BR112014002737B1 - Mir-135 - Google Patents

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Abstract

MICRO-RNAS E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS MESMOS PARA O TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO DE CONDIÇÕES MÉDICAS ASSOCIADAS À SEROTONINA, ADRENALINA, NORADRENALINA, GLUTAMATO, E CORTICOTROPINA QUE LIBERAM HORMÔNIO, abrange micro-RNAs e composições compreendendo os mesmos para o tratamento e diagnóstico de condições médicas associadas à serotonina, adrenalina, noradrenalina, glutamato, e corticotropina que liberam hormônio são fornecidos.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA
[0001] O presente pedido depatente de invenção, em algumas aplicações, refere-se a microRNAs e, mais especificamente, mas não exclusivamente, ao uso dos mesmos para diagnóstico, tratamento e tratamento de monitoramento de doenças.
[0002] Os transtornos de humor como uma grande depressão representam alguns dos mais comuns e proliferadores problemas de saúde em todo o mundo afetando cerca de 10% da população. Apesar de muitas décadas de pesquisa, os mecanismos por trás do início da depressão, terapias de susceptibilidade e disponíveis são apenas parcialmente compreendidas. Atualmente, apenas cerca de um terço dos pacientes respondem aos tratamentos disponíveis, desta forma, há uma grande necessidade de um melhor entendimento da patologia. O dogma atual sobre a etiologia da depressão é de uma complexa interação entre fatores ambientais e predisposição genética, o que sugere um papel mecanicista para processos epigenéticos.
[0003] Serotonina (5HT) é um neurotransmissor de monoamina produzido no cérebro pelo núcleo da rafe (RN/raphe nucleus), que se projeta amplamente por todo o cérebro para modular a variedade de funções cognitivas, emocionais e fisiológicas. A ligação entre a atividade serotonérgica desregulada e a depressão está bem estabelecida [Michelsen KA. Et al., Brain Res Ver (2007) 55(2):329-42]. Os níveis de 5HT, bem como o circuito genético responsável pela mesma produção, secreção e recaptação de desativação estão desregulados na depressão. Além disso, os medicamentos antidepressivos mais atualmente disponíveis direcionam a função das proteínas relacionadas ao sistema 5HT, resultando em um aumento dos níveis de 5HT na sinapse [Krishnan V e Nestler EJ, Nature (2008) 455: 894-902]. Terapêuticas disponíveis exigem um longo período de administração antes de o alívio dos sintomas ser observado.
[0004] MicroRNAs (miRs) são um subconjunto de pequenas moléculas de RNA (cerca de 22 nucleotídeos) que reprimem a expressão do gene póstranscricional. MiRs são transcritos como moléculas de miR primária, que são processadas no núcleo de célula em miRs precursores com estruturas de loop-tronco, que são exportadas para o citoplasma onde ainda são processadas nos miRs maduros ativos. O miR maduro é posteriormente incorporado no complexo de silencia induzido por RNA e função principalmente através da ligação às regiões 3' não traduzidas (3' UTRs) de moléculas de mRNA específicos. A ligação ocorre através da sequência de sementes, uma sequência de 6-8 nucleotídeos na extremidade 5' do miR, estes pares de bases em uma sequência de correspondência da semente complementar no mRNA 3' UTR alvo. A ligação de um miR leva a desestabilização direta de mRNA ou repressão translacional, resultando na redução dos níveis de proteína do gene alvo.
[0005] MiRs são abundantes no sistema nervosa, e a pesquisa inicial focou principalmente nos neurônios no contexto de desenvolvimento, câncer e distúrbios neurodegenerativos e processo normal como plasticidade [Kosik KS. Nat Rev Neurosci (2006) 7:911-20]. Adicionalmente, foi sugerido que miRs têm uma função nos distúrbios psiquiátricos, como esquizofrenia, autismo e também depressão e ansiedade, ambos em modelos de humanos e rato [Miller BH e Wahlestedt C, Brain Res (2010) 1338: 8999]. Vários estudos demonstraram recentemente o envolvimento de miRs nos genes relacionados à regulação 5HT [Milian MJ. Curr Opin Pharmacol (2011) 11(1):1l-22], revelando a função emergente de miRs na regulação do sistema 5HT e sua associação potencial com distúrbios relacionados à depressão.
[0006] O Pedido de Patente Norte-Americano No. 20100222413 (para Stoffel M. et al.). revela os oligonucleotídeos quimicamente modificados para expressão modular de microRNAs. U.S. 20100222413 ainda revela métodos para silenciar os microRNAs (por exemplo, miR-122, miR-16, miR-192 e miR-194) para o tratamento de doenças do sistema nervosa central.
SUMÁRIO
[0007] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção é fornecido um método para tratar uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica em um sujeito em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do sujeito um polinucleotídeo exógeno que codifica, pelo menos, um microRNA ou um precursor deste, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR-135, miR-335, miR-26 e miR-182, tratando, deste modo, a condição médica.
[0008] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido o uso de um polinucleotideo exógeno, codificando pelo menos um microRNA ou um precursor do mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo que consiste em miR-135, miR- 335, miR-26 e miR-182, para a fabricação de um medicamento identificado no tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica.
[0009] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de aumentar o nível de serotonina em uma fenda sinóptica de um sujeito em necessidade da mesma, o método compreendendo a administração ou expressão em um neurônio serotonérgico do sujeito um polinucleotídeo exógeno, codificando, pelo menos, um microRNA ou um precursor do mesmo, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR- 135, miR-335, miR-26 e miR-182, aumentando assim o nível de serotonina na fenda sináptica.
[00010] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de'invenção, é fornecida uma célula de neuróglia isolada, compreendendo uma estrutura de ácido nucleico expressando, pelo menos, um microRNA ou um precursor do mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo que consiste em miR-135, miR-335, miR-26 e miR-182 sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00011] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo exógeno, codificando pelo menos um microRNA ou um precursor do mesmo, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR- 135, miR-335, miR-26 e miR-182, no tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica.
[00012] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico em um sujeito em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do sujeito um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-19 ou um precursor do mesmo, tratando, desse modo, a condição médica.
[00013] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido o uso de um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-19 ou um precursor do mesmo para a fabricação de um medicamento identificado no tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico.
[00014] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula isolada, compreendendo uma estrutura de ácido nucleico, expressando um miR-19 ou um precursor do mesmo sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00015] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, codificando um miR-19 ou um precursor do mesmo para tratar uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico.
[00016] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRHIcorticotropin-releasin g hormone) é terapeuticamente benéfico em um sujeito em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do sujeito um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-15 ou um precursor do mesmo, tratando, assim, a condição médica.
[00017] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido o uso de um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-15 ou um precursor do mesmo para a fabricação de um medicamento identificado no tratamento de uma condição médica na qual um hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico.
[00018] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico expressando um miR-15 ou um precursor do mesmo, sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00019] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, codificando um miR-15 ou um precursor do mesmo para o tratamento de uma condição médica na qual o nível de hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico.
[00020] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um nível receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico em um sujeito em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do sujeito um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-181 ou um precursor do mesmo, tratando, assim, a condição médica.
[00021] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido o uso de um polinucleotídeo exógeno, codificando um miR-181 ou um precursor do mesmo para a fabricação de um medicamento identificado no tratamento de uma condição médica, na qual um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico.
[00022] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico, expressando um miR-181 ou um precursor do mesmo sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00023] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, codificando a miR-181 ou um precursor do mesmo no tratamento de uma condição médica na qual um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico.
[00024] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido a estrutura de um ácido ucléico compreendendo uma ucléico de ácido nucléico, codificando um microRNA ou um precursor do mesmo, caracterizado pelo microRNA ou um precursor do mesmo ser selecionado do grupo que consiste em miR-135, miR-335, miR-26, miR-27, miR-181, miR-182, miR-19 e miR-15, estando a ucléico de ácido ucléico sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00025] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo a estrutura de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00026] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene triptofano hidroxilase 2 (Tph2/tryptophan hydroxylase) em uma célula de neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou a expressão de um microRNA ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR-181 e miR27, regulando, desse modo, a expressão do gene Tph2.
[00027] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor glutamato em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de. uma atividade ou expressão do miR-181 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene receptor de glutamato.
[00028] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucléico para regular para baixo uma expressão de miR -181, miR-27 ou um precursor do mesmo.
[00029] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida a estrutura de um ácido ucléico, compreendendo uma ucléico de ácido nucléico para regular para baixo uma expressão de um microRNA ou um precursor do mesmo, caracterizado pelo microRNA ou um precursor do mesmo ser selecionado do grupo constituído pelo miR-181 e pelo miR-27, estando a ucléico de ácido ucléico sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis.
[00030] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene transportador de serotonina (S1c6a4) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um microRNA ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR- 135 e miR-335, regulando, desse modo, a expressão do gene Slc6a4.
[00031] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene receptor inibitório 1a de serotonina (Htrla) em uma célula euroglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou a expressão de um microRNA ou um precursor do mesmo na célula euroglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo que consiste em miR- 135, miR-335, miR-181, miR-182 e miR-26, regulando, desse modo, a expressão do gene Htrla.
[00032] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene da Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down (Dscam 1 Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene Dscam.
[00033] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene da molécula Li de adesão celular (Licam) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene L1cam.
[00034] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene da proteína X associado à translina (Tsnax 1 translin- associated protein X), em uma célula euroglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo na célula euroglia, regulando, desse modo, a expressão do gene Tsnax.
[00035] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene de hidroxilase monoamina (MaoAlmonoamine hydroxylase) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-27, regulando, desse modo, a expressão do gene de MaoA.
[00036] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor beta-adrenérgico 1 (Adrbl) em uma célula neuróglia ou células cardíacas, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-19, regulando, desse modo, a expressão do gene Adrbl.
[00037] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene receptor canabinoide 1 (CB1) em uma célula euroglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-19 ou um precursor do mesmo na célula euroglia, regulando, desse modo, a expressão do gene CB1.
[00038] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene do receptor tipo 1 CRH em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão do miR- 15, regulando, desse modo, a expressão do gene do receptor CRH tipo 1.
[00039] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene da proteína de ligação 5 FK506 (FKBP5) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão do miR-15 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene FKBP5.
[00040] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene de sintaxina la (Stxla) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão do miR- 15 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene Stxla.
[00041] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene de quinase regulada de soro/glicocorticoide (Sgkl) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão do miR-15 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene Sgkl.
[00042] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene receptor beta-adrenérgico 2 (Adrb2) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão do miR-15 ou um precursor do mesmo na célula neuróglia, regulando, desse modo, a expressão do gene Adrb2.
[00043] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de monitoramento do tratamento de uma droga antidepressiva, o método compreendendo: (a) tratar um sujeito em necessidade das mesmas com uma droga antidepressiva; e (b) medição de um nível de expressão de um miR-135 no sangue do sujeito antes e após o tratamento, caracterizado pelo menor nível de expressão do miR-135 após o tratamento pela droga antidepressiva, em comparação com o nível de expressão do miR-135 antes do tratamento pela droga antidepressiva, ser indicativo do tratamento eficiente.
[00044] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de diagnosticar uma condição médica associada a serotonina em um sujeito em necessidade da mesma, o método compreendendo a medição do nível de expressão de um miR-135 no sangue de um sujeito, caracterizado pelo nível de alta expressão do miR-135, se comparado ao da amostra de sangue de um sujeito sadio, ser indicativo da condição médica associada a serotonina.
[00045] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula é uma célula neuróglia.
[00046] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula neuróglia é um neurônio serotonérgico.
[00047] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é tal como enunciado na SEQ ID N° [Sequência de Identificação N°]: 58-62.
[00048] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-335 é tal como enunciado na SEQ ID N°: 63-64.
[00049] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-26 é tal como enunciado na SEQ ID N°: 65-69.
[00050] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-182 é tal como enunciado na SEQ ID N°: 70-71.
[00051] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica é selecionada do grupo que consiste em uma depressão, uma ansiedade, um stress, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, uma dependência, uma fobia social, um distúrbio do sono, um distúrbio relacionado à comida, um distúrbio de crescimento e um distúrbio de reprodução.
[00052] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando o microRNA for miR-135, a condição médica é depressão ou ansiedade.
[00053] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a célula é uma célula neuróglia ou uma célula cardíaca.
[00054] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-19 é tal como enunciado na SEQ ID N°: 72-76.
[00055] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica é selecionada do grupo que consiste em um stress, uma ansiedade, uma deficiência de memória e uma condição cardíaca.
[00056] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-15 é tal como enunciado na SEQ ID N°: 77-80.
[00057] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica é selecionada do grupo que consiste em uma depressão, uma ansiedade, um stress, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, uma dependência, uma fobia social, um distúrbio do sono, um distúrbio relacionado à comida, um distúrbio de crescimento e um distúrbio de reprodução.
[00058] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo estando sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis ativo em uma célula neuróglia.
[00059] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo estando sob um controle transcricional de um elemento regulador da atuação do cis ativo em uma célula cardíaca.
[00060] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-181 é tal como enunciados na SEQ ID N°: 85-94.
[00061] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica é selecionada do grupo que consiste em uma convulsão, uma doença de Huntington, uma esquizofrenia, uma síndrome de X Frágil, um distúrbio de ansiedade generalizado e um câncer.
[00062] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o elemento regulador da atuação do cis é ativo em uma célula neuróglia ou uma célula cardíaca.
[00063] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o sujeito é um sujeito humano.
[00064] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreende aumentar a expressão do gene Tph2, a modulação compreende diminuir o miR-181 e/ou o miR27 na célula neuroglia.
[00065] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene Tph2 após regular para baixo o miR-181 e/ou o miR-27 na célula neuróglia.
[00066] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o gene receptor de glutamato é selecionado do grupo que consiste em receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grml), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 3 (Grik3), receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 2 (Grik2) e receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7).
[00067] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreender regular para baixo a expressão do gene Slc6a4, a modulação compreende regular para cima o miR- 135 e/ou miR-335 na células neuróglia.
[00068] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene Slc6a4 após regular para cima o miR-135 e/ou miR-335 na célula neuróglia.
[00069] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreender regular para baixo a expressão do gene Htrla, a modulação compreende regular para cima o miR- 135, miR-335, miR-181,.miR-182 e/ou miR-26 na célula neuróglia.
[00070] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene Htrla após regular para cima o miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 e/ou miR-26 na célula neuróglia.
[00071] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de - patente de invenção, quando a regulação compreender regular para baixo a expressão do gene MaoA, a modulação compreende regular para cima o miR- 27 na célula neuróglia.
[00072] De .acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene MaoA, após regular para cima.o miR-27 na célula neuróglia.
[00073] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreende regular apara baixo a expressão do gene Adrbl, a modulação compreende regular para cima o miR- 19 na célula neuróglia ou na célula cardíaca.
[00074] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene Adrbl após regular para cima o miR-19 na célula neuróglia ou na célula cardíaca.
[00075] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreender regulara para baixo a expressão do gene CB1, a modulação compreende regular para cima o miR- 19 na célula neuróglia.
[00076] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene CB1 após regular para cima o CB1 na célula neuróglia.
[00077] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreender regular para baixo a expressão do gene receptor tipo 1 CRH, a modulação compreende regular para cima o miR-15 na célula neuróglia.
[00078] De acordo com algumasaplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene receptor tipo 1 CRH após regular para cima o miR-15 na célula neuróglia.
[00079] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, quando a regulação compreender regulara para baixo a expressão do gene FKBP5, a modulação compreende regular para cima o miR-15 na célula neuróglia.
[00080] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, medir uma expressão do gene FKBP5 após regular para cima o miR-15 na célula neuróglia.
[00081] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, obter uma amostra de sangue do sujeito antes do tratamento.
[00082] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a droga antidepressiva é selecionada do grupo que consiste em inibidores seletivos de recaptação de serotonina (SSRI/selective serotonin reuptake inhibitors), antidepressivos tricíclicos e inibidores da recaptação de noradrenalina (NRI I noradrenaline reuptake inhibitors).
[00083] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica associada a serotonina é uma condição psiquiátrica.
[00084] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição psiquiátrica é selecionada do grupo que consiste em uma depressão, uma ansiedade, um stress, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, uma dependência, uma fobia social, um distúrbio do sono e um distúrbio relacionado à comida.
[00085] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 compreende o miR-135' ou o miR-135b.
[00086] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como é comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica a qual pertence o presente pedido de patente de invenção. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento poderem ser utilizados na prática ou teste de aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares estão descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser necessariamente limitantes.
[00087] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00088] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são descritas neste documento, a título de exemplo somente, tendo como referência os desenhos de acompanhamento. Com referência específica aos desenhos em detalhes, sublinhe-se que os elementos indicados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. A este respeito, a descrição tomada com os desenhos torna evidente aos especialistas na técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.
[00089] Nos desenhos: A figura 1A-I retrata a expressão microRNA nos neurônios de serotonina (5HT). A Figura lA é uma ilustração gráfica de miRNAs expressos diferencialmente em neurônios 5HT. Valores normalizados Lowess são retratados como valores de mudança de dobra 1n2 da intensidade do ponto traçado com relação às intensidades de logs médios (Gráfico MA); a Figura 1B é uma validação dos resultados da matriz em tempo real miRs PCR indicando um aumento dos níveis de miR-375 nos neurônios 5HT comparado ao controle. n= 5 células 5HT, n= 4 não 5HT. Barras representam uma média ± de s.e.m. **P=0,0071; a Figura 1C é uma validação dos resultados da matriz em tempo real miRs PCR indicando uma diminuição dos níveis de miR135a nos neurônios 5HT comparado ao controle. N= 5 células 5HT, n = 4 não 5HT. **P=0,0075; a Figura 1D é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para Slc6a4, com 5HT resultados de micro matriz e listando miRs escolhidos para testes in vitro; a Figura lE é um diagrama de van representando predições de bioinformática cruzadas para Htrla com resultados de micro matriz 5HT e listando miRs escolhidos para testes in vitro; a Figura 1F é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para Tph2 com resultados de micro matriz 5HT e listagem de miRs escolhidos para testes in vitro; a Figura 1 é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para MaoA com resultados de micro matriz 5HT e listagem de miRs escolhidos para testes in vitro; a Figura 1H é um gráfico que ilustra os resultados de ensaio de repórter luciferase indicando que o vmiR-181c e o miR-27b podem direcionar o Tph2 3'UTR; e a Figura lI é um gráfico que ilustra os resultados de ensaio de repórter luciferase indicando que miR-27b pode direcionar o Htrla MaoA; A figura 2A-H retrata o direcionamento microRNA de Slc6a4 3'UTR (SEQ ID N°: 25) e Htrla 3'UTR (SEQ ID N': 27) . A figura 2A é uma ilustração do direcionamento miR-135a e miR-135b (SEQ ID N°s: 24 e 26, respectivamente) do Slc6a4 3'UTR; a figura 2B é uma ilustração do direcionamento miR-135a e miR-135b (SEQ ID N°s: 24 e 26, respectivamente) do Htrla 3'UTR; a Figura 2C é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase, indicando que o miR-135a e o miR-135b podem direcionar Slc6a4 3'UTR. Os dados do ensaio de luciferase retratam a atividade .luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter luciferase. de vaga-lume cotransfectado em células HEK293 transfectadas com 3'UTR do gene descrito e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico. Barras representam uma média ± de s.e.m. *P=0,014, ***P=0,0002, para miR-16 #p<0,0535, para miR-27 #P=0,0967; a figura 2D é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase indicando que miR-135a, miR-135b, miR-335, miR-181C e miR26a podem direcionar Htrla 3'UTR. ***P<0,0001, **P=0,0029; a figura 2E é um desenho da conservação slc6a4 3'UTR das combinações de sementes para miR-135. (SEQ ID N°s: 27-41); a figura 2F é um desenho das combinações de sementes Htrla 3'UTR para miR-135 (SEQ ID N°s: 42-54), indicando que a semente 1 aparece apenas no rato 3' UTR, e semente 2 é altamente conservada; a figura 2 é um gráfico que ilustra que a mutação na combinação de semente miR-135 no slc6a4 3'UTR bloqueou o efeito repressor de miR-135a e miR-135b, ***P<0,0001, **P=0,0032; e a figura 2H é um gráfico que ilustra a mutação na combinação de semente miR-135 no Htrla 3' UTR individualmente e os dois juntos, indicando que miR135b direciona Htrla através de ambas as combinações de sementes e miR-135a apenas pela semente 2. ***P<0,0001; A figura 3A-J retrata os níveis de miR-135a e miR-135b sob diferentes condições. A Figura 3A é um gráfico que ilustra uma regulação para baixo dos níveis de miR-135a no RN após stress agudo. As barras representam uma média ± de s.e.m. (n=8 no grupo 0, n=10 no grupo 90 e n=9 no grupo 24) ***P<0,0001, *P=0,0357; a Figura 3B é um gráfico que ilustra uma regulação para baixo dos níveis de miR-135b no RN após estresse agudo. ***P<0,0001, **P=0,0055; ,a figura 3C é um gráfico que ilustra uma regulação para cima dos níveis de miR-135a no RN após administração de imipramina aguda e crônica, independentemente de se os ratos foram expostos a derrota social. (n=8 em salina crônica de controle e imipramina crônica de controle, n=7 imipramina aguda, n=11 salina crônica da derrota social, n=9 na imipramina crônica da derrota social) **P=0,003; a figura 3D é um gráfico que ilustra uma regulação para cima dos níveis de miR-135b no RN após administração de imipramina aguda e crônica, independentemente de se os ratos foram expostos a derrota social. **P=0,0093; a figura 3E é um gráfico que ilustra o aumento nos níveis de miR-135a no RN após administração aguda ou crônica de SSRI, e não NRI ou solução salina. (n=8 em cada grupo, além da solução salina aguda n=7) ***P<0,0001; a figura 3F é um gráfico que ilustra níveis inalterados de miR-135b no RN após administração aguda ou crônica de SSRI ou NRI; a figura 3G é um gráfico ilustrando a diminuição nos níveis de miR-135a no plasma dos ratos, recebendo SSRI crônica ou aguda em comparação aos controles. (n=8 em cada grupo, além do SSRI e NRI crônicos n=7) **P=0,0004 para SSRI agudo comparado com solução salina aguda e **P=0,0006 para SSRI crônico comparado com a solução salina crônica; a figura 3H é um gráfico que ilustra níveis inalterados de miR-135b no plasma de ratos, recebendo SSRI crônico ou agudo em comparação aos controles; a figura 3I é um gráfico de dispersão demonstrando níveis de miR-135a em ratos individuais no RN em comparação com o plasma, indicando uma correlação inversa em ratos que receberam SSRI ou tratamento com solução salina; e a figura 3J é um gráfico de dispersão demonstrando nenhuma correlação entre os níveis de miR-135b no RN e o plasma em ratos que receberam tratamento de SSRI, em comparação com controles; As figuras 4A-H retratam superexpressão in vivo do miR- 135b. A figura 4A é um desenho esquemático dos lentivírus para a superexpressão do miR-135b; a figura 4B é um gráfico que ilustra os resultados PCR em tempo real, indicando superexpressão do miR-135b in vivo no núcleo de rafe dorsal (DRNIdorsal raphe nucleus) de ratos adultos. As barras representam uma média ± de s.e.m. (n=5 GFP injetado e n=3 miR-135 OE) P=0,0032; as figuras 3C-D são desenhos de um local de injeção DRN pela demonstração de coloração GFP no local de injeções. (Mapa de seção adotado de Paxinos); a figura 4E é um gráfico que ilustra uma diminuição do tempo de imobilidade no teste de natação forçada em ratos superexpressando o miR-135b no RN em relação ao controle de ratos. (n=9 controle n=9 miR- 135) P=0,0088 no minuto 3 e P=0,00330 para minuto 4; a figura 4F é um gráfico que ilustra a diminuição do tempo de imobilidade no teste de suspensão da cauda em ratos superexpressando o miR-135b no RN em relação ao controle de ratos. P=0,07351; as figuras 4G-H são gráficos que ilustram nenhuma diferença na locomoção de gaiola em ratos superexpressando o miR-135b no RN em comparação aos controles; A figura 5 retrata o ADRb1 3'UTR clonado acompanhando o gene da luciferase. O desenho do ADRbl 3'UTR (superior) intacto, abrigando quatro locais de ligação miR-19 e forma mutante (inferior) do ADRbl 3'UTR, faltando todos os quatro locais de ligação miR-19, clonaram a jusante ao gene da luciferase em plasmídeo Psicheck2; As figuras 6A-E retratam que miR-19b direciona ADRbl 3 'UTR através da combinação de sementes em sua 3' UTR; as figuras. 6A-B são gráficos que ilustram os níveis normalizados de luciferase, medidos em células HT22 que expressam níveis baixos de endógenos miR19, após transfecção com plasmídeo GFP (figura 6A) ou plasmídeo de superexpressão (OEloverexpression) pre-miR-19b (figura 6B); as figuras 6C-E são gráficos que ilustram os níveis de luciferase normalizados medidos em. células HEK293T que expressam altos níveis endógenos de miR-19. Transfecção com plasmídeo de controle (figura 6C), sonda de silenciamento (KDlknockdown) miR-19b (figura 6D) ou sonda de movimento como controle, e transfecção (Figura 6E) com plasmídeo miArrest miR-19b ou plasmídeo miArrest de controle. *** P<0,005. Uma atividade luciferase de renila foi normalizada por níveis de expressão de luciferase de vaga-lume e apresentada como razão da atividade alcançada pela forma mutante do Adrbl- 3'UTR (Adrbl-mut), na presença do tratamento de controle; As figuras 7A-D retratam a expressão diferencial do miRNA na amígdala. As figuras 7A-B são gráficos que ilustram a expressão diferencial do miRNA na amígdala 90 minutos após stress agudo. A figura 7A ilustra um resultado de matriz Agilent. A figura 7b ilustra resultados de matriz Affymetrix. Valores normalizados são retratados como relação de log2 (stress vs. controle) de intensidade local, traçada com relação às intensidades médias através das condições (N=2, 2). A intensidade de cada miRNA foi calculada como a intensidade média normalizada através de repetições biológicas. O miR-15a e o miR-15b são indicados em vermelho. O miR-124, um marcador neuronal bem estabelecido, não afetado pelo protocolo de stress, é indicado em branco; a Figura 7C ilustra que o miR-15a e miR-15b têm uma combinação de semente semi-conservada no receptor 3'UTR de tipo 1 do hormônio de liberação de corticotropina [(CRHR1, adaptado do targetscan(ponto)org]; e a figura 7D é um gráfico que ilustra a atividade de luciferase medida em células HEK293T co-transfectadas com superexpressão do miR-15b-EGFP ou expressando plasmídeo GFP e um plasmídeo relator de luciferase controlado por CRFR1-3'UTR. Uma atividade luciferase de renila foi normalizada por níveis de expressão de luciferase de vaga-lume; A figura 8 é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase indicando que o miR-182 provavelmente direciona o Htrla 3'UTR. Os dados dos ensaios de luciferase retratam a atividade luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter de luciferase de vaga-lume co-transfectado em células HEK293, transfectadas com 3'UTR do gene descrito e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico; A figura 9 é um gráfico ilustrando os resultados PCR em tempo real dos níveis de expressão do miR-182 no DRN de ratos adultos, indicando uma tendência para a diminuição da expressão após frustração Social Crônica. Os dados representam uma média ± de controles s.e.m. n=7 e 18 ratos no grupo de derrota social, # = p = 0,1; A figura 10 é um diagrama de van representando previsões bioinformáticas in silico para direcionamento miR-182 em dois algoritmos, e lista de genes alvo em potencial, altamente relevantes para a função neuronal normal e patológica, aparecendo nesta previsão; As figuras 11A-C retratam a superexpressão ou silenciamento do miR-182. A figura 11A é um desenho esquemático do lentivírus para uma superexpressão do miR-182; a figura 11B é um gráfico que ilustra os resultados PCR em tempo real, indicando uma superexpressão do miR-182 in vitro em linhagem de células N2A; e a figura 11 é um desenho esquemático do lentivírus por silenciamento do miR-182;; As figuras 12A-D mostram níveis de miR-19 no PFC após administração de NRI. A reboxetina NRI foi administrada tanto de forma aguda (uma vez) quanto crônica (por 18 dias). De nota, níveis de miR19a e 19b-miR diminuíram no PFC após administração aguda de NRI (figura 12A e figura 12B, respectivamente), mas aumentou após a administração crônica de NRI (figura 12C e figura 12D, respectivamente); As figuras 13A-D retratam níveis de miR-19 no PFC e amígdala dos ratos submetidos a derrota social. Os níveis de miR-19a e 19b- miR foram medidos em amostras de amígdala tiradas de ratos que foram submetidos a paradigma de derrota social. De nota, os níveis de miR-19a e miR-19b no PFC foram elevados em ratos categorizados como sendo "Suscetíveis" a derrota social, relativo a ratos de controle (figura 13A e figura 13B, respectivamente). Os níveis de miR-19 também foram elevados na amígdala de ratos categorizados como sendo "Suscetíveis" a derrota social, relativo a ratos de controle (figura 13 C e figura 13D, respectivamente); A figura 14 mostra o direcionamento de miRNA-19b CB1 3'UTR. A transfecção de células HT-22 com CB1 3' UTR e plasmídeos superexpressando tanto miR-19b quanto controle GFP levam a uma diminuição de 50% nos níveis de luciferase normalizado; As figuras 15A-B são desenhos esquemáticos de uma seção coronal do cérebro do rato. A Figura 15A mostra vários núcleos do cérebro, incluindo o BLA (adaptado do cérebro do rato por Paxinos e Franklin); a figura 15B mostra uma distribuição CB1 no cérebro (adaptado do Atlas do Cérebro de Allen www.mouse.brain-map.org/). De nota, é evidente por esta distribuição que a CB1 é abundante no BLA; A figura 16 é um desenho esquemático de um mecanismo proposto para a consolidação da memória no núcleo basolateral da amígdala (BLA I basolateral amygdala). A corticosterona (CORT) se liga a um receptor de glicocorticoide de membrana-limite ainda descaracterizada (mbGRImembrane-bound glucocorticoíd receptor) que ativa a via Gs- cAMP/PKA para induzir a síntese de endocanabinoides (eCBlendocannabinoid). Endocanabinoides são liberados na sinapse onde eles se ligam aos receptores CB1 em terminais gabaérgicos, inibindo a liberação de GABA. Esta inibição da liberação de GABA desinibe a liberação de norepinefrina (NE) e aumenta a ativação de NE dos adrenoceptores-3 pós- sinápticos, aumentando a consolidação de memórias emocionalmente repugnantes. As figuras 17A-B ilustram o Ago2 no complexo RISC. A figura 17A é um desenho esquemático da Ago2 no complexo RISC, mediando a interação entre o miRNA e o mRNA; a figura 17B ilustra uma análise do borrão ocidental realizada com anticorpo anti-Ago2. Este IP foi específico para a proteína Ago2, como pode ser visto quando comparando a amostra total do cérebro que foi precipitada uma vez com o anticorpo Ago2 e outra com o controle de IgGl. De nota, não houve nenhuma detecção da proteína Ago2 em amostras precipitadas com o controle de IgGl; As figuras 18A-D retratam um teste de esquiva social. Os ratos foram colocados em um labirinto por 3 minutos sozinhos para habituação (figura 18A e figura 18B) e seu movimento foi gravado e traçado. Após 3 minutos, um novo rato ICR foi colocado na câmara ao lado do rato examinado (figura 18C e figura 18D) e o movimento do rato examinado foi gravado e traçado novamente; A figura 19A retrata um desenho de um mapa de calor dos miRNAs selecionados regulados para cima nas matrizes; A figura 19B retrata um desenho de um mapa de calor dos miRNAs selecionados regulados para baixo nas matrizes; As figuras 20A-B retratam a expressão alog2 de miR-15a (figura 20A) e FKBP5 (figura 20B) dos resultados de micro matriz. Cada ponto vermelho refere-se a uma repetição de uma matriz. O grupo de controle (CNT) teve 4 repetições, o grupo de "Suscetíveis" (SUSC) teve 3 repetições e o grupo "Resiliente" (RESIL) teve 3 repetições. A linha preta mostrou a média das repetições em cada grupo; A figura 20 retrata uma sequência 3' UTR do rato FKBP5 (extraído do targetscan.org); As figuras 21A-B retratam os níveis de miR-15a amigdalar (figura 21A) e FKBP5 (figura 21B) em ratos "Suscetíveis" em relação a ratos de controle após a derrota social. De nota, os níveis de miR-15a foram elevados na amígdala de ratos submetidos a derrota social e caracterizado como "Suscetíveis" (figura 21A). Os níveis FKBP5 foram menores na amígdala de ratos submetidos à derrota social e caracterizado como "Suscetíveis" (figura 21B); A figura 22 é um desenho esquemático do 3'UTR do Stxla, Sgkl e Adrb2, cada um abrigando um único local de ligação miRNA-15; A figura 23 mostra os níveis de miR-181 amigdalar em ratos submetidos a derrota social relativo a ratos de controle. De nota, os níveis de miR-181 foram elevados na amígdala de ratos submetidos a derrota social; A figura 24 mostra diagramas de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para receptores miR-181 e glutamato; A figura 25 é um desenho esquemático do 3'UTR intacto de • 6 direcionamentos potenciais de miR-181; A figura 26 mostra os níveis de expressão de miR182 no núcleo de rafe após stress. De nota, um stress de imobilização agudo de 30 minutos levou à níveis de diminuição da expressão de miRl82 no RN quando testados 24 horas após o stress medido pelo PCR em tempo real. **=P<0,01; n=8 em cada grupo; As figuras 27A-C retratam os resultados de um ensaio de repórter luciferase indicando que o miR182 direciona DSCAM, L1CAM e TSNAX 3'UTR. A figura 27A ilustra dados dos ensaios de luciferase, retratando a atividade de luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter luciferase de vaga-lume cotransfectado em células N2a transfectadas com 3'UTR dos genes descritos e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico. A mutação na combinação de sementes miRl82 na Llcam (figura 27B) e Tsnax (figura 27) 3' UTRs bloqueou o efeito repressor do miR182. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001; As figuras 28A-D retratam a expressão do miR135 na amígdala (AMYlamygdala) e o córtex pré-frontal (PFCIprefrontal cortex). A Figura 28A ilustra que SSRI agudo e NRI aumentaram os níveis de miR135a na AMY; a figura 28B ilustra que os níveis de miR135b na AMY foram regulados para cima pela administração de SSRI agudo ou NRI se comparada à solução salina; a figura 28C ilustra que o SSRI crônico diminuiu os níveis de miR135a no PFC; e a figura 28D ilustra que os níveis de miR135b no PFC aumentaram por SSRI ou NRI agudo e diminuíram pelo tratamento de SSRI crônico. n=7-8 em cada grupo *=P<0,05;**=P<0,01;***=P<0,0001; As figuras 29A-B mostram aumento dos níveis de miR135 no sistema de circulação de ratos após derrota social. Os níveis de miR135a (figura 29A) e miRl35b (figura 29B) no plasma de ratos duas semanas após a derrota social aumentaram significativamente em relação aos ratos de controle (**=P<0,01 n=7-16 em cada grupo); As figuras 30A-E retratam a validação da KD miR135 in vitro e in vivo. As Figuras 30A-B ilustram os resultados de um ensaio repórter do luciferase indicando que o direcionamento de miRl35 do Htrla (Figura 30A) e slc6a4 (figura 30B) foi bloqueado pela estrutura da KD miR135b; a Figura 30C é um desenho esquemático da KD miRl35b e controle de vetores virais; e as figuras 30D-E são desenhos de um local de injeção DRN (figura 30 adotada de Paxinos) e figura 30E é uma coloração GFP de DRN infectados com lentivírus da KD miRl35; As figuras 31A-G retratam o comportamento de ansiedade aumentado e resposta atenuada de SSRI nos ratos da KD miR135. A figura 31A ilustra que o comportamento dos ratos da KD miRl35 foi semelhante aos ratos de controle no teste de campo aberto; a Figura 31B ilustra o comportamento de ansiedade aumentado em ratos da KD miRl35 em relação aos ratos de controle no labirinto de pulso elevado; a figura 31C ilustra que, no teste de transferência em luz negra, os ratos da KD miR135 gastaram mais tempo na câmara de luz em comparação com os ratos de controle sob condições de stress basal, mas não após stress agudo; a Figura 31D ilustra que os ratos da KD miR135 visitaram a câmara de luz mais vezes se comparado aos ratos de controle, sob condições de stress basal, mas não após stress agudo; a figura 31E ilustra que os ratos da KD miR135 viajaram menos distância na câmara de luz em relação aos ratos de controle, sob condições de stress basal, mas não após stress agudo; a figura 31F não ilustra nenhuma diferença entre os ratos da KD miR135 e ratos de controle no teste de suspensão de cauda, ambos em condições basais e após administração de SSRI, no entanto, a diminuição do tempo de imobilidade foi observada após tratamento de SSRI se comparado à condição basal em ambos os grupos. (Figuras 31F-G). O tempo de imobilidade foi reduzido em SSRI em ambos os grupos, no entanto, a redução foi atenuada em ratos da KD miRl35, em comparação aos ratos de controle nos últimos 2 minutos do teste.-=p<0,1 *=p<0,05;**=p<0,01; ***=p<0,001. n=10-11 em cada grupo; A figura 32 é um desenho esquemático do sistema de superexpressão induzível de ratos miR135. Ratos transgênicos expressam uma parada transacional em forma de sanduíche antes da sequência do miR135a e repórter GFP. Ratos transgênicos mutantes expressam o miR135a apenas em células positivas de 5-HT ePet; As figuras 33A-C retratam a validação de uma linha de ratos superexpressando o miR135 em neurônios 5-HT. A figura 33A ilustra que o miR135 foi superexpressado no RN de ratos miR135OE se comparado aos ratos de controle. As figuras 33B-C ilustram que o mRNA dos genes alvo miR 135 forma regulados para baixo em ratos miR135OE RN, ambos Slc6a4 (figura 33B) e Htrla (figura 33C). #=p<0,1 *=p<0,05; n=4 em cada grupo; e As figuras 34A-E retratam a diminuição do comportamento de ansiedade e depressão após derrota social em ratos miR135OE. A figura 34A mostra que os ratos miR135OE têm um comportamento de ansiedade diminuído no teste de campo aberto; a Figura 34B mostra menos comportamentos de ansiedade em relação aos ratos de controle miR135OE em um teste de transferência de luz negra; a figura 34 mostra uma diminuição do comportamento de ansiedade em relação aos ratos de controle no labirinto de pulso elevado dos ratos miRl350E; a figura 34 mostra uma tendência na diminuição do tempo da imobilidade de ratos miR135OE em comparação com ratos de controle em teste de suspensão de cauda; e a Figura 34E mostra o tempo de imobilidade reduzido em ratos miR135OE se comparado com ratos de controle no teste de natação forçada.#=p<0,1 *=p<0,05;**=p<0,01 n=7-11 em cada grupo.
DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES ESPECÍFICAS
[00090] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, se relaciona com microRNAs e, mais especialmente, mas não exclusivamente, com a utilização dos mesmos para a doença, diagnóstico, acompanhamento e tratamento.
[00091] Os princípios e o funcionamento do presente pedido de patente de invenção podem ser melhor compreendidos tendo como referência os desenhos e descrições que o acompanha.
[00092] Antes de explicar pelo menos uma aplicação do presente pedido de patente de invenção em detalhes, deve ser entendido que o presente pedido de patente de invenção não está necessariamente limitado em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificado pelos exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou realizado de várias maneiras. Também, deve ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregada neste documento têm o propósito de descrição e não deve ser considerado como limitação.
[00093] A ligação entre a atividade serotoninérgica desregulada e transtornos psiquiátricos como ansiedade e depressão foi estabelecida anteriormente, no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essas patologias não são totalmente compreendidos. MicroRNAs (miRs) são um subconjunto de pequenas moléculas de RNA que regulam a expressão do gene pós-transcricionalmente e são abundantes no cérebro.
[00094] Reduzindo-se o presente pedido de patente de invenção a prática, os inventores presentes revelaram que microRNAs específicos (miRs) estão envolvidos na regulação de genes relacionados a serotonina (5HT) neuróglia e, portanto, estão envolvidos na modulação de condições médicas associadas com os níveis de serotonina aberrante, tais como distúrbios psiquiátricos.
[00095] Como é ilustrado adiante e na seção de exemplos que segue, os inventores presentes determinaram o padrão de expressão miRs nos neurônios 5HT, obtidos a partir do núcleo de rafe (RN) de ratos de repórter 5HT (ePET- YFP), utilizando micro matriz miRs (ver Tabelas 2A-B nos Exemplos e a seção que segue). O perfil único de expressão miRs dos neurônios serotonérgicos, obtidos a partir da matriz, foi analisado bioinformaticamente para identificar miRs que presumidamente visavam genes chaves serotonérgicos relacionados, tais como transportador de serotonina (S1c6a4, Figura 1D), auto receptor de serotonina (Htrla, Figura 1E), triptofano hidroxilase 2 (Tph2, Figura 1F) e monoamina hidroxilase (MaoA, Figura 1G). O direcionamento do m1RNA dos 3'UTRs para estes genes foram testados, ainda, in vitro, ilustrando miRs específicos (ex.: miR-135) que especificamente direciona e regula os genes neuronais 5HT (ver Figuras 1H-I e Figuras 2C-D). Os inventores presentes ilustraram, ainda, que os níveis de expressão miR-135 são alterados no RN e plasma após stress agudo (Figuras 3A-D) e após o tratamento com antidepressivos (Figuras 3E-J). A superexpressão in vivo do miR-135 no RN de ratos adultos reduziu o comportamento semelhante a depressão após derrota social (Figuras 4A-H). Além disso, os inventores presentes ilustraram a atividade do miR-182 como um regulador da atividade neuronal (via repressão direta de Htrla, Figura 8) e do comportamento psicopatológico (Figura 9) e do miR- 15 como regulador da resposta ao stress [via repressão direta de CRH1R (Figuras 7A-B), proteína de ligação 5 FK506 (FKBP5) (Figuras 21A-B) e Stxla, Sgkl e Adrb2 (Figura 22)]. Os inventores presentes também ilustraram o direcionamento específico dos receptores beta-adrenérgicos (Adrbl) e do receptor canabinoide 1 (OB1) por miR-19. A superexpressão miR-19 reprimiu o Adrbl (Figuras 6A-C) enquanto o silenciamento de miR-19 reforçou a expressão do Adrbl (Figuras 6D-E). A superexpressão miR-19 também reprimiu o CB1 (Figura 14). Os inventores presentes também têm direcionamentos descobertos para o miR- 181.
[00096] Especificamente, os inventores presentes ilustraram que o miR-181 regula exclusivamente os receptores de glutamato (Figuras 24 e 25). Tomados em conjunto, estes resultados fundamentaram o uso de miRNAs ou sequências que regulam os mesmos, tais como miR-135, miR-335, miR-181, miR-182, miR26, miR-27, miR-15 e miR-19, como modalidades terapêuticas.
[00097] Assim, de acordo com um aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica em um indivíduo em necessidade da mesma, o método compreende administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando, pelo menos, um microRNA ou um precursor do mesmo.
[00098] De acordo com uma aplicação específica, para o tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica, o microRNA compreende miR-135, miR-335, miR-26 e miR-182.
[00099] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade das mesmas, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando um microRNA ou um precursor do mesmo.
[000100] De acordo com uma aplicação específica, para o tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-19.
[000101] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH I corticotropin-releasing hormone) é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando uma microRNA ou um precursor do mesmo.
[000102] De acordo com uma aplicação específica, para o tratamento de uma condição médica na qual o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-15.
[000103] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um nível de receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando um microRNA ou um precursor do mesmo.
[000104] De acordo com uma aplicação específica, para o tratamento de um condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-181.
[000105] O termo "tratamento" refere-se a inibição ou contenção do desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição e/ou causando a redução, remissão ou regressão da doença, distúrbio ou condição ou impedindo uma doença, distúrbio ou condição médica de ocorrer em um indivíduo que pode estar em risco da doença, distúrbio ou condição, mas ainda não foi diagnosticado como tendo o a doença, distúrbio ou condição. Os especialistas na técnica vão entender que várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar o desenvolvimento de doença, distúrbio ou condição, e da mesma forma, várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redução, a remissão ou a regressão de uma doença, distúrbio ou condição.
[000106] Conforme utilizado neste documento, o termo "indivíduo" inclui mamíferos, preferencialmente seres humanos, em qualquer idade que sofrem de patologia. Preferencialmente, este termo engloba os indivíduos que correm o risco de desenvolver a patologia.
[000107] Conforme utilizado neste documento, a frase "condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica" refere-se a uma doença ou distúrbio em que aumentar o nível de serotonina pode prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante).
[000108] Conforme utilizado neste documento, o termo "serotonina" refere-se ao neurotransmissor monoamina [também conhecido como 5- hidroxitriptamina (5-HT)]. A serotonina está prevista, por exemplo, nos números CAS 50-67-9.
[000109] De acordo com uma aplicação, é fornecido um método aumentar um nível de serotonina em uma fenda sinóptica, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula neuróglia, p.ex., neurônio serotonérgico do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando pelo menos um microRNA ou um precursor do mesmo.
[000110] Conforme utilizado neste documento, o termo "fenda sináptica" refere-se à área entre dois neurônios por onde passam sinais elétricos ou químicos.
[000111] Uma "célula neuróglia" refere-se a um neurônio ou uma célula glial (p.ex., oligodendrócitos ou astrócitos).
[000112] Conforme utilizado neste documento, o termo "neurônio serotonérgico" refere-se a um neurônio que segrega a serotonina ou é capaz de recaptação de serotonina (i.e, pelos transportadores de serotonina expressados em suas superfícies da célula).
[000113] A condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica pode incluir, por exemplo, qualquer transtorno de humor, incluindo depressão, ansiedade, stress, fadiga, perturbações da função cognitiva, ataques de pânico, comportamento compulsivo, vício, fobia social; transtorno do sono, transtorno relacionado aos alimentos, distúrbio de crescimento e reprodução.
[000114] De acordo com uma aplicação específica, a condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica compreende a depressão.
[000115] De acordo com uma aplicação, Quando a condição médica for depressão ou ansiedade, o microRNA é miR-135.
[000116] Deve-se observar que a depressão ou a ansiedade não possam necessariamente ser relacionadas à serotonina.
[000117] Conforme utilizado neste documento; a frase "condição médica em que um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico" refere-se a uma doença ou transtorno no qual diminuindo a expressão ou atividade de adrenalina ou noradrenalina pode-se prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante).
[000118] Conforme utilizado neste documento, o termo "adrenalina" refere-se ao hormônio e ao neurotransmissor (também conhecido como epinefrina). A adrenalina está prevista, por exemplo, no número CAS 51-434.
[000119] Conforme utilizado neste documento, o termo "noradrenalina" refere-se a catecolamina, agindo como um hormônio e neurotransmissor (também conhecido como norepinefrina). A noradrenalina é prevista, p.ex., em números CAS (1) 51-41-2 (1) e 138-65- 8(d1).
[000120] A condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfica pode incluir, por exemplo, transtornos de estresse, ansiedade, deficiência de memória, doenças do coração (p.ex., palpitações, taquicardia, arritmia), dores de cabeça, tremores, hipertensão e edema pulmonar agudo.
[000121] Conforme utilizado neste documento a frase "condição médica em que o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico" refere-se a uma doença ou transtorno no qual se diminuindo a expressão ou atividade de CRH pode se prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante).
[000122] Conforme utilizado neste documento, o termo "hormônio liberador de corticotropina (CRH)" refere-se ao hormônio polipeptídeo e neurotransmissor (também conhecido como fator liberador de corticotropina (CRFIcorticotropin-releasing factor) ou corticoliberina). O CRH está previsto, p.ex. no NP 000747.1.
[000123] A condição médica na qual um baixo nível de CRH é terapeuticamente benéfico pode incluir, por exemplo, estresse, depressão, ansiedade, fadiga, função cognitiva prejudicada, ataques de pânico, comportamento compulsivo, vício, fobia social, transtorno do sono, alimentares, transtorno de crescimento, transtorno de reprodução e obesidade.
[000124] Conforme utilizado neste documento, a frase "condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico" refere-se a uma doença ou distúrbio no qual se diminuindo a expressão ou a atividade de um glutamato receptor pode se prevenir o aparecimento de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados com os mesmos (como mais detalhado adiante).
[000125] Conforme utilizado neste documento, o termo "receptor de glutamato" refere-se a um receptor sinóptico normalmente localizado sobre as membranas das células neuronais (p.ex., Grml, Grik3, Grm5, Gria2, Grik2 e Grm7). O receptor de glutamato está previsto, p.ex., no NP 000822.2 [receptor de glutamato ionotrópico, cainato 3 (Grik3Iglutamate receptor ionotropic kainate 3)]; NP 000817.2, NP 001077088.1, NP 001077089.1 [receptor de glutamato ionotrópico AMPA 2(Gria2)];
[000126] NP 001159719.1, NP 068775.1, NP 786944.1 [receptor de glutamato ionotrópico, cainato 2 (Grik2)]; NP 000833.1, NP 001137303.1 [receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5 glutamate receptor metabotropic)]; NP 000835.1, NP_870989.1 [receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7)]; NP 000829.2, NP 001107801.1 [receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grm1)].
[000127] A condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico pode compreender, por exemplo, convulsões (p.ex., epilepsia), doença de Huntigtons, esquizofrenia, síndrome do X frágil, transtorno de ansiedade generalizada e câncer (p.ex., melanoma).
[000128] Conforme utilizado neste documento, o termo "microRNA ou um precursor do mesmo" refere-se a moléculas microRNA (miRNA) atuando como reguladores pós-transcricionais. Os microRNAs são normalmente processados dos pré-miR (precursores prémicroRNA). Pré-miRs são um conjunto de moléculas de miRNA de precursores transcritos pelo RNA polimerase III que eficientemente transformado em miRNAs funcionais, p.ex., sobre transfecção em células cultivadas. Um pre-miR pode ser utilizado para eliciar a atividade específica do miRNA em tipos de células que normalmente não expressam esse miRNA, abordando assim a função de seu direcionamento diminuindo sua expressão em um experimento de "ganho de função (miRNA)". O projeto Pre-miR existe para todos os miRNAs conhecidos, listados nos Registros do miRNA e podem ser facilmente projetados para qualquer pesquisa. Os microRNAs podem ser administrados à célula por se ou codificado a partir de uma molécula precursora ligada em uma estrutura de ácido nucleico, como descrito mais adiante.
[000129] Deve-se observar que os microRNAs dos ensinamentos presentes possam ligar, anexar, regular, processar, interferir, aumentar, estabilizar e/ou desestabilizar qualquer microRNA alvo. Esse alvo pode ser qualquer molécula, incluindo, mas não se limitando a, as moléculas de DNA, moléculas de RNA e polipeptídeos, tais como, mas não limitado a, genes relacionados a serotonina, tais como o transportador de serotonina (i.e. SERT ou Slc6a4), o gene do receptor inibitório lA de serotonina (Htrla), triptofano hidroxilase 2 (Tph2) e monoamina hidroxilase (MaoA); receptores de adrenalina ou noradrenalina (receptores adrenérgicos tais como Adr1); Adenilato ciclase tipo 1 (ADCY1); receptores CRH como Crh1R; ou qualquer outras moléculas, p.ex., proteína de ligação FK506 5 (FKBP5), receptor canabinoide 1 (CB1), Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down (Dscam), gene da proteína X (Tsnax) associada à translina e molécula de adesão celular Ll (LlcamIcell adhesion molecule), todos descritos adiante em mais detalhes.
[000130] Deve-se observar que os microRNAs do presente pedido de patente de invenção possam ser identificados através de vários bancos de dados, incluindo, por exemplo, o registro de microRNA (http://wwwdotsangerdotacdotuk/Software/Rfam/mima/mdexdot shtml) .
[000131] Os métodos do presente pedido de patente de invenção podem ser efetuados ao se administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando um microRNA.
[000132] O termo "polinucleotídicas" refere-se a um oligômero de cadeia única ou cadeia dupla ou polímero de ácido ribonucleico (RNA), Ácido desoxirribonucleico (DNA) ou miméticos respectivos. Este termo inclui polinucleotídeos e/ou oligonucleotídeos derivados de moléculas de ácidos nucleicos de ocorrências naturais (p.ex., o RNA ou DNA), polinucleotidicos sintéticos e/ou moléculas do oligonucleotídeos, compostas de bases naturais, açúcares e ligações internucleosídeas covalentes (p.ex., estrutura), bem como de polinucleotídeos sintéticos e/ou oligonucleotídeos tendo porções não-naturais, que funcionam da mesma forma às respectivas partes que ocorre naturalmente.
[000133] O comprimento do polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é opcionalmente de 100 nucleotídeos ou menos, opcionalmente de 90 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 80 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 70 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 60 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 50 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 40 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 30 nucleotídeos ou menos, p.ex., 29 nucleotídeos, 28 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 26 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 22 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 17 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, opcionalmente, entre 12 e 24 nucleotídeos, opcionalmente entre 5-15, opcionalmente, entre 5-25, mais de preferência, aproximadamente 20-25 nucleotídeos.
[000134] Os polinucleotídeos (incluindo oligonucleotídeos) projetados de acordo com os ensinamentos do presente pedido de patente de invenção podem ser gerados de acordo com qualquer método de síntese de oligonucleotídeos conhecido na técnica, incluindo tanto sínteses enzimáticas quanto sínteses de fase sólida. Equipamentos e reagentes para execução da síntese de fase sólida estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, da Applied Biosystems. Quaisquer outros meios para tal síntese também podem ser empregados; a síntese real dos oligonucleotídeos encontra-se dentro das capacidades de um especialista na técnica e pode ser realizada através de metodologias estabelecidas conforme detalhado em, por exemplo: Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Ausubel, R. M. et al., eds. (1994, 1989), "Current Protocols in Molecular Biology," Volumes I-III, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland; Perbal, B. (1988), "A Practical Guide to Molecular Cloning," John Wiley & Sons, New York; e Gait, M. J., ed.) (1984), "Oligonucleotide Synthesis"; utilizando química de fase sólida, p.ex., fosforamidita cianoetil, seguida de desproteção, dessalinização e purificação por, por exemplo, um método automatizado de tritil-on ou HPLC.
[000135] Deve-se observar que um polinucleotídeo constituído por uma molécula de RNA pode ser gerado utilizando um vetor de expressão, conforme descrito adiante.
[000136] Preferencialmente, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é um polinucleotídeo modificado. Polinucleotídeos podem ser modificados utilizando vários métodos conhecidos na técnica.
[000137] Por exemplo, os oligonucleotídeos ou polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem compreender nucleosídeos heterocílicos, consistindo de bases de pirimidinas e purinas, ligadas em uma ligação fosfodiéster de 3' a 5'.
[000138] Exemplos específicos de oligonucleotídeos preferenciais ou polinucleotídeos úteis, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, incluem oligonucleotídeos ou polinucleotídeos contendo um estrutura modificado ou ligações não-naturais internucleosídeas. Oligonucleotídeos ou polinucleotídeos tenda estrutura modificado incluem aqueles que mantêm um átomo de fósforo na estrutura, conforme divulgado nas Patentes Norte-Americanas N°: 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; e 5.625.050.
[000139] Estruturas preferencialmente modificadas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos incluem, por exemplo: fosforotioatos; fosforotioatos quirais; fosforoditioatos; fosfotriesteres; fosfotriesteres aminoalkila; metila e outros fosfonatos alquila, incluindo fosfonatos alquilenos-3' e fosfonatos quirais; Fosfinatos; fosforamidatos, incluindo fosforamidatos amino-3' e aminoalquilfosforamidatos; tionofosforamidatos; tionoalquilfosfonatos; tionoal- quilfosfotriésteres; e boranofosfatos tendo ligações normais de 3-5', análogos dos mesmos ligados de 2'-5', e aqueles tendo polaridade invertida, onde os pares adjacentes de unidades de nucleosídeos são ligados de 3'-5' a 5'3' ou 2'-5' a 5'-2'. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre das modificações acima também podem ser usados.
[000140] Alternativamente, estruturas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos modificadas que não incluem um átomo de fósforo em si têm estruturas formadas por ligações de internucleosídeos de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomo misto e ligações de internucleosídeos de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações de internucleosídeos heteroatômicos de cadeia curta ou heterocíclicas. Estes incluem aqueles que têm vínculos morfolinos (formados em parte a partir da porção de' açúcar de uma nucleosídeo); estruturas de siloxano; sulfeto, sulfóxido e estruturas de sulfona; estruturas de formacetil e tioformacetil; estruturas de formacetil e tioformacetil de metileno; estruturas contendo alceno; estruturas de sulfamato; estruturas de metileno- imino e metileno- hidrazina; estruturas de sulfonato e sulfonamida; estruturas de amida; e outros tendo partes misturadas de componentes de N, 0, S e CH2, conforme divulgado nas Patentes Norte-Americanas N°: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289;5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439.
[000141] Outros oligonucleotideos ou polinucleotideos que podem ser utilizados, de acordo com o presente pedido de patente de invenção, são aqueles modificados tanto em açúcar quanto na ligação internucleosidea, i.e., a estrutura das unidades de nucleotídeo é substituída com grupos novos. As unidades base são mantidas para complementação com o polinucleotídeo alvo apropriado. Um exemplo de um oligonucleotídeo mimético inclui um peptídeo de ácidos nucleicos (PNAlpeptide nucleic acid). Um oligonucleotideo PNA refere-se a um oligonucleotídeo onde a estrutura do açúcar é substituida pela estrutura de amida, contendo, em especial, um estrutura aminoetilglicina. As bases são mantidas e são vinculadas direta ou indiretamente a átomos de nitrogênio-aza da parte da estrutura de amida. Patentes Norte-Americanas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas às Pat. Norte-Americanas N°. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262; cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Outras modificações da estrutura, que podem ser utilizadas no presente pedido de patente de invenção, são divulgadas na Patente Norte-Americana N°. 6.303.374.
[000142] Oligonucleotídeos ou polinucleotfdeos do presente pedido de patente de invenção também podem incluir substituições ou modificações de bases. Conforme utilizado neste documento, bases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases purina adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Bases "Modificadas". incluem, mas não são limitadas a outras bases sintéticas e naturais, tais como: 5-metilcitosina (5-me-C); 5-hidroximetil citosina; xantina; hipoxantina; 2- aminoadenina; 6-metila e outros derivados alquílicos de adenina e guanina; 2- propil e outros derivados alquílicos de adenina e guanina; Z-tiouracila, 2- tiotimina, e 2-tiocitosina; 5-halouracila e citosina; 5-propinila uracila e citosina; 6-azo uracila, citosina e timina; 5-uracila (pseudouractla); 4- tiouracila; 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas 8-substituidas e guaninas; 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil, e outras uracilas 5-substituídas citosinas; 7-metilguanina e 7-metiladenina; 8- azaguanina e 8-azaadenina; 7-deazaguanina e 7-deazaadenina; e 3- deazaguanina e 3-deazaadenina. Bases modificadas adicionais incluem aquelas divulgadas em: Pat. Norte-Americana N°. 3.687.808; Kroschwitz, J. I., ed. (1990), "The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering," páginas 858-859, John Wiley & Sons; Englisch et al. (1991), "Angewandte Chemie," International Edition, 30, 613; e Sanghvi, Y. S., "Antisense Research and Applications," Cápitulo 15, páginas 289-302, S. T. Crooke e B. Lebleu, eds., CRC Press, 1993. Tais bases modificadas são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos do presente pedido de patente de invenção. Estas incluem 5- pirimidinas substituídas, 6azapirimidinas, e N-2, N-6, e O-6-purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila, e 5- propinilcitosina. Subistituições de 5-metilcitosina foram mostradas para aumentar a estabilidade frente e verso de ácidos nucleicos por 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S. et al. (1993), "Antisense Research and Applications," páginas 276- 278, CRC Press, Boca Raton), e são substituições de base atualmente preferidas, especialmente quando combinada com modificações de açúcar 2'- O-metoxietílico.
[000143] De acordo com uma aplicação específica, o miRNA polinucleotídico do presente pedido de patente de invenção tem uma sequência de ácido nucléico, conforme estabelecido adiante na SEQ ID N°: 58-94 (veja Tabela 1A). Tabela 1A: sequências de miRNA polinucleotídicos.
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[000144] Conforme mencionado acima e mostrado na seção de exemplos que segue, os microRNAs são moléculas transformadas, derivadas de precursores específicos (i.e., pré-miRNA), o aumento de uma função de miRNA específica pode ser efetuado utilizando uma molécula precursora miRNA específica.
[000145] Também contempladas são sequências homólogas aos miRNAs e seus precursores. O nível de homologia deve ser relativamente alto para o miRNA maduro, mas mais pedidos de liberdade são permitidos no nível precursor (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais), enquanto as alterações de sequência estão na sequência em grampo e não no segmento de ácido nucleico, correspondente do miR madura.
[000146] Tais agentes polinucleotídicos do precursor são normalmente administrados para as células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) como parte de uma estrutura de expressão. Neste caso, o agente polinucleotídico é ligado em uma estrutura de ácido nucleico sob o controle de um elemento regulatório de ação cis (p.ex., promotor) capaz de dirigir uma expressão do microRNA nas células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) de forma constitutiva ou induzível.
[000147] Exemplos de agentes polinucleotídicos de microRNA do presente pedido de patente de invenção incluem, mas não estão limitados a miR-15 (p.ex. adesão GenBank no. NR029485 RNA), miR-19 (p.ex. adesão GenBank no. NR029489.1), miR-26 (p.ex. adesão GenBank nos. NR02950O e NR029499), miR-27 (p.ex. adesão GenBank no. NR029501 RNA), miR-135 (p.ex. adesão GenBank no. NR_029677.1), miR-335 (p.ex. adesão GenBank no. NR 029899.1), miR-181(p.ex. GenBank accession no. NR 029611.1) e miR-182 (p.ex. adesão GenBank no. NR 029614).
[000148] Exemplos de promotores específicos de células dos neurônios incluem, mas não estão limitados a promotor do gene enolase de neurônio específico, promotor de sinapses, promotor sinapses reforçadas, promotor de calmodulina cálcica e promotor de Thyl.
[000149] Exemplos de promotores específicos de células cardíacas incluem, mas não estão limitados a promotor de NCX1 cardíaca e promotor de amiosina de corrente pesada (aMHCIa-myosin heavy chain).
[000150] As construções de expressão do presente pedido de patente de invenção também podem incluir sequências adicionais que a tornam apta para replicação e integração em eucariotas (p.ex. vetores de transporte). Vectores de clonagem típicos contém sequências de iniciação da transcrição e tradução (p.ex., promoção, aumento) e terminadores da transcrição e tradução (p.ex., sinais de poliadenilação). As construções de expressão do presente pedido de patente de invenção podem, ainda, incluir um intensificador, que pode ser adjacente ou distante da sequência do promotor e pode funcionar aumentando sua transcrição.
[000151] Elementos intensificadores podem estimular a transcrição em até 1.000 vezes de promotores homólogos ou heterólogos vinculados.
[000152] Intensificadores estão ativos quando colocados a jusante ou a montante do local de iniciação da transcrição. Muitos elementos intensificadores derivados de vírus têm um alcance amplo acolhimento e são ativos em uma variedade de tecidos. Por exemplo, o intensificador de gene precoce SV40 é apropriado para muitos tipos de células. Outras combinações do intensificador/promotor que são adequadas para o presente pedido de patente de invenção incluem os derivados do poliomavírus, humano ou citomegalovírus murino (CMV 1 murine cytomegalovirus) e as longas repetições em tandem (LTRs 1 long tandem repeats) de vários retrovírus, como o vírus da leucemia de murino, vírus do sarcoma de Rous ou murino e HIV. Vide Gluzman, Y. e Shenk, T., eds. (1983). Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que está incorporado neste documento por referência.
[000153] Sequências de poliadenilação também podem ser adicionadas às construções de expressão do presente pedido de patente de invenção, a fim de aumentar a eficiência da expressão da fração detectável. Dois elementos distintos da sequência são necessários para poliadenilação precisa e eficiente: sequências GU ou U-rich localizadas a jusante do local de poliadenilação e uma sequência altamente conservada de seis nucleotídeos, nomeadamente AAUAAA, localizada a 11-30 nucleotídeos acima do local. Sinais de terminação e poliadenilação adequadas o presente pedido de patente de invenção incluem os derivados de SV40.
[000154] Além das aplicações já descritas, as construções de expressão do presente pedido de patente de invenção podem tipicamente conter outros elementos especializados destinados a aumentar o nível de expressão dos ácidos nucleicos clonados ou para facilitar a identificação das células que transportam o DNA recombinante. Por exemplo, um número de vírus animais contêm sequências de DNA que promovem replicação extra
[000155] cromossômica do genoma viral em tipos de células permissivas. Plasmídeos, tendo estes réplicões virais são replicados episomalmente, enquanto os elementos adequados são fornecidos por genes que também encontram o plasmídeo ou com o genoma da célula hospedeira.
[000156] As construções de expressão do presente pedido de patente de invenção podem ou não incluir um réplicão eucariótico. Se houver um réplicão eucariótico, o vetor é capaz de amplificação em células eucarióticas, utilizando o marcador selecionável apropriado. Se a estrutura não compreende um réplicão eucariótico, não é possível uma amplificação epissomal. Em vez disso, o DNA recombinante se integra no genoma da célula projetada, onde o promotor direciona a expressão do ácido nucleico desejado.
[000157] A estrutura de ácidos nucleicos pode ser introduzida nas células alvo (p.ex. células neuróglias ou células cardíacas) do presente pedido de patente de invenção, utilizando um método/veículo de entrega apropriado do gene (transfecção, transdução, etc.) e um sistema de expressão adequado.
[000158] Exemplos de vetores de expressão mamíferos incluem, mas não estão limitados a pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, e pNMT81, que estão disponíveis a partir da Invitrogen, pCI disponíveis da Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV e pBK- CMV, disponíveis da Strategene, pTRES disponível da Clontech, e seus derivados.
[000159] Vetores de expressão contendo elementos reguladores de vírus eucariotas como retrovírus também podem ser usados. Vetores SV40 incluem pSVT7 e pMT2, por exemplo. Vetores derivados do vírus do papiloma bovino incluem pBV-1MTHA e vetores derivados do vírus Epstein. Vírus de barras incluem pHEBO e p205. Outros vetores exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5 e baculovírus pDSVE.
[000160] Sistemas com base em lipídios podem ser utilizados para a entrega dessas construções às células de destino (p.ex. células neuróglia ou células cardíacas) do presente pedido de patente de invenção.
[000161] Lipossomas incluem qualquer estrutura sintética (i.e., não naturais) composta de bicamadas lipídicas, que incluem um volume. Lipossomas incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões de fosfolipídios, camadas lamelares e afins. Os lipossomas podem ser preparados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica [Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145; Lasic D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (chapter 3); Winterhalter M, Lasic D, Chem Phys Lipids, 1993 September;64(1-3):35-43]. Os lipossomas podem ser carregados positivamente, neutro ou negativamente. Para absorção do Sistema de Fagócitos Mononucleares (MPS mononuclear phagocyte system), os lipossomas podem ser hidrofóbicos desde que o mascaramento hidrofílico da membrana em lipossomas (p.ex. pelo uso de lipídios de polietilenoglicol ligados e partículas hidrofílicas) possam ser menos propenso a absorção de MPS. Também é preferível que os lipossomas não compreendam lipídios blindados estericamente como gangliosídeos GM1 e fosfatidilinositol, desde que esses lipídios impeçam a absorção MPS.
[000162] Os lipossomas podem ser uma camada lipídica única ou podem ser multilamelar. Se o agente terapêutico for hidrofílico, sua entrega pode ser melhorada utilizando vesículas unilamelares grandes por causa de seu maior volume interno. Por outro lado, se o agente terapêutico for hidrofóbico, sua entrega pode ser melhorada utilizando vesículas multilamelares.
[000163] Alternativamente, o agente terapêutico (p.ex. oligonucleotídeos) pode não ser capaz de penetrar a bicamada lipídica e, consequentemente, permaneceria adsorvido à superfície dos lipossomas. Neste caso, aumentando a área de superfície do lipossoma, pode-se melhorar ainda mais a entrega do agente terapêutico. Lipossomas apropriados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, são lipossomas não tóxicos, tais como, por exemplo, aqueles preparados a partir de fosfatidil- colina fosfoglicerol e colesterol. O diâmetro dos lipossomas utilizado pode variar de 0,1-1,0 micra. No entanto, outras escalas de tamanho adequadas para a fagocitose por células fagocíticas também podem ser utilizadas. Para dimensionar os lipossomas, homogeneização pode ser utilizada, baseada na energia de corte para fragmentar lipossomas grandes em outros menores. Homogeneizadores que podem ser convenientemente utilizados incluem microfluidizadores, produzidos pela Microfluidics de Boston, MA. Em um procedimento típico de homogeneização, os lipossomas são recirculados através de um homogeneizador de emulsão padrão até que os tamanhos dos lipossomas selecionados sejam observados. A distribuição de tamanho de partículas pode ser monitorada pela discriminação de tamanho de partícula convencional por raio laser. A extrusão de lipossomas através de uma membrana de policarbonato de pequenos poros ou uma membrana cerâmica assimétrica é um método eficaz para reduzir tamanhos de lipossomas para uma distribuição de tamanho, relativamente bem definida. Normalmente, a suspensão é um ciclo através da membrana de uma ou mais vezes até que a distribuição de tamanho do lipossoma desejado seja alcançada. Os lipossomas podem ser extrudados através de membranas de poros sucessivamente menores para alcançar uma redução gradual no tamanho de lipossomas.
[000164] Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para incorporar um agente polinucleotídico lipossoma de microRNA. Por exemplo, o agente polinucleotídico de microRNA pode ser encapsulado no lipossoma. Alternativamente, ele pode ser adsorvido na superfície do lipossoma. Outros métodos que podem ser utilizados para incorporar um agente farmacêutico no lipossoma do presente pedido de patente de invenção são descritos por Alfonso et al., [The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)] e aqueles descritos por Kulkarni et al., [J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46].
[000165] Os lipossomas utilizados nos métodos do presente pedido de patente de invenção cruzam preferencialmente as barreiras do sangue. Assim, os lipossomas do presente pedido de patente de invenção, preferencialmente, não constituem uma barreira sangue direcionando um polissacarídeo (p.ex., manose) em sua porção de membrana. De preferência, os lipossomas do presente pedido de patente de invenção não incluem peptídeos em sua porção de membrana que direcionam os lipossomas a um receptor em uma barreira de sangue. Exemplos de tais peptídeos incluem, mas não estão limitados a transferrina, insulina, IGF-1, anticorpo receptor antitransferrina IGF-2, anticorpo receptor anti-insulina, anticorpo receptor anti-IGF-1 e anticorpo receptor antiIGF-2.
[000166] A fim de determinar os lipossomas que são especialmente adequados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, um ensaio de triagem pode ser executado como os ensaios descritos na Patente Norte-Americana. Appl. No. 20040266734 e Patente Norte- Americana. Appl. No. 20040266734; e em Danenberg et al., Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9; Circulation 2002, 106:599-605; Circulation 2003, 108:2798- 804
[000167] Outros vetores com base não lipídica que podem ser usados, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, incluem, mas não estão limitados à polilisina e dendrímeros.
[000168] A estrutura de expressão também pode ser um vírus. Exemplos de construções virais incluem, mas não estão limitados a vetores adenovírais, vetores retrovirais, vetores virais vaccínia, vetores de vírus adeno-associado, vetores virais polioma, vetores alfavirais, vetores rhabdovirais, vetores virais lenti e vetores herpéticos.
[000169] Vetores retrovirais representam uma classe de vetores particularmente adequados para uso com o presente pedido de patente de invenção. Retrovírus defeituosos são rotineiramente utilizados na transferência de genes em células de mamíferos (para uma revisão, ver Miller, A. D. (1990). Blood 76, 271). Um retrovírus recombinante, compreendendo os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção, pode ser construído utilizando técnicas moleculares conhecidas. Porções do genoma retroviral podem ser removidas para processar a maquinaria de replicação de retrovírus defeituoso e o retrovírus deficiente de replicação pode, então, ser encapsidado em viriões, que pode ser utilizado para infectar células alvo através da utilização de um ajudante de vírus enquanto empregando técnicas padrão.
[000170] Protocolos para a produção de retrovírus recombinantes e para infectar as células com vírus in vitro ou in vivo podem ser encontrados em, por exemplo, Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates, Inc. & John Wiley & Sons, Inc.). Retrovírus têm sido utilizados para introduzir uma variedade de genes em muitos tipos de células diferentes, incluindo células neuronais, células epiteliais, células endoteliais, linfócitos, mioblastos, hepatócitos e células da medula óssea.
[000171] De acordo com uma aplicação, um vetor lentiviral, um tipo de vetor retroviral, é utilizada de acordo com os ensinamentos presentes. Vetores lentivirais são amplamente utilizados como vetores devido à sua capacidade de integrar o genoma tanto das células que não se dividem quanto as que se dividem. O genoma viral, na forma de RNA, é transcrito reverso quando o vírus entra na célula para produzir o DNA, que é então inserido no genoma em uma posição aleatória pela enzima integrase viral. O vetor (um pró-vírus) permanece no genoma e é passado para a descendência da célula quando ela se divide. Por razões de segurança, vetores lentivirais nunca carregam os genes necessários para a sua replicação. Para produzir um lentivirus, vários plasmídeos são transfectados em uma linha celular chamada encapsidação, ou comumente, HEK 293. Um ou mais plasmídeos, geralmente referidos como plasmídeos de encapsidação, codificam as proteínas do vírião, tais como o capsídeo e o transcriptase reverso. Outro plasmídeo contém o material genético para ser entregue pelo vetor. Ele é transcrito para produzir o genoma viral do RNA de cadeia única e é marcado pela presença da sequência i (psi). Esta sequência é utilizada para encapsidar o genoma no vírião.
[000172] Um exemplo específico de um vetor lentiviral adequado para introduzir e expressar as sequências polinucleotídicas do presente pedido de patente de invenção em células neuróglia ou células cardíacas é o vetor lentiviral pLK0.1.
[000173] Outro vetor de expressão adequado que pode ser usado, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, é o vetor de adenovírus. O adenovírus é um vetor de transferência do gene extensivamente estudado e rotineiramente utilizado. As vantagens de um vetor de adenovírus incluem eficiência de transdução relativamente alta em células quiescentes e que se dividem; tropismo natural para uma ampla gama de tecidos epiteliais e fácil produção de altos títulos (Russel, W. C. (2000) J Gen Virol 81, 57-63). O DNA do vírus adenoide é transportado para o núcleo, mas não integra o mesmo. Assim, o risco de mutagênese com vetores adenovírus é minimizado, enquanto a expressão de curto prazo é particularmente adequada para o tratamento de células cancerosas. Vetores adenovírus utilizados em tratamentos de câncer experimental são descritos por Seth et al. (1999). "Adenoviral vectors for cancer gene therapy," pp. 103120, P. Seth, ed., Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX).
[000174] Um vetor de expressão viral adequado também pode ser um vetor de adenovírus/retrovírus quimérico, combinando componentes retrovirais e adenovirais. Tais vetores podem ser mais eficientes do que vetores de expressão tradicional para transdutar células tumorais (Pan et al. (2002). Cancer Letts 184, 179-188).
[000175] Ao introduzir as construções de expressão do presente pedido de patente de invenção em células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) por infecção viral, a dose viral para a infecção é de, pelo menos, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 ou partículas pfu e virais mais altas.
[000176] Independentemente do método ou estrutura empregada, é fornecida uma célula isolada que compreende a estrutura de ácido nucleico, codificação um microRNA, conforme detalhado acima.
[000177] Conforme utilizado este documento, o termo "isolado" refere- se a parcialmente separado do ambiente natural, por exemplo, o corpo humano.
[000178] De acordo com uma aplicação, é fornecida uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico, expressando pelo menos uma unidade organizacional de microRNA ou um precursor do mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR-15, miR-19, miR-26, miR-27, miR-181 e miR-182 sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.
[000179] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada neuróglia compreendendo uma estrutura de ácido nucleico expressando, pelo menos, um microRNA ou um precursor mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR- 26 e miR-182 sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.
[000180] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada, composta por uma estrutura de ácido nucleico, expressando um miR-19 ou um precursor do mesmo sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.
[000181] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico, expressando um miR-15 ou um precursor do mesmo sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.
[000182] De acordo com uma aplicação específica, a célula é uma célula neuróglia ou uma célula cardíaca.
[000183] De acordo com uma aplicação específica, a célula neuróglia é um neurônio como um neurônio serotonérgico.
[000184] Os microRNAs ou seus precursores devem ser fornecidos para as células, ou seja, células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) do presente pedido de patente de invenção in vivo (ou seja, dentro do organismo ou objeto) ou ex vivo (p.ex., em uma cultura de tecido). No caso das células serem tratadas ex vivo, o método de preferência inclui uma etapa de administração das tais células de volta ao indivíduo (terapia celular ex vivo terapia).
[000185] Para terapia ex vivo, as células são tratadas, preferencialmente, com o agente do presente pedido de patente de invenção (p.ex., um polinucleotídeo codificando um microRNA), depois que eles são administrados ao indivíduo em necessidade do mesmo.
[000186] A administração de
[000187] células ex vivo tratadas, do presente pedido de patente de invenção, pode ser efetuada utilizando qualquer rota
[000188] apropriada de introdução, como intravenosa, jntraperitoneal, intra-renal, faixa intra-gastrointestinal, subcutânea, transcutânea, intramuscular, intracutânea, intratecal, epidural e retal. De acordo com aplicações atualmente preferidas, as células tratadas ex vivo, do presente pedido de patente de invenção, podem ser introduzidas no indivíduo utilizando intravenosa, intrarenal, faixa intra-gastrointestinal e/ou administração intraperitoneal.
[000189] As células do presente pedido de patente de invenção (p.ex., células neuróglia ou células cardíacas) podem ser tanto derivadas de fontes autólogas quanto de origens alogênicas, como cadáveres humanos ou doadores. Uma vez que células não autólogas são susceptíveis a induzir uma reação imune quando administradas ao organismo, várias abordagens têm sido desenvolvidas para se reduzir a probabilidade de rejeição de células não autólogas. Estas incluem suprimir o sistema imunológico destinatário ou encapsular as células não autólogas em imunoisolação, membrana semipermeável antes do transplante.
[000190] Técnicas de encapsulamento são geralmente classificadas como microencapsulação, envolvendo pequenos veículos esféricos, e macroencapsulação, envolvendo membranas de folha plana e fibra oca maiores (Uludag, H. et al. (2000) . Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev 42, 29- 64) .
[000191] Métodos de preparação de microcápsulas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aquelas divulgadas em: Lu, M. Z. et al. (2000). Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene- acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng 70, 479-483; Chang, T. M. e Prakash, S. (2001) Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol 17, 249-260; and Lu, M. Z., et al. (2000). A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul 17, 245521.
[000192] Por exemplo, microcápsulas são preparadas com colágeno modificado em um complexo com um escudo ter-polímero de metilacrilato de 2hidroxietila (HEMA I hydroxyethyl methylacrylate), ácido metacrílico (MAA I methacrylic acid) e metacrilato de metila (MMA I methyl methacrylate), resultando em uma espessura da cápsula de 2-5 μm. Tais microcápsulas podem ser ainda mais encapsuladas com um adicional de 2-5 μm de capsulas de polímero-ter a fim de lhes conferir uma superfície lisa carregada negativamente para minimizar a absorção de proteínas do plasma (Chia, S. M. et al. (2002). Multi-layered microcapsules for cell encapsulation. Biomaterials 23, 849-856).
[000193] Outras microcápsulas são baseadas em alginato, um polissacarídeo marinho (Sambanis, A. (2003). Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Thechnol Ther 5, 665-668), ou seus derivados. Por exemplo, microcápsulas podem ser preparadas pela complexação do polieletrolito entre o alginato de sódio poliânico e sulfato de sódio de celulose e o hidrocloridrato de poli(metileno-co-guanidina) de policação na presença de cloreto de cálcio.
[000194] Deve-se observar que o encapsulamento da célula é melhorado quando cápsulas menores são usadas. Assim, por exemplo, o controle de qualidade, estabilidade mecânica, propriedades de difusão e atividades in vitro de células encapsuladas melhoraram quando o tamanho da cápsula foi reduzido de 1 mm para 400 μm (Canaple, L. et al. (2002). Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed 13, 783-96). Além disso, biocapsulas de nanoporos com tamanho de poros bem controlados, tão pequeno quanto 7 nm, químicas de superfície costuradas e microarquiteturas precisas foram consideradas para imuno-isolar microambientes para as células com êxito (Consulte: Williams, D. (1999). Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol 10, 6-9; e Desai, T. A. (2002). Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther 2, 633646).
[000195] Exemplos de agentes imunossupressores que podem ser utilizados em conjunto com o tratamento ex vivo incluem, mas não se limitando a metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE.sup.R), etanercepte, bloqueadores de TNF alfa, um agente biológico que direcione uma citocina inflamatória e fármacos anti- inflamatórios não esteroides (NSAIDs 1 non-steroidal anti-inflammatory drug). Exemplos de AINEs incluem, mas não estão limitados a ácido acetil salicílico, salicilato de magnésio de colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salsalato, salicilato de sódio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inibidores de Cox-2 e tramadol.
[000196] Para a terapia in vivo, o agente (p.ex., uma codificação de um microRNA polinucleotídico) é administrado ao indivíduo por si só ou como parte de uma composição farmacêutica. De preferência tais composições são formuladas para permitir a passagem através da barreira hemato-encefálica (BBB I blood brain barrier).
[000197] Abordagens convencionais para a entrega do fármaco para o sistema nervoso central (CNSIcentral nervous system) incluem: estratégias neurocirúrgicas (p.ex., injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (p.ex., a produção de uma proteína de fusão quimérica que compreende um peptídeo de transporte que tem uma afinidade com uma molécula de superfície celular endotelial em combinação com um agente que é incapaz de cruzar a BBB em si) em uma tentativa de explorar uma das vias de transporte endógena da BBB; estratégias farmacológicas destinadas a aumentar a solubilidade lipídica de um agente (p.ex., conjugação de agentes aos transportadores de lipídios ou colesterol); e a perturbação transitória da integridade da BBB por interrupção de hiper-osmóticos (resultante da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou o uso de um agente biologicamente ativo tais como um peptídeo angiotensina).
[000198] Métodos para administração de fármacos por trás da BBB incluem a implantação intracerebral (tais como com agulhas) e distribuição avançada da convecção. Manitol pode ser usado, evitando a BBB. Da mesma forma, administração da mucosa (p.ex., nasal) pode ser utilizada para ignorar a BBB.
[000199] Os agentes de microRNA polinucleotídicos do presente pedido de patente de invenção também podem ser administrados a um organismo em uma composição farmacêutica onde é misturado com transportadores apropriados ou excipientes.
[000200] Conforme utilizado neste documento uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes ativos descritos com outros componentes químicos tais como transportadores fisiologicamente adequados e excipientes. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto de um organismo.
[000201] Neste documento o termo "transportador ingrediente" refere-se ao peptídeo responsável pelo efeito biológico.
[000202] Doravante, as frases "transportador fisiologicamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável", podem ser usadas de forma intercambiável, referindo-se a um transportador ou um diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não revoga a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante é incluído sob estas frases.
[000203] Neste documento o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, diversos açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.
[000204] Técnicas para a formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente, que está incorporada neste documento por referência.
[000205] Vias adequadas de administração podem, por exemplo, incluir oral, retal, transmucoso, especialmente transnasal, entrega intestinal ou parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea e injeções de haste intramedular, bem como intratecal, intraperitoneal, intranasal, intranasal ou injeções intra- oculares.
[000206] Alternadamente, pode-se administrar a composição farmacêutica de forma local, ao invés de sistêmica, por exemplo, através da injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região de tecido de um paciente.
[000207] As composições farmacêuticas do presente pedido de patente de invenção podem ser fabricadas por processos conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigamento, emulsionantes, encapsulamento, captura ou processos de liofilização.
[000208] As composições farmacêuticas, para uso em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, podem, portanto, ser formuladas de modo convencional, utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis, compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam a transformação dos ingredientes ativos em preparações que, podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.
[000209] Para a injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em buffers fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou solução fisiológica de sal. Para administração do transmucoso, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.
[000210] Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada prontamente combinando os compostos ativos com os transportadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidas na técnica. Esses transportadores permitem a composição farmacêutica a ser formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões e afins, para a ingestão oral de um paciente. Preparações farmacológicas para o uso oral podem ser feitas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente efetuando a moagem da mistura resultante, e processamento da mistura de grânulos, depois de adicionar os auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos drágea. Excipientes adequados são, nomeadamente, enchimentos, tais como açúcares, incluindo a lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma tragacanto, celulose metila, celulose- hidroxipropilmetila, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis, tais como polivinilpirrolidona (PVPIpolyvinylpyrrolidone). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, como pirrolidona polivinila reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal respectivo como alginato de sódio.
[000211] Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados. Para este efeito, soluções de açúcar concentrado podem ser usadas, o que pode conter, opcionalmente, goma arábica, talco, pirrolidona polivinila, gel de carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos ativos.
[000212] Composições farmacêuticas que podem ser usadas por via oral, incluem cápsulas duras de gelatina, bem como cápsulas moles, capsulas seladas feitas de gelatina e um plastificante, tais como o glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os ingredientes ativos em mistura com enchimento como lactose, ligantes como amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os ingredientes ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizadores. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para a rota escolhida da administração.
[000213] Para administração bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de forma convencional.
[000214] Para administração por inalação nasal, os ingredientes ativos para uso, de acordo com o presente pedido de patente de invenção, convenientemente são entregues sob a forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de um pacote pressurizado ou um nebulizador com a utilização de um propulsor apropriado, p.ex., diclorodifluorometano, tricloromonofluormetano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada, fornecendo uma válvula para entregar uma quantidade de inaladores. Cápsulas e cartuchos de, p.ex., gelatina para uso em um distribuidor pode ser formulada contendo uma mistura de pó do composto e uma base em pó apropriada, como a lactose ou o amido.
[000215] A composição farmacêutica descrita neste documento pode ser formulada para administração parentérica, p.ex., por injeção ou contínua infusão do bolo. Formulações para injeção podem ser apresentadas sob forma de dosagem de unidade, p.ex., em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas com opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios como suspensão, estabilização e/ou agentes de dispersão.
[000216] Composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de preparação ativa na forma solúvel em água. Além disso, suspensões dos ingredientes ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa ou aquosa apropriada. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos, tais como o óleo de gergelim, ou ésteres sintéticos de ácidos graxos como oleato de etila, triglicérides ou lipossomas. Suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores apropriados ou agentes que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[000217] Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser em forma de pó para constituição com um veículo adequado, p.ex., solução à base de água estéril, apirógena, antes do uso.
[000218] A composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção também pode ser formulada em composições retais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, p.ex., bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.
[000219] Composições farma cêuticas adequadas para uso no contexto do presente pedido de patente de invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos (peptídeos) eficazes para prevenir, aliviar ou amenizar os sintomas de uma doença (por exemplo, diabetes) ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado.
[000220] De acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, a superexpressão odo miR-135 tem um efeito antidepressivo.
[000221] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade daqueles especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada, apresentada neste documento.
[000222] Para qualquer preparação utilizada nos métodos do presente pedido de patente de invenção, a quantidade terapeuticamente efetiva ou a dose podem ser estimadas inicialmente a partir de ensaios in vitro e de cultura de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma concentração desejada ou título. Tais informações podem ser usadas para determinar com mais precisão doses uteis em humanos.
[000223] A toxicidade e eficácia terapêutica dos ingredientes ativos descritos neste documento podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas de células ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir destes ensaios in vitro e de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. A composição exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual, tendo em conta as condições do paciente. (Veja p.ex., Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).
[000224] O intervalo e quantidade de dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis suficientes de plasma do ingrediente ativo para induzir ou suprimir o efeito biológico (concentração mínima eficaz [MECIminimal effective concentration]). A MEC irá variar para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro. As dosagens necessárias para atingir a MEC vão depender de suas características individuais e via de administração. A detecção de ensaios pode ser utilizada para determinar as concentrações de plasma.
[000225] Dependendo da severidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de administração única ou plural, com curso de tratamento durando de vários dias a várias semanas ou até a cura ser realizada ou diminuição do estado da doença ser alcançada.
[000226] A quantidade de uma composição a ser administrada será, claro, dependente do indivíduo a ser tratado, da severidade da aflição, da forma de administração, do julgamento do médico que prescreveu, etc. A dosagem e o tempo de administração será sensíveis a uma monitorização cuidadosa e contínua da condição de mudança individual.
[000227] Deve-se observar que existem modelos animais, pelos quais os agentes do presente pedido de patente de invenção possam ser testados antes do tratamento humano. Por exemplo, modelos animais de depressão, estresse, ansiedade, tais como o modelo do desamparo aprendido (LH I learned helplessness), modelo de estresse crônico suave (CMS I chronic mild stress), modelo de estresse de derrota social (SDS I social defeat stress) e modelo de privação materna podem ser usados.
[000228] Composições do presente pedido de patente de invenção podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador, tais como um Kit aprovado FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem da unidade que contém o ingrediente ativo. O pacote pode, por exemplo, incluir folha de metal ou de plástico, tais como um blister. O dispositivo do bloco ou do distribuidor pode ser acompanhado a partir das instruções para a administração. O pacote ou distribuidor podem ser alojados por uma nota associada com o recipiente em uma forma elaborada por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, e tal nota é reflexiva de aprovação pela agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Esta nota, por exemplo, pode ser de rotulação aprovada pela Administração Federal de Alimentos e Medicamentos para prescrição de fármacos ou da inserção de um produto aprovado. Composições compreendendo uma preparação do presente pedido de patente de invenção formulada em um transportador farmacêutico compatível podem também ser preparadas, posicionadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada, como é mais detalhado acima.
[000229] Deve-se observar que as composições terapêuticas do presente pedido de patente de invenção possam incluir, além dos agentes de microRNA polinucleotídicos, outros medicamentos conhecidos para o tratamento de depressão, estresse, ansiedade, privação de sono, etc., tais como, mas não se limitando a inibidores seletivos da recaptação de serotonina (SSRIsIselective serotonin reuptake inhibitors), inibidores de recaptação de serotonina-noradrenalina (SNRIsIserotonin-norepinephrine reuptake inhibitors), antidepressivos noradrenérgicos e serotonérgicos específicos (NaSSAs1noradrenergic and specific serotonergic antidepressants), inibidores da recaptação de norepinefrina (noradrenalina) (NRI 1 norepinephrine reuptake inhibitors), inibidores da recaptação de noradrenalina-dopamina, intensificadores de recaptação de serotonina, desinibidores de noradrenalina- dopamina, antidepressivos tricíclicos (p.ex., imipramina), inibidores da oxidase monoamina (MAOIs 1 monoamine oxidase inhibitors). Estes fármacos podem ser incluídos no artigo da manufatura em embalagens únicas ou separadas.
[000230] Os inventores presentes mostraram a superexpressão dos resultados de miR-27 na supressão de MaoA (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados de miR-135 na supressão da Slc6a4 (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados demiR- 135, miR-335, miR-26, miR-181 ou miR-182 na supressão do Htrla (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados de miR-19 na supressão de Adrl (vide Exemplo 2, adiante) e na supressão de CB1 (vide Exemplo 3B adiante) e a superexpressão dos resultados de miR-15 na supressão de Crh1R (vide Exemplo 4, adiante) e na supressão de FKBP5 (vide Exemplo 4B, adiante).
[000231] Assim, de acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene do transportador (S1c6a4) de serotonina em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um microRNA ou precursor do mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135 e miR-335.
[000232] Conforme utilizado neste documento, o termo "transportador de serotonina (Slc6a4)" refere-se à proteína de transporte da monoamina (também chamada SERT) envolvida na recaptação da serotonina da fenda sináptica. Um exemplar de Slc6a4 está previsto em NP 001036.1.
[000233] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão do gene da serotonina (Htrla) de um gene do receptor inibitório 1A em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de uma microRNA ou precursor do mesmo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 e miR26.
[000234] Conforme utilizado neste documento, o termo "gene receptor inibitório lA de serotonina (Htrla)" refere-se ao receptor acoplado à proteína G que funciona como um autorreceptor no neurônio pré-sináptico e mediado por inibição da liberação de serotonina. Um exemplar Htrla está previsto em NP 000515.2.
[000235] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene de hidroxilase monoamina (MaoA) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-27 ou um precursor do mesmo.
[000236] Conforme utilizado neste documento, o termo "hidroxilase monoamina (MaoA)" refere-se à enzima que degrada neurotransmissores amina, tais como a dopamina, noradrenalina e serotonina. Um MaoA exemplar está previsto em NP 000231.1.
[000237] De acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene triptofano hidroxilase 2 (Tph2) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de uma microRNA ou precursor do mesmo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo constituído por miR-181 e miR27.
[000238] Conforme utilizado neste documento, o termo "triptofano hidroxilase 2 (Tph2)" refere-se a enzima que catalisa a primeira etapa, limitante de taxa na biossíntese de serotonina. No exemplar Tph2 está previsto em NP NP 775489.2.
[000239] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor beta adrenérgico 1 (Adrbl) em uma célula neuróglia ou células cardíacas, o método compreendendo uma modulação de atividade ou expressão de uma miR-19 ou um precursor do mesmo.
[000240] Conforme utilizado neste documento, o termo "1(Adrbl) de receptores adrenérgicos beta" refere-se ao receptor que media os efeitos fisiológicos da adrenalina e noradrenalina. Um exemplar Adrbl está previsto em NP 000675.1.
[000241] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor beta-2 adrenérgico (Adrb2) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor do mesmo.
[000242] Conforme utilizado neste documento, o termo "receptor beta-2 adrenérgico (Adrb2)" refere-se ao receptor que está diretamente associado com o canal de cálcio tipo-L classe Ca(V)1.2. O Adrb2 está previsto, p.ex. NP 000015.1.
[000243] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor do tipo 1 CRH em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de miR-15 ou um precursor do mesmo.
[000244] Conforme utilizado neste documento, o termo "CRH de tipo 1" refere-se ao receptor que liga o hormônio liberador de corticotropina (CRH I corticotropín-releasing hormone). O tipo 1 CRH está previsto, p.ex., em NP 001138618.1, NP 001138619.1, NP 001138620.1 e NP 004373.2.
[000245] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor de glutamato em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de miR-181ou um precursor do mesmo.
[000246] De acordo com outra aplicação, o gene receptor de glutamato compreende o receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grml), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 3 (Grik3), receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 2 (Grik2) e receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7), conforme descrito em mais detalhes acima.
[000247] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down (Dscam) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo.
[000248] Conforme utilizado neste documento, o termo "Molécula de Adesão Celular de Síndrome de Down (Dscam)" refere-se a molécula de adesão celular que desempenha um papel na evasão auto neuronal. A Dscam está prevista, p.ex., em NP 001380.2.
[000249] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da molécula de adesão celular L1 (Llcam) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo.
[000250] Conforme utilizado neste documento, o termo "Molécula de adesão celular Li (Llcam) "refere-se a molécula de adesão celular neuronal. A Llcam está prevista p.ex. em NP 000416.1, NP 001137435.1, NP 076493.1.
[000251] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da proteína X associado à translina (Tsnax) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor do mesmo.
[000252] Conforme utilizado neste documento, o termo "gene da proteína X associado à translina (Tsnax)" refere-se à proteína que interage especificamente com translina. A Tsnax está prevista p.ex. em NP 005990.1.
[000253] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene receptor canabinoide 1 (CB1) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-19 ou um precursor do mesmo.
[000254] Conforme utilizado neste documento, o termo "receptor canabinoide 1 (CB1)" refere-se ao receptor da membrana celular (também conhecido como CNR1). O CB1 é previsto, p.ex. em NP 001153698.1, NP 001153730.1, NP 001153731.1, NP 057167.2, NP 149421.2. [0246] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da proteína de ligação FK506 5 (FKBP5) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor do mesmo.
[000255] Conforme utilizado neste documento, o termo "proteína de ligação FK506 5 (FKBP5)" refere-se à proteína que liga especificamente à Imunossupressão FK506 e a rapamicina. A FKBP5 é prevista p.ex. em NP 001139247.1, NP 001139248.1, NP 001139249.1,NP 004108.1.
[000256] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene sintaxina la (Stxla) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor do mesmo.
[000257] Conforme utilizado neste documento, o termo "sintaxina la (Stxla)" refere-se a proteínas específicas do sistema nervoso. A Stxla é prevista p.ex. em NP 001159375.1, NP 004594.1.
[000258] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de uma quinase regulada por soro/glicocorticoide (Sgkl) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão of a miR-15 ou um precursor do mesmo.
[000259] Conforme utilizado neste documento, o termo "quinase regulada por soro/glicocorticoide (Sgkl)" refere-se à quinase de proteína serina/treonina. A Sgkl está prevista p.ex. em NP 001137148.1, NP 001137149.1, NP 001137150.1, NP 005618.2.
[000260] Os ensinamentos presentes contemplam regular para mais (i.e, aumentar) ou regular para menos (ou seja, diminuir) os níveis de expressão dos genes acima mencionados.
[000261] A diminuição da expressão gênica, de acordo com os ensinamentos presentes, é normalmente realizada ao se administrar ou expressar em células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) um polinucleotídeo de microRNA (como descrito em mais detalhes acima, neste documento).
[000262] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Slc6a4, a modulação compreende aumentar o miR-135 e/ou o miR-335.
[000263] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Htrla, a modulação compreende aumentar o miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 e/ou o miR-26.
[000264] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene MaoA, a modulação compreende aumentar o miR-27.
[000265] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Adrbl, a modulação compreende aumentar o miR-19.
[000266] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene receptor CRH tipo 1, a modulação compreende aumentar o miR-15.
[000267] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene CB1, a modulação compreende aumentar o miR-19.
[000268] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene FKBP5, a modulação compreende aumentar o miR-15.
[000269] Alternativamente, de acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, o aumento da expressão do gene é afetado ao se administrar ou expressar em células alvo (p.ex. células neuróglias ou células cardíacas) um agente capaz de diminuir a expressão de um microRNA.
[000270] A diminuição de microRNAs pode ser efetuada em nível genômico e/ou de transcrição utilizando uma variedade de moléculas que interferem com a transcrição e/ou tradução (p.ex., agentes silenciadores de RNA, Ribozima, DNAzima e antissentido). Métodos de diminuir a expressão microRNA são conhecidos na técnica.
[000271] Agentes de ácido nucleico que diminuem a atividade de miR incluem, mas não estão limitados a um alvo mimético, um gene resistente a microRNA e um inibidor de miRNA.
[000272] O alvo mimético ou o alvo resistente a microRNA são essencialmente complementares ao micro RNA desde que uma ou mais das seguintes incompatibilidades sejam permitidas: uma incompatibilidade entre os nucleotídeos na extremidade 5' do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondentes no alvo mimético ou alvo resistente a microRNA; uma incompatibilidade entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 1 para a posição 9 do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondentes no alvo mimético ou um alvo resistente a microRNA; ou três incompatibilidades entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 12 para a posição 21 do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondente no alvo mimético e ao alvo resistente a microRNA, desde que não existam mais de duas diferenças consecutivas.
[000273] O RNA mimético alvo é essencialmente similar ao RNA alvo, modificado para torná-lo resistente à clivagem induzida de miRNA, modificando, p.ex., a sequência de seu tal modo que uma variação é apresentada no nucleotídeo da sequência alvo, complementar aos nucleotídeos 10 ou 11 do miRNA, resultando em uma incompatibilidade.
[000274] Alternativamente, pode ser implementado um alvo resistente a microRNA. Assim, uma mutação silenciosa pode ser introduzida no local de ligação do microRNA do gene alvo, para que o DNA e as sequências de RNA resultantes sejam alteradas de uma maneira que impeça a ligação do microRNA, mas a sequência de aminoácidos da proteína seja alterada. Assim, uma nova sequência pode ser sintetizada em vez do local de ligação existente, em que a sequência de DNA é alterada, resultando em falta de ligação do miRNA ao seu alvo.
[000275] De acordo com uma aplicação específica, o mimético alvo ou alvo resistente a microRNA está ligado ao promotor naturalmente associado com pre-miRNA, reconhecendo o gene alvo e introduzidos na célula da planta. Desta forma, o mimético alvo de miRNA ou alvo resistente a microRNA será expresso sob as mesmas circunstâncias que o miRNA e o mimético alvo e o alvo resistente a microRNA vai substituir o mimético/alvo resistente a microRNA não-alvo degradado pela miRNA induzida por clivagem.
[000276] Alelos miRNA não-funcionais ou genes alvo miRNA resistentes também podem ser introduzidos por recombinação homóloga, substituindo os alelos miRNA de codificação ou genes-alvo sensível a miRNA.
[000277] Expressão recombinante é efetuada pela clonagem do ácido nucleico de interesse (p.ex., miRNA, gene alvo, agente silenciador, etc.) em uma estrutura da expressão de ácido nucleico sob a expressão de um promotor da planta.
[000278] Em outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, ácidos nucleicos de cadeia única são utilizados como inibidores de miRNA. Um inibidor de miRNA está tipicamente entre cerca de 17 a 25 nucleotídeos de comprimento e compreende uma sequência de 5' a 3' que é de, pelo menos, 90% complementar à sequência de 5' a 3' de um miRNA maduro. Em determinadas aplicações, uma molécula do inibidor de miRNA tem 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento ou qualquer intervalo derivável nele. Além disso, um inibidor de miRNA tem uma sequência (de 5' a 3') que é de, pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ou 100 complementares, ou qualquer intervalo derivável nele, para a sequência de 5' a 3' de um miRNA maduro, particularmente, um miRNA maduro e de ocorrência natural.
[000279] Os inibidores de miRNA podem ser contatados com as células utilizando técnicas de transfecção transiente. Os inibidores de miRNA estão comercialmente disponíveis a partir de empresas como a Applied Biosystems.
[000280] Alternativamente, os inibidores de miRNA podem ser parte de um vetor de expressão, como descritos acima. Neste caso, as células podem ser transfectadas transitoriamente ou de forma estável com o vetor.
[000281] De acordo com uma aplicação específica, Quando a regulação compreende aumentar a expressão do gene Tph2, a modulação compreende diminuir o miR-181 e/ou miR-27.
[000282] De acordo com uma aplicação, a diminuição da expressão de um microRNA é efetuada pelo uso de uma sequência de ácido nucleico que liga e diminui especificamente a expressão do gene microRNA. Uma sequência exemplar de ácido nucleico que pode ser utilizada em conformidade com o presente pedido de patente de invenção pode ser adquirida de qualquer fabricante, como por exemplo, da Genecopoeia (miArrest, inibidores baseados em vetor de microRNA).
[000283] Assim, de acordo com outra aplicação, é fornecido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico para diminuir uma expressão de miR-181, miR-182, miR-26, miR-27, miR-135, miR-335, miR-15 e miR-19 ou um precursor do mesmo.
[000284] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-181 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 134-137 e SEQ ID N°s: 154157.
[000285] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-182 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 138-141 e SEQ ID N°: 147. [0278] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-26 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 126-129 e SEQ ID N°s: 145146.
[000286] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-27 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 130-133 e SEQ ID N°s: 152153.
[000287] Polinucleotideos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-135 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 110-113 e SEQ ID N°s: 142- 143.
[000288] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-335 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 114-117 e SEQ ID N°: 144.
[000289] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-15 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 118-121 e SEQ ID N°s: 150151.
[000290] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizado em conformidade com o presente pedido de patente de invenção para diminuir a expressão de miR-19 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos em SEQ ID N°s: 122-125 e SEQ ID N°s: 148- 149.
[000291] Tais sequências de ácidos nucleicos podem, ainda, compreender um vetor de expressão conforme descrito em mais detalhes neste documento.
[000292] O presente pedido de patente de invenção contempla, ainda, avaliar a expressão do gene (p.ex., transcrição ou polipeptídeo) após diminuir ou aumentar o nível de microRNA na célula (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas).
[000293] Assim, a presença e/ou nível de um gene alvo (p.ex., Slc6a4, Htrla, MaoA, Adrbl, Adrb2, receptor CRH tipo 1, Tph2, Grml, Grik3, Grm5, Grik2, Grm7, Gria2, Dscam, L1cam, Tsnax, Sgkl e/ou Stxla), sequência de ácido nucleico (p.ex., transcrição) pode ser determinada utilizando um polinucleotídeo isolado (p.ex., uma sonda polinucleotídica, uma sonda/primer oligonucleotidea) capaz de se hibridizar a sequência de ácido nucléico de um gene alvo (p.ex., Slc6a4, conforme previsto em p.ex. NM 00l045.4, ou uma porção do mesmo; Htrla, conforme previsto em p.ex. NM 000524.3, ou uma porção do mesmo; MaoA, conforme previsto em p.ex. NM 000240.3, ou NM 001270458.1, ou uma porção do mesmo; Adrbl, conforme previsto em p.ex. NM 000684.2, ou uma porção do mesmo; Adrb2, conforme previsto em p.ex. NM 000024.5, ou uma porção do mesmo; receptor CRH tipo 1, conforme previsto em p.ex. NM 001145146.1 e NM 001145147.1, ou uma porção do mesmo; CB1 conforme previsto em p.ex. NM 001160226.1 e NM 033181.3, ou uma porção do mesmo; FKBP5, conforme previsto em p.ex. NM 001145775.1 e NM 001145777.1, ou uma porção do mesmo; Tph2, conforme previsto em p.ex. NM 173353.3, ou uma porção do mesmo; Grml, conforme previsto em p.ex. NM 000838.3 e NM 001114329.1, ou uma porção do mesmo; Grik3, conforme previsto em p.ex. NM 000831.3, ou uma porção do mesmo; Grm5, conforme previsto em p.ex. NM 000842.3 e NM 001143831.2, ou uma porção do mesmo; Grik2, conforme previsto em p.ex. NM 001166247.1 e NM 021956.4, ou uma porção do mesmo; Grm7, conforme previsto em p.ex. NM000844.3 e NM181874.2, ou uma porção do mesmo; Gria2, conforme previsto em p.ex. NM 000826.3 e NM 001083619.1, ou uma porção do mesmo; Dscam, conforme previsto em p.ex. NM 001389.3, ou uma porção do mesmo; Llcam, conforme previsto em p.ex. NM 000425.3, NM 001l43963.1 e NM 024003.2 ,ou uma porção do mesmo; Tsnax, conforme previsto em p.ex. NM 005999.2, ou uma porção do mesmo; Sgkl, conforme previsto em p.ex. NM 001143676.1, NM 001143677.1 e NM 001143678.1, ou uma porção do mesmo e/ou Stxla, conforme previsto em p.ex. NM 001165903.l, NM 004603.3, ou uma porção do mesmo). Tal polinucleotídeos podem ser de qualquer tamanho, tal como um polinucleotídeo curto (p.ex., de 15-200 bases) e polinucleotídeos intermediários (p.ex., de 200-2000 bases) ou um polinucleotídeo longo, maior que 2000 bases.
[000294] A sonda de polinucleotídeo isolado utilizada pelo presente pedido de patente de invenção pode ser de qualquer molécula de RNA, direta ou indiretamente rotulada (p.ex., oligonucleotídeo de RNA, uma molécula de RNA transcrita in vitro), molécula de DNA (p.ex., oligonucleotídeo, molécula de cDNA, molécula genômica) e/ou um análogo respectivos [p.ex., ácido nucleico peptídeo (PNA 1 peptide nucleic acid] que é específico para a transcrição do gene do RNA alvo do presente pedido de patente de invenção.
[000295] Os oligonucleo- tídeos projetados de acordo com os ensinamentos do presente pedido de patente de invenção podem ser gerados de acordo com qualquer método de síntese dos oligonucleotídeos conhecido na técnica, conforme descrito em detalhes abaixo.
[000296] O oligonucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é base de pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 40, especificamente hibridizáveis com sequência de alterações descritas abaixo.
[000297] Os oligonu-cleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem compreender a nucleosídeos heterocíclicos que consistem em purinas e as bases pirimidinas, combinadas em uma ligação fosfodiéster de 3' a 5'.
[000298] Os oligonucleotídeos utilizados preferivelmente são aqueles modificados ou na coluna vertebral, ligações internucleosídeas ou bases, conforme está amplamente descrito abaixo.
[000299] O polinucleotídeo isolado utilizado pelo presente pedido de patente de invenção pode ser rotulado direta ou indiretamente utilizando uma molécula etiqueta ou rotulo. Tais rótulos podem ser, por exemplo, moléculas fluorescentes (p.ex., fluoresceína ou Texas Red), molécula radioativa (p.ex., 32P-y-ATP ou 32P-a-ATP) e substratos cromogênicos [p.ex., Fast Red, BCIP/INT, disponível em (ABCAM, Cambridge, MA)]. A rotulagem direta pode ser conseguida conjugando covalentemente uma molécula rótulo com um polinucleotídeo (p.ex., utilizando uma síntese de fase sólida) ou incorporando através da polimerizaçao (p.ex., utilizando uma reação de transcrição in vitro ou rotulagem primária aleatória). A selagem indireta pode ser conseguida conjugando ou incorporando covalentemente com o polinucleotídeo uma molécula-etiqueta não rotulada (p.ex. Digoxigenina ou biotina) e sujeitando subsequentemente o polinucleotídeo com uma molécula rotulada (p.ex., anticorpos anti-Digoxigenina ou estreptavidina) capaz de reconhecer especificamente a etiqueta não rotulada.
[000300] Os polinucleotídeos supracitados podem ser empregados em uma variedade de métodos de detecção de RNA, tais como a análise Northern Blot, transcrição reversa PCR (RT-PCR) [p.ex., um RT-PCR semi- quantitativo, RT-PCR quantitativo utilizando, por exemplo, o Light CyclerTM (Roche)], hibridização do RNA in situ (RNA-ISH), mancha do RT-PCR in situ [p.ex., conforme descrito em Nuovo GJ, et al. 1993, Intracelular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 17: 683-90, e Komminoth P, et al. 1994, Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of' histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) e in situ RT-PCR. Pathol Res Pract., 190: 1017-25] e análise de microarranjos dos oligonucleotídeos [p.ex., utilizando o microarranjo Affymetrix (Affymetrix®, Santa Clara, CA)].
[000301] A presença e/ou nível da sequência de aminoácidos (p.ex., proteína) do gene alvo (p.ex., Slc6a4, Htrla, MaoA, Adrbl, Adrb2, receptor CRH tipo 1, CB1, FKBP5, Tph2, Grml, Grik3, Grm5, Grik2, Grm7, Gria2, Dscam, L1cam, Tsnax, Sgkl e/ou Stxla) pode ser determinado utilizando, por exemplo, um anticorpo específico através da formação de um imunocomplexo [ou seja, um complexo formado entre o gene alvo antígeno (uma sequência de aminoácidos) presente na amostra biológica e o anticorpo específico].
[000302] O imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção pode ser formado em uma variedade de temperaturas, concentrações salinas e valores de pH que podem variar dependendo do método e da amostra biológica utilizados e os especialistas na técnica são capazes de ajustar as condições adequadas para a formação de cada imunocomplexo.
[000303] O termo 'anticorpo" conforme utilizado neste pedido de patente de invenção inclui as moléculas intactas bem como os fragmentos funcionais da mesma, como Fab, F(ab')2, Fv ou moléculas de domínio simples como o VH e o VL para um epitopo de um antígeno. Estes fragmentos de anticorpos funcionais são definidos a seguir: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação antigênica monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão de anticorpo completo com a enzima da papaína para a produção de uma cadeia leve intacta e uma parte de uma cadeia pesada; (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtida tratando todo o anticorpo com pepsina, seguido da redução, para a produção de uma cadeia leve intacta e uma parte da cadeia pesada, os fragmentos Fab' são obtidos por moléculas de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido tratando todo o anticorpo com a enzima de pepsina sem a redução subsequente; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab' retidos juntos por duas ligações de dissulfetos, (4) Fv, definido como um fragmento da engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressada como duas cadeias; (5) Anticorpos de cadeia simples ("SCA"), uma molécula geneticamente modificada contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligada ao ligante de polipepirida adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida, e (6) Anticorpos de domínio simples são compostos de um VH simples ou de domínios VL que apresentam afinidade suficiente com o antígeno.
[000304] Os métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais, bem como os fragmentos do mesmo são amplamente conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: Um Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporado aqui com referência).
[000305] Os fragmentos de anticorpos de acordo com o presente pedido de patente de invenção podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E. coli ou células de mamíferos (p.ex., cultura de células do ovário de hamsters chineses ou outros sistemas de expressão de proteínas) Do DNA codificando o fragmento. Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína dos anticorpos totais através de métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina parafornecer um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo bloqueador para grupos sulfidrila resultantes da clivagem de ligações de dissulfureto, para produzir fragmentos 3.5S Fab' monovalentes. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Patente Americana Nos. 4,036,945 e 4,331,647, e referências contidas no mesmo, cujas patentes estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Vide também Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação das cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalente, a clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usadas uma vez que os fragmentos unem o antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
[000306] Os fragmentos Fv compreendem a uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente conforme descrito em Inbar et al. [Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 69:2659-62 (19720]. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfeto intermolecular ou reticuladas por agentes químicos como o glutaraldefdo. Preferivelmente, os fragmentos Fv compreendem às cadeias VH e VL conectadas por um ligante peptideo. Estas proteínas de ligação antígena de cadeia simples (scFv) são preparadas construindo um gene estrutural compreendendo às sequências de DNA codificando os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido dentro de um vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido dentro de uma célula hospedeira como a E-coli. A célula hospedeira recombinante sintetiza uma cadeia de polipeptídeo simples com um peptideo vinculador ligando os dois domínios V. Métodos para a produção de scFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow e Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); e Patente Americana No. 4,946,778, incorporados aqui por referência em sua totalidade.
[000307] Outra forma de um fragmento de anticorpo é uma codificação de peptídeo para uma região determinante de complementaridade (CDR complementarity-determining region). Peptídeos CDR ("unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos através da estrutura de genes codificando o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, utilizando a reação em cadeia de polimerase para sintetizar a região variável a partir do RNA das células de produção de anticorpos. Vide, por exemplo, Larrick e Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].
[000308] Os anticorpos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo as bibliotecas de apresentação em fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação dos anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, os anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, ratos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completamente inativados. Mediante o estímulo, a produção de anticorpos humanos é observada, o que se assemelha bastante àqueles vistos em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo dos genes, as montagens, e o repertório do anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na Patente Americana Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e na seguinte publicação cientifica: Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
[000309] Exemplos de anticorpos que podem ser utilizados de acordo com o presente pedido de patente de invenção incluem, por exemplo, anticorpos antiSlc6a4 disponíveis, por exemplo, a partir da Empresa Abnova, Abgent e MBL Internacional; anticorpos anti-Htrla disponíveis, por exemplo, a partir da Novus Biologicals, Acris Antibodies GmbH e Abnova anticorpos anti-MaoA anticorpos disponíveis, por exemplo, da Abnova Corporation, Proteintech Group, Inc. e Abgent; anti-Adrbl anticorpos disponíveis, por exemplo, da Biorbyt, Abgent e anticorpos em linha; anti-Adrb2 anticorpos disponíveis, por exemplo, da Tocris Bioscience, Abnova Corporation e anticorpos em linha; anti-CRH receptor tipo 1 do anticorpo disponível, por exemplo, do MyBioSource.com, Abcam e Novus Biologicals; anticorpos anti- CB1 disponíveis, por exemplo, de Santa Cruz Biotechnology, Inc. e Epitomics, Inc.; anticorpos anti-FKBP5 disponíveis, por exemplo, de BD Biosciences e Abnova Corporation; anticorpos anti-Tph2 disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals e Acris Antibodies GmbH; anticorpos anti- Grml disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals a Biorbyt; anticorpos anti-Grik3 disponíveis, por exemplo, de Acris Antibodies GmbH e Atlas Antibodies; anticorpos anti-Grm5 disponíveis, por exemplo, de Biorbyt and Acris Antibodies GmbH; anti-Grik2 disponíveis, por exemplo, de Proteintech Group, Inc., Aviva Systems Biology e Abgent; anticorpos anti-Grm7 disponíveis, por exemplo, de Acris Antibodies GmbH e anticorpos em linha; anticorpos antiGria2 disponíveis, por exemplo, de Proteintech Group, Inc. e Abnova Corporation; anticorpos anti-Dscam disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals e R&D Systems; anticorpos anti-L1cam disponíveis, por exemplo, de GeneTex, Novus Biologicals e Acris Antibodies GmbH; anticorpos anti-Tsnax disponíveis, por exemplo, de BD Biosciences e GenWay BioEmpresatech, Inc.; anticorpos anti-Sgkl disponíveis, por exemplo, de Epitomics, Inc. e Acris Antibodies GmbH; e/ou anticorpos anti- Stxla disponíveis, por exemplo, de MBL International e Spring Bioscience.
[000310] Vários métodos podem ser utilizados para detectar a formação do imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção e os especialistas na técnica são capazes de determinar qual método é adequado para cada imunocomplexo e/ou o tipo de células usadas para o diagnóstico.
[000311] O anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htrla; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrbl; anticorpo antiAdrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti- Obi; anticorpo anti- FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grml; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti- Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-Llcam; anticorpo anti- Tsnax; anticorpo anti-Sgkl e/ou anticorpo anti-Stxla) utilizado no imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção pode ser rotulado utilizando os métodos conhecidos na técnica. Deve-se observar que os anticorpos rotulados possam ser tanto anticorpos primários (ou seja, que se unem ao antígeno específico, por exemplo, um antígeno específico de gene) ou anticorpos secundários (p.ex., anticorpos de coelho e cabra marcados, anticorpo de rato marcado anti-humano) que unem os anticorpos primários. O anticorpo pode ser diretamente conjugado com um rótulo ou podem ser conjugados com uma enzima.
[000312] Os anticorpos do presente pedido de patente de invenção podem ser rotulados de forma fluorescente (utilizando uma tinta fluorescente para um anticorpo), radiorrotulado (utilizando anticorpos radiorrotulados, por exemplo, 125I), ou conjugados com uma enzima (p.ex., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e utilizado juntamente com um substrato cromogênico para produzir uma reação colorimétrica. Os substratos cromogênicos utilizados pelos anticorpos conjugados por enzima do presente pedido de patente de invenção incluem, porém não são limitados a, AEC, Fast red, substrato ELF-97 [2 - (5'-cloro-2-fosforiloxifenil)-6-cloro-4 (3H)- quinazolinona], fosfato de p-nitrofenilo (PNPP), difosfato de fenolftaleína, e fosfato ELF-39 , BCIP / INT, Vector Red (VR), salmão e fosfato magenta (Avivi C., et al., 1994, J Histochem. Cytochem. 1994; 42: 551-4) para a enzima fosfatase alcalina e Nova Red, diaminobenzidina (DAB), vetor (R) SG substrato, substrato quimioluminescente à base de luminol pela enzima peroxidase. Estes substratos enzimáticos estão disponíveis no mercado na Sigma (St. Louis, MO, USA), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, EUA), Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, USA), Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, USA), Dako Cytomation (Denmark).
[000313] A detecção do imunocomplexo em uma amostra biológica, como amostras de sangue ou de soro, que podem conter polipeptídeos de gene alvo solúveis (p.ex., secretados, derramados) pode ser realizada utilizando a seleção de células ativadas por fluorescência [FACS I fluorescence activated cell sorting], enzimas ligadas ao ensaio imunoabsorvente [ELISA I enzyme linked immunosorbent assay], análises Western blot e rádioimunoensaio [RIA I Western blot and radioimmunoasssay], imunoprecipitação [IP I immunoprecipitation] ou através de uma abordagem baseada no peso molecular.
[000314] Para o Western bolt, as proteínas são extraídas a partir de uma amostra celular e são submetidas a eletroforese (p.ex., SDS-PAGE) e borradas para uma membrana (p.ex., nylon ou PVDF). A membrana é, então, interagida com um anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-S1c6a4; anticorpo anti-Htrla; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrbl; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Cbl; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti- Grml; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti-Gria2;
[000315] anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-Lfcam; anticorpo anti- Tsnax; anticorpo anti-Sgkl e/ou anticorpo anti-Stxla) que pode ser tanto rotulado ou adicionalmente submetido a um anticorpo rotulado secundariamente. A detecção pode ser por autorradiografía, reação colorimétrica ou quimiluminescência. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de substratos quanto a determinação de sua identidade através de uma posição relativa na membrana que é indicativa de uma migração de distância em um gel de acrilamida durante a electroforese.
[000316] No caso de a concentração do antígeno na amostra biológica ser baixa, a detecção do antígeno (sequência de aminoácidos do gene alvo) pode ser realizada por imunoprecipitação (IP). Para a análise da imunoprecipitação, o anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htrla; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrbl; anticorpo antiAdrb2; anticorpo receptor antí-CRH tipo 1; anticorpo anti- Obi; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grml; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo antiGria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-Llcam; anticorpo anti-Tsnax; anticorpo anti-Sgkl e/ou anticorpo anti-Stxla) pode interagir diretamente com uma amostra (p.ex., lisado celular) incluindo o polipeptídeo do gene alvo e o complexo formado pode ser detectado ainda utilizando um anticorpo secundário conjugado com os rebordos (p.ex., se o anticorpo específico é um anticorpo monoclonal de rato, o anticorpo secundário pode ser um anticorpo antirrato conjugado para, por exemplo, os rebordos Sefarose). Os rebordos podem ser, então, precipitados por centrifugação, seguindo quais proteínas precipitadas (p.ex., polipeptídeo do gene alvo e anticorpos específicos) podem ser separadas dos rebordos (p.ex., utilizando a desnaturação em 95 °C) e ainda submetidas à análise Western blot utilizando .anticgrpos. Como alternativa, o anticorpo específico e o anticorpo secundário conjugado ao rebordo podem Sf?r adicionados à amostra biológica contendo o antígeno (polipeptídeo do gene alvo) para formar assim um imunocomplexo. Alternativamente, se o polipeptídeo do gene alvo for uma proteína altamente glicosilada, pode ser também precipitado utilizando um substrato capaz ligar peptídeos glicosilados como o Concavalin A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia) que pode também ser conjugado ao rebordo, seguido por anticorpos específicos da análise Western blot conforme descrito acima.
[000317] A análise FACS permite a detecção dos antígenos presentes nas membranas da célula. Em suma, os anticorpos específicos, conforme descrito acima, são ligados à fluoróforos e a detecção é realizada por meio de uma máquina. de classificação celular que lê o comprimento de ondas de luz emitido de cada célula conforme esta passa através do facho de luz. Este método pode empregar dois ou mais anticorpos simultaneamente.
[000318] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando o ELISA. Em suma, uma amostra contendo o 'antígeno do gene alvo é fixada a uma superfície tal como um poço de uma placa de microtitulação. Um anticorpo específico antígeno . (p.ex., anticorpo anti-S1c6a4; anticorpo anti-Htrla; anticorpo anti-MoaA; anticorpo antiAdrbl; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Obi; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grml; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo antiGrm7; anticorpo anti-Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-Llcam; anticorpo anti-Tsnax; anticorpo anti-Sgk1 e/ou anticorpo anti-Stx1a) acoplado a uma enzima é aplicado e permitido para ligar-se ao antígeno. A presença de um anticorpo é então detectada e quantificada por uma reação colorimétrica empregando a enzima acoplada ao anticorpo. As enzimas comumente empregadas neste método incluem a peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. Se bem calibrada e dentro da faixa linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de coloração produzida. Um substrato padrão é geralmente empregado para aprimorar a efetividade quantitativa.
[000319] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando o rádioimunoensaio (RIAIradio- immunoassay). Em uma versão, este método envolve a precipitação do antígeno desejado (polipeptídeo do gene alvo) com um anticorpo específico e anticorpo radiorrotulado ligado à proteína (p.ex., proteína A rotulada com I125) imobilizado em uma carreira precipitável como rebordos de agarose. O número de contagens nos grânulos precipitados é proporcional à quantidade de antígenos.
[000320] Em uma versão alternativa do RIA, um antígeno rotulado e um anticorpo não rotulado ligado à proteína são empregados. Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de antígeno é adicionada em quantidades variantes. A queda nas contagens de precipitados a partir do antígeno rotulado é proporcional à quantidade de antígeno na amostra adicionada.
[000321] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando a abordagem baseada no peso molecular. Uma vez que o imunocomplexo apresenta um peso molecular mais alto do que seus componentes, os métodos capazes de detectar tal alteração no peso molecular podem também ser empregados. Por exemplo, o imunocomplexo pode ser detectado através de arranjo de retardação do gel. Em suma, um gel de acrilamida não desnaturante é carregado com amostras. Uma alteração no tamanho (peso molecular) do produto proteína como comparado com seus componentes é indicativo da presença de um imunocomplexo. Tal alteração para um peso molecular mais alto pode ser visualizado utilizando uma coloração de proteína não específico, tal como uma mancha prateada ou uma mancha azul Commassie.
[000322] A detecção in situ do polipeptídeo do gene alvo em uma amostra biológica como uma seção de tecido (p.ex., incluído em parafina ou criocorte) pode ser realizada utilizando os métodos de coloração imunológicos que detectam a ligação de anticorpos nas células in situ. Exemplos e procedimentos de manchas imunológicas incluem, mas não se limitam a, imunohistoquímica marcada por fluorescência (utilizando uma tinta flourescente conjugada com um anticorpo), imunohistoquímica radiorrotulada (utilizando anticorpos radiorrotulados, por exemplo, 1251), e imunocitoquímica [usando uma enzima (p.ex., horseradish peroxidase ou fosfatase alcalina) e um substrato cromogênico para produzir uma reação colorimétrica]. Deve-se observar que as enzimas conjugadas com os anticorpos possam utilizar vários substratos cromogênicos conforme descrito abaixo.
[000323] Preferivelmente, a coloração imunológica utilizada pelo presente pedido de patente de invenção é imunohistoquímica e/ou imunocitoquímica.
[000324] A coloração imunológica é preferivelmente seguido pela contracoloração das células utilizando uma tinta que se une aos compartimentos da célula não coloridas. Por exemplo, se o anticorpo rotulado se une aos antígenos presentes no citoplasma da célula, uma mancha nuclear (p.ex., coloração Hematoxilina-Eosina) é um contracoloração apropriado.
[000325] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Tph2 seguindo a baixa regulação do miR- 181 e/ou do miR-27.
[000326] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Slc6a4 seguindo a alta regulação do miR- 135 e/ou do miR-335.
[000327] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Htr1a seguindo a alta regulação do miR- 135, miR- 335, miR-181, miR-182 e/ou miR-26.
[000328] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene MaoA seguindo a alta regulação do miR- 27.
[000329] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Adrbl seguindo a alta regulação do miR- 19.
[000330] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene CB1 seguindo a alta regulação do CB1.
[000331] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene receptor CRH tipo 1 seguindo a alta regulação do miR-15.
[000332] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene FKBP% seguindo a alta regulação do miR-15.
[000333] Os presentes inventores perceberam ainda que o mR135 é alto regulado em sujeitos com condições médicas associadas à serotonina (descritas acima).
[000334] Desta forma, existe um método fornecido de diagnosticar uma condição médica relacionada com a serotonina em um sujeito que necessite do mesmo, o método compreendendo à medição de um nível de expressão de um miR-135 em um sangue do sujeito, em que um nível de expressão alto do miR-135 conforme comparado com
[000335] aquele na amostra de sangue de um sujeito saudável é indicativo da condição médica associada com serotonina.
[000336] Os métodos de análise miR em amostras de sangue são amplamente conhecidos na técnica e são descritos abaixo.
[000337] O diagnóstico pode ser ainda avaliado e estabelecido utilizando os métodos de padrão-Ouro. Tipicamente, pelo menos um de um histórico médico completo do paciente, avaliações físicas e avaliações sistemáticas dos sintomas ajudam a determinar a causa da depressão. Os questionários padronizados podem ser úteis como a Escala de Hamilton para Depressão, e o Inventário de Depressão de Beck.
[000338] Os presentes inventores mostraram ainda que os níveis plasmáticos miR-135a são diminuídos em sujeitos tratados com drogas antidepressivas, tais como Fluoxetina (um antidepressivo de classe SSRI), enquanto que os níveis cerebrais miR-135a são aumentados nestes mesmos sujeitos (vide Figuras 3E-J).
[000339] Assim, de acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, há um método fornecido de monitorar o tratamento de uma droga antidepressiva, o método compreende a: (a) tratamento de um sujeito com necessidade do mesmo com uma droga antidepressiva; e (b) medição de um nível de expressão de um miR-135 no sangue do sujeito antes e na sequência do tratamento, em que um nível de expressão mais baixo do miR135 seguinte ao tratamento com droga antidepressiva conforme comparado com o nível de expressão do miR-135 antes do tratamento por droga antidepressiva é indicativo de um tratamento eficiente.
[000340] Conforme utilizado aqui, o termo "droga antidepressiva" refere-se à qualquer medicamento utilizado para aliviar os distúrbios de humor, tal como a depressão agudo e a distimia, e os distúrbios de ansiedade, tais como os distúrbios de ansiedade social. Como exemplo de drogas antidepressivas incluem, mas não limitam-se a, inibidores seletivos de recaptação de serotonina (SSRIs, tais como Citalopram, Escitalopram, Fluoxetina, Fluvoxamina, Paroxetina e Sertralina); Inibidores seletivos de recaptação de serotoninanorepinefrina (SNRis, como Desvenlafaxina, Duloxetina,
[000341] Milnacipran e Venlafaxina); Noradrenergico e antidepressivos serotonérgico específicos (como Mianserina e Mirtazapina); Norepinefrina (noradrenalina) inibidores de recaptação (NRIs, como Automoxetina, Mazindol, Reboxetina e Viloxazina); Inibidores de recaptação de dopamina norepinefrina (como o Bupropion); Seletores de recaptação de serotonina seletiva (como Tianeptina); Desinibidores de dopamina norepinefrina (NDDIs, como Agomelatina); Antidepressivos tricíclicos (incluindo os Antidepressivos tricíclicos de amina terciária e Antidepressivo tricíclico de amina secundária); e Inibidor da monoamina oxidase (MAOlslmonoamine oxidase inhibitor).
[000342] De acordo com uma aplicação específica, a droga antidepressiva compreende à inibidores de recaptação de serotonina seletiva (SSRI) ou inibidores de recaptação de noradrenalina (NRI).
[000343] A medição do nível de expressão do miR-135 é tipicamente afetada na amostra de sangue obtida do sujeito.
[000344] Conforme utilizado aqui, o termo "amostra de sangue" refere- se ao sangue total fresco, sangue total fracionado e ao plasma sanguíneo. A amostra de sangue é tipicamente obtida do sujeito seguindo tratamento com uma droga antidepressiva, entretanto, uma amostra de sangue pode também ser obtida do sujeito antes do tratamento para uma comparação adicional dos níveis de miR-135.
[000345] Um tratamento antidepressivo eficiente é determinado quando um nível de expressão mais baixo do miR-135 é obtido na sequência do tratamento conforme comparado com o nível de expressão miR-135 anterior ao tratamento.
[000346] De acordo com uma outra aplicação, existe um método fornecido de monitorar uma condição psiquiátrica em um sujeito que necessite do mesmo, método compreendendo à medição de um nível de expressão de um miR-135 em um sangue do sujeito, em que um nível de expressão alto do miR-135 conforme comparado com uma amostra de sangue de um sujeito saudável é indicativo da condição psiquiátrica.
[000347] De acordo com outra aplicação, a condição psiquiátrica compreende a uma depressão, uma ansiedade, um estresse, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, uma dependência, uma fobia social, um distúrbio do sono e um distúrbio relacionado à comida.
[000348] De acordo com uma aplicação específica, o miR-135 compreende ao miR-135a.
[000349] A medição de um nível de expressão de um miR-135 pode ser desempenhada por qualquer método conhecido por um especialista na técnica comum, como por exemplo, pela análise northern, arranjo de proteção Nrase, e PCR (p.ex., PCR em tempo real).
[000350] Monitorar o tratamento pode também ser efetivo avaliando o bem estar do paciente, e adicionalmente ou alternativamente, submetendo o sujeito à testes comportamentais, MRI ou qualquer outro método conhecido por um especialista na técnica.
[000351] Espera-se que durante a vida de uma patente em amadurecimento a partir desta aplicação muitos inibidores relevantes de miRNAs ou alternativamente as modificações Mirna serão desenvolvidos e espera-se que o escopo do termo microRNAs inclua toda estas novas tecnologias a priori.
[000352] Conforme utilizado aqui o termo "cerca de" refere-se a ±10%.
[000353] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e suas conjugações derivadas significam "incluindo, mas não limitado a".
[000354] O termo "consistindo de" significa "incluindo e limitado a".
[000355] O termo "consistindo essencialmente em" significa que a composição, método ou estrutura podem incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, porém somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alterarem materialmente as características básicas e recentes da composição, método ou estrutura reivindicada.
[000356] Conforme utilizado aqui, a forma singular "um", "uma" e "o, a" incluem referências plurais salvo se o contexto indicar claramente em contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma variedade de compostos, incluindo as misturas do mesmo.
[000357] Ao longo deste pedido, várias aplicações deste pedido de patente de invenção podem estar presentes em um formato de leque. Deve-se entender que a descrição no formato de leque é meramente para a conveniência e brevidade e não deve ser construído como uma limitação inflexível no escopo do presente pedido de patente de invenção. Por conseguinte, a descrição de um leque deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as possíveis subgamas, bem como os valores numéricos individuais dentro de tal leque. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo divulgado especialmente subgamas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[000358] Sempre que uma faixa numérica é indicada aqui tem a intenção de incluir qualquer numeral citado (fração ou integral) dentro da faixa indicada. As frases "oscilando/oscila entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "oscilando/oscila de" um primeiro número indicado "para" um segundo número indicado são utilizados aqui de forma intercambiável e tem a intenção de incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionados e integrais entre eles.
[000359] Conforme utilizado aqui, o termo "método" refere-se às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para o alcance de uma dada tarefa incluindo, mas não limitada àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidos ou recém-desenvolvidos a partir das maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos praticantes das artes química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.
[000360] Aprecia-se que certos recursos do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritos no contexto das aplicações separadas, podem também ser fornecidos em combinação em uma aplicação simples. Inversamente, vários recursos do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de simplificação, descritos no contexto de uma aplicação simples, podem também ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou conforme adequado em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias aplicações não têm que ser considerados como recursos essenciais daquelas aplicações, salvo se a aplicação estiver inoperante sem tais elementos.
[000361] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção conforme delineado abaixo e conforme reivindicado na seção das reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos seguintes exemplos.
EXEMPLOS
[000362] É feita agora referência aos seguintes exemplos, que juntamente com as descrições acima ilustram o presente pedido de patente de invenção de forma não limitante.
[000363] De modo geral, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e DNA recombinantes. Tais técnicas são extensivamente exploradas na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme estabelecidas na Patentes Norte-Americanas N°. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nova Iorque (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e na literatura científica; vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N°. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San
[000364] Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); os quais estão incorporados por referência como se estabelecidos no presente em sua totalidade. Outras referências gerais são fornecidas ao longo de todo este documento. Os procedimentos aqui contidos são tidos como bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações aqui contidas estão incorporadas no presente documento por referência. EXEMPLO 1 Expressão diferencial dos miRs em serotonina neuronal MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Microarranjo MicroRNA dos neurônios 5HT.
[000365] Células cerebelares do dia embrionário 12 de ratos ePET YFP foram cultivadas e classificadas para distinguir os neurônios 5HT dos neurônios não 5HT circunvizinhos. O RNA total incluindo a população de miRNA foi purificado, rotulado e hibridizado na Microarranjo miRNA de Ratos Agilent (Agilent Tech, Mississauga, ON, Canadá) número designado 021828 com base na Sanger miRBase verso 12,0 de acordo com as instruções do fabricante. As microsséries foram escareadas e os dados foram extraídos e processados utilizando o Feature Extraction Software (Agilent Technologies). Na sequência do escaneamento, a intensidade dos dados de saída dos arquivos GeneView.txt foi analisada para quantificar a expressão relativa diferencial dos microRNAs utilizando o the Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, MO). Os dados foram transformados em log2, quantil normalizado e filtrada de acordo com a sinalização "gIsGeneDetected" no arquivo GeneView. De 666 miRs murino, restaram 198 para análises adicionais nesta etapa de filtragem. Os miRs diferencialmente expressados foram, então, identificados utilizando um limiar de 1,5 vezes muda com significância de acordo com a ANOVA. Os contrastes foram calculados dentro do teste da ANOVA. A correção Benjamini e Hochberg foi utilizada para uma redução de falso positivo (correção de teste múltiplo). Clonagem de 3'UTRs dentro do plasmídeo de expressão de luciferase Psicheck2
[000366] Sequências 3'UTR de Slc6a4, Htrla, MaoA e Tph2 foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico de ratos, ou cDNA cerebral total. Fragmentos 3'UTR PCR foram ligados dentro do vetor leve pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e, na sequência, subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3' da luciferase do plasmídeo relator Psicheck2 (Promega). Sequências 3'UTR mutadas, falta das sequências de semente miR-135, foram sintetizadas com ressaltos importantes através da sequência de combinação de semente. A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento. Ensaios de luciferase e transfecções
[000367] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formatos de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietilenoimina com os seguintes plasmídeos: 5 ng de plasmídeo Psicheck2- 3'UTR e 25 ng de vetor superexpressante para um miRNA específico, ou plasmídeos de superexpressão de vetor miR vazio. 24 horas seguintes à transfecção as células foram usadas e a atividade dos relatores de luciferase foram ensaiadas conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.
Animais e alojamento
[000368] Ratos machos adultos C57BL/6J, de 10 semanas (Harlan, Jerusalem, Israel) foram alojados em temperatura ambiente controlada (22 ± 1 °C) em um ciclo reverso de 12 horas de luz/escuridão. Alimentos e água foram disponibilizados ad libitum. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais [Institutional Animal Care e Use Committee] do Instituto Weizmann de Ciência. Paradigmas de estresse agudo por imobilização
[000369] Ratos adultos foram introduzidos em um tubo ventilado de 50 ml por 30 minutos durante seu ciclo de escuridão.
Frustração Social Crônica
[000370] Os ratos foram submetidos ao protocolo de frustração social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo e interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claros e perfurados foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias.
Tratamento antidepressivo
[000371] Os ratos receberam injeção i.p. de Imipramina tricíclica, ou Fluoxetina SSRI, ou Reboxetina NRI (20 mg/kg em salina) ou salina. Injeções crônicas foram realizadas por 18-2 dias consecutivos, e uma injeção aguda foi realizada 24 horas antes das microdissecações cerebrais. Microdissecação dos núcleos das rafes e coletas de plasma
[000372] Amostras cerebrais foram tomadas de núcleos das rafes (RN) de ratos após a remoção do cérebro e a colocação do mesmo em matriz cerebral acrílica (Stoelting). Pedaços foram retirados utilizando as lâminas do tipo navalha padrão (GEM) com base nos marcadores atômicos designados. Foram usadas seringas 14G embotadas para extrair a região do RN de pedaços de 3 mm removidos da matriz. Adicionalmente, sangues-troncos foram coletados nos tubos contendo EDTA a fim de evitar a coagulação. Após a centrifugação em 3.500 g por 30 minutos a 4 °C, o plasma foi separado e mantido em -70°C até a purificação do RNA. Purificação do microRNA e Análise de Expressão RT-PCR Quantitativa
[000373] mRNAs, incluindo os microRNAs, foram isolados dos neurônios classificados, perfurações cerebrais congeladas e plasma utilizando o minikit miRNeasy (Qigen) de acordo com as instruções do fabricante, e tratados utilizando o kit mRNA de transcrição Reversa miScript para gerar cDNA. Amostras de cDNA foram, então, analisadas utilizando o kit SYBR®Green PCR (Qiagen) de acordo com as orientações do fabricante no termociclador AB 7500 (Biossistemas Aplicados) Iniciadores específicos para cada miR foram utilizados juntamente com o iniciador universal comercial, enquanto que o U6 snRNA foi utilizado como controle interno. Tabela 1B: Sequência de iniciadores utilizados para PCR em tempo real
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Tabe a 1C: Sequências de iniciadores utilizados para a clonagem molecular
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[000374] O pre-miR-135b foi amplificado pelo PCR a partir do DNA genômico do rato com )s iniciadores adicionando locais Agel de enzimas de restrição e, então, foi o inSlc6a4ed para o vetor pGEM—T Fasy (Promega, Madison, WI). Depois da sequência do pGEM—T asy e da digestão de ambos os vetores pGEM-T Easy e o EGFP (Clontech laboratories Inc., Mountain View, CA) com o gel, a sequência miR-135b prematura foi ligada ao vetor EGFP para construir a expressão plasmídeo pEGFP-miR-135b. finalmente, o pEGFP-miR-135b foi cortado pelo BamHi e o srGI paralelamente ao corte da plasmídeo pCSC-E/Syn-eGFP om as mesmas enzimas, e a sequência miR- 135b-eGFPfoi igada à pCSC-E/Syn para construir o plasmídeo pCSC-eSNY- re-miR-135b-eGFP que foi confirmada pela análise ndonuclease de restrição e o sequenciamento do DNA. Produção de vetores lentivirais
[000375] Lentivírus recominantes foram produzidos pela transfecção transiente nas élulas HEK293T, conforme descrito anteriormente [Naldini L t al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:11382-8]. Em suma, s infecções por lentivírus foram colidas em 48 e 72 horas .pós a transfecção, filtrada através de filtros de acetato Le celulose de poro 0,45 pm e concentrada por iltracentrifugação. Injeções intracerebrais dos lentivírus
[000376] Para fornecer um Iontrole de precisão sobre a cirurgia extereotáxica e o local de transporte lentiviral, os inventores usaram um Instrumento estereotáxico orientado por computador e um monoinjetor motorizado (Instrumento Estereotáxico Angle woTM, myNeurolab). Conforme descrito anteriormente [Singer ). et al. Nat Neurosci (2005).8, 1343-9] os ratos foram colocados em um aparato estereotáxico sob anestesia geral, coordenadas foram determinadas conforme definido por Franklin e Paxinos atlas. A preparação lentiviral foi transportada utilizando uma seringa Hamilton conectada com sistema nanoinjetor motorizado e a solução injetada em uma taxa de 0,2 p1 a cada 1 minuto. Após um período de recuperação de duas semanas, os ratos foram submetidos a estudos comportamentais e psicológicos e no final anestesiados e perfundidos com fosfato regulados a 4% de paraforrmaldeído. Os cérebros fixos foram seccionados em série para pedaços de 30μ, a fim de confirmar a precisão do local da injeção, utilizando imunohistoquímica.
Imunohistoquímica
[000377] O procedimento utilizado para a imunohistoquímica foi desempenhado conforme descrito anteriormente [Chen A et al. J Neurosci 2006) 26: 5500-10]. Para a imunocoloração GFP, os inventores usaram anticorpo anti-GFP biotinilado cultivado ?m coelhos como anticorpo primário (Abcam, Cambridge, UK), estreptavidina conjugada Cy2 como anticorpo secundário ,Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, J.S.A) .
Avaliações comportamentais
[000378] Todas as avaliações comportamentais foram realizadas durante a fase de escuridão seguindo da habituação para a sala de teste por 2 horas anteriores a cada teste.
Teste de suspensão pela cauda
[000379] O teste de suspensão pela cauda foi realizado no TSE [Tail Suspension Monitor Monitor de Suspensão pela Cauda] (Sistemas TSE, Bad Homburg, Alemanha). Cada rato foi preso pela ponta da cauda e suspenso a partir de um sensor de força por 10 minutos. O tempo passado imóvel e o tempo passado lutando foram calculados e registrados pelo software com base no limiar pré-estabelecido. Teste de nado forçado modificado
[000380] O teste de suspensão pela cauda foi realizado conforme previamente descrito [Krishnan V and Nestler EJ, Nature (2008) 455: 894902]. Em suma, o aparato usou um balde plástico, 18 cm de diâmetro, preenchido com água a 25 °C com uma profundidade de 15 cm.
[000381] Cada rato foi colocado no centro do balde para iniciar um vídeo de 6 minutos gravado da seção de teste. A duração do tempo passado imóvel durante os 2-6 minutos de teste foi classificado automaticamente utilizando o EtoVision XT (Noldus, Wageningen, Holanda). Atividade locomotora
[000382] Para controlar a possibilidade dos efeitos comportamentais oriundas das diferenças em movimento ambulatorial, a atividade locomotora dos ratos foi examinada por um período de 48 horas, que foi precedido por alguns dias de habituação. Os ratos foram alojados sozinhos em gaiolas especializadas e a 5 locomoção foi medida utilizando o sistema InfraMot (Sistemas TSE, Bad Hamburg, Alemanha).
[000383] Análise estatística
[000384] Os dados foram expressos como médias de +/- SEM. Para testar a significância estatística, o teste t dos estudantes foi utilizado em casos onde somente dois grupos foram comparados, tais como entre a validação de microarranjo qPCR. Uma maneira que o ANOVAs foi utilizado para comparar entre os múltiplos grupos tais como entre os tratamentos diferentes no ensaio de luciferase. Duas maneiras que o ANOVAs foi utilizado nos casos de 2 variáveis independentes, tais como a injeção SSRI NRI, ambos em durações agudos e crônicas. Testes t posteriores foram utilizados quando necessário para revelar a significância estatística. As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas quando P<0,05.
RESULTADOS
[000385] Os neurônios 5HT foram isolados do RN dos embriões ePET YFP, e seus perfis de expressão miR foram comparados com os neurônios não 5HT, obtidos dos mesmos núcleos, utilizando o microarranjo miR (Figura 1A). Quatorze miRs foram descobertos como regulado 0 para cima e vinte e sete regulado para baixo por mais de 2 vezes nos neurônios 5Ht comparados com os neurônios não 5HT (vide Tabelas 2a-B, abaixo). A validação representativa dos resultados do arranjo foi realizada utilizando o PCR em tempo real para os miRs regulado para cima em neurônios 5HT 5 como o miR-375 (P=0,0071; Figura 1B) e regulado para baixo como o miR-135a (P=0,0075; Figura 10). A fim de estudar ainda o papel dos miRs como moduladores dos neurônios 5HT, análises bioinformáticas extensivas foram realizadas de uma maneira hipotética. Visando a previsão dos genes relacionados com a serotonina conhecidos que tenham sido previamente demonstrado como associados com as psicopatologias, foram cruzados com os resultados do microarranjo. As quatro proteínas seguintes codificando os genes alvo expressadas nos neurônios 5HT no RN foram escolhidas para teste: transportador de serotonina, responsável pela recaptação 5HT (também conhecida como SERT ou Slc6a4); o receptor la inibidor de serotonina (também) conhecido como Htrla); triptofano hidroxilase 2 (Tph2), a taxa de limitação da enzima de sínteses 5HT no cérebro; e a monoamina hidroxilase (MaoA), que desativa o 5HT. As previsões almejadas do microRNA para estes genes foram realizadas utilizando dois algoritmos diferentes com base na web: o Escaneamento Alvo [www(ponto)targetscan(ponto)org] e o Miranda [www(ponto)microrna(ponto)org] e foram cruzadas com a lista de 91 miRs alterados por, pelo menos, ± 1,5 no arranjo miR dos neurônios 5HT, comparado com as células não 5HT. Com base nos dados do arranjo miRs e nas análises bioinformáticas, oito miRs foram escolhidos para estudos adicionais in vitro (Figura 1D-G). Tabela 2A: Lista de miRs regulados para cima em neurônios 5HT comparados com não serotonérgicos (por mais que duas vezes).
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Tabela 2B: Lista de miRs regulados para baixo em neurônios 5HT comparados com não serotonérgicos (por mais que 2 vezes).
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[000386] Ensaios luciferase in vitro foram realizados para testar as interações miR-alvo entre o 3'UTR do 5HT testado relacionado com o gene e os miRs previstos para alvejá-lo putativamente. Os inventores descobriram que o Tph2 3'UTR foi severamente reprimido (por aproximadamente 20%) por miR-27b (P = 0,0051) e miR-181C (P 0 = 0,0305, Figura 1H) e MaoA 3'UTR também foi reprimido por miR-27b (P = 0,0008, Figura lI). miR-135 alvejando de 3'UTR (Figura 2A e 2C) e Htrla 3'UTR (Figura 2B e 2D) resultou em repressão robusta de tradução destas transcrições. Enquanto miR- 135a leva a uma repressão de aproximadamente 30% para Slc6a4 (P=0,014)e Htrla (P < 0,0001), miR-135b causou uma repressão de aproximadamente 50% para o Slc6a4 (P = 0,0002) e Htrla (P < 0,0001). Adicionalmente, uma repressão significante do Htrla 3'UTR foi gerada pelo miR-335 (P<0,0001), miR-181c (P=0,0029) e miR-26a (P<0,0001, Figura 2D). Uma abordagem genômica adicional da análise bioinformática revelou uma forte conservação da combinação de semente miR-135 no slc6a4 3'UTR (Figura 2E) e em uma de duas correspondências de semente identificadas no Htrla 3'UTR (Figura 2F). Estudos de mutação no 3'UTR da transcrição Slc6a4, que removeu a combinação de semente miR do miR-135, revelou que tanto o miR-135 quanto o miR-135b alvejando o Slc6a4 foi mediado através da sequência de combinação de semente. A repressão induzida pelo miR-135 foi totalmente bloqueada pela mutação no Slc6a4 3'UTR Figura 2G) . A mutação da combinação de semente Htrla miR-135 individualmente ou ambas revelou que o miR-135 estava reprimindo o Htrla 3'UTR através da combinação de semente distal e não proximal enquanto que o miR-135b age através de ambos os locais previstos (Figura 2H).
[000387] Os inventores testaram ainda a regulação da expressão RN- miR-135 in vivo seguindo os estímulos ambientais diferentes ou tratamentos farmacológicos. Na sequência da manipulação dos ratos (ou seja, estresse por manipulação agudo) o RN foi removido, o RNA foi extraído e os níveis de miR-135 foram testados utilizando o PCR em tempo real. Uma vez que os níveis de 5HT são conhecidos por ser alertados por estresse agudo, os inventores testaram os níveis do miR-135 em pontos de tempo diferentes após o estresse por restrição agudo, e descobriram que tanto o miR-135a quanto o miR-135b foram regulado para baixo por 90 minutos seguindo o estresse agudo (P<0,001). Os níveis reduzidos destes miRs ainda permaneceram por 24 horas após o estresse, comparado com o rato de controle (P=0,0357 para o miR-135a, Figura 3a; P=0,0055 para o miR 135b, Figura 3B). Ademais, uma vez que as funções neuronais e os níveis de expressão Slc6a4 e Htrla são conhecidos por ser fortemente afetados em 3 pacientes deprimidos e seguindo as medicações antidepressivas, os inventores testaram os níveis de duas variantes miR em ratos expostos ao modelo ambiental para a indução de comportamento do tipo depressivo (modelo de frustração social crônica) e para o antidepressivo tricíclico, Imipramina. Interessantemente, o estresse por frustração social crônica não altera os níveis do miR-135 no núcleo de rafe, entretanto, a Imipramina administrada agudamente ou cronicamente, ambos em ratos estressados ou não estressados, aumentou os níveis de expressão miR-135a (P=0,003; Figura 3C) e miR-135b (P=0,0093; Figura 3D) no RN. Uma vez que a Imipramina não é um inibidor de recaptação 5HT específico, os inventores ainda testaram o efeito de ambos os inibidores de recaptação de serotonina seletiva agudo e crônico (SSRI), Fluoxetina, e os inibidores de recaptação de noradrenalina (NRI), Reboxetina, e descobriram um robusto aumento nos níveis de miR-135a seguindo tanto o tratamento SSRI agudo quanto o crônico (P<0,0001, Figura 3E), e não nos níveis de miR-135b no RN (Figura 3F). Intrigados com a alteração nos níveis de miR-35 no RN seguindo o tratamento de SSRI, os inventores testaram os níveis de miR-135 circulantes no plasma dos ratos, e descobriram uma queda robusta nos níveis de miR- 135a seguindo tanto a administração do SSRI aguda quanto a crônica (efeito principal para a droga P<0,0001, Figura 3G) e nenhum efeito nos níveis do miR-135b circulante (Figura 3H), sugerindo uma forte correlação reversa entre os níveis de miR-135a no RN e o plasma seguindo a administração do SSRI (Figura 3I e 3J).
[000388] Para explorações adicionais da importância dos níveis de miR- 135 em todo o contexto animal os inventores manipularam os níveis de miR- 135 in vivo especificamente no RN de ratos adultos e testaram seu efeito nos comportamentos do tipo depressivo em ratos. Para este fim, os inventores construíram lentivírus recombinantes superexpressando o miR-135b especificamente em neurônios utilizando o promotor de sinapsina aprimorado, que também coexpressou o repórter GFP 3 (vide seção de materiais e procedimentos adicionais acima e na Figura 4A). Os inventores testaram os lentivírus in vivo injetando-os dentro do RN de ratos adultos, e compararam os níveis de miR-135b no RN para os lentivírus de controle injetados nos ratos. Análises de PCR em tempo real dos níveis de miR-135b revelaram uma indução de 10 vezes comparada com os lentivirus de controle injetados nos ratos (P=0,0032, Figura 4B). Os ratos adultos injetados com a superexpressão miR-135b foram expostos à frustração social crônica, para iniciar os comportamentos do tipo depressivo, e foram subsequentemente testados comportamentalmente. Seguindo o teste comportamental, os ratos foram perfundidos e os cérebros foram analisados para a localização do local de injeção (Figuras 4C-D). RN de ratos com miR-135 superexpressados demonstraram um tempo de imobilidade reduzido no nado forçado (P=0,0088 no minuto 3 e P=0,00330 para o minuto 4; Figura 4E) e nos testes de suspensão da cauda (P=0,07356 no último 5 minuto do teste, Figura 4F) sem nenhuma alteração observada na locomoção em sua gaiola (Figuras 4G-H), sugerindo um efeito antidepressivo para a superexpressão miR-135.
[000389] Com tudo isso, os presentes inventores determinaram a impressão digital da expressão dos miRs específicas no RN dos neurônios serotogênico e não serotogênicos. Os presentes inventores cruzaram estes dados únicos estabelecidos com a previsão bioinformática para os miRs alvejando o 5HTrelacionado com o gene. Os presentes inventores testaram in vitro a previsão alvo para Tph2, MaoA, Slc6a4 e Htrla utilizando ensaios luciferase 3'UTR's e em estudos de mutilação e revelaram, entre outras interações miR alvo, um forte efeito inibidor para o miR-135 para o S16a4 e para o Htrla 3'UTR. Ademais, os inventores demonstraram que o miR-135 no RN é regulado para baixo por estresse agudo, e regulado para cima por administração antidepressiva, especificamente por drogas SSRI. Além disso, os presentes inventores identificaram uma correlação reversa entre os níveis de miR-135 no RN para seus níveis no plasma seguindo a administração SSRI. Finalmente, os presentes inventores demonstraram que a superexpressão específica do local do miR-135 no RN de ratos adultos leva à uma diminuição dos 1 comportamentos do tipo depressivo seguindo a frustração social.
EXEMPLO 2
[000390] O miR-19 especificamente objetiva o receptor adrenérgico beta tipo um (Adrbl) MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Clonagem de 3'UTRs dentro do plasmídeo de expressão da luciferase Psicheck2
[000391] A sequência 3'UTR de ADRbl foi ampliada a partir do DNA genômico do rato. As sequências 3'UTR mutadas, faltando todas as quatro correspondências de semente miR-19, foram sintetizadas pelo Epoch Biolabs, Inc. (TX, USA). Fragmentos 3'UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3' da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.
Ensaios de luciferase e transfecções
[000392] As células HEK293T ou células neuronais HT22 foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formatos de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os seguintes plasmídeos: Plasmídeo Psicheck2-3'UTR, a superexpressão pre-mmu-miR- 19b em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech), plasmídeo miR-19b de silenciamento (KD) (Genocopoeia) ou plasmídeo KD de controle (Genocopoeia). 24 horas seguintes à transfecção as células foram lisadas e a atividade dos relatores de luciferase foram arranjados, conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de repila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.
RESULTADOS
[000393] As análises bioinformáticas para o estresse relacionado aos genes com sequências alvo miRNA distintas, evolucionárias e conservadas que contêm várias repetições em seu 3'UTR revelaram o miR-19 como um forte candidato para o alvo do receptor adrenérgico beta tipo um (Adrb 1), com três correspondências de semente miR-19 fortemente conservadas e uma menos conservada no Adrbl 3'UTR. O Adrbl é um receptor adrenérgico que é expresso em várias regiões do cérebro incluindo a amídala, hipocampos e núcleos para ventriculares (PVN 1 paraventricular nucleus). O Adrbl amigdalar foi previamente descrito como afetando o comportamento do tipo ansiedade [Fu A et al., Brain Res (2008) 1211: 85-92; Rudoy CA e Van Bockstaele EJ, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2007) 31: 111929] e a memória do medo [Roozendaal B et al., J Neurosci (2004) 24: 8161-9; Roozendaal B et al., Neuroscience (2006) 138: 901-10]. De forma intrigante, o Adrbl foi descoberto em células CRF positivas da amígdala e é um receptor acoplado à proteína G (GPCR) que exerce seu efeito através do Gs ativando ainda a adenilato ciclase (AC) Há 10 genes conhecidos codificando para o AC, a saber, o ADCY1-10. Três destes (ADCY1, ADCY7 e ADCY9) foram previstos bioinformaticamente como alvejados pelo miR-19. O ADCY1 tem uma expressão específica do cérebro e foi previamente mostrado que a superexpressão da mesma no cerebelo no rato aprimora o reconhecimento da memória e o LTP [Wang H et al., Nat Neurosci (2004) 7: 635-42].
[000394] A fim de investigar se o miR-19 de fato regula a expressãoAdrbl ou ADCY1 através de suas sequências alvo presumidas no Adrb1-3'UTR ou ADCY1- 3'UTR, formas intactas ou mutadas do Adrbl- 3'UTR (Figura 5) ou ADCY1-3'UTR foram clonados em fluxo descendente do gene luciferase no plasmídeo de expressão Psicheck2. Na forma mutada do ADRb1-3'UTR todas as quatro correspondências de semente para o miR-19b estavam faltando (Figura 5). Na forma mutada do ADCY1-3'UTR parcial, comente a combinação de semente conservada (de 3) estavam faltando.
[000395] O ensaio de luciferase foi utilizado para determinar a natureza da interação entre o miR-19 e o Adrbl-3'UTR e também entre o miR-19 e o ADCY1- 3'UTR. Nas células HT22, que expressam endogenamente baixos níveis de miR-19, nenhuma diferença foi encontrada entre os níveis luciferase controlados tanto pela forma intacta ou mutada do ADRb1-3'UTR (Figura 6A). Entretanto, quando o miR-19b foi superexpressado nas células HT22, os níveis de luciferase foram significantemente (aproximadamente 2 vezes) inferior a quando conduzido pela forma intacta relativa à forma mutada do ADRb1-3'UTR (ademais de uma redução geral, aparentemente não específica na expressão luciferase normalizada (Figura 6B)). Em células HEK293T que expressa endogenamente alto níveis de miR-19, os níveis de expressão luciferase regulados pelo ADRb1-3'UTR foram de 2 a 4 vezes menores do que aqueles expressados quando regulados pela forma mutada do ADRb1- 3'UTR (Figuras 6C).
[000396] O sistema MiRs de silenciamento (KD) foi utilizado, a fim de manipular os níveis de miR-19 em células HEK293T. A saber, (1) sondas miRCURY LNA KD (Exiqon, MA, EUA Figura 6D), e (2) plasmídeo baseado na sequência de silenciamento (Genecopoeia, Rockville, MD, EUA, Figure 6E). Os níveis LNA-Anti-miR-19b luciferase aprimorados quando regulados sob o ADRb1-3'UTR em aproximadamente 20% relativo para controlar a sonda KD misturados e não tem efeito na forma mutada do ADRb1-3'UTR (Figura 6D). Onde, plasmídeo baseada no miR-19b KD, causou até 2 aprimoramentos de vezes na expressão luciferase regulada pela forma intacta do ADRb1-3'UTR relativo à sequência KD Controle (Figura 6E). Nenhum resgate completo dos níveis de luciferase relativo àquele conduzido pela forma mutante do ADRb1-3'UTR foi alcançado. Isso pode ser explicado seja pela especificidade do miR-19b da sonda/sequência genômica (perfuraram a regulação miR-19), os altos níveis do miR-19 nas células HEK293T que podem ser difíceis de regular completamente para baixo, ou o efeito do outro possível miRNA expressado nas células HEK293T que pode unir-se às mesmas sequências da combinação de semente no ADRb1-3'UTR. EXEMPLO 3A
[000397] MiR-19a e MIR-19b são regulados para cima no PFC e na amígdala seguindo o estresse crônico
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Animais e alojamento
[000398] Ratos miR 17-92 flx/flx [Ventura A et al, Cell (2008) 7;132(5):875-86], foram reproduzidos em cruzamento com ratos CamKIIa- Cre [Dragatsis I et al Genesis. (2000) 26(2):133-5]. Ratos transgênicos ou ratos adultos machos C57BL/6J foram alojados em uma temperatura ambiente controlada (22 ± 1 °C) em um ciclo reverso de 12 horas de luz/escuridão. Alimentos e água foram disponibilizados ad libitum. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Weizmann de Ciências. Geração de lentivírus para a manipulação miR-19b em cérebros adultos
[000399] A sequência MiR-19b foi clonada dentro de um plasmídeo lentiviral, seguindo o promotor III-Hl de RNA polimerase. Ademais, a sequência Pré-miR-19b foi Clonada seguindo um promotor neuronal específico (Sinapsina aprimorada, ESyn) em uma plasmídeo lentiviral. Os lentivírus foram gerados para ambos os experimentos in vivo, miR-19b-KD e superexpressões-Pre-miR19b (0E). Estes lentivírus foram utilizados para manipular os níveis miR-19b nas regiões alvo onde os níveis miR-19 foram tidos como alterados, seguindo um estímulo comportamental/farmacológico. Geração de ratos faltando o miR-19 no cerebelo
[000400] A fim de gerar ratos com falta do miR-19 no cerebelo, os inventores, estão, reproduziram ratos carregando o gene que codifica a recombinase Cre sob o promotor CamKIIa com ratos carregando uma forma condicional dos miRs com ramificação miR17-92. A família MiR-19 inclui o miR-19a e o miR-19b. No genoma miR19 do rato há duas cópias idênticas, miR-19b e miR-19b-2. O MiR19a e o miR-19b-1 estão localizados na mesma ramificação miRNA, a saber, miT17-92, onde o miR-19b-2 está localizado em diferentes locais genômicos, miR106a-363. Este último parece ter pouca ou nenhuma expressão nos tecidos do rato e, portanto o silenciamento da ramificação miR17-92 é expressada como suficiente para permitir um efeito profundo sobre os níveis de expressão miR-19a e miR-19b no cerebelo. Estímulos comportamentais/farmacológico
[000401] Ratos com falta da ramificação miR-17-92 no cerebelo, ou ratos onde o miR-19 foi especificamente manipulado (níveis superexpressados de ADRb1, ADCY1 e outras transcrições e produtos do gene.
[000402] Estes animais também serão testados para o comportamento do tipo ansiedade, atividades locomotoras e desempenho da memória. Ademais, os níveis da expressão do miR-19a e do miR-19b são examinados em regiões diferentes de interesse (P.EX. do hipotálamo, amígdala e cerebelo) seguindo um tratamento sistêmico Oagudo e crônico com inibidor de racaptação de Noradrenalina Reboxetina em ratos WT.
RESULTADOS
[000403] A ligação psicológica entre o miRNA-19 e o Adrbl foi estudada, avaliando o nível do miR-19a/b no córtex pré-frontal (PFC) dos ratos que foram injetados com Reboxetina, um inibidor de recaptação de noradrenalina (NRI), seja aguda ou cronicamente (Figuras 12A-D). Conforme mostrado nas Figuras 12A-D, os níveis de miR-19a/b foram regulados para baixo seguindo a administração aguda de Reboxetina (Figura 12A, B) e regulado para cima seguindo a administração crônica de Reboxetina (Figura 12C,D).
[000404] Na sequência, os níveis de miR-19 foram avaliados seguindo o estresse por medição dos níveis de miR-19 a e b no PFC e amígdala dos ratos submetidos ao protocolo de frustração social (Figuras 12A-D) . Conforme mostrado nas Figuras 13A-D, os níveis de miR-19 a e b aumentaram tanto para o PFC como para a amígdala seguindo o estresse crônico. Estes resultados ilustram o envolvimento do miR-19 na regulação da resposta ao estresse central. EXEMPLO 3B miRNA-19 e receptor canabinoide 1 (CB1) MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Animais e alojamento
[000405] Conforme descrito no Exemplo 3A, acima.
[000406] Geração de lentivírus para a manipulação miRNA-19b em cérebros adultos
[000407] Conforme descrito no Exemplo 3A, acima.
RESULTADOS
[000408] O CB1 é um dos GPCRs mais abundantemente expressados no cérebro e é particularmente enriquecido no córtex, amígdala, hipotálamo, gânglio basal, e cerebelo (Figuras 15A-B) [Herkenham M. et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience (1991) 11:563-583; Mackie, K. Handbook of experimental pharmacology (2005) 299-325]. Os receptores CB1 são altamente expressados em axônios e terminais do axônio, onde estão bem posicionados quanto à modulação da neurotransmissão. Os inventores descobriram que o CB1 contém 2 locais de semente que são compatíveis com o miRNA- 19.
[000409] O ensaio de luciferase foi utilizado para determinar a natureza da interação entre miRNA-19 e o CB1-3'UTR. Quando o miRNA-19b foi superexpressado em células HT22 juntamente com o 3'UTR do CBI, os níveis de luciferase foram significantemente (50%) mais baixos quando comparados com o GFP superexpressado com mesmo 3'UTR (Figura 14), suportando um possível papel para o miR-19 na regulação dos níveis de CB1. Experimentos de mutação adicionais são realizados para verificar o papel da sequência de semente miR-19 prevista para a regulação observada (conforme descrito para o Adrbl acima).
[000410] De forma interessante, estudos prévios demonstraram convincentemente que a consolidação das memórias aversivas é facilitada pela conversa cruzada entre a sinalização glucocorticoide, noradrenalínica e canabinoide nos núcleos basolaterais da amígdala (BLA 1 basolateral nucleus of the amygdala) [Roozendaal, B. et al. Neurobiology of learning and memory (2006) 86:249-255]. Um modelo proposto por Hill e McEwen [Hill M.N. and McEwen B.S. Proc of the Nat Acad of Sci of the USA (2009) 106:4579-4580] mostrou um possível mecanismo de ação no BLA para a consolidação da memória (Figura 16).
[000411] Conforme mostrado nos presentes resultados, o MiRNA-19 aparece para regular ambos Adrbl e CB1 in vitro. A superexpressão e o de silenciamento do miR-19 usando, por exemplo, o lentivírus transportado especificamente para o BLA onde pode alterar os níveis de Adrbl e CB1, são desempenhados, bem como testes que examinam o desempenho dos ratos quanto aos paradigmas de aprendizado e de memória como o condicionamento do medo com e sem exposição a estímulos estressantes. EXEMPLO 3C Identificação de miRNA diferencialmente expressados em ratos submetidos ao estresse crônico MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Imunoprecipitação da proteína Ago2
[000412] Tanques de 3 amígdalas de 3 animais que são parte do mesmo grupo ("Suscetíveis", "Resilientes" ou Controle) foram homogeneizados no tampão NP40 que foi suplementado com inibidor RNase, inibidor e inibidor de fosfatos. As amostras foram mantidas sobre constante agitação por 2 horas a 4°C. As amostras foram, então, centrifugadas por 20 minutos a 12,000 rpm a 4°C. Em uma microcentrífuga, o sobrenadante foi colocado em um tubo fresco mantido em gelo e a grânulos foi descarregada. A proteína G magnética do rebordo (Dynabeads, Invitrogen) foi incubada com o anticorpo monoclonal Ago2 (WAKO) com rotação em temperatura ambiente por 10 minutos. Após várias lavagens, as amostras foram adicionadas aos rebordos da proteína G revestida de Ago2 e incubadas a noite toda em 4°C sob agitação. No dia seguinte, os rebordos foram lavados 3 vezes com PBS. Para a purificação RNA, os rebordos foram homogeneizados no tampão RLT do kit RNase, protocolo suplementares miRNA). Para a análise western blot, os rebordos foram fervidos em tampão de amostras para liberar a proteína dos rebordos. Microarranjo e purificação do RNA
[000413] O RNA das amostras de imunoprecipitação Ago2 foi isolado utilizando o kit Rneasy plus (Qiagen) seguindo o Protocolo 1 suplementar Quagen: Purificação do RNA total contendo miRNA. O RNA para todas as outras finalidades foi isolado de perfurações cerebrais congeladas utilizando o minikit miRNeasy (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante, e a integridade do RNA foi avaliada utilizando o bioanalisador Agilent 2100. O RNA derivado dos tecidos de ratos estressados seguindo a imunossupreção Ago2 foi ainda analisado nos arranjos Affymetrix miRNA 2,0 (protocolo RNA enriquecido) e arranjo Affymetrix Mouse Gene 1,0 ST.
RESULTADOS
[000414] A fim de identificar e estudar os miRNAs expressados diferentemente isolados da amígdala de ratos submetidos ao paradigma de estresse crônico e/ou associado com o fenótipo comportamental "Resiliente" ou "Suscetível", o protocolo de frustração social foi utilizado (vide seção de Métodos).
[000415] A fim de identificar uma conexão genuína entre os miRNAs e seu 3'UTR do genes alvo seguindo o paradigma de frustração social, uma imunoprecipitação (IP) do complexo Ago2 foi realizada e a população de miRNAs e mRNAs coprecipitados foi analisado. Quando o miRNA maduro foi formado, foi incorporado ao complexo RISC. Enquanto no complexo RISC, o Ago2 facilita a interação entre um miRNA específico e seu mRNA 3'UTR alvo [Meister G. et al., Molecular cell (2004) 15:185-197] (Figura 17A).
[000416] A fim de verificar que o complexo Ago2 pode de fato ser precipitado com seu RNA unido, o IP foi realizado na amígdala dos ratos neutros. O IP foi realizado utilizando os rebordos magnéticos de proteína G que foram reagidos com anticorpo Ago2 monoclonal. Conforme mostrado na Figura 17B, uma banda Ago2 específica foi precipitada de um extrato de células NIH 3T3 (Figura 17B, linha 1) ou de um extrato do tecido da amígdala (Figura 17B, linha 2).
[000417] Para demonstrar a especificidade do IP, uma amostra cerebral total foi dividida em duas, onde uma foi precipitada com anti-Ago2 e a outra com um anticorpo IgG1 de controle não específico. Uma banda Ago2 específica estava presente somente no precipitado Ago2 (Figura 17B, linhas 3, 4).
[000418] Assim, ao puxar para baixo o complexo Ago2 e analisar as populações de miRNA bem como as de mRNA no material precipitado, havia uma chance maior de descobrir uma conexão correta entre uma dada miRNA e seu mRNA 3'UTR alvejado em regiões cerebrais específicas. Isolamento do Ago 2 associado ao RNA da amígdala de ratos submetidos ao paradigma de frustração social
[000419] Na sequência, com base em resultados específicos do experimento Agos2 IP, a mesma estratégia foi implementada a fim de revelar potenciais diferentes no miRNA e seus mRNAs alvo no cérebro de ratos que foram submetidos ao protocolo de frustração social.
[000420] Depois de 10 dias de paradigma de frustração social, os ratos foram categorizados em 3 grupos: Controle, "Suscetível" e "Resiliente". Um rato foi categorizado como "Suscetível" quando apresentou uma esquiva social quando encontrava um novo rato da mesma raça que o atacou durante o paradigma de frustração social. Um rato foi caracterizado como "Resiliente" se não evitar o novo rato agressivo e interagir com o mesmo. A maioria dos ratos submetidos à frustração social apresentou tipicamente uma esquiva social e, portanto seria classificado como "Suscetível". Aproximadamente somente 10-20% dos ratos em um experimento são esperados que sejam "Resiliente". Abaixo é mostrado um exemplo de teste conduzido de esquiva social.
[000421] Conforme demonstrado na Figura 18A, o rato foi colocado sozinho em um labirinto social por 3 minutos para a habituação. A câmera captou os movimentos do rato através do labirinto. Na Figura 18C, o mesmo rato foi exposto a um rato recente ICR que foi colocado além de uma divisória. A câmera captou o rato no canto mais distante da arena longe da localização do rato recente. A resposta foi considerada como esquiva social e, assim, este rato foi classificado como "Suscetível". Em contrapartida, na Figura 18B e na Figura 18D o rato não apresentou esquiva social e, assim, foi classificado como "Resiliente".
[000422] Quarenta ratos foram submetidos ao paradigma de frustração social e quarenta ratos serviram como controle. Na sequência do teste de esquiva social 9 ratos "Resilientes", 9 ratos "Suscetíveis" e 12 ratos controle foram selecionados para a microdissecação cerebral. As amostras cerebrais foram coletadas 8 dias após o teste de esquiva social da amígdala, BNST, PFC, rafe dorsal e hipocampo juntamente com o sangue-tronco.
[000423] Grupos de 3 perfurações da amígdala obtidas de 3 ratos diferentes foram combinados e a imunoprecipitação com anti-Ago2 foi realizada. Na sequência ao IP, o RNA foi extraído do material precipitado. Após puxar 3 amígdalas de cada grupo, haviam 3 amostras de RNA dos ratos "Resilientes", 3 amostras de RNA dos ratos "Suscetíveis" e 4 amostras de RNA dos ratos de controle - um total de 10 amostras de RNA. Cada amostra foi testada em um microarranjo ST do rato bem como no arranjo miRNA (ambos Affymetrix). Os genes e os miRNAs que foram regulados para cima ou baixo em cada um dos 2 grupos: "Suscetível" ou "Resiliente" relativo ao grupo de controle, foram examinados. Se uma interação entre certo mRNA e um gene alvo acontece, os inventores esperaram por uma correlação oposta em seus níveis totais. Entretanto, o mPNA presente no complexo RISC (precipitado com anti-Ago2) foram esperados que estivessem com níveis altos por conta de ainda não terem sido fragmentados, assim enquanto olhando os dados do arranjo, os inventores examinaram os miRNAs e o mRNA alvo potencial que foram ambos ou elevados ou regulados para baixo relativo à amostra de controle porque esta era uma indicação de que interagiram no complexo RISC. Resultados do microarranjo
[000424] A Tabela 3 abaixo ilustrou os resultados dos arranjos preliminares analisados utilizando os filtros convencionais. Tabelas 3A-B: Lista de miRNAs amigdalares regulados para cima (Tabela 3A) ou regulados para baixo (Tabela 3B), seguindo o IP com Ago2
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[000425] *Para ambas as Tabelas 3A-B, os dados foram apresentados como alterações sucessivas para ratos "Suscetíveis" ou "Resilientes" comparados com os de Controle. Os valores em negrito foram significantemente alterados.
[000426] Vários miRNAs, que foram significantemente regulados para cima nos grupos de ratos "Suscetíveis" e "Resilientes", foram selecionados e ilustrados no mapa de calor (vide Figura 19A-B). Arranjo de expressão do gene (mRNA) Tabela 4: Lista de mRNAs amigdalares regulados para cima seguindo o IP com Ago2.
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[000427] *Os dados são apresentados como alterações sucessivas para ratos "Suscetíveis" ou "Resilientes" comparados com os de Controle. Os valores em negrito foram significantemente alterados. Tabela 5: Lista de mRNAs amigdalares regulados para baixo seguindo o IP com Ago2.
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[000428] Vários miRNAs potenciais e seus alvos putativos no cérebro foram analisados. EXEMPLO 4A miR-15a e miR-15b como reguladores da resposta ao estresse. MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Extração do RNA total
[000429] O tecido da amígdala foi dissecado 90 minutos seguintes ao procedimento de estresse agudo. O RNA total foi isolado utilizando o kit miRNeasy (Qiagen) a fim de preservar os miRNAs. Perfurações cerebrais congeladas foram transferidas dentro do lise tampão e imediatamente homogeneizadas. As culturas primárias neuronais ou as culturas de células N2a foram lisados em poços, em gelo. O processamento adicional foi feito de acordo com as recomendações do fabricante. Os extratos de RNA foram armazenados a -80° C até o seu uso.
Arranjo miRNA
[000430] A expressão diferencial do mRNA foi testada pelos microarranjos de miRNA da Agilent (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) ou Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para a avaliação da expressão diferencial do mRNA utilizando o arranjo Agilent, 100 ng de RNA total por amostra (3 amostras de controle e duas amostras de estresse agudo) foram cada uma rotuladas e hibridizadas, de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram escaneados utilizando um scanner de microarranjo Agilent. Os dados foram extraídos utilizando o software v9 Agilent Feature Extraction e analisados utilizando o Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, Missouri, EUA). Os dados dos arquivos geneView.txt foram submetidos à transformação de log e à normalização do quantil. Para a avaliação da expressão diferencial do mRNA utilizando o arranjo Affymetrix, 1 pg de RNA total por amostra (duas amostras de controle e duas amostras de estresse agudo) foram cada uma rotuladas e hibridizadas de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram escaneados utilizando um scanner de microarranjo Affymetrix. Os dados foram extraídos utilizando o software de scanner Affymetrix e normalizados utilizando os parâmetros padrão do software Affymetrix miRNAQCtool (ajuste de fundo, normalização quantil, transformação de log e determinação do limiar). Os dados normalizados dos quatro arquivos foram importados do software Partek Genomics. Os genes não apresentados em nenhum dos microarranjos foram filtrados. Devido à diferença da distribuição do miRNA, diferentes intervalos de log de cortes (correspondente a cerca de 1 erro padrão para cada arranjo) foram escolhidos para cada arranjo: 0,2 para o Agilent e 0,4 para o Affymetrix, os miRNAs com intervalos maiores que os cortes foram comparados entre os arranjos e os miRNAs comuns são reportados. Clonagem de 3'UTRs dentro do plasmídeo de expressão da luciferase Psicheck2
[000431] A sequência 3'UTR de CRFR1 foi ampliada a partir do DNA genômico do rato. Fragmentos 3'UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3' da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento. Ensaios de luciferase e transfecções
[000432] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em formato 48 poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os seguintes plasmídeos: plasmídeo Psicheck2-3'UTR, superexpressão pre-mmu-miR-15 em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech). 24 horas após a transfecção, as células foram lisadas e a atividade dos relatores de luciferase foi testada, conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3'UTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.
RESULTADOS
[000433] O miR-15a e o miR-15b emergiram, conforme regulado para cima 90 minutos depois do estresse por restrição aguda (Figura 7A-B). Ambos miR-15a e miR-15b foram bioinformaticamente previstos para o CRFR13'UTR alvo (Figura 7C). A superexpressão in vitro do miR15b nas células HEK293T reduziram significantemente os níveis da expressão luciferase controlada pelo CRFR1-3'UTR (Figura 7D) .
EXEMPLO 4B
[000434] Efeito do miR15 no FKBP5
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000435] Conforme ilustrado no Exemplo 4A, abaixo.
RESULTADOS
[000436] De acordo com os resultados do arranjo, o miR-15a e a proteína 5 de ligação FK506 (também conhecida como FKBP5) foram ambos regulados para cima nos ratos "Suscetíveis" e "Resilientes", relativos ao grupo de controle (Figuras 2OA-B), sugerindo sua regulação para cima no complexo RIC como um resultado do estresse crônico.
[000437] Estudos genéticos vêm identificando um papel para o FKBP5 no distúrbio do estresse pós-traumático, depressão e ansiedade. Por exemplo, descobriu-se que os polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs I single nucleotide polymorphisms) no FKBP5 interagem com o trauma de infância para prever a severidade do distúrbio do estresse pós-traumático adulto (PTSD posttraumatic stress disorder) [Binder, E.B. et al., Nature genetics (2004) 36:1319-1325]. Estas descobertas sugerem que os indivíduos com estes SNPs que são abusados quando crianças são mais suscetíveis ao PTSD quando adultos. 0
[000438] FKBP5 também foi encontrado como menos expressados em indivíduos com PTSD atual [Yehuda, R. et al., Biological psychiatry (2009) 66:708-711]. O gene FKBP5 foi encontrado como tendo vários locais de poliadenilação e está estatisticamente associado a uma taxa mais elevada de transtornos depressivos [Binder et al. supra].
[000439] Análises adicionais do 3' UTR of FKBP5 revelaram que tem uma sequência de combinação de semente para o miR-15 (Figura 20C).
[000440] Se de fato o miR-15a regula o FKBP5 ARNm, esperava-se que, embora tanto o miR15a e o FKBPS seria regulado para cima no precipitado Ago-2 (tal como mostrado pelos resultados de microarranjo, Fig. 20B), os níveis totais de mRNA ou de proteína da FKBP5 na amostra da amígdala seria diminuído.
[000441] A fim de analisar se a interação entre o miR-15a e o FKBP5 ocorre na amígdala, foi realizada uma análise de PCR em tempo real em amostras de RNA total obtido a partir da amígdala de ratos "Suscetíveis" e de controle. Conforme mostrado nas figuras 21A-B, os níveis de miR-15a foram aumentados no extrato de RNA total feitos a partir de ratos suscetíveis ao passo que os níveis FKBP5 foram reduzidos. Estes resultados indicam que o miR-15a reprime os níveis de FKBP5 na amígdala seguinte à condição de estresse crônico.
[000442] A clonagem das formas 3'UTR intactas e mutadas de FKBP5 para análise de arranjos de luciferase é realizada de modo a descobrir se uma interação direta entre o miR-15a e FKBP5 ocorre in vitro.
[000443] Além do FKBP5, o miR-15 pode potencialmente regular um número de genes que estão envolvidos na resposta ao estresse, incluindo o Stxla (sintaxina la), Sgkl (soro/glicocorticoide quinase regulada) e ADRB2 (Figura 22). EXEMPLO 4C O miR-181 regula os receptores de glutamato MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Clonagem de 3'UTRs dentro do plasmídeo de expressão da luciferase Psicheck2
[000444] Sequências 3'UTR de Grml, Grik3, GrmS, Grik2 e Grm7 foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico do rato. Fragmentos 3'UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) ou vetor pJET1,2 (Fermentas) , de acordo com as orientações do fabricante, e na sequência subclonados dentro de um local NotI ou XhoI simples na extremidade 3' da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento. Frustração Social Crônica
[000445] Os ratos foram submetidos ao protocolo de frustração social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo, onde interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claras e perfuradas foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias. RESULTADOS
[000446] Níveis de miR-181d foram significativamente aumentados em ratos que sofreram de estresse crônico (Figura 23). Na tentativa de encontrar as interações entre o miR-181 e potenciais ARNm alvos, os inventores descobriram que o miR-181 pode potencialmente regular muitos tipos de receptores de glutamato Em geral, os receptores de glutamato podem ser divididos em dois grupos, os receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs), que formam a poro de canal fônico que é acionado quando o glutamato liga-se ao receptor, e os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs), que, indiretamente, ativam os canais de íons no plasma membrana através de uma cascata de sinalização que envolve as proteínas G.
[000447] Dos muitos subtipos específicos de receptores de glutamato, é costume referirse a subtipos principais de um produto químico que se liga a ele de forma mais seletiva do que o glutamato. A pesquisa, no entanto, está em curso, conforme os subtipos são identificados e as afinidades químicas são medidas. Vários compostos são rotineiramente utilizados em pesquisa de receptores de glutamato e associados com os subtipos de receptores: Tabela 6: Receptores de glutamato categorizados dentro dos subgrupos.
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[000448] Conforme ilustrado nas Figuras 24 e 25, de todas as metas previstas conservadas do miR-181, há 6 receptores de glutamato (Grml, Grik3, Grm5, Gria2, Grik2 e Grm7).
[000449] Foi demonstrado anteriormente que o miR-181a controla a expressão Gria2 de superfície em neurônios do hipocampo [Saba. R. et al., Molecular and Cellular Biology (2012) 32(3):619-32]. Arranjos luciferase estão sendo realizados a fim de verificar a interação miRNA-mRNA. Além disso, uma linha de ratos miR-181 KO condicional é cruzado com uma linha específica cre obtendo-se assim uma supressão de miR-181 em núcleos específicos do cérebro. EXEMPLO 5A MiR-182, um sintonizador preciso de atividade neuronal normal e de comportamento psicopatológico MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Clonagem de 3'UTRs dentro do plasmídeo de expressão da luciferase Psicheck2
[000450] A sequência 3'UTR de Htrla foi ampliada a partir do DNA genômico do rato.
[000451] Fragmentos 3'UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3' da luciferase no plasmídeo relator Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento. Ensaio de luciferase e tranfecções
[000452] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formato de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os seguintes plasmídeos. A plasmídeo Psicheck2- 3'UTR, superexpressão pre-mmu-miR-182 em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech). 24 horas seguintes à transfecção as células foram lisadas e a atividade do relator de luciferase foram arranjadas conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.
Frustração Social Crônica
[000453] Os ratos foram submetidos ao protocolo de frustração social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo e interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claros e perfurados foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias. Microdissecação dos núcleos das rafes e coletas de plasma
[000454] Amostras cerebrais foram tomadas de núcleos das rafes (RN) de ratos após a remoção do cérebro e a colocação do mesmo em matriz cerebral acrílica (Stoelting). Pedaços foram retirados utilizando as lâminas tipo navalha padrão (GEM) com base nos marcadores atômicos designados. Foram usadas seringas 14G embotadas para extrair a região do RN de pedaços de 3 mm removidos da matriz.
Purificação do microRNA e Análise de Expressão RT-PCR Quantitativa
[000455] mRNAs, incluindo os microRNAs, foram isolados dos neurônios classificados, perfurações cerebrais congeladas e plasma utilizando o minikit miRNeasy (Qigen), de acordo com as instruções do fabricante, e tratados utilizando o kit mRNA de transcrição Reversa miScript para gerar cDNA. Amostras de cDNA foram, então, analisadas utilizando o kit SYBR®Green PCR (Qiagen), de acordo com as orientações do fabricante no termociclador AB 7500 (Applied Biosystems). Iniciadores específicos para cada miR foram utilizados juntamente com o iniciador universal comercial, enquanto que o U6 snRNA foi usado como controle interno. Clonagem de miR182 sobre o vetor de expressão viral
[000456] O Pre-miR-135b foi amplificado pelo PCR a partir do DNA genômico do rato com os iniciadores, adicionando locais Agel de enzimas de restrição e, então, foi inSlc6a4ed para o vetor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Após a sequenciação do pGEM-T Easy e da digestão de ambos os vetores pGEM-T Easy e pEGFP (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA) com o Agel, a sequência prematura de miR-182, foi ligada ao vetor pEGFP para construir o plasmídeo de expressão pEGFP-miR-182. Posteriormente, o pEGFP-miR-182 foi cortado por BamHI e BsrGI em paralelo ao corte pCSC-E/Syn-eGFP plasmídeo com as mesmas enzimas, e a sequência de miR-182-eGFP foi ligada ao pCSC-E/Syn para construir o pcSC-eSNY-pre-miR-182-eGFP plasmídeo, que foi confirmado por análise com endonucleases de restrição e sequenciação de DNA.
Produção de vetores lentivirais
[000457] Lentivírus recombinantes foram produzidos pela transfecção transiente nas células HEK293T, conforme descrito anteriormente [Naldini L et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93:11382-8]. Em suma, os lentivírus infecciosos foram colhidos em 48 e 72 horas após a transfecção, filtrados através de filtros de acetato de celulose com poro de 0,45 um e concentrados por ultracentrifugação.
RESULTADOS
[000458] Até o momento o miR-182 foi relatado principalmente em estudos relacionados ao câncer, tais como células de adenocarcinoma de pulmão humano, glioma, câncer de mama, câncer de bexiga, melanoma e reparo de DNA. Além disso, o miR-182 foi tido como envolvido em processos de desenvolvimento, tais como desenvolvimento do ouvido interno e da retina, e no sistema imunológico na ativação dos linfócitos T e na doença de lúpus. No sistema nervoso, o mi-R182 foi implicado em órgãos sensoriais específicos dos gânglios da raiz dorsal do rato e como um modulador do relógio circadiano, enquanto uma correlação entre as variações genéticas de pre-miR-l82 foram encontradas em pacientes com depressão grave [Saus E et al., Hum Mol Genet. (2010) 19 (20) :4017-25] . Além disso, o miR-182 foi listado entre outros 12 miRs como regulados para baixo em ratos machos resilientes a comportamentos indefesos aprendidos do córtex pré-frontal. (2011) 1-11].
[000459] A Análise Bfoinformática de Htrla 3'UTR realizada como parte da análise de microarranjo 5HT miRs implicou em uma possível segmentação deste gene por miR-182. Portanto, os inventores realizaram os testes in vitro através de um arranjo de luciferase, o qual revelou uma forte repressão do Htla 3'UTR por miR-182 (Figura 8). Duas sequências de combinações de semente conservadas de miR-182 apareceram no Htrla do rato 3 'UTR.
[000460] Estudos de regulação indicaram uma forte tendência a diminuição da regulação do miR-182 em níveis de expressão do RN de ratos machos adultos expostos à frustração social crônica em comparação com os controles (Fig. 9), sugerindo o envolvimento do miR182 em resposta aos estímulos ambientais moleculares conhecidos como comportamentos doo tipo depressivos induzidos.
[000461] A geração de análise bioinformática adicional visando previsões para o miR-182 em dois bancos de dados revelou uma longa lista de potenciais alvos, incluindo genes relacionados à atividade neuronal, tanto em condições normais quanto em patológicas (Figura 10).
[000462] De forma a testar ainda mais o miR-182 in vitro para identificação de interações miR alvo específicas, e para revelar o miR-182 em função de regulação de comportamentos normais e patológicos in vivo, o plasmídeo e os sistemas lentivirais para manipulação do miR-182 foram desenvolvidos. A superexpressão de lentivírus específicos neuronais foi transformada (Figura 11A) e testada in vitro na linha de célula neuronal N2a. Estes resultados demonstram um aumento de miR-182 em níveis de células infectadas com a superexpressão de lentivírus do miR-182 em comparação com o controle (Figura 11B). Sequência de plasmídeo de silenciamento específica para miR-182 chamado miArrest (Genecopoeia, Rockville, MD, EUA, Figura 11C) foi comprada e subclonada para construções virais (Figura 11C). Estes sistemas são testados em culturas de células e pelo local da injeção específico para cérebros de ratos adultos.
[000463] Ratos nulos para miR182 são desenvolvidos a fim de investigar o papel dos miRs no desenvolvimento de retina. Recentemente, os inventores obtiveram pares reprodutores para esta linha, e sobre uma geração de uma colônia, miR-182 KO e seus companheiros de gaiolas WT estão sendo fenotipados comportamental e fisiologicamente.
EXEMPLO 5B
[000464] Regulação dos níveis de expressão miR182 por estresse agudo MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000465] Conforme descrito no Exemplo 5A acima RESULTADOS
[000466] O efeito do estresse agudo sobre o nível miR182 foi examinado. Tal como ilustrado na Figura 26, o estresse de imobilização aguda conduziu à diminuição dos níveis de expressão do miR182 em núcleo da rafe de ratos (RN), 24 horas após a indução do estresse (P <0,01). O miR182 demonstrou uma redução dos níveis de expressão no núcleo da rafe tanto após o estresse agudo quanto após o crônico, sugerindo que tem um papel na modulação das respostas moleculares ao estresse no núcleo de rafe, possivelmente afetando seu gene alvo HT1A modulando os níveis de 5-HT na sinapse. Arranjo de interação miR-alvo para os genes alvo miR182 previstos.
[000467] Usando um arranjo de luciferase, onze genes alvo de miR182 previstos escolhidos após bioinformática extensivas, foram examinados (Figura 27A). Os 3'UTRs dos genes-alvo foram testados in vitro para verificar se o miRl82 tem um efeito repressivo conforme medido pela atividade do gene repórter da luciferase conjugada. Dos onze genes testados três genes: Dscam (Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down), L1CAM (molécula de adesão celular L1) e Tsnax (proteína X associada à translina) demonstraram efeito repressivo por miR182 como no arranjo de luciferase (Figura 27A). Ao testar o 3'UTR do gene alvo de miR182 listado acima, uma sequência conservada de combinação de semente miR182 foi observada tanto no Tsnax, L1CAM quanto no Dscam, sugerindo que esta interação miR-alvo tem um papel funcional (dados não mostrados).
[000468] Em seguida, foi verificado o efeito repressivo direto do miRl82 nestes três genes. Portanto, os 3'UTRs foi mutado para remover a sequência de combinação de semente miR182 e comparou-se os
[000469] 3'UTRs regulares com os mutantes uma in vitro por arranjo de luciferase. O efeito repressivo do miR182 em L1CAM 3'UTR foi abolido quando sua sequência de combinação de semente foi mutada (Figura 27B), e da mesma forma o efeito do miR182 em Tsnax foi abolido no 3'UTR mutante (Figura 27C), indicando que o miR182 alvejava este gene diretamente. Uma verificação semelhante para Dscam e Htrla com mutação 3'UTR é executada.
[000470] Um modelo de ratos com falta de miR182 é utilizado para estudar a interação entre o miR182 e seus genes-alvo in vivo. Os inventores estão examinando o fenótipo comportamental de ratos miR182K0 em testes de comportamento social, aprendizagem e memória, e os comportamentos do tipo esquizofrenia.
EXEMPLO 6
[000471] Regulação dos níveis de miR135 no plasma e no cérebro de ratos adultos.
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000472] Clonagem de vetores virais de superexpressão do miR135 e do vetor viral miR135 KD
[000473] O plasmldeo miR135b KD pEZX-Hl-miR135KD-CMV- mCherry e o controle pEZX-Hl-controle KD-CMV-mCherry foram adquiridos a partir da GeneCopeia (EUA). O promotor H1 e a sequência de KD foram amplificados utilizando iniciadores de flanqueamento com NheI e ligados 1 ao pGEM-T Easy. Após o sequenciamento do pGEM-T Easy e da digestão de ambos pGEM-T Easy e p156-pRRL-CMV-GFP com o local NheI, H1-KD miR e o apelidado p156 foram ligados para gerar p156-pRRL- Hl-miR135bKD-CMV-GFP' e p156-pRRL-Hlcontrole KD-CMV-GFP.
Avaliações comportamentais
[000474] Todas as avaliações comportamentais foram realizadas durante a fase de escuridão após a habituação para a sala de teste por 2 horas anteriores a cada teste. Teste de transferência de luz/escuridão
[000475] O aparato de teste de transferência de luz/escuridão e as condições experimentais foram conforme descritas anteriormente. Resumidamente, o aparelho continha duas câmaras, uma escura coberta, na qual os ratos foram colocados no início do teste, e uma câmara bem iluminada, para a qual pôde-se transferir livremente durante o arranjo de 5 minutos. O tempo passado no compartimento de luz, a distância percorrida à luz, a latência para visitar a câmara de luz e o número de transições claro- escuro foram quantificados com um sistema de rastreamento de vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburgo, Alemanha). Teste de campo aberto
[000476] O teste de campo aberto foi realizado em uma caixa de 50x50x22 cm branca, iluminada em 120 lux, no qual os ratos foram colocados em um teste de 10 minutos. O tempo passado no centro, o número de visitas no centro, a latência para visitar o centro, o número de retrocessos e a distância total percorrida foi quantificada utilizando um sistema de monitoramento de vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburg, Alemanha). Teste de labirinto mais elevado
[000477] Este aparato de teste tinha uma forma maior e continha 2 paredes de barreira e 2 braços de aberturas muito pouco iluminados (6 lux). O número de entradas, a distância percorrida e o tempo passado nos braços de abertura foram automaticamente registrados com sistema de monitoramento de vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburg, Alemanha) durante o teste de 5 minutos.
RESULTADOS
[000478] Os efeitos da administração de antidepressivos sobre os níveis de miR135 foram testados em locais do cérebro conhecidos por serem enervados por neurônios serotonérgicos do RN e envolvidos na regulação do humor, da amígdala (AMY | amygdala) e do córtex pré-frontal (PFC | prefrontal cortex). No AMY, ambas as variantes do miR135 foram reguladas para cima por inibidores da recaptação de serotonina agudas (SSRI) e os inibidores da recaptação da noradrenalina (NRI), mas não pela administração crônica destes fármacos (P = 0,0001 para o SSRI, p = 0,003 para o NRI para miR135a, Figura 28A, p = 0,0001 para SSRI e p = 0,003 para NRI para miR-135b, Figura 28B). No PFC, os níveis miR135b foram regulados para cima por SSRI agudo e NRI (P = 0,0183 para SSRI e 0,0013 para NRI, Figura 28c), mas os níveis de miR135a não foram significativamente alterados (Figura 28D). Além disso, o SSRI crônico levou à diminuição dos níveis miR135a e miR135b no PFC (P = 0,0241 para o miR135a na Figura 28C e P = 0,0067 para o miR135b na Figura 28D).
[000479] Adicionalmente, os níveis de miR135 na circulação foram testados a seguir no paradigma de frustração social. No miR135a (P = 0,0089; Figura 29A) e no miR135b (P = 0,0033, Figura 29B), os níveis foram aumentados no plasma dos ratos expostos à frustração social, crônica, em comparação com ratos de controle, medidos no PCR em tempo real. Assim, os resultados apresentados demonstraram que o miR135 no plasma foi regulado para cima seguinte ao estresse crônico, conhecido por induzir comportamentos do tipo depressivo em ratos, e robustamente diminuiu a administração de antidepressivos. Estas descobertas sugerem os níveis de miR135 no plasma como um biomarcador para estados depressivos relacionados com serotonérgicos.
EXEMPLO 7
[000480] Estabelecimento de um sistema de silenciamento do miR135; clonagem, geração de lentivirus e validações in vitro e in vivo MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000481] Clonagem de vetor viral miR135 KD
[000482] O plasmídeo miR135b KD pEZX-Hl-miR135KD-CMV- mCherry e o controle pEZX-Hl-controle KD-CMV-mCherry foram adquiridos a partir da GeneCopeia (EUA). O promotor H1 e a sequência de KD foram amplificados utilizando iniciadores de flanqueamento com NheI e ligados ao pGEM-T Easy. Após o sequenciamento do pGEM-T Easy e da digestão de ambos pGEM-T Easy e p156-pRRL-CMV-GFP com o local NheI, Hl-KD miR e o apelidado p156 foram ligados para gerar p156-pRRL- Hl-miR135bKD-CMV-GFP e p156-pRRL-H1controle KD-CMV-GFP.
RESULTADOS
[000483] Para avaliar o efeito dos níveis de miR135 diminuídos em RN de ratos de 5-HT relacionados com comportamentos, um inibidor miR135b baseado em plasmídeo foi utilizado e a sua eficiência foi testada num ensaio de luciferase. Neste arranjo, as células HEK293T foram cosseccionadas com plasmídeos miR135OE, miR135KD e 3'UTR, e a capacidade do plasmídeo miR135bKD bloquear o efeito repressor do miRl35 em SLC6A4 e Htrla 3 'UTR foi testado. O efeito repressor do miR135b do Htrla 3'UTR foi bloqueado elo plasmídeo miR135KD (Figura 30A). Similarmente, o efeito do miR135b no Slac6a4 3'UTR foi bloqueado pelo miR135KD (Figura 30B). Estes resultados indicam que o plasmídeo miR135KD de fato bloqueia a atividade biológica do miRl35.
[000484] A sequência miR135KD e uma sequência de controle que foram subclonadas para um vetor viral (Figura 30C) e lentivirus expressando o diferente da sequência de silenciamento (KD) foram gerados. A fim de testar a capacidade dos lentivírus para infectar o tecido cerebral, o RN dos ratos foi infectado com qualquer um dos lentivirus. De fato, a infecção causou a expressão do GFP (Figuras 30D-E) demonstrando a capacidade dos lentivírus miR135bKD de infectar o tecido cerebral.
EXEMPLO 8
[000485] Efeitos comportamentais do silenciamento do miR135 no RN de ratos adultos.
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000486] Avaliações comportamentais
[000487] Os ratos foram caracterizados comportamentalmente utilizando os testes para a ansiedade e comportamentos do tipo depressivo semelhantes aos descritos no Exemplo 6 acima.
RESULTADOS
[000488] Após a validação in vitro e in vivo dos lentivírus miR135KD, eles foram utilizados para manipular os níveis de miR135 no RN e para testar os seus efeitos sobre o comportamento dos ratos. Os ratos adultos foram injetados ou com lentivírus miR135KD ou com lentivírus KD de controle para o RN e depois do período de recuperação foram testados para a ansiedade e comportamentos do tipo depressivo. Uma vez que o miR135 reprime os reguladores negativos de 5-HT, espera-se que o miR135KD leve à diminuição dos níveis de 5-HT na sinapse e, portanto a um aumento dos comportamentos do tipo ansiedade e depressão.
[000489] No teste de campo aberto não foram observadas diferenças entre os grupos (Figura 31-A), no entanto, no teste de labirinto para pulso elevado, os ratos miR135KD demonstraram um comportamento tipo de ansiedade mais alto, demonstrando uma tendência a passar menos tempo nos braços de abertura (P = 0,0644) e visitar menos vezes os braços de abertura (P = 0,0572
[000490] Figura 31B). Além disso, os ratos miR135KD caminharam significativamente por uma distância menor nos braços de abertura (P = 0,0433) e tiveram maior tendência a visitar os braços de abertura (P = 0,0124 Figura 31B). Da mesma forma, no teste de luz negra realizado sob condições de estresse basais, os ratos miR135KD demonstraram um aumento significativo no comportamento do tipo ansiedade em comparação com os controles por gastarem menos tempo à luz (P = 0,0454 Figura 31C), visitando menos vezes a câmara de luz (P = 0,0107 Figura 31D) e andando uma distância menor na câmara de luz (P = 0.0402s Figura 31E). Os resultados ilustraram uma diminuição nos níveis miR135 de 40 min. e 24 horas após o estresse agudo (Figura 30A-B), portanto, a presente teoria era que os ratos R135KD estressados não diferem de seus controles em comportamentos do tipo ansiedade, como quando testados após estresse agudo, uma vez que os ratos de controle também teriam níveis miR135 diminuídos devido ao estresse. De fato, não havia nenhuma diferença entre os grupos quando retestados no teste de transferência de luz negra em qualquer um dos parâmetros, tanto quando testada 40 minutos como 24 horas após o estresse agudo (Figura 31C-E).
[000491] Comportamentos do tipo depressivo de miR135KD foram testados tanto em condições basais como após a manipulação farmacológica. Uma vez que os níveis de miR135 mostraram um aumento no RN após a administração de SSRI (Figura 31E), especulou-se que a redução de níveis de miR135 pode levar a uma resposta reduzida ao SSRI. No teste de suspensão pela cauda realizado tanto em níveis basais como após a administração de SSRI, não houve diferença entre os ratos KD miR135b e os ratos KD de controle quanto ao tempo de imobilidade (Figura 31F), e a diminuição esperada no tempo de imobilidade devido a um tratamento por SSRI foi observada (P <0,0008). No entanto, no teste de nado forçado, adicionalmente ao efeito principal para o SSRI injetável (P <0,0001), os ratos miR135KD injetados com SSRI ficaram mais imóveis nos últimos 2 minutos de teste, em comparação com ratos KD de controle (P = 0,0141 5 minutos, P = 0,0404 6 minutos; Figura 31G sugerindo uma atenuação dos efeitos antidepressivos SSRI, reduzindo os níveis miR135 no RN. Este resultado implica que o miR135 é parte da alternância endógena levando a mudanças comportamentais provocadas pelo SSRI.
EXEMPLO 9
[000492] Superexpressão miR135 nos neurônios 5-HT MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
[000493] Os ratos com superexpressão do miR135a em neurônios 5-HT foram comparados com controles da mesma ninhada, tanto nos níveis de expressão de miR135 como em seus genes alvo e comportamentalmente.
RESULTADOS
[000494] Os efeitos da manipulação dos níveis de miR135 especificamente em neurônios 5-HT no RN de ratos foram testados para comportamentos do tipo ansiedade e depressão. Para esse efeito, um sistema genético foi desenvolvido utilizando o sistema Cre-loxP. Especificamente, a especificidade do 5-HT foi obtida utilizando os ratos ePet Cre que expressa a recombinase Cre especificamente nos neurônios RN positivos de 5-HT e superexpressão miR135 foi realizada através do cruzamento da linha de Cre específica do 5-HT (ePet Cre) com a linha de rato transgênico com superexpressão condicional para o miR135a (Figura 32).
[000495] O nível de expressão miRl35 no RN de ratos que sobrexpressam o miR135 especificamente em neurônios 5-HT (miR135OE) foi testado para o PCR em tempo real para o miR135 e comparado com ratos de controle, positivo para o alelo superexpressão condicional do miR135, mas negativo para ePet CRE. Os ratos miR1350E demonstraram cerca de 2 vezes de superexpressão em comparação com ratos de controle (Figura 33A, P <0,05). Os níveis de superexpressão do miR135 foram semelhantes aos níveis medidos no RN de ratos após a administração do SSRI, sugerindo que esta linha de ratos era um bom modelo para o estudo das características antidepressivas do miR135. Além disso, o miR135 do gene alvo ARNm, Slc6a4 (Figura 33B, P <0,05) e Htrla (Figura 33C, P <0,1) foram sub- regulados no RN de ratos miR135OE comparado com o controle demonstrando a repressão in vivo pelo miR135 dos seus genes-alvo.
[000496] A fim de testar a sobrexpressão do miR135 especificamente em neurônios 5-HT, os ratos miR135OE e seus controles da mesma ninhada foram expostos ao paradigma de frustração social crônica, um processo conhecido por induzir os comportamentos do tipo depressão e ansiedade e, posteriormente, foram testados para a comportamentos do tipo ansiedade e depressão.
[000497] Os ratos miR135OE demonstraram um aumento no comportamento do tipo ansiedade após a frustração social em relação aos companheiros da gaiola de controle. Em campo aberto, uma tendência para o aumento da ansiedade foi observada em ratos miR135OE em relação ao tempo e ao número de visitas ao centro (P <0,1, Figura 34A) . Durante o teste de transferência de luz negra os ratos miR 1350E passaram mais tempo na luz (P <0,05, Figura 34B) e menos tempo na câmara de luz (P <0,01, Figura 34B). Resultados semelhantes foram observados no labirinto de pulso elevado (P <0,05, Figura 34B), enquanto os ratos miR135OE passaram mais tempo nos braços de abertura (P <0,05, Figura 34C) e percorreram maior distância nos braços de abertura (P <0,05, Figura 34C).
[000498] Comportamentos do tipo depressão de ratos miR135OE após frustração social foram mais baixos do que os companheiros de controle. Uma tendência para a diminuição do tempo de imobilidade dos ratos miR135OE em comparação com os controles foi observado no teste de suspensão pela cauda (P <0.1, Figura 34D), juntamente com uma significativa diminuição do tempo de imobilidade no teste de nado forçado (P <0,05, Figura 34E).
[000499] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto com as formas de realização específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os especialistas na técnica. Por conseguinte, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.
[000500] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporados em sua totalidade por especificação, na mesma medida como se cada aplicação de publicação, patente ou patentes individuais foi específica e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência a este pedido não deverá ser interpretada como uma admissão de que essa referência está disponível como técnica anterior do presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os cabeçalhos das seções são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes. Legendas das Figuras Figura 16 CORT Neurônio pós-sináptico Neurônio GABAérgivo Inibição de liberação de GABA por CB que desinibe a liberação NE 1 Neurônio noradrenérgico Liberação NE melhorada-consolidação de memória aprimorada Incorporado de Hill M.N. e McEwen B.S. Proc. Of the Nat. Acad. Of Sci. Of the USA (2009) 106:4579-4580. Figura 17B Incorporado de Meister G. et al., Molecular Cell (2004) 15:185-197. Figura 18A, 18B e 18C Suscetível Habituação Rato Familiar Figura 24 Alvos 181 Glutamato-R

Claims (6)

1. miR-135, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma condição médica em que uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfico, sendo o referido miR-135 definido pela SEQ ID NO: 58-62, e em que o referido miR- 135 compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma estrutura modificada e uma ligação internucleosídica modificada.
2. miR-135 de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ser formulado em uma composição farmacêutica.
3. miR-135 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida estrutura modificada compreende uma modificação selecionada do grupo que consiste em um fosforotioato, um fosforotioato quiral, um fosforoditioato, um fosfotriéster, um aminoalquil fosfotriéster, um metil fosfonato, um alquil fosfonato , um fosfonato quiral, um fosfinato, um fosforamidato, um aminoalquilfosforamidato, um tionofosforamidato, um tionoalquilfosfonato, um tionoalquilfosfotriéster, um boranofosfato, um fosfodiéster, um ácido nucleico peptídico (PNA) e um 2’-O-metoxietil.
4. miR-135 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido miR-135 compreende uma modificação tanto em um açúcar quanto em uma ligação internucleosídica.
5. miR-135 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida condição médica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma depressão, uma ansiedade, um estresse, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, um vício, uma fobia social, um distúrbio do sono, um distúrbio relacionado à comida, um distúrbio do crescimento e um distúrbio da reprodução.
6. miR-135 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida condição médica é um distúrbio do humor.
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