BR112014009623B1 - PROCESSO PARA PRODUQAO DE UMA COMPOSIQAO DE GLICOSIL STEVIA ALTAMENTE PURIFICADA, COMPOSIQOES, INGREDIENTE ALIMENTfCIO, PRODUTO ALIMENTICIO, BEBIDA, COSMETICO OU FARMACEUTICO - Google Patents
PROCESSO PARA PRODUQAO DE UMA COMPOSIQAO DE GLICOSIL STEVIA ALTAMENTE PURIFICADA, COMPOSIQOES, INGREDIENTE ALIMENTfCIO, PRODUTO ALIMENTICIO, BEBIDA, COSMETICO OU FARMACEUTICO Download PDFInfo
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Abstract
"PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE GLICOSIL STEVIA ALTAMENTE PURIFICADA, COMPOSIÇÕES, INGREDIENTE ALIMENTÍCIO, PRODUTO ALIMENTÍCIO, BEBIDA, COSMÉTICO OU FARMACÊUTICO" A presente invenção se refere a composições de glicosil stevia que são preparadas a partir de glicosídeos de esteviol de Stevia rebaudiana Bertoni. A glicosila- ção foi realizada por ciclodextrina glicanotransferase usando o amido como a fonte de resíduos de glicose. As composições foram purificadas a um teor >95% dos glicosídeos de esteviol totais. As composições podem ser utilizadas como intensifica- dores de dulçor, intensificadores de sabor, e adoçantes para alimentos, bebidas, cosméticos e farmacêuticos.
Description
[001]A invenção refere-se a um processo para produzir um ingrediente alimentício altamente purificado a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e a seu uso em vários produtos alimentícios e bebidas.
[002]Atualmente, alternativas de açúcar estão recebendo uma atenção crescente devido à conscientização de muitas doenças em conjunto com o consumo de alimentos e bebidas ricos em açúcar. No entanto, muitos adoçantes artificiais, como dulcina, ciclamato sódico e sacarina foram proibidos ou restritos em alguns países devido a preocupações quanto à sua segurança. Portanto, adoçantes não calóricos de origem natural estão se tornando cada vez mais populares. A erva de sabor doce Stevia rebaudiana Bertoni, produz uma série de diterpeno glicosídeos que apresentam alta intensidade de doçura e propriedades sensoriais superiores aos de muitos outros adoçantes de grande potência.
[003]Os glicosídeos doces acima mencionados possuem um esteviol aglicon comum e diferem pelo número e tipo de resíduos de carboidratos nas posições C13 e C19. As folhas da Stevia são capazes de acumular até 10-20% (em base seca) de glicosídeos de esteviol. Os principais glicosídeos encontrados nas folhas de Stevia são Rebaudiosídeo A (2-10%), Esteviosídeo (2-10%), e Rebaudiosídeo C (1-2%). Outros glicosídeos como Rebaudiosídeo B, D, E e F, Steviolbiosídeo e Rubusosídeo são encontrados em níveis muito mais baixos (aproximadamente 0 a 0,2%).
[004]Dois glicosídeos principais - Steviosídeo e Rebaudiosídeo A foram extensivamente estudados e caracterizados em termos da sua adequação como ado çantes comerciais de alta intensidade. Os estudos de estabilidade em bebidas carbonatadas confirmaram sua estabilidade ao calor e ao pH (Chang SS, Cook, JM (1983) Stability studies of stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages. J Agric Food Chem. 31: 409-412).
[005]Os glicosídeos de esteviol diferem entre si não só pela estrutura molecular, mas também pelas suas propriedades de gosto. Normalmente o esteviosídeo é considerado como 110 a 270 vezes mais doce do que a sacarose, o rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes, e o Rebaudiosídeo C entre 40 a 60 vezes mais doce que a sacarose. Dulcosídeo A é 30 vezes mais doce do que a sacarose. O rebaudiosídeo A tem menos adstringente, é menos amargo, e tem retrogosto menos persistente, portanto, possui os atributos sensoriais mais favoráveis nos principais glicosídeos de esteviol (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweetners. Pure Appl. Chem. 69:675-683; Phillips KC (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener: In: Grenby ed TH. ed. Developments in sweetners vol 3. Elsevier Applied Science, London 1-43).
[006]Os métodos para a extração e purificação de glicosídeos doces a partir da planta Stevia rebaudiana, utilizando água ou solventes orgânicos encontram-se descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA N°s. 4.361.697; 4.082.858, 4.892.938; 5.972.120; 5.962.678; 7.838.044 e 7.862.845.
[007]No entanto, mesmo em um estado altamente purificado, os glicosídeos de esteviol ainda possuem atributos de gosto indesejável, como a amargura, retrogosto doce, sabor de alcaçuz, etc. Um dos principais obstáculos para o sucesso na comercialização de adoçantes de stevia são esses atributos de gosto indesejáveis. Foi demonstrado que essas notas de sabor se tornam mais proeminentes, à medida que a concentração dos glicosídeos de esteviol aumenta (Prakash I., DuBois G, E, Cios J, F, Wilkens. K.L., Fosdick L.E (2008) Development of rebiana, a natural, non- caloric sweetener, Food Chem. Toxicol., 46, S75-S82).
[008]Algumas destas propriedades indesejáveis podem ser reduzidas ou eliminadas através da submissão dos glicosídeos de esteviol a uma reação de transglicosilação intermolecular, quando novos resíduos de carboidrato estão ligados à molécula inicial nas posições C13 e C19. Dependendo do número de resíduos de carboidratos nessas posições, a qualidade e potência do gosto desses compostos irá variar.
[009] Pululanase, isomaltase (Lobov S.V, Jasai., R., Ohtani, Tanaka O. Yamasaki K. (1991) Enzymatic production of sweet stevioside derivatives: transglycosylation by glucosidades Agric. Biol. Chem. 55: 2959-2965) β,-galactosidase (Kita- hata S., Ishikawa S., Miyata T., Tanaka O. (1989) Production of rubusoside derivatives by transglycosylation of varios β-galactosidase. Agric. Biol. Chem. 53: 2923- 2928), e dextrana sacarase (Yamamoto K., Yoshikawa K., Okada S. (1994) Effective production of glucosyl-stevioside by α-1,6-transglucosylation of dextrana dextranase. Biosci. Biotech. Biochem. (58: 1657-1661) foram utilizados como enzimas de trans-glicosilação, em conjunto com pululano, maltose, lactose, e amido parcialmente hidrolisado, respectivamente, como os doadores de resíduos glicosídicos.
[010]A transglicosilação dos glicosídeos de esteviol também foi realizada por ação de ciclodextrina glucanotransferases (CGTase) produzidas por Bacillus stea- rothermophilus (Patentes americanas nos. 4.219.571 e 7.807.206), como resultado, foram formados derivados de a-1,4-glicosil com um grau de polimerização até 10.
[011]Também deve ser observado que muitos produtos de glicosil stevia contem até 20% de dextrinas residuais e impurezas, tais como vários polifenólicos, compostos flavonóides e seus derivados de glicosil, etc. Estas misturas não possuem propriedades funcionais significativas, reduzem o teor de glicosídeos de esteviol no produto, e alguns deles afetam o perfil de gosto da preparação final.
[012]A remoção dessas impurezas, utilizando resinas adsorventes poliméri- cas em geral, rende produtos com um teor total de glicosídeos de esteviol de até 90%, o que significa que a adsorção comum - técnica de dessorção pode alcançar um aumento apenas parcial do teor total de glicosídeos de esteviol. As misturas restantes ainda afetam as características sensoriais do produto final que limitam seu uso em aplicações alimentícias.
[013]Portanto, faz-se necessário um desenvolvimento de produtos de glicosil stevia altamente purificados com menor teor de aditivos, o que irá proporcionar a melhor combinação de perfil de sabor e potência de doçura.
[014]A presente invenção destina-se a superar as desvantagens dos adoçantes de Stevia existentes. A invenção descreve um processo para produzir um ingrediente alimentício com alto grau de pureza a partir do extrato da planta Stevia rebaudiana Bertoni e à sua utilização em vários produtos alimentícios e bebidas como um modificador de sabor e doçura.
[015]A invenção, em parte, se refere a um ingrediente compreendendo derivados glicosilados de glicosídeos de esteviol da planta Stevia rebaudiana Bertoni. Os glicosídeos de esteviol são selecionados a partir do grupo que consiste em este- viosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, esteviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e suas misturas.
[016]A invenção, em parte, é pertinente a um processo para a produção de um ingrediente que contenha formas glicosiladas de esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, esteviolbiosídeo, rubusosídeo bem como outros glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni. O processo pode ser um processo de transglicosilação enzimático usando CGTases produzidas por culturas de Bacillus stearothermophilus. O processo também pode ter uma etapa de tra tamento enzimático pós-transglicosilação utilizando várias glicosidases. O processo também pode ter as etapas de descoloração, dessalinização e remoção de dextrinas e várias outras impurezas. A descoloração pode ser realizada utilizando carvão ativado. A dessalinização pode ser efetuada por passagem através de resinas de troca iônica e/ou filtros de membrana. A remoção das impurezas e de dextrina pode ser realizada pela passagem através de resina polimérica macroporosa.
[017]Na invenção, o extrato de Stevia comercializado por PureCircIe (Jiangxi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo (28 a 30%), Rebaudiosídeo A (50 a 55%), Rebaudiosídeo C (9 a 12%), Rebaudiosídeo F (1 a 3%) e de outros glicosídeos perfazendo o teor total dos glicosídeos de esteviol de pelo menos 95%, foi usado como material de partida. Alternativamente, os extratos de stevia com uma proporção diferente dos glicosídeos de esteviol, bem como de glicosídeos de esteviol altamente purificados como Rebaudiosídeo A, esteviosídeo, Rebaudiosídeo D, rubusosídeo etc., podem ser usados como materiais de partida.
[018]O material de partida foi submetido à transglicosilação enzimática por ação de ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) na presença de amido como um doador de glicose. Como resultado, derivados de a-1,4-glicosil do glicosídeo de esteviol inicial foram formados. Em seguida, a mistura de reação foi submetida a tratamento com uma a-amilase para reduzir o número de impurezas capazes de adsorver na resina adsorvente macroporosa em etapas adicionais de processamento.
[019]As impurezas da mistura de reação obtida foram removidas por resina Amberlite XAD7 HP, e, em seguida a mistura de reação purificada foi descolorida, deionizada, concentrada e seca por pulverização.
[020]Os produtos obtidos foram aplicados em vários alimentos e bebidas como adoçantes, intensificadores de adoçante e modificadores de sabor incluindo sorvetes, biscoitos, pães, sucos de frutas, produtos lácteos, produtos de panificação e produtos de confeitaria.
[021]Deve ficar entendido que tanto a descrição geral anterior como a descrição detalhada seguinte são exemplificativas e explicativas e destinam-se a proporcionar uma melhor explicação da invenção, conforme reivindicada.
[022]Nenhum.
[023]As vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. No entanto, deve ficar entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando formas de realização preferidas da invenção, são oferecidos apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na técnica a partir desta descrição detalhada.
[024]Extrato de Stevia comercializado por PureCircIe (Jiangxi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo (28-30%), Rebaudiosídeo A (50-55%), Rebaudiosídeo C (9-12%), Rebaudiosídeo F (1-3%) e outros glicosídeos (doravante coletivamente, "glicosídeos de esteviol") totalizando o teor total de glicosídeos de esteviol de pelo menos 95%, foi usado como um material de partida. Alternativamente, extratos de stevia com uma proporção diferente de glicosídeos de esteviol, bem como glicosídeos de esteviol altamente purificados como Rebaudiosídeo A, esteviosídeo, Rebaudiosídeo D, rubusosídeo etc., podem ser usados como materiais de partida.
[025]A análise por HPLC das matérias primas e dos produtos foi realizada em cromatografia líquida da Agilent Technologies da série 1200 (EUA), equipado com a coluna Zorbax-NH2 (4,6X250mm). A fase móvel foi gradiente de acetonitrila- água a partir de 80:20, v/v (0-2 min) a 50:50, v/v (2-70 min). Um detector de arranjo de diodo ajustado para 210 nm foi utilizado como o detector.
[026]O teor total de glicosídeos de esteviol foi determinado de acordo com "g-Glucosyltransferase Treated Stevia", Japan's Specifications and Standards for Food Additives, 8th edition, 2009. P 257-258.
[027]A transglicosilação foi realizada por ciclomaltodextrina glucanotransfe- rases (CGTases; EC 2.4.1 0,19) produzida pelo Bacillus stearothermophilus St-88 (PureCircIe Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malásia). No entanto, qualquer outra CGTase ou enzima possuindo atividade de transglicosilação intermo- lecular pode ser aplicada também. A enzima pode estar em uma forma de caldo de cultura isenta de células, caldo de cultura concentrado líquido isento de células, caldo de cultura isento de células seco por pulverização ou liofilizado, ou proteína de alta pureza. Podem ser usadas preparações enzimáticas livres e imobilizadas.
[028]A atividade de preparações de CGTase foi determinada de acordo com o procedimento descrito em Hale W.S, Rawlins L.C (1951) Amilase de Bacillus ma- cerans. Cereal Chem. 28, 49-58.
[029]Amidos de origem diferente podem ser utilizados como doadores de unidades de glicosil, tais como, os derivados de trigo, milho, batata, tapioca e sagu.
[030]O amido foi submetido à hidrólise parcial (liquefação) antes da reação de transglicosilação. O equivalente de dextrose do amido parcialmente hidrolisado pode estar na faixa de cerca de 10 a 25, preferivelmente cerca de 12 a 16. Qualquer enzima capaz de hidrólise do amido pode ser utilizada para a liquefação, tais como- α-amilases, β-amilases, etc. Numa forma de realização, as misturas de CGTase e a- amilase como enzimas de liquefação são preferidas.
[031]A atividade de a-amilase é expressa em Unidades de Kilo Novo a- amilase (KNU). Um KNU é a quantidade de a-amilase que, sob condições padrão (pH 7,1; 37°C), dextriniza 5,26 g de amido sob a forma de matéria seca por hora.
[032]A mistura de liquefação contém cerca de 0,001-0,2 KNU, de preferência cerca de 0,05-0,1 KNU de a-amilase por uma unidade de CGTase.
[033]O uso de a-amilase na liquefação permite atingir uma produção mais elevada na filtração adicional de carbono ativado. Quando a CGTase é usada como a única enzima de liquefação, a taxa de filtração é de aproximadamente de 10-15 L/h por 1m2 da superfície do filtro. No caso da mistura de enzimas de liquefação (compreendendo a-amilase e CGTase) a taxa de filtração é duas vezes mais rápida - aproximadamente 20-30 L/h por 1 m2 da superfície do filtro.
[034]A proporção de amido e de CGTase na mistura de liquefação é de cerca de 0,1-0,5 unidades por 1 grama de amido, de preferência cerca de 0,2-0,4 unidades por grama.
[035]A concentração de amido na mistura de liquefação é de cerca de 15- 40% (peso/peso), de preferência cerca de 20-30%.
[036]A liquefação é realizada a cerca de 70-90°C durante cerca de 0,5-5 horas, de preferência cerca de 1 -2 horas.
[037]Após a liquefação, a mistura de reação é submetida à inativação térmica da a-amilase, em condições de baixo pH. A faixa de pH preferida para a inativação é cerca de pH 2,5 a pH 3,0 e temperatura preferida é de cerca de 95-105°C. A duração da inativação térmica é de cerca de 5-10 minutos.
[038]Após a inativação, o pH da mistura de reação é ajustado a cerca de pH 5,5-6,5 e os glicosídeos de esteviol são adicionados à mistura e dissolvidos. A razão preferida dos glicosídeos de esteviol para amido (kg de glicosídeos de esteviol por 1 kg de amido) é de cerca de 0,5-1,5, de preferência cerca de 0,8-1,2.
[039]Uma segunda parte da preparação de CGTase é adicionada e a reação transglicosilação é realizada a cerca de 65°C por cerca de 24-48 horas. A quantidade da segunda parte de CGTase é de cerca de 0,2-4 unidades de CGTase por grama de sólidos, de preferência cerca de 0,5-1,2 unidades por grama de sólidos.
[040]Após a conclusão da reação transglicosilação, a reação foi interrompida por aquecimento a cerca de 95°C durante cerca de 15 minutos para inativar a CGTase e a solução foi tratada a uma segunda porção de a-amilase de cerca de 0,01 -0,2 KNU, de preferência cerca de 0,05-0,1 KNU por grama de sólidos foi adiei- onado e a reação continuou durante cerca de 12-16 horas a cerca de 55-95°C, de preferência cerca de 65°C. A α-amilase derivada de Bacillus licheniformis St-3501 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malaysia) foi utilizada nesta fase. No entanto, as α-amilases e outras glicosidases derivadas de qualquer outra fonte também podem ser usadas.
[041]Subsequentemente, a mistura de reação foi submetida à inativação térmica de a-amilase em baixas condições de pH. A faixa de pH preferida para a inativação é cerca de pH 2,5 a pH 3,0 e temperatura preferida é de cerca de 95-105°C. A duração da inativação térmica é de cerca de 5-10 minutos. Em seguida, a solução foi tratada com carvão ativado para obter uma mistura de reação descolorida. A quantidade de carvão ativado foi de cerca de 0,02-0,4 gramas por grama de sólidos, de preferência cerca de 0,05-0,2 gramas por grama de sólidos.
[042]A mistura de reação descolorida foi dessalinizada por passagem através de resinas de troca iônica, como Amberlite FPC23 (tipo H+) e Amberlite FPA51 (tipo OH ). Outros métodos de descoloração e dessalinização apropriados, tais como filtração por membranas, ou outros métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados.
[043]A mistura de reação dessalgada foi depois concentrada por meio de um evaporador a vácuo e seca por meio de um secador de pulverização. Outros métodos de concentração e secagem apropriados, tais como filtração por membrana, liofi- lização ou outros métodos conhecidos da técnica podem ser usados. O produto resultante contém glicosídeos não-modificados, derivados de a-1,4-glicosil e impurezas (Amostra 1).
[044]A fim de preparar um produto com maior teor de glicosídeos doces totais (a soma de glicosídeos glicosilados e não glicosilados), as impurezas foram removidas usando Amberlite XAD7 HP antes do tratamento de dessalinização. Os glicosídeos de esteviol e seus derivados glicosilados foram adsorvidos sobre a resina e, subsequentemente, eluídos por etanol aquoso. O eluído de etanol aquoso resultante, contendo glicosídeos de esteviol glicosila foi subsequentemente descolorido e dessalinizado conforme descrito acima e a solução de glicosídeos, após a evaporação do solvente de eluição, foi pulverizada por secagem por pulverização. O produto de glicosil stevia altamente purificado resultante contém glicosídeos não modificados, e derivados de a-1,4-glicosil (Amostra 2).
[045]Usando um procedimento semelhante ao da Amostra 2, com exclusão da etapa de tratamento pós-transglicosilação da a-amilase, um outro produto de glicosil stevia de alta pureza, contendo glicosídeos não-modificados e derivados de a- 1,4-glicosil, foi preparado (Amostra 3).
[046]A composição das amostras está resumida na Tabela 1. Tabela 1
[047]A avaliação sensorial das amostras foi realizada utilizando soluções aquosas, com 20 críticos. Com base na aceitação total das amostras foram escolhidas as amostras mais desejáveis e mais indesejáveis. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2
[048]Como é evidente a partir dos resultados da Tabela 2, a qualidade de doçura da Amostra 2 foi classificada como a de superior qualidade. No geral, as amostras com maior teor de glicosídeo de esteviol possuíram melhor perfil de gosto.
[049]A amostra 2 teve a mais elevada potência de doçura (160 vezes mais doce em comparação com uma solução de sacarose a 5%).
[050]As composições da presente invenção podem ser utilizadas como po- tenciadores de doçura, intensificadores de sabor e adoçantes em vários produtos alimentícios e bebidas. Exemplos de produtos alimentícios e bebidas não limitantes incluem refrigerantes carbonatados, bebidas prontas para consumo, bebidas energé- ticas, bebidas isotônicas, bebidas de baixa caloria, bebidas de zero caloria, bebidas esportivas, chás, sucos de frutas e vegetais, suco de frutas, bebidas lácteas, bebidas de iogurte, bebidas alcoólicas, bebidas em pó, produtos de panificação, biscoitos, misturas de panificação, cereais, confeitos, balas, caramelos, gomas de mascar, produtos lácteos, leite flavorizado, iogurtes, iogurtes flavorizados, leite fermentado, molho de soja e outros produtos a base de soja, molhos para salada, maionese, vinagre, sobremesas congeladas, produtos de carne, produtos à base de peixe, alimentos enlatados e engarrafados, adoçantes de mesa, frutas e vegetais.
[051]Além disso, as composições podem ser utilizadas em fármacos ou preparações farmacêuticas e cosméticos, incluindo, mas não limitado a, pasta de dentes, enxaguante bucal, xarope para tosse, comprimidos mastigáveis, pastilhas, preparações de vitaminas e semelhantes.
[052]As composições podem ser usadas "como tal" ou em combinação com outros adoçantes, sabores e ingredientes alimentícios.
[053]Exemplos não limitantes de adoçantes incluem glicosídeos de esteviol, esteviosídeo, Rebaudioside A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, bem como outros glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas desta, extrato de stevia, extrato de Luo Han Guo, mogrosídeos, xarope de milho com alto teor de frutose, xarope de milho, açúcar invertido, fruto- oligossacarídeos, inulina, inulo-oligossacarídeos, açúcar de acoplamento, malto- oligossacarídeos, maltodextrinas, sólidos de xarope de milho, glicose, maltose, sacarose, lactose, aspartame, sacarina, sucralose, e álcoois de açúcar.
[054]Exemplos não limitantes de sabores incluem limão, laranja, fruta, banana, uva, pera, abacaxi, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, sabores de baunilha.
[055]Exemplos não limitantes de outros ingredientes alimentícios incluem sabores, acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agentes corantes, agentes de enchimento, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espessantes, gelificantes.
[056]Os exemplos seguintes ilustram várias formas de realização da invenção. Deve ser entendido que a invenção não se limita aos materiais, proporções, as condições e aos procedimentos estabelecidos nos exemplos, os quais são apenas ilustrativos.
[057]Uma cepa de Bacillus stearothermophilus, St-88 foi inoculada em 2000 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% de amido, 0,25% de extrato de milho, 0,5% (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCOs (pH 7,0-7,5) a 56°C durante 24 horas com aeração contínua (2,000 L/min) e agitação (150 rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado utilizando Kerasep, membrana cerâmica de 0,1 pm (Novasep, França) para separar as células. O permeado isento de células foi novamente concentrado duas vezes em ultrafiltros Persep de 10Da (Orelis, França). A atividade da enzima foi determinada de acordo com Hale, Rawlins (1951). Foi obtida uma preparação bruta de enzimas com atividade de cerca de 2 unidades/mL.
[058]Uma cepa de Bacillus licheniformis St-3501 foi inoculada em 400 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% de amido, 1,0% de extrato de milho, 0,5% de NaCI, 0,1% de CaC03, e 0,002% de MnS04 (pH 7,2-7,3), a 56°C durante 24 horas com aeração contínua (400 L/min) e agitação (250 rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado utilizando Kerasep, membrana cerâmica de 0,1 pm (Novasep, França) para separar as células. O permeado isento de células foi concentrado 100 vezes mais em ultrafiltros Persep de 10kDa (Orelis, França). Foi obtida uma prepara- ção bruta de enzimas com atividade de cerca de 100 KNU/mL.
[059]100 g de amido de tapioca foi suspenso em 300 mL de água (pH 6,5). 2 KNU de a-amilase obtida de acordo com o Exemplo 2 e 30 unidades de CGTase obtidas de acordo com o Exemplo 1 foram adicionadas, e a liquefação de amido foi realizada a 80°C durante cerca de uma hora para dextrose equivalente a cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado a pH 2,8 com ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Depois de arrefecer a 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido pela PureCircIe (Jiangxi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos totalizando um teor total de glicosídeos de esteviol de cerca de 96,4% foi adicionado ao amido liquefeito e agitou-se até obter uma solução homogênea. 200 unidades de CGTase foram adicionadas à solução e a mistura foi mantida a uma temperatura de 65°C durante 24 horas sob agitação contínua. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C durante 15 minutos para inativar a enzima, e 14 KNU de a-amilase obtida de acordo com o Exemplo 2 foi adicionado. A reação foi continuada por mais 12 horas a 65°C. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 pelo ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar a enzima. Depois de arrefecer a 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 20 gramas de carvão ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C sendo mantida nessa temperatura por 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água a 5% de teor de sólidos e passada por colunas recheadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OH ). A solução dessalinizada foi concentrada a 60°C, sob vácuo, e seca em uma forma de pó utilizando secador de pulverização de laboratório. Foram obti- das 190 gramas do produto (Amostra 1).
[060]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH 6,5). 2 KNU de a-amilase obtida de acordo com o Exemplo 2 e foram adicionadas 30 unidades de CGTase obtidos de acordo com o Exemplo 1, e a liquefação de amido foi realizado a 80°C durante cerca de uma hora para um equivalente de dextrose de cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 com ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Depois de arrefecer para 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido pela PureCircIe (Jiangxi) Co., Ltd. (China) contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos totalizando um teor total de gli-cosídeos de esteviol de cerca de 96,4% foram adicionados ao amido liquefeito e agi- tou-se até que uma solução homogênea fosse obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionadas à solução e a mistura foi mantida a uma temperatura de 65°C durante 24 horas sob agitação contínua. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95° C durante 15 minutos para inativar a enzima, e 14 KNU de a-amilase obtida de acordo com o Exemplo 2 foram adicionados. A reação foi continuada por mais 12 horas a 65°C. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 com ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar a enzima. Depois de arrefecer até 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 20 gramas de carvão ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C sendo mantida nesta temperatura durante 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água a 5% de teor de sólidos e passada por colunas cada qual recheada com 4000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. As colunas foram lavadas com 5 volumes de água e 2 volumes a 20% (v/v) de etanol. Os glico- sídeos adsorvidos foram eluídos com etanol a 50%. O eluído obtido foi passado através de colunas recheadas com resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OHj. O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalinizada e descolorida foi concentrada a 60°C, sob vácuo, em seguida, seca em uma forma de pó utilizando secador de pulverização de laboratório. Obteve-se 149 gramas do produto (Amostra 2).
[061]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH 6,5). 2 KNU de a-amilase obtida de acordo com o Exemplo 2 e 30 unidades de CGTase obtidas de acordo com o Exemplo 1 foram adicionados e a liquefação do amido foi realizada a 80°C durante cerca de uma hora a um equivalente de dextrose de cerca de 15. O pH da mistura de reação foi ajustado para pH 2,8 com ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100°C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Depois de arrefecer para 65°C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 100 g de extrato de stevia produzido pela PureCircIe (Jiangxi) Co., Ltd. (China), contendo esteviosídeo 29,2%, Rebaudiosídeo A 54,3%, Rebaudiosídeo C 9,0%, Rebaudiosídeo F (1,7%) e outros glicosídeos totalizando glicosídeos de este-viol em cerca de 96,4% foram adicionados ao amido liquefeito e agitou-se até que uma solução homogênea fosse obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionadas à solução e a mistura foi mantida a uma temperatura de 65°C durante 24 horas sob agitação contínua. A mistura de reação obtida foi aquecida a 95°C durante 15 minutos para inativar a enzima. 20 gramas de carvão ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75°C e mantida nessa temperatura durante 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água a 5% de teor de sólidos e passada através de colunas cada qual recheada com 4000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. As colunas foram lavadas com 5 volumes de água e 2 volumes a 20% (v/v) de etanol. Os glicosídeos adsorvidos foram eluidos com etanol a 50%. O eluído obtido foi passado através de colunas recheadas com resina de troca iônica Amberlite FPC23 (H+) e Amberlite FPA51 (OHj. O etanol foi evaporado e a solução aquosa dessalinizada e descolorida foi concentrada a 60° C, sob vácuo, em seguida, seca em uma forma de pó utilizando secador de pulverização de laboratório. Foram obtidas 166 gramas do produto (Amostra 3).
[062]Um concentrado de laranja (35%), ácido cítrico (0,35%), ácido ascórbi- co (0,05%), cor vermelho alaranjada (0,01%), sabor de laranja (0,20%), Rebaudiosídeo A (0,003%) e diversas composições de glicosil stevia (0,03%) foram misturadas e completamente dissolvidas em água (até 100%) e pasteurizadas. Composições de glicosil stevia foram representadas pelas amostras 1, 2 e 3, obtidas de acordo com os Exemplos 3, 4 e 5, respectivamente.
[063]As avaliações sensoriais das amostras estão resumidas na Tabela 3. Os dados mostram que os melhores resultados podem ser obtidos usando a composição de glicosil stevia altamente purificada (Amostra 2). As bebidas preparadas com Amostra 2 apresentaram, particularmente, um perfil de sabor e um paladar redondo e completo. Tabela 3
[064]O mesmo método pode ser usado para preparar sucos e bebidas de suco de outras frutas, como maçãs, limões, damascos, cerejas, abacaxis, mangas, etc.
[065]Uma bebida carbonatada de acordo com a fórmula apresentada foi a seguir preparada.
[066]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 provadores. Os resultados estão resumidos a Tabela 4. Tabela 4
[067]Os resultados acima mostram que a bebida preparada usando a Amostra 2 possuía melhores características organolépticas.
[068]Farinha (50,0%), margarina (30,0%) frutose (10,0%), maltitol (8,0%), leite integral (1,0%), sal (0,2%), fermento em pó (0,15%), baunilha (0,1%) e diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) foram amassados muito bem na máquina de misturar massa. A massa obtida foi moldada e cozida em forno a 200°C durante 15 minutos. As composições de glicosil stevia foram representadas pelas Amostras 1,2 e 3, obtidas de acordo com os Exemplos 3, 4 e 5, respectivamente.
[069]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 provadores. Os melhores resultados foram obtidos nas amostras preparadas pela composição de glicosil stevia altamente purificada (Amostra 2). Os profissionais observaram um perfil de sabor arredondado e completo e bom paladar nos biscoitos preparados com a Amostra 2.
[070]Diferentes composições de glicosil stevia (0,03%) e sacarose (4%) foram dissolvidas em leite com baixo teor de gordura. As composições de glicosil stevia foram representadas pelas Amostras 1, 2 e 3, obtidas de acordo com os Exemplos 3, 4 e 5, respectivamente. Após a pasteurização a 82°C durante 20 minutos, o leite foi arrefecido a 37°C. Uma cultura iniciadora (3%) foi adicionada e a mistura foi incubada a 37°C durante 6 horas, em seguida, a 5°C durante 12 horas.
[071]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 provadores. Os melhores resultados foram obtidos nas amostras preparadas pela composição de glicosil stevia altamente purificada (Amostra 2). Os provadores observaram um perfil de sabor arredondado e completo bem como bom paladar na amostra preparada com a Amostra 2.
[072]Deve ficar entendido que as descrições precedente e as concretizações específicas aqui apresentadas são meramente ilustrativas do melhor modo da invenção e dos princípios da mesma, e que modificações e adições podem ser facilmente feitas pelos peritos na técnica sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção, ficando entendido, portanto, estar limitada apenas pelo âmbito das reivindicações anexas.
Claims (17)
1. Processo para produção de uma composição de glicosil stevia altamente purificada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: adicionar amido em água para formar uma suspensão de amido; adicionar uma mistura de a-amilase e CGTase na suspensão de amido e incubar por 0,5 a 2 horas a 75-80°C, resultando em uma suspensão de amido liquefeito; inativar a a-amilase por tratamento térmico a baixo pH; resfriar a suspensão de amido liquefeito e ajustar o pH a 5,5 a 7,0; adicionar glicosídeos de esteviol na suspensão de amido liquefeito, resultando em uma mistura de reação; adicionar uma segunda batelada de CGTase na mistura de reação e incubar por 12 a 48 horas a 55 a 75°C; adicionar uma segunda batelada de a-amilase na mistura de reação e incubar por 12 a 16 horas a 55 a 95°C; inativar a a-amilase da segunda batelada por tratamento térmico a baixo pH; ajustar o pH para 5,5 a 7,0; descolorir a mistura de reação; remover impurezas mediante contato da mistura de reação descolorida com resina adsorvente macroporosa e subsequentemente eluir os diterpenos glicosídeos adsorvidos com etanol aquoso para resultar em um eluído de etanol aquoso contendo glicosídeo; dessalinizar o eluído de etanol aquoso contendo glicosídeo com resinas de troca iônica; remover etanol do eluído de etanol aquoso, resultando em um eluído aquoso; e concentrar e secar o eluído aquoso para obter a composição de glicosil ste- via altamente purificada.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de a-amilase e CGTase contém 0,001 a 0,2 KNU de a-amilase por uma unidade de CGTase.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de a-amilase e CGTase contém 0,05 a 0,1 KNU de a-amilase por uma unidade de CGTase.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peso dos glicosídeos de esteviol adicionados é igual ao do amido.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os glicosídeos de esteviol adicionados são selecionados do grupo consistindo em esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, esteviolbiosídeo, ru- busosídeo, bem como outros glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas dos mesmos.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a CGTase é produzida por culturas de Bacillus stearothermophilus.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda batelada de CGTase tem 0,2 a 4 unidades de CGTase por grama de sólidos.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda batelada de CGTase tem 0,5 a 1,2 unidades de CGTase por grama de sólidos.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a a-amilase é produzida por culturas de Bacillus licheniformis.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda batelada de a-amilase é adicionada a 0,01 a 0,2 KNU, preferível- mente 0,05 a 0,1 KNU por grama de sólidos, e o tratamento é realizado a uma temperatura de 55-95°C durante 12-16 horas.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é realizada usando carvão ativado.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a descoloração é realizada usando resinas ou membranas de troca iônica, as referidas membranas sendo selecionadas a partir do grupo consistindo em membranas de ultrafiltração, nanofiltração e de osmose reversa.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a remoção de impurezas é realizada com uma pluralidade de colunas sequencialmente ligadas recheadas com uma resina adsorvente macroporosa, seguido por lavagem das colunas com água, então, lavagem com 10 a 50% (v/v) de etanol, desconexão das colunas e, então, eluição de cada coluna individualmente com 30 a 100% de etanol.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dessalinização é feita pela passagem do eluído por colunas recheadas com resinas ou membranas de troca iônica, as referidas membranas sendo selecionadas do grupo consistindo em membranas de ultrafiltração, nanofiltração e de osmose reversa.
15. Composição adoçante, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma composição de glicosil stevia altamente purificada produzida pelo processo conforme definido na reivindicação 1, e um agente adoçante adicional selecionado do grupo consistindo em: extrato de stevia, glicosídeos de esteviol, esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, dulcosídeo A, steviolbiosídeo, rubusosídeo, outros glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana Bertoni e misturas destes, extrato de Luo Han Guo, mogrosídeos, xarope de milho com alto teor de frutose, xa- rope de milho, açúcar invertido, fruto-oligossacarídeos, inulina, inulo- oligossacarídeos, açúcar de acoplamento, malto-oligossacarídeos, maltodextrinas, sólidos de xarope de milho, glicose, maltose, sacarose, lactose, aspartame, sacarina, sucralose, álcoois de açúcar, e uma combinação dos mesmos.
16. Composição flavorizante, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma composição de glicosil stevia altamente purificada produzida pelo processo conforme definido na reivindicação 1, e um agente flavorizante adicional selecionado do grupo consistindo em: limão, laranja, frutíferas, banana, uva, pera, abacaxi, manga, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha, e uma combinação dos mesmos.
17. Ingrediente alimentício, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma composição de glicosil stevia altamente purificada produzida pelo processo conforme definido na reivindicação 1, e um ingrediente alimentício adicional selecionado do grupo consistindo em: acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agentes de coloração, agentes de enchimento, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espessantes, gelifican- tes, e uma combinação dos mesmos.
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