BR112014009655B1 - processo para produção de uma composição de glicosil stevia altamente purificada - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO DE GLICOSIL STEVIA. Trata-se de composições de glicosil stevia que são preparadas a partir de glicosídeos de esteviol de Stevia rebaudiana Bertoni. A glicosilação foi executada por ciclodextrina glucanotransferase com o uso do amido como fonte de resíduos de glicose. As composições compreendem principalmente derivados de glicosil com características de sabor superiores e podem ser usadas como intensificadores de doçura, intensificadores de sabor e adoçantes em alimentos, bebidas, cosméticos e produtos farmacêuticos.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[001]A invenção refere-se a um processo para a produção de um ingrediente alimentício altamente purificado a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e seu uso em diversos produtos alimentícios e bebidas.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[002]Atualmente, as alternativas de açúcar estão recebendo atenção crescente devido ao conhecimento de muitas doenças em conjunto com o consumo de bebidas e alimentos com alto teor de açúcar. No entanto, muitos adoçantes artificiais como dulcina, ciclamato de sódio e sacarina foram proibidos ou limitados em alguns países devido a preocupações sobre sua segurança. Portanto, os adoçantes não calóricos de origem natural estão se tornando cada vez mais populares. A erva doce Stevia rebaudiana Bertoni produz uma série de diterpeno glicosídeos que apresentam propriedades sensoriais e doçura de alta intensidade superiores àquelas de muitos outros adoçantes com alta potência.
[003]Os glicosídeos doces mencionados acima têm um aglicona comum, esteviol, e se diferem pelo número e tipo de resíduos de carboidrato nas posições C13 e C19. As folhas de Stevia são capazes de acumular até 10 a 20% (em base de peso seco) de glicosídeos de esteviol. Os principais glicosídeos encontrados em folhas de Stevia são rebaudiosídeo A (2 a 10%), esteviosídeo (2 a 10%) e rebaudiosídeo C (1 a 2%). Outros glicosídeos, tais como rebaudiosídeo B, D, E e F, esteviolbiosídeo e rubusosídeo são encontrados em níveis muito menores (aproximadamente 0 a 0,2%).
[004]Dois glicosídeos principais - esteviosídeo e rebaudiosídeo A, foram extensivamente estudados e caracterizados em termos de sua adequação como adoçantes de alta intensidade comerciais. Os estudos de estabilidade em bebidas carbonadas confirmaram sua estabilidade em calor e pH (Chang S.S., Cook, J.M. (1983) Stability studies of stevioside and rebaudioside A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31 : 409-412).
[005]Os glicosídeos de esteviol se diferem um do outro não somente pela estrutura molecular, mas também por suas propriedades de sabor. Usualmente, acredita-se que o esteviosídeo seja 110 a 270 vezes mais doce do que sucrose, rebaudiosídeo A entre 150 a 320 vezes e rebaudiosídeo C entre 40 a 60 vezes mais doce do que sucrose. O dulcosídeo A é 30 vezes mais doce do que sucrose. O rebaudiosídeo A tem o retrogosto menos adstringente, menos amargo e menos persistente, possuindo, deste modo, os atributos sensoriais mais favoráveis na maioria dos glicosídeos de esteviol (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweetners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips K.C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. Em: Grenby T.H. ed. Developments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, Londres. 1 -43).
[006]Os métodos para a extração e purificação de glicosídeos doces a partir da planta Stevia rebaudiana com o uso de água ou solventes orgânicos são descritos, por exemplo, nas patentes nos. U.S. 4.361.697; 4.082.858; 4.892.938; 5.972.120; 5.962.678; 7.838.044 e 7.862.845.
[007]No entanto, mesmo em um estado altamente purificado, os glicosídeos de esteviol ainda possuem atributos de gosto indesejável, tais como amargura, retrogosto doce, sabor de alcaçuz, etc. Um dos principais obstáculos para a comercialização bem sucedida de adoçantes de stevia consiste nestes atributos de gosto indesejáveis. Foi mostrado que estas notas de sabor se tornam mais proeminentes à medida que a concentração de glicosídeos de esteviol aumenta (Prakash I., DuBois G.E., Clos J.F., Wilkens K.L., Fosdick L.E. (2008) Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82).
[008]Algumas destas propriedades indesejáveis podem ser reduzidas ou eliminadas submetendo-se os glicosídeos de esteviol à reação de transglicosilação intermodular, quando novos resíduos de carboidrato são fixados á molécula inicial em porções glicosídicas ligadas às posições C13 e C19 de esteviol. Dependendo do número de resíduos de carboidrato nestas posições, a qualidade e potência do gosto dos compostos irão varias.
[009]Pululanase, isomaltase (Lobov S.V., Jasai R., Ohtani K., Tanaka O. Yamasaki K. (1991) Enzymatic production of sweet stevioside derivatives: transglycosylation by glucosidases. Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965), β-galactosidase (Kitahata S., Ishikawa S., Miyata T., Tanaka O. (1989) Production of rubusoside derivatives by transglycosylation of various β-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 2923-2928) e dextrano sacarase (Yamamoto K., Yoshikawa K., Okada S. (1994) Effective production of glucosyl-stevioside by α-1,6-transglucosylation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) têm sido usados como enzimas de transglicosilação, em conjunto com pululano, maltose, lactose e amido parcialmente hidrolisado, respectivamente, como doadores de resíduos glucosídicos.
[010]A transglicosilação de glicosídeos de esteviol também foi executada pela ação de ciclodextrina glucanotransferases (CGTase) produzidas por Bacillus stea- rothermophilus (patentes nos. U.S. 4.219.571 e 7.807.206), como consequência, derivados de α-1,4-gIicosil foram formados com grau de polimerização de até 10.
[011]Deve ser observado que, no processo mencionado acima, a α-1,4- glicosilação ocorre em porções glicosídicas ligadas à posição C13 e C19 de esteviol. Por outro lado, foi descrito por Fukunaga et al. (1989) que os derivados com resíduos de α-1,4-glicosil na posição C13 de esteviol possuem características de gosto superiores em comparação com aqueles com porções α-1,4-glicosil fixadas à posição C19 de esteviol. (Fukunaga Y., Miyata T., Nakayasu N., Mizutani K., Kasai R., Tanaka O. (1989) Enzymic Transglucosylation Products of Stevioside: Separation and Sweetness-evaluation, Agric. Biol. Chm., 53 (6), 1603- 1607).
[012]Também deve ser observado que dois glicosídeos de esteviol de ocorrência natural, ou seja, esteviolbiosídeo (CAS No. 41093-60-1) e rebaudiosídeo B (CAS No. 58543-17-2) não têm porções glicosídicas fixadas à posição C19. Portanto, sua α- 1,4-glicosilação irá produzir exclusivamente derivados com resíduos de α-1,4-glicosil fixados a porções carboidrato da posição C13 de esteviol. No entanto, um processo comercialmente viável para a produção de tais derivados não está disponível devido à baixa solubilidade de esteviolbiosídeo e rebaudiosídeo B (reb B).
[013]Além disso, nenhuma informação sobre propriedades de gosto e funcionalidade de esteviolbiosídeo e reb B α-1,4-glicosilados está disponível.
[014]Portanto, para fornecer um glicosil stevia com a melhor combinação de potência de doçura e perfil de sabor, é necessário desenvolver produtos de glicosil stevia altamente purificados que contêm derivados com as características de gosto mais desejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[015]A presente invenção tem como objetivo superar as desvantagens de adoçantes de Stevia existentes. A invenção descreve um processo para a produção de um ingrediente alimentício de alta pureza a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e o uso do mesmo em diversos produtos alimentícios e bebidas como um modificador de sabor e doçura.
[016]A invenção, em parte, se refere a um ingrediente que compreende derivados glicosilados de glicosídeos de esteviol da planta Stevia rebaudiana Bertoni. Os glicosídeos de esteviol são selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo B, esteviolbiosídeo, esteviolmonosídeo, assim como outros glicosídeos de esteviol encontrados em planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas da mesma.
[017]A invenção, em parte, se refere a um processo para a produção de um ingrediente que contém formas glicosiladas de rebaudiosídeo B, esteviolbiosídeo, es- teviolmonosídeo, assim como outros glicosídeos de esteviol encontrados em planta Stevia rebaudiana Bertoni. O processo pode ser um processo de transglicosilação enzimática com o uso de CGTases produzidas por culturas de Bacillus stearother- mophilus. O processo também pode ter uma etapa de tratamento enzimático pós- transglicosilação com o uso de diversas glucosidases. O processo também pode ter as etapas de descolorir, dessalinizar e remover dextrinas e diversas impurezas. A descoloração pode ser executada com o uso de carbono ativado. A dessalinização pode ser executada passando-se através de filtros de membrana e/ou resinas de troca iônica. A remoção das dextrinas e impurezas pode ser executada passando-se através de resina polimérica macroporosa.
[018]Na invenção, esteviolbiosídeo ou reb B comercializado por PureCircle Sdn. Bhd. (Malásia), com pureza de ao menos 95%, foi usado como um material de partida. Alternativamente, os materiais de partida com teor e razão diferentes de esteviolbiosídeo, reb B e/ou outros glicosídeos de esteviol também podem ser usados.
[019]O material de partida foi convertido em forma livremente solúvel e, então, submetido à transglicosilação enzimática pela ação de ciclodextrina glicosiltransfera- se (CGTase) na presença de amido como um doador de glicose. Como consequência disto, derivados de α-1,4-glicosil (C13) de glicosídeo de esteviol inicial foram formados.
[020]O glicosídeo de esteviol não reagido foi precipitado a partir da mistura de reação, enquanto que as outras impurezas foram removidas por resina Amberlite XAD7 HP e, então, a mistura de reação purificada foi descolorida, concentrada e seca por aspersão.
[021]Os produtos obtidos foram aplicados em diversos alimentos e bebidas como adoçantes, intensificadores de adoçante e modificadores de sabor, que incluem sorvete, biscoitos, pão, sucos de fruta, produtos lácteos, produtos assados e produtos de confeitaria.
[022]Deve-se compreender que tanto a descrição geral mencionada anteriormente como a seguinte descrição detalhada são exemplificadoras e explicativas e se destinam a fornecer explicação adicional da invenção conforme reivindicado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[023]As Figuras 1a e 1b mostram a estrutura de reb B e esteviolbiosídeo.
[024]A Figura 2 mostra a cromatografia HPLC da mistura de reação contendo reb B e seus derivados de glicosil após a etapa de glicosilação.
[025]A Figura 3 mostra a cromatografia HPLC da mistura de reação após a etapa de precipitação de reb B residual.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[026]As vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada dada mais adiante nesse documento. No entanto, deve-se compreender que a descrição detalhada e exemplos específicos, embora indiquem as modalidades preferidas da invenção, são dados a título de ilustração somente, uma vez que diversas mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para os elementos versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
[027] Em uma modalidade da presente invenção, reb B altamente purificado comercializado por PureCircle Sdn. Bhd. (Malásia), contendo reb B (>95%), reb A (<5%) e outros glicosídeos que equivalem ao teor de glicosídeos de esteviol total de ao menos 97%, foi usado como um material de partida. Alternativamente, os materiais de partida com teor e razão diferentes de esteviolbiosídeo, reb B e/ou outros glicosídeos de esteviol também podem ser usados.
[028] A análise HPLC dos produtos e matérias-primas foi executada em equipamento de cromatografia líquida Agilent Technologies 1200 Series (EUA), equipado com coluna Zorbax-NH2 (4,6X250mm). A fase móvel consistiu no gradiente de ace- tonitrila-água a partir de 70:30, volume/volume (0 a 2 min.) a 50:50, volume/volume (2 a 70 min.). Um detector de arranjo de diodo ajustado em 210 nm foi usado como o detector.
[029]Mais adiante nesse documento, os termos que descrevem a solubilidade de material, tal como "ligeiramente solúvel", "livremente solúvel", etc., são dados de acordo com as definições fornecidas em FAO JECFA Monographs 1 (2006), Combined Compendium of Food Additive Specifications, vol. 4, página 41.
[030]Devido ao fato de que reb B (e esteviolbiosídeo) é ligeiramente solúvel em água, não é possível introduzir o mesmo à mistura de reação "tal como é". Portanto, o reb B é convertido para a forma livremente solúvel. Reb B é suspenso em 1 a 3 volumes, de preferência, em 1,2 a 1,6 volumes de água. A suspensão é aquecida a 50 a 100°C, de preferência, 60 a 90°C, sob agitação contínua. NaOH é adicionado à suspensão para alcançar um valor de pH de cerca de 6,0 a 9,0, de preferência, 7,0 a 8,0. Alternativamente, KOH ou outras bases alcalinas podem ser usadas. A adição de álcali assegura a dissolução completa de reb B (e esteviolbiosídeo), o qual, de outro modo, é quase insolúvel em água mesmo em temperaturas que excedem 100°C. Após a dissolução completa, a solução obtida é seca por aspersão para produzir uma forma livremente solúvel de reb B. Técnicas similares podem ser usadas para a preparação da forma livremente solúvel de esteviolbiosídeo.
[031]A transglicosilação foi realizada por ciclomaltodextrina glucanotransferases (CGTases; EC 2.4.1.19) produzidas por Bacillus stearothermophilus St- 88 (PureCir- cle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malásia). No entanto, qualquer outra CGTase ou enzima que possui atividade de transglicosilação intermolecular também pode ser aplicada. A enzima pode ser em uma forma de caldo de cultura livre de célula, caldo de cultura livre de célula líquido concentrado, caldo de cultura livre de célula seco por congelamento ou seco por aspersão, ou proteína de alta pureza. As preparações de enzima livre e imobilizada podem ser usadas.
[032]A atividade de preparações de CGTase foi determinada de acordo com o procedimento descrito em Hale W.S., Rawlins L.C. (1951) Amylase of Bacillus mace- rans. Cereal Chem. 28, 49-58.
[033]Os amidos de origem diferente podem ser usados como doadores de unidades de glicosil, tais como derivados a partir do trigo, milho, batata, tapioca e sagu.
[034]O amido foi submetido à hidrólise parcial (liquefação) antes da reação de transglicosilação. O equivalente de dextrose do amido parcialmente hidrolisado pode se situar na faixa de cerca de 10 a 25, de preferência, cerca de 12 a 16. Qualquer enzima capaz de hidrólise de amido pode ser usada para a liquefação, tal como α- amilases, β-amilases, etc. Em uma modalidade, as misturas de CGTase e α-amilase como enzimas de liquefação são preferidas.
[035]A atividade de α-amilase é expressa em Kilo Novo unidades de α-amilase (KNU). Uma KNU é a quantidade de α-amilase que, sob condições padrão (pH 7,1; 37°C), dextriniza 5,26 g de substância seca de amido por hora.
[036]A mistura de liquefação contém cerca de 0,001 a 0,2 KNU, de preferência, cerca de 0,05 a 0,1 KNU de α-amilase por uma unidade de CGTase.
[037]O uso de α-amilase na liquefação permite alcançar taxas de rendimento maiores em filtração de carbono ativado adicional. Quando a CGTase é usada como a única enzima de liquefação, a taxa de filtração é de aproximadamente 10 a 15 L/h por 1m2 de superfície do filtro. No caso da mistura de enzima de liquefação (que compreende α-amilase e CGTase), a taxa de filtração é duas vezes mais rápida - aproximadamente 20 a 30 L/h por 1 m2 de superfície do filtro.
[038]A razão de amido e CGTase na mistura de liquefação é de cerca de 0,1 a 0,5 unidades por um grama de amido, de preferência, cerca de 0,2 a 0,4 unidades por grama.
[039]A concentração de amido na mistura de liquefação é de cerca de 15 a 40% (em peso), de preferência, cerca de 20 a 30%.
[040]A liquefação é conduzida em cerca de 70 a 90°C durante cerca de 0,5 a 5 horas, de preferência, cerca de 1 a 2 horas.
[041]Após a liquefação, a mistura de reação é submetida à inativação térmica de α-amilase em condições de pH baixo. A faixa de pH preferida para inativação é de cerca de pH 2,5 a pH 3,0 e a temperatura preferida é de cerca de 95 a 105°C. A duração da inativação térmica é de cerca de 5 a 10 minutos.
[042]Após a inativação, o pH da mistura de reação é ajustado para cerca de pH 5,5 a 6,5 e o reb B livremente solúvel é adicionado à mistura e dissolvido. A razão preferida de reb B para amido (kg de glicosídeo de esteviol por 1 kg de amido) é de cerca de 0,5 a 1,5, de preferência, cerca de 0,8 a 1,2.
[043]Uma segunda parte da preparação de CGTase é adicionada e a reação de transglicosilação é conduzida a cerca de 65°C por cerca de 24 a 48 horas. A quantidade da segunda parte de CGTase é de cerca de 0,2 a 4 unidades de CGTase por grama de sólidos, de preferência, cerca de 0,5 a 1,2 unidades por grama de sólidos.
[044]Sob a completação da reação de transglicosilação, a reação foi parada mediante o aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 15 minutos para inativar a CGTase, então, a solução foi tratada com carbono ativado, para se obter mistura de reação descolorida. A quantidade de carbono ativado foi de cerca de 0,02 a 0,4 gramas por grama de sólidos, de preferência, cerca de 0,05 a 0,2 gramas por grama de sólidos.
[045]A mistura de reação descolorida foi resfriada a 5°C e o pH foi ajustado por H3PO4 para pH 2,0 a 4,5, de preferência, 3,0 a 4,0. A mistura foi mantida sob agitação moderada por 24 h, o qual resultou em precipitação de reb B não reagido. O reb B precipitado foi separado por filtração e o pH do filtrado contendo principalmente derivados de α-1,4-glicosil (C13) foi ajustado para 5,0 a 7,0, de preferência, 6,0 a 6,5.
[046]As impurezas foram removidas com o uso de Amberlite XAD7 HP. Os glicosídeos de esteviol e seus derivados glicosilados foram absorvidos na resina e sub sequentemente eluídos por etanol aquoso. O eluído de etanol aquoso resultante, contendo glicosil glicosídeos de esteviol, foi subsequentemente descolorido, conforme descrito acima, e a solução de glicosídeos, após a evaporação de solvente de eluição, foi pulverizada por meio de secagem por aspersão.
[047]A avaliação sensorial da amostra de glicosil reb B ("amostra da invenção") em comparação com a amostra de glicosil stevia comercial foi realizada com o uso de soluções aquosas, com 20 examinadores. Com base na aceitação em geral, as amostras mais desejáveis foram escolhidas. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1
Figure img0001
[048]Conforme é evidente a partir dos resultados na Tabela 1, a qualidade de doçura da composição de glicosil reb B foi classificada como mais superior.
[049]A composição de glicosil reb B tinha potência de doçura maior (150 vezes mais doce em comparação com uma solução de sucrose a 5%).
[050]As composições desta invenção podem ser usadas como intensificadores de doçura, intensificadores de sabor e adoçantes em diversos produtos de bebida e alimentícios. Os exemplos não limitadores de produtos de bebida e alimentícios incluem refrigerantes carbonados, bebidas prontas para beber, bebidas energéticas, bebidas isotônicas, bebidas de baixa caloria, bebidas de caloria zero, bebidas para esportes, chás, sucos de frutas e vegetais, bebidas à base de suco, bebidas lácteas, bebidas de iogurte, bebidas alcoólicas, bebidas em pó, produtos assados, biscoitos, bolachas, misturas para assados, cereais, produtos de confeitaria, doces, caramelos, goma de mascar, produtos lácteos, leite com sabor, iogurtes, iogurtes com sabor, leite elaborado, molho de soja e outros produtos à base de soja, molhos para saladas, maionese, vinagre, sobremesas congeladas, produtos de carne, produtos de peixe, comidas enlatadas e engarrafadas, adoçantes de mesa, frutas e vegetais.
[051]Adicionalmente, as composições podem ser usadas em fármacos ou preparações farmacêuticas e cosméticos, que incluem, mas não se limitam a, pasta de dente, enxaguatório bucal, xarope contra tosse, comprimidos mastigáveis, tabletes, preparações de vitamina, e similares.
[052]As composições podem ser usadas "tal como são" ou em combinação com outros adoçantes, sabores e ingredientes de alimento.
[053]Os exemplos não limitadores de adoçantes incluem glicosídeos de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, esteviolbiosídeo, rubusosídeo, assim como outros glicosídeos de esteviol encontrados em planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas da mesma, extrato de stevia, extrato de Luo Han Guo, mogrosí- deos, xarope de milho com alto teor de frutose, xarope de milho, açúcar invertido, fructooligossacarídeos, inulina, inulooligossacarídeos, açúcar de acoplamento, mal- tooligossacarídeos, maltodextinas, xaropes de milho sólidos, glicose, maltose, sucrose, lactose, aspartame, sacarina, sucralose, álcoois de açúcar.
[054]Os exemplos não limitadores de sabores incluem sabores de limão, laranja, frutado, banana, uva, pêra, abacaxi, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha.
[055]Os exemplos não limitadores de outros ingredientes de alimento incluem sabores, acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agente colorantes, agentes avo- lumadores, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espessantes, agentes gelificantes.
[056]Os seguintes exemplos lustram diversas modalidades da invenção. Será compreendido que a invenção não é limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos apresentados nos exemplos, os quais são somente ilustrativos. EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE CGTASE
[057]Uma cepa de Bacillus stearothermophilas St-88 foi inoculada em 2.000 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% de amido, 0,25% de extrato de milho, 0,5% de (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCO3 (pH 7,0 a 7,5) a 56°C por 24 horas com aera- ção contínua (2.000 L/min.) e agitação (150 rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado com o uso de membrana de cerâmica Kerasep de 0,1 μm (Novasep, França) para separar as células. O permeado livre de célula foi adicionalmente concentrado 2 vezes em ultrafiltros Persep 10kDa (Orelis, França). A atividade da enzima foi determinada de acordo com Hale, Rawlins (1951). Uma preparação de enzima bruta com atividade de cerca de 2 unidades/mL foi obtida. EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE REB B LIVREMENTE SOLÚVEL
[058]1.000 g de reb B produzido por PureCircle Sdn Bhd contendo 97,1% de reb B, 2,5% de reb A, foram suspensos em 1.500 mL de água. A suspensão foi colocada sob agitador e aquecida a 80°C. A solução de NaOH a 50% foi adicionada à suspensão até que o pH alcançasse 8,0. A suspensão foi agitada por 1 h até a dissolução completa. A solução obtida foi seca com o uso de secador por aspersão de laboratório YC-015 (Shanghai Pilotech Instrument & Equipment Co. Ltd., China) operando em temperatura de entrada de 175°C e de saída 100°C. 990 g de pó amorfo foram obtidos com 40% (peso por volume) de solubilidade em água (a 25°C). EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO DE GLICOSIL STEVIA
[059]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH 6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidas de acordo com o EXEMPLO 1 foram adicionados, e a liquefação de amido foi realizada a 80°C por cerca de uma hora ao equivalente de dextrose de cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após o resfriamento a 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de reb B livremente solúvel obtido de acordo com o EXEMPLO 2 foram adicionados ao amido liquefeito e agitados até que uma solução homogênea fosse obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionadas à solução e a mistura foi mantida em uma temperatura de 65°C por 24 horas sob agitação contínua. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C por 15 minutos para inativar a enzima. Após o resfriamento a 65°C, 20 gramas de carbono ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C e mantida por 30 minutos. A mistura foi filtrada, o filtrado foi resfriado a 5°C e o pH foi ajustado para pH 3,5 com H3PO4. O filtrado foi mantido sob agitação moderada por 24 h. Então, os cristais precipitados foram filtrados e o pH da solução obtida foi ajustado para pH 6,5. A solução foi diluída com água a 5% de teor de sólidos e passada através da coluna recheada com 4000 mL de resina adsorven- te macroporosa Amberlite XAD 7HP. A coluna foi lavada com 5 volumes de água e 2 volumes de etanol a 20% (volume/volume). Os glicosídeos absorvidos foram eluídos com etanol a 50%. O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalinizada e des-colorida foi concentrada a 60°C sob vácuo, então, seca em uma forma de pó com o uso do secador por aspersão de laboratório. 151 gramas de produto foram obtidos. EXEMPLO 4 BEBIDA DE SUCO DE LARANJA DE BAIXA CALORIA
[060]Concentrado de laranja (35%), ácido cítrico (0,35%), ácido ascórbico (0,05%), cor vermelha alaranjada (0,01%), sabor de laranja (0,20%), rebaudiosídeo A (0,003%>) e diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) foram misturados e dissolvidos completamente em água (até 100%) e pasteurizados. As composições de glicosil stevia foram representadas por glicosil stevia comercial e uma amostra obtida de acordo com o EXEMPLO 3.
[061]As avaliações sensoriais das amostras são resumidas na Tabela 2. Os dados mostram que os melhores resultados podem ser obtidos com o uso da composição de glicosil stevia altamente purificada do EXEMPLO 3. Particularmente, as bebidas preparadas com a amostra do EXEMPLO 3 exibiram uma impressão sensorial na boca e perfil de sabor completo e suave. Tabela 2 Avaliação de amostras de bebida de suco de laranja
Figure img0002
[062]O mesmo método pode ser usado para preparar sucos e bebidas de suco a partir de outras frutas, tais como maçãs, limões, damascos, cerejas, abacaxis, mangas, etc. EXEMPLO 5 BEBIDA CARBONADA DE BAIXA CALORIA Ingredientes Quantidade, % Sucrose 5,5
[063]Uma bebida carbonada de acordo com a fórmula apresentada abaixo foi preparada.
Figure img0003
Figure img0004
[064]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 examinadores. Os resultados são resumidos na Tabela 3. Tabela 3 Avaliação de amostras de bebidas carbonadas de baixa caloria
Figure img0005
[065]Os resultados acima mostram que a bebida preparada com o uso da amostra do EXEMPLO 3 possui as melhores características organolépticas. EXEMPLO 6 BISCOITOS DIETÉTICOS
[066]Farinha (50,0%), margarina (30,0%), frutose (10,0%), maltitol (8,0%), leite integral (1,0%), sal (0,2%), fermento em pó (0,1 %), baunilha (0,1%) e diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) foram misturados bem em uma máquina de mistura de massa. A massa obtida foi moldada e assada em forno a 200°C por 15 minutos. As composições de glicosil stevia foram representadas por glicosil stevia comercial e uma amostra obtida de acordo com o EXEMPLO 3.
[067]As propriedades sensoriais foram avaliadas 20 examinadores. Os melhores resultados foram obtidos em amostras preparadas por composição de glicosil stevia altamente purificada (EXEMPLO 3). Os examinadores observaram impressão sensorial na boca e perfil de sabor completo e suave em biscoitos preparados com a amostra do EXEMPLO 3. EXEMPLO 7 IOGURTE
[068]Diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) e sucrose (4%) foram dissolvidas em leite de baixa caloria. As composições de glicosil stevia foram representadas por glicosil stevia comercial e uma amostra obtida de acordo com o EXEMPLO 3. Após a pasteurização a 82°C por 20 minutos, o leite foi resfriado a 37°C. Uma cultura iniciadora (3%) foi adicionada e a mistura foi incubada a 37°C por 6 horas, então, a 5°C por 12 horas.
[069]As propriedades sensoriais foram avaliadas 20 examinadores. Os melhores resultados foram obtidos em amostras preparadas por composição de glicosil stevia altamente purificada (EXEMPLO 3). Os examinadores observaram impressão sensorial na boca e perfil de sabor completo e suave em amostra preparada com a amostra do EXEMPLO 3.
[070]Deve-se compreender que as descrições mencionadas anteriormente e modalidades específicas mostradas no presente documento são somente ilustrativas do melhor modo da invenção e dos princípios da mesma, e que modificações e adições podem ser facilmente feitas pelos elementos versados na técnica sem que se desvie do espírito e escopo da invenção, o qual deve, portanto, ser compreendido como limitado somente pelo escopo das reivindicações em anexo.

Claims (12)

1. Processo para produção de uma composição de glicosil stevia altamente purificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: adicionar amido em água para formar uma suspensão de amido; adicionar uma mistura de α-amilase e CGTase na suspensão de amido e incubar por cerca de 0,5 a 2 horas em cerca de 75 a 80°C, resultando em uma suspensão de amido liquefeito; inativar a α-amilase por meio de tratamento por calor com pH baixo; resfriar a suspensão de amido liquefeito e ajustar o pH para cerca de 5,5 a 7,0; adicionar uma forma livremente solúvel de glicosídeos de esteviol selecionados dentre o grupo consistindo em rebaudiosídeo B e esteviolbiosídeo na suspensão de amido liquefeito, resultando em uma mistura de reação; adicionar uma segunda batelada de CGTase na mistura de reação e incubar por cerca de 12 a 48 horas em cerca de 55 a 75°C; inativar a CGTase por meio de tratamento por calor baixo; descolorir a mistura de reação; resfriar a mistura de reação e ajustar o pH para cerca de 2,0 a 4,5; precipitar os glicosídeos de esteviol não reagidos; separar os cristais de glicosídeos de esteviol não reagidos precipitados do filtrado; ajustar o pH do filtrado para cerca de 5,5 a 7,0; remover as impurezas pelo contato do filtrado com resina adsorvente ma- croporosa e subsequentemente eluir diterpeno glicosídeos adsorvidos com etanol aquoso para resultar em um eluído de etanol aquoso contendo glicosídeo; remover etanol do eluído de etanol aquoso, resultando em um eluído aquoso; e concentrar e secar o eluído aquoso para obter a composição de glicosil stevia altamente purificada, em que a composição de glicosil stevia altamente purificada compreende derivados que contêm resíduos de α-1,4-glicosil fixados aos resíduos glucosídicos da posição C13 de esteviol, e glicosídeos de esteviol não modificados.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de α-amilase e CGTase contém cerca de 0,001 a 0,2 KNU de α- amilase por uma unidade de CGTase.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de α-amilase e CGTase contém cerca de 0,05 a 0,1 KNU de α- amilase por uma unidade de CGTase.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peso de glicosídeos de esteviol adicionados é quase igual ao do amido.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGTase é produzida por culturas de Bacillus stearothemophilus.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda batelada de CGTase tem cerca de 0,2 a 4 unidades de CGTase por grama de sólidos.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda batelada de CGTase tem cerca de 0,5 a 1,2 unidades de CGTase por grama de sólidos.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é executada usando carbono ativado.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é executada usando membranas ou resinas de troca iônica, as ditas membranas sendo selecionadas a partir do grupo que consiste em membranas de ultrafiltração, nanofiltração, e osmose inversa.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a remoção de impurezas é conduzida com uma pluralidade de colunas sequencialmente conectadas recheadas com uma resina adsorvente macroporosa, seguido pela lavagem das colunas com água, então, lavagem com cerca de 10 a 50% (volume/volume) de etanol, desconexão das colunas e, então, eluição de cada coluna individualmente com 30 a 100% de etanol.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosil stevia altamente purificada tem ao menos cerca de 90% de glicosídeos de esteviol total em uma base anidra.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a forma livremente solúvel de glicosídeos de esteviol é preparada em um processo que compreende as etapas de: fornecer uma forma ligeiramente solúvel de glicosídeos de esteviol selecionado dentre o grupo consistindo em rebaudiosídeo B e esteviolbiosídeo; adicionar os glicosídeos de esteviol à água para formar uma suspensão; adicionar álcali à suspensão para ajustar o pH para cerca de pH 6,0 a pH 9,0; aquecer a suspensão a cerca de 50 a 100°C para obter uma solução de gli- cosídeo de esteviol; e secar por aspersão a solução para obter forma livremente solúvel de glicosídeos de esteviol.
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