

[00114] O ácido clorídrico concentrado (0,026 ml, 0,31 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-propanol (2,0 ml) do composto (192 mg, 0,31 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 18 horas. O precipitado foi coletado por filtração para dar 173 mg (85 %) do cristal do título. RMN1H (500 MHz, DMSO-d6) f: 0,62 (3H, s), 0,92 (3H, s), 1,09-1,58 (6H, m), 1,65-2,07 (5H, m), 2,53-2,94 (1H, m), 3,29-3,73 (5H, m), 4,56-4,76 (1H, m), 4,85-5,23 (1H, m), 6,80 (1H, s), 7,01-7,13 (2H, m), 7,14-7,20 (1H, m), 7,49-7,74 (2H, m), 8,19-8,42 (1H, m), 8,61-9,08 (1H, m), 10,41 (1H, br s), 11,25 (1H, br s).

[00115] Análise calculada para C30H34CI2FN5O4 • HCl • 0,75H2O • IPA: C, 54,48; H, 6,03; N, 9,63. Observado: C. 54,47; H, 6,14; N, 9,65.

[00116] O padrão de difração de raio X no pó do cristal do título é mostrado na Figura 4, as isotermias de adsorção-dessorção destes são mostradas na Figura 12 e os dados de análise térmica (TG/DTA) destes são mostrados na Figura 20. [Tabela 4] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 15 ou mais)

Exemplo 3

[00117] Sulfato de (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H- piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"- diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida água/solvato de 2-propanol (IPA)

[00118] O ácido sulfúrico concentrado (0,005 ml, 0,08 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-propanol (0,5 ml) do composto (52 mg, 0,08 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 2 dias. O precipitado foi coletado por filtração para dar 20 mg (34 %) do composto do título como um sólido.

[00119] RMN1H (500 MHz, DMSO-d6) f: 0,62 (3H, s), 0,92 (3H, s), 1,13-1,61 (6H, m), 1,67-2,09 (5H, m), 2,45-2,88 (1H, m), 3,47-4,01 (5H, m), 4,58-4,77 (1H, m), 4,83-5,11 (1H, m), 6,79 (1H, s), 6,98-7,25 (3H, m), 7,51-7,73 (2H, m), 8,20-8,41 (1H, m), 8,51-8,73 (1H, m), 8,79-9,05 (1H, m), 10,35 (1H, br s), 11,18 (1H, br s).

[00120] Análise calculada para C30H34CI2FN5O4 -1I2SO.I -0,25H2O -IPA: C, 49,94; H, 5,71; N, 8,82. Observado: C. 49,74; H, 5,71; N, 8,85.

[00121] O padrão de difração de raio X no pó do composto do título é mostrado na Figura 5.

Exemplo 4

[00122] Cristal hidratado de metanossulfonato de (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida

[00123] O ácido metanossulfônico (0,026 ml, 0,39 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-propanol (3 ml) do composto (221 mg, 0,36 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. O precipitado foi coletado por filtração para dar 48 mg (19 %) do cristal do título.

[00124] RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) f: 0,62 (3H, s), 0,92 (3H, s), 1,03-2,01 (11H, m), 2,30 (3H, s), 2,47-2,56 (1H, m), 3,72-3,65 (4H, m), 4,624,75 (1H, m), 5,95-5,09 (1H, m), 6,73-6,85 (1H, m), 7,04-7,20 (3H, m), 7,547,73 (2H, m), 8,23-8,36 (1H, m), 8,60-8,75 (1H, m), 8,83-8,98 (1H, m), 10,83 (1H, br s), 11,22 (1H, br s).

[00125] Análise calculada para C30H34CI2FN5O4 • CH3SO3H • 2H2O: C. 49,60; H, 5,64; N, 9,33. Observado: C. 49,63; H, 5,45; N, 9,30.

[00126] O padrão de difração de raio X no pó do cristal do título é mostrado na Figura 6, as isotermias de adsorção-dessorção destes são mostradas na Figura 13 e os dados de análise térmica (TG/DTA) destes são mostrados na Figura 21. [Tabela 5] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 31 ou mais)

Exemplo 5

[00127] Cristal hidratado de etanossulfonato de (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida

[00128] O ácido etanossulfônico (0,032 ml, 0,39 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-propanol (3 ml) do composto (221 mg, 0,36 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 23 horas. O precipitado foi coletado por filtração para dar 128 mg (49 %) do cristal do título.

[00129] RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) f: 0,62 (3H, s), 0,92 (3H, s), 1,05 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,09-1,59 (6H, m), 1,62-2,06 (5H, m), 2,38 (2H, q, J=7,4 Hz), 2,59-3,07 (1H, m), 3,27-3,79 (5H, m), 4,53-4,76 (1H, m), 4,78-5,16 (1H, m), 6,79 (1H, s), 7,00-7,23 (3H, m), 7,51-7,75 (2H, m), 8,21-8,41 (1H, m), 8,48-9,07 (1H, m), 10,35 (1H, br s), 11,19 (1H, br s).

[00130] Análise calculada para C30H34CI2FN5O4 H22H5SO3H MH2O: C. 48,00; H, 6,04; N, 8,75, Observado: C. 47,97; H, 5,93; N, 8,56.

[00131] O padrão de difração de raio X no pó do cristal do título é mostrado na Figura 7, as isotermias de adsorção-dessorção destes são mostradas na Figura 14 e os dados de análise térmica (TG/DTA) destes são mostrados na Figura 22. [Tabela 6] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 23 ou mais)

Exemplo 6

[00132] Cristal hidratado de benzenossulfonato de (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida

[00133] O monoidrato do ácido benzenossulfônico (30 mg, 0,17 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-propanol (1 ml) do composto (104 mg, 0,17 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas. O precipitado foi coletado por filtração para dar 116 mg (89 %) do cristal do título.

[00134] Análise calculada para C30H34CI2FN5O4 • C6H5SO3H • 1,5HiO: C. 53,80; H, 5,39; N, 8,71, Observado: C. 53,89; H, 5,40; N, 8,80.

[00135] O padrão de difração de raio X no pó do cristal do título é mostrado na Figura 8, as isotermias de adsorção-dessorção destes são mostradas na Figura 15 e os dados de análise térmica (TG/DTA) destes são mostrados na Figura 23. [Tabela 7] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 16 ou mais)

Exemplo 7

[00136] Cristal hidratado de p-toluenossulfonato (3'R,4'S,5'R)-N- [(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro-2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3- fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'- pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida

[00137] Uma solução de acetonitrila (4 ml) de monoidrato do ácido p- toluenossulfônico (85 mg, 0,45 mmol) foi adicionada a uma suspensão de acetonitrila (4 ml) do composto (300 mg, 0,50 mmol) obtida no exemplo 1 e então a mistura resultante foi aquecida em aproximadamente 50° C por dissolução. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 dia. O precipitado foi coletado por filtração para dar 255 mg (66 %) do cristal do título.

[00138] Análise calculada para C30H34Q2FN5O4 H26H4CH3SO3H -1,5H2O: C. 54,34; H, 5,55; N, 8,56, Observado: C. 54,06; H, 5,45; N, 8,50.

[00139] O padrão de difração de raio X no pó do cristal do título é mostrado na Figura 9, as isotermias de adsorção-dessorção destes são mostradas na Figura 16 e os dados de análise térmica (TG/DTA) destes são mostrados na Figura 24. [Tabela 8] Pico de padrão de difração de raio X no pó (intesidade relativa de 17 ou mais)

Exemplo de referÍncia 1

[Etapa 1] (3E/Z)-6-cloro-3-[(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)metileno]-1,3-diidro- 2H-indol-2-ona

[00140] N,N-Diisopropiletilamina (0,46 ml, 2,63 mmol) foi adicionada a uma solução de metanol (130 ml) de 6-cloro-1,3-diidro-2H-indol-2-ona (2,20 g, 13,11 mmol) e 2-cloro-3-fluoroisônicootinaldeído (2,20 g, 13,8 mmol) e a mistura resultante foi aquecida em refluxo por 16 horas. Após esfriamento, o precipitado foi coletado por filtração, lavado com metanol gelado e secado para dar 3,37 g (83 %) do composto do título como um sólido.

[00141] MS (APCI) m/z: 309 (M+H)+. [Etapa 2] (3'S,4'R,7'S,8'S,8a'R)-6"-cloro-8'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4- dimetil-3',4'-difenil-3',4',8',8a'-tetraidro-1'H-dispiro[cicloexano-1,6'- pirrolo[2,1-c][1,4]oxazina-7',3"-indol]-1',2"(1"H)-diona

[00142] Um complexo do éter dietílico-trifluoreto de boro (0,15 ml, 1,20 mmol) e peneiras moleculares 4A (pó) (3 g) foram adicionados a uma solução de tetraidrofurano (30 ml) do composto (1,86 g, 6,00 mmol) obtido na etapa 1, (5R,6S)-5,6-difenilmorfolin-2-ona (1,67 g, 6,60 mmol) e 4,4- dimetilcicloexanona (0,83 g, 6,60 mmol) sob atmosfera de nitrogênio e a mistura resultante foi agitada sob aquecimento a 70° C por 7 dias. Após esfriamento, o material insolúvel foi removido por filtração através de celite e o filtrado foi lavado com salmoura e então secado em sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado pela cromatografia de coluna em gel de sílica [n-hexano:acetato de etila = 4:1 1:1 (v/v)] para dar 3,39 g (84 %) do composto do título como um sólido.

[00143] RMN-1H (400 MHz, CDCl3) f: 0,21 (3H, s), 0,53 (3H, s), 0,89-1,08 (3H, m), 1,28-1,43 (3H, m), 1,73-1,81 (1H, m), 2,23-2,33 (1H, m), 4,58 (1H, d, J=11,0 Hz), 4,86 (1H, d, J=3,2 Hz), 5,31 (1H, d, J=11,0 Hz), 6,25 (1H, d, J=8,3 Hz), 6,67 (1H, dd, J=8,3, 1,8 Hz), 6,72-6,77 (2H, m), 6,93 (1H, d, J=1,8 Hz), 7,04-7,17 (6H, m), 7,18-7,25 (3H, m), 7,79 (1H, t, J=4,6 Hz), 7,99 (1H, s), 8,29 (1H, d, J=5,0 Hz).

[00144] MS (APCI) m/z: 670 (M+H)+. [Etapa 3] Ácido (4'S,5'R)-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4- dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"-indol]-5'- carboxílico

[00145] O composto (630 mg, 0,94 mmol) obtido na etapa 2 foi dissolvido em acetonitrila (10 ml) e água (4 ml), carbonato de potássio (130 mg, 0,94 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi aquecida em refluxo a 85fl C por 16 horas. Após esfriamento, sulfato de magnésio anidro (113 mg, 0,94 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 15 minutos. Após extração com acetato de etila, a camada orgânica foi lavada com salmoura e secada em sulfato de magnésio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar ácido (4'S,5'R)-6"-cloro- 4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-1'-[(1R,2S)-2-hidróxi-1,2-difeniletil]-4,4- dimetil-2"-oxo-1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"-indol]-5'- carboxílico (650 mg, 100 %) como um sólido [MS (ESI) m/z: 688 (M+H)+]. O ácido carboxílico (650 mg, 0,94 mmol) obtido foi dissolvido em metanol (30 ml) e água (8 ml), nitrato de diamônio cério (IV) (1,55 g, 2,82 mmol) foi adicionado sob esfriamento em gelo e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 30 minutos. O carbonato de potássio (780 mg, 5,64 mmol) foi adicionado sob esfriamento em gelo e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. O material insolúvel foi removido por filtração através de celite, então o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e água foi adicionada ao resíduo obtido, seguido pela extração com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salmoura e secada em sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo obtido foi purificado pela cromatografia de coluna em gel de sílica [clorofórmio:metanol = 20:1 4:1 (v/v)] para dar 152 mg (33 %) do composto do título como um sólido.

[00146] RMN-1H (500 MHz, CD3OD) f: 0,74 (3H, s), 0,9 (3H, s), 1,29-1,44 (2H, m), 1,48-1,58 (2H, m), 1,64-1,76 (1H, m), 1,94-2,02 (1H, m), 2,11 (1H, ddd, J=14,0, 14,0, 4,0 Hz), 2,43-2,53 (1H, m), 5,07 (1H, d, J=10,3 Hz), 5,32 (1H, d, J=10,3 Hz), 6,84 (1H, d, J=1,7 Hz), 7,16 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz), 7,63 (1H, dd, J=8,0, 2,3 Hz), 7,75 (1H, t, J=5,2 Hz), 8,15 (1H, d, J=5,2 Hz).

[00147] MS (ESI) m/z: 492 (M+H)+. Exemplo de referência 2

[Etapa 1] Ácido 2,6-anidro-3,4,5-tridesóxi-5-(dibenzilamino)-L-eritro- hexônico

[00148] O 2,6-anidro-3,4,5-tridesóxi-5-(dibenzilamino)-L-eritro- hexonato de metila 2,6-anidro-3,4,5-tridesóxi-5-(dibenzilamino)-L-eritro- hexonato de metila (1,60 g, 4,70 mmol) foi dissolvido em metanol (30 ml), 1N da solução de hidróxido de sódio (10 ml) foi gradualmente adicionado sob esfriamento em gelo e então a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 3 horas. Dowex 50W-X8 foi adicionado a uma mistura de reação para ajustar seu pH a 5 a 6, o material insolúvel foi removido por filtração e então um filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar 1,7 g (100 %) do composto do título como um sólido.

[00149] RMN-1H (400 MHz, CDCl3) f: 1,18-1,26 (1H, m), 1,36-1,48 (1H, m), 1,79-1,97 (2H, m), 2,62 (1H, t, J=11,0 Hz), 3,18 (1H, t, J=10,4 Hz), 3,40 (1H, d, J=11,5 Hz), 3,51-3,61 (4H, m), 3,90-3,99 (1H, m), 7,12-7,38 (10H, m).

[00150] MS (ESI) m/z: 326 (M+H)+. [Etapa 2] (2S,5R)-5-(dibenzilamino)tetraidro-2H-piran-2-carboxamida

[00151] O composto (870 mg, 2,67 mmol) obtido na etapa 1 acima foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (30 ml), 1-hidroxibenzotriazol (361 mg, 2,67 mmol) e cloridreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (614 mg, 3,20 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 15 minutos. O cloreto de amônia (285 mg, 5,44 mmol) e N,N-diisopropiletilamina (l,86 ml, 10,7 mmol) foram adicionados e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 8 horas. A mistura de reação foi diluída com acetato de etila e a camada orgânica foi lavada com solução de bicarbonato de sódio saturado e salmoura nesta ordem e secada em sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para dar 495 mg (57 %) do composto do título como um sólido.

[00152] RMN-1H (400 MHz, CDCl3) f: 1,35-1,45 (1H, m), 1,60-1,70 (1H, m), 2,10-2,18 (1H, m), 2,21-2,28 (1H, m), 2,76 (1H, tt, J=11,4, 4,0 Hz), 3,44 (1H, t, J=10,9 Hz), 3,67 (4H, q, J=14,2 Hz), 3,71-3,73 (1H, m), 4,04 (1H, dq, J=11,0, 2,1 Hz), 5,35 (1H, s), 6,40 (1H, s), 7,21-7,36 (10H, m).

[00153] MS (ESI) m/z: 325 (M+H)+. [Etapa 3] (2S,5R)-5-aminotetraidro-2H-piran-2-carboxamida

[00154] O composto (490 mg, 1,51 mmol) obtido na etapa 2 acima foi dissolvido em etanol (10 ml), 20 % de hidróxido de paládio (100 mg) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas sob uma atmosfera de hidrogênio. O catalisador foi removido por filtração através de celite, então o solvente no filtrado foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi secado para dar 215 mg (99 %) do composto do título como um sólido.

[00155] RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6) f: 1,11-1,22 (1H, m), 1,25 1,35 (1H, m), 1,83-1,91 (2H, m), 2,51-2,60 (1H, m), 2,90 (1H, t, J=10,5 Hz), 3,52 (1H, d, J=11,9 Hz), 3,78-3,84 (1H, m), 6,99 (1H, br s), 7,09 (1H, br s).

[00156] MS (ESI) m/z: 145 (M+H)+. (Exemplo teste 1 Ensaio de ligação Mdm2/p53)

[00157] Uma diluição de proteína contendo 6,25 nM cada um de His- p53 (proteína de fusão de uma proteína parcial p53 tendo aminoácidos p53 nas posições 1 a 132, com uma proteína de histidina) e proteínas GST-Mdm2 (proteína de fusão de uma proteína parcial Mdm2, tendo aminoácidos Mdm2 nas posições 25 a 108 com resíduo de leucina 33 substituído pelo ácido glutâmico, com glutationa transferase) foi preparada usando uma solução de tampão de proteína (20 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1 % de BSA). Esta diluição de proteína foi adicionada em uma quantidade de 8 oL/reservatório a uma placa de 384 reservatórios (NBC de volume baixo de 384 reservatórios, Corning Inc., catálogo N°: 3676).

[00158] A seguir, um composto testado foi diluído com DMSO para produzir a solução de tampão de proteína contendo 10 % de diluição e esta solução de tampão foi adicionada em uma quantidade de 4 oL/reservatório à placa.

[00159] Subsequentemente, uma solução contendo um anticorpo anti- His rotulado por XL665 (anticorpo anti-6HIS HTRF monoclonal rotulado com XL665 (catálogo N°.: 61HISXLB), Schering/Cisbio Bioassays) e um anticorpo anti-GST rotulado por európio (Eu) (anticorpo anti-GST HTRF monoclonal rotulado com criptato de európio, Schering/Cisbio Bioassays, catálogo N°.: 61GSTKLB) nas concentrações de 2,5 og/mL e 0,325 og/mL, respectivamente, foi preparada usando uma solução de tampão de diluição de anticorpo (20 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1 % de BSA, 0,5 M de KF). Estas diluições foram adicionadas em uma quantidade de 8 oL/reservatório (volume da solução de reação total: 20 ol/reservatório). Então, a placa foi deixada a 25fl C por 1 hora.

[00160] A fluorescência resolvida por tempo em 620 e 665 nm foi medida em um comprimento de onda de excitação de 320 nm usando-se um leitor de placa (ARVOsx, PerkinElmer Co., Ltd. ou PHERAstar, BMG LABTECH). A razão (R) foi calculada usando-se o valor de medição ds (RFU 620 nm e RFU 665 nm) de acordo com a seguinte fórmula:

[00161] R = (RFU 665 nm-BI-C^RFU 620 nm)/RFU 620 nm

[00162] BI: valor de medição d em 665 nm de solução de reação (apenas cada solução de tampão) são suplementada com cada proteína, o composto e os anticorpos

[00163] C (fator de correção) = (A-BI)/D

[00164] A e D: cada valor de medição d em 665 nm e 620 nm de solução de reação suplementado com apenas solução de anticorpo anti-GST rotulada por Eu.

[00165] O valor R calculado a partir do reservatório complementado com His-p53, GST-Mdm2, o composto de teste e cada anticorpo foi definido como R (amostra). O valor R calculado a partir do reservatório suplementado por His-p53, GST-Mdm2 e cada anticorpos mas sem o composto de teste foi definido como R (controle). O valor R calculado a partir do reservatório suplementado com GST-Mdm2, o composto de teste e cada anticorpo mas sem His-p53 foi definido como R (base). T/C foi calculado a partir da fórmula mostrada abaixo. Um valor IC50 para a ligação de Mdm2/p53 foi calculada pelo ajuste sigmóide. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[00166] T/C = (R (amostra)-R (base))/(R (controle)-R (base))

[00167] O composto (1) apresentou um valor de IC50 de 0,1 oM ou inferior.

(Teste do exemplo 2 Ensaio de inibição do desenvolvimento celular)

[00168] A ensaio de inibição do desenvolvimento celular foi conduzida usando-se a linha celular derivada de câncer pulmonar humano NCI-H460 tendo p53 do tipo selvagem.

[00169] As células NCI-H460 foram colocadas em suspensão em um meio (meio RPMI1640 contendo soro fetal bovino a 10 %) e a suspensão foi inoculada em uma quantidade de 500 células/150 oL/reservatório a uma placa de reservatório múltiplo de 96 reservatórios. Um composto de teste foi dissolvido em DMSO e esta solução foi diluída com meio para preparar uma solução de amostra (concentração de DMSO: 1 % ou inferior). No dia seguinte da inoculação, o meio não suplementado com o composto de teste ou a solução da amostra foi adicionada em uma quantidade de 50 oL/reservatório. O ensaio de MTT foi conduzido imediatamente após o meio ser adicionado em uma quantidade de 50 oL no dia seguinte da inoculação celular e após a solução da amostra ou o meio foi adicionado às células seguido pela cultura a 37fl C por 3 dias em uma atmosfera de CO2 a 5 %. O ensaio de MTT foi conduzido como mostrado abaixo.

[00170] Uma solução de 5 mg/mL de MTT (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, Sigma-Aldrich Co., M-2128) foi preparada usando-se uma solução de tampão de fosfato (salmoura tamponada por fosfato Dulbecco's). Esta solução MTT foi adicionada em uma quantidade de 20 oL/reservatório. Então, a placa foi cultivada a 37fl C por 4 horas em uma atmosfera de CO2 a 5 %. A placa foi centrifugada a 1200 rpm por 5 minutos e então um sobrenadante de cultura foi removido por aspiração usando-se um dispensador. O DMSO foi adicionado em uma quantidade de 150 oL/reservatório para dissolver o formazan gerado. A placa foi agitada usando-se um misturador de placa para o desenvolvimento de cor uniforme de cada reservatório. A absorbância de cada reservatório foi medida sob condições de OD 540 nm e referência 660 nm usando-se um leitor de placa (SpectraMax PLUS384, Molecular Devices, CA, USA).

[00171] O valor OD medido no dia de adicionar a solução da amostra foi definido como S. O valor OD medido três dias após a adição da solução da amostra foi definido como T. O valor OD medido três dias após a adição da diluição de DMSO foi definido como C. T/C (%) foi determinado em cada concentração de acordo com a fórmula de cálculo mostrada abaixo para preparar uma curva de resposta de dose, a partir da qual a concentração de inibição de desenvolvimento de 50 % (valor GI50) foi calculado.

[00172] T/C (%) = (T-S)/(C-S>100

[00173] O composto (1) apresentou um efeito de inibição do desenvolvimento celular de GI50 (oM) < 0,1.

(Exemplo de preparação 1) <Cápsula>

[00174] 5 g de um cristal obtido nos Exemplos, 115 g de lactose, 58 g de amido de milho e 2 g de estearato de magnésio podem ser misturados usando um misturador V e então enchidos em uma quantidade de 180 mg/casca em cascas de cápsula N° 3 para dar cápsulas.

(Exemplo de preparação 2) <Tablete>

[00175] 5 g de um cristal obtido nos Exemplos, 90 g de lactose, 34 g de amido de milho, 20 g de celulose cristalina e 1 g de estearato de magnésio podem ser misturados usando um misturador V e então comprimidos em uma máquina tabletadora em uma massa de 150 mg/tablete para dar tabletes.

(Exemplo de preparação 3) <Suspensão>

[00176] A metilcelulose é dispersada e dissolvida na água purificada para preparar um meio de dispersão. Um cristal obtido nos Exemplos é pesado em um mortar. O meio de dispersão é adicionado em porções menores ao cristal enquanto a mistura é bem misturada. A água purificada é adicionada para preparar 100 g da suspensão.

Claims

1. Cristal de (3'R,4'S,5'R)-N-[(3R,6S)-6-carbamoiltetraidro- 2H-piran-3-il]-6"-cloro-4'-(2-cloro-3-fluoropiridin-4-il)-4,4-dimetil-2"-oxo- 1",2"-diidrodispiro[cicloexano-1,2'-pirrolidino-3',3"-indol]-5'-carboxamida, caracterizado pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula (1) ou um sal deste:

tendo um padrão de difração de raio X como mostrado na Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 6, Figura 7, Figura 8 ou Figura 9 como um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

2. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 7,78, 9,14, 10,06, 10,78, 12,18, 13,42, 14,34, 15,50, 16,62, 17,06, 17,66, 18,18, 18,74, 20,18, 22,46, 24,90, 25,54, 26,94, 27,58 e 28,90 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

3. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 7,62, 13,06, 15,10, 17,22 e 21,98 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

4. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 9,18, 12,18, 15,58, 16,22, 17,22, 18,42, 18,82 e 19,86 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

5. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 6,46, 7,86, 9,12, 13,00, 14,42, 19,32, 20,34, 20,42 e 21,98 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

6. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 7,56, 8,26, 14,00, 16,26, 16,78, 17,72, 18,42, 18,62, 20,28 e 23,06 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

7. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 6,28, 7,72, 12,62, 14,06, 15,50, 16,62, 16,96, 19,68, 21,18 e 25,82 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

8. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 6,22, 7,34, 7,90, 12,46, 13,60, 14,22, 15,56, 18,86, 19,04, 19,52, 19,72 e 20,54 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

9. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta picos característicos em ângulos de difração 2θ = 6,16, 7,18, 7,88, 12,38, 13,50, 13,88, 15,46, 18,46, 19,10, 19,28, 19,66, 20,28, 21,88 e 24,68 em um padrão de difração de raio X de pó obtido por radiação Ka de cobre (comprimento de onda X = 1,54 angstroms).

10. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cristal é o cloridreto água/solvato de 2-propanol de um composto como definido na fórmula (1).

11. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cristal é o hidrato de metanossulfonato de um composto conforme definido na fórmula (1).

12. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cristal é o hidrato de etanossulfonato de um composto conforme definido na fórmula (1).

13. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cristal é o hidrato de benzenossulfonato de um composto conforme definido na fórmula (1).

14. Cristal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cristal é o hidrato de p-toluenossulfonato de um composto como definido na fórmula (1).

15. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende um cristal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14.