WO2016093205A1 - カチオン性脂質の製造方法 - Google Patents

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ion
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雅己 太田
健 羽村
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日油株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C213/08—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton by reactions not involving the formation of amino groups, hydroxy groups or etherified or esterified hydroxy groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/06—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the hydroxy groups esterified by carboxylic acids having the esterifying carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cationic lipid.
  • Nucleic acid drugs are attracting attention as next-generation drugs, but carriers are necessary to efficiently introduce nucleic acids into cells.
  • Carriers can be broadly divided into viral carriers and non-viral carriers. Viral carriers have higher nucleic acid introduction efficiency than non-viral carriers, but cannot essentially solve the toxicity problem. Accordingly, non-viral carriers with high safety are attracting attention, although their introduction efficiency is inferior to that of viral carriers.
  • lipid membranes composed of cationic lipids and PEG lipids and carriers using micelles composed of cationic polymers have been reported, but lipid membranes whose functions can be controlled by lipid composition have been reported. Research on the carriers used is particularly active. Among the lipids used in the lipid membrane, the cationic lipid has the most influence on the nucleic acid introduction efficiency.
  • Cationic lipids generally have one quaternary ammonium group and two hydrophobic groups.
  • Representative cationic lipids include N- [1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium Chloride (hereinafter DOTAP-Cl) and N- [1- (2,3-Dioleyloxy). propylene] -N, N, N-trimethylammonium Chloride (hereinafter DOTMA-Cl). These lipids are the most widely used cationic lipids because they have higher nucleic acid introduction efficiency than other known cationic lipids.
  • DOTAP-Cl and DOTMA-Cl can be obtained by introducing an oleoyl group or oleyl group into dimethylaminopropanediol and then quaternizing with methyl chloride (Non-patent Document 1).
  • methyl chloride is a gas at normal temperature and atmospheric pressure, a high-pressure reaction vessel such as an autoclave must be used.
  • methyl chloride is highly toxic, there is a problem that requires special attention for safety in handling and using the equipment.
  • Non-Patent Document 2 an oleoyl group is introduced into dimethylaminopropanediol, and methyl iodide is used to produce N- [1- (2,3-Dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium Ioxide (hereinafter referred to as “N- [1- (2,3-Dioleyloxy) propyl]”).
  • N- [1- (2,3-Dioleyloxy) propyl] N- [1- (2,3-Dioleyloxy) propyl]
  • DOTAP-I iodide ions of DOTAP-I were exchanged for chloride ions in a column packed with an ion exchange resin.
  • Non-Patent Document 2 requires a large amount of ion exchange resin for the obtained lipid. Furthermore, since it is necessary to dilute the concentration of DOTAP-I in the solution for efficient anion exchange, DOTAP-I must be dissolved in a large amount of solvent, and the production scale becomes very large. Moreover, after anion exchange in the ion exchange column, a large amount of solvent must be removed, which is inefficient and industrially undesirable.
  • this method has a low anion exchange rate and has an ester bond in the molecule like DOTAP-Cl, so that impurities such as fatty acids are produced by hydrolysis with an acid.
  • an inefficient purification step such as column purification is required.
  • the method for producing the cationic lipid reported so far is a production method requiring a special production facility or a very inefficient production method including an ion exchange column. An efficient industrial process for producing pure cationic lipids has not been established.
  • An object of the present invention is to provide an industrial method for producing a cationic lipid that does not require special equipment and can efficiently obtain a high-purity cationic lipid.
  • the equilibrium can be tilted to one side by discharging the product out of the reaction system.
  • the reaction proceeds by precipitation of a by-product sodium salt.
  • the present inventors have determined that a cationic lipid represented by formula (1) and a tetraalkylammonium salt having an arbitrary anion are used as an organic solvent. Reaction, the reaction proceeds efficiently by precipitation of tetraalkylammonium iodide produced by anion exchange. After that, the tetraalkylammonium iodide is filtered off and the filtrate is concentrated to exchange the anion. The inventors have found that the rate can be further increased and have completed the present invention.
  • the method for producing a cationic lipid according to the present invention comprises mixing a cationic lipid represented by the formula (1) and a tetraalkylammonium salt having X ⁇ in an organic solvent, and depositing tetraalkyl iodide. After filtering off ammonium and obtaining a filtrate, the filtrate is concentrated to precipitate at least tetraalkylammonium iodide to obtain a cationic lipid represented by the formula (2).
  • R 1 , R 2 and R 3 each represent a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 4 and R 5 each represent an acyl group having 10 to 22 carbon atoms or a hydrocarbon group having 10 to 22 carbon atoms.
  • R 1 , R 2 and R 3 each represent a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 4 and R 5 each represent an acyl group having 10 to 22 carbon atoms or a hydrocarbon group having 10 to 22 carbon atoms
  • X ⁇ represents a chloride ion, bromide ion, fluoride ion, acetate ion, methanesulfonate ion, or p-toluenesulfonate ion.
  • the present invention is extremely useful as an industrial method for producing cationic lipids because it does not require special equipment and can efficiently obtain highly pure cationic lipids.
  • FIG. 1 is a titration result of DOTAP-Cl obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of titration of DOTMA-Cl obtained in Example 2.
  • FIG. 3 is a titration result of DOTAP-Cl obtained in Comparative Example 1.
  • R 1 to R 3 in the formulas (1) and (2) represent a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 1 to R 3 may be linear, branched, or cyclic, and R 1 and R 2 may be bonded to each other to form a ring.
  • R 1 to R 3 may be the same or different.
  • the hydrocarbon group preferably has 1 to 3 carbon atoms, more preferably 1.
  • hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms constituting R 1 to R 3 include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, t-pentyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2,2-dimethylbutyl group 2,3-dimethylbutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, phenyl group and the like.
  • R 1 and R 2 are bonded to each other to form a ring, examples include a tetramethylene group and a pentamethylene group.
  • R 1 to R 3 are preferably a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or an isopropyl group, and more preferably a methyl group.
  • R 4 and R 5 in Formula (1) and Formula (2) each represent an acyl group having 10 to 22 carbon atoms or a hydrocarbon group having 10 to 22 carbon atoms, and may be linear or branched. May be saturated or unsaturated, may be the same, or may be different from each other.
  • the number of carbon atoms of the acyl group or hydrocarbon group is preferably 14 or more, preferably 18 or less, and more preferably 18.
  • Examples of the acyl group having 10 to 22 carbon atoms constituting R 4 and R 5 include a decanoyl group, an undecanoyl group, a dodecanoyl group, a tridecanoyl group, a tetradecanoyl group, a pentadecanoyl group, a hexadecanoyl group, a heptadecanoyl group, an octadecanoyl group, Decanoyl group, nonadecanoyl group, icosanoyl group, heicosanoyl group, docosanoyl group, decenoyl group, undecenoyl group, dodecenoyl group, tridecenoyl group, tetradecenoyl group, pentadecenoyl group, hexadecenoyl group, heptadecenoyl group, octadece
  • Examples of the hydrocarbon group having 10 to 22 carbon atoms constituting R 4 and R 5 include decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, Icosyl group, henicosyl group, docosyl group, decenyl group, undecenyl group, dodecenyl group, tridecenyl group, tetradecenyl group, pentadecenyl group, hexadecenyl group, heptadecenyl group, octadecenyl group, nonadecenyl group, icocenyl group, heicosenyl group, dococenyl group, decocenyl group, decocenyl group , decocenyl group
  • X ⁇ in the formula (2) represents a halide ion other than an iodide ion, a carboxylate ion, or an organic sulfonate ion.
  • Specific examples include chloride ion, bromide ion, fluoride ion, acetate ion, methanesulfonate ion, p-toluenesulfonate ion, and the like, preferably chloride ion and methanesulfonate ion, more preferably. Is a chloride ion.
  • the cationic lipid represented by the formula (2) is obtained by mixing the cationic lipid represented by the formula (1) and a tetraalkylammonium salt having X ⁇ in an organic solvent and performing anion exchange. It is done. Anion exchange is an equilibrium reaction, and the slightly soluble tetraalkylammonium iodide produced as a by-product by the exchange precipitates, so that the equilibrium of the system is inclined to the side where the cationic lipid represented by the formula (2) is generated. Make it go.
  • X - tetraalkyl ammonium salt having an X - is, X cationic lipids of Formula (2) - are the same as.
  • the alkyl group of the tetraalkylammonium salt has 1 to 4 carbon atoms, preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • X - is the tetraalkyl ammonium salt with, tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium bromide, tetramethylammonium fluoride, tetramethylammonium acetate, tetramethylammonium methanesulfonate, tetramethylammonium p- toluenesulfonate, tetraethylammonium chloride , Tetraethylammonium bromide, tetraethylammonium fluoride, tetraethylammonium acetate, tetraethylammonium methanesulfonate, tetraethylammonium p-toluenesulfonate, tetrapropylammonium chloride, tetrapropylammonium bromide, tetrapropylammonium fluoride, tetraprop
  • tetramethylammonium chloride Preferably tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium bromide, tetramethylammonium fluoride, tetramethylammonium acetate, tetramethylammonium methanesulfonate, tetramethylammonium p-toluenesulfonate, tetraethylammonium chloride, tetraethylammonium bromide, fluoride Tetraethylammonium, tetraethylammonium acetate, tetra Chill ammonium methanesulfonate, a tetraethylammonium p- toluenesulfonate, and more preferably tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium bromide, tetramethylammonium fluoride, tetramethylammonium methanesulf
  • X - amount of tetraalkylammonium salt having X ⁇ is too small, the yield of the cationic lipid represented by the formula (2) decreases. If too much X - amount of the solvent for dissolving the tetra-alkyl ammonium salt is increased with not preferable to lower the productivity. Therefore, X - amount of tetraalkylammonium salt having preferably 1.5 to 10.0 moles amount with respect to the cationic lipids of Formula (1), more 2.0 to 5.0 equivalents preferable.
  • the organic solvent used in the anion exchange step of this production method is preferably a protic polar solvent for the purpose of increasing the dissociation degree of the cationic lipid or tetraalkylammonium salt represented by the formula (1).
  • a protic polar solvent for the purpose of increasing the dissociation degree of the cationic lipid or tetraalkylammonium salt represented by the formula (1).
  • lower alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, isobutanol and tert-butanol are preferable, and ethanol is more preferable.
  • the amount of the organic solvent used in the anion exchange step of this production method is preferably 5 to 30 times by weight and more preferably 10 to 20 times by weight with respect to the cationic lipid represented by the formula (1).
  • the reaction temperature in this production method is not particularly limited as long as the cationic lipid represented by the formula (1) and the tetraalkylammonium salt having X ⁇ can be dissolved in an organic solvent. 120 ° C., preferably 10 to 60 ° C.
  • the cationic lipid represented by the formula (1) and the tetraalkylammonium salt having X 2 - are reacted in an organic solvent, and the precipitated tetraalkylammonium iodide is then filtered off.
  • the weight of the concentrate is preferably 2 times by weight or less, more preferably 1.6 times by weight or less of the charged amount of the cationic lipid represented by the formula (1).
  • the filtrate concentrate contains a tetraalkylammonium salt having X ⁇ used in excess.
  • the concentrate is dispersed in an aprotic solvent in which the tetraalkylammonium salt having X ⁇ is difficult to dissolve, and the insoluble matter is filtered off.
  • the insoluble matter separated by filtration contains a tetraalkylammonium salt having X ⁇ and a tetraalkylammonium iodide.
  • the cationic lipid represented by the high purity formula (2) can be easily obtained.
  • aprotic solvents examples include acetone, acetonitrile, methyl-t-butyl ether, ethyl acetate, chloroform, hexane, and the like, and acetone and ethyl acetate are preferred.
  • the use amount of the aprotic solvent is preferably 5 to 30 times by weight and more preferably 10 to 20 times by weight with respect to the cationic lipid represented by the formula (1).
  • the cationic lipid represented by the formula (1) is obtained by quaternization of the compound represented by the formula (3) with an alkyl iodide.
  • the amount of alkyl iodide used is preferably 1.1 to 3.0 equivalents, more preferably 1.2 to 2.0 equivalents, relative to the compound represented by formula (3).
  • a solvent can be used in the quaternization.
  • the solvent used is not particularly limited as long as the compound represented by the formula (3) and alkyl iodide are dissolved and do not inhibit the reaction.
  • the amount of the solvent used in the quaternization is preferably 5 to 30 times by weight and more preferably 8 to 20 times by weight with respect to the compound represented by the formula (3).
  • the quaternization reaction temperature is preferably 0 to 100 ° C, more preferably 20 to 70 ° C.
  • the compound represented by the formula (3) is obtained by esterification of 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol with a fatty acid or etherification with a hydrocarbon having a leaving group.
  • 3- (Dialkylamino) -1,2-propanediol may be appropriately synthesized or commercially available.
  • 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol includes 3- (dimethylamino) -1,2-propanediol, 3- (diethylamino) -1,2-propanediol, 3- ( Dipropylamino) -1,2-propanediol, 3-pyrrolidino-1,2-propanediol, 3-piperidino-1,2-propanediol, 3- (diphenylamino) -1,2-propanediol
  • 3- (dimethylamino) -1,2-propanediol, 3- (diethylamino) -1,2-propanediol, 3- (dipropylamino) -1,2-propanediol, and more 3- (Dimethylamino) -1,2-propanediol is preferred.
  • the amount of the fatty acid used in the esterification is preferably 1.9 to 2.5 equivalents, more preferably 2.0 to 2.4 equivalents, relative to 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol.
  • a condensing agent may be used for esterification.
  • a carbodiimide condensing agent a uronium condensing agent, a phosphonium condensing agent, and the like can be used, and a carbodiimide condensing agent is preferable because of its high reactivity and high availability.
  • the carbodiimide-based condensing agent include N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, N, N′-diisopropylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, and the like. From the viewpoint of simplicity, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride is preferable.
  • the amount of the condensing agent used in the esterification is preferably 2.0 to 3.0 equivalents, more preferably 2.2 to 2.6 equivalents, relative to 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol.
  • the solvent used in esterification is preferably a solvent having high raw material solubility from the viewpoint of enhancing reaction efficiency and suppressing the formation of by-products.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride is used as a condensing agent, urea, which is one of by-products, can be removed by washing with water. Those that do not are preferred. Specifically, chloroform, dichloromethane and the like are preferable.
  • the amount of the solvent used in the esterification is preferably 30 to 120 times by weight, more preferably 50 to 100 times by weight with respect to 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol.
  • the esterification reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C, and more preferably 10 to 30 ° C.
  • the amount of the hydrocarbon having a leaving group used in etherification is preferably 1.9 to 3.0 equivalents, more preferably 2.0 to 2.5 equivalents, relative to 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol. preferable.
  • a base is used as a catalyst.
  • the base potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium hydride, potassium t-butoxy and the like can be used. If the amount used is too small, the reaction does not proceed, and if it is too large, the productivity decreases, which is not preferable. Therefore, the amount of the base used is preferably 2.0 to 15.0 equivalents, more preferably 5.0 to 10.0 equivalents, relative to 3- (dialkylamino) -1,2-propanediol.
  • a solvent that is stable to a base and incompatible with water is preferable.
  • hexane and toluene are preferable, and hexane is more preferable.
  • the etherification reaction temperature is too low, the reaction does not proceed, and if it is too high, the side reaction proceeds and the yield of the target product decreases, which is not preferable. Specifically, 40 to 120 ° C is preferable, and 60 to 100 ° C is more preferable.
  • the amount of iodide ion and chloride ion in the cationic lipid represented by the formula (2) obtained by this production method is, for example, a potential difference using a silver / silver chloride electrode as an electrode and silver nitrate as a titrant. It can be confirmed by a titration method. Specifically, about 1 g of the cationic lipid represented by the formula (2) is dissolved in 100 ml of ethanol. A silver / silver chloride electrode is immersed in the solution, titrated with an aqueous silver nitrate solution (N / 100, N / 10) while stirring with a stirrer, and the potential difference is measured.
  • the potential difference with respect to the titration amount was plotted, and the iodide ion amount was determined from the titration amount at the inflection point 1, and the chloride ion amount was determined from the difference between the titration amount at the inflection point 2 and the titration amount at the inflection point 1.
  • FIG. 1 is a titration result of DOTAP-Cl obtained in Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of titration of DOTMA-Cl obtained in Example 2.
  • FIG. 3 is a titration result of DOTAP-Cl obtained in Comparative Example 1.
  • the amount of iodide ion was found to be extremely small from the titration amount at inflection point 1 (less than 0.001 mmol) immediately after the start of titration. . Furthermore, the difference between the titration amount at the inflection point 2 and the titration amount at the inflection point 1 reveals that the amount of chloride ions is included in almost the same amount as the theoretical value, and ion exchange proceeds quantitatively, and DOTAP It was confirmed that —Cl or DOTMA-Cl was obtained. Chloride ion purity (ratio of chloride ions to the sum of iodide ions and chloride ions) was 99 mol% or more.
  • the DOTAP-Cl obtained in Comparative Example 1 contained 0.181 mmol of iodide ions, and the chloride ion purity was 90 mol% (Table 1). From the above results, it was confirmed that this production method is useful as a production method of the cationic lipid represented by the formula (2).

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Abstract

　特殊な設備を必要とせず、高純度なカチオン性脂質を効率的に得ることができる、工業的なカチオン性脂質の製造方法を提供する。下記式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、析出したヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別したろ液を濃縮することでヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、下記式（２）で表されるカチオン性脂質を得る。

Description

カチオン性脂質の製造方法
　本発明は、カチオン性脂質の製造方法に関する。
　核酸医薬品は次世代の医薬品として注目されているが、核酸を細胞内に効率良く導入するためには、キャリアが必要である。キャリアは大きく分けてウイルスキャリアと非ウイルスキャリアに分けられる。ウイルスキャリアは非ウイルスキャリアに比べて核酸の導入効率が高いが、毒性の問題を本質的に解決できない。そこで、ウイルスキャリアよりも導入効率は劣るものの、安全性が高い非ウイルスキャリアが注目されている。
 非ウイルスキャリアには、カチオン性脂質やPEG脂質などからなる脂質膜を用いたキャリアやカチオン性ポリマーからなるミセルを用いたキャリアが報告されているが、脂質の組成によって機能を制御できる脂質膜を用いたキャリアの研究が、特に盛んに行われている。脂質膜に使用される脂質の中で、核酸の導入効率に最も影響を与えるのが、カチオン性脂質である。
 カチオン性脂質は、一般的に一つの四級アンモニウム基と二本の疎水基を有している。代表的なカチオン性脂質としてはＮ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ－Ｃｌ）とＮ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＤＯＴＭＡ－Ｃｌ）が挙げられる。これらの脂質は、他の公知のカチオン性脂質と比較して、核酸の導入効率が高いため、最も汎用されているカチオン性脂質である。
　ＤＯＴＡＰ－Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ－Ｃｌは、ジメチルアミノプロパンジオールにオレオイル基もしくはオレイル基を導入した後、塩化メチルで四級化させることで得られる（非特許文献１）。しかしながら、塩化メチルは常温・大気圧下で気体であるため、オートクレーブのような高圧反応容器を使用しなければならない。さらに、塩化メチルは強毒性であるために、その取扱いや使用する装置に、安全上の特段の留意を要する難点がある。
　上記の理由から、塩化メチルを使用しないＤＯＴＡＰ－Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ－Ｃｌの製造方法が開発され、報告されている。非特許文献２では、ジメチルアミノプロパンジオールにオレオイル基を導入し、ヨウ化メチルを使用してＮ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ－Ｉ）を合成した後、イオン交換樹脂を充填したカラムでＤＯＴＡＰ－Ｉのヨウ化物イオンを塩化物イオンに交換している。
　しかし、非特許文献２記載の方法は、得られる脂質に対して大量のイオン交換樹脂が必要となる。さらに、効率的なアニオン交換を行うには溶液のＤＯＴＡＰ－Ｉの濃度を希薄にする必要があるため、ＤＯＴＡＰ－Ｉを大量の溶媒に溶解しなければならず、製造スケールが非常に大きくなる。しかも、イオン交換カラムでのアニオン交換後は大量の溶媒を除去しなければならず、非効率的であり工業的に好ましくない。
　そこで、特許文献１では、Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ＩｏｄｉｄｅやＮ－［１－（２，３－Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅのジクロロメタン溶液に、1Ｎ塩酸のメタノール溶液を加えて攪拌して、食塩水による水洗を行うという操作を４回繰り返すことでアニオン交換を行っている。しかし、この方法はアニオン交換率が低い上に、ＤＯＴＡＰ－Ｃｌのように分子内にエステル結合を有している場合には酸による加水分解で脂肪酸等の不純物が生じるため、医薬品として求められる純度のものを得るためには、カラム精製等の非効率的な精製工程が必要となる。
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８４，７４１３（１９８７） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２９９，２８１（１９９８）
日本国特開２０１４－１３２０１４号公報
　以上述べてきたように、これまでに報告されている前記カチオン性脂質の製造方法は、特殊な製造設備を要する製法か、もしくはイオン交換カラムをはじめとする極めて非効率的な製法であり、高純度なカチオン性脂質の効率的な工業的製法は確立されていなかった。
　本発明の課題は、特殊な設備を必要とせず、高純度なカチオン性脂質を効率的に得ることができる、工業的なカチオン性脂質の製造方法を提供することである。
　一般的な平衡反応では、生成物を反応系外へ排出することで、平衡を一方へ傾けることができる。例えば、種々のハロゲン化アルキルからヨウ化アルキルを得るフィンケルシュタイン反応では、副生するナトリウム塩が析出することで反応が進行する。
　そこで、本発明者らは、アニオン交換が平衡反応であることに着目し鋭意研究を重ねた結果、式（１）で表されるカチオン性脂質と任意のアニオンを有するテトラアルキルアンモニウム塩を有機溶媒中で反応させると、アニオン交換により生じたヨウ化テトラアルキルアンモニウムが析出することで効率的に反応が進行し、さらにその後、ヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を濃縮することで、アニオン交換率をより高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係るカチオン性脂質の製造方法は、式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、析出したヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を得た後、前記ろ液を濃縮することで少なくともヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式（１）において、
　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、炭素数1～６の炭化水素基を示し、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、炭素数１０～２２のアシル基または炭素数１０～２２の炭化水素基を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式（２）において、
　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、炭素数1～６の炭化水素基を示し、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、炭素数１０～２２のアシル基または炭素数１０～２２の炭化水素基を示し、
　Ｘ－は、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、またはｐ－トルエンスルホン酸イオンを示す。）
　本発明は、特殊な設備を必要とせず、高純度なカチオン性脂質を効率的に得ることができるため、工業的なカチオン性脂質の製造方法として極めて有用である。
図１は、実施例１で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌの滴定結果である。 図２は、実施例２で得られたＤＯＴＭＡ－Ｃｌの滴定結果である。 図３は、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌの滴定結果である。
　式（１）および式（２）におけるＲ１～Ｒ３は、炭素数１～６の炭化水素基を表す。Ｒ１～Ｒ３は、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、環状であってもよく、Ｒ１、Ｒ２が相互に結合し環を形成していてもよい。また、Ｒ１～Ｒ３は、同一であってもそれぞれ異なっていてもよい。該炭化水素基の炭素数は、好ましくは１～３であり、より好ましくは１である。
　Ｒ１～Ｒ３を構成する炭素数１～６の炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ－ペンチル基、１，２－ジメチルプロピル基、２－メチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２，２－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基等があげられる。Ｒ１とＲ２が相互に結合し環を形成している場合は、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等が挙げられる。Ｒ１～Ｒ３は、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
　式（１）および式（２）におけるＲ４、Ｒ５は、炭素数１０～２２のアシル基もしくは炭素数１０～２２の炭化水素基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても、飽和であっても不飽和であってもよく、同一であってもよく、それぞれ異なっていてもよい。該アシル基もしくは炭化水素基の炭素数は、好ましくは１４以上であり、また好ましくは１８以下であり、より好ましくは１８である。
　Ｒ４、Ｒ５を構成する炭素数１０～２２のアシル基としては、デカノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、ヘンイコサノイル基、ドコサノイル基、デセノイル基、ウンデセノイル基、ドデセノイル基、トリデセノイル基、テトラデセノイル基、ペンタデセノイル基、ヘキサデセノイル基、ヘプタデセノイル基、オクタデセノイル基、ノナデセノイル基、イコセノイル基、ヘンイコセノイル基、ドコセノイル基、デカジエノイル基、ウンデカジエノイル基、ドデカジエノイル基、トリデカジエノイル基、テトラデカジエノイル基、ペンタデカジエノイル基、ヘキサデカジエノイル基、ヘプタデカジエノイル基、オクタデカジエノイル基、ノナデカジエノイル基、イコサジエノイル基、ヘンイコサジエノイル基、ドコサジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、イソステアリル基、テトラメチルヘキサデセニル基（フィトール残基）等が挙げられるが、好ましくはテトラデカノイル基、テトラデセノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘキサデセノイル基、オクタデカノイル基、オクタデセノイル基、オクタデカジエノイル基であり、より好ましくはオクタデカノイル基、オクタデセノイル基、オクタデカジエノイル基である。
　Ｒ４、Ｒ５を構成する炭素数１０～２２の炭化水素基としては、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、デカジエニル基、ウンデカジエニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、テトラメチルヘキサデセニル基（フィトール残基）等が挙げられるが、好ましくはテトラデシル基、テトラデセニル基、ヘキサデシル基、ヘキサデセニル基、オクタデシル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基であり、より好ましくはオクタデシル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基である。
　式（２）におけるＸ－は、ヨウ化物イオン以外のハロゲン化物イオン、カルボキシレートイオン、または有機スルホネートイオンを表す。具体的には塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ－トルエンスルホン酸イオン等が挙げられるが、好ましくは塩化物イオン、メタンスルホン酸イオンであり、より好ましくは塩化物イオンである。
　式（２）で表されるカチオン性脂質は、式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、アニオン交換を行うことによって得られる。アニオン交換は平衡反応であり、交換によって副生させた難溶性のヨウ化テトラアルキルアンモニウムが析出することによって、系の平衡を、式（２）で表されるカチオン性脂質が生成する側に傾かせる。Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩のＸ－は、式（２）で表されるカチオン性脂質のＸ－と同じである。
　本製造方法のアニオン交換の工程で使用するＸ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩としては、結合しているアルキル基の炭素数が大きすぎると、副生するヨウ化テトラアルキルアンモニウムが反応で使用する有機溶媒に溶解し易くなることで、平衡が傾き難くなるために、式（２）で表されるカチオン性脂質の生成量が低下する。このため、該テトラアルキルアンモニウム塩のアルキル基の炭素数は１～４であり、好ましくは１～２であり、より好ましくは１である。
　Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩としては、塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネート、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラエチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネート、塩化テトラプロピルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、フッ化テトラプロピルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウムアセテート、テトラプロピルアンモニウムメタンスルホネート、テトラプロピルアンモニウムｐ－トルエンスルホネート、塩化テトラブチルアンモニウム、臭化テトラブチルアンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウムアセテート、テトラブチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラブチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネート等が挙げられるが、好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムアセテート、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネート、塩化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラエチルアンモニウム、フッ化テトラエチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムアセテート、テトラエチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラエチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネートであり、より好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモニウム、フッ化テトラメチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウムメタンスルホネート、テトラメチルアンモニウムｐ－トルエンスルホネートである。
　Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩の使用量は、少なすぎると、式（２）で表されるカチオン性脂質の収率が低下する。多すぎるとＸ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩を溶解するための溶媒量が増加し、生産性が低下するため好ましくない。よって、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩の使用量は、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して１．５～１０．０当量が好ましく、２．０～５．０当量がより好ましい。
　本製造方法のアニオン交換の工程で使用する有機溶媒は、式（１）で表されるカチオン性脂質やテトラアルキルアンモニウム塩のイオンの解離度を高める目的からプロトン性極性溶媒が好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール等の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。
　本製造方法のアニオン交換の工程で使用する有機溶媒の使用量は、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。有機溶媒の使用量は、具体的には、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して５～３０重量倍が好ましく、１０～２０重量倍がより好ましい。
　本製造方法における反応温度は、式（１）で表されるカチオン性脂質とＸ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩が有機溶媒に溶解しうる温度であれば特に限定されないが、一般的には０～１２０℃であり、好ましくは１０～６０℃である。
　本製造方法では、式（１）で表されるカチオン性脂質とＸ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩を有機溶媒中で反応させた後、析出しているヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮することで、ろ液中に溶解しているヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、平衡を式（２）で表されるカチオン性脂質の生成系へ傾け、式（１）で表されるカチオン性脂質の残存量をさらに低減することができる。ろ液の濃縮が不十分で、濃縮物中に溶媒が大量に残存していると、式（１）で表されるカチオン性脂質が残存し、式（２）で表されるカチオン性脂質の純度が低下する。よって濃縮物の重量としては、式（１）で表されるカチオン性脂質の仕込み量の２重量倍以下が好ましく、１．６重量倍以下がより好ましい。
　ろ液の濃縮物には、式（２）で表されるカチオン性脂質の他に、過剰に使用したＸ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩が含まれている。これを除去するためには、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩が溶解し難い非プロトン性溶媒に濃縮物を分散させ、不溶物をろ別する。このろ別された不溶物中には、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩とヨウ化テトラアルキルアンモニウムとが含まれている。次いで、このろ液を脱溶剤することで、容易に高純度の式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることができる。使用できる非プロトン性溶媒としてはアセトン、アセトニトリル、メチル－ｔ－ブチルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン等が挙げられるが、好ましくはアセトン、酢酸エチルである。
　非プロトン性溶媒の使用量としては、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。非プロトン性溶媒の使用量は、具体的には、式（１）で表されるカチオン性脂質に対して５～３０重量倍が好ましく、１０～２０重量倍がより好ましい。
　式（１）で表されるカチオン性脂質は、式（３）で表される化合物の、ヨウ化アルキルによる四級化によって得られる。
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（式（３）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５は式（１）、式（２）と同じである。）
　ヨウ化アルキルの使用量は、少なすぎると反応が完結せず、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって、ヨウ化アルキルの使用量は、式（３）で表される化合物に対して１．１～３．０当量が好ましく、１．２～２．０当量がより好ましい。
　四級化の際は溶媒を使用することができる。使用される溶媒としては、式（３）で表される化合物とヨウ化アルキルが溶解し、反応を阻害しないものであれば、特に限定されない。
　四級化の際の溶媒の使用量は、少なすぎると攪拌が困難になり、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって溶媒の使用量は、式（３）で表される化合物に対して５～３０重量倍が好ましく、８～２０重量倍がより好ましい。
　四級化の反応温度は、低すぎると反応が進行せず、高すぎると副反応が起き目的物の収率が低下するため好ましくない。よって、四級化の反応温度は、０～１００℃が好ましく、２０～７０℃がより好ましい。
　式（３）で表される化合物は、３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールと、脂肪酸とのエステル化、もしくは脱離基を有する炭化水素とのエーテル化によって得られる。３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールは適宜合成してもよいし、市販されているものを用いてもよい。市販されている３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールとしては、３－（ジメチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－（ジエチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－（ジプロピルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－ピロリジノ－１，２－プロパンジオール、３－ピペリジノ－１，２－プロパンジオール、３－（ジフェニルアミノ）－１，２－プロパンジオール等が挙げられるが、好ましくは３－（ジメチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－（ジエチルアミノ）－１，２－プロパンジオール、３－（ジプロピルアミノ）－１，２－プロパンジオールであり、より好ましくは３－（ジメチルアミノ）－１，２－プロパンジオールである。
　エステル化で使用する脂肪酸の量は、多すぎると脂肪酸が残存し、目的物純度が低下してしまう。少なすぎると反応がモノエステル体で停止してしまい、目的物純度が低下してしまう。よって、脂肪酸の使用量は３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールに対して１．９～２．５当量が好ましく、２．０～２．４当量がより好ましい。
　エステル化には縮合剤を使用してもよい。縮合剤としてはカルボジイミド系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤などが使用できるが、反応性と入手性の高さからカルボジイミド系縮合剤が好ましい。カルボジイミド系縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、反応後の除去の簡便さから１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩が好ましい。
　エステル化で使用する縮合剤の量は、多すぎると中間体である酸無水物の生成を阻害する。少なすぎると原料が残存し、収率が低下する。よって縮合剤の使用量は３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールに対して２．０～３．０当量が好ましく、２．２～２．６当量がより好ましい。
　エステル化で使用する溶媒としては、反応効率を高めて、副生成物の生成を抑制できる観点から原料の溶解度が高いものが好ましい。また、縮合剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩を使用した場合、副生成物の一つであるウレアが水洗で除去可能であることから、水と相溶しないものが好ましい。具体的にはクロロホルム、ジクロロメタン等が好ましい。
　エステル化で使用する溶媒の量は、多すぎると生産性が低下する。少なすぎると反応溶液の粘度が上昇し攪拌が困難になる。よって、３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールに対して３０～１２０重量倍が好ましく、５０～１００重量倍がより好ましい。
　エステル化の反応温度は、低すぎると反応が進行せず、高すぎるとＮ－アシルウレアが副生し、収率が低下する。エステル化の反応温度は、具体的には、０～４０℃が好ましく、１０～３０℃がより好ましい。
　エーテル化で使用する脱離基を有する炭化水素の使用量は、多すぎると脱離基を有する炭化水素が残存し、目的物純度が低下してしまう。少なすぎると反応がモノエーテル体で停止してしまい、目的物純度が低下してしまう。よって、脱離基を有する炭化水素の使用量は３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールに対して１．９～３．０当量が好ましく、２．０～２．５当量がより好ましい。
　エーテル化には触媒として塩基を使用する。塩基としては水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、t-ブトキシカリウムなどが使用できる。使用量は少なすぎると反応が進行せず、多すぎると生産性が低下するため好ましくない。よって、塩基の使用量は、３－（ジアルキルアミノ）－１，２－プロパンジオールに対して２．０～１５．０当量が好ましく、５．０～１０．０当量がより好ましい。
　エーテル化で使用する溶媒としては、塩基に対して安定で水と相溶しないものが好ましい。具体的にはヘキサン、トルエンが好ましく、ヘキサンがより好ましい。
　エーテル化の反応温度としては、低すぎると反応が進行せず、高すぎると副反応が進行し、目的物の収量が低下するため好ましくない。具体的には４０～１２０℃が好ましく、６０～１００℃がより好ましい。
（ヨウ化物イオン量と塩化物イオン量の分析方法）
　本製造方法によって得られた式（２）で表されるカチオン性脂質中のヨウ化物イオン量と塩化物イオン量は、例えば電極として銀／塩化銀電極を用い、滴定液として硝酸銀を用いた電位差滴定法によって確認することができる。具体的には、式（２）で表されるカチオン性脂質約１ｇをエタノール１００ｍｌに溶解する。その溶液に銀／塩化銀電極を浸して、スターラーで攪拌しながら硝酸銀水溶液（Ｎ／１００、Ｎ／１０）で滴定し、電位差を測定する。滴定量に対する電位差をプロットして、最初に表れる変曲点（変曲点１）の滴定量からヨウ化物イオン量を、二つ目の変曲点（変曲点２）の滴定量と変曲点１の滴定量の差から塩化物イオン量を求めることができる。
（製造例１）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（以下ＤＯＤＡＰ）の製造
　３－（ジメチルアミノ）－１，２－プロパンジオール２．００ｇ（１６．７８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）、オレイン酸９．４８ｇ（３３．５６ｍｍｏｌ、日油株式会社品「ＥＸＴＲＡ　ＯＬＥＩＮ９９」）、４－ジメチルアミノピリジン０．４１ｇ（３．３６ｍｍｏｌ、広栄化学工業株式会社品）をクロロホルム１２０ｇに溶解した。そこに１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩７．７２ｇ（４０．２７ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）を加えて、２０～３０℃で攪拌した。１時間後、イオン交換水１２０ｇと２５ｗｔ％食塩水１２０ｇで水洗し、有機層に無水硫酸マグネシウム３．０ｇを加えて攪拌した。硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液をエバポレーターで脱溶剤してＤＯＤＡＰを得た（収量：１１．１２ｇ、１７．１６ｍｍｏｌ）。
（製造例２）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＡＰ－Ｉ）の製造
　ＤＯＤＡＰ３．００ｇ（４．６３ｍｍｏｌ）をアセトン３０ｇに溶解し、そこに、ヨウ化メチル０．９９ｇ（６．９４ｍｍｏｌ、関東化学株式会社品）を加え、２０～３０℃で攪拌した。５時間後、析出している結晶をろ別、乾燥してＤＯＴＡＰ－Ｉを得た(収量：２．９４ｇ、３．７２ｍｍｏｌ)。
（製造例３）
　Ｏｌｅｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（以下Ｏｌｅ－Ｍｓ）の製造
オレイルアルコール２９０ｇ（１．０８ｍｏｌ、日油株式会社品「ＮＯＦＡＢＬＥ（登録商標）　ＡＯ－９９」）を脱水トルエン１４５０ｇに溶解し、５～１０℃まで冷却した。そこにトリエチルアミン１３１ｇ（１．３０ｍｏｌ、関東化学株式会社品）を加えて５～１０℃で１０分攪拌した後、塩化メタンスルホニル１３６ｇ（１．１９ｍｏｌ、関東化学株式会社品）をゆっくり滴下した。５～１５℃で１時間攪拌した後、析出しているトリエチルアミン塩酸塩をろ別し、ろ液をイオン交換水５８０ｇで２回水洗した。有機層に無水硫酸マグネシウム８７ｇを加えて攪拌した後、ろ過し、ろ液をエバポレーターで脱溶剤してＯｌｅ－Ｍｓを得た（収量：３３５ｇ、０．９７ｍｏｌ）。
（製造例４）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（以下ＤＯＤＭＡ）の製造
　水酸化カリウム２３３ｇ（４．１５ｍｏｌ、関東化学株式会社品）をヘキサン１１６８ｇに加え、攪拌しながら３－（ジメチルアミノ）１，２－プロパンジオール５５ｇ（０．４６ｍｏｌ、東京化成工業株式会社品）を加えた。さらに、Ｏｌｅ－Ｍｓ３２０ｇ（０．９２ｍｏｌ）を加え、３８～４２℃で攪拌した。７時間後、反応液を１５℃まで冷却し、蒸留水６４０ｇとアセトニトリル２５６ｇで３回水洗した。さらにアセトニトリル７６８ｇで４回抽出洗浄した後、上層をエバポレーターで脱溶剤して黄色液体を得た。この黄色液体をシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９５／５～７０／３０（ｖ／ｖ））によって精製し、ＤＯＤＭＡを得た（収量：１５７ｇ、０．２５ｍｏｌ）。
（製造例５）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（以下ＤＯＴＭＡ－Ｉ）の製造
　ＤＯＤＭＡ３．００ｇ（４．８４ｍｍｏｌ）をアセトン３０ｇに溶解し、そこに、ヨウ化メチル１．０３ｇ（７．２６ｍｍｏｌ）を加え、２０～３０℃で攪拌した。３時間後、反応溶液をエバポレーターで脱溶剤し、ＤＯＴＭＡ－Ｉを得た(収量：３．７０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ)。
（実施例１）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＴＡＰ－Ｃｌ）の製造
　テトラメチルアンモニウムクロリド１．３９ｇ（１２．６６ｍｍｏｌ、関東化学株式会社品）をエタノール２０ｇに溶解し、ＤＯＴＡＰ－Ｉ２．０ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を加え、２０～３０℃で攪拌した。１時間後、析出している結晶をろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮物に酢酸エチル２０ｇを加え、２０～３０℃で攪拌した。１時間後、不溶物をろ別し、ろ液を脱溶剤してＤＯＴＡＰ－Ｃｌを得た（収量：１．６５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）。
（実施例２）
　Ｎ－［１－（２，３－Ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＴＭＡ－Ｃｌ）の製造
　テトラメチルアンモニウムクロリド１．４４ｇ（１３．１２ｍｍｏｌ）をエタノール２０ｇに溶解し、ＤＯＴＭＡ－Ｉ　２．０ｇ（２．６３ｍｍｏｌ）を加え２０～３０℃で攪拌した。１時間後、析出している結晶をろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。濃縮物に酢酸エチル２０ｇを加え、２０～３０℃で攪拌した。１時間後、不溶物をろ別し、ろ液を脱溶剤してＤＯＴＭＡ－Ｃｌを得た（収量：１．６５ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）。
（比較例１）
　ＤＯＴＡＰ－Ｉ　１．５０ｇ（１．９０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３５ｍｌに溶解した。そこに、１Ｎ塩酸のメタノール溶液を８ｍｌ加え、２０～３０℃で攪拌した。さらに２５ｗｔ％食塩水を１２ｍｌ加え、２０～３０℃で攪拌した後、有機層を分離回収した。残った水層にジクロロメタン４ｍｌを加え攪拌し、回収した有機層を先の有機層に混合した。この１Ｎ塩酸のメタノール溶液を加えてからの一連の操作を４回繰り返した後、回収した有機層を２５ｗｔ％食塩水１８ｍｌで水洗し、無水硫酸ナトリウム５．０ｇを加え攪拌した後、ろ過、脱溶剤してＤＯＴＡＰ－Ｃｌの粗体を得た。粗体を、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１００／０～７５／２５（ｖ／ｖ））で精製し、脂肪酸等の副生物を除去してＤＯＴＡＰ－Ｃｌを得た（収量：１．２６ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）。
　（ＤＯＴＡＰ－ＣｌまたはＤＯＴＭＡ－Ｃｌ中のヨウ化物イオン量と塩化物イオン量の分析）
　実施例または比較例で得られたＤＯＴＡＰ－ＣｌまたはＤＯＴＭＡ－Ｃｌ約１ｇをエタノール１００ｍｌに溶解した。その溶液に銀／塩化銀電極を浸して、スターラーで攪拌しながら硝酸銀水溶液（Ｎ／１００、Ｎ／１０）で滴定し、電位差を測定した。滴定量に対する電位差をプロットして、変曲点１の滴定量からヨウ化物イオン量を、変曲点２の滴定量と変曲点１の滴定量の差から塩化物イオン量を求めた。
　ＤＯＴＡＰ－Ｃｌの分析結果をプロットした(図１、２、３)。図１は、実施例１で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌの滴定結果である。図２は、実施例２で得られたＤＯＴＭＡ－Ｃｌの滴定結果である。図３は、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌの滴定結果である。
　実施例１、２で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌ、ＤＯＴＭＡ－Ｃｌについては、滴定開始直後の変曲点1の滴定量（０．００１ｍｍｏｌ未満）から、ヨウ化物イオンの量が極めて少ないことが分かった。さらに変曲点2の滴定量と変曲点１の滴定量の差から、塩化物イオンの量が理論値とほぼ同量含まれていることが分かり、イオン交換が定量的に進行し、ＤＯＴＡＰ－Ｃｌ、またはＤＯＴＭＡ－Ｃｌが得られていることが確認できた。塩化物イオン純度（ヨウ化物イオンと塩化物イオンの和に対する塩化物イオンの割合）は９９ｍｏｌ％以上であった。
　一方、比較例１で得られたＤＯＴＡＰ－Ｃｌについては、ヨウ化物イオンが０．１８１ｍｍｏｌ含まれており、塩化物イオン純度は９０ｍｏｌ％であった（表１）。以上の結果から、本製造方法は式（２）で表されるカチオン性脂質の製造方法として有用であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
　なお、本願は、２０１４年１２月８日付で出願された日本国特許出願（２０１４－２４７７２３）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
 

Claims (3)

  1. 　式（１）で表されるカチオン性脂質と、Ｘ－を有するテトラアルキルアンモニウム塩とを有機溶媒中で混合し、析出したヨウ化テトラアルキルアンモニウムをろ別してろ液を得た後、前記ろ液を濃縮することで少なくともヨウ化テトラアルキルアンモニウムを析出させ、式（２）で表されるカチオン性脂質を得ることを特徴とする、カチオン性脂質の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）において、
    　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、炭素数1～６の炭化水素基を示し、
    　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、炭素数１０～２２のアシル基または炭素数１０～２２の炭化水素基を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）において、
    　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、炭素数1～６の炭化水素基を示し、
    　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ、炭素数１０～２２のアシル基または炭素数１０～２２の炭化水素基を示し、
    　Ｘ－は、塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、メタンスルホン酸イオン、またはｐ－トルエンスルホン酸イオンを示す。）
  2. 　前記テトラアルキルアンモニウム塩がテトラメチルアンモニウム塩である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記式（２）において、Ｘ－が塩化物イオンである、請求項１または２記載の方法。
     
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107827762B (zh) * 2017-11-14 2020-10-02 苏州东南药业股份有限公司 一种(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵及其制备方法和用途
CN114853618A (zh) * 2022-03-25 2022-08-05 江苏东南纳米材料有限公司 一种阳离子脂质材料dodma的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05508626A (ja) * 1990-04-19 1993-12-02 バイカル・インコーポレイテッド 生物学的活性分子の細胞内配達のための陽イオン脂質
JP2002515024A (ja) * 1995-09-27 2002-05-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性サイトフェクチン：ポリヌクレオチドトランスフェクション複合体を製造するための多官能価陽イオンサイトフェクチン、配合物及び方法
WO2007022030A2 (en) * 2005-08-11 2007-02-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for the efficient delivery of therapeutic agents to cells and animals
WO2008148057A2 (en) * 2007-05-23 2008-12-04 Vical Incorporated Cationic lipids compositions and methods for enhancing immune responses to vaccines
JP2011509258A (ja) * 2008-01-02 2011-03-24 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 核酸の送達のための改善された組成物および方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869715A (en) 1995-09-27 1999-02-09 The Reagents Of The University Of California Polyfunctional cationic cytofectins
WO2009088892A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Liver screening method
CA2711236A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
RU2627354C2 (ru) * 2011-05-20 2017-08-07 Мерк Патент Гмбх Устойчивые кристаллические модификации хлорида dotap
JP2013095755A (ja) * 2011-11-02 2013-05-20 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd カチオン性脂質
CN103880688B (zh) * 2014-03-14 2016-10-05 北京大学 一种疏水亲油可聚合电解质及其高吸油聚电解质凝胶

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05508626A (ja) * 1990-04-19 1993-12-02 バイカル・インコーポレイテッド 生物学的活性分子の細胞内配達のための陽イオン脂質
JP2002515024A (ja) * 1995-09-27 2002-05-21 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 活性サイトフェクチン：ポリヌクレオチドトランスフェクション複合体を製造するための多官能価陽イオンサイトフェクチン、配合物及び方法
WO2007022030A2 (en) * 2005-08-11 2007-02-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for the efficient delivery of therapeutic agents to cells and animals
WO2008148057A2 (en) * 2007-05-23 2008-12-04 Vical Incorporated Cationic lipids compositions and methods for enhancing immune responses to vaccines
JP2011509258A (ja) * 2008-01-02 2011-03-24 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 核酸の送達のための改善された組成物および方法

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