MX2014004817A - Composicion de glucosil estevia. - Google Patents

Composicion de glucosil estevia.

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Abstract

Se preparan composiciones de glucosil estevia a partir de glicósidos de esteviol de Stevia rebaudiana Bertoni. La glucosilación se realizó mediante ciclodextrina glucanotransferasa usando el almidón como fuente de residuos de glucosa. Las composiciones principalmente comprenden derivados de glucosilo con características de sabor superiores y se pueden usar como aumentadores de dulzura, aumentadores de sabor y edulcorantes en alimentos, bebidas, cosméticos y farmacéuticos.

Description

COMPOSICIÓN DE GLUCOSIL ES EVIA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La invención se relaciona a un proceso para producir un ingrediente alimenticio altamente purificado del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni y su uso en varios productos alimenticios y bebidas.
Descripción de la Técnica Relacionada En la actualidad, las alternativas de azúcar están recibiendo cada vez más atención debido a la conciencia de muchas enfermedades en conjunción con el consumo de alimentos y bebidas con alto contenido de azúcar. Sin embargo muchos edulcorantes artificiales tales como dulcina, ciclamato de sodio y sacarina se prohibieron o restringieron en algunos países debido a las preocupaciones en su seguridad. Por lo tanto los edulcorantes no calóricos de origen natural están siendo cada vez más populares. La hierba dulce Stevia rebaudiana Bertoni, produce una variedad de glicósidos de diterpeno que poseen propiedades de dulzura y sensoriales de alta intensidad superiores a aquellas de muchos otros edulcorantes de potencia alta.
Los glicósidos dulces mencionados en lo anterior, tienen un aglicón común, esteviol, y difieren por el número y tipo de residuos de carbohidratos en las posiciones C13 y C19. Las hojas de Stevia son capaces de acumular hasta 10-20% (sobre base en peso seco) de glicósidos de esteviol. Los glicósidos principales encontrados en las hojas de Stevia son Rebaudiosido A (2-10%), Esteviosido (2-10%), y Rebaudiosido C (1 -2%) . Otros glicósidos tales como Rebaudiosido B, D, E, y F, Esteviolbiosido y Rubusosido se encuentran en niveles muchos más bajos (aproximadamente 0-0.2%).
Dos glicósidos principales - Esteviosido y Rebaudiosido A, se estudiaron extensamente y se caracterizaron en términos de su idoneidad como edulcorantes de alta intensidad comerciales. Los estudios de estabilidad en las bebidas carbonatadas confirmaron su estabilidad al calor y pH (Chang S.S., Cook, J.M. (1983) Stability studies of esteviosido and Rebaudiosido A in carbonated beverages. J. Agrie. Food Chem. 31: 409-412.) Los glicósidos de esteviol difieren entre si no solo por la estructura molecular, sino también por sus propiedades de sabor. Usualmente, el esteviosido se encuentra que es 110-270 veces más dulce que la sacarosa, el Rebaudiosido A entre 150 y 320 veces, y el Rebaudiosido C entre 40-60 veces más dulce que la sacarosa. El Dulcosido A es 30 veces más dulce que la sacarosa. El Rebaudiosido A tiene el resabio menos astringente, menor amargo y menos persistente poseyendo de esta manera los atributos sensoriales más favorables en la mayoría de glicósidos de esteviol (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweetners. Puré Appl . Chem. 69:675-683; Phillips K.C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. In: Grenby T.H. ed. Developments in sweeteners, vol . 3. Elsevier Applied Science, London. 1-43) .
Los métodos para la extracción y purificación de glicósidos dulces de la planta Stevia rebaudiana usando solventes de agua u orgánicos se describen en, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Números 4,361,697; 4,082,858; 4,892,938; 5,972, 120; 5,962,678; 7,838,044 y 7,862,845.
Sin embargo, aún en un estado altamente purificado, los glicósidos de esteviol aún poseen atributos de sabor indeseables tales como amargor, resabio dulce, sabor a regaliz, etc. Uno de los obstáculos principales para la comercialización exitosa de los edulcorantes de estevia son esos atributos de sabor indeseables. Se mostró que estas notas de sabor son más prominentes conforme se incrementa la concentración de glicósidos de esteviol (Prakash I., DuBois G.E., Clos J.F., ilkens .L., Fosdick L.E. (2008) Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener. Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82) .
Algunas de estas propiedades indeseables se pueden reducir o eliminar al someter los glicósidos de esteviol a la reacción de transglicosilación intermolecular, cuando nuevos residuos de carbohidratos se unen a la molécula inicial en las porciones glicosidicas en las posiciones C13 y C19 del esteviol. Dependiendo del número de residuos de carbohidrato en estas posiciones variará la calidad y potencia del sabor del compuesto.
La pululanasa, isomaltasa (Lobov S.V., Jasai R. , Ohtani., Tanaka 0. Yamasaki K. (1991) Enzymatic production of sweet esteviosido derivatives: transglycosylation by glucosidases . Agrie. Biol. Chem. 55: 2959-2965), ß-galactosidasa (Kitahata S., Ishikawa S., Miyata T., Tanaka 0. (1989) Production of rubusosido derivatives by transglycosylation of various ?-galactosidase . Agrie. Biol. Chem. 53: 2923-2928), y dextrano saccarasa (Yamamoto K., Yoshikawa K. , Okada S. (1994) Effective production of glucosyl-esteviosido by cc-1 , 6-transglucosylation of dextran dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 1657-1661) se han usado como enzimas de transglicosilación, junto con pululano, maltosa, lactosa, y almidón parcialmente hidrolizado, respectivamente, como donadores de residuos glicosidicos .
La transglucosilación de los glicósidos de esteviol también se llevó a cabo por la acción de la ciclodextrina glucanotransferasas (CGTasa) producidas por Bacillus stearothermophilus (Números de Patentes de los Estados Unidos 4,219,571, y 7,807,206) como resultado se formaron derivados de c-1, 4-glucosilo con grado de polimerización de hasta 10.
Tiene que ser observado que en el proceso mencionado en lo anterior, la cc-1, 4-glucosilación se presenta en las porciones glicosidicas enlazadas a la posición C13 y C19 del esteviol. Por otra parte, se descubrió por Fukunaga y colaboradores (1989) que los derivados con los residuos de -1, -glucosilo en la posición C13 del esteviol posee características de sabor superiores, comparadas con aquellas co porciones a-1, 4-glucosilo unidas a la posición C19 del esteviol. (Fukunaga Y., Miyata T . , Nakayasu N., Mizutani K. , Kasai R. , Tanaka 0. (1989) Enzymic Tramglucosylation Products of Stevioside : Separation and Sweetness-evaluatíon, Agrie. Biol. Chem., 53 (6), 1603- 1607).
También tiene que ser observado que dos glicósidos de esteviol de origen natural, particularmente esteviolbiosido (CAS No. 41093-60-1) y rebaudiosido B (CAS No. 58543-17-2) no tienen porciones glicosidicas unidas a la posición C19. Por lo tanto su a-1, 4-glucosilación producirá exclusivamente derivados con residuos a-1, -glucosilo unidos a las porciones de carbohidrato de la posición C13 del esteviol. Sin embargo, un proceso comercialmente viable para producir tales derivados no está disponible debido a la baja solubilidad del esteviolbiosido y rebaudiosido B (reb B) .
Ninguna información en las propiedades de sabor y funcionalidad del esteviolbiosido a-1 , 4-glucosido y reb B está disponible también.
Por lo tanto para proporcionar un glucosil-estevia con la mejor combinación de potencia de dulzura y perfil de sabor es necesario desarrollar productos de glucosil-estevia altamente purificados que contienen derivados con las características de sabor más deseables.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a superar las desventajas de los edulcorantes de Estevia existentes. La invención describe un proceso para producir un ingrediente alimenticio de pureza alta del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni y uso del mismo en varios productos alimenticios y bebidas como modificador de dulzura y sabor.
La invención, en parte, pertenece a un ingrediente que comprende derivados glucosilados de glicosidos de esteviol de la planta Stevia rebaudiana Bertoni. Los glicosidos de esteviol se seleccionan del grupo que consiste de rebaudiosido B, esteviolbiosido, esteviolmonosido, así como otros glicosidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni y mezclas de los mismos.
La invención, en parte, pertenece a un proceso para producir un ingrediente que contiene formas glucosiladas de rebaudiosido B, esteviolbiosido, esteviolmosido, así como otros glicosidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni. El proceso puede ser un proceso de transglucosilación enzimática que usa CGTasas producidas por cultivos de Bacillus stearothermophilus. El proceso también puede tener una etapa de tratamiento enzimático a de pos- transglucosilación que usa varios glucosidasas . El proceso también puede tener las etapas de decolorar, desalar y remover las dextrinas y varias impurezas. La decoloración se puede llevar a cabo usando carbón activado. La desalación se puede llevar a cabo al pasar a través de resinas de intercambio iónico y/o filtros de membrana. La remoción de las dextrinas e impurezas se puede llevar a cabo al pasar a través de resina polimérica macroporosa.
En la invención, el esteviolbiosido o reb B comercializado por PureCircle Sdn. Bhd. (Malasia) , con pureza de por lo menos 95%, se usó como un material de partida. Alternativamente, los materiales de partida con diferente relación y contenido de esteviolbiosido, reb B y/o otros glicósidos de esteviol se pueden usar también.
El material de partida se convirtió en forma libremente soluble y luego se sometió a transglucosilación enzimática por la acción de la ciclodextrina glicosiltransferasa (CGTasa) en presencia de almidón como un donador de glucosa. Como resultado, se formaron derivados de a-1 , 4-glucosilo (C13) del glicósido de esteviol inicial.
El glicósido de esteviol no reaccionado se precipitó de la mezcla de reacción mientras que las otras impurezas se removieron por la resina Amberlite XAD7 HP, y luego la mezcla de reacción purificada se decoloró, se concentró y se secó por rocío.
Los productos obtenidos se aplicaron en varios alimentos y bebidas como edulcorantes, aumentadores de dulzura y modificadores de sabor, incluyendo helado, galletitas, pan, jugos de fruta, productos de leche, artículos horneados y productos de confitería.
Se va a entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y se proponen para proporcionar una explicación adicional de la invención como es reclamada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las FIGS. la y Ib muestran la estructura del reb B y esteviolbiosido .
La FIG. 2 muestra el cromatograma HPLC de la mezcla de reacción que contiene reb B y sus derivados de glucosilo después de la etapa de glucosilación.
La FIG. 3 muestra el cromatograma HPLC de la mezcla de reacción después de la etapa de precipitación del reb B residual .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las ventajas de la presente invención serán más evidentes a partir de la descripción detallada dada a partir de ahora. Sin embargo, se debe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indiquen modalidades preferidas de la invención, se dan a manera de ilustración solamente, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica a partir de esta descripción detallada.
En una modalidad de la presente invención el reb B altamente purificado comercializado por PureCircle Sdn. Bhd. (Malaysia) , que contiene reb B (>95%) , reb A (<5%), y otros glicósidos que ascienden a un contenido de glicósidos de esteviol total de por lo menos 97%, se usó como un material de partida. Alternativamente, los materiales de partida con diferente contenido y relación de esteviolbiosido, reb B, y/u otros glicósidos de esteviol se pueden usar también.
El análisis HPLC de las materias primas y productos se llevó a cabo en la cromatografía líquida Agilent Technologies 1200 Series (EUA) , equipada con una columna Zorbax-NH2 (4.6X250mm). La fase móvil fue el gradiente de acetonitrilo-agua de 70:30, v/v (0-2 min) a 50:50, v/v (2-70 min) . Un detector de arreglo de diodos ajustado a 210 nm se usó como el detector.
A partir de ahora los términos que describen la solubilidad del material tal como "ligeramente soluble", "libremente soluble" etc., se dan de acuerdo con las definiciones proporcionadas en FAO JECFA Monographs 1 (2006) , Combined Compendium of Food Additive Specifications, vol. 4, page 41.
Debido al hecho de que el reb B (y esteviolbiosido) es ligeramente soluble en agua, no es posible introducirlo a la mezcla de reacción "como se encuentra". Por lo tanto, el reb B se convierte a forma libremente soluble. El reb B se suspende en 1-3 volúmenes, preferiblemente en 1.2-1.6 volúmenes de agua. La suspensión se calienta a 50-100 °C, preferiblemente 60-90 °C bajo agitación continua. El NaOH se adiciona a la suspensión para alcanzar un valor de pH de aproximadamente 6.0-9.0, preferiblemente 7.0-8.0.
Alternativamente el OH u otros álcalis se pueden usar. La adición del álcali asegura la disolución completa del reb B (y esteviolbiosido) , que de otra manera es casi insoluble en agua aun en temperaturas que exceden 100°C. después de la disolución completa la solución obtenida se seca por rocío para producir una forma libremente soluble del reb B. Se puede usar una técnica similar para la preparación de la forma libremente soluble de esteviolbiosido.
La transglucosilación se logró por ciclomaltodextrina glucanotransferasas (CGTasas; EC 2.4.1.19) producidas por Bacillus stearothermophilus St-88 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malaysia) . Sin embargo, cualquier otra CGTasa o enzima que posee la actividad de transglucosilación intermolecular se puede aplicar también. La enzima puede está en una forma de caldo de cultivo sin células, caldo de cultivo sin células liquido concentrado, caldo de cultivo sin células seco por rocío o seco por congelación, o proteina de pureza alta. Se pueden usar preparaciones de enzimas libres e inmovilizadas.
La actividad de las preparaciones de CGTasa se determinó de acuerdo con el procedimiento descrito en Hale .S., Rawlins L.C. (1951) Amylase of Bacillus macerans. Cereal Chem. 28, 49-58.
Los almidones de diferente origen se pueden usar como donadores de unidades de glicosilo tales como, derivadas de trigo, maíz, papa, tapioca y sagú.
El almidón se sometió a hidrólisis parcial (licuefacción) antes de la reacción de transglucosilación . El equivalente de dextrosa del almidón parcialmente hidrolizado puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-25, de manera preferente de aproximadamente 12-16. Cualquier enzima capaz de la hidrólisis del almidón se puede usar para licuefacción, tales como a-amilasas, ?-amilasas etc. En una modalidad, las mezclas de CGTasa y ctr-amilasa como enzimas de licuefacción son preferidas.
La actividad de la a-amilasa se expresa en unidades de a-amilasa Kilo Novo (KNU) . Una KNÜ es la cantidad de a-amilasa, bajo condiciones estándares (pH 7.1; 37°C), dextrinizas 5.26 g de sustancia seca de almidón por hora.
La mezcla de licuefacción contiene aproximadamente 0.001-0.2 KNU, de manera preferente de aproximadamente 0.05-0.1 KNU de a-amilasa por una unidad de CGTasa.
El uso de or-amilasa en la licuefacción permite lograr rendimientos más altos en la aplicación de carbón activado adicional. Cuando la CGTasa se usa como la única enzima de licuefacción la velocidad de filtración es de aproximadamente 10-15 L/hr por lm2 de superficie del filtro. En el caso de la mezcla de enzima de licuefacción (que comprende or-amilasa y CGTasa) la velocidad de filtración es dos veces más rápida - aproximadamente 20-30 L/hr por lm2 de superficie de filtro.
La relación de almidón y CGTasa en la mezcla de licuefacción es de aproximadamente 0.1-0.5 unidades por un gramo de almidón, de manera preferente de aproximadamente 0.2-0.4 unidades por gramo.
La concentración de almidón en la mezcla de licuefacción es de aproximadamente 15-40% (p/p) , de manera preferente de aproximadamente 20-30%.
La licuefacción se conduce a aproximadamente 70-90 °C durante aproximadamente 0.5-5 hora, de manera preferente de aproximadamente 1-2 horas.
Después de la licuefacción, la mezcla de reacción se somete a inactivación térmica de la or-amilasa en condiciones de pH bajo. El intervalo de pH preferido para la inactivación es de aproximadamente pH 2.5 a pH 3.0 y la temperatura preferida es de aproximadamente 95-105 °C. La duración de la inactivación térmica es de aproximadamente 5- 10 minutos.
Después de la inactivación, el pH de la mezcla de reacción se ajusta a aproximadamente pH 5.5-6.5 y los glicósidos de esteviol se adicionan a la mezcla y se disuelven. La relación preferida de glicósidos de esteviol a almidón (kg de glicósidos de esteviol por 1 kg de almidón) es de aproximadamente 0.5-1.5, de manera preferente aproximadamente 0.8-1.2.
Una segunda porción de preparación de CGTasa y la relación de transglucosilación se conduce a aproximadamente 65°C durante aproximadamente 24-48 horas. La cantidad de la segunda porción de CGTasa es aproximadamente 0.2-4 unidades de CGTasa por gramo de sólidos, de manera preferente aproximadamente 0.5-1.2 unidades por gramo de sólidos.
En la terminación de la reacción de transglucosilación, la reacción se detuvo por calentamiento a aproximadamente 95°C durante aproximadamente 15 minutos para inactivar la CGTasa, luego la solución se trató con carbón activado para obtener una mezcla de de reacción decolorada. La cantidad de carbón activado fue de aproximadamente 0.02-0.4 gramos por gramo de sólidos, preferiblemente de aproximadamente 0.05-0.2 gramos por gramo de sólidos.
La mezcla de reacción decolorada se enfrió a 5°C y el pH se ajustó por H3P04 a pH 2.0-4.5, preferiblemente 3.0-4.0. La mezcla se mantuvo bajo agitación moderada durante 24 horas, lo cual dio por resultado la precipitación del reb B no reaccionado. El reb B precipitado se separó por filtración y el pH y el material del filtrado que contiene principalmente derivados de a-1, 4-glucosilo (C13) se ajustó a 5.0-7.0, preferiblemente 6.0-6.5.
Las impurezas se removieron usando Amberlite XAD7 HP. Los glicósidos de esteviol y sus derivados glucosilados se adsorbieron en la resina y se eluyeron subsecuentemente por etanol acuoso. El eluato de etanol acuoso resultante, que contiene glicósidos de glucosilesteviol , se decoloraron subsecuentemente como se describe en lo anterior y la solución de glicósidos, después de la evaporación del solvente de elución, se formó en polvo por secado por roció.
La evaluación sensorial de la muestra de reb B de glucosilo ("Muestra de la Invención") en comparación con la muestra de glucosil-estevia comercial se llevó a cabo usando soluciones acuosas, con 20 panelistas. Basada en aceptación general se eligieron las muestras más deseables. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 Evaluación sensorial de las muestras en el sistema de agua Comentarios Dulce, ligeramente Dulce, ligero, amargo, astringente, blando, redondo, el principio de agradable, similar dulzura es lento la sacarosa, sin resabio persistente el principio de dulzura es rápido Como es evidente a partir de los resultados en la Tabla 1, la calidad de dulzura de la composición reb B de glucosilo se clasificó como más superior.
La composición de glucosilo-reb B tuvo potencia de dulzura más alta (150 veces más dulce comparada con una solución de sacarosa al 5%) .
Las composiciones de esta invención se pueden usar como aumentadores de dulzura, aumentadores de sabor y edulcorantes en varios productos alimenticios y de bebida. Ejemplos no limitantes de productos alimenticios y de bebida incluyen bebidas sin alcohol carbonatadas, bebidas listas para tomar, bebidas energéticas, bebidas isotónicas, bebidas bajas en calorías, bebidas de cero calorías, bebidas deportivas, tés, jugos de fruta y vegetales, bebidas de jugo, bebidas lácteas, bebidas de yogur, bebidas alcohólicas, bebidas en polvo, productos de panadería, galletitas, bizcochos, mezclas de para hornear, cereales, confiterías, dulces, caramelos, goma de mascar, productos lácteos, leche saborizada, yogures, yogures saborizados, leche cultivada, salsa de soja y otros productos basados en soja y otros productos basados en soja, aderezos de ensalada, mayonesa, vinagre, postres congelados, productos de carne, productos de pescado-carne, alimentos embotellados y enlatados, edulcorantes de mesa, frutas y vegetales.
Adicionalmente, las composiciones se pueden usar en preparaciones de fármacos o farmacéuticas y cosméticas, incluyendo pero no limitada a pastas de dientes, lavado bucal, jarabe para la tos, tabletas masticables, pastillas, preparaciones de vitaminas, y similares.
Las composiciones se pueden usar "como se encuentran" o en combinación con otros edulcorantes, sabores e ingredientes alimenticios.
Ejemplos no limitantes de edulcorantes incluyen glicósidos de esteviol, esteviosido, Rebaudiosido A, Rebaudiosido B, Rebaudiosido C, Rebaudiosido D, Rebaudiosido E, Rebaudiosido F, Dulcosido A, esteviolbiosido, rubusosido, asi como otros glicósidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni y mezclas de los mismos, extracto de stevia, extracto de Luo Han Guo, mogrosidos, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, jarabe de maíz, azúcar invertida, fructo-oligosacáridos, inulina, inulooligosacáridos, azúcar de acoplamiento, maltooligosacáridos, maltodextinas, sólidos de jarabe de maíz, glucósidos, maltosa, sacarosa, lactosa, aspartame, sacarina, sucralosa, alcoholes de azúcar.
Ejemplos no limitantes de sabores incluyen limón, naranja, frutas, plátano, uva, pera, pina, almendra agria, cola, canela, azúcar, dulce de algodón, sabores de vainilla.
Ejemplos no limitantes de otros ingredientes alimenticios incluyen sabores, acidulantes, ácidos orgánicos y aminoácidos, agentes colorantes, agentes de volumen, almidones modificados, gomas, texturizadores, conservadores, antioxidantes, emulsificantes , estabilizantes, espesantes, agentes gelificantes .
Los siguientes ejemplos ilustran varias modalidades de la invención. Se entenderá gue la invención no se limita a los materiales, proporciones, condiciones y procedimientos expuestos en los ejemplos, gue son solamente ilustrativos. EJEMPLO 1 Preparación de CGTasa Una cepa de Bacillus stearothermophilus St-88 se inoculó en 2,000 litros de medio de cultivo esterilizado que contiene 1.0% almidón, 0.25% de extracto de maíz, 0.5% de (NH4)2S04, y 0.2% de CaC03 (pH 7.0-7.5) a 56°C durante 24 hrs con aireación continua (2,000 L/min) y agitación (150rpm). El caldo de cultivo obtenido se filtró usando una membrana de cerámica de 0.1 µp? Kerasep (Novasep, France) para separar las células. El permeado sin células se concentró adicionalmente 2 veces en ultrafiltros de 10 kDa Persep (Orelis, France) . La actividad de la enzima se determinó de acuerdo con Hale, Rawlins (1951) . Se obtuvo una preparación de enzima cruda con actividad de aproximadamente 2 unidades/mL.
EJEMPLO 2 Preparación del reb B libremente soluble 1,000 g de reb B producido por PureCircle Sdn Bhd que contiene 97.1% de reb B, 2.5% de reb A, se suspendió en 1,500 mL de agua. La suspensión se colocó bajo agitador y se calentó a 80°C. Se adicionó una solución de NaOH al 50% a la suspensión hasta que el pH alcanzó 8.0. La suspensión se agitó durante 1 hora hasta la disolución completa. La solución obtenida se secó usando un secador por rocío de laboratorio YC-015 (Shanghai Pilotech Instrument & Equipment Co. Ltd. , China) operando a temperatura de 175°C de entrada y 100°C de salida. 990g de polvo amorfo se obtuvieron con 40% de solubilidad (p/v) en agua (a 25°C) .
EJEMPLO 3 Preparación de la composición de glucosil estevia 100 g de almidón de tapioca se suspendieron en 300 mL de agua (pH 6.5) . 2 KNU de a-amilasa (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) y 30 unidades de CGTasa obtenida de acuerdo con el EJEMPLO 1 se agregaron, y la licuefacción del almidón se llevó a cabo a 80 °C durante aproximadamente una hora al equivalente de dextrosa de aproximadamente 15. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 2.8 por ácido clorhídrico y la mezcla se hirvió a 100°C durante 5 minutos para inactivar las enzimas. Después del enfriamiento a 65°C, el pH se ajustó a pH 6.0 con solución de hidróxido de sodio. 100 g de reb B libremente soluble obtenidos de acuerdo con el EJEMPLO 2 se adicionaron al almidón licuado y se agitaron hasta que se obtuvo una solución homogénea. 200 unidades de CGTasa se adicionaron a la solución y la mezcla se mantuvo en una temperatura de 65 °C durante 24 horas bajo agitación continua. La mezcla de reacción obtenida se calentó a 95 °C durante 15 minutos para inactivar la enzima. Después de enfriamiento a 65°C, se adicionaron 20 gramos de carbón activado y la mezcla se calentó a 75°C y se mantuvo durante 30 minutos. La mezcla se filtró, el filtrado se enfrio a 5°C y el pH se ajustó a pH 3.5 con H3PO4. El filtrado se mantuvo bajo agitación moderada durante 24 hrs. Luego los cristales precipitados se filtraron y el pH de la solución obtenida se ajustó a pH 6.5. La solución se diluyó con agua a 5% de contenido de sólidos y se hizo pasar a través de una columna empacada con 4000 mL de resina adsorbente macroporosa Amberlite XAD 7HP. La columna se lavó con 5 volúmenes de agua y 2 volúmenes de etanol al 20% (v/v) etanol. Los glicósidos adsorbidos se eluyeron con 50% de etanol. El etanol se evaporó y la solución de agua desalada y decolorada se concentró a 60°C bajo vacio, luego se secó en una forma de polvo usando un secador por roció de laboratorio. Se obtuvieron 151 gramos de producto.
EJEMPLO 4 Bebida de jugo de naranja con bajo contenido de calorías Concentrado de naranja (35%), ácido cítrico (0.35%), ácido ascórbico (0.05%), color rojo naranja (0.01%), sabor a naranja (0.20%), Rebaudiosido A (0.003%) y diferentes composiciones de glucosil estevia (0.03%) se mezclaron y se disolvieron completamente en agua (hasta 100%) y se pasteurizaro . Las composiciones de glucosil estevia se representaron por glucosil estevia y una muestra obtenida de acuerdo con el EJEMPLO 3.
Las evaluaciones sensoriales de las muestras se resumen en la Tabla 2. Los datos muestran que los mejores resultados se pueden obtener al usar la composición de glucosil estevia altamente purificada del EJEMPLO 3. Particularmente las bebidas preparadas con la muestra del EJEMPLO 3 mostraron un perfil de sabor redondeado y completo y sensación a la boca.
Tabla 2 Evaluación de las muestras de bebida de jugo de naranja El mismo método se puede usar para preparar jugos y bebidas de jugo de otras frutas, tales como manzanas, limones chabacanos, cerezas, piñas, mangos, etc.
EJEMPLO 5 Bebida carbonatada con bajo contenido de calorías Se preparó una bebida carbonatada de acuerdo con la fórmula presentada a continuación.
Las propiedades sensoriales se evaluaron por 20 panelistas. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3 Evaluación de las muestras de bebida carbonatada con baj o contenido de calorías Los resultados anteriores muestran que la bebida preparada usando la Muestra del EJEMPLO 3 poseen las mejores características organolépticas.
EJEMPLO 6 Galletitas de dieta Harina (50.0%), margarina (30.0%) fructosa (10.0%), maltitol (8.0%), leche entera (1.0%), sal (0.2%), polvo para hornear (0.15%), vainilla (0.1%) y diferentes composiciones de glucosil estevia (0.03%) se amasaron bien en una máquina de amasado-mezclado . La masa obtenida se moldeó y se horneó en un horno a 200°C durante 15 minutos. Las composiciones de glucosil estevia se representaron por glucosil estevia comercial y una muestra obtenidas de acuerdo con el EJEMPLO 3.
Las propiedades sensoriales se evaluaron por 20 panelistas. Se obtuvieron los mejores resultados en las muestras preparadas por la composición de glucosil estevia altamente purificada (EJEMPLO 3) . Los panelistas notaron un perfil de sabor redondeado y completo y sensación a la boca en las galletitas preparadas con la Muestra del EJEMPLO 3. EJEMPLO 7 Yogurt Las composiciones de glucosil estevia diferentes (0.03%) y sacarosa (4%) se disolvieron en leche con bajo contenido de grasa. Las composiciones de glucosil estevia se representaron por glucosil estevia comercial y una muestra obtenidas de acuerdo con el EJEMPLO 3. Después de la pasteurización a 82°C durante 20 minutos, la leche se enfrió a 37 °C. Se adicionó un cultivo de partida (3%) y la mezcla se incubó a 37 °C durante 6 horas luego a 5°C durante 12 horas.
Las propiedades sensoriales se evaluaron por 20 panelistas. Los mejores resultados se obtuvieron en las muestras preparadas por la composición de glucosil estevia altamente purificada (EJEMPLO 3). Los panelistas notaron un perfil de sabor redondeado y completo y sensación a la boca en la muestra preparada con la muestra del EJEMPLO 3.
Se va a entender que las descripciones anteriores y las modalidades especificas mostradas en la presente son meramente ilustrativas del mejor modo de la invención y los principios de la misma, y que las modificaciones y adiciones se pueden hacer fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, que por lo tanto se entiende que se limita solo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para producir una composición de glucosil estevia altamente purificada, caracterizado porque comprende las etapas de: adicionar almidón en el agua para formar una suspensión de almidón; adicionar una mezcla de a-amilasa y CGTasa en la suspensión de almidón e incubar durante aproximadamente 0.5 a 2 horas a aproximadamente 75-80 °C, dando por resultado una suspensión de almidón licuada; inactivar la or-amilasa por el tratamiento con calor de pH bajo; enfriar la suspensión de almidón licuada y ajustar el pH a aproximadamente 5.5 a 7.0; adicionar una forma libremente soluble de glicósidos de esteviol en la suspensión de almidón licuada, dando por resultado una mezcla de reacción; adicionar un segundo lote de CGTasa en la mezcla de reacción e incubar durante aproximadamente 12 a 48 horas a aproximadamente 55-75 °C; inactivar la CGTasa por tratamiento por calor bajo; decolorar la mezcla de reacción; enfriar la mezcla de reacción y ajustar el pH aproximadamente 2.0 a 4.5; precipitar los glicósidos de esteviol no reaccionados ; separar los cristales de glicósido de esteviol no reaccionados precipitados del filtrado: ajustar el pH del filtrado a aproximadamente 5.5 a 7.0; remover las impurezas al poner en contacto el filtrado con resina adsorbente macroporosa y eluir subsecuentemente los glicósidos de diterpeno adsorbidos con etanol acuoso para dar por resultado un eluato de etanol acuoso que contiene glicósido, remover el etanol del eluato de etanol acuoso, dando por resultado un eluato acuoso; y concentrar y secar el eluato acuoso para obtener la composición de glucosil estevia altamente purificada, en donde la composición de glucosil estevia altamente purificada comprende derivados que contienen residuos de a-1 , 4-glucosilo unidos a los residuos gicosidicos de la posición C13 de esteviol, y glicósidos de esteviol no modificados .
2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de a-amilasa y CGTasa contiene aproximadamente 0.001-0.2 KNU de a-amilasa por una unidad de CGTasa.
3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mezcla de a-amilasa y CGTasa contiene aproximadamente 0.05-0.1 KNU de a-amilasa por una unidad de CGTasa.
4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el peso de los glicósidos de esteviol adicionados es aproximadamente igual a aquel del almidón.
5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los glicósidos de esteviol adicionados se seleccionan del grupo que consiste de rebaudiosido B, esteviolbiosido, esteviolmonosido, asi como otros glicósidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni y mezclas de los mismos.
6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CGTasa se produce por cultivos de Bacillus stearothemophilus .
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo lote de CGTasa tiene de aproximadamente 0.2-4 unidades de CGTasa por gramo de sólidos.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo lote de CGTasa tiene aproximadamente 0.5-1.2 unidades de CGTasa por gramo de sólidos.
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la decoloración se lleva a cabo usando carbón activado.
10. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la decoloración se lleva a cabo usando resinas o membranas de intercambio iónico, las membranas que se seleccionan del grupo que consiste de membranas de ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa.
11. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la remoción de las impurezas se conduce con una pluralidad de columnas secuencialmente conectadas empacadas con una resina adsorbente macroporosa, seguido por el lavado de las columnas con agua, luego lavar con aproximadamente 10-50% de etanol (v/v) , desconectar las columnas, y luego eluir cada columna individualmente con 30-100% de etanol.
12. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de glucosil estevia altamente purificada tiene por lo menos aproximadamente 90% de glicosidos de esteviol total sobre una base anhidra.
13. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma libremente soluble de glicosidos de esteviol se prepara en un proceso que comprende las etapas de: proporcionar una forma ligeramente soluble de glicósidos de esteviol; adicionar los glicósidos de esteviol al agua para formar una suspensión; adicionar álcali a la suspensión para ajustar el pH de aproximadamente pH 6.0 a pH 9.0; calentar la suspensión a aproximadamente 50-100 °C para obtener una solución de glicósido de esteviol; y secar por rocío para obtener una forma libremente soluble de glicósidos de esteviol.
14. Una composición edulcorante, caracterizada porque comprende una composición de glucosil estevia altamente purificada fabricada por el proceso de conformidad con la reivindicación 1, y un agente edulcorante adicional seleccionado del grupo que consiste de: extracto de estevia, glicósidos de esteviol, esteviosido, Rebaudiosido A, Rebaudiosido B, Rebaudiosido C, Rebaudiosido D, Rebaudiosido E, Rebaudiosido F, Dulcosido A, esteviolbiosido, rubusosido, otros glicósidos de esteviol encontrados en la planta Stevia rebaudiana Bertoni y mezclas de los mismos, extracto de Luo Han Guo, mogrosidos, jarabe de maíz con alto contenido de fructosa, jarabe de maíz, azúcar invertida, fructo-oligosacáridos , inulina, inulo-oligosacáridos, azúcar de acoplamiento, malto-oligosacáricos, maltodextinas, sólidos de jarabe de maíz, glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa, aspartame, sacarina, sucralosa, alcoholes de azúcar, y una combinación de los mismos .
15. Una composición de sabor, caracterizada porque comprende una composición de glucosil estevia altamente purificada fabricada por el proceso de conformidad con la reivindicación 1, y un agente saborizante adicional seleccionado del grupo que consiste de: limón, naranja, fruta, plátano, uva, pera, piña, almendra agria, cola, canela, azúcar, dulce de algodón, vainilla y una combinación de los mismos.
16. Un ingrediente alimenticio, caracterizado porque comprende una composición de glucosil estevia altamente purificada fabricada por el proceso de conformidad con la reivindicación 1, y un ingrediente alimenticio adicional seleccionado del grupo que consiste de: acidulantes, ácidos orgánicos y aminoácidos, agentes colorantes, agentes de volumen, almidones modificados, gomas, texturizantes, conservadores, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espesadores, agentes gelificantes y una combinación de los mismos.
17. Un alimento, bebida, producto cosmético o farmacéutico, caracterizado porque comprende una composición de glucosil estevia altamente purificada fabricada por el proceso de conformidad con la reivindicación 1.
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