BR112013029588A2 - "modificações estáveis de cristal de cloreto de dotap" - Google Patents

Abstract

MODIFICAÇÕES ESTÁVEIS DE CRISTAL DE CLORETO DE DOTAP. A presente invenção refere-se a modificações de cristal de cloreto de DOTAP racêmico (2R,S) e enanciomericamente puros (2R)- ou (2S), a processos para sua preparação e ao seu uso para a preparação de compo- sições farmacêuticas.

Description

- Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODIFICA- ÇÕES ESTÁVEIS DE CRISTAL DE CLORETO DE DOTAP". A presente invenção refere-se à modificações de cristal de clore- to de DOTAP racêmico e enanciomericamente puro, à processos para a sua preparação, easeu uso para a preparação de composições farmacêuticas. As formas cristalinas de cloreto de DOTAP e composições far- ' macêuticas correspondentes têm os mesmos usos bem conhecidos das for- ' mas não cristalinas de cloreto de DOTAP. | Cloreto de DOTAP acima e abaixo denota formas racêmicas ou formas isomericamente puras de cloreto de (2R,S)-N,N N-trimetil-2,3- bis[[(92)-1-0x0-9-octadecenil]óxi)-1I-propanamínio, de cloreto de (2R)- NN,N- 7 trimetil-2,3-bis[[(92)-1-0x0-9-0ctadecenilJóxi)-1-propanamínio,e cloreto de ” o” (2S)-N,N N-trimetil-2,3-bis[[(9Z)-1-0x0-9-octadecenil]óxi]-1-propanamínio, também conhecido como cloreto de (Z,Z)-N,N N-trimetil-2,3-bis[(1-0x0-9-

15. octadecenil)óxil-I-propanamiínio ou cloreto de 1,2-dioleoilóxi-3-trimetilamônio propano, e seus hidratos. sn An

N ? ! re A cP º CazHgoCINO,, Pu 698,54 Números CAS: 132172-61-3 e 477274-39-8 (racemato), 197974-73-58 (racemato, mono-hidrato) | 428506-51-8 (forma 28), 328250-28-8 (forma 2R) DOTAP pode, entre outras coisas, formar lipossomas e outros agregados lipídicos vesiculares. Lipossomas são vesículas sintéticas com multicamadas (membranas esfericamente autocontidas) compreendendo substâncias ambifílicas, normalmente lipídios naturais, nos quais tanto as substâncias hidrofílicas podem ser encapsuladas no interior aquoso, como também as substâncias lipofílicas podem ser incorporadas no interior da membrana de lipídio.

Elas são empregadas em particular em cosméticos e na medici-

2/30 | - na, especialmente em dermatologia.

Aqui estão incluídos, em particular, vi- taminas, coenzimas, agentes de cuidados com a pele e filtros solares.

Lipos- ' ' somas geralmente são adicionados topicamente.

Adicionalmente lipossomas estão alcançando cada vez mais uma maior importância na tecnologia farmacêutica, visto que a aplicação parenteral de lipossomas viabiliza atingir uma distribuição mais específica em um órgão do que no caso de compostos ativos empregados na forma livremente dissolvida.

Se DNA, RNA ou proteinas são incorporados aos lipossomas e | outros agregados lipídicos vesiculares, são obtidos lipoplexos.

A adição de óleos e o emprego de homogeneizadores de alta | pressão permite que se force a formação de assim chamadas nanopartículas " ” (nanopartes) a partir de lipossomas.

Essas são partículas de aproximada- mente o mesmo tamanho que os lipossomas, que não têm uma fase aquosa mas, ao invés disso, uma fase oleosa em seu interior.

Elas são particular mente adequadas para a encapsulação de substâncias lipofílicas.

Microemulsões são sistemas coloidalmente dispersos, monofá- sicos, compreendendo componentes aquosos, semelhantes a lipídio e ten- soativos.

Elas têm um tamanho de partícula de 1-500 nm e se comportam de maneirasemelhante a liquidos.

Especialmente em conexão com compostos peptídicos ativos, nucleotídeos, vacinas e outros produtos biofarmacêuticos, os quais normal- mente apresentam solubilidade baixa, o efeito de solubilização tem impor- | ” tância muito elevada no caso das aplicações descritas acima. ' Além disso, a degradação dos compostos ativos no corpo pode ser freada e um efeito de desprendimento sustentado pode ser atingido des- ' sa maneira.

Cloreto de DOTAP pertence à classe de lipídios catiônicos.

Em | contraste com fosfolipídios que ocorrem naturalmente, esses não apresen- ' tam um caráter anfótero.

Lipossomas compreendendo lipídios catiônicos, | individualmente ou combinados com fosfolipídios ou outros compostos se- melhantes a lipídio, têm uma superfície positivamente carregada.

Isso dá '

l 3/30 - surgimento a alta afinidade com células que apresentam uma superfície ne- gativamente carregada no lado externo, por exemplo células endoteliais. ' É particularmente importante, entretanto, a capacidade de lipos- somas baseados em DOTAP e outros lipossomas e lipoplexos catiônicos de penetrar em células e dessa forma transportar os compostos ativos incorpo- rados neles até o interior da célula (transfecção). Todas essas propriedades tornam cloreto de DOTAP muito inte- | ressante para a terapia de câncer também.

Essas propriedades geram a possibilidade de aplicar agentes citostáticos convencionais incorporados em lipossomas DOTAP catiônicos.

As propriedades de transfecção de cloreto de DOTAP e outros º sais de DOTAP, tais como, por exemplo, acetato, brometo, di-hidroge- . nofosfato, hidrogenossulfato, iodeto, mesilato, metilsulfato, trifluoracetato, sulfato ou dissulfato e triflato, são adequadamente conhecidas na literatura.

Em alguns estudos in-vitro, outros sais, tais como, por exemplo, metilsulfato de DOTAP, têm alcançado melhores taxas de transfecção do que cloreto de DOTAP.

Quando empregado in vivo, entretanto, ocorre uma troca aniôni- ca na superfície do lipossoma no corpo vivo, o que significa que as vanta- gens de outros sais não surgem aqui.

Especialmente no uso médico em hu- manos, em particular para aplicação parenteral, sais de DOTAP com ânions fisiologicamente aceitáveis, tais como, por exemplo, o cloreto ou o acetato correspondente, são portanto preferidos. | Aplicações médicas, em particular aplicações parenterais, im- põem as mais elevadas exigências de qualidade e pureza dos compostos ativos e adjuvantes empregados.

Existem, portanto regulações muito estritas | por parte das autoridades com respeito à preparação, reprodutibilidade de preparação e perfil de subprodutos desses compostos.

No caso de substân- cias usadas parenteralmente, a contaminação microbiológica por microorga- —nismos patogênicos e endotoxinas precisa, adicionalmente, ser estritamente evitada e controlada.

Formas amorfas de cloreto de DOTAP e outros sais de DOTAP |

4/30 | . . | - atualmente existentes são extremamente instáveis e são, portanto difíceis por se para preparar com uma pureza aceitável de modo que elas sejam : apropriadas para uso na preparação de uma formulação medicamentosa.

Como todos os lipídios que carregam radicais de ácido oleico, tais como, por exemplo, os fosfolipídios naturais DOPC e DOPE, todos os sais de DOTAP são muito sensíveis a oxidação e os produtos de oxidação de derivados de ácidos graxos insaturados geralmente apresentam elevada toxidez. | Métodos apropriados de preparação, purificação e estabilização | 10 são requeridos aqui.

Acetato de DOTAP, por exemplo, está na forma de um | óleo de elevado ponto de ebulição, e portanto pode ser obtido industrialmen- s te apenas com grande dificuldade com qualidade adequada. | ' Métodos convencionais para suplantar a instabilidade, tais como, | por exemplo, a adição de antioxidantes na forma de ácido ascórbico ou L- glutationa reduzida, restringem fortemente a empregabilidade geral de clore- | to de DOTAP, visto que as interações com os compostos ativos a serem embutidos mais tarde não podem ser excluídas.

A completa exclusão de o- | xigênio durante a preparação, armazenamento e uso é virtualmente impos- sível ou pode ser viabilizada apenas com um esforço muito elevado.

Cloreto de DOTAP é comercialmente disponivel como uma solu- ção de clorofórmio ou como um sólido amorfo.

Em complemento à sua sensibilidade a oxidação, cloreto de DOTAP amorfo é também extremamente higroscópico e deliquesce, dentro de um período de tempo muito curto, a níveis normais de umidade atmosfé- rica, para formar um filme gorduroso.

Isto torna o manuseio desse composto muito mais difícil, Tecnicamente qualquer manuseio de formas amorfas de cloreto de DOTAP correntemente disponíveis é, portanto apenas possível sob me- didas vigorosas de proteção.

Portanto, o fabricante de cloreto de DOTAP amorfo geralmente recomenda o armazenamento sob gás de proteção a - 20ºC e garante apenas um tempo de prateleira de aproximadamente 6 me- ses.

- Eibel e Unger, DE4013632A1, esboçam a síntese de cloreto de (2R,S)- DOTAP a partir de brometo de DOTAP por troca iônica no sistema ' de solvente clorofórmio/metanol/HCI aquoso seguido de purificação por meio de cromatografia. Brometo de DOTAP é obtido antecipadamente in situ a partirde 1i-bromo-2,3-dioleoiloxipropano.

Leventis e Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, reportam a síntese de cloreto de (2R,S)- DOTAP a partir de iodeto de DO- TAP por troca iônica no sistema bifásico de solvente/solução de NaCl. lodeto de DOTAP é obtido antecipadamente por metilação do composto correspon- l 10 dente de dimetilamino por meio de iodeto de metila. Nantz et al., Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Í Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078, descreve a síntese de cloreto de (2R,S)- . DOTAP por cromatografia de troca iônica não-aquosa. O composto desejado . é obtido por evaporação do eluato. Feigner et al., US 5.264.618, executam a metilação do composto | correspondente de dimetilamino diretamente para cloreto de (2R,S)- DOTAP por meio de cloreto de metila. Eles aparentemente obtêm uma cera amarela por cristalização a partir de acetonitrila a -20ºC. Entretanto, cloreto de (2R,S)- DOTAP é virtualmente insolúvel em acetonitrila à temperatura ambi- ente Tentativas de reproduzir essa assim chamada cristalização resultaram apenas em material amorfo através de solidificação da substância oleosa obtida da solução quente após resfriamento. O fato de que essa não é uma cristalização é também evidente devido ao fato de que os autores aparente- mente não atingiram um efeito de purificação e tiveram que purificar a subs- tância por cromatografia. Ver também os exemplos comparativos que de- monstram que Feigner et al. não alcançam cloreto de (2R,S)- DOTAP crista- lino.

Em particular se os compostos são pretendidos para uso paren- teral, uma preparação que inclui tratamento com resina de troca iônica é ex- tremamente problemática tendo em vista a possível contaminação microbio- lógica, visto que as resinas correspondentes são um meio nutriente ideal para bactérias e mesmo após elas terem sido mortas, ainda resta um risco o MM 6/30 | “ « - de contaminação por endotoxinas.

| A WO 2006/056312 A1 descreve cloreto de DOTAP enanciome- | ' ricamente puro. Um processo detalhado para cristalização não é divulgado.

O objeto da presente invenção é, portanto proporcionar sais cris- talinos de cloreto de DOTAP e hidratos com elevada pureza e com estabili- dade química e física adequada. Um outro objeto da presente invenção é o de proporcionar esses sais cristalinos com tempos de prateleira longos, via- bilizando que eles sejam empregados na preparação de formulações farma- cêuticas. Continua elevada a demanda por um processo reprodutível para a | 10 preparação de formas estáveis de sais de cloreto de DOTAP e hidratos que possa ser executado em escala industrial. : Cloreto de DOTAP enanciomericamente puro pode ser obtido a . partir de materiais de partida enanciomericamente puros de forma análoga aos processos descritos para o racemato, isto é via (R)- ou (S)-1-cloro-2,3-dioleoiloxipropano, via (R)- ou (S)-1-LG-2,3-dioleoiloxipropano e troca iônica (LG = grupo de partida) ou via (R)- ou (S)-1-dimetilamino-2,3-dioleoiloxipropano. Ver WO 2006/056 312.

Um outro método de preparação que pode ser mencionado é a resolução de racemato de cloreto de DOTAP racêmico.

Por meio de experimentos, descobriu-se agora, surpreendente- mente, que tanto cloreto de DOTAP racêmico quanto também enanciomeri- camente puro, cristalino pode ser obtido em uma maneira simples com ele- vada pureza quimica, excelente estabilidade e propriedades de manuseio apropriadas para manusear esses compostos em uma escala industrial mais elevada. Os produtos cristalinos obtidos dessa maneira apresentam estabili- dade virtualmente ilimitada à temperatura ambiente sob gás de proteção. Eles são portanto adequados como constituintes ou como materiais de parti- da para a preparação de formas medicamentosas.

A presente invenção concordantemente diz respeito a modifica- ções estáveis de cristal de cloreto de DOTAP racêmico e enanciomerica- mente puro.

- As modificações estáveis de cristal podem ser em forma cristali- na e parcialmente cristalina. Elas apresentam uma pureza até agora nunca " antes atingida de pelo menos aproximadamente 95%, de preferência de > 98%. Além disso, verificou-se que cloreto de (2R,S)-DOTAP apresenta uma estabilidade até agora nunca antes atingida superior a 99% em peso e área- % determinada por HPLC em relação ao valor de partida quando armazena- do a 25ºC por 36 meses ou a 40ºC por 12 meses (ver com esse respeito a | tabela 1 e tabela 1a). Uma pessoa versada na técnica pode facilmente criar um méto- do apropriado de HPLC a fim de determinar a pureza e teor de cloreto de DOTAP. Por exemplo, um Agilent 1200 HPLC com uma coluna Inertsil ODS- ' 3 (150x3 mm, 3 pm) (Gl Sciences) pode ser usado como equipamento. Elu- ' entes típicos são solução de pentanossulfonato de sódio em solução aquosa 10 mM de H3PO, (0,085%) (eluente A) e 3,85 mM de pentanossulfonato de sódioem acetonitrila 94% contendo H3PO, (0,085%) aquoso (eluente B). Um gradiente apropriado é o seguinte (tempo de corrida 25 minutos, tempo pos- terior 5 minutos; vazão: 1,5 ml/min; 22000 kPa (220 bar); 50ºC, volume de injeção 10u!): Lo remo ———Jevenes — [enenen — |

E E A E 100% [| jzomn Po deseo do le | 25% As modificações de cristal de cloreto de DOTAP apresentam um teor menor do que | equivalente de água ou solvente de cristalização por equivalente de cloreto de DOTAP. (2R)-, (28)- e (2R,S)-DOTAP cristalinos apresentam proprieda- des de manuseio excelentes e altamente desejáveis, tais como uma higros- copicidade admiravelmente reduzida e capacidade de escoamento livre mui-

- to boa. (2R)-, (28)- e (2R,S)-DOTAP cristalinos têm um ponto de fusão | ' acima de 180ºC, particularmente entre 183 e 185ºC, e uma entalpia de fusão de pelo menos -130 J/g, preferentemente acima de -140J/g, particularmente entre-143e-159J/g(ver com esse respeito a tabela 3). | As modificações de cristal de (2R,S)-cloreto de DOTAP racêmi- cas exibem bandas moderadamente agudas em medições de difração de raios X em pó (ver a esse respeito a fig. 1 e a tabela 2). Valores 2 Teta para a modificação de cristal são aproximada- | mente6,5,12,6,13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 e 29,8, sendo que valores de 2 teta selecionados são aproximadamente 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 e 25,2. For- ' mas cristalinas de cloreto de (2R,S)-DOTAP correspondentes ao padrão de . difração de raios X em pó mostrados na fig.1 se situam dentro do âmbito da invenção.

Cloretos de (2S)-DOTAP enanciomericamente puros são obtidos semelhantemente em forma cristalina.

Valores 2-teta para a modificação de cristal são aproximadamente 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 e 25,3, sendo que valores selecionados de 2 teta são aproximadamente 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, e 21,6 (ver fig. 2 e tabela 2). Formas cristalinas de cloreto de (28)- DOTAP correspondentes ao padrão de difração de raios X em pó mos- trado na Fig, 2 se situam dentro do âmbito da invenção.

Cloretos de (2R)-DOTAP enanciomericamente puros são obtidos semelhantemente em forma cristalina.

Valores 2-teta para a modificação de cristal são aproximadamente 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 e 25,3, sendo que valores selecionados de 2 teta são aproximadamente 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, e 21,6 (ver fig. 3 e tabela 2). Formas cristalinas de cloreto de (2R)-DOTAP correspondentes ao padrão de difração de raios X em pó mos- trado na Fig. 3 se situam dentro do âmbito da invenção.

A invenção ainda diz respeito a um processo para a preparação de modificações de cristal de cloreto de (2R)-, (2S)- e (2R,S)- DOTAP que é caracterizado pelo fato de que cloreto de (2R)- , (2S)-, (2R,S)-DOTAP é cris- talizado a partir de um meio aprótico.

O meio aprótico empregado com esse

| 9/30 : | ; ' . fim pode ser um solvente aprótico, ou uma mistura de solventes apróticos, | ou uma mistura de um ou mais solventes apróticos com um solvente prótico 7 ou uma mistura de solventes próticos. Solventes apróticos apropriados são solventes apróticos, con- | 5 tendo oxigênio, em particular, éteres, tais como, por exemplo, tetra-hidrofurano, metiltetra- hidrofurano, dioxano, dietil éter, dipropil éter, di-isopropil éter e metil terc-butil éter, : cetonas, tais como, por exemplo, acetona e 2-butanona, metil i- | 10 —sobutil cetona, metil isopropil cetona, e | ésteres, tais como, por exemplo, formiato de etila, acetato de " metila, acetato de etila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetato de ' butila, acetato de isobutila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila e 1,3- ' di- oxolidin-2-ona. Solventes apróticos preferidos são cetonas. | Solventes próticos apropriados são, em particular, álcoois, tais como, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, i- sopropa- nol, n-butanol, isobutanol, 2-butanol, terc-butanol, 3-metil-1-butanol e etileno glicol, metoxietanol, etoxietano|.

Se o meio aprótico é uma mistura de um ou mais solventes apró- ticos com um solvente prótico então o solvente aprótico pode ser um solven- te aprótico, contendo oxigênio conforme definido acima ou uma nitrila, tal como, por exemplo, acetonitrila.

Os solventes podem em cada caso ser empregados na forma puraouna forma de uma mistura, isto é, é possível tanto empregar os vários solventes apróticos em um grupo na forma de uma mistura como também empregar tipos de solventes apróticos na forma de uma mistura um com o outro.

Se o meio aprótico é uma mistura de um ou mais solventes apró- ticoscom um solvente prótico então os solventes próticos podem estar pre- sentes de mais do que 0% até 40% em peso, preferentemente de 10% até 20% em peso, dependendo das condições aplicadas, a pureza das matérias-

- primas e o alvo do processo (rendimento, pureza do produto, grau de crista- linidade). Preferentemente, um meio aprótico contendo quantidades muito ' baixas de água deveria ser empregado. Em um modo de realização especi- almente preferido, água é excluída.

Em um modo de realização preferido da invenção, acetona ou 2- propanol são usados como meio aprótico. Em um modo de realização muito especialmente preferido, uma mistura de acetona e 2-propanol é emprega- da. Tipicamente, uma mistura de 2-propanol e acetona compreende 0-25 % de 2-propanol.

A cristalização dos cloretos de DOTAPs pode ser efetuada aqui diretamente a partir da solução de reação sem purificação prévia. Semelhan- ' temente, cloreto de DOTAP cristalino pode ser obtido por recristalização de : material amorfo, parcialmente cristalino ou cristalino.

Em um modo de realização preferido, os cloretos de DOTAP empregados para preparar formas cristalinas deles são de elevada pureza quimica e ótica, preferentemente a uma pureza de aproximadamente > 95% ou mais, mais preferentemente aproximadamente 98% ou mais, ainda mais preferentemente aproximadamente 99% ou mais. A este respeito, a prepara- - “ção de cloretos de DOTAP cristalinos aqui emprega ácido oleico muito puro como um reagente, o que leva a cloretos de DOTAP de elevada pureza que cristalizam mais facilmente do que cloretos de DOTAP disponiveis previa- mente com pureza inferior. Impurezas principais típicas em cloretos de DO- TAP correntemente disponíveis incluem, mas não estão limitadas a outros lipídios ou seus derivados. A pureza PhEUR efetiva (sendo portanto "quali- dade farma"”) de ácido oleico é hoje em dia ainda apenas aproximadamente 65-88%. Por ácido oleico muito puro aqui é entendido um que apresenta qualidade ultra-pura de aproximadamente 95% ou mais, preferentemente aproximadamente 99% ou mais. Um ácido oleico muito puro apropriado po- de, por exemplo ser comercialmente obtido de RCA (lote OA 11.G.01.2007) ouAcme Synthetic Chemicals (lote 060528). A pureza enanciomérica pode, por exemplo ser determinada por determinação da rotação ótica.

| | - Em um modo de realização preferido, os cloretos de DOTAP empregados para preparar formas cristalinas deles são cristalizados ou re- ' cristalizados a partir de misturas com solventes apropriados dentro de faixas de concentração de 1 parte de cloreto de DOTAP para 4 partes de solvente até1partede cloreto de DOTAP para 100 partes de solvente, mais preferen- temente dentro de faixas de concentração de 1 parte de cloreto de DOTAP para 4 partes de solvente até 1 parte de cloreto de DOTAP para 10 partes de solvente.

A cristalização das modificações de cloreto de DOTAP é geral- mente alcançada especificamente por resfriamento lento da solução prepa- rada até temperaturas abaixo de 30ºC, por exemplo por resfriamento a uma S taxa de 0,001ºC a 0,1ºC por minuto, por exemplo 0,05ºC por minuto ou . 0,004ºC por minuto, levando a tempos de resfriamento de aproximadamente 5 a 200 horas, por exemplo aproximadamente 10 horas a 50 horas.

Opções específicas são aquecer a solução a 35ºC e em seguida resfriar lentamente a -12ºC ao longo de um período de 12 horas, ou aquecer a solução a tempe- raturas mais baixas, por exemplo 25ºC, ou começar da temperatura ambien- te sem aquecimento, e em seguida resfriar lentamente, por exemplo por 10 a 50 horas, até preferentemente -12ºC.

A formação dos cristais é executada ou espontaneamente ou por inoculação com a modificação correspondente de cristal de cloreto de DOTAP.

O resfriamento lento pode ser efetuado por qualquer método co- nhecido por um versada na técnica.

Tipicamente, é empregado um criostato.

Conforme mencionado anteriormente, todos os sais de DOTAP sãomuito sensíveis a oxidação, e como tal, a exclusão de oxigênio durante os métodos de preparação divulgados aqui é preferida, por exemplo pelo emprego de uma atmosfera inerte, por exemplo atmosfera de nitrogênio e/ou usando solventes com um baixo teor de oxigênio e peróxido.

O emprego de cloreto de DOTAP amorfo ou parcialmente crista- | 30 linocomo material de partida para a recristalização fornece, para o processo descrito, cloretos de DOTAP essencialmente cristalinos de pureza e estabili- dade até agora nunca alcançadas. ;

» A invenção também diz respeito ao uso de cloretos de (2R)-, (28)- , (2R,S)-DOTAP cristalinos para a preparação de formulações medi- " camentosas visto que os cloretos de (2R)- , (2S)-, (2R,S8)-DOTAP apresen- ' tam estabilidade excelente em forma sólida sob as condições estabelecidas etêm qualidade constante e muito boa por um tempo virtualmente ilimitado.

A invenção consequentemente ainda também diz respeito a composições farmacêuticas resultantes do uso das formas cristalinas de clo- reto de (2R)-, (28S)-, (2R,S)-DOTAP reivindicadas. Composições farmacêuti- cas desse tipo podem compreender as modificações de cristal de cloreto de (2R,S)- (2S)- e (2R)-DOTAP juntamente com outros compostos ativos far- macêuticos e adjuvantes conhecidos usualmente empregados em prepara- S ções medicamentosas, assim como um ou mais solventes. : Essas composições farmacêuticas podem, por exemplo, estar na forma de lipossomas, lipoplexos, microemulsões e nanopartículas e incluem, por exemplo, um composto ativo do grupo dos peptídeos, nucleotídeos, va- cinas ou agentes citostáticos.

A presente descrição permite ao versada na técnica aplicar a in- venção em uma maneira abrangente. Em adição, os exemplos seguintes servem para melhor compreensão e para ilustração de possíveis variantes dainvenção. Esses exemplos não deveriam ser de forma alguma considera- dos restritivos.

Todas as temperaturas mencionadas nos exemplos seguintes são indicadas em graus Celsius. A menos que explicitado de outra forma, dados de teores são dados em % em peso. '

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S) DO- TAP cristalino, A Fig. 2 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2S)- DO- TAP cristalino, A Fig. 3 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R)- DO- TAP cristalino, A Fig. 4 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S)- DO-

| 13/30 | : > TAP amorfo, ' A Fig. 5 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S)- DO- 7 TAP cristalino (a), cloreto de (2R)-DOTAP cristalino (b) e cloreto de (2S)- DOTAP cristalino (c) em comparação com uma amostra comercialmente | 5 disponíveide cloreto de (2R,S)-DOTAP (Avanti Polar Lipids) (d), A Fig. 6 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0318- E) em acetonitrila quando do resfriamento como em Feigner et al.

A Fig. 7 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0318- E) em acetonitrila após ter sido resfriada a -20ºC como em Feigner et al.

A Fig. 8 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0364- E) em acetonitrita antes do resfriamento como em Feigner et al. ' A Fig. 9 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0364- . E) em acetonitrila após ter sido resfriada a -20ºC como em Feigner et al.

A Fig. 10 ilustra cloreto de (2R,S)- DOTAP racêmico cristalino.

A Fig. 11 ilustra as temperaturas de transição de fase e pontos de fusão de cloreto de (2R,S)-DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)- DOTARP puro cristalino assim como duas misturas de ambas formas cristali- nas.

A Fig. 12 ilustra as curvas DVS para cloreto de (2R,S)-DOTAP (topo)e cloretode(2R)-DOTAP (fundo): formas amorfas: diagramas na direi- ta; formas cristalinas (diagramas na esquerda) (ver exemplo 5 de caracteri- zação). Exemplos para ilustração da invenção Observações gerais sobre as condições experimentais: É importante resfriar muito vagarosamente durante a cristaliza- ção e recristalização a fim de otimizar a precipitação de material cristalino.

Todos os reagentes e solventes compreendem teores muito bai- xOS de água.

Todas as operações são executadas em equipamento fechado sob atmosfera de nitrogênio.

É empregado ácido oleico muito puro com uma pureza mais ele- vada do que 95%, preferentemente mais do que 98%, ainda mais preferen-

| | 14/30 | | | ; temente mais do que 99%. | Parâmetros de medição para a Difração de raios X em pó são como a se- | ' guir. l Difração de raios X em pó STOE Difração: Transmissão Monocromador: Germânio (111) curvado Comprimento de onda da radiação: 1,54060 Cu Detetor: Detetor modo varredura sensível a posição linear: Modo de varredura: Debye-Scherrer/Detetor sensível a posição | móvei/Ômega fixo É comum em estudos de difração de raios X em pó que peque- ' nas diferenças de faixas individuais podem ocorrer se instrumentos ou mé- : todos de registro diferentes, tais como reflexão ou transmissão, ou capilar ou janela, são utilizados, ou se condições de registro diferentes (por exemplo, umidade atmosférica ou temperatura) prevaleceram.

Qualquer pessoa ver- sada na técnica está bastante familiarizada com tais pequenas diferenças e seria prontamente capaz de identificar um dado material para uma corres- pondência próxima a um dado padrão de difração de raios X em pó em con- sideração com a metodologia usada.

Exemplo de preparação 1: Preparação de cloreto de (2R,S)-DOTAP [cloreto de (R,S)-1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio cristalino racêmico]: Materiais de partida Os seguintes produtos químicos foram usados: N,N'-carbonildiimidazols da SIGMA-ALDRICH, lote 1252812 Ácido oleico da RCA, lote OA 11.G.01.2007, 99,1 % em área (HPLC), onde o ensaio poderia ser de 99,5% ou até mesmo maior visto que ácido linoléico (a maior impureza) mostra taxas de resposta muito maiores em UV do que ácido oleico. (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, da MERCK EPROVA, lo- te MSCH-103-A, 0,11% Água, 99,4% (GC)

| - 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]Jundec-7-eno da SIGMA ALDRICH, lote | 1076841, 99,7% (GC) " Cloreto de metila da LINDE, lote 61448 lodeto de sódio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336385, 0,27% água Óxido de alumínio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336643 Acetonitrila da ICC, lote 0000426130, 100,0% (GC), < 0,015% água n-Heptno — da BRENNTAG SCHWEIZERHALL, lote 0000278245, 96,4% (GC) 2-Propanol da THOMMEN FURLER, lote 070920211487, 99,96% (GC), 0,03% de água ' Acetona da THOMMEN FURLER, lote 080609324212, 99,98% : (GC), 0,16% água Síntese de (2R,S)-DODAP [(R,S)-1,2-dioleoil-3-dimetilamônio propano] Dissolve-se 241 kg de N N'-carbonildiimidazol à temperatura ambiente em 6,33 kg de acetonitrila seca.

A solução resultante é aquecida a 25ºC.

Depois 4,0 kg de ácido oleico é bombeado para a solução durante um período de 60 minutos enquanto a temperatura de reação é regulada abaixo de35ºC por variação da velocidade de adição (formação do gás dióxido de carbono). Depois que a adição é concluída, a solução de reação é agitada por 90 minutos adicionais a 30ºC (a evolução de gás termina). Então 11 g de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno é adicionado seguido por uma solução de 0,83 kg de (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol racêmico em 0,37 kg de acetonitrila seca.

A agitação a 30ºC é continuada por 21 horas.

A emulsão resultante é resfriada a 25ºC e a agitação é interrompida.

Duas camadas aparecem.

A camada mais baixa é isolada, desgaseificada a 0,1 kPa (1 mbar)/25ºC por 200 minutos e finalmente diluída com 11,7 kg de n-heptano.

Adiciona-se à solução 1,21 kg de óxido de alumínio básico e a suspensão é agitada por 3 horas a 0ºC.

A suspensão é filtrada e o resíduo filtrado é lava- do com 1,5 kg de n-heptano previamente resfriado a 0ºC.

Os filtrados com- binados são homogeneizados para originar 15,9 kg de solução de 4,08 kg de

16/30 | l . (2R,S)-DODAP puro em n-heptano (lote nº MBA-116, ensaio: 25,7%, rendi- mento: 88,9%). " Outra batelada é realizada da mesma maneira resultando em 16,6 kg de solução de 3,52 kg de (2R,S)-DODAP puro em n-heptano (lote nº MBA-117, ensaio: 21,2%, rendimento: 88,6%). Síntese de cloreto de (2R,S)-DOTAP 23,4 kg de solução de 3,52 kg de (2R,S)-DODAP puro em n- heptano (15,9 kg de lote nº MBA-116 e 7,5 kg de lote nº MBA-117) é carre- gada no vaso de reação e o n-heptano é destilado a uma temperatura da | camisa de 60ºC e pressão reduzida.

Quando o vácuo permanece estável a | 0,8 kPa (8 mbar) a temperatura da camisa é ajustada a 25ºC.

Depois 7,0 kg ' de 2-propanol é adicionado seguido por 3,1 g de iodeto de sódio.

Depois a . temperatura de reação é ajustada a 30ºC e a atmosfera de nitrogênio é substituída por uma atmosfera de cloreto de metila com uma pressão abso- luta constante de 120 kPa (1200 mbar). A mistura de reação é agitada sob essas condições por 137 horas até que a reação de metilação de (2R,S)- DODAP em cloreto de (2R,S)-DOTAP é terminada (98% de conversão). O consumo de cloreto de metila é de 1,39 ka.

Cristalização de cloreto de (2R,S8)-DOTAP A solução de cloreto de (2R,S8)-DOTAP em 2-propanoíl prepara- da como descrito acima é diluída com 35,8 kg de acetona seca a 25ºC.

À quantidade de 2-propanol, conforme observado acima, é de 7 kg e a quanti- dade de cloreto de DOTAP baseada em cálculos é de 3,64 kg na solução.

À solução clara é lentamente resfriada até -12ºC a uma taxa de resfriamento de0,05ºC por minuto, isto é, o resfriamento ocorre durante um período de tempo de 12 1/3 horas.

A solução resultante é mantida a -12ºC a 14 horas adicionais e é então filtrada através de um filtro pré resfriado (-15ºC). O clo- reto de (2R,S)- DOTAP bruto é lavado duas vezes com 6,0 kg de acetona seca fria (-18ºC). ' A modificação de cristal obtida neste ponto, neste experimento particular, não é verificada; entretanto, a partir de experimentos anteriores correspondentes, nos quais o produto bruto foi isolado neste ponto, sabe-se

2 que a modificação do cristal é aquela do (2R,S)-DOTAP cristalino.

Para conseguir um produto até mesmo mais puro, isto é, para " remover algumas impurezas menores, é realizada uma etapa de recristaliza- ção.

Recristalização de cloreto de (2R,S)- DOTAP O cloreto de (2R,S)- DOTAP bruto úmido é dissolvido no filtro fe- chado em uma mistura de 44,1 kg de acetona seca e 3,5 kg de 2-propanol a 35ºC.

A solução é transferida para o vaso de reação e levada a 0ºC.

A solu- ção é lentamente resfriada até -12ºC a uma taxa de resfriamento de 0,004ºC porminuto, isto é, o resfriamento ocorre por um período de tempo de 50 ho- ras.

A suspensão resultante é mantida a -12ºC por 16 horas adicionais e en- Ú tão é filtrada com um filtro secador resfriado (-15ºC). O resíduo do filtro é . lavado duas vezes com 0,8 kg de acetona seca fria (-18ºC) e secado por meio de aplicação de vácuo.

Durante a secagem permite-se que o filtro secador aqueça até a temperatura ambiente.

A secagem está completa quando o vácuo é estável a 0,79 kPa | (7,9 mbar). Rendimento: 3,46 kg de cloreto de (2R,S)-DOTAP racêmico cris- talino ((2R,S)-DOTAP cristalino, lote nº MBA-118, ensaio: 100,0%, rendimen- ' to: 37,8% com ref. a (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, HPLC pureza: 99,9% de área). Um gráfico de cloreto de (2R,S)- DOTAP cristalino pode ser en- contrado na figura 10 Exemplo de preparação 2: Preparação de cloreto de (2R)- DOTAP cristalino enanciomericamente puro cloreto de (R)-1,2-dioleoil-3-propiltrimetilamônio]: Materiais de partida Os seguintes produtos químicos foram usados: | N N"-carbonildiimidazo! da SIGMA-ALDRICH, lote 1252812 Ácido oleico da ACME SYNTHETIC CHEMICALS, lote 060528, 97,8% (HPLC) | (R)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, da DAISO, lote | '

. RMAD62151, 0,11 % de água, 99,6% (GC) 1,8-Diazabiciclo[5.4.0Jundec-7-ena da SIGMA ALDRICH, lote " 1076841, 99,7% (GC) Cloreto de metila da LINDE, lote 61448 lodeto de sódio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336385, 0,27% de água | Acetonitrita da SIGMA ALDRICH, lote 7219K, 100,0% (GC), 0,005% de água n-Heptano — da BRENNTAG SCHWEIZERHALL, lote 0000278245, 96,4%(GC) . 2-Propanol da THOMMEN FURLER, lote 070629176434, ' 99,96% (GC), 0,016% de água . Acetona da THOMMEN FURLER, lote 061201101946, 99,98% (GC), 0,10% de água Síntese de (2R)-DODAP [(R)-1,2-dioleoil-3-dimetilamônio propa- no] Dissolve-se 1,683 kg de N, N'-carbonildiimidazol à temperatura ambiente em 4,3 kg de acetonitrila seca.

A solução é aquecida a 25ºC.

De- pois 2,7 kg de ácido oleico é bombeado na solução por um período de 60 minutos enquanto a temperatura de reação é regulada abaixo 35ºC pela va- riação da velocidade de adição (formação de gás dióxido de carbono). Após o término da adição a solução de reação é agitada por 105 minutos adicio- nais a 30ºC (término da evolução de gás). Adiciona-se então 7,5 g de 1,8- diazabiciclo[5.4.0Jundec-7-eno seguido por uma solução de 0,56 kg de (R)-3- (dimetilamino)-1,2- propanodiol enanciomericamente pura em 0,25 kg de acetonitrila seca.

A agitação a 30ºC é continuada por 19 horas.

A emulsão resultante é resfriada a 10ºC e a agitação é interrompida.

Duas camadas aparecem.

A camada inferior é isolada, desgaseificada a 0,001 kPa (0,1 mbar)/20ºC por 30 minutos e finalmente diluída com 9,7 kg de n-heptano.

À suspensão é agitada por 1,5 horas a 0ºC e filtrada para render 12,3 kg de solução de 2,66 kg de (2R)-DODAP puro em n-heptano (lote nº MBR-001, ensaio: 21,6%, rendimento: 88,4%).

l 19/30 | . . ' Síntese de Cloreto de (2R)-DOTAP Carrega-se 12,2 kg da solução de 2,66 kg de (2R)-DODAP puro ' em n-heptano (lote nº MBR- 001) no vaso de reação e o n-heptano é destila- do a uma temperatura de camisa de 60ºC e pressão reduzida.

Quando o vácuo permanece estável em 0,1 kPa (1 mbar), a temperatura da camisa é ajustada a 20ºC.

Depois 3,26 kg de 2-propanol é adicionado seguido por 1,4 g de iodeto de sódio.

Depois a temperatura de reação é ajustada a 30ºCea atmosfera de nitrogênio é substituída por uma atmosfera de cloreto de metila | com pressão absoluta constante de 125 kPa (1250 mbar). A mistura de rea- çãoé agitada sob essas condições por 330 horas até que a reação de meti- lação de (2R)-DODAP em cloreto de (2R)-DOTAP esteja terminada (97% de conversão). O consumo de cloreto de metila é de 0,58 kg. . Cristalização de Cloreto de (2R)- DOTAP A solução de cloreto de (2R)-DOTAP em 2-propanol preparada conforme descrito acima é diluída com 16,2 kg de acetona seca a 25ºC.

À j quantidade de 2-propanol, conforme observado acima, é de 3,26 kg ea | quantidade de cloreto de DOTAP baseado em cálculos é de 2,78 kg na solu- ção.

A solução clara é lentamente resfriada a -12ºC a uma taxa de resfria- mento de 0,05ºC por minuto, isto é, o resfriamento ocorreu por um período de tempo de 12 1/3 horas.

A suspensão resultante é mantida a -12ºC por uma hora adicional e é então filtrada através de um filtro pré-resfriado (- 12ºC). O cloreto de (2R)-DOTAP bruto é lavado duas vezes com 3,2 kg de acetona seca fria (-18ºC). O produto cristalino é aquele de (2R)-DOTAP cris- talino. | A modificação de cristal obtida neste ponto, neste experimento em particular, não é verificada; entretanto, de experimentos anteriores cor- respondentes nos quais o produto bruto foi isolado neste ponto, sabe-se que | a modificação do cristal é aquela do (2R)-DOTAP cristalino.

Para se obter um produto ainda mais puro, isto é, para remover algumas impurezas menores, é realizada uma etapa de recristalização.

Recristalização de Cloreto de (2R)- DOTAP O cloreto de (2R)-DOTAP úmido bruto é dissolvido no filtro fe- |

| 20/30 - chado em uma mistura de 20,5 kg de acetona seca e 1,63 kg de 2-propanol a 35ºC.

A solução é transferida para um vaso de reação e trazida até 25ºC. " A solução é lentamente resfriada até -12ºC com uma taxa de resfriamento de 0,05ºC por minuto, isto é, o resfriamento ocorre durante um período de tempo de 12 1/3 horas.

À suspensão resultante é mantida a -12ºC por 9 ho- ras adicionais e é então filtrada com um filtro secador resfriado (-12ºC). O resíduo do filtro é lavado duas vezes com 3,2 kg de acetona seca fria (-18ºC) e secado por aplicação a vácuo.

Durante a secagem permite-se que o filtro secador seja aqueci- doatéatemperatura ambiente.

A secagem está completa quando o vácuo é estável a 0,06 kPa (0,6 mbar). Rendimento: 1,467 kg de cloreto de (2R)- | DOTAP cristalino enanciomericamente puro (lote nº MBR-002, ensaio: | : 99,7%, rendimento: 44,7% ref. a (R)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, pure- za de HPLC: 99,9% da área). Exemplo de Preparação 3: Preparação de cloreto de (2S)-DOTAP [cloreto de (S)-1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio cristalino enanciomericamente puro]: Cloreto de (2S)-DOTAP [cloreto de (S)-1,2-dioleoil-3-propiltri- metilamônio] é preparado da mesma maneira que cloreto de (R)-DOTAP (ver | acima) apenas no início à partir do mesmo material de partida enanciomeri- j camente puro (S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol (lote SMAO62281 da | DAISO, 0,14% de água, GC: 99,8%; todos os outros produtos químicos são idênticos) e rendem 1,67 kg de cloreto de (2S)- DOTAP cristalino enancio- mericamente puro (lote nº MBS-002, ensaio: 99,6%, rendimento: 50,4% ref. a(S)3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, pureza de HPLC: 100,0% da área). | Exemplo de Caracterização 1 | Estabilidades | Para determinar a estabilidade do cloreto de (2R,S)-DOTAP cris- talino, a substância é armazenada a 25ºC e 60% de umidade relativa (tabela 1)ouad40ºCe?75% de umidade relativa (tabela 1a) com exclusão de ar.

O teor remanescente de cloreto de (2R,S)-DOTAP é medido em intervalos pe- riódicos e quotado em comparação com um valor inicial.

| 21/30 a | i A pureza e o teor de cloreto de DOTAP são determinados por | meio de HPLC usando o seguinte método: + Equipamento HPLC: Agilent 1200 HPLC Coluna: ODS-3: 150x3 mm, 3 um.

Gl Sciences: Inertsil EluenteA 10 mM de sal de pentanossulfonato de sódio em 0,085% de H3P0, aquoso Eluente B: 3,85 mM de sal de pentanossulfonato de sódio em 94% de acetonitrila contendo 0,085% de H;PO0, aquoso: Gradiente: O min 75% B 1 min 75% B | | ] 6 min 90% B | i 7 min 100% B 20 min 100% B 25 min 75% de B tempo posterior: 5 min 75% de B tempo de execução: 25 min escoamento: 1,5 mi/min pressão: ca. 22000 kPa (220 bar) temperatura da coluna: 50ºC volume de injeção: 1041 Os resultados que se seguem são observados: A determinação da estabilidade pode ser repetida em qualquer tempo desejado, os valores são indicados 1 e 1a são reproduzíveis.

Tabela 1: Condições de armazenamento: 25ºC Cloreto de (2R,S)- Tempo de exposição em meses DOTARP cristalino e 1; ke | : %deárea — —joo7 99.2 % em peso 99,7 99,2 |99,5 Os dados de estabilidade acima confirmam que o cloreto de

' ' | . DOTAP cristalino abaixo é uma substância estável.

Mesmo após 36 meses não foi observada nenhuma degradação significativa para as amostras ar- ] mazenadas a 25+2ºC.

Tabela 1a: | 5 — Condições de armazenamento: 40ºC l DOTAP cristalino E o seas — Íoar Jena | soa | % em peso [ees —jess loos Jozxo joor | Os dados de estabilidade acima confirmam que o cloreto de | l DOTAP é uma substância estável.

Mesmo em condições aceleradas após | . 12 meses não foi observada nenhuma degradação significativa para as a- | mostras armazenadas em 40+2ºC.

Cloretos de (2R)-DOTAP e de (2S)-DOTAP cristalinos mostram valores de estabilidade comparáveis.

Exemplo de caracterização 2 Diagramas de raio X em pó Para caracterização das propriedades estruturais (modificações decristal) dos cloretos de DOTAPs cristalinos, são registrados diagramas de raio X de pó (espectros de difração) dessas substâncias.

Cloretos de (2R,S)-, (2R)- e (2S)-DOTAP cristalinos originam espectros com faixas moderadamente agudas que têm resolução relativa- mente boa para lipídios.

Os espectros indicam altos teores cristalinos.

Ne- nhuma fração amorfa é visível sob microscópio de polarização Exemplos de espectros são mostrados nas Fig. 1, Fig. 2e Fig. 3. Para comparação, um espectro de uma amostra comercialmente disponível, amorfa é mostrado na Fig. 4 (amorfa). A Fig. 5 mostra a compa- ração dos espectros de raios X para cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino (a), cloreto de (2R)-DOTAP cristalino (b) e cloreto de (2S)-DOTAP cristalino (c) em comparação com uma amostra comercialmente disponível de cloreto de (2R,S)-DOTAP (d) (Lipídeos polares Avanti). '

A ei Aa 2.-) 2º Óó UiM M$“ .MAÂPOÊObÍÂ SAMPA DO CO 23/30 | . A Tabela 2 lista valores 2 teta selecionados para as várias modi- ficações de cristal de cloreto de DOTAP racêmico e enanciomericamente ' puros: - | Tabela 2: | Exemplo de caracterização 3 Ponto de Fusão e Entalpia de fusão O ponto de fusão e entalpia de fusão de cloretos de DOTAP cris- talinos são determinados por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (30- . 350ºC, 5,0ºC/min, N2 80 ml/min). Os pontos de fusão resultantes e entalpias de fusão para cloreto de (2R,S)-DOTAP racêmico e (2R)-DOTAP e (28S)-DOTAP resp. enanciome- ricamente puros são listados na Tabela 3. Tabela 3: Tipo Entalpia = de eo fusão racêmico 161,0 ºC enanciomericamente puro 28S)-DOTAP enanciomericamente puro 184,7 ºC Exemplo de caracterização 4 Temperaturas de transição de fase e entalpias As temperaturas de transição de fase e entalpia de cloretos de DOTAP cristalinos são determinadas por calorimetria de varredura diferenci- al (DSC) (30- 350ºC, 5,0º C/min, N; 80 mi/min). Além dos pontos de fusão (ver exemplo de caracterização 3) : muitos pontos de transição de fases cristalinas resp. líquidas-cristalinas são observados.

' A A SEEAAA sas tt Da O Rm RS RSRS: Si TORO RN | 24/30 j . As temperaturas de transição de fase correspondentes e ental- pias para cloreto de (2R,S)-DOTAP racêmico e cloreto de (2R)-DOTAP e + resp. cloreto de (28)-DOTAP enanciomericamente puros são listados na Ta- bela 4. Tabelas Tipo (2R,S)-DOTAP | (2PR-DOTAP — enan- | (28)-DOTAP enan- ciomericamente puro | ciomericamente puro racêmico Tºtransição início —f498%€ [408% [410% pico 43,0ºC entaipi | 2º transição início 64,7ºC 524ºC — | | pico 66,2ºC 60,7ºC | entalpia | -25,0 J/g 38,0 Jg 3º transição inicio - pieo faso -- [88C À eae | [as — Ja - Quando o experimento DSC é realizado em misturas de cloreto | ; de (2R,S)- DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)- DOTAP puro cristalino todas as temperaturas de transição de fase de ambos, o racemato e o enan- ciômero são observadas.

A Fig. 11 ilustra as temperaturas de transição de fasee pontos de fusão do cloreto de (2R,S)- DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)- DOTAP puro cristalino bem como as misturas de ambas as formas cristalinas na proporção de 100:50 e 63:100. Essas proporções são corres- pondentes a um teor de 33,3% em mol resp. 19,3% em mol de cloreto de (28)-DOTAP nas misturas.

Conclusão: As modificações do cristal de cloreto de DOTAP cristalino enan- ciomericamente puro e cloreto de DOTAP cristalino racêmico são distintas.

Exemplo de caracterização 5 Absorção de água com dependência na umidade relativa A absorção de cloreto de DOTAP é determinada por Sorção Di- nâmica de Vapor (DVS) empregando-se um analisador de sorção de vapor de água Projekt Messtechnik SPS 11-100n.

As amostras são colocadas em cadinhos de aluminio no topo de uma microbalança e permite-se que sejam equilibrados a 25ºC e 0% de r.h. (umidade relativa) durante a noite antes da exposição dos mesmos a dois ciclos de umidificação/secagem a 25ºC com

25/30 | . uma taxa de varredura de A r.h. = 5% h” e períodos de equilíbrio 'isoúmido' | nos valores extremos. " Amostras de cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino, cloreto de (2R)-DOTAP cristalino, cloreto de (2R,S)- DOTAP amorfo e cloreto de (2R)- | 5 DOTAP amorfo são investigadas. : Resultados: | A comparação das curvas de DVS (ver Figura 12: linha cheia do primeiro ciclo, linha pontilhada do segundo ciclo) aponta diferenças caracte- rísticas entre as amostras cristalinas e amorfas: As amostas cristalinas (dia- | | 10 grama esquerdo da Figura 12) exibem um peso estável a baixa r.h., sendo | que o peso das amostras amorfas (diagramas da direita da Figura 12) au- | ] mentam já imediatamente acima de 0% r.h.

Além disso, para as amostras | | : que eram cristalinas no início, uma histerese significativamente mais elevada | é observada em ambos os ciclos.

Uma diferença também pode ser observada entre as amostras | racêmicas (diagramas do tipo da Figura 12) e as enanciomericamente puras (diagramas da parte inferior da Figura 12): As amostras racêmicas exibem | um nítido aumento do teor de água em cerca de 10-15% de r.h., sendo que as amostras isomericamente puras exibem esta etapa em cerca de 20-25% derh.

Exemplo Comparativo 1 No experimento de Feigner et al., aqui reproduzido, todas as | condições experimentais foram selecionadas para ficar em estreita confor- midade com a US 5.264.618 (Feigner et al.), Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 | ad. 31,5 g de cloreto de oleoila (FLUKA 0733lAH) dissolvidos em ! 125 ml de clorofórmio foi adicionado gota a gota a 4ºC sob resfriamento por um período de 1% hora a 5,0 g de 3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, dissolvi- do em 37,5 ml! de clorofórmio e 25 ml de piridina.

A solução amarela foi agi- tada durante a noite.

Adicionou-se então 125 m! de água fria e 125 ml de dietiléter.

A fase orgânica foi lavada duas vezes com 100 mil de HCL 0,5N e também duas vezes com 100 ml! de solução de bicarbonato de sódio O,S5N. | OU TITS O

BR 39 g de sulfato de sódio anidro foi adicionado e a suspensão assim obtida foi filtrada e lavada com 100 mi! de clorofórmio. O filtrado foi então concentrado ' sob pressão reduzida a 40ºC. Resultou 40,1 g de um líquido marrom (SM- 0318-A) contendo um teor de (2R,S)-DODAP de 24,3% p/p medido por H- PLC. Uma outra secagem sob pressão reduzida a 60ºC resultou em uma redução de peso para 31,2 g. | 31,0 g deste material foi purificado por cromatografia de coluna de ácido silícico como se segue: | Sílica-gel: 129 g (a quantidade de sílica-gel foi calculada relativo àquantidade de (2R,S)-DODAP) Merck 60 F 63-200um Coluna: diâmetro 4 cm, altura 80 cm : ] Fluxo: aproximadamente 8 mlímin : Como fase móvel foi empregado primeiramente 1.500 ml de clo- reto de metileno (frações de 1-27), depois 1.000 ml de cloreto de metile- —no/metanol 95:5 (frações de 28-47) e finalmente 1.000 ml de metanol. Fra- ções foram coletadas e combinadas de acordo com sua análise TLC. Assim as frações 4-33 foram concentradas juntas sob pressão reduzida. Resultou 10,8 g de um óleo marrom (SM-0318-B) contendo um teor de (2R,S)-DODAP de 65,6% p/p medido por HPLC. E frações 34-42 resultaram em 12,6 g de um óleo marrom (SM 0318-D) contendo um teor de (2R,S8)-DODAP de 54,2% p/p medido por HPLC.

10,4 g de cloreto de metileno foi adicionado a 9,6 g do composto obtido a partir das frações 4-33 (SM-0318-B) em um tubo de vidro de alta pressão. O tubo de vidro foi então fechado e a solução amarronzada foi a- —quecida durante a noite a 50ºC para formar uma emulsão. Depois o tubo foi aberto e cloreto de metileno residual foi removido por evaporação. Resulta- ram 8,0 g de uma cera amarela (SM-0318-E) contendo um teor de cloreto de (2R,S)-DOTAP de 65,0% p/p e 1,3% p/p (2R,S)-DODAP ambos medidos por HPLC.

Adicionou-se 14,0 g de acetonitrila a esta cera (SM-0318-E). À emulsão assim obtida foi transferida com 80 ml de acetonitrila (para obter uma proporção de sólido para solvente de aproximadamente 1:12) em um |

27/30 | . frasco e resfriada a 20ºC. Não foi observada nenhuma cristalização. A 20ºC resultou um material amarelo-amarronzado como mel solidificado que, mes- mo quando somente amornando lentamente, tendeu a se tornar um material amarronzado viscoso pegajoso. Conclusão Os dados demonstram que cloreto de 1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio (cloreto de (2R,S)-DOTAP) preparado de acordo com o procedimento acima, que está de acordo com a US 5.264.618 (Feigner et al), Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 a 47 não pode ser obtido na forma cris- | talina Ver também Figuras 6 e 7 ilustrando uma emulsão de cloreto de | (2R,S)-DOTAP (SM- 0318-E) em acetonitrila durante o resfriamento, e emul- | : são de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0318-E) em acetonitrila após ter sido | resfriada a - 20ºC, respectivamente. | 15 Exemplo Comparativo 2 | : Uma outra reprodução do experimento de Feigner et al., foi pre- ' parada confirmando a mesma descoberta acima. : Todas as condições experimentais foram selecionadas para ficar tão próximas quanto possível às condições para a preparação/isolamento do cloreto de (2R,S)-DOTAP conforme divulgado em US 5.264.618 (Feigner et ' al) Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 a 47. Neste experimento, uma ênfase especial foi feita no grau dos re- | agentes, o uso de piridina anidra, o tempo de metilação e a temperatura do | tubo. | 25 Dentro da US 5.264.618 (Feigner et al) Exemplo 5 não pode ser encontrada nenhuma informação válida quanto à matéria prima empregada. Para o reprocessamento foram empregados cloreto de oleoila da SIGMA- ALDRICH (Art. nº 367850, lote 0733l!AH) e 3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol | da TCI (Art. nº D2072, lote FGCO1EF). : | Dietiléter (Art. nº. 8.22270.1000, lote nº K33237470), sulfato de sódio (Art. nº 8.22286.5000, lote nº TAGO3386), areia do mar (Art. nº

1.07711.5000, lote nº TA1417811), silica-gel 60 F 63-200 um (Art. nº

* 28/30 . 1.07734.9025, lote nº TA1570234) e acetonitrila (Art. nº 1.15500.1000, lote nº K38172000) todos da Merck KGaaA. Clorofórmio (Art. nº 34854, lote nº ' 8178C) e piridina sobre peneira molecular, H20< 0,005% (Art. nº, 82704, lote nº 1166921) da Fluka.

5,0 g de 3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol foi dissolvido à tempe- ratura ambiente em 25 ml de piridina anidra e 37,5 ml de corofórmio recen- temente destilado. A solução foi resfriada a 4ºC. 31,5 q de cloreto de oleoíla | foi dissolvida em 125 ml de clorofórmio destilado. A solução de cloreto de oleoila foi adicionada gota a gota à solução de 3-(dimetilamino)-1,2- —propanodio! fria por um período de uma hora. A solução amarela foi agitada durante à noite. Depois 125 ml de água fria e 125 ml de dietiléter foram adi- ] cionados. A fase orgânica foi lavada duas vezes com 100 ml de HCi a 0,5N : e depois também duas vezes com 100 ml de solução de bicarbonato de só- dio O0,5N. Depois adicionou-se 39 g de sulfato de sódio anidro. A suspensão assim obtida foi filtrada e o sólido residual foi lavado com 20 mi! de clorofór- mio. O produto filtrado foi então concentrado sob pressão reduzida. Resulta- ram 31,5 g de um líquido marrom (SM 0364 A) contendo um teor de 1,2- dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) de 62,2% p/p medido por HPLC. Uma coluna de sílica-gel foi preparada como se segue: Coluna: diâmetro 4 cm, altura 60 cm Silica gel: 200 g sílica-gel e 42,6 g de areia do mar (calculado relativo à quantidade de DODAP) Fluxo: aproximadamente 7 ml/min Adicionou-se gota a gota 15 g do material preparado acima (SM 0364 A) na coluna de silica-gel e enxaguou-se com 50 ml de clorofórmio. À coluna foi primeiro eluída com 1.000 ml de clorofórmio, depois com 1.000 mi de clorofórmio/metanol 95/5, depois com 1.250 ml de clorofórmio/metanol| 90/10 e finalmente com 2.500 ml! de metanol. Foram coletadas e combinadas frações de acordo com sua análise por cromatografia em camadas finas em placas de sílica-gel (Merck 60 F254), desenvolvidas com clorofórmio/aceto- na/metanoíi/ácido acético/água 50/15/5/5/2 por volume, detecção por iodo. Após concentração sob pressão reduzida, as frações combinadas de 11-17

. resultaram em 4,88 g (SM 0364 B) contendo um teor de DODAP de 73,2% P/p, as frações 18-27 resultaram em 7,24 g (SM 0364 C) contendo um teor - de DODAP de 68,2% p/p e as frações 28-31 resultaram em 1,9 g (SM 0364 | D) contendo um teor de DODAP de 40,4% p/p, tudo medido por HPLC.

No totalresultou um equilíbrio de massa de 93,5%. | 1,0 g do composto obtido a partir das frações mais puras de 11- 17 (SM-0364- B) foi adicionado em um tubo de vidro de silicato de boro de parede pesada, altamente pressurizável (Sigma Aldrich Z2181072-1 EA). De- pois 10 ml de cloreto de metila foram condensados no tubo de vidro.

O tubo de vidro foifechado de forma estanque e mantido por 72 horas a 70ºC.

De- pois o tubo foi resfriado a 0ºC, aberto, e cloreto de metila residual foi removi- ' do por evaporação.

Isto resultou em 1,11 g de uma cera amarelo-acasta- | : nhada (SM 0364 E) contendo um teor de cloreto de (2R,S)-DOTAP de 69,3% | | P/p e mostrando um teor de DODAP de 1,8% p/p e um teor de ácido oleico | 15 de2,7% p/p (todos medidos por HPLC). | A 1,08 g do composto obtido conforme descrito acima (SM 0364 | E) adicionou-se 10 ml de acetonitrila e aqueceu-se a 50ºC.

A emulsão assim obtida foi resfriada a -20ºC.

Nenhuma cristalização pode ser observada.

A - 20ºC resultou uma cera amarelo-amarronzada. ' Conclusão: Conforme mostrado acima, quando se reelabora o(s) modo(s) de | realização mais próximo(s) da US 5.264.618 (Feigner et al), apenas cloreto de (2R,S)- DOTAP amorfo pode ser obtido.

Ver também as Figuras 8 e 9 ilustrando a emulsão de cloreto de (2R,S-DOTAP (SM-0364-E) em acetonitrila antes de resfriá-la e emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0364-E) em acetonitrila após resfriá-la a - 20ºC, respectivamente.

Sem maior elaboração, acredita-se que uma pessoa com conhe- cimentos na técnica pode, usando a descrição precedente, utilizar a presen- | te invenção em toda a sua extensão.

Os modos de execução precedentes ' preferidos devem ser, portanto, construídos como meramente ilustrativos, e | de maneira alguma limitantes do restante da divulgação. |

. . ' Os exemplos precedentes podem ser repetidos com sucesso similar por substituição dos reagentes e/ou condições de operação descritos 7 genericamente ou especificamente nesta invenção por aqueles usados nos exemplos precedentes.

A partir da descrição anterior, uma pessoa com conhecimento na técnica pode facilmente determinar as características essenciais desta in- venção e, sem sair do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e | modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. | |

Claims (15)

. ' . REIVINDICAÇÕES

1. Cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalinos, onde o ' cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino possui uma das seguintes característi- cas: Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 12,6, aproximadamente 19,5, aproximadamente 20,2, aproxi- madamente 21,5 e aproximadamente 25,2; ou Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 6,5, aproximadamente 12,6, aproximadamente 13,4, aproxima- damente 19,5, aproximadamente 20,2, aproximadamente 21,5, aproxima- damente 25,2 e aproximadamente 29,8; ou um padrão de difração de raios X em pó correspondendo ao padrão retratado na Fig. 1; . ou onde cloreto de (2S)-DOTAP cristalino possui uma das seguintes características: Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 12,8, aproximadamente 19,5, aproximadamente 19,8, aproxi- madamente 20,2, e aproximadamente 21,6; Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 6,5, aproximadamente 12,8, aproximadamente 19,5, aproxima- damente 19,8, aproximadamente 20,2, aproximadamente 20,7, aproxima- damente 21,6 e aproximadamente 25,3; ou um padrão de difração de raios X em pó correspondendo ao padrão representado na Fig. 2; ou onde cloreto de (2R)-DOTAP cristalino tem uma das seguintes características: Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 12,8, aproximadamente 19,5, aproximadamente 19,8, aproxi- madamente 20,3, e aproximadamente 21,6; Valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de aproxi- madamente 6,6, aproximadamente 12,8, aproximadamente 19,5, aproxima- damente 19,8, aproximadamente 20,3, aproximadamente 20,8, aproxima-

. damente 21,6 e aproximadamente 25,3; ou um padrão de difração de raios X em pó correspondendo ao padrão representado na Fig. 3. ' 2. Cloreto de (2R,S)- (2S)- ou (2R)- DOTAP cristalinos que têm uma estabilidade maior do que 99% em peso e % de área determinada por HPLC quando armazenado a 25ºC por 36 meses ou a 40ºC por 12 meses.

3. Cloreto de (2R,S)-, (28S)- ou (2R)- DOTAP cristalinos, que têm uma pureza química de pelo menos aproximadamente 95% determinada por HPLC.

4. Cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalinos de acordo comuma ou mais reivindicações | a 3, que têm um ponto de fusão maior do que 160ºC e uma entalpia de fusão maior do que -130 J/g.

5. Composição farmacêutica compreendendo cloreto de (2R,S)-, : (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalinos de acordo com uma ou mais das reivindica- ções 1 a 4 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, ainda compreendendo um ou mais peptídeos, nucleotídeos, antígenos, a- gentes citostáticos, lipossomas, lipoplexos, nanopartículas ou microemul- sões, ou uma mistura dos mesmos.

7. Processo para preparação de uma forma cristalina de cloreto de(2R,S)-,(2S)- ou (2R)-DOTAP de acordo com uma ou mais das reivindi- cações | a 4, compreendendo a cristalização de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)- DOTAP a partir de um ou mais solventes apróticos.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, no qual um ou mais solventes apróticos compreendem um ou mais solventes próticos.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, no qual a cristalização ocorre sob uma atmosfera inerte.

10. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 7 a 9, no qual a cristalização ocorre por resfriamento lento a uma taxa de 0,001ºC a 0,1ºC por minuto por 5 a 200 horas.

11. Processo de acordo com uma reivindicação 10, em que o resfriamento lento é por um período de tempo de aproximadamente 10 a 100 horas.

Á o 3/3 : 12. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 7 a 11, no qual a cristalização é executada diretamente a partir de uma solução ' ' de reação sem uma purificação anterior, solução de reação essa que vem de um processo de preparação de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP.

13. Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 7 a 12, que ainda compreende a recristalização de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)- DOTAP cristalinos.

14. Cloreto de (2R,S)-DOTAP, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalinos obteníveis por um processo de acordo com uma ou mais reivindicações 7 a

13.

15. Método de transfecção de uma célula, compreendendo a | ' administração a esta referida célula de um cloreto de (2R,S)-, (28S)- ou (2R)- ' DOTAP cristalinos de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4. ' | |