KR102583917B1

KR102583917B1 - 양이온성 지질을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR102583917B1
Application number: KR1020177014617A
Authority: KR
Inventors: 마사키 오타; 켄 하무라
Original assignee: 니치유 가부시키가이샤
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2015-12-08
Publication date: 2023-10-04
Also published as: US20170275242A1; CN107001238A; EP3231790A4; JP6583682B2; DK3231790T3; KR20170094163A; EP3231790A1; US9834502B2; JP2016108343A; CN107001238B; EP3231790B1; WO2016093205A1

Abstract

특별한 장비를 필요로 하지 않고, 고순도의 양이온성 지질을 효율적으로 얻을 수 있는 양이온성 지질의 산업적 제조 방법이 제공된다. 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질과 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 유기 용매에서 혼합하고, 석출된 테트라알킬암모늄 요오드화물을 여과에 의해 분리하여 얻은 여과액을 농축시켜서 테트라알킬암모늄 요오드화물을 석출함으로써 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 얻는다.

화학식 (1)

화학식 (2)

Description

양이온성 지질을 제조하는 방법{METHOD FOR PRODUCING CATIONIC LIPID}

본 발명은 양이온성 지질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

핵산 의약품은 차세대 의약품으로 주목받고 있지만, 핵산을 세포 내에 효율적으로 도입하기 위해서는 캐리어가 필요하다. 캐리어는 크게 바이러스 캐리어 및 비-바이러스 캐리어로 나뉜다. 바이러스 캐리어는 비-바이러스 캐리어에 비해 핵산 도입 효율이 높지만, 독성 문제를 해결할 수 없다. 따라서, 도입 효율은 바이러스 캐리어보다 열등하지만 안전성이 높기 때문에 비-바이러스 캐리어가 주목받고 있다.

비-바이러스 캐리어로서, 양이온성 지질, PEG 지질 등으로 구성된 지질 막을 사용하는 캐리어 및 양이온성 고분자로 구성된 미셀을 사용하는 캐리어가 보고되었고, 지질의 조성에 의해 기능을 제어할 수 있는 지질 막을 사용하는 캐리어에 대한 조사가 활발하게 이루어졌다. 지질 막으로 사용되는 지질 중에서, 핵산의 도입 효율에 가장 큰 영향을 미치는 지질은 양이온성 지질이다.

양이온성 지질은 일반적으로 하나의 4차 암모늄기와 2개의 소수성기를 갖는다. 전형적인 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물(이하 DOTAP-C1) 및 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물(이하 DOTMA-C1)을 포함한다. 이들 지질은 다른 알려진 양이온성 지질들에 비해 핵산의 도입 효율이 높기 때문에 가장 널리 사용되는 양이온성 지질이다.

DOTAP-C1 및 DOTMA-C1은 디메틸아미노프로판디올에 올레오일기 또는 올레일기를 도입한 후, 염화메틸로 4차화 반응을 수행함으로써 얻어진다(비특허 문헌 1). 그러나, 염화메틸은 상온 및 상압 하에서 기체이기 때문에, 고압 반응 용기, 예를 들어, 오토클레이브(autoclave)를 사용해야 한다. 또한, 염화메틸은 독성이 강하기 때문에, 그의 취급 및 사용하는 장치에 대한 안전에 특히 주의를 기울여야 한다는 단점이 있다.

전술한 이유 때문에, 염화메틸을 사용하지 않고 DOTAP-C1 또는 DOTMA-C1을 제조하는 방법이 개발되고 보고되었다. 비특허 문헌 2에서는, 디메틸아미노프로판디올에 올레오일기가 도입되고, 염화메틸을 사용하여 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 요오드화물(이하 DOTAP-I)이 합성된 후, 이온 교환 수지로 충전된 칼럼에 의해 DOTAP-I의 요오드화 이온이 염화 이온으로 교환한다.

그러나, 비특허 문헌 2에 기재된 방법은 얻어진 지질에 대해 다량의 이온 교환 수지를 필요로 한다. 또한, 효율적인 음이온 교환을 수행하기 위해서는, 용액 중의 DOTAP-I 농도가 희석되어야 하기 때문에, DOTAP-I를 다량의 용매에 용해시킬 필요가 있어서 생산 규모가 매우 커진다. 또한, 이온 교환 칼럼에서 음이온 교환 후에 다량의 용매가 제거되어야 하기 때문에, 상기 방법은 비효율적이고 산업적으로 바람직하지 않다.

따라서, 특허 문헌 1에서는, N-[1-(2,3-디리놀레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 요오드화물 또는 N-[1-(2,3-디리놀레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 요오드화물의 디클로로메탄 용액에 1N 염산의 메탄올 용액을 첨가하고, 교반하고, 염화나트륨 용액으로 세척하는 작업을 4회 반복하여 음이온 교환을 수행한다. 그러나, 본 방법은 낮은 음이온 교환 비를 가질 뿐만 아니라, DOTAP-C1에서와 같이 분자 내에 에스테르 결합을 갖는 경우에는 불순물, 예를 들어, 지방산이 산에 의한 가수분해에 의해 생성되기 때문에 의약품에 요구되는 순도를 갖는 제품을 얻기 위해서 비효율적인 정제 단계, 예를 들어, 칼럼 정제를 필요로 한다.

특허 문헌 1: JP-A-2014-132014

비특허 문헌 1: Biochem., 84, 7413 (1987) 비특허 문헌 2: Biochem. Biophys. Acta, 1299, 281 (1998)

전술한 바와 같이, 현재까지 보고된 양이온성 지질을 제조하는 방법은 특별한 생산 장비를 필요로 하는 제조 방법 또는 이온 교환 칼럼을 포함하는 매우 비효율적인 제조 방법이고, 고순도의 양이온성 지질의 효율적인 산업적 제조 방법은 확립되지 않았다.

본 발명의 목적은 특별한 장비를 필요로 하지 않고, 고순도의 양이온성 지질을 효율적으로 얻을 수 있는 양이온성 지질의 산업적 제조 방법을 제공하는 것이다.

일반적인 평형 반응에서, 평형은 생성물을 반응계 밖으로 배출함으로써 한 방향으로 기울어질 수 있다. 예를 들어, 다양한 알킬 할로겐화물로부터 알킬 요오드화물을 얻는 핀켈스타인 반응에서, 반응은 부산물인 나트륨염의 석출로 인해 진행된다.

따라서, 음이온 교환이 평형 반응이라는 사실에 대해 집중적으로 조사한 결과, 발명자들은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질이 유기 용매에서 임의의 음이온을 갖는 테트라알킬암모늄염과 반응하는 경우에 음이온 교환에 의해 형성된 테트라알킬암모늄 요오드화물이 석출됨으로써 반응이 효율적으로 진행되고, 그 후에 테트라알킬암모늄 요오드화물이 여과에 의해 제거되고, 여과액을 농축시켜 음이온 교환 비를 증가시킴으로써 본 발명을 완성한다는 것을 알아내었다.

본 발명에 따른 양이온성 지질을 제조하는 방법은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질을 유기 용매에서 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염과 혼합하고, 여과에 의해 석출된 테트라알킬암모늄 요오드화물을 분리하여 여과액을 얻은 후, 여과액을 농축시켜 적어도 테트라알킬암모늄 요오드화물을 석출함으로써 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 얻는 것을 특징으로 한다.

화학식 (1)에서, R¹, R² 및 R³는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, R⁴ 및 R⁵는 각각 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타낸다.

화학식 (2)에서, R¹, R² 및 R³는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, R⁴ 및 R⁵는 각각 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, X^-는 염화 이온, 브롬화 이온, 플루오르화 이온, 아세테이트 이온, 메탄설포네이트 이온 또는 p-톨루엔설포네이트 이온을 나타낸다.

본 발명은 특별한 장비를 필요로 하지 않고 고순도의 양이온성 지질을 효율적으로 얻을 수 있기 때문에 양이온성 지질을 제조하는 산업적 방법으로서 매우 유용하다.

도 1은 실시예 1에서 얻은 DOTAP-C1의 적정 결과를 보여준다.
도 2는 실시예 2에서 얻은 DOTMA-C1의 적정 결과를 보여준다.
도 3은 비교예 1에서 얻은 DOTAP-C1의 적정 결과를 보여준다.

화학식 (1) 또는 화학식 (2)의 R¹ 내지 R³는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타낸다. R¹ 내지 R³는 각각 직쇄형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 또는 R¹ 및 R²는 서로 결합하여 고리를 형성할 수 있다. R¹ 내지 R³는 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 탄화수소기의 탄소 원자 수는 바람직하게는 1개 내지 3개이고, 보다 바람직하게는 1개이다.

구체적으로, R¹ 내지 R³ 각각을 구성하는 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기는 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 네오펜틸기, tert-펜틸기, 1,2-디메틸프로필기, 2-메틸부틸기, 2-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 2,2-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 및 페닐기를 포함한다. R¹ 및 R²가 서로 결합하여 고리를 형성하는 경우에는 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기 등이 예시된다. R¹ 내지 R³ 각각은 바람직하게는 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 이소프로필기이고, 보다 바람직하게는 메틸기이다.

화학식 (1) 또는 화학식 (2)의 R⁴ 및 R⁵는 각각 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, 직쇄형 또는 분지형일 수 있고, 포화 또는 불포화일 수 있고, 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 아실기 또는 탄화수소기의 탄소 원자 수는 바람직하게는 14개 이상, 바람직하게는 18개 이하, 보다 바람직하게는 18개이다.

R⁴ 내지 R⁵ 각각을구성하는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기는 예를 들어, 데카노일기, 운데카노일기, 도데카노일기, 트리데카노일기, 테트라데카노일기, 펜타데카노일기, 헥사데카노일기, 헵타데카노일기, 옥타데카노일기, 노나데카노일기, 이코사노일기, 헤니코사노일기, 도코사노일기, 데세노일기, 운데세노일기, 도데세노일기, 트리데세노일기, 테트라데세노일기, 펜타데세노일기, 헥사데세노일기, 헵타데세노일기, 옥타데세노일기, 노나데세노일기, 이코세노일기, 헤니코세노일기, 도코세노일기, 데카디에노일기, 운데카디에노일기, 도데카디에노일기, 트리데카디에노일기, 테트라데카디에노일기, 펜타데카디에노일기, 헥사데카디에노일기, 헵타데카디에노일기, 옥타데카디에노일기, 노나데카디에노일기, 이코사디에노일기, 헤니코사디에노일기, 도코사디에노일기, 옥타데카트리에노일기, 이코사트리에노일기, 이코사테트라에노일기, 이코사펜타에노일기, 도코사헥사에노일기, 이소스테아릴기 및 테트라메틸헥사데세닐기(피톨 잔기)를 포함하고, 바람직하게는 테트라데카노일기, 테트라데세노일기, 헥사데카노일기, 헥사데세노일기, 옥타데카노일기, 옥타데세노일기 또는 옥타데카디에노일기이고, 보다 바람직하게는 옥타데카노일기, 옥타데세노일기 또는 옥타데카디에노일기이다.

R⁴ 내지 R⁵ 각각을구성하는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기는 예를 들어, 데실기, 운데실기, 도데실기, 트리데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 헥사데실기, 헵타데실기, 옥타데실기, 노나데실기, 이코실기, 헤니코실기, 도코실기, 데세닐기, 운데세닐기, 도데세닐기, 트리데세닐기, 테트라데세닐기, 펜타데세닐기, 헥사데세닐기, 헵타데세닐기, 옥타데세닐기, 노나데세닐기, 이코세닐기, 헤니코세닐기, 도코세닐기, 데카디에닐기, 운데카디에닐기, 도데카디에닐기, 트리데카디에닐기, 테트라데카디에닐기, 펜타데카디에닐기, 헥사데카디에닐기, 헵타데카디에닐기, 옥타데카디에닐기, 노나데카디에닐기, 이코사디에닐기, 헤니코사디에닐기, 도코사디에닐기, 옥타데카트리에닐기, 이코사트리에닐기, 이코사테트라에닐기, 이코사펜타에닐기, 도코사헥사에닐기, 이소스테아릴기 및 테트라메틸헥사데세닐기(피톨 잔기)를 포함하고, 바람직하게는 테트라데실기, 테트라데세닐기, 헥사데실기, 헥사데세닐기, 옥타데실기, 옥타데세닐기, 또는 옥타데카디에닐기이고, 보다 바람직하게는 옥타데실기, 옥타데세닐기 또는 옥타데카디에닐기이다.

화학식 (2)의 X^-는 요오드화 이온, 카르복실레이트 이온 또는 유기 설포네이트 이온 이외의 할로겐화 이온을 나타낸다. 구체적으로, X^-는 염화 이온, 브롬화 이온, 플루오르화 이온, 아세테이트 이온, 메탄설포네이트 이온 및 p-톨루엔설포네이트 이온을 포함하고, 바람직하게는 염화 이온 또는 메탄설포네이트 이온이고, 보다 바람직하게는 염화 이온이다.

화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질은 유기 용매에서 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염과 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질을 혼합하여 음이온 교환을 수행함으로써 얻어진다. 음이온 교환은 평형 반응이고, 음이온 교환에 의해 부산물로 생성된 거의 용해되지 않는 테트라알킬암모늄 요오드화물이 석출됨으로써, 계의 평형은 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 생성하는 방향으로 기울어진다. X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염의 X^-는 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 X^-와 동일하다.

본 발명의 제조 방법의 음이온 교환 단계에서 사용되는 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염에 있어서, 결합된 알킬기의 탄소 원자 수가 너무 많으면, 부산물인 테트라알킬암모늄 요오드화물이 반응에서 사용되는 유기 용매에 쉽게 용해되고 평형이 거의 기울어지지 않아서 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 생성량이 감소한다. 따라서, 테트라알킬암모늄염의 알킬기의 탄소 원자 수는 1개 내지 4개, 바람직하게는 1개 내지 2개, 보다 바람직하게는 1개이다.

X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염은 예를 들어, 테트라메틸암모늄 염화물, 테트라메틸암모늄 브롬화물, 테트라메틸암모늄 플루오르화물, 테트라메틸암모늄 아세테이트, 테트라메틸암모늄 메탄설포네이트, 테트라메틸암모늄 p-톨루엔설포네이트, 테트라에틸암모늄 염화물, 테트라에틸암모늄 브롬화물, 테트라에틸암모늄 플루오르화물, 테트라에틸암모늄 아세테이트, 테트라에틸암모늄 메탄설포네이트, 테트라에틸암모늄 p-톨루엔설포네이트, 테트라프로틸암모늄 염화물, 테트라프로틸암모늄 브롬화물, 테트라프로틸암모늄 플루오르화물, 테트라프로틸암모늄 아세테이트, 테트라프로틸암모늄 메탄설포네이트, 테트라프로틸암모늄 p-톨루엔설포네이트, 테트라부틸암모늄 염화물, 테트라부틸암모늄 브롬화물, 테트라부틸암모늄 플루오르화물, 테트라부틸암모늄 아세테이트, 테트라부틸암모늄 메탄설포네이트 및 테트라부틸암모늄 p-톨루엔설포네이트를 포함하고, 바람직하게는 테트라메틸암모늄 염화물, 테트라메틸암모늄 브롬화물, 테트라메틸암모늄 플루오르화물, 테트라메틸암모늄 아세테이트, 테트라메틸암모늄 메탄설포네이트, 테트라메틸암모늄 p-톨루엔설포네이트, 테트라에틸암모늄 염화물, 테트라에틸암모늄 브롬화물, 테트라에틸암모늄 플루오르화물, 테트라에틸암모늄 아세테이트, 테트라에틸암모늄 메탄설포네이트, 또는 테트라에틸암모늄 p-톨루엔설포네이트이고, 보다 바람직하게는 테트라메틸암모늄 염화물, 테트라메틸암모늄 브롬화물, 테트라메틸암모늄 플루오르화물, 테트라메틸암모늄 아세테이트, 테트라메틸암모늄 메탄설포네이트, 또는 테트라메틸암모늄 p-톨루엔설포네이트이다.

X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염의 사용량에 있어서, 사용량이 너무 적으면, 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 수율이 감소한다. 사용량이 너무 많으면, X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 용해시키기 위한 용매의 양이 증가함으로써 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염의 사용량은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질에 대해서 바람직하게는 1.5 당량 내지 10.0 당량, 보다 바람직하게는 2.0 당량 내지 5.0 당량이다.

본 발명의 제조 방법의 음이온 교환 단계에서 사용되는 유기 용매는 테트라알킬암모늄염의 이온 및 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질의 해리도를 높이기 위해서 양성자성 극성 용매가 바람직하다. 구체적으로, 저급 알코올 예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올 또는 tert-부탄올이 바람직하고, 에탄올이 보다 바람직하다.

본 발명의 제조 방법의 음이온 교환 단계에서 사용되는 유기 용매의 사용량에 있어서, 사용량이 너무 적으면 교반이 어렵고, 사용량이 너무 많으면 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 구체적으로, 유기 용매의 사용량은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질에 대하여 바람직하게는 중량으로 5배 내지 30배, 보다 바람직하게는 중량으로 10배 내지 20배이다.

본 발명의 제조 방법에서 반응 온도는 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질 및 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염이 유기 용매에 용해될 수 있는 온도인 한 특별히 제한되지 않으며, 통상적으로는 0℃ 내지 120℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃이다.

본 발명의 제조 방법에 따르면, 유기 용매에서 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염과 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질을 반응시킨 후, 석출된 테트라알킬암모늄 요오드화물을 여과에 의해 분리하고, 여과액을 증발기로 농축시켜서 여과액에 용해된 테트라알킬암모늄 요오드화물을 석출함으로써 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 생성하는 계에 대한 평형을 기울어지게 하여 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질의 나머지 양은 더욱 감소될 수 있다. 여과액의 농도가 충분하지 않고 다량의 용매가 농축물에 남아 있는 경우, 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질이 남아 있게 되어 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 순도가 떨어진다. 따라서, 농축물의 중량은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질의 충전량의 중량으로 2배 미만이 바람직하고, 중량으로 1.6배 미만이 보다 바람직하다.

여과액의 농축물은 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질 이외에 과다하게 사용된 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 함유한다. X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 제거하기 위해, 농축물을 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 용해시키기 어려운 비양성자성 용매에 분산시키고, 불용성 물질을 여과에 의해 분리한다. 여과에 의해 분리된 불용성 물질은 테트라알킬암모늄 요오드화물 및 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염을 함유한다. 이후, 고순도의 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 쉽게 얻을 수 있도록 하기 위해 여과액으로부터 용매를 제거한다. 사용될 수 있는 비양성자성 용매는 예를 들어, 아세톤, 아세토니트릴, 메틸 tert-부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 헥산을 포함하고, 바람직하게는 아세톤 또는 에틸 아세테이트이다.

비양성자성 용매의 사용량에 있어서, 사용량이 너무 적으면 교반이 어렵고, 사용량이 너무 많으면 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 구체적으로, 비양성자성 용매의 사용량은 화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질에 대해, 바람직하게는 중량으로 5배 내지 30배, 보다 바람직하게는 중량으로 10배 내지 20배이다.

화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질은 알킬 요오드화물에 의한 화학식 (3)으로 표시되는 화합물의 4차화에 의해 얻어진다.

화학식 (3)에서, R¹, R², R⁴ 및 R⁵는 각각 화학식 (1) 또는 화학식 (2)에서 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다.

알킬 요오드화물의 사용량에 있어서, 사용량이 너무 적으면 반응이 완료되지 않고, 사용량이 너무 많으면 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 알킬 요오드화물의 사용량은 화학식 (3)으로 표시되는 화합물에 대해, 바람직하게는 1.1 당량 내지 3.0 당량, 보다 바람직하게는 1.2 당량 내지 2.0 당량이다.

4차화에서는 용매가 사용될 수 있다. 사용되는 용매는 알킬 요오드화물 및 화학식 (3)으로 표시되는 화합물을 용해시키고, 반응을 억제하지 않는 한 특별히 제한되지 않는다.

4차화에서의 용매 사용량에 있어서, 사용량이 너무 적으면 교반이 어렵고, 사용량이 너무 많으면 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 용매 사용량은 화학식 (3)으로 표시되는 화합물에 대해, 바람직하게는 중량으로 5배 내지 30배, 보다 바람직하게는 중량으로 8배 내지 20배이다.

4차화의 반응 온도에 있어서, 반응 온도가 너무 낮으면 반응이 진행되지 않고, 반응 온도가 너무 높으면 부반응이 일어나고 원하는 생성물의 수율이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 4차화의 반응 온도는 바람직하게는 0℃ 내지 100℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 70℃이다.

화학식 (3)으로 표시되는 화합물은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올과 지방산의 에스테르화 또는 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올과 이탈기를 갖는 탄화수소의 에테르화에 의해 얻어진다. 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올은 적절하게 합성되거나 시판되고 있는 화합물이 사용될 수 있다. 시판되고 있는 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올은 예를 들어, 3-(디메틸아미노)-1,2-프로판디올, 3-(디에틸아미노)-1,2-프로판디올, 3-(디프로틸아미노)-1,2-프로판디올, 3-피롤리디노-1,2-프로판디올, 3-피페리디노-1,2-프로판디올 및 3-(디페닐아미노)-1,2-프로판디올을 포함하고, 바람직하게는 3-(디메틸아미노)-1,2-프로판디올, 3-(디에틸아미노)-1,2-프로판디올 또는 3-(디프로필아미노)-1,2-프로판디올이고, 보다 바람직하게는 3-(디메틸아미노)-1,2-프로판디올이다.

에스테르화에서 사용되는 지방산의 양에 있어서, 지방산의 양이 너무 많으면, 지방산이 남아서 원하는 생성물의 순도가 떨어진다. 지방산의 양이 너무 적으면, 모노에스테르 본체의 단계에서 반응이 중단되어 원하는 생성물의 순도가 떨어진다. 따라서, 지방산의 사용량은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올에 대해, 바람직하게는 1.9 당량 내지 2.5 당량, 보다 바람직하게는 2.0 당량 내지 2.4 당량이다.

에스테르화에서는 축합제가 사용될 수 있다. 축합제로서는 카르보디이미드 축합제, 우로늄 축합제, 포스포늄 축합제 등이 사용될 수 있고, 높은 반응성 및 높은 가용성의 관점에서 카르보디이미드 축합제가 바람직하다. 카르보디이미드 축합제는 예를 들어, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염을 포함하고, 반응 후 제거의 단순성의 관점에서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염이 바람직하다.

에스테르화에서 사용되는 축합제의 양에 있어서, 축합제의 양이 너무 많으면, 중간 생성물인 산 무수물의 형성이 억제된다. 축합제의 양이 너무 적으면, 원료가 남아서 수율을 감소시킨다. 따라서, 축합제의 사용량은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올에 대해, 바람직하게는 2.0 당량 내지 3.0 당량, 보다 바람직하게는 2.2 당량 내지 2.6 당량이다.

에스테르화에서 사용되는 용매로서는 부산물의 형성을 억제하고 반응 효율을 증가시키는 관점에서 원료의 용해도가 높은 용매가 바람직하다. 또한, 축합제로서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염을 사용하는 경우, 부산물 중 하나인 요소는 물로 세척하여 제거될 수 있기 때문에 물과 친화성이 없는 용매가 바람직하다. 구체적으로, 클로로포름 또는 디클로로메탄이 바람직하다.

에스테르화에서 사용되는 용매의 양에 있어서, 용매의 양이 너무 많으면 생산성이 감소한다. 용매의 양이 너무 적으면 반응 용액의 점도가 증가하여 교반하는 데 어려움을 겪는다. 따라서, 용매의 양은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올에 대해, 바람직하게는 중량으로 30배 내지 120배, 보다 바람직하게는 중량으로 50배 내지 100배이다.

에스테르화의 반응 온도에 있어서, 반응 온도가 너무 낮으면 반응이 진행되지 않고, 반응 온도가 너무 높으면 N-아실우레아가 부산물로 생성되어 수율을 감소시킨다. 구체적으로, 에스테르화의 반응 온도는 바람직하게는 0℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다.

에테르화에서 사용되는 이탈기를 갖는 탄화수소의 양에 있어서, 탄화수소의 양이 너무 많으면, 이탈기를 갖는 탄화수소가 남아 있게 되어 원하는 생성물의 순도가 떨어진다. 탄화수소의 양이 너무 적으면, 모노에테르 본체의 단계에서 반응이 중단되어 원하는 생성물의 순도가 떨어진다. 따라서, 이탈기를 갖는 탄화수소의 사용량은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올에 대해, 바람직하게는 1.9 당량 내지 3.0 당량, 보다 바람직하게는 2.0 당량 내지 2.5 당량이다.

에테르화에서는 촉매로서 염기가 사용된다. 염기로서는 예를 들어, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수소화나트륨 또는 칼륨 tert-부톡시드가 사용될 수 있다. 촉매의 사용량에 있어서, 촉매의 사용량이 너무 적으면 반응이 진행되지 않고, 촉매의 사용량이 너무 많으면 생산성이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 염기의 사용량은 3-(디알킬아미노)-1,2-프로판디올에 대해, 바람직하게는 2.0 당량 내지 15.0 당량, 보다 바람직하게는 5.0 당량 내지 10.0 당량이다.

에테르화에서 사용되는 용매로서는 물과 친화성이 없고 염기에 대해 안정한 용매가 바람직하다. 구체적으로, 헥산 또는 톨루엔이 바람직하고, 헥산이 보다 바람직하다.

에테르화의 반응 온도에 있어서, 반응 온도가 너무 낮으면 반응이 진행되지 않고, 반응 온도가 너무 높으면 부반응이 진행되어 원하는 생성물의 수율이 감소하기 때문에 바람직하지 않다. 구체적으로, 반응 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 120℃, 보다 바람직하게는 60℃ 내지 100℃이다.

실시예

(요오드화 이온 함량 및 염화 이온 함량의 분석 방법)

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 요오드화 이온 함량 및 염화 이온 함량은 예를 들어, 전극으로 은/염화은 전극을 사용하고 적정제로 질산은을 사용하는 전위차 적정법으로 확인할 수 있다. 구체적으로, 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 약 1g을 에탄올 100㎖에 용해시킨다. 상기 용액에 은/염화은 전극을 담그고, 교반기로 교반하면서 질산은 수용액(N/100, N/10)을 첨가함으로써 적정을 수행하여 전위차를 측정한다. 적정량에 대한 전위차를 그래프로 나타내고, 처음 나타난 변곡점(변곡점 1)에서의 적정량으로부터 요오드화 이온 함량을 결정할 수 있고, 변곡점 1에서의 적정량과 제2 변곡점(변곡점 2)에서의 적정량의 차로부터 염화 이온 함량을 결정할 수 있다.

(제조예 1)

N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N-디메틸아민(이하 DODAP)의 제조

120g의 클로로포름에 2.00g(16.78 mmol)의 3-(디메틸아미노)-1,2-프로판디올(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 제품), 9.48g(33.56 mmol)의 올레산(EXTRA OLEIN99, NOF Corp. 제품), 및 0.41g(3.36 mmol)의 4-디메틸아미노피리딘(Koei Chemical Co., Ltd. 제품)을 용해시켰다. 상기 용액에 7.72g(40.27 mmol)의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 제품)을 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 1 시간 후에 혼합물을 120g의 이온 교환수 및 120g의 25 wt% 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 유기층에 3.0g의 무수 황산마그네슘을 첨가한 후 교반하였다. 황산마그네슘을 여과에 의해 분리하고, 증발기로 여과액에서 용매를 제거하여 DODAP(수율: 11.12g, 17.16 mmol)를 얻었다.

(제조예 2)

N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 요오드화물(이하 DOTAP-I)의 제조

30g의 아세톤에 3.00g(4.63 mmol)의 DODAP를 용해시킨 용액에 0.99g(6.94 mmol)의 메틸 요오드화물(Kanto Chemical Co., Inc. 제품)을 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 5시간 후에 석출된 결정들을 여과에 의해 분리하고 건조시켜서 DOTAP-I(수율: 2.94g, 3.72 mmol)를 얻었다.

(제조예 3)

올레일메탄설포네이트(이하 Ole-Ms)의 제조

1,450g의 무수 톨루엔에 290g(1.08 mol)의 올레일 알코올(NOFABLE(등록 상표) AO-99, NOF Corp. 제품)을 용해시킨 용액을 5℃ 내지 10℃까지 냉각시켰다. 상기 용액에 131g(1.30 mol)의 트리에틸아민(Kanto Chemical Co., Inc. 제품)을 첨가하고 10분 동안 5℃ 내지 10℃에서 교반한 후, 136g(1.19 mol)의 메탄설포닐 염화물(Kanto Chemical Co., Inc. 제품)을 한 방울씩 천천히 첨가하였다. 1 시간 동안 5℃ 내지 15℃에서 교반한 후, 석출된 트리에틸아민 염산염을 여과에 의해 분리하고, 여과액을 580g의 이온 교환수로 2회 세척하였다. 유기층에 87g의 무수 황산마그네슘을 첨가하고 교반한 후 여과하였다. 증발기로 여과액에서 용매를 제거하여 Ole-Ms(수율: 335g, 0.97 mol)를 얻었다.

(제조예 4)

N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸아민(이하 DODMA)의 제조

1168g의 헥산에 233g(4.15 mol)의 수산화칼륨(Kanto Chemical Co., Inc. 제품)을 첨가하고, 교반하면서 55g(0.46 mol)의 1,2-프로판디올(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 제품)을 첨가하였다. 그 다음, 320g(0.92 mol)의 Ole-Ms를 첨가한 후 38℃ 내지 42℃에서 교반하였다. 7시간 후에 반응 용액을 15℃까지 냉각시키고 640g의 증류수 및 256g의 아세토니트릴로 3회 세척하였다. 768g의 아세토니트릴로 4회 추가 추출 및 세척 후, 증발기로 상부 층에서 용매를 제거하여 황색 액체를 얻었다. 황색 액체를 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트 = 95/5(v/v) 내지 70/30(v/v))로 정제하여 DODMA(수율: 157g, 0.25 mol)를 얻었다.

(제조예 5)

N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 요오드화물(이하 DOTMA-I)의 제조

30g의 아세톤에 3.00g(4.84 mmol)의 DODMA를 용해시킨 용액에 1.03g (7.26 mmol)의 메틸 요오드화물을 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 3시간 후에 증발기로 반응 용액에서 용매를 제거하여 DOTMA-I(수율: 3.70 g, 4.86 mmol)를 얻었다.

(실시예 1)

N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물(DOTAP-C1)의 제조

20g의 메탄올에 1.39g(12.66 mmol)의 테트라메틸암모늄 염화물(Kanto Chemical Co., Inc. 제품)을 용해시킨 용액에 2.0g(2.53 mmol)의 DOTAP-I를 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 1 시간 후에 석출된 결정들을 여과에 의해 분리하고, 증발기로 여과액을 농축시켰다. 농축물에 20g의 에틸 아세테이트를 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 1 시간 후에 불용성 물질을 여과에 의해 분리하고, 여과액에서 용매를 제거하여 DOTAP-C1(수율: 1.65g, 2.36 mmol)을 얻었다.

(실시예 2)

N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물(DOTMA-C1)의 제조

20g의 메탄올에 1.44g(13.12 mmol)의 테트라메틸암모늄 염화물을 용해시킨 용액에 2.0g(2.63 mmol)의 DOTMA-I를 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 1 시간 후에 석출된 결정들을 여과에 의해 분리하고, 증발기로 여과액을 농축시켰다. 농축물에 20g의 에틸 아세테이트를 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 1 시간 후에 불용성 물질을 여과에 의해 분리하고, 여과액에서 용매를 제거하여 DOTMA-C1(수율: 1.65g, 2.36 mmol)을 얻었다.

(비교예 1)

35㎖의 디클로로메탄에 1.50g(1.90 mmol)의 DOTAP-I를 용해시켰다. 상기 용액에 1N 염산의 메탄올 용액 8㎖를 첨가한 후 20℃ 내지 30℃에서 교반하였다. 또한, 25 wt%의 염화나트륨 수용액 12㎖를 첨가하고 20℃ 내지 30℃에서 교반한 후 유기층을 분리 및 수집하였다. 나머지 수성 층에 4㎖의 디클로로메탄을 첨가한 후 교반하고, 유기층을 수집하여 이전에 수집한 유기층과 혼합하였다. 1N 염산의 메탄올 용액의 첨가부터 일련의 작업을 4회 반복한 후, 수집된 유기층을 25 wt%의 염화나트륨 수용액 18㎖로 세척한 후, 5.0g의 무수 황산나트륨을 첨가하고 교반해준 후 여과하였다. 여과액에서 용매를 제거하여 DOTAP-C1의 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피(클로로포름/메탄올 = 100/0(v/v) 내지 75/25(v/v))로 정제하여 부산물 예를 들어, 지방산을 제거함으로써 DOTAP-C1(수율: 1.26g, 1.80 mmol)을 얻었다.

(DOTAP-C1 또는 DOTMA-C1의 요오드화 이온 함량 및 염화 이온 함량의 분석)

비교예 및 실시예에서 얻어진 DOTAP-C1 또는 DOTMA-C1의 약 1g을 100㎖의 에탄올에 용해시켰다. 용액에 은/염화은 전극을 담그고, 교반기로 교반하면서 질산은 수용액(N/100, N/10)을 첨가함으로써 적정을 수행하여 전위차를 측정하였다. 적정량에 대한 전위차를 그래프로 나타내었고, 변곡점 1에서의 적정량으로부터 요오드화 이온 함량을 결정하였고, 변곡점 1에서의 적정량과 변곡점 2에서의 적정량의 차로부터 염화 이온 함량을 결정하였다.

DOTAP-C1의 분석 결과를 그래프로 나타내었다(도 1, 도 2 및 도 3). 도 1은 실시예 1에서 얻어진 DOTAP-C1의 적정 결과를 나타낸다. 도 2는 실시예 2에서 얻어진 DOTMA-C1의 적정 결과를 나타낸다. 도 3은 비교예 1에서 얻어진 DOTAP-C1의 적정 결과를 나타낸다.

실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 DOTAP-C1 및 DOTMA-C1 각각에 대해서, 요오드화 이온 함량은 적정 시작 직후 변곡점 1에서의 적정량(0.001 mmol 미만)으로부터 매우 적다는 것을 알 수 있다. 또한, 함유된 염화 이온 함량은 변곡점 1에서의 적정량과 변곡점 2에서의 적정량의 차로부터의 이론값과 거의 동일하다는 것을 알 수 있고, 이온 교환이 정량적으로 진행되어 DOTAP-C1 또는 DOTMA-C1을 얻을 수 있음이 확인된다. 염화 이온 순도(요오드화 이온과 염화 이온의 합에 대한 염화 이온의 비율)는 99 mol% 이상이었다.

반면에, 비교예 1에서 얻어진 DOTAP-C1에 대해서는 0.181 mmol의 요오드화 이온이 함유되었고, 염화 이온 순도는 90 mol%이었다(표 1). 전술한 결과들로부터, 본 발명의 제조 방법이 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질의 제조 방법으로서 유용하다는 것이 확인되었다.

특정 실시예들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경예 및 수정예가 이루어질 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다.

본 출원은 2014년 12월 8일에 출원된 일본 특허 출원을 기반으로 하고, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, 본 명세서에서 인용된 모든 참조는 전체로서 통합된다.

Claims

화학식 (1)로 표시되는 양이온성 지질을 유기 용매에서 X^-를 갖는 테트라알킬암모늄염과 혼합하고, 석출된 테트라알킬암모늄 요오드화물을 여과에 의해 분리하여 여과액을 얻은 후, 상기 여과액을 농축시켜서 적어도 테트라알킬암모늄 요오드화물을 석출하고 상기 유기 용매를 제거함으로써 화학식 (2)로 표시되는 양이온성 지질을 얻고,

화학식 (1)
상기 화학식 (1)에서, R¹, R² 및 R³는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, R⁴ 및 R⁵는 각각 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고,

화학식 (2)
상기 화학식 (2)에서, R¹, R² 및 R³는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, R⁴ 및 R⁵는 각각 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 아실기 또는 10개 내지 22개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소기를 나타내고, X^-는 염화 이온, 브롬화 이온, 플루오르화 이온, 아세테이트 이온, 메탄설포네이트 이온 또는 p-톨루엔설포네이트 이온을 나타내는 양이온성 지질을 제조하는 방법.
제1 항에 있어서, 상기 테트라알킬암모늄염은 테트라메틸암모늄염인 양이온성 지질을 제조하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 화학식 (2)의 X^-는 염화 이온인 양이온성 지질을 제조하는 방법.