CN104220594A - 对植物赋予环境胁迫耐性的方法 - Google Patents

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Abstract

对植物赋予环境胁迫耐性或者提高植物的环境胁迫耐性。通过使酪氨酸磷酸酶基因(At1g71860)的表达量改变从而对植物体赋予环境胁迫耐性。

Description

对植物赋予环境胁迫耐性的方法
技术领域
本发明涉及通过使规定的基因的表达量变化来对植物赋予环境胁迫耐性的方法。
背景技术
植物的生长发育可能性依赖于温度、湿度、土壤所含的盐浓度等各种环境要素。有时被这些要素赋予特征的环境，对于某种植物来说适合，但对于其他植物来说不适合。一般地，影响植物的生长发育这样的上述要素被称为环境胁迫。在具有规定的环境胁迫的环境中，规定的植物不能生长发育或生长发育困难的情况下，说明该植物没有环境胁迫耐性。相反，即使在具有规定的环境胁迫的环境中也能生长发育的植物，说明具有环境胁迫耐性。
如果能对植物赋予环境胁迫耐性，则可以扩展该植物的可栽培地域，从而可以有效地利用有限的大地。特别是甘蔗等能量作物是生物燃料的原料，因而期望获得对各种环境胁迫的耐性。即，如果能对上述的能量作物赋予环境胁迫耐性，则即使在由于上述的环境要素而不能栽培的地域也可以栽培该能量作物。
作为对植物赋予环境胁迫耐性的技术，例如，如专利文献1所示，已知使拟南芥中的酪氨酸磷酸酶(PTP)基因(At3g44620)过表达的方法。根据专利文献1，通过使PTP基因过表达，可以对植物赋予干燥耐性。另外，非专利文献1中记载，来源于拟南芥的酪氨酸磷酸酶基因(At1g71860)在高盐处理中被诱导表达。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2009-132057
非专利文献
非专利文献1：Xu Q,Fu HH,Gupta R,Luan S.Molecularcharacterization of a tyrosine-specific protein phosphatase encoded by astress-responsive gene in Arabidopsis.Plant Cell.1998May；10(5):849-57.
发明内容
发明要解决的课题
然而，一般地，即使已知在相当于环境胁迫的条件下规定的基因特异性地高表达，以高表达该基因的方式改变后的植物也未必获得环境胁迫耐性。因此可以说，来源于拟南芥的酪氨酸磷酸酶基因(At1g71860)怎样参与植物的环境胁迫耐性，还是完全不参与植物的环境胁迫耐性，是完全不明的。
于是，鉴于如上所述的事实，本发明的目的在于提供对植物赋予环境胁迫耐性或者提高植物中的环境胁迫耐性的技术。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过使酪氨酸磷酸酶基因(At1g71860)的表达量改变可以对植物赋予环境胁迫耐性这样的新见解，从而完成了本发明。
即，本发明的植物体是改变了At1g71860基因或与该基因在功能上等价的基因的表达量的植物体。
另外，本发明的对植物体赋予环境胁迫耐性的方法是使At1g71860基因或与该基因在功能上等价的基因的表达量改变的方法。本发明的植物体的制造方法是包括：准备改变了At1g71860基因或与该基因在功能上等价的基因的表达量的植物体的工序；和评价所述植物体的环境胁迫耐性，挑选该环境胁迫耐性有意义地提高了的系统的工序的方法。
特别地，所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因优选是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的基因，
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质，
(c)由与包含序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码、且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质。
本发明中作为对象的植物可列举双子叶植物、例如十字花科植物，在十字花科植物中可列举拟南芥、油菜。本发明中作为对象的植物可列举单子叶植物、例如禾本科植物，在禾本科植物中可列举稻、甘蔗。
另外，本发明中使基因的表达量改变，是包含使该基因的表达量增加、及使该基因的表达量减少这两者的含义，无论增加的程度及减少的程度如何。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2012-094931号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明的植物体是与野生型相比，对盐胁迫这样的环境胁迫的耐性有意义地提高了的植物体。另外，本发明的环境胁迫的赋予方法，能够使作为对象的植物对环境胁迫的耐性与野生型相比大幅提高。进而，本发明的植物体的制造方法，能够制造与野生型相比对环境胁迫的耐性大幅提高了的植物体。因此，通过应用本发明，例如，能够大幅缓和植物的栽培条件，能够实现以植物自身作为生产物时的生产量的提高，从而能够实现低成本化。
附图说明
图1是显示为了确认atptp1-1突变体及atptp1-2突变体中的T-DNA的插入位置而设计的引物的位置的示意图。
图2是显示通过PCR而被扩增的片段的电泳照片。
图3是显示将通过实时PCR测定的At1g71860基因的表达量作为相对值算出的结果的特性图。
图4是将Col、atptp1-1突变体及atptp1-2突变体接种于1/2MS培养基(NaCl0mM)中、然后培养21天后拍摄的照片。
图5是将Col、atptp1-1突变体及atptp1-2突变体接种于1/2MS培养基(NaCl125mM)中、然后培养21天后拍摄的照片。
图6是将Col、atptp1-1突变体及atptp1-2突变体接种于1/2MS培养基(NaCl137.5mM)中、然后培养21天后拍摄的照片。
图7是显示将对于实施例2中制作的过表达体通过实时PCR测定的At1g71860基因及突变型At1g71860基因的表达量作为相对值算出的结果的特性图。
图8是将实施例2中制作的各过表达体及Col接种于1/2MS培养基(NaCl0mM、125mM或137.5mM)中、然后培养21天后拍摄的照片。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的植物体是改变了特定的酪氨酸磷酸酶基因的表达量的植物体，是与野生型相比环境胁迫耐性提高了的植物体。这里，环境胁迫是包含盐胁迫、高温胁迫及干燥胁迫等的含义。特别地，在本发明的植物体中，作为环境胁迫耐性优选以盐胁迫耐性为对象。即，本发明的植物体优选是与野生型相比盐胁迫耐性提高了的植物体。盐胁迫等环境胁迫耐性提高，是指在添加了野生型的不能生长发育或者生长发育困难的环境胁迫的条件下能生长发育。
本发明中使酪氨酸磷酸酶基因的表达量改变，是包含使该基因的表达量增加、使该基因的表达量减少这两者的含义。为了使酪氨酸磷酸酶基因的表达量改变，可以通过进行详细如后所述那样的各种改变来实现。使酪氨酸磷酸酶基因的表达量增加或者减少，只要与改变前的植物(例如野生型的植物)中的该基因的表达量相比，改变后的植物中的该基因的表达量在统计学上有意义地增加或者减少即可。这样，只要该基因的表达量在统计学上有意义地增加或者减少即可，无论增加量及减少量如何。
另外，本发明中使酪氨酸磷酸酶基因的表达量减少，与抑制植物内中的酪氨酸磷酸酶基因是同义的。通过抑制酪氨酸磷酸酶基因，使对象植物中的特定的酪氨酸磷酸酶活性降低或丧失。这里，抑制基因是包含从染色体中使该基因缺失，使该基因的表达量降低，分解该基因的转录产物，使该基因的翻译量降低，分解、抑制该基因的表达产物(蛋白质)等的含义。换言之，抑制特定的酪氨酸磷酸酶基因，是包含将功能缺失突变体(loss-of-function mutant)型的突变导入酪氨酸磷酸酶基因中的含义。更具体地，作为抑制基因的方法，可列举所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的降解(Nonsense mediated decay,NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(微小RNA，micro-RNA)法、siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)法、抗体法等。
例如，所谓使酪氨酸磷酸酶基因从染色体中缺失，不特别限定，是指将该基因的表达控制区和/或编码区从染色体中删除。对使酪氨酸磷酸酶基因从染色体中缺失的方法不特别限定，可以按照常规方法适宜实施。
另外，抑制酪氨酸磷酸酶基因的siRNA，是与该酪氨酸磷酸酶基因对应的mRNA(即由该基因编码的mRNA)或包含其选择性剪接型mRNA的互补序列的小双链RNA，介由RNA-核酸酶复合体(RNA诱导沉默复合体，RNA induced silencing complex或RISC)的形成，而该mRNA或其选择性剪接型mRNA被选择性地加工。
另外，siRNA还可以从作为其前体的短发夹RNA(shRNA)，介由利用作为细胞内RNase的Dicer的加工而被诱导出。shRNA是在siRNA的正义链序列与反义链序列之间具有环(loop)的双链RNA，优选在其3’末端包含由1～6个、优选为2～4个多聚U组成的突出端(overhang)。shRNA在被属于RNaseIII家族的Dicer加工成siRNA之后，siRNA被单链化，其正义链RNA与RNaseH形成复合体(RISC)，由此具有siRNA序列的互补序列的目标mRNA被切断，其结果基因的表达被抑制。将与酪氨酸磷酸酶基因对应的siRNA导入对象植物中时，优选直接注射siRNA，或使用能表达siRNA的载体。
具体地，可以使用在启动子的调节下包含编码所述siRNA或其前体的DNA序列的表达载体。表达载体的1例是发夹型载体。该载体是包含编码所述正义链RNA序列与所述反义链RNA序列介由单链环(loop)序列共价结合而成的发夹型RNA的DNA的载体，其中该DNA在细胞内通过转录而形成该发夹型RNA，被Dicer加工而形成所述siRNA。在编码siRNA的发夹型DNA的3’末端，作为转录停止信号序列，或者为了形成突出端，而连接由1～6个、优选为1～5个T组成的多聚T序列，例如4个或5个的多聚T序列。作为由载体DNA转录出的siRNA前体的shRNA，期望在其反义链的3’末端具有由2～4个U组成的突出端，通过突出端的存在，能够增加正义链RNA及反义链RNA对由核酸酶造成的分解的稳定性。内源性的Dicer具有将长链dsRNA、前体微RNA(miRNA)分别转化成siRNA和成熟miRNA的功能。
质粒载体一般除了编码上述siRNA的DNA序列及启动子之外，还可以包含抗药性基因(例如，新霉素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、嘌呤霉素耐性基因、潮霉素耐性基因等)、转录终止序列、单一限制性位点或多克隆位点、复制起始点等。
另外，抑制酪氨酸磷酸酶基因的反义核酸，是包含与酪氨酸磷酸酶基因对应的mRNA的序列、或与其部分序列互补的序列的RNA或DNA的任一者。所述部分序列可以包含在酪氨酸磷酸酶基因或mRNA的序列中连续的约30个以上、50个以上、70个以上、100个以上、150个以上、200个以上或250个以上至全长以下的核苷酸组成的序列。
反义核酸的核苷酸除了天然的核苷酸之外，还包含具有卤素(氟、氯、溴或碘)、甲基、羧甲基或硫代基等基团的修饰核苷酸。反义核酸可以使用周知的DNA/RNA合成技术或DNA重组技术来合成。在通过DNA重组技术合成的情况下，可以以包含酪氨酸磷酸酶基因的碱基序列的载体DNA作为模板，使用夹入了要扩增的序列的引物进行聚合酶链反应(PCR)，来扩增目标序列，根据需要克隆到载体中，生成反义DNA。或者，可以将具有这样得到的扩增目标序列的DNA插入载体中，将该载体导入真核或原核细胞，利用其转录系统得到反义RNA。
本发明的反义核酸，无论其是DNA还是RNA，都可以通过与酪氨酸磷酸酶基因或对应的mRNA结合，来阻碍或抑制转录或翻译。该反义核酸另外还可以与上述的siRNA同样地，通过装载于适当的载体而导入对象植物中。
进而，抑制酪氨酸磷酸酶基因的核酶是具有催化活性的RNA，具有切断与目标酪氨酸磷酸酶基因对应的mRNA的活性。通过该切断，酪氨酸磷酸酶基因的表达被阻碍或抑制。已知核酶能切断的目标序列一般是包含NUX(N＝A,G,C,U；X＝A,C,U)、例如GUC三连体的序列。核酶包含锤头型核酶。锤头型核酶可以包含：构成传感器部位的核苷酸序列、包含能仅在传感器部位结合了RNA时稳定地形成捕捉Mg2+离子的空洞的区域的核苷酸序列、及包含与目标RNA的切断部位周围的序列互补的区域的核苷酸序列。本发明的核酶同样可以通过搭载于适当的载体而导入对象植物中。
进而另外，抑制酪氨酸磷酸酶基因的抗体是指阻碍或抑制由酪氨酸磷酸酶基因所编码的酪氨酸磷酸酶的抗体或其功能片段。作为针对酪氨酸磷酸酶的抗体，可列举单克隆抗体、重组产生抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体及合成抗体。另外，作为该抗体的功能片段，包含Fab片段、F(ab’)2片段、scFv等。另外，抗体的类、亚类可以是任意类型。例如，作为抗体的类，包含IgG,IgM,IgE,IgD,IgA，作为亚类，包含IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2。抗体另外还可以通过PEG化、乙酰化、糖基化、酰胺化等而被衍生物化。
另一方面，本发明中使酪氨酸磷酸酶基因的表达量增加，与使由酪氨酸磷酸酶基因所编码的酪氨酸磷酸酶的活性在植物内增强是同义的。作为使酪氨酸磷酸酶基因的表达量增加的原理，可列举例如，将该基因以能表达的方式导入、使该基因的转录量增强、使该基因的翻译量增强、抑制该基因的表达产物(蛋白质)的分解等。更具体地，作为使基因的表达增加的方法，可列举将位于启动子的下游的酪氨酸磷酸酶基因导入植物的方法、及改变内在的酪氨酸磷酸酶基因的表达控制区的方法。
这里，在导入酪氨酸磷酸酶基因的情况下，既可以将该基因以整合到染色体中的形式导入，也可以以搭载于表达载体的形式导入。但是，为了使导入的基因稳定地表达，优选以通过恒常表达启动子而表达被增强的形式导入染色体。
另外，表达控制区是包含RNA聚合酶所结合的启动子区域及其他转录因子所结合的区域的含义。作为转录控制区的改变，可列举将内在的转录控制区中的例如启动子区域替换成能更高表达的启动子区域这样的改变。
表达载体以包含能在植物体内表达的启动子、和上述的酪氨酸磷酸酶基因的方式构建。作为成为表达载体的母体的载体，可以使用现有公知的各种载体。例如，质粒、噬菌体、或粘粒等，可以根据被导入的植物细胞和/或导入方法来适宜选择性。具体可列举例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系的载体等。特别是在对植物体的载体的导入法是使用农杆菌的方法的情况下，优选使用pBI系的双元载体。作为pBI系的双元载体，具体可列举例如，pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
启动子只要是能够在植物体内使酪氨酸磷酸酶基因表达的启动子就不特别限定，优选可以使用公知的启动子。作为该启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、烟草的PR1a基因启动子、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因启动子、Napin(油菜籽蛋白)基因启动子等。其中，更优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。如果使用上述各启动子，则可以在导入植物细胞内时使酪氨酸磷酸酶基因恒常地强表达。
另外，作为启动子，还可以使用具有在植物中部位特异性地表达的功能的启动子。作为这样的启动子，可以使用现有公知的任何启动子。使用这样的启动子，还可以使酪氨酸磷酸酶基因部位特异性地表达。
此外，表达载体中除了启动子、酪氨酸磷酸酶基因之外，还可以进一步包含其他DNA片段。对该其他DNA片段不特别限定，可列举终止子、选择标志物、内含子、用于提高翻译效率的碱基序列等。另外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区域。T-DNA区域特别是在使用农杆菌将上述重组表达载体导入植物体的情况下可以提高基因导入的效率。
转录终止子只要具有作为转录终止部位的功能就不特别限定，可以是公知的转录终止子。例如，具体地，可以优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中可以更优选使用Nos终止子。通过在上述重组载体中将转录终止子配置在适当的位置，从而可以防止在导入植物细胞中之后，合成不必要地长的转录物、强力的启动子使转录物的拷贝数减少这样的现象发生。
作为转化体选择标志物，可以使用例如抗药性基因。作为该抗药性基因的具体例，可列举针对潮霉素、博来霉素、卡那毒素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性基因。由此，通过选择在包含上述抗生素的培养基中生长发育的植物体，从而可以容易地挑选被转化的植物体。
作为用于提高翻译效率的碱基序列，可列举例如来源于烟草花叶病病毒的omega序列。通过将该omega序列配置于启动子的非翻译区(5’UTR)，可以提高上述融合基因的翻译效率。这样，上述重组表达载体中可以根据其目的包含各种DNA片段。
对于重组表达载体的构建方法不特别限定，只要在适宜选择的成为母体的载体中以规定的顺序导入上述启动子、酪氨酸磷酸酶基因、以及根据需要的上述其他DNA片段即可。例如，将酪氨酸磷酸酶基因与启动子以及(根据需要的转录终止子等)连接而构建表达盒，将其导入载体即可。表达盒的构建中，例如，将各DNA片段的切断部位制成彼此互补的突出末端，通过用连接酶使其反应，从而可以规定该DNA片段的顺序。此外，在表达盒包含终止子的情况下，从上游起形成启动子、酪氨酸磷酸酶基因、终止子的顺序即可。另外，对于用于构建表达载体的试剂类、即限制性酶和/或连接酶等的种类也不特别限定，可以适宜选择使用市售品。
另外，对上述表达载体的扩增方法(生产方法)也不特别限定，可以使用现有公知的方法。一般以大肠杆菌为宿主使其在该大肠杆菌内扩增即可。此时，也可以根据载体的种类，选择优选的大肠杆菌的种类。
上述的表达载体可通过一般的转化方法导入对象的植物内。对将表达载体导入植物细胞的方法(转化方法)不特别限定，可以使用适应植物细胞的适当的现有公知的方法。具体地，可使用例如，利用农杆菌的方法和/或直接导入植物细胞中的方法。作为利用农杆菌的方法，可以使用例如，Bechtold,E.,Ellis,J.and Pelletier,G.(1993)In PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisplants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie,316,1194-1199.或者Zyprian E,KadoCl,Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectorsin conjunction with a high-copy vir region helper plasmid.Plant MolecularBiology,1990,15(2),245-256.所记载的方法。
作为将表达载体直接导入植物细胞中的方法，可使用例如，显微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。
另外，如果采用将DNA直接导入植物细胞中的方法，则只要包含作为对象的基因的表达所需的转录单元、例如启动子和/或转录终止子、以及作为对象的基因的DNA即可，载体功能并非必须。进而，即使是不具有转录单元、仅包含作为对象的基因的蛋白质编码区的DNA，只要是能整合到宿主的转录单元内、表达成为对象的基因即可。
作为导入了所述表达载体、和/或不含表达载体但包含成为对象的基因的表达盒的植物细胞，可列举例如，花、叶、根等植物器官中的各组织的细胞、愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里，表达载体可以根据要生产的种类的植物体来适宜构建适当的表达载体，也可以预先构建通用的表达载体，将其导入植物细胞中。
如上，通过使对象植物内的酪氨酸磷酸酶基因的表达量改变(增加或减少)，从而植物内的酪氨酸磷酸酶活性改变。由此，该植物可以获得对高盐浓度的耐性这样的环境胁迫耐性。
＜酪氨酸磷酸酶基因＞
在本发明中，使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，是以At1g71860特定的基因(简称为At1g71860基因)及被评价为与At1g71860基因在功能上等价或同等的基因。被评价为与At1g71860基因在功能上等价或同等的基因群，例如可以通过使用SALAD数据库来检索·鉴定。
作为一例，At1g71860基因的编码区的碱基序列示于序列号1，由At1g71860基因所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号2。对上述在功能上等价的基因不特别限定，可以通过检索储存了关于各种生物的基因序列的数据库来特定。即，可以以序列号1所示的碱基序列或序列号2所示的氨基酸序列作为查询(Query)序列，检索例如DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库、SWISS-PROT数据库，从公知的数据库容易地检索·鉴定。
此外，在本发明中，作为使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，不限于由如上所述的序列号1所示的碱基序列及序列号2所示的氨基酸序列所特定的基因。即，作为使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，也可以是编码包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入了1个或多个氨基酸序列的氨基酸序列，且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质的基因。这里，作为多个氨基酸，是指例如，1～20个、优选为1～10个、更优选为1～7个、进而优选为1个～5个、特别优选为1个～3个。此外，氨基酸的缺失、替换或添加可以通过用该技术领域公知的方法改变所述酪氨酸磷酸酶基因的碱基序列来进行。为了在碱基序列中导入突变，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法(缺口双链体法)等公知方法或依据公知方法的方法来进行，例如使用利用了定点突变法的突变导入用试剂盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均为商品名、TAKARA Bio社制))等，或者使用LA PCR in vitroMutagenesis系列试剂盒(商品名、TAKARA Bio社制)来导入突变。另外，作为突变导入方法，可以是使用以EMS(甲基磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表那样的化学诱变剂的方法，还可以是利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表那样的放射线处理和/或紫外线处理的方法。
另外，作为使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，还可以是由序列号1所示的碱基序列及序列号2所示的氨基酸序列所特定的At1g71860基因的同源基因。这里，同源基因一般是指由共同的祖先基因趋异进化而得的基因，其含义包括2种物种的同源基因(直向同源物(ortholog))和由同一物种内的反复趋异进化产生的同源基因(旁系同源物(paralog))。换言之，上述“在功能上等价的基因”的含义包括直向同源物、旁系同源物等的同源基因。但上述“在功能上等价的基因”还包括不由共同基因进化、而仅仅具有类似的功能的基因。
进而，作为使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，还可以是编码具有与序列号2所示的氨基酸序列的相似性(Similarity)或同一性(identity)例如为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的氨基酸序列，且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质的基因。这里，相似性的值是指使用安装了BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。
进而另外，作为使表达量改变的酪氨酸磷酸酶基因，还可以是包含与包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸的至少一部分或全部在严格条件下杂交的多核苷酸，且编码具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质的基因。这里，严格条件是指形成所谓特异性的杂种、不形成非特异性的杂种的条件。例如，可列举在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下进行杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下进行洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下进行杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下进行洗涤。杂交可以按照J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Ed.(分子克隆实验指南第二版),Cold Spring HarborLaboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。
特别在使酪氨酸磷酸酶基因的表达量增加的情况下，优选制成以能够在氧化条件下维持活性的方式进行了改变的突变型酪氨酸磷酸酶基因。这里所说的氧化条件下包含氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢存在的条件下。这些氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢将酪氨酸磷酸酶氧化而使其失活。另外，这里所说的突变型酪氨酸磷酸酶基因，是编码对氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢为低敏感性的酪氨酸磷酸酶的基因。
例如，作为突变型酪氨酸磷酸酶基因，可列举编码序列号2所示的氨基酸序列中的第175位的半胱氨酸残基被替换为其他氨基酸、变为对氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢低敏感性的酪氨酸磷酸酶的基因。作为对于第175位的半胱氨酸残基替换后的氨基酸，只要使对氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢的敏感性降低就不特别限定，可列举例如丝氨酸。即，将序列号2所示的氨基酸序列中的第175位的半胱氨酸替换为丝氨酸后的酪氨酸磷酸酶获得了对氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢为低敏感性这样的特征。
这样，也可以通过导入以能够在氧化条件下维持活性的方式进行了改变的突变型酪氨酸磷酸酶基因，来使酪氨酸磷酸酶基因的表达量增加。在导入以能够在氧化条件下维持活性的方式进行了改变的突变型酪氨酸磷酸酶基因的情况下，与导入野生型酪氨酸磷酸酶基因的情况相比，可以进一步提高环境胁迫耐性。换言之，在使用以能够在氧化条件下维持活性的方式进行了改变的突变型酪氨酸磷酸酶基因的情况下，与使用野生型酪氨酸磷酸酶基因的情况相比，即使表达量的增加程度低，也可以期待环境胁迫耐性提高效果。
作为成为改变如上的特定的酪氨酸磷酸酶基因的表达量的对象的植物、换言之作为使环境胁迫耐性提高的植物，不特别限定。即，通过改变上述的酪氨酸磷酸酶基因的表达量，可以对于所有植物体期待环境胁迫耐性提高效果。作为成为对象的植物，可列举例如，双子叶植物、单子叶植物，例如，属于十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参考下述)，但并不限于这些植物。
十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa、Brassicanapus、Brassica campestris)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、大白菜(Brassica rapa var.pekinensis)、青梗菜(Brassica rapa var.chinensis)、芜青(Brassica rapa var.rapa)、野泽菜(Brassica rapa var.hakabura)、日本芜青(Brassica rapa var.lancinifolia)、小松菜(Brassica rapa var.peruviridis)、小白菜(パクチョイ，Brassica rapa var.chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。
茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneum tuberosum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)、矮牵牛(Petunia)等。
豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脉根(Lotus corniculatus var.japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合欢(Acacia)等。
菊科：菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。
棕榈科：油棕(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)等。
漆树科：野漆树(Rhus succedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)等。
葫芦科：南瓜(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、黄瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda)等。
蔷薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)等。
石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。
杨柳科：杨(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)等。
禾本科：玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、沙生蔗茅(Erianthus ravenae)、条芒(芒)(Miscanthus virgatum)、高粱属(Sorghum)、黍属(Panicum)等。
百合科：郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。
其中，优选以甘蔗和/或玉米、油菜籽、向日葵等能够作为生物燃料的原料的能量作物为对象。这是因为，通过使能量作物的环境胁迫耐性提高，可以大幅扩展该能量作物的栽培范围和/或栽培条件。即，即使在野生型不能栽培的土地和/或环境要素下(例如平均气温、和/或土壤所含的盐浓度等)，也能够栽培能量作物，可以实现生物乙醇、生物柴油、生物甲醇、生物DME、生物GTL(BTL)和生物丁醇等生物燃料的低成本化。
＜其他工序、其他方法＞
进行了上述使酪氨酸磷酸酶基因的表达量变化的改变之后，按照现有公知的方法进行从植物体中挑选具有适当的表型的个体的筛选工序。对挑选的方法不特别限定，例如，可以在培育出进行了改变的植物体后，挑选植物体本身、或任意器官和/或组织中的环境胁迫耐性有意义地提高了的植物体。
另外，可以从所得的植物体按照常规方法获得后代植物。通过以其环境胁迫耐性为基准来挑选保持了上述酪氨酸磷酸酶基因的表达量改变的性状的植物体，来制作通过具有上述性状而环境胁迫耐性提高了的稳定的植物系统。此外，还可以从所得的植物体和/或其后代植物获得植物细胞和/或种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、扦插枝、块等繁殖材料，以它们为基础根据具有上述性状来大量生产环境胁迫耐性提高了的稳定的植物系统
此外，本发明中的植物体是指包含长成的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子的至少任一者的植物体。即，在本发明中，只要是最终能生长成植物个体的状态即全部可看作是植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所述植物细胞，包含例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞增殖、分化可以获得植物体。此外，由植物细胞再生植物体可以根据植物细胞的种类使用现有公知的方法来进行。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于这些实施例。
〔实施例1〕
(1)拟南芥的酪氨酸磷酸酶(PTP)基因的选择
在本实施例中，作为拟南芥中的酪氨酸磷酸酶基因，选择由AGI编码:At1g71860所特定的基因。此外，关于该At1g71860，在Plant Cell,10,849-857,1998中作为具有通过高盐浓度处理而表达增强的特征的基因而已知。在本实施例中，对于抑制了At1g71860基因的突变体研究高盐浓度条件中的生长发育可能性。
此外，At1g71860基因的编码区的碱基序列示于序列号1，由该基因所编码的酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列示于序列号2。
(2)拟南芥的T-DNA标签系
在选择的At1g71860基因中插入了T-DNA的拟南芥T-DNA插入突变体，使用从Nottingham Arabidopsis Stock Centre(http://nasc.nott.ac.uk/)获得的SALK_118658和SALK_062441。
(3)T-DNA插入位置和同型系(ホモライン)的确认
SALK_118658在At1g71860基因的第4外显子中插入了T-DNA，SALK_062441在第7内含子中插入了T-DNA，分别命名为atptp1-1突变体、atptp1-2突变体。从atptp1-1突变体、atptp1-2突变体和野生型拟南芥(Col)的植物体中提取基因组DNA。
对于atptp1-1突变体，用于检出插入了T-DNA的边界区域的引物使用5’-TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3’(PL11：序列号3)及5’-CAACCAATCGAGTGAGCATC-3’(p3：序列号4)，用于检出At1g71860基因的引物使用5’-CAGTGGCTATGAACAGTGTC-3’(p5：序列号5)及p3(图1)。对于atptp1-2突变体，用于检出插入了T-DNA的边界区域的引物使用5’-ACAGAGGATCAGCCCATGTC-3’(p6：序列号6)及PL11，用于检出At1g71860基因的引物使用p6及5’-TTAGGAACTCGTTCCAGCATTTG-3’(p2：序列号7)(图1)。作为对照，对于Col也使用上述的引物组进行PCR。PCR对于任一引物组均以1个循环的94℃(3分钟)、然后25个循环的94℃(30秒)、58℃(1分钟)及72℃(1分钟)进行反应。
在任一突变体中插入了T-DNA的边界区域均被扩增，与此相对，At1g71860基因不被扩增(由于插入基因大至5kb以上，因而在该条件下不能检出)。在Col中确认了At1g71860基因的正常扩增。由这些带图案判断，这些突变体中T-DNA同型地插入到At1g71860基因中(图2)。
(4)Col和atptp1突变体中的At1g71860基因表达量的比较
从在琼脂培养基(1/2MS、和光纯药工业社制ムラシゲ·スクーグ培养基用混合盐类(Murashige and Skoog Plant Salt Mixture)、pH5.7、蔗糖浓度1％、琼脂0.7％)中生长发育14天的植物体的全地上部提取总RNA。通过RT-QuantiTect Reverse Transcription kit(QIAGEN社制)由1μg的总RNA制备cDNA，在检测At1g71860基因的情况下稀释4倍、在检测18SrRNA(AGI编码:At3g41768.1)的情况下稀释1000倍，然后进行实时PCR(Applied Biosystems社制、Applied Biosystems7500Real-Time PCRSystem)。用于检出表达基因的反应液包含稀释后的cDNA2μl，20μM正向和反向引物各1μl，Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems社制)12μl，调制成总体积为24μl。引物针对At1g71860基因使用5’-GTCCTTTACCACACACGATGGA-3’(序列号8)及5’-TTGGGCAATGCTGCTGAA-3’(序列号9)、针对18S rRNA使用5’-TCCTAGTAAGCGCGAGTCATC-3’(序列号10)及5’-CGAACACTTCACCGGATCAT-3’(序列号11)。PCR以1个循环的50℃(2分钟)及95℃(10分钟)、然后40个循环的95℃(15秒)及60℃(1分钟)进行反应。
结果在将各系中的At1g71860基因的表达用18S rRNA的表达规格化之后，用以Col中的表达为1时的相对表达量显示(图3)。由与Col中的表达水平的差而考虑，atptp1-1突变体是敲除系、atptp1-2突变体是敲低系。
(5)对拟南芥的atptp1突变体的耐盐性试验
将所述(4)中考虑为敲除系的atptp1-1突变体、考虑为敲低系的atptp1-2突变体及作为对照的非重组野生型Col的种子无菌接种于包含0、125、137.5mM NaCl的1/2MS琼脂培养基中。将其在22℃、16小时光周期8小时暗周期、光强度约30～45μE/cm2的条件下培养21天，进行耐盐性试验。
作为耐盐性试验结果，将Col、atptp1-1突变体及atptp1-2突变体的板的拍摄照片示于图4～6。由图5及6可以明确，atptp1-1突变体及atptp1-2突变体与Col相比，对NaCl的耐性提高了。
由以上结果在本实施例中可以得到如下见解：通过抑制At1g71860基因，能够赋予对高盐浓度的耐性。
〔实施例2〕
在本实施例中，制作At1g71860基因的过表达体及突变型At1g71860基因的过表达体，与实施例1同样地研究高盐浓度条件中的生长发育可能性。此外，本实施例中制作的突变型At1g71860基因，是编码具有序列号2所示的氨基酸序列中的第175位的半胱氨酸替换为丝氨酸的氨基酸序列、对氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢为低敏感性的酪氨酸磷酸酶的基因。
(1)At1g71860基因的过表达体
从Col中通过以下步骤克隆包含At1g71860基因的核酸片段。
首先，从Col使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen社制)回收总RNA。用DNaseI(Invitrogen社制)消化基因组DNA，然后从5μg的总RNA使用StrataScript First Strand cDNA Synthesis System(Stratagene社制)制备cDNA。以该cDNA为模板使用添加了XbaI或SacI位点的引物、5’-TCTAGAATGGCGACCGGTAAAACCTC-3’(序列号12)及5’-GAGCTCTTAGGAACTCGTTCCAGCAT-3’(序列号13)进行PCR。通过本PCR，包含At1g71860基因的cDNA的核酸片段被扩增。
接着，将用PCR扩增而得的核酸片段克隆到pGEM-T Easy载体(Promega社制)的XbaI/SacI位点。进而，将At1g71860基因的全长cDNA以在来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制下表达的方式与双元载体pBI121的γ-葡糖醛酸糖苷酶基因置换。
接着，将所得的构建体通过农杆菌法导入Col中而制作过表达体。将所得的At1g71860基因的过表达体命名为35S-AtPTP1。
(2)突变型At1g71860基因的过表达体
包含突变型At1g71860基因的核酸片段，通过以上述(1)中制作的At1g71860基因的cDNA为模板的PCR来制作。具体地，该PCR中，使用为了将由At1g71860基因所编码的蛋白质的第175位的半胱氨酸(TGC)替换为丝氨酸(TCC)而设计的一对引物5’-GACTGTTAAATCCGGGGACTATTTTCAA-3’(序列号14)及5’-AATAGTCCCCGGATTTAACAGTCCTATT-3’(序列号15)。
将通过PCR扩增而得的突变型At1g71860基因的cDNA克隆到pGEM-T Easy载体(Promega社制)中。进而，将突变型At1g71860基因的全长cDNA以在来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制下表达的方式与双元载体pBI121的γ-葡糖醛酸糖苷酶基因置换。
接着，将所得的构建体通过农杆菌法导入Col中制作过表达体。将所得的突变型At1g71860基因的过表达体命名为35S-AtPTP1(C175S)。
此外，由该突变型At1g71860基因所编码的酪氨酸磷酸酶中，序列号2所示的氨基酸序列中的第175位的半胱氨酸替换为了丝氨酸。关于该替换突变，如冈山县生物科学综合研究所、平成19年研究年报、第99-103页及第49回日本植物生理学会年会要旨集、第193页(3aD10)所记载的那样，已知在氧化型谷胱甘肽和/或过氧化氢存在下这样的氧化条件下维持酪氨酸磷酸酶活性。
(3)各过表达体中的At1g71860基因表达量的比较
与实施例1(4)同样地，通过实时PCR法来测得At1g71860基因的表达量。其结果示于图7。此外，图7中，也将At1g71860基因的表达用18S rRNA的表达规格化之后，以Col中的表达为1时的相对表达量显示。如图7所示可知，上述(1)中制作的过表达体及上述(2)中制作的过表达体均与野生型中的At1g71860基因的表达量相比，分别At1g71860基因及突变型At1g71860基因的表达量高。
特别地，可知上述(1)中制作的At1g71860基因的过表达体6-2，与过表达体5-1相比At1g71860基因的表达量高。另外，可知上述(2)中制作的突变型At1g71860基因的过表达体1-3，与过表达体2-4相比突变型At1g71860基因的表达量高。进而，可知上述(2)中制作的At1g71860基因的过表达体1-3及2-4，与所述(1)中制作的过表达体5-1及6-2中的At1g71860基因的表达量相比，At1g71860基因的表达量低。
(4)对各过表达体的耐盐性试验
使用上述(1)中制作的过表达体及上述(2)中制作的过表达体，与实施例1(5)同样地进行耐盐性试验。耐盐性试验结果示于图8。图8的左侧是At1g71860基因的过表达体和野生型拟南芥(Col)的板的拍摄照片，图8的右侧是突变型At1g71860基因的过表达体和野生型拟南芥(Col)的板的拍摄照片。
如由图8可判断的那样，明确了At1g71860基因的过表达体及突变型At1g71860基因的过表达体，与野生型拟南芥(Col)相比，对盐的耐性均提高了。另外，如图8的左侧所示，判断过表达体6-2与过表达体5-1相比耐盐性更加优异。这启示，与At1g71860基因的表达量的增加程度(图7)相关，如果At1g71860基因的表达量更大地增加，则可以获得更优异的耐盐性。进而，如图8的右侧所示，判断过表达体1-3与过表达体2-4相比，耐盐性更加优异。这启示，与突变型At1g71860基因的表达量的增加程度(图7)相关，如果突变型At1g71860基因的表达量更大地增加，则可以获得更优异的耐盐性。
此外，上述(2)中制作的过表达体中的At1g71860基因的表达量如图7所示，与上诉(1)中制作的过表达体中的At1g71860基因的表达量相比较低。尽管如此，但上述(2)中制作的过表达体如图8所示，与上述(1)中制作的过表达体显示同等的耐盐性。由该结果明确了，为了对植物赋予耐盐性，优选使导入了在氧化条件下维持活性那样的突变的At1g71860基因过表达。
本说明书所引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考引入本说明书中。

Claims (14)

1.对植物赋予环境胁迫耐性的方法，其特征在于，使At1g71860基因或与该基因在功能上等价的基因的表达量改变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，抑制所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因的表达量增加。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，其特征在于，所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的基因，
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质，
(c)由与包含序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码、且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质。
5.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，其特征在于，所述在功能上等价的基因是来源于除拟南芥以外的生物的酪氨酸磷酸酶基因。
6.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，其特征在于，所述环境胁迫是高盐浓度胁迫。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述At1g71860基因是编码突变型酪氨酸磷酸酶的基因，并且导入该编码突变型酪氨酸磷酸酶的基因，所述突变型酪氨酸磷酸酶被导入了在氧化条件下维持磷酸酶活性的突变。
8.植物体的制造方法，包括：
准备改变了At1g71860基因或与该基因在功能上等价的基因的表达量的植物体的工序；和
评价所述植物体的环境胁迫耐性，挑选该环境胁迫耐性有意义地提高了的系统的工序。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物体是抑制了所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因的植物体。
10.根据权利要求8所述的制造方法，其特征在于，使所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因的表达量增加。
11.根据权利要求8～10的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述At1g71860基因及与该基因在功能上等价的基因是编码以下(a)～(c)的任一蛋白质的基因，
(a)包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、替换、添加或插入了1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质，
(c)由与包含序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码、且具有酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质。
12.根据权利要求8～10的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述在功能上等价的基因是来源于除拟南芥以外的生物的酪氨酸磷酸酶基因。
13.根据权利要求8～10的任一项所述的制造方法，其特征在于，所述环境胁迫是高盐浓度胁迫。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述At1g71860基因是编码突变型酪氨酸磷酸酶的基因，所述植物体是导入了该编码突变型酪氨酸磷酸酶的基因的植物体，所述突变型酪氨酸磷酸酶被导入了在氧化条件下维持磷酸酶活性的突变。
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