BR112014025070B1

BR112014025070B1 - Método para aumentar a resistência de uma planta contra elevada concentração de sal, e método para produzir uma planta apresentando resistência aumentada contra elevada concentração de sal quando comparada com uma planta do tipo selvagem

Info

Publication number: BR112014025070B1
Application number: BR112014025070-7A
Authority: BR
Inventors: Satoshi Kondo; Chikara Ohto; Kenichi Ogawa; Kenji Henmi
Original assignee: Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2022-02-01
Also published as: AU2013250334A1; US20150059020A1; CN104220594B; AU2013250334B2; BR112014025070A2; WO2013157580A1; CN104220594A; US9803213B2; JP5799345B2; JP2013220078A

Abstract

MÉTODO PARA CONFERIR RESISTÊNCIA AO PRESSÃO AMBIENTAL PARA PLANTAS. A resistência à pressão ambiental é conferida a uma planta ou a resistência à pressão ambiental de uma planta é melhorada. A resistência à pressão ambiental é conferida a uma planta ao alterar o nível de expressão do gene de tirosina fosfatase (At1g71860).

Description

DESCRIÇÃOCAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método para conferirresistência ao pressão ambiental para plantas mediante a alteração do nível de expressão de um gene predeterminado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A possibilidade de crescimento das plantas depende de fatores ambientais diferentes, tais como a temperatura, a umidade e a concentrações de sais no solo. Em alguns casos, um ambiente caracterizado por tais fatores é apropriado para uma determinada planta, mas não para outras plantas. Em geral, os fatores acima que devem influenciar o crescimento de planta são indicados como pressão ambiental. Os casos em que uma determinada planta não pode crescer ou então pode crescer, mas com dificuldade, em um ambiente caracterizado por determinada pressão ambiental são explicados pela observação que a planta carece de resistência à pressão ambiental. Por outro lado, a capacidade de uma planta de crescer em um ambiente caracterizado por determinada pressão ambiental é explicada ao observar que tal planta tem resistência à pressão ambiental.

[003] Se a resistência à pressão ambiental puder ser conferida auma planta, torna-se possível expandir a área em que a planta pode ser cultivada, permitindo o uso eficaz de um espaço de solo limitado. Em particular, uma cultura energética, tal como a cana-de-açúcar, é usada como matéria-prima para o biocombustível. Portanto, é desejá- vel que tal cultura energética tenha resistência a vários tipos de pressão ambiental. Isso quer dizer que se a resistência à pressão ambiental pode ser conferida a tal cultura energética, e a cultura energética pode ser cultivada em uma área em que, de outro modo, ela não poderia ser cultivada devido aos fatores ambientais acima descritos.

[004] Como uma técnica para conferir resistência à pressão ambiental às plantas, por exemplo, o Documento de Patente 1 descreve um método conhecido para a superexpressão do gene de tirosina fos- fatase (PTP) de Arabidopsis thaliana (At3g44620). De acordo com o Documento de Patente 1, a resistência à estiagem pode ser conferida às plantas ao causar a superexpressão do gene de PTP. Além disso, o Documento que não da Patente 1 descreve que a expressão do gene de tirosina fosfatase derivado de Arabidopsis thaliana (At1g71860) é induzida pelo tratamento com alto teor de sal.

DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIORDOCUMENTO DE PATENTE

[005] Documento de Patente 1: WO2009-132057

DOCUMENTO DE NÃO PATENTE

[006] Documento que não da Patente 1: Xu Q, Fu HH, Gupta R,Luan S. Molecular characterization of tirosina-specific protein fosfatase encoded by a stress-responsive gene in Arabidopsis. Plant Cell. 1998 may; 10 (5):849-57.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOPROBLEMA A SER RESOLVIDO PELA INVENÇÃO

[007] No entanto, de modo geral, mesmo quando é conhecido ofato de que um determinado gene é expresso especificamente a um nível elevado sob condições que correspondem a um pressão ambiental, não pode ser dito que uma planta modificada para poder expressar o gene a um nível elevado pode sempre adquirir resistência à pressão ambiental. Portanto, é completamente desconhecido como o gene de tirosina fosfatase derivado de Arabidopsis thaliana (At1g71860) é envolvido na resistência à pressão ambiental das plantas, ou se o gene não é envolvido na mesma.

[008] Portanto, tendo em vista as circunstâncias acima, o objetivoda presente invenção consiste em apresentar uma técnica para conferir resistência ao pressão ambiental a plantas ou melhorar a resistência das plantas à pressão ambiental.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

[009] Em consequência de estudos intensivos para atingir o objetivo acima, os autores da presente invenção chegaram a um novo co-nhecimento que a resistência à pressão ambiental pode ser conferida a uma planta ao alterar o nível de expressão do gene da tirosina fosfa- tase (At1g71860), e desse modo eles completaram a presente invenção.

[0010] Especificamente, as plantas de acordo com a presente invenção são produzidas mediante a alteração do nível de expressão do gene At1g71860 ou de um gene funcionalmente equivalente ao mesmo.

[0011] Além disso, o método para conferir resistência à pressãoambiental a plantas da presente invenção compreende a alteração do nível de expressão do gene At1g71860 ou de um gene funcionalmente equivalente ao mesmo. O método para a produção de plantas da presente invenção compreende as etapas de: preparação das plantas ao alterar o nível de expressão do gene At1g71860 ou de um gene funcionalmente equivalente ao mesmo; a avaliação da resistência das plantas à pressão ambiental e a seleção de uma linhagem com resistência à pressão ambiental significativamente incrementada.

[0012] Em particular, o gene At1g71860 acima e um gene funcionalmente equivalentes ao mesmo são de preferência genes que codificam qualquer uma das seguintes proteínas (a) a (c): (1) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID N°: 2;(2) uma proteína que compreende uma sequência de ami- noácidos que tem uma deleção, uma substituição, uma adição ou uma inserção de um ou de uma pluralidade de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 e tem a atividade de tirosina fosfatase; e(3) uma proteína que é codificada por uma hibridização de polinucleotídeos sob condições estritas para um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID N°: 1 e tem a atividade de tirosina fosfatase.

[0013] Os exemplos de plantas a ser submetidas à presente invenção incluem as dicotiledôneas, tais como as plantas da família Brassicaceae. Os exemplos de plantas da família Brassicaceae incluem a Arabidopsis thaliana e a colza. Outros exemplos de plantas a ser submetidas à presente invenção incluem as monocotiledôneas, tais como as plantas da família Gramineae. Os exemplos de plantas da família Gramineae incluem o arroz e a cana-de-açúcar.

[0014] Além disso, a expressão "alteração do nível de expressãode um gene" na presente invenção refere-se tanto ao aumento quanto à diminuição do nível de expressão de um gene, independente do grau de aumento ou de diminuição.

[0015] Esta descrição inclui parte ou todo o conteúdo tal como indicado na descrição e/ou nos desenhos do Pedido de patente Japonesa n° 2012-094931, que é um documento de prioridade do presente pedido de patente.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[0016] A planta da presente invenção tem uma resistência à pressão ambiental, tal como o stress ao sal, incrementada de maneira sig- nificativa se comparada com plantas do tipo selvagem. Além disso, o método para conferir resistência à pressão ambiental da presente invenção pode incrementar de maneira significativa a resistência de uma planta-alvo à pressão ambiental, se comparada com plantas do tipo selvagem. Além disso, de acordo com o método para a produção de plantas da presente invenção, podem ser produzidas plantas que têm uma resistência à pressão ambiental incrementada de maneira significativa se comparadas com plantas do tipo selvagem. Portanto, através do pedido de depósito de patente da presente invenção, por exemplo, as condições de cultivo de plantas podem ser bastante relaxadas, uma quantidade de produção pode ser melhorada quando a própria planta é um produto, e a redução de custos pode ser obtida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra as posições dos iniciadores projetados para confirmação da posição de inserção do T-DNA no mutante atptp1-1 e no mutante atptp1-2.

[0018] A Figura 2 é uma imagem eletroforética que mostra fragmentos amplificados por PCR.

[0019] A Figura 3 é um diagrama característico que mostra os resultados do cálculo dos níveis de expressão relativos do geneAt1g71860 medido por PCR em tempo real.

[0020] A Figura 4 apresenta fotografias que mostram o mutanteCol, atptp1-1 e o mutante atptp1-2 semeados em um meios 1/2 MS (0mM de NaCl) e então cultivados por 21 dias.

[0021] A Figura 5 apresenta fotografias que mostram Col, o mutante atptp1-1 e o mutante atptp1-2 semeados em um meio 1/2 MS (125 mM de NaCl) e então cultivados por 21 dias.

[0022] A Figura 6 apresenta fotografias que mostram Col, o mutante atptp1-1 e o mutante atptp1-2 semeados em um meio 1/2 MS (NaCl 137.5 mM) e então cultivados por 21 dias.

[0023] A Figura 7 é um diagrama característico que mostra os resultados do cálculo dos níveis de expressão relativos do gene At1g71860 e de um gene At1g71860 mutado nas plantas de superex- pressão produzidas no exemplo 2, tal como medido por PCR em tempo real.

[0024] A Figura 8 apresenta fotografias que mostram cada plantade superexpressão (produzidas no Exemplo 2) e Col semeados em um meio 1/2 MS (0 mM, 125 mM ou 137,5 mM de NaCl) e então cultivadas por 21 dias.

MODOS PARA PRATICAR A INVENÇÃO

[0025] Daqui por diante, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0026] A planta da presente invenção é produzida pela modificação do nível de expressão de um gene de tirosina fosfatase específico e, desse modo, exibe uma resistência à pressão ambiental mais signi-ficativamente incrementada do que a planta do tipo selvagem. O termo "pressão ambiental" aqui utilizado refere-se ao pressão ao sal, pressão a altas temperaturas, pressão à estiagem, e algo do gênero. Particularmente de preferência, o tipo de resistência à pressão ambiental a ser conferido à planta da presente invenção é a resistência à pressão ao sal. Isto é, de preferência, a planta da presente invenção exibe uma resistência à pressão ao sal maior do que a planta do tipo selvagem. A melhoria da resistência à pressão ambiental, tal como a resistência ao stress ao sal, indica que uma planta pode crescer sob condições às quais a pressão ambiental foi aplicada, tornando impossível ou difícil para que a planta do tipo selvagem cresça.

[0027] A expressão "alteração do nível de expressão de um genede tirosina fosfatase" na presente invenção refere-se tanto ao aumento quanto à diminuição do nível de expressão do gene. O nível de expressão de um gene de tirosina fosfatase pode ser alterado ao realizar várias modificações, tal como descrito em detalhes a seguir. A expressão "aumento ou diminuição do nível de expressão de um gene de ti- rosina fosfatase" pode se referir a um aumento ou a uma diminuição estatisticamente significativa no nível de expressão do gene em uma planta modificada, se comparada com o mesmo em uma planta não modificada (por exemplo, uma planta do tipo selvagem). Tal como descrito acima, a expressão pode se referir a um aumento ou a uma diminuição estatisticamente significativa no nível de expressão do gene, independente da quantidade de aumento ou de diminuição.

[0028] Além disso, a expressão "diminuição do nível de expressãode um gene de tirosina fosfatase" na presente invenção é sinônimo da supressão de um gene de tirosina fosfatase de uma planta. A supressão do gene de tirosina fosfatase causa uma diminuição ou perda da atividade de tirosina fosfatase específica em uma planta-alvo. A expressão "suprimindo (ou supressão de) um gene" refere-se a: deleção do gene do cromossomo; diminuição do nível de expressão do gene, com a degradação do produto da transcrição do gene; diminuição da quantidade do gene traduzido; e degradação ou supressão do produto da expressão (proteína) do gene, por exemplo. Em outras palavras, a expressão "suprimir um gene de tirosina fosfatase específico" refere-se à introdução de uma mutação do tipo mutante de perda de função em um gene de tirosina fosfatase. Mais especificamente, os exemplos de uma técnica para suprimir um gene incluem, a saber, um método de transposon, um método de transgene, um silenciamento gênico pós- transcricional, um método de RNAi, um método de decaimento mediado por mutações sem senso (NMD), um método de ribozimas, um método de mutações antissenso, um método de miRNA (micro-RNA), um método de siRNA (RNA interferente pequeno) e um método de anticorpos.

[0029] Por exemplo, a expressão "deletando (deleção de) um gene de tirosina fosfatase do cromossomo" refere-se, mas sem ficar a ela particularmente limitado, à deleção da região de controle de expressão e/ou da região de codificação do gene relevante do cromossomo. Os métodos para a deleção de um gene de tirosina fosfatase do cromossomo não são particularmente limitados, e a deleção pode ser executada adequadamente de acordo com um método-padrão.

[0030] Além disso, o siRNA, que suprime um gene de tirosina fos-fatase é o mRNA (isto é, o mRNA que é codificado pelo gene) que cor-responde ao gene de tirosina fosfatase ou o RNA de duplo filamento pequeno que contém uma sequência complementar ao mRNA encaixado seletivo, sendo que o mRNA ou seu mRNA do tipo encaixado seletivo é processado seletivamente através da formação de um complexo de RNA-nuclease (complexo de silenciamento induzido por RNA ou RISC).

[0031] Além disso, o siRNA pode ser induzido a partir de seu precursor, o RNA de grampo pequeno (shRNA), por meio de processamento por uma enzima que é a RNase intracelular. O shRNA é um RNA de duplo filamento que tem um laço entre a sequência de filamento de sentido do siRNA e a sequência de filamento antissenso, e contém de preferência uma saliência que consiste em 1 a 6, e de preferência 2 a 4 poliUs na extremidade 3’. O shRNA é processado no siRNA por uma enzima que pertence à família da RNaseIII, o siRNA de um só filamento é formado e então o seu RNA de filamento de sentido forma um complexo (RISC) com a RNaseH, de modo a clivar o mRNA alvo que tem uma sequência complementar à sequência do siRNA, suprimindo desse modo a expressão do gene. Quando o siRNA que corresponde a um gene de tirosina fosfatase é introduzido em uma planta-alvo, a injeção direta do siRNA ou o uso de um vetor capaz de expressar o siRNA é preferido.

[0032] Especificamente, pode ser usado um vetor de expressão que contém uma sequência de DNA que codifica o siRNA acima ou seu precursor sob a regulação de um promotor. Um exemplo de vetor de expressão é um vetor do tipo grampo. Este vetor contém o RNA do tipo grampo que codifica o DNA em que a sequência do RNA de filamento de sentido acima e a sequência de RNA de filamento antissen- so acima são ligadas covalentemente através de uma sequência de laço de um só filamento. Aqui, o DNA é um vetor por meio do qual o RNA do tipo grampo é formado por transcrição intracelular, e então é processado por uma enzima para formar o siRNA acima. Quatro (4) ou 5 sequências de poliT, cada uma das quais consiste de 1 a 6, de preferência 1 a 5 Ts, são ligadas à extremidade 3’ do siRNA que codifica o DNA do tipo grampo, como sequências de sinal de parada de transcrição ou para saliência. É desejável que o shRNA como um precursor de siRNA que é transcrito do DNA vetor tenha uma saliência que consista de 2 a 4 Us na extremidade 3' de seu filamento antissenso. Devido à presença da saliência, o RNA de filamento de sentido e o RNA de filamento antissenso podem ter uma estabilidade intensificada contra a degradação pela nuclease. Uma enzima endógena desempenha um papel na conversão do dsRNA de cadeia longa e no micro RNA precursor (miRNA) no siRNA e no miRNA maduro, respectivamente.

[0033] De modo geral, um vetor de plasmídio pode conter, além deuma sequência de DNA que codifica o siRNA acima e um promotor, um gene de resistência a fármacos (por exemplo, um gene de resistência à neomicina, um gene de resistência à ampicillina, um gene de resistência à puromicina e um gene de resistência à higromicina), uma sequência de parada de transcrição, um único sítio de restrição ou múltiplos sítios de clonagem, uma origem de replicação, e algo do gênero.

[0034] Além disso, um ácido nucleico de antissenso que suprimeum gene de tirosina fosfatase é o RNA ou o DNA que contém uma se- quência de mRNA que corresponde ao gene de tirosina fosfatase ou uma sequência complementar a uma sequência parcial da mesma. A sequência parcial acima pode compreender uma sequência de carca de 30 ou mais, 50 ou mais, 70 ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais ou 250 ou mais nucleotídeos contínuos a menos do que o comprimento total do gene de tirosina fosfatase ou sua sequência de mRNA do mesmo.

[0035] Os exemplos de nucleotídeos de um ácido nucleico antis-senso incluem, além dos nucleotídeos naturais, os nucleotídeos modificados que têm halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo) ou um grupo tal como um grupo metila, carbóxi metila ou tio. O ácido nucleico de antis- senso pode ser sintetizado ao usar uma técnica de síntese de DNA/RNA conhecida ou uma técnica de recombinação de DNA conhecida. Quando um ácido nucleico de antissenso é sintetizado por uma técnica de recombinação de DNA, uma reação em cadeia de po- limerase (PCR) é realizada ao utilizar o DNA de vetor que contém a sequência de nucleotídeos de um gene de tirosina fosfatase como molde e iniciadores que flanqueiam uma sequência a ser amplificada, de modo a amplificar a sequência-alvo. A clonagem em um vetor é realizada tal como necessário, de modo que o DNA antissenso possa ser gerado. Alternativamente, o DNA que tem, desse modo, a sequência-alvo amplificada é introduzido em um vetor, e o vetor é introduzido em células eucarióticas ou procarióticas, e desse modo o RNA antis- senso pode ser obtido ao utilizar o sistema da transcrição do mesmo.

[0036] A transcrição ou a tradução do ácido nucleico antissenso dapresente invenção podem ser inibidas ou suprimidas por meio de sua ligação a um gene de tirosina fosfatase ou mRNA correspondente, independente do DNA ou o RNA. O seu ácido nucleico de antissenso também pode ser inserido em uma planta-alvo ao fazer com que um vetor apropriado carregue o ácido nucleico de antissenso de uma ma- neira similar àquela do siRNA acima.

[0037] Além disso, uma ribozima que suprime um gene de tirosinafosfatase é o RNA que tem a atividade catalítica e a atividade de clivagem de mRNA que correspondem ao gene de tirosina fosfatase alvo. Esta clivagem inibe ou suprime a expressão do gene de tirosina fosfa- tase. Uma sequência-alvo que pode ser clivada por uma ribozima é conhecida de modo geral como NUX (N = A, G, C, U; X = A, C, U), tal como uma sequência que contém uma trinca GUC. Um exemplo de ribozima é uma ribozima do tipo cabeça-de-martelo. A ribozima do tipo cabeça-de-martelo pode conter uma sequência de nucleotídeos que compõem um sítio de sensor, uma sequência de nucleotídeos que contém uma região com a capacidade de formar uma cavidade para capturar de modo estável o íon de Mg2+ somente quando o RNA se liga a um sítio de sensor e uma sequência de nucleotídeos que contém uma região complementar a uma sequência na periferia do sítio de clivagem do RNA alvo. A ribozima da presente invenção pode, do mesmo modo, ser inserida em uma planta-alvo ao fazer com que um vetor apropriado carregue a ribozima.

[0038] Além disso, o termo "anticorpo que suprime um gene detirosina fosfatase" refere-se a um anticorpo ou a um fragmento funcional do mesmo que inibe ou suprime uma tirosina fosfatase codificada pelo gene de tirosina fosfatase. Os exemplos de um anticorpo contra a tirosina fosfatase incluem anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos por recombinação, anticorpos quiméricos, anticorpos de um só filamento, anticorpos biespecíficos e anticorpos sintéticos. Os exemplos de fragmentos funcionais de anticorpos incluem o fragmento Fab, o fragmento F(ab')2 e scFv. Além disso, as classes e subclasses de anticorpos podem ser de qualquer tipo. Os exemplos de classe de anticorpos incluem IgG, IgM, IgE, IgD e IgA. Os exemplos de subclasses de anticorpos incluem IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Um anti- corpo também pode derivatizado por meio de peguilação, acetilação, glicosilação, amidação ou algo do gênero.

[0039] Entrementes, a expressão "aumento do nível de expressãode um gene de tirosina fosfatase" na presente invenção é sinônimo da intensificação da atividade do tirosina fosfatase codificada pelo gene de tirosina fosfatase dentro de uma planta. Os exemplos de um princípio de aumento do nível de expressão de um gene de tirosina fosfa- tase incluem a execução da introdução de modo a permitir a expressão do gene, o aumento da quantidade do gene transcrito, o aumento da quantidade de gene traduzido, e a supressão da degradação do produto da expressão do gene (proteína) do gene. Mais especificamente, os exemplos de uma técnica para aumentar a expressão do gene incluem um método que envolve a introdução de um gene de ti- rosina fosfatase localizado a jusante de um promotor em uma planta, e um método que envolve a modificação da região de controle de expressão de um gene endógeno de tirosina fosfatase.

[0040] Aqui, um gene de tirosina fosfatase pode ser introduzidomediante a incorporação do gene em um cromossomo, ou ao fazer com que um vetor de expressão carregue o gene. Nesse momento, para a expressão estável do gene introduzido, o gene é introduzido de preferência em um cromossomo de modo que a expressão seja realçada por um promotor para a expressão constante.

[0041] Além disso, o termo "região de controle de expressão" refere-se a uma região do promotor à qual a polimerase do RNA se liga e às regiões às quais outros fatores de transcrição se ligam. Um exemplo da modificação de uma região de controle da transcrição é a modificação por meio da qual uma região do promotor entre regiões de controle da transcrição endógena é substituída por uma região do promotor que permite um nível mais elevado da expressão, por exemplo.

[0042] Um vetor de expressão é construído para conter um promo tor que permite a expressão dentro de uma planta e do gene de tirosi- na fosfatase descrito acima. Como um vetor que serve como um corpo materno para um vetor de expressão, vários vetores convencionalmente conhecidos podem ser usados. Por exemplo, plasmídios, fagos, cosmídios ou algo do gênero podem ser usados e tal vetor pode ser apropriadamente selecionado dependendo das células da planta em que é introduzido e do método de introdução. Os exemplos específicos de tal vetor incluem os vetores pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, pBluescript, pBluescriptSK, e pBI. Em particular, quando um método para a introdução de um vetor em uma planta usa Agrobacterium, um vetor binário de pBI é de preferência usado. Os exemplos específicos de tal vetor binário de pBI incluem pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121 e pBI221.

[0043] Um promotor a ser aqui utilizado não é particularmente limitado, contanto que permita a expressão de um gene de tirosina fosfa- tase dentro de uma planta. Qualquer promotor conhecido pode ser apropriadamente usado. Os exemplos de tal promotor incluem um promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (CaMV35S), vários promotores de gene de actina, vários promotores de gene de ubiquiti- na, um promotor do gene de nopalina sintase, um promotor de gene do tabaco PR1a, um promotor de gene de subunidade pequena de carboxilase-oxigenase ribulose 1,5-bisfosfato, e um promotor de gene de napin. Destes, um promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S, um promotor do gene de actina, ou um promotor do gene de ubiquitina podem ser com mais preferência usados. O uso de cada um dos promotores acima permite a expressão intensa constante do gene de tiro- sina fosfatase introduzido nas células da planta.

[0044] Além disso, um promotor que tem funções de causar a expressão específica de sítio em uma planta também pode ser aqui utilizado. Como tal promotor, qualquer promotor convencionalmente co- nhecido pode ser usado. Um gene de tirosina fosfatase pode ser expresso de modo específico de sítio ao usar tal promotor.

[0045] Além disso, um vetor de expressão também pode conteroutros segmentos de DNA além de um promotor e do gene de tirosina fosfatase. Tais outros segmentos de DNA não são particularmente limitados e os exemplos dos mesmos incluem um terminador, um marcador de seleção, um intensificador, e uma sequência de nucleotídeos para realçar a eficiência da tradução. Além disso, o vetor de expressão recombinante acima também pode ter uma região de T-DNA. Uma região de T-DNA pode intensificar a eficiência para a introdução do gene em particular quando o vetor de expressão recombinante acima é introduzido em uma planta ao usar Agrobacterium.

[0046] Um terminador de transcrição não é particularmente limitado, contanto que tenha funções como um sítio de terminação de transcrição e pode ser qualquer terminador de transcrição conhecido. Por exemplo, especificamente, uma região de terminação de transcrição (terminador Nos) de um gene de nopalina sintase, uma região de terminação de transcrição (terminador CaMV35S) do vírus do mosaico da couve-flor 35S, ou algo do gênero podem ser de preferência usados. Destes, o terminador Nos pode ser com mais preferência usado. No caso do vetor recombinante acima, um fenômeno tal que um transcrito desnecessariamente longo é sintetizado e que um promotor robusto diminui o número de cópias de um transcrito depois da introdução nas células da planta pode ser impedido ao posicionar um terminador de transcrição em uma posição apropriada.

[0047] Como um marcador de seleção de transformante, um genede resistência a drogas pode ser usado, por exemplo. Os exemplos específicos de tal gene de resistência a drogas incluem genes de resistência a drogas contra a higromicina, a bleomicina, a canamicina, a gentamicina, o cloranfenicol, e outros do gênero. As plantas transfor- madas podem ser facilmente selecionadas ao selecionar as plantas que podem crescer no meio que contém os antibióticos acima.

[0048] Um exemplo de uma sequência de nucleotídeos para aumentar a eficiência da tradução é uma sequência ômega do vírus do mosaico do tabaco. Esta sequência ômega é posicionada em uma região não traduzida (5'UTR) de um promotor, de modo que a eficiência da tradução do gene de fusão possa ser aumentada. Dessa maneira, o vetor de expressão recombinante pode conter vários segmentos de DNA dependendo das finalidades.

[0049] Um método para construir um vetor de expressão recombi-nante não é particularmente limitado. A um vetor apropriadamente selecionado que serve como um corpo materno, o promotor acima e um gene de tirosina fosfatase, e caso necessário outros segmentos acima de DNA podem ser introduzidos em uma ordem predeterminada. Por exemplo, um gene de tirosina fosfatase e um promotor (e, caso necessário, um terminador de transcrição ou algo do gênero) são ligados para construir um cassete de expressão e então o cassete pode ser introduzido em um vetor. Na construção de um cassete de expressão, por exemplo, os sítios de clivagem de cada segmento de DNA são preparados para que tenham as extremidades projetadas complementares entre si e então é realizada uma reação com uma enzima de ligação, tornando possível especificar a ordem dos segmentos do DNA. Além disso, quando um cassete de expressão contém um terminador, os segmentos de DNA podem ser posicionados na seguinte ordem a montante: um promotor, o gene de tirosina fosfatase, e um terminador. Além disso, os reagentes para a construção de um vetor de expressão (isto é, tipos de enzima de restrição, enzima de ligação, e outros ainda) também não são particularmente limitados. Desse modo, os reagentes comercialmente disponíveis podem ser apropriadamente selecionados e usados.

[0050] Além disso, um método para amplificar (um método paraproduzir) o vetor de expressão acima não é particularmente limitado e os métodos de amplificação convencionalmente conhecidos podem ser aqui usados. Em geral, tal vetor de expressão pode ser amplificado dentro de Escherichia coli como um hospedeiro. Neste momento, os tipos preferidos de Escherichia coli podem ser selecionados dependendo dos tipos de vetor.

[0051] O vetor de expressão descrito acima é introduzido em umaplanta-alvo por um método geral de transformação. Um método para introduzir um vetor de expressão em células da planta (método de transformação) não é particularmente limitado. Os métodos apropriados de introdução convencionalmente conhecidos podem ser empregados dependendo das células da planta. Especificamente, um método que usa Agrobacterium ou um método que envolve a introdução direta em células da planta pode ser empregado, por exemplo. Como um método que usa Agrobacterium, um método descrito em Bechtold, E., Ellis, J.and Pelletier, G. (1993) em Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C. R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199, ou um método descrito em Zyprian E, Kado C1, Agrobacterium-mediated plant transformation bu novel mini- T vectors with a high-copy vir region helper plasmid, Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256 pode ser empregado, por exemplo.

[0052] Como um método para introduzir diretamente um vetor deexpressão em células da planta, a microinjeção, a eletroporação, um método de polietileno glicol, um método de pistola de partículas, a fusão de protoplasto, um método de fosfato de cálcio, ou algo do gênero, podem ser empregados.

[0053] Além disso, quando um método para introduzir diretamenteo DNA em células da planta for empregado, DNA que pode ser aqui usado suficientemente contém as unidades transcricionais requeridas para a expressão de um gene-alvo, tal como um promotor e um termi- nador de transcrição, e um gene-alvo. As funções do vetor não são essenciais em tal caso. Além disso, um DNA que contém uma região de codificação de proteína apenas de um gene-alvo que não tem nenhuma unidade transcricional pode ser aqui utilizado, contanto que esteja integrado na unidade transcricional de um hospedeiro e então o gene-alvo pode ser expresso.

[0054] Os exemplos das célula de planta, em que o vetor de expressão acima ou um cassete de expressão em vez de um vetor de expressão, contendo um gene-alvo, é introduzido incluem células de cada tecido de órgãos da planta tais como flores, folhas e raízes, calos, e células cultivadas em suspensão. Neste momento, um vetor de expressão apropriado pode ser construído de acordo com os tipos de plantas a ser produzidos ou um vetor de expressão versátil pode ser construído de antemão e então ser introduzido em células da planta.

[0055] Tal como descrito acima, a atividade da tirosina fosfatasedentro de uma planta-alvo é alterada ao mudar (aumentar ou diminuir) o nível de expressão de um gene de tirosina fosfatase dentro da plan- ta-alvo . Por conseguinte, a planta pode adquirir a resistência ao pressão ambiental tal como a resistência a altas concentrações de sal.<Gene de tirosina fosfatase>

[0056] Na presente invenção, um gene de tirosina fosfatase, cujonível de expressão é alterado, é o gene especificado com At1g71860 (abreviado como gene At1g71860) ou um gene avaliado para ser fun-cionalmente equivalente ou idêntico ao gene At1g71860. Um grupo de genes que é avaliado para ser funcionalmente equivalente ou idêntico ao gene At1g71860 pode ser procurado e identificado ao usar o banco de dados SALAD, por exemplo.

[0057] Como exemplos, a sequência de nucleotídeos da região decodificação do gene At1g71860 é mostrada na SEQ ID N°: 1, e a se- quência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene At1g71860 é mostrada na SEQ ID N°: 2. O gene funcionalmente equivalente acima não é particularmente limitado, e pode ser especificado por bancos de dados de busca que contêm sequências de genes de vários organismos. Especificamente, os Banco de Dados de Sequências de Nucleo- tídeos Internacional DDBJ/EMBL/GenBank e o banco de dados SWISS-PROT são consultados ao usar a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID N°: 1 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 como uma sequência de indagação, por exemplo, e desse modo tal gene funcionalmente equivalente pode ser facilmente buscado e identificado a partir de bancos de dados conhecidos.

[0058] Além disso, na presente invenção, tal gene de tirosina fos-fatase, cujo nível de expressão é alterado, não fica limitado ao gene descrito acima especificado pela sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID N°:1 e pela sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2. Especificamente, tal gene de tirosina fosfatase, cujo nível de expressão é alterado, pode codificar uma proteína que contém uma sequência de aminoácidos que tem uma deleção, uma substituição, uma adição, ou uma inserção de 1 ou uma pluralidade de sequências de aminoácidos com respeito à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 e tem uma atividade de tirosina fosfatase. Aqui, o termo "uma pluralidade de aminoácidos" refere-se a 1 a 20, de preferência 1 a 10, com mais preferência 1 a 7, ainda com maior preferência 1 a 5, e particularmente de preferência 1 a 3 aminoácidos, por exemplo. Além disso, uma deleção, uma substituição ou uma adição de aminoácido podem ser executadas ao modificar a sequência de nucleotídeos do gene de tirosina fosfatase acima por uma técnica conhecida no estado da técnica. A mutação pode ser introduzida em uma sequência de nu- cleotídeos por uma técnica conhecida, tal como o método de Kunkel ou o método duplex de Gapped, ou um método de acordo com a mesma. Por exemplo, uma mutação é introduzida com um kit de mu- tagênese baseado na mutagênese dirigida por sítio (por exemplo, Mu- tant-K ou Mutant-G (ambos são nomes comerciais da TAKARA Bio)) ou algo do gênero, ou um kit da série Mutagenesis in vitro LA PCR (nome comercial, TAKARA Bio). Além disso, um método de mutagê- nese pode ser: um método que usa um agente químico de mutação representado por EMS (metano sulfonato de etila), 5-bromouracil, 2- amino purina, hidroxilamina, N-metil-N'-nitroso guanidina, ou outros compostos carcinogênicos; ou um método que envolve o tratamento com radiação ou o tratamento com radiação ultravioleta [UV] tipicamente ao usar raios X, raios alfa, raios beta, raios gama, um feixe de íons, ou algo do gênero.

[0059] Além disso, um gene de tirosina fosfatase, cujo nível de expressão é alterado, pode ser um gene homólogo ao gene At1g71860 especificado com a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID N°: 1 e a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2. Aqui, o termo "gene homólogo" refere-se de modo geral a um gene que ramificou evolutivamente de um gene ancestral comum, incluindo um gene homólogo de 2 tipos de espécies (ortólogo), e um gene homólogo gerado ao sobrepor a ramificação que ocorre dentro da mesma espécie (parálogo). Em outras palavras, o termo "gene funcionalmente equivalente" acima refere-se a um gene homólogo tal como um ortólo- go ou um parálogo. Além disso, o termo "gene funcionalmente equivalente" acima também pode se referir a um gene que não evolua a partir de um gene comum, mas tem simplesmente funções análogas.

[0060] Além disso, um gene de tirosina fosfatase, cujo nível de expressão é alterado, também pode ser um gene que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, com mais preferência 90% ou mais, e ainda com maior preferência 95% ou mais de similaridade ou identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 e tem a atividade de tirosina fosfatase. Aqui, o valor da similaridade refere-se a um valor que pode ser encontrado com base no ajuste padrão ao usar um computador montado com um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) e um banco de dados que contêm a informação da sequência de gene.

[0061] Além disso, um gene de tirosina fosfatase, cujo nível de expressão é alterado, também pode ser um gene que compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estritas em pelo menos uma parte ou todo o polinucleotídeo que consiste na sequência de nu- cleotídeos mostrada na SEQ ID N°: 1 e a codificação de uma proteína que tem a atividade de tirosina fosfatase. Aqui, o termo "condições estritas" refere-se às condições sob as quais um híbrido específico é formado, mas um híbrido não específico não é formado nunca. Por exemplo, tais condições compreendem a hibridização a 45°C com 6 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), seguida por uma lavagem a 50°C - 65°C com 0,2-1 x SSC e SDS a 0,1%. Alternativamente, tais condições compreendem a hibridização a 65°C - 70°C com 1 x SSC, seguida por uma lavagem a 65°C - 70°C com 0,3 x SSC. A hibridiza- ção pode ser executada por um método convencionalmente conheci-do, tal como um método descrito em J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

[0062] Em particular, quando o nível de expressão de um gene detirosina fosfatase é aumentado, um gene de tirosina fosfatase mutante é modificado de preferência para poder manter a atividade sob condições de oxidação. Os exemplos de tais condições de oxidação incluem as condições que envolvem a presença de glutationa oxidada ou peró- xido de hidrogênio. Essa glutationa oxidada e peróxido de hidrogênio oxidam e inativam a tirosina fosfatase. Aqui, o termo "gene de tirosina fosfatase mutante" refere-se a um gene que codifica a fosfatase tirosi- na que tem pouca sensibilidade à glutationa oxidada ou ao peróxido de hidrogênio.

[0063] Um exemplo de um gene de tirosina fosfatase mutante éum gene que codifica a fosfatase tirosina que tem pouca sensibilidade a glutationa oxidada ou peróxido de hidrogênio em consequência da substituição do 175° resíduo de cisteína por outro aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2. Os exemplos de um aminoácido a ser substituído pelo 175° resíduo de cisteína não são particularmente limitados, contanto que possam abaixar a sensibilidade à glutationa oxidada ou ao peróxido de hidrogênio, e incluem a serina. Especificamente, a tirosina fosfatase preparada pela substituição da 175° cisteína por serina na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 adquire propriedades tais como a sua pouca sensibilidade à glutationa oxidada ou ao peróxido de hidrogênio.

[0064] Tal como descrito acima, o nível de expressão de um genede tirosina fosfatase pode ser aumentado pela introdução de tal gene de tirosina fosfatase mutante modificado de modo a poder manter a sua atividade sob condições de oxidação. A introdução de tal gene de tirosina fosfatase mutante modificado para poder manter a sua atividade sob condições de oxidação pode melhorar a resistência à pressão ambiental um grau a mais do que aquele da introdução de um gene de tirosina fosfatase do tipo selvagem. Em outras palavras, quando um gene de tirosina fosfatase mutante modificado para poder manter a sua atividade sob condições de oxidação é usado, pode ser esperado um efeito ainda maior de melhora da resistência à pressão ambiental do que aquele do uso de um gene de tirosina fosfatase do tipo selvagem, embora o grau de aumento do nível de expressão seja baixo.

[0065] As plantas a ser sujeitadas à alteração descrita acima donível de expressão de um gene de tirosina fosfatase específico, em outras palavras, as plantas que são sujeitadas à melhoria da resistência à pressão ambiental, não são particularmente limitadas. Especificamente, pode-se esperar que a alteração do nível de expressão do gene de tirosina fosfatase acima tenha efeitos de melhorar a resistência à pressão ambiental de todas as plantas. Os exemplos de plantas alvo incluem, mas sem ficar a elas limitados, dicotiledôneas e monoco- tiledôneas, tais como as plantas (ver abaixo) que pertencem às famílias Brassicaceae, Gramineae, Solanaceae, Leguminosae, Salicaceae, e outras ainda.

[0066] Família Brassicaceae: Arabidopsis thaliana, colza (Brassicarapa, Brassica napus, Brassica campestris), repolho (Brassica olera- cea var. capitata), napa (Brassica rapa var. pekinensis), ging-geng-cai (Brassica rapa var. chinensis), nabo (Brassica rapa var. rapa), folhas de nabo (Brassica rapa var. hakabura), mostarda potherb (Brassica rapa var. lancinifolia), komatsuna (Brassica rapa var. peruviridis), pak choi (Brassica rapa var. chinensis), daikon (Raphanus sativus), raiz forte japonesa (Wasabia japonica), e outros ainda.

[0067] Família Solanaceae: tabaco (Nicotiana tabacum), berinjela(Solanum melongena), batata (Solaneum tuberosum), tomate (Lyco- persicon lycopersicum), pimenta malaguenha (Capsicum annuum), pe- túnia, e outros ainda.

[0068] Família Leguminosae: soja (Glycine Max), (Pisum sativum),fava (Vicia faba), Wisteria (Wisteria floribunda), amendoim (Arachis hypogaea), trevo de três folhas (Lotus corniculatus var. japonicus), feijão comum (Phaseolus vulgaris), feijão azuki (Vigna angularis), acácia, e similares.

[0069] Família Asteraceae: margarida dos floristas (Chrysanthemum morifolium), girassol (Helianthus annuus), e outros ainda.

[0070] Família Arecaceae: palma de óleo (Elaeis guineensis, Ela-eis oleifera), coco (Cocos nucifera), palma de tâmara (Phoenix dactyli- fera), copernicia, e similares.

[0071] Família Anacardiaceae: cereira do Japão (Rhus succeda-nea), caju (Anacardium occidentale), árvore de laca (Toxicodendron vernicifluum), manga (Mangifera indica), pistache (Pistacia vera), e si-milares.

[0072] Família Cucurbitaceae: abóbora (Cucurbita maxima, Cucur-bita moschata, Cucurbita pepo), pepino (Cucumis sativus), abóbora pescoçuda (Trichosanthes cucumeroides), cucúrbita (Lagenaria sicera- ria var. gourda), e similares.

[0073] Família Rosaceae: amêndoa (Amygdalus communis), rosa(Rosa), morango (Fragaria), cereja (Prunus), maçã (Malus pumila var. domestica), e similares.

[0074] Família Caryophyllaceae: cravo (Dianthus caryophyllus) esimilares.

[0075] Família Salicaceae: choupo (Populus trichocarpa, Populusnigra ou Populus tremula), e similares.

[0076] Família Gramineae: milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa),cevada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum), bambu (Phyllos- tachys), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), grama napier (Pen- nisetum pupureum), erianthus (Erianthus ravenae), miscanthus (grama prateada japonesa) (Miscanthus virgatum), sorgo (Sorghum) e grama (Panicum), e similares.

[0077] Família Liliaceae: tulipa (Tulipa), lírio (Lilium), e outros ainda.

[0078] Destes exemplos, as culturas energéticas tais como a cana-de-açúcar, o milho, a colza e o girassol, que podem servir como matérias-primas para o biocombustível, podem ser os alvos preferíveis. É possível ampliar de maneira significativa as áreas de cultivo e as condições de cultivo para uma cultura energética relevante ao melhorar a resistência à pressão ambiental da cultura energética. Especificamen- te, torna-se possível o cultivo de culturas energéticas até mesmo no solo ou sob a influência de fatores ambientais (por exemplo, a temperatura média, a concentração de sal no solo, etc.) em que as plantas do tipo selvagem não podem ser cultivadas. Por conseguinte, os custos dos biocombustívels tais como o bioetanol, o biodiesel, o biometa- nol, o bioDME, o bioGTL (BTL) e o biobutanol podem ser reduzidos.<Outras etapas e métodos>

[0079] Depois da alteração (modificação) do nível de expressão deum gene de tirosina fosfatase tal como descrito acima, uma etapa de seleção de plantas com um traço apropriado pode ser executada por um método convencionalmente conhecido. Tal método de seleção não é particularmente limitado. Por exemplo, após o crescimento de plantas modificadas, as próprias plantas, ou seus órgãos arbitrários e tecidos que têm uma resistência à pressão ambiental significativamente maior podem ser selecionados.

[0080] Além disso, as plantas de progênie podem ser obtidas apartir das plantas obtidas desse modo de acordo com um método con-vencional. As plantas que retêm um traço em que o nível de expressão do gene de tirosina fosfatase foi alterado são selecionadas com base na resistência à pressão ambiental. Portanto, uma linhagem estável de planta que pode exibir uma resistência incrementada da pressão ambiental devido ao fato de ter o traço acima pode ser produzida. Além disso, as células ou materiais reprodutivos da planta, tais como sementes, frutas, talos, calos, túberos, orelhas cortadas, ou protuberâncias, podem ser obtidos a partir da planta resultante ou de uma sua planta de progênie. Uma linhagem de planta estável que pode exibir uma resistência incrementada à pressão ambiental devido ao fato de ter o traço acima pode ser produzida em massa a partir da mesma com base em tais materiais.

[0081] Além disso, as plantas na presente invenção podem incluir uma matéria que compreende pelo menos qualquer dentre uma planta adulta, células de plantas, tecidos de plantas, calos e sementes. Isto é, de acordo com a presente invenção, qualquer matéria em um estado que permite que ela venha eventualmente a se transformar em uma planta pode ser considerada como uma planta. Além disso, as células da planta acima incluem células da planta em várias formas. Os exemplos de tais células da planta incluem células cultivadas em sus-pensão, protoplastos, e seções da folha. Em consequência da prolife- ração/diferenciação de tais células da planta, uma planta pode ser obtida. Além disso, uma planta pode ser reproduzida a partir das células da planta por um método convencionalmente conhecido dependendo dos tipos de células da planta.

EXEMPLOS

[0082] Daqui por diante, a presente invenção é descrita em maisdetalhes com referência aos exemplos, embora o âmbito técnico da presente invenção não fique limitado aos exemplos.

EXEMPLO 1(4) seleção do gene de tirosina fosfatase (PTP) de Arabidopsis thaliana

[0083] Neste exemplo, o gene especificado com o código AGI:At1g71860 foi selecionado como um gene de tirosina fosfatase de Arabidopsis thaliana. Além disso, o At1g71860 é conhecido como um gene caracterizado pela expressão que é realçada pelo tratamento com elevada concentração de sal, tal como descrito em Plant Cell, 10, 849-857, 1998. Neste exemplo, um mutante caracterizado pela supressão do gene At1g71860 foi examinado quanto à possibilidade de seu crescimento sob condições de alta concentração de sal.

[0084] Além disso, a sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene At1g71860 é mostrada na SEQ ID N°: 1 e a sequência de aminoácidos de tirosina fosfatase que é codificada pelo gene é mostrada na SEQ ID N°: 2.(5) Linhagem de etiqueta de T-DNA de Arabidopsis thaliana

[0085] SALK_118658 e SALK_062441 obtidos junto ao Nottingham Arabidopsis Stock Center (http://nasc.nott.ac.uk/) foram usados como mutantes de inserção de T-DNA de Arabidopsis thaliana em que o T-DNA tinha sido inserido no gene At1g71860 selecionado.(6) Confirmação da posição de inserção de T-DNA e linhagem homo

[0086] SALK_118658 continha o T-DNA inserido no 4° éxon dogene At1g71860. SALK_062441 continha o T-DNA inserido no 7° ín- tron do mesmo. Eles foram nomeados como mutante atptp1-1 e mutante atptp1-2, respectivamente. O DNA genômico foi extraído do mutante atptp1-1, do mutante atptp1-2, e de plantas Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col).

[0087] Como iniciadores para a detecção da região de borda emque o T-DNA tinha sido inserido no mutante atptp1-1, foram usados 5'- TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3' (PL11: SEQ ID N°: 3) e 5'-CAACCAATCGAGTGAGCATC-3 ' (p3: SEQ ID N°: 4). Como iniciadores para a detecção do gene At1g71860, 5'-CAGTGGCTATGAACAGTGTC-3' (p5: SEQ ID N°: 5) e p3 foram usados (Figura 1). Como iniciadores para a detecção da região de borda em que o T-DNA tinha sido inserido no mutante atptp1-2, 5'- ACAGAGGATCAGCCCATGTC-3' (p6: SEQ ID N°: 6) e PL11 foram usados. Como iniciadores para a detecção do gene At1g71860, p6 e 5'-TTAGGAACTCGTTCCAGCATTTG-3' (p2: SEQ ID N°: 7) foramusados (Figura 1). Como um controle, PCR também foi executado para Col com os conjuntos de iniciadores acima. Com qualquer conjunto de iniciadores, o PCR foi sempre executado sob condições que compreendem 1 ciclo de 94°C (3 minutos), seguido por 25 ciclos de 94°C (30 segundos), 58°C (1 minuto) e 72°C (1 minuto).

[0088] Uma vez que as regiões de borda em que o T-DNA tinhasido inserido foram amplificadas para todos os mutantes, nenhum gene At1g71860 foi amplificado (o tamanho do gene inserido era tão grande quanto 5 kb ou mais, de modo que não era detectável sob tais condições). A amplificação normal do gene At1g71860 foi confirmada para Col. A inserção de T-DNA Homozigoto no gene At1g71860 nestes mutantes foi determinada com base nestes padrões de faixa (Figura 2).(7) Comparação de Col. e mutante atptp1 para o nível de expressão do gene At1g71860

[0089] O RNA total foi extraído de todas as partes de plantas aéreas cultivadas por 14 dias em um meio de ágar (1/2MS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Murashige and Skoog Plant Salt Mixture), pH 5,7, a uma concentração de 1% de sacarose, em ágar a 0,7%). O DNA foi preparado a partir de 1 μg do RNA total ao usar um kit de Transcrição Reversa RT-QuantiTect (Qiagen). Após uma diluição de 4 vezes para a detecção do gene PLANTSAt1g71860 e uma diluição de 1.000 vezes para a detecção de 18S rRNA (código AGI: At3g41768.1), as resultantes foram sujeitadas ao PCR em tempo real (Applied Biosystems, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System). Cada solução da reação para a detecção da expressão de um gene foi preparada até um volume total de 24 μl contendo 2 μl de DNA diluído, cada 1 μl contendo 20 μM de iniciadores de Avanço e Reverso, e 12 μl de Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Como iniciadores para o gene At1g71860, 5'-GTCCTTTACCACACACGATGGA-3' (SEQ ID N°: 8) e 5'-TTGGGCAATGCTGCTGAA-3' (SEQ ID N°: 9) foram usados. Como iniciadores para 18S rRNA, 5'- TCCTAGTAAGCGCGAGTCATC-3' (SEQ ID N°: 10) e 5'-CGAACACTTCACCGGATCAT-3' (SEQ ID N°: 11) foram usados. O PCR foi executado sob condições que compreendem 1 ciclo de 50°C (2 minutos) e 95°C (10 minutos) seguido por 40 ciclos de 95°C (15 segundos) e 60°C (1 minuto).

[0090] Cada um dos resultados foi mostrado em termos do nívelde expressão relativo quando o nível de expressão em Col. foi designado como "1" após a normalização do nível de expressão do gene At1g71860 em cada linhagem com o nível de expressão de 18S rRNA (Figura 3). Com base nas diferenças comparadas com o nível de expressão em Col., o mutante atptp1-1 foi considerado como uma linhagem knockout, e o mutante atptp1-2 foi considerado como uma linhagem knockdown.(8) Teste de resistência ao sal para o mutante atptp1 de Arabi- dopsis thaliana

[0091] As sementes do mutante atptp1-1 considerado como umalinhagem knockout e o mutante atptp1-2 considerado como uma linhagem knockdown em (4) acima, e Col. (do tipo selvagem não recombi- nante) como um controle foram semeadas assepticamente em meios de ^ MS ágar contendo 0 mM, 125 mM, e 137,5 mM de NaCl. Elas foram cultivadas por 21 dias sob condições de 22°C e 16 horas na cla- ridade/8 horas no escuro, e com uma intensidade de luz variando de cerca de 30 a 45 μE/cm2 para realizar um teste de resistência ao sal.

[0092] As Figuras 4 a 6 mostram os resultados do teste de resistência ao sal que são fotografias das placas que contêm plantas de Col, mutante atptp1-1 e mutante atptp1-2. As Figuras 5 e 6 revelaram que as plantas do mutante atptp1-1 e do mutante atptp1-2 exibiram uma maior resistência ao NaCl do que Col.

[0093] Tal como mostrado nos resultados acima, foi feita uma verificação neste exemplo que uma resistência a altas concentrações de sal pode ser conferida ao suprimir o gene At1g71860.

EXEMPLO 2

[0094] Neste exemplo, as plantas que superexpressam o gene At1g71860 e as plantas que superexpressam um gene At1g71860 mu- tado foram produzidas, e então examinadas quanto à possibilidade de crescimento sob condições de uma elevada concentração de sal de uma maneira similar àquela no Exemplo 1. Além disso, o gene At1g71860 mutado preparado neste exemplo tem uma sequência de aminoácidos preparada pela substituição da 175a cisteína na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 por serina, e codifica a tirosina fosfatase que tem pouca sensibilidade à glutationa oxidada e ao peróxido de hidrogênio.(9) Plantas que superexpressam o gene At1g71860

[0095] Um fragmento de ácido nucleico que contém o geneAt1g71860 foi clonado a partir de Col pelo procedimento a seguir.

[0096] Em primeiro lugar, o RNA total foi coletado de Col ao usarum RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Após a digestão do DNA genômi- co com dNase I (Invitrogen), o DNA foi preparado a partir de 5 g do RNA total ao usar um StrataScript First Strand cDNA Synthesis System (Stratagene). O PCR foi executado ao usar o DNA como um molde e os iniciadores, aos quais um sítio Xba I ou Sac I tinha sido adicionado, 5'-TCTAGAATGGCGACCGGTAAAACCTC-3' (SEQ ID N°: 12) e 5'-GAGCTCTTAGGAACTCGTTCCAGCAT-3' (SEQ ID N°: 13). O fragmento de ácido nucleico que contém o DNA do gene At1g71860 foi amplificado por PCR.

[0097] Em seguida, o fragmento do ácido nucleico amplificado porPCR foi clonado no sítio Xba I/Sac I de um vetor pGEM-T Easy (Pro- mega). Além disso, a resultante foi substituída com por um gene de y- glucuronidase de um vetor binário pBI121, de modo que o DNA de comprimento total do gene At1g71860 foi expresso sob o controle do promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S.

[0098] Em seguida, o construto obtido desse modo foi introduzidoem Col por um método de Agrobacterium, preparando desse modo as plantas de superexpressão. As plantas obtidas desse modo que supe- rexpressam o gene At1g71860 foram nomeadas como 35S-AtPTP1.(10) Plantas que superexpressam o gene At1g71860 mutado

[0099] Um fragmento de ácido nucleico que contém o geneAt1g71860 mutado foi preparado por PCR ao usar o DNA do gene At1g71860 preparado em (1) acima como um molde. Especificamente, neste PCR, foi usado um par de iniciadores que tinha sido projetado para substituir a 175a cisteína (TGC) da proteína codificada pelo gene At1g71860 por serina (TCC), 5'-GACTGTTAAATCCGGGGACTATTTTCAA-3' (SEQ ID N°: 14) e 5'-AATAGTCCCCGGATTTAACAGTCCTATT-3' (SEQ ID N°: 15).

[00100] O DNA do gene At1g71860 mutado amplificado por PCR Foi clonado em um vetor pGEM-T Easy (Promega). Além disso, a resultante foi substituída por um gene de y-glucuronidase de um vetor binário pBI121, de modo que o DNA de comprimento total do gene At1g71860 mutado foi expresso sob o controle do promotor 35S derivado do vírus do mosaico da couve-flor.

[00101] Em seguida, o construto obtido desse modo foi introduzido em Col por um método de Agrobacterium, produzindo desse modo plantas de superexpressão. As plantas obtidas desse modo que supe- rexpressam o gene At1g71860 mutado foram nomeadas como 35S- AtPTP1 (C175S).

[00102] Além disso, na tirosina fosfatase codificada pelo gene At1g71860 mutado, a 175a cisteína na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°: 2 foi substituída por serina. No que diz respeito à substituição (mutação), tal como descrito no Okayama Prefectural Technology Center for Agriculture, Forestry, and Fisheries, Research Institute for Biollogical Sciences, Annual Research Report 2007 (páginas 99-103), e nos Summaries of the 49th Annual Meeting, The Japanese Society of Plant Physologists (página 193 (3aD10)), é sabido que a tirosina fosfatase mantém a sua atividade sob condições de oxidação tais como a presença de glutationa oxidada ou peróxido de hidrogênio.(11) Comparação dos níveis de expressão do gene At1g71860 em plantas de superexpressão

[00103] O nível de expressão do gene At1g71860 foi medido por um método de PCR em tempo real de uma maneira similar àquela no Exemplo 1 (4). Os resultados são mostrados na Figura 7. Além disso, também na Figura 7, cada um dos resultados foi mostrado em termos do nível de expressão relativo quando o nível de expressão em Col foi designado como "1" após a normalização do nível de expressão do gene At1g71860 com o mesmo de 18S rRNA. Tal como mostrado na Figura 7, foi revelado que ambas as plantas de superexpressão produzidas em (1) acima e as plantas de superexpressão produzidas em (2) acima exibem níveis mais elevados da expressão do gene At1g71860 e do gene At1g71860 mutado do que o nível de expressão do gene At1g71860 nas plantas do tipo selvagem.

[00104] Em particular, foi revelado que as plantas de superexpres- são 6-2 do gene At1g71860 (produzidas em (1) acima) exibem níveis mais elevados da expressão do gene At1g71860 do que aqueles das plantas de superexpressão 5-1. Além disso, foi revelado que as plantas de superexpressão 1-3 do gene At1g71860 mutado (produzidas em (2) acima) exibem níveis mais elevados da expressão do gene At1g71860 mutado do que aqueles das plantas de superexpressão 24. Além disso, foi revelado que as plantas de superexpressão 1-3 e 2-4 do gene At1g71860 (produzidas em (2) acima) exibem níveis mais baixos da expressão do gene At1g71860 do que aqueles das plantas de superexpressão 5-1 e 6-2 (produzidas em (1) acima).(12) Teste de resistência ao sal para cada planta de superexpres- são

[00105] Um teste de resistência ao sal foi realizado de uma maneira similar àquela no Exemplo 1 (5) ao usar as plantas de superexpressão produzidas em (1) acima e as plantas de superexpressão produzidas em (2) acima. Os resultados do teste de resistência ao sal são mostrados na Figura 8. As fotografias do lado esquerdo na Figura 8 mostram as placas que contêm as plantas que superexpressam o gene At1g71860 e as plantas de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col). As fotografias do lado direito na Figura 8 mostram as placas que contêm as plantas que superexpressam as plantas do gene At1g71860 mutado e as plantas de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col).

[00106] Tal como mostrado na Figura 8, foi revelado que as plantas que superexpressing o gene At1g71860 e as plantas que superex- pressam o gene At1g71860 mutado têm uma resistência maior ao sal do que aquelas de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Col). Além disso, tal como mostrado do lado esquerdo na Figura 8, foi revelado que as plantas de superexpressão 6-2 têm uma melhor resistência ao sal do que aquelas das plantas de superexpressão 5-1. O resultado foi correlacionado com o grau de aumento no nível de expressão do gene At1g71860 (Figura 7), sugerindo que uma maior resistência ao sal pode ser adquirida se o nível de expressão do gene At1g71860 for aumentado de maneira mais significativa. Além disso, tal como mostrado do lado direito na Figura 8, foi revelado que as plantas de superex- pressão 1-3 têm uma maior resistência ao sal do que aquelas das plantas de superexpressão 2-4. O resultado é correlacionado com o grau de aumento no nível de expressão do gene At1g71860 mutado (Figura 7), sugerindo que uma resistência ainda maior ao sal pode ser obtida se o nível de expressão do gene At1g71860 mutado for aumentado de maneira significativa.

[00107] Além disso, o nível de expressão do gene At1g71860 nas plantas de superexpressão produzidas em (2) acima era mais baixo do que aquele do gene At1g71860 nas plantas de superexpressão produzidas em (1) acima, tal como mostrado na Figura 7. Apesar dos resultados, as plantas de superexpressão produzidas em (2) acima exibiram uma resistência ao sal equivalente àquela das plantas de supe- rexpressão produzidas em (1) acima, tal como mostrado na Figura 8. Os resultados revelaram que a superexpressão do gene At1g71860, em que uma mutação tinha sido introduzida para manter a atividade sob condições de oxidação, é a preferida para conferir resistência ao sal às plantas.

[00108] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Claims

1. Método para aumentar a resistência de uma planta contra elevada concentração de sal, caracterizado pelo fato de que compreende:a alteração, em uma planta, do nível de expressão de uma enzima de proteína tirosina fosfatase que é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácido, ou a introdução, em uma planta, de uma enzima de proteína tirosina fosfatase que é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos que codifica cisteína na posição 175 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituída pela sequência de nucleotídeos que codifica serina, ou a se-quência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminácidos; eavaliar a resistência contra o sal da planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida alteração compreende diminuir o nível de expressão da referida proteína.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida alteração compreende aumentar o nível de expressão da referida proteína.

4. Método para produzir uma planta apresentando resistência aumentada contra elevada concentração de sal quando comparada com uma planta do tipo selvagem, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a alteração, em uma planta, do nível de expressão de uma enzima de proteína tirosina fosfatase que é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácido, ou a introdução, em uma planta, de uma enzima de proteína tirosina fosfatase que é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos que codifica cisteína na posição 175 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é substituída pela sequência de nucleotídeos que codifica serina, ou a sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminácidos;avaliar a resistência contra o sal da planta; eselecionar a linhagem apresentando resistência significativamente aumentada contra elevada concentração de sal.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida alteração compreende diminuir o nível de expressão da referida proteína.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida alteração compreende aumentar o nível de expressão da referida proteína.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é inferior a 0,5 vezes em comparação com o tipo selvagem.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é maior que 17 vezes em comparação com o tipo selvagem.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é maior que 13 vezes comparado ao tipo selvagem.

10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é inferior a 0,5 vezes em comparação com o tipo selvagem.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é maior que vezes em comparação com o tipo selvagem.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão da referida proteína é maior que 13 vezes comparado ao tipo selvagem.