BR112013029588B1 - Processo para preparação de uma forma cristalina de cloreto de (2r,s)-, (2s)- ou (2r)- dotap, e composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
modificações estáveis de cristal de cloreto de dotap. a presente invenção refere-se a modificações de cristal de cloreto de dotap racêmico (2r,s) e enanciomericamente puros (2r)- ou (2s), a processos para sua preparação e ao seu uso para a preparação de compo- sições farmacêuticas.
Description
[001] A presente invenção se refere a modificações de cristal de cloreto de DOTAP racêmico e enanciomericamente puro, a processos para a sua preparação, e a seu uso para a preparação de composições farmacêuticas.
[002] As formas cristalinas de cloreto de DOTAP e composições farmacêuticas correspondentes têm os mesmos usos bem conhecidos das formas não cristalinas de cloreto de DOTAP.
[003] Cloreto de DOTAP acima e abaixo denota formas racêmi- cas ou formas isomericamente puras de cloreto de (2R,S)-N,N,N- trimetil-2,3-bis[[(9Z)-1-oxo-9-octadecenil]óxi]-1-propanamínio, de cloreto de (2R)- N,N,N-trimetil-2,3-bis[[(9Z)-1-oxo-9-octadecenil]óxi]-1- propanamínio,e cloreto de (2S)-N,N,N-trimetil-2,3-bis[[(9Z)-1-oxo-9- octadecenil]óxi]-1-propanamínio, também conhecido como cloreto de (Z,Z)-N,N,N-trimetil-2,3-bis[(1-oxo-9-octadecenil)óxi]-1-propanamínio ou cloreto de 1,2-dioleoilóxi-3-trimetilamônio propano, e seus hidratos.
Números CAS: 132172-61-3 e 477274-39-8 (racemato), 197974-73-58 (racemato, mono-hidrato) 428506-51-8 (forma 2S), 328250-28-8 (forma 2R)
[004] DOTAP pode, entre outras coisas, formar lipossomas e ou tros agregados lipídicos vesiculares. Lipossomas são vesículas sintéticas com multicamadas (membranas esfericamente autocontidas) compreendendo substâncias ambifílicas, normalmente lipídios naturais, nos quais tanto as substâncias hidrofílicas podem ser encapsuladas no interior aquoso, como também as substâncias lipofílicas podem ser incorporadas no interior da membrana de lipídio.
[005] Elas são empregadas em particular em cosméticos e na medicina, especialmente em dermatologia. Aqui estão incluídos, em particular, vitaminas, coenzimas, agentes de cuidados com a pele e filtros solares. Lipossomas geralmente são adicionados topicamente.
[006] Adicionalmente lipossomas estão alcançando cada vez mais uma maior importância na tecnologia farmacêutica, visto que a aplicação parenteral de lipossomas viabiliza atingir uma distribuição mais específica em um órgão do que no caso de compostos ativos empregados na forma livremente dissolvida.
[007] Se DNA, RNA ou proteínas são incorporados aos liposso mas e outros agregados lipídicos vesiculares, são obtidos lipoplexos.
[008] A adição de óleos e o emprego de homogeneizadores de alta pressão permite que se force a formação de assim chamadas na- nopartículas (nanopartes) a partir de lipossomas. Essas são partículas de aproximadamente o mesmo tamanho que os lipossomas, que não têm uma fase aquosa mas, ao invés disso, uma fase oleosa em seu interior. Elas são particularmente adequadas para a encapsulação de substâncias lipofílicas.
[009] Microemulsões são sistemas coloidalmente dispersos, mo nofásicos, compreendendo componentes aquosos, semelhantes a lipídio e tensoativos. Elas têm um tamanho de partícula de 1-500 nm e se comportam de maneira semelhante a líquidos.
[010] Especialmente em conexão com compostos peptídicos ativos, nucleotídeos, vacinas e outros produtos biofarmacêuticos, os quais nor-malmente apresentam solubilidade baixa, o efeito de solubilização tem importância muito elevada no caso das aplicações descritas acima.
[011] Além disso, a degradação dos compostos ativos no corpo pode ser freada e um efeito de desprendimento sustentado pode ser atingido dessa maneira.
[012] Cloreto de DOTAP pertence à classe de lipídios catiônicos. Em contraste com fosfolipídios que ocorrem naturalmente, esses não apresentam um caráter anfótero. Lipossomas compreendendo lipídios catiônicos, individualmente ou combinados com fosfolipídios ou outros compostos semelhantes a lipídio, têm uma superfície positivamente carregada. Isso dá surgimento a alta afinidade com células que apresentam uma superfície negativamente carregada no lado externo, por exemplo células endoteliais.
[013] É particularmente importante, entretanto, a capacidade de lipossomas baseados em DOTAP e outros lipossomas e lipoplexos catiônicos de penetrar em células e dessa forma transportar os compostos ativos incorporados neles até o interior da célula (transfecção).
[014] Todas essas propriedades tornam cloreto de DOTAP muito interessante para a terapia de câncer também. Essas propriedades geram a possibilidade de aplicar agentes citostáticos convencionais incorporados em lipossomas DOTAP catiônicos.
[015] As propriedades de transfecção de cloreto de DOTAP e ou tros sais de DOTAP, tais como, por exemplo, acetato, brometo, di- hidrogenofosfato, hidrogenossulfato, iodeto, mesilato, metilsulfato, tri- fluoracetato, sulfato ou dissulfato e triflato, são adequadamente conhecidas na literatura.
[016] Em alguns estudos in-vitro, outros sais, tais como, por exemplo, metilsulfato de DOTAP, têm alcançado melhores taxas de transfecção do que cloreto de DOTAP.
[017] Quando empregado in vivo, entretanto, ocorre uma troca aniônica na superfície do lipossoma no corpo vivo, o que significa que as vantagens de outros sais não surgem aqui. Especialmente no uso médico em humanos, em particular para aplicação parenteral, sais de DOTAP com ânions fisiologicamente aceitáveis, tais como, por exemplo, o cloreto ou o acetato correspondente, são, portanto, preferidos.
[018] Aplicações médicas, em particular aplicações parenterais, impõem as mais elevadas exigências de qualidade e pureza dos compostos ativos e adjuvantes empregados. Existem, portanto regulações muito estritas por parte das autoridades com respeito à preparação, reprodutibilidade de preparação e perfil de subprodutos desses compostos. No caso de substâncias usadas parenteralmente, a contaminação microbiológica por microorganismos patogênicos e endotoxinas precisa, adicionalmente, ser estritamente evitada e controlada.
[019] Formas amorfas de cloreto de DOTAP e outros sais de DOTAP atualmente existentes são extremamente instáveis e são, portanto, difíceis por se para preparar com uma pureza aceitável de modo que elas sejam apropriadas para uso na preparação de uma formulação medicamentosa.
[020] Como todos os lipídios que carregam radicais de ácido olei- co, tais como, por exemplo, os fosfolipídios naturais DOPC e DOPE, todos os sais de DOTAP são muito sensíveis a oxidação e os produtos de oxidação de derivados de ácidos graxos insaturados geralmente apresentam elevada toxidez.
[021] Métodos apropriados de preparação, purificação e estabili zação são requeridos aqui. Acetato de DOTAP, por exemplo, está na forma de um óleo de elevado ponto de ebulição, e, portanto, pode ser obtido industrialmente apenas com grande dificuldade com qualidade adequada.
[022] Métodos convencionais para suplantar a instabilidade, tais como, por exemplo, a adição de antioxidantes na forma de ácido as- córbico ou L-glutationa reduzida, restringem fortemente a empregabili- dade geral de cloreto de DOTAP, visto que as interações com os com postos ativos a serem embutidos mais tarde não podem ser excluídas. A completa exclusão de oxigênio durante a preparação, armazenamento e uso é virtualmente impossível ou pode ser viabilizada apenas com um esforço muito elevado.
[023] Cloreto de DOTAP é comercialmente disponível como uma solução de clorofórmio ou como um sólido amorfo.
[024] Em complemento à sua sensibilidade a oxidação, cloreto de DOTAP amorfo é também extremamente higroscópico e deliquesce, dentro de um período de tempo muito curto, a níveis normais de umidade atmosférica, para formar um filme gorduroso. Isto torna o manuseio desse composto muito mais difícil.
[025] Tecnicamente qualquer manuseio de formas amorfas de cloreto de DOTAP correntemente disponíveis é, portanto apenas possível sob medidas vigorosas de proteção. Portanto, o fabricante de cloreto de DOTAP amorfo geralmente recomenda o armazenamento sob gás de proteção a -20°C e garante apenas um tempo de prateleira de aproximadamente 6 meses.
[026] Eibel e Unger, DE4013632A1, esboçam a síntese de clore to de (2R,S)- DOTAP a partir de brometo de DOTAP por troca iônica no sistema de solvente clorofórmio/metanol/HCl aquoso seguido de purificação por meio de cromatografia. Brometo de DOTAP é obtido antecipadamente in situ a partir de 1-bromo-2,3-dioleoiloxipropano.
[027] Leventis e Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, reportam a síntese de cloreto de (2R,S)- DOTAP a partir de iodeto de DOTAP por troca iônica no sistema bifásico de solven- te/solução de NaCI. Iodeto de DOTAP é obtido antecipadamente por metilação do composto correspondente de dimetilamino por meio de iodeto de metila.
[028] Nantz et al., Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078, descreve a síntese de cloreto de (2R,S)- DOTAP por cromatografia de troca iônica não-aquosa. O composto desejado é obtido por evaporação do eluato.
[029] Feigner et al., US 5,264,618, executam a metilação do composto correspondente de dimetilamino diretamente para cloreto de (2R,S)- DOTAP por meio de cloreto de metila. Aparentemente obtêm uma cera amarela por cristalização a partir de acetonitrila a - 20°C. Entretanto, cloreto de (2R,S)- DOTAP é virtualmente insolúvel em acetonitrila à temperatura ambiente. Tentativas de reproduzir essa assim chamada cristalização resultaram apenas em material amorfo através de solidificação da substância oleosa obtida da solução quente após resfriamento. O fato de que essa não é uma cristalização é também evidente devido ao fato de que os autores aparentemente não atingiram um efeito de purificação e tiveram que purificar a substância por cromatografia. Ver também os exemplos comparativos que demonstram que Feigner et al. não alcançam cloreto de (2R,S)- DOTAP cristalino.
[030] Em particular se os compostos são pretendidos para uso parenteral, uma preparação que inclui tratamento com resina de troca iônica é extremamente problemática tendo em vista a possível contaminação microbiológica, visto que as resinas correspondentes são um meio nutriente ideal para bactérias e mesmo após elas terem sido mortas, ainda resta um risco de contaminação por endotoxinas.
[031] O WO 2006/056312 A1 descreve cloreto de DOTAP enan- ciomericamente puro. Um processo detalhado para cristalização não é divulgado.
[032] O objeto da presente invenção é, portanto, proporcionar sais cristalinos de cloreto de DOTAP e hidratos com elevada pureza e com estabilidade química e física adequada. Um outro objeto da presente invenção é o de proporcionar esses sais cristalinos com tempos de prateleira longos, viabilizando que eles sejam empregados na pre- paração de formulações farmacêuticas. Continua elevada a demanda por um processo reprodutível para a preparação de formas estáveis de sais de cloreto de DOTAP e hidratos que possa ser executado em escala industrial.
[033] Cloreto de DOTAP enanciomericamente puro pode ser ob tido a partir de materiais de partida enanciomericamente puros de forma análoga aos processos descritos para o racemato, isto é via (R)- ou (S)-1-cloro-2,3-dioleoiloxipropano, via (R)- ou (S)-1-LG-2,3-dioleoiloxipropano e troca iônica (LG = grupo de partida) ou via (R)- ou (S)-1-dimetilamino-2,3- dioleoiloxipropano. Ver WO 2006/056 312.
[034] Um outro método de preparação que pode ser mencionado é a resolução de racemato de cloreto de DOTAP racêmico.
[035] Por meio de experimentos, constatou-se agora, surpreen dentemente, que tanto cloreto de DOTAP racêmico quanto também enanciomericamente puro, cristalino pode ser obtido em uma maneira simples com elevada pureza química, excelente estabilidade e propriedades de manuseio apropriadas para manusear esses compostos em uma escala industrial mais elevada. Os produtos cristalinos obtidos dessa maneira apresentam estabilidade virtualmente ilimitada à temperatura ambiente sob gás de proteção. Eles são, portanto, adequados como constituintes ou como materiais de partida para a preparação de formas medicamentosas.
[036] A presente invenção concordantemente diz respeito a modi ficações estáveis de cristal de cloreto de DOTAP racêmico e enancio-mericamente puro.
[037] As modificações estáveis de cristal podem ser em forma cristalina e parcialmente cristalina. Elas apresentam uma pureza até agora nunca antes atingida de pelo menos aproximadamente 95%, de preferência de > 98%. Além disso, verificou-se que cloreto de (2R,S)- DOTAP apresenta uma estabilidade até agora nunca antes atingida superior a 99% em peso e área-% determinada por HPLC em relação ao valor de partida quando armazenado a 25°C por 36 meses ou a 40°C por 12 meses (ver com esse respeito a tabela 1 e tabela 1a).
[038] Uma pessoa versada na técnica pode facilmente criar um método apropriado de HPLC a fim de determinar a pureza e teor de cloreto de DOTAP. Por exemplo, um Agilent 1200 HPLC com uma coluna Inertsil ODS-3 (150x3 mm, 3 pm) (Gl Sciences) pode ser usado como equipamento. Eluentes típicos são solução de pentanossulfonato de sódio em solução aquosa 10 mM de H3PO4 (0,085%) (eluente A) e 3,85 mM de pentanossulfonato de sódio em acetonitrila 94% contendo H3PO4 (0,085%) aquoso (eluente B). Um gradiente apropriado é o seguinte (tempo de corrida 25 minutos, tempo posterior 5 minutos; vazão: 1,5 mL/min; 22000 kPa (220 bar); 50°C, volume de injeção 10μl):
[039] As modificações de cristal de cloreto de DOTAP apresen tam um teor menor do que 1 equivalente de água ou solvente de cristalização por equivalente de cloreto de DOTAP.
[040] (2R)-, (2S)- e (2R,S)-DOTAP cristalinos apresentam propri edades de manuseio excelentes e altamente desejáveis, tais como uma higroscopicidade admiravelmente reduzida e capacidade de escoamento livre muito boa.
[041] (2R)-, (2S)- e (2R,S)-DOTAP cristalinos têm um ponto de fusão acima de 160°C, particularmente entre 183 e 185°C, e uma en- talpia de fusão de pelo menos -130 J/g, preferentemente acima de - 140J/g, particularmente entre -143 e - 159 J/g (ver com esse respeito a tabela 3).
[042] As modificações de cristal de (2R,S)-cloreto de DOTAP ra- cêmicas exibem bandas moderadamente agudas em medições de di- fração de raios X em pó (ver a esse respeito a fig. 1 e a tabela 2).
[043] Valores 2 Teta para a modificação de cristal são aproxima damente 6,5, 12,6, 13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 e 29,8, sendo que valores de 2 teta selecionados são aproximadamente 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 e 25,2. Formas cristalinas de cloreto de (2R,S)-DOTAP correspondentes ao padrão de difração de raios X em pó mostrados na fig.1 se situam dentro do âmbito da invenção.
[044] Cloretos de (2S)-DOTAP enanciomericamente puros são obtidos semelhantemente em forma cristalina. Valores 2-teta para a modificação de cristal são aproximadamente 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 e 25,3, sendo que valores selecionados de 2 teta são aproximadamente 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, e 21,6 (ver fig. 2 e tabela 2). Formas cristalinas de cloreto de (2S)- DOTAP correspondentes ao padrão de difração de raios X em pó mostrado na Fig. 2 se situam dentro do âmbito da invenção.
[045] Cloretos de (2R)-DOTAP enanciomericamente puros são obtidos semelhantemente em forma cristalina. Valores 2-teta para a modificação de cristal são aproximadamente 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 e 25,3, sendo que valores selecionados de 2 teta são aproximadamente 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, e 21,6 (ver fig. 3 e tabela 2). Formas cristalinas de cloreto de (2R)-DOTAP correspondentes ao padrão de difração de raios X em pó mostrado na Fig. 3 se situam dentro do âmbito da invenção.
[046] A invenção ainda diz respeito a um processo para a prepa ração de modificações de cristal de cloreto de (2R)-, (2S)- e (2R,S)- DOTAP que é caracterizado pelo fato de que cloreto de (2R)- , (2S)-, (2R,S)-DOTAP é cristalizado a partir de um meio aprótico. O meio aprótico empregado com esse fim pode ser um solvente aprótico, ou uma mistura de solventes apróticos, ou uma mistura de um ou mais solventes apróticos com um solvente prótico ou uma mistura de solventes próticos.
[047] Solventes apróticos apropriados são solventes apróticos, contendo oxigênio, em particular, éteres, tais como, por exemplo, tetra-hidrofurano, metiltetra- hidrofurano, dioxano, dietil éter, dipropil éter, di-isopropil éter e metil terc-butil éter, cetonas, tais como, por exemplo, acetona e 2-butanona, metil isobutil cetona, metil isopropil cetona, e ésteres, tais como, por exemplo, formiato de etila, acetato de metila, acetato de etila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetato de butila, acetato de isobutila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila e 1,3-di- oxolidin-2-ona.
[048] Solventes apróticos preferidos são cetonas.
[049] Solventes próticos apropriados são, em particular, álcoois, tais como, por exemplo, metanol, etanol, n- propanol, isopropa- nol, n-butanol, isobutanol, 2-butanol, terc-butanol, 3-metil-1-butanol e etileno glicol, metoxietanol, etoxietanol.
[050] Se o meio aprótico é uma mistura de um ou mais solventes apróticos com um solvente prótico então o solvente aprótico pode ser um solvente aprótico, contendo oxigênio conforme definido acima ou uma nitrila, tal como, por exemplo, acetonitrila.
[051] Os solventes podem em cada caso ser empregados na forma pura ou na forma de uma mistura, isto é, é possível tanto empregar os vários solventes apróticos em um grupo na forma de uma mistura como também empregar tipos de solventes apróticos na forma de uma mistura um com o outro.
[052] Se o meio aprótico é uma mistura de um ou mais solventes apróticos com um solvente prótico então os solventes próticos podem estar presentes de mais do que 0% até 40% em peso, preferentemente de 10% até 20% em peso, dependendo das condições aplicadas, a pureza das matérias-primas e o alvo do processo (rendimento, pureza do produto, grau de cristalinidade). Preferentemente, um meio aprótico contendo quantidades muito baixas de água deveria ser empregado. Em um modo de realização especialmente preferido, água é excluída.
[053] Em um modo de realização preferido da invenção, acetona ou 2-propanol são usados como meio aprótico. Em um modo de realização muito especialmente preferido, uma mistura de acetona e 2- propanol é empregada. Tipicamente, uma mistura de 2-propanol e acetona compreende 0-25 % de 2-propanol.
[054] A cristalização dos cloretos de DOTAPs pode ser efetuada aqui diretamente a partir da solução de reação sem purificação prévia. Semelhantemente, cloreto de DOTAP cristalino pode ser obtido por recristalização de material amorfo, parcialmente cristalino ou cristalino.
[055] Em um modo de realização preferido, os cloretos de DO TAP empregados para preparar formas cristalinas deles são de elevada pureza química e ótica, preferentemente a uma pureza de aproximadamente > 95% ou mais, mais preferentemente aproximadamente 98% ou mais, ainda mais preferentemente aproximadamente 99% ou mais. A este respeito, a preparação de cloretos de DOTAP cristalinos aqui emprega ácido oleico muito puro como um reagente, o que leva a cloretos de DOTAP de elevada pureza que cristalizam mais facilmente do que cloretos de DOTAP disponíveis previamente com pureza inferior. Impurezas principais típicas em cloretos de DOTAP correntemente disponíveis incluem, mas não estão limitadas a outros lipídios ou seus derivados. A pureza PhEUR efetiva (sendo portanto "qualidade farma") de ácido oleico é hoje em dia ainda apenas aproximadamente 65-88%. Por ácido oleico muito puro aqui é entendido um que apresenta qualidade ultra-pura de aproximadamente 95% ou mais, preferentemente aproximadamente 99% ou mais. Um ácido oleico muito puro apropriado pode, por exemplo ser comercialmente obtido de RCA (lote OA 11.G.01.2007) ou Acme Synthetic Chemicals (lote 060528).
[056] A pureza enanciomérica pode, por exemplo ser determina da por determinação da rotação ótica.
[057] Em um modo de realização preferido, os cloretos de DO TAP empregados para preparar formas cristalinas deles são cristalizados ou recristalizados a partir de misturas com solventes apropriados dentro de faixas de concentração de 1 parte de cloreto de DOTAP para 4 partes de solvente até 1 parte de cloreto de DOTAP para 100 partes de solvente, mais preferentemente dentro de faixas de concentração de 1 parte de cloreto de DOTAP para 4 partes de solvente até 1 parte de cloreto de DOTAP para 10 partes de solvente.
[058] A cristalização das modificações de cloreto de DOTAP é geralmente alcançada especificamente por resfriamento lento da solução preparada até temperaturas abaixo de 30°C, por exemplo por resfriamento a uma taxa de 0,001°C a 0,1°C por minuto, por exemplo 0,05°C por minuto ou 0,004°C por minuto, levando a tempos de resfriamento de aproximadamente 5 a 200 horas, por exemplo aproximadamente 10 horas a 50 horas. Opções específicas são aquecer a solução a 35°C e em seguida resfriar lentamente a -12°C ao longo de um período de 12 horas, ou aquecer a solução a temperaturas mais baixas, por exemplo 25°C, ou começar da temperatura ambiente sem aquecimento, e em seguida resfriar lentamente, por exemplo por 10 a 50 horas, até preferentemente -12°C. A formação dos cristais é executada ou espontaneamente ou por inoculação com a modificação cor- respondente de cristal de cloreto de DOTAP.
[059] O resfriamento lento pode ser efetuado por qualquer méto do conhecido por um versado na técnica. Tipicamente, é empregado um criostato.
[060] Conforme mencionado anteriormente, todos os sais de DOTAP são muito sensíveis a oxidação, e como tal, a exclusão de oxigênio durante os métodos de preparação divulgados aqui é preferida, por exemplo pelo emprego de uma atmosfera inerte, por exemplo atmosfera de nitrogênio e/ou usando solventes com um baixo teor de oxigênio e peróxido.
[061] O emprego de cloreto de DOTAP amorfo ou parcialmente cristalino como material de partida para a recristalização fornece, para o processo descrito, cloretos de DOTAP essencialmente cristalinos de pureza e estabilidade até agora nunca alcançadas.
[062] A invenção também diz respeito ao uso de cloretos de (2R)- , (2S)- , (2R,S)-DOTAP cristalinos para a preparação de formulações medicamentosas visto que os cloretos de (2R)- , (2S)-, (2R,S)-DOTAP apresentam estabilidade excelente em forma sólida sob as condições estabelecidas e têm qualidade constante e muito boa por um tempo virtualmente ilimitado.
[063] A invenção consequentemente ainda também diz respeito a composições farmacêuticas resultantes do uso das formas cristalinas de cloreto de (2R)-, (2S)-, (2R,S)-DOTAP reivindicadas. Composições farmacêuticas desse tipo podem compreender as modificações de cristal de cloreto de (2R,S)- (2S)- e (2R)-DOTAP juntamente com outros compostos ativos farmacêuticos e adjuvantes conhecidos usualmente empregados em preparações medicamentosas, assim como um ou mais solventes.
[064] Essas composições farmacêuticas podem, por exemplo, estar na forma de lipossomas, lipoplexos, microemulsões e nanopartí- culas e incluem, por exemplo, um composto ativo do grupo dos peptí- deos, nucleotídeos, vacinas ou agentes citostáticos.
[065] A presente descrição permite ao versada na técnica aplicar a invenção em uma maneira abrangente. Em adição, os exemplos seguintes servem para melhor compreensão e para ilustração de possíveis variantes da invenção. Esses exemplos não deveriam ser de forma alguma considerados restritivos.
[066] Todas as temperaturas mencionadas nos exemplos seguin tes são indicadas em graus Celsius. A menos que explicitado de outra forma, dados de teores são dados em % em peso.
[067] A Fig. 1 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S) DOTAP cristalino,
[068] A Fig. 2 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2S)- DOTAP cristalino,
[069] A Fig. 3 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R)- DOTAP cristalino,
[070] A Fig. 4 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S)- DOTAP amorfo,
[071] A Fig. 5 ilustra espectros de raios X para cloreto de (2R,S)- DOTAP cristalino (a), cloreto de (2R)-DOTAP cristalino (b) e cloreto de (2S)- DOTAP cristalino (c) em comparação com uma amostra comercialmente disponível de cloreto de (2R,S)-DOTAP (Avanti Polar Lipids) (d),
[072] A Fig. 6 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM- 0318-E) em acetonitrila quando do resfriamento como em Feigner et al.
[073] A Fig. 7 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM- 0318-E) em acetonitrila após ter sido resfriada a -20°C como em Feigner et al.
[074] A Fig. 8 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM- 0364-E) em acetonitrila antes do resfriamento como em Feigner et al.
[075] A Fig. 9 ilustra emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM- 0364-E) em acetonitrila após ter sido resfriada a -20°C como em Feigner et al.
[076] A Fig. 10 ilustra cloreto de (2R,S)- DOTAP racêmico cristalino.
[077] A Fig. 11 ilustra as temperaturas de transição de fase e pontos de fusão de cloreto de (2R,S)-DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)-DOTAP puro cristalino assim como duas misturas de ambas formas cristalinas.
[078] A Fig. 12 ilustra as curvas DVS para cloreto de (2R,S)- DOTAP (topo) e cloreto de (2R)-DOTAP (fundo): formas amorfas: diagramas na direita; formas cristalinas (diagramas na esquerda) (ver exemplo 5 de caracterização). Exemplos para ilustração da invenção Observações gerais sobre as condições experimentais:
[079] É importante resfriar muito vagarosamente durante a crista lização e recristalização a fim de otimizar a precipitação de material cristalino.
[080] Todos os reagentes e solventes compreendem teores muito baixos de água.
[081] Todas as operações são executadas em equipamento fe chado sob atmosfera de nitrogênio.
[082] É empregado ácido oleico muito puro com uma pureza mais elevada do que 95%, preferentemente mais do que 98%, ainda mais preferentemente mais do que 99%. Parâmetros de medição para a Difração de raios X em pó são como a seguir: Difração de raios X em pó STOE Difração: Transmissão Monocromador: Germânio (111) curvado Comprimento de onda da radiação: 1,54060 Cu Detetor: Detetor modo varredura sensível a posição linear: Modo de varredura: Debye-Scherrer/Detetor sensível a posição móvel/Ômega fixo
[083] É comum em estudos de difração de raios X em pó que pe quenas diferenças de faixas individuais podem ocorrer se instrumentos ou métodos de registro diferentes, tais como reflexão ou transmissão, ou capilar ou janela, são utilizados, ou se condições de registro diferentes (por exemplo, umidade atmosférica ou temperatura) prevaleceram. Qualquer pessoa versada na técnica está bastante familiarizada com tais pequenas diferenças e seria prontamente capaz de identificar um dado material para uma correspondência próxima a um dado padrão de difração de raios X em pó em consideração com a metodologia usada. Exemplo de preparação 1: Preparação de cloreto de (2R,S)-DOTAP [cloreto de (R,S)-1,2-dioleoil- 3-propiltrimetilamônio cristalino racêmico]: Materiais de partida
[084] Os seguintes produtos químicos foram usados: N,N'-carbonildiimidazols da SIGMA-ALDRICH, lote 1252812
[085] Ácido oleico da RCA, lote OA 11.G.01.2007, 99,1 % em área (HPLC), onde o ensaio poderia ser de 99,5% ou até mesmo maior visto que ácido linoléico (a maior impureza) mostra taxas de resposta muito maiores em UV do que ácido oleico. (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, da MERCK EPRO- VA, lote MSCH-103-A, 0,11% Água, 99,4% (GC) 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno da SIGMA ALDRICH, lote 1076841,99,7% (GC) Cloreto de metila da LINDE, lote 61448 Iodeto de sódio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336385, 0,27% água Óxido de alumínio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336643 Acetonitrila da ICC, lote 0000426130, 100,0% (GC), < 0,015% água n-Heptano da BRENNTAG SCHWEIZERHALL, lote 0000278245, 96,4% (GC) 2-Propanol da THOMMEN FURLER, lote 070920211487, 99,96% (GC), 0,03% de água Acetona da THOMMEN FURLER, lote 080609324212, 99,98% (GC), 0,16% água Síntese de (2R,S)-DODAP [(R,S)-1,2-dioleoil-3- dimetilamônio propano]
[086] Dissolve-se 2,41 kg de N,N'-carbonildiimidazol à temperatu ra ambiente em 6,33 kg de acetonitrila seca. A solução resultante é aquecida a 25°C. Depois 4,0 kg de ácido oleico é bombeado para a solução durante um período de 60 minutos enquanto a temperatura de reação é regulada abaixo de 35°C por variação da velocidade de adição (formação do gás dióxido de carbono). Depois que a adição é concluída, a solução de reação é agitada por 90 minutos adicionais a 30°C (a evolução de gás termina). Então 11 g de 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno é adicionado seguido por uma solução de 0,83 kg de (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol racêmico em 0,37 kg de acetonitrila seca. A agitação a 30°C é continuada por 21 horas. A emulsão resultante é resfriada a 25°C e a agitação é interrompida. Duas camadas aparecem. A camada mais baixa é isolada, desgaseificada a 0,1 kPa (1 mbar)/25°C por 200 minutos e finalmente diluída com 11,7 kg de n-heptano. Adiciona-se à solução 1,21 kg de óxido de alumínio básico e a suspensão é agitada por 3 horas a 0°C. A suspensão é filtrada e o resíduo filtrado é lavado com 1,5 kg de n- heptano previamente resfriado a 0°C. Os filtrados combinados são homogeneizados para originar 15,9 kg de solução de 4,08 kg de (2R,S)-DODAP puro em n-heptano (lote no MBA-116, ensaio: 25,7%, rendimento: 88,9%).
[087] Outra batelada é realizada da mesma maneira resultando em 16,6 kg de solução de 3,52 kg de (2R,S)-DODAP puro em n- heptano (lote no MBA-117, ensaio: 21,2%, rendimento: 88,6%). Síntese de cloreto de (2R,S)-DOTAP
[088] 23,4 kg de solução de 3,52 kg de (2R,S)-DODAP puro em n-heptano (15,9 kg de lote no MBA-116 e 7,5 kg de lote no MBA-117) é carregada no vaso de reação e o n-heptano é destilado a uma temperatura da camisa de 60°C e pressão reduzida. Quando o vácuo permanece estável a 0,8 kPa (8 mbar) a temperatura da camisa é ajustada a 25°C. Depois 7,0 kg de 2-propanol é adicionado seguido por 3,1 g de iodeto de sódio. Depois a temperatura de reação é ajustada a 30°C e a atmosfera de nitrogênio é substituída por uma atmosfera de cloreto de metila com uma pressão absoluta constante de 120 kPa (1200 mbar). A mistura de reação é agitada sob essas condições por 137 horas até que a reação de metilação de (2R,S)-DODAP em cloreto de (2R,S)-DOTAP é terminada (96% de conversão). O consumo de cloreto de metila é de 1,39 kg. Cristalização de cloreto de (2R,S)-DOTAP
[089] A solução de cloreto de (2R,S)-DOTAP em 2-propanol pre parada como descrito acima é diluída com 35,8 kg de acetona seca a 25°C. A quantidade de 2-propanol, conforme observado acima, é de 7 kg e a quantidade de cloreto de DOTAP baseada em cálculos é de 3,64 kg na solução. A solução clara é lentamente resfriada até -12°C a uma taxa de resfriamento de 0,05°C por minuto, isto é, o resfriamento ocorre durante um período de tempo de 12 1/3 horas. A solução resultante é mantida a -12°C a 14 horas adicionais e é então filtrada através de um filtro pré resfriado (-15oC). O cloreto de (2R,S)- DOTAP bruto é lavado duas vezes com 6,0 kg de acetona seca fria (-18°C).
[090] A modificação de cristal obtida neste ponto, neste experi mento particular, não é verificada; entretanto, a partir de experimentos anteriores correspondentes, nos quais o produto bruto foi isolado neste ponto, sabe-se que a modificação do cristal é aquela do (2R,S)- DOTAP cristalino.
[091] Para conseguir um produto até mesmo mais puro, isto é, para remover algumas impurezas menores, é realizada uma etapa de recristalização. Recristalização de cloreto de (2R,S)- DOTAP
[092] O cloreto de (2R,S)- DOTAP bruto úmido é dissolvido no fil tro fechado em uma mistura de 44,1 kg de acetona seca e 3,5 kg de 2- propanol a 35°C. A solução é transferida para o vaso de reação e levada a 0°C. A solução é lentamente resfriada até -12°C a uma taxa de resfriamento de 0,004°C por minuto, isto é, o resfriamento ocorre por um período de tempo de 50 horas. A suspensão resultante é mantida a -12°C por 16 horas adicionais e então é filtrada com um filtro secador resfriado (-15°C). O resíduo do filtro é lavado duas vezes com 0,8 kg de acetona seca fria (-18°C) e secado por meio de aplicação de vácuo.
[093] Durante a secagem permite-se que o filtro secador aqueça até a temperatura ambiente.
[094] A secagem está completa quando o vácuo é estável a 0,79 kPa (7,9 mbar). Rendimento: 3,46 kg de cloreto de (2R,S)-DOTAP ra- cêmico cristalino ((2R,S)-DOTAP cristalino, lote no MBA-118, ensaio: 100,0%, rendimento: 37,8% com ref. a (R,S)-3-(dimetilamino)-1,2- propanodiol, HPLC pureza: 99,9% de área).
[095] Um gráfico de cloreto de (2R,S)- DOTAP cristalino pode ser encontrado na figura 10. Exemplo de preparação 2: Preparação de cloreto de (2R)- DOTAP cristalino enanciomericamente puro [cloreto de (R)-1,2-dioleoil-3-propiltrimetilamônio]: Materiais de partida
[096] Os seguintes produtos químicos foram usados: N,N'-carbonildiimidazol da SIGMA-ALDRICH, lote 1252812 Ácido oleico da ACME SYNTHETIC CHEMICALS, lote 060528, 97,8% (HPLC) (R)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, da DAISO, lote RMA062151,0,11 % de água, 99,6% (GC) 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ena da SIGMA ALDRICH, lote 1076841,99,7% (GC) Cloreto de metila da LINDE, lote 61448 Iodeto de sódio da SIGMA-ALDRICH, lote 1336385, 0,27% de água Acetonitrila da SIGMA ALDRICH, lote 7219K, 100,0% (GC), 0,005% de água n-Heptano da BRENNTAG SCHWEIZERHALL, lote 0000278245, 96,4% (GC) 2-Propanol da THOMMEN FURLER, lote 070629176434, 99,96% (GC), 0,016% de água Acetona da THOMMEN FURLER, lote 061201101946, 99,98% (GC), 0,10% de água Síntese de (2R)-DODAP [(R)-1,2-dioleoil-3-dimetilamônio propano]
[097] Dissolve-se 1,63 kg de N,N'-carbonildiimidazol à temperatu ra ambiente em 4,3 kg de acetonitrila seca. A solução é aquecida a 25°C. Depois 2,7 kg de ácido oleico é bombeado na solução por um período de 60 minutos enquanto a temperatura de reação é regulada abaixo 35°C pela variação da velocidade de adição (formação de gás dióxido de carbono). Após o término da adição a solução de reação é agitada por 105 minutos adicionais a 30°C (término da evolução de gás). Adiciona-se então 7,5 g de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno seguido por uma solução de 0,56 kg de (R)-3-(dimetilamino)-1,2- pro- panodiol enanciomericamente pura em 0,25 kg de acetonitrila seca. A agitação a 30°C é continuada por 19 horas. A emulsão resultante é resfriada a 10°C e a agitação é interrompida. Duas camadas aparecem. A camada inferior é isolada, desgaseificada a 0,001 kPa (0,1 mbar)/20°C por 30 minutos e finalmente diluída com 9,7 kg de n- heptano. A suspensão é agitada por 1,5 horas a 0°C e filtrada para render 12,3 kg de solução de 2,66 kg de (2R)-DODAP puro em n- heptano (lote no MBR-001, ensaio: 21,6%, rendimento: 88,4%). Síntese de Cloreto de (2R)-DOTAP
[098] Carrega-se 12,2 kg da solução de 2,66 kg de (2R)-DODAP puro em n-heptano (lote no MBR- 001) no vaso de reação e o n- heptano é destilado a uma temperatura de camisa de 60°C e pressão reduzida. Quando o vácuo permanece estável em 0,1 kPa (1 mbar), a temperatura da camisa é ajustada a 20°C. Depois 3,26 kg de 2- propanol é adicionado seguido por 1,4 g de iodeto de sódio. Depois a temperatura de reação é ajustada a 30°C e a atmosfera de nitrogênio é substituída por uma atmosfera de cloreto de metila com pressão absoluta constante de 125 kPa (1250 mbar). A mistura de reação é agitada sob essas condições por 330 horas até que a reação de metila- ção de (2R)-DODAP em cloreto de (2R)-DOTAP esteja terminada (97% de conversão). O consumo de cloreto de metila é de 0,58 kg. Cristalização de Cloreto de (2R)- DOTAP
[099] A solução de cloreto de (2R)-DOTAP em 2-propanol prepa rada conforme descrito acima é diluída com 16,2 kg de acetona seca a 25°C. A quantidade de 2-propanol, conforme observado acima, é de 3,26 kg e a quantidade de cloreto de DOTAP baseado em cálculos é de 2,78 kg na solução. A solução clara é lentamente resfriada a -12°C a uma taxa de resfriamento de 0,05°C por minuto, isto é, o resfriamento ocorreu por um período de tempo de 12 1/3 horas. A suspensão resultante é mantida a -12°C por uma hora adicional e é então filtrada através de um filtro pré-resfriado (-12°C). O cloreto de (2R)-DOTAP bruto é lavado duas vezes com 3,2 kg de acetona seca fria (-18°C). O produto cristalino é aquele de (2R)-DOTAP cristalino.
[0100] A modificação de cristal obtida neste ponto, neste experi mento em particular, não é verificada; entretanto, de experimentos anteriores correspondentes nos quais o produto bruto foi isolado neste ponto, sabe-se que a modificação do cristal é aquela do (2R)-DOTAP cristalino.
[0101] Para se obter um produto ainda mais puro, isto é, para remover algumas impurezas menores, é realizada uma etapa de re-cristalização. Recristalização de Cloreto de (2R)- DOTAP
[0102] O cloreto de (2R)-DOTAP úmido bruto é dissolvido no filtro fechado em uma mistura de 20,5 kg de acetona seca e 1,63 kg de 2- propanol a 35°C. A solução é transferida para um vaso de reação e trazida até 25°C. A solução é lentamente resfriada até -12°C com uma taxa de resfriamento de 0,05°C por minuto, isto é, o resfriamento ocorre durante um período de tempo de 12 1/3 horas. A suspensão resultante é mantida a -12°C por 9 horas adicionais e é então filtrada com um filtro secador resfriado (-12°C). O resíduo do filtro é lavado duas vezes com 3,2 kg de acetona seca fria (-18°C) e secado por aplicação a vácuo.
[0103] Durante a secagem permite-se que o filtro secador seja aquecido até a temperatura ambiente. A secagem está completa quando o vácuo é estável a 0,06 kPa (0,6 mbar). Rendimento: 1,47 kg de cloreto de (2R)-DOTAP cristalino enanciomericamente puro (lote no MBR-002, ensaio: 99,7%, rendimento: 44,7% ref. a (R)-3- (dimetilamino)-1,2-propanodiol, pureza de HPLC: 99,9% da área). Exemplo de Preparação 3: Preparação de cloreto de (2S)-DOTAP [cloreto de (S)-1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio cristalino enanciomericamente puro]:
[0104] Cloreto de (2S)-DOTAP [cloreto de (S)-1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio] é preparado da mesma maneira que cloreto de (R)-DOTAP (ver acima) apenas no início a partir do mesmo material de partida enanciomericamente puro (S)-3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol (lote SMA062281 da DAISO, 0,14% de água, GC: 99,8%; todos os outros produtos químicos são idênticos) e rendem 1,67 kg de cloreto de (2S)- DOTAP cristalino enanciomericamente puro (lote no MBS-002, ensaio: 99,6%, rendimento: 50,4% ref. a (S)-3-(dimetilamino)-1,2- propanodiol, pureza de HPLC: 100,0% da área). Exemplo de Caracterização 1 Estabilidades
[0105] Para determinar a estabilidade do cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino, a substância é armazenada a 25°C e 60% de umidade relativa (tabela 1) ou a 40°C e 75% de umidade relativa (tabela 1a) com exclusão de ar. O teor remanescente de cloreto de (2R,S)-DOTAP é medido em intervalos periódicos e quotado em comparação com um valor inicial.
[0106] A pureza e o teor de cloreto de DOTAP são determinados por meio de HPLC usando o seguinte método: HPLC: Agilent 1200 HPLC 150x3 mm, 3 μm. Gl Sciences: Inertsil 10 mM de sal de pentanossulfonato de sódio em 0,085% de H3P04 aquoso Eluente B: 3,85 mM de sal de pentanossulfonato de sódio em 94% de acetonitrila contendo 0,085% de H3P04 aquoso: Gradiente: 0 min 75% B 1 min 75% B 6 min 90% B 7 min 100% B 20 min 100% B 25 min 75% de B tempo posterior: 5 min 75% de B tempo de execução: 25 min escoamento: 1,5 mL/min pressão: ca. 22000 kPa (220 bar) temperatura da coluna: : 50°C volume de injeção: 10 μl
[0107] Os resultados que se seguem são observados:
[0108] A determinação da estabilidade pode ser repetida em qualquer tempo desejado, os valores são indicados 1 e 1a são reproduzíveis. Tabela 1 Condições de armazenamento: 25°C
[0109] Os dados de estabilidade acima confirmam que o cloreto de DOTAP cristalino abaixo é uma substância estável. Mesmo após 36 meses não foi observada nenhuma degradação significativa para as amostras armazenadas a 25±2°C. Tabela 1a Condições de armazenamento: 40°C
[0110] Os dados de estabilidade acima confirmam que o cloreto de DOTAP é uma substância estável. Mesmo em condições aceleradas após 12 meses não foi observada nenhuma degradação significativa para as amostras armazenadas em 40±2°C.
[0111] Cloretos de (2R)-DOTAP e de (2S)-DOTAP cristalinos mos tram valores de estabilidade comparáveis. Exemplo de caracterização 2 Diagramas de raio X em pó
[0112] Para caracterização das propriedades estruturais (modifica ções de cristal) dos cloretos de DOTAPs cristalinos, são registrados diagramas de raio X de pó (espectros de difração) dessas substâncias.
[0113] Cloretos de (2R,S)-, (2R)- e (2S)-DOTAP cristalinos originam espectros com faixas moderadamente agudas que têm resolução relati-vamente boa para lipídios. Os espectros indicam altos teores cristalinos. Nenhuma fração amorfa é visível sob microscópio de polarização.
[0114] Exemplos de espectros são mostrados nas Fig. 1, Fig. 2 e Fig. 3.
[0115] Para comparação, um espectro de uma amostra comercial mente disponível, amorfa é mostrado na Fig. 4 (amorfa). A Fig. 5 mostra a comparação dos espectros de raios X para cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino (a), cloreto de (2R)-DOTAP cristalino (b) e cloreto de (2S)- DOTAP cristalino (c) em comparação com uma amostra comercialmente disponível de cloreto de (2R,S)-DOTAP (d) (Lipídeos polares Avanti).
[0116] A Tabela 2 lista valores 2 teta selecionados para as várias modificações de cristal de cloreto de DOTAP racêmico e enanciomeri- camente puros:
Exemplo de caracterização 3 Ponto de Fusão e Entalpia de fusão
[0117] O ponto de fusão e entalpia de fusão de cloretos de DOTAP cristalinos são determinados por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (30-350°C, 5,0°C/min, N280 mL/min).
[0118] Os pontos de fusão resultantes e entalpias de fusão para cloreto de (2R,S)-DOTAP racêmico e (2R)-DOTAP e (2S)-DOTAP resp. enanciomericamente puros são listados na Tabela 3.
Exemplo de caracterização 4 Temperaturas de transição de fase e entalpias
[0119] As temperaturas de transição de fase e entalpia de cloretos de DOTAP cristalinos são determinadas por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (30- 350°C, 5,0°C/min, N2 80 mL/min).
[0120] Além dos pontos de fusão (ver exemplo de caracterização 3. muitos pontos de transição de fases cristalinas resp. líquidas- cristalinas são observados.
[0121] As temperaturas de transição de fase correspondentes e entalpias para cloreto de (2R,S)-DOTAP racêmico e cloreto de (2R)- DOTAP e resp. cloreto de (2S)-DOTAP enanciomericamente puros são listados na Tabela 4.
[0122] Quando o experimento DSC é realizado em misturas de cloreto de (2R,S)- DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)- DOTAP puro cristalino todas as temperaturas de transição de fase de ambos, o racemato e o enanciômero são observadas. A Fig. 11 ilustra as temperaturas de transição de fase e pontos de fusão do cloreto de (2R,S)- DOTAP puro cristalino e cloreto de (2R)- DOTAP puro cristalino bem como as misturas de ambas as formas cristalinas na proporção de 100:50 e 63:100. Essas proporções são correspondentes a um teor de 33,3% em mol resp. 19,3% em mol de cloreto de (2S)-DOTAP nas misturas. Conclusão
[0123] As modificações do cristal de cloreto de DOTAP cristalino enanciomericamente puro e cloreto de DOTAP cristalino racêmico são distintas. Exemplo de caracterização 5 Absorção de água com dependência na umidade relativa
[0124] A absorção de cloreto de DOTAP é determinada por Sorção Dinâmica de Vapor (DVS) empregando-se um analisador de sorção de vapor de água Projekt Messtechnik SPS 11-100n. As amostras são colocadas em cadinhos de alumínio no topo de uma microbalança e permite-se que sejam equilibrados a 25°C e 0% de r.h. (umidade relativa) durante a noite antes da exposição dos mesmos a dois ciclos de umidificação/secagem a 25°C com uma taxa de varredura de Δ r.h. = 5% h-1 e períodos de equilíbrio 'isoúmido' nos valores extremos.
[0125] Amostras de cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino, cloreto de (2R)-DOTAP cristalino, cloreto de (2R,S)- DOTAP amorfo e cloreto de (2R)-DOTAP amorfo são investigadas. Resultados
[0126] A comparação das curvas de DVS (ver Figura 12: linha cheia do primeiro ciclo, linha pontilhada do segundo ciclo) aponta diferenças características entre as amostras cristalinas e amorfas: As amostas cristalinas (diagrama esquerdo da Figura 12) exibem um peso estável a baixa r.h., sendo que o peso das amostras amorfas (diagramas da direita da Figura 12) aumentam já imediatamente acima de 0% r.h. Além disso, para as amostras que eram cristalinas no início, uma histerese significativamente mais elevada é observada em ambos os ciclos.
[0127] Uma diferença também pode ser observada entre as amos tras racêmicas (diagramas do tipo da Figura 12) e as enanciomerica- mente puras (diagramas da parte inferior da Figura 12): As amostras racêmicas exibem um nítido aumento do teor de água em cerca de 1015% de r.h., sendo que as amostras isomericamente puras exibem esta etapa em cerca de 20-25% de r.h. Exemplo Comparativo 1
[0128] No experimento de Feigner et al., aqui reproduzido, todas as condições experimentais foram selecionadas para ficar em estreita conformidade com a US 5.264.618 (Feigner et al.), Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 a 47.
[0129] 31,5 g de cloreto de oleoíla (FLUKA 0733IAH) dissolvidos em 125 mL de clorofórmio foi adicionado gota a gota a 4°C sob resfriamento por um período de 1^ hora a 5,0 g de 3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol, dissolvido em 37,5 mL de clorofórmio e 25 mL de piridina. A solução amarela foi agitada durante a noite. Adicionou-se então 125 mL de água fria e 125 mL de dietiléter. A fase orgânica foi lavada duas vezes com 100 mL de HCL 0,5N e também duas vezes com 100 mL de solução de bicarbonato de sódio 0,5N. 39 g de sulfato de sódio anidro foi adicionado e a suspensão assim obtida foi filtrada e lavada com 100 mL de clorofórmio. O filtrado foi então concentrado sob pressão reduzida a 40°C. Resultou 40,1 g de um líquido marrom (SM-0318-A) contendo um teor de (2R,S)- DODAP de 24,3% p/p medido por HPLC. Uma outra secagem sob pressão reduzida a 60°C resultou em uma redução de peso para 31,2 g.
[0130] 31,0 g deste material foi purificado por cromatografia de co luna de ácido silícico como se segue: Sílica-gel: 129 g (a quantidade de sílica-gel foi calculada relativo à quantidade de (2R,S)-DODAP) Merck 60 F 63-200um Coluna: diâmetro 4 cm, altura 60 cm Fluxo: aproximadamente 8 mL/min
[0131] Como fase móvel foi empregado primeiramente 1.500 mL de cloreto de metileno (frações de 1-27), depois 1.000 mL de cloreto de metileno/metanol 95:5 (frações de 28-47) e finalmente 1.000 mL de metanol. Frações foram coletadas e combinadas de acordo com sua análise TLC. Assim as frações 4-33 foram concentradas juntas sob pressão reduzida. Resultou 10,8 g de um óleo marrom (SM-0318-B) contendo um teor de (2R,S)-DODAP de 65,6% p/p medido por HPLC. E frações 34-42 resultaram em 12,6 g de um óleo marrom (SM 0318D) contendo um teor de (2R,S)-DODAP de 54,2% p/p medido por HPLC.
[0132] 10,4 g de cloreto de metileno foi adicionado a 9,6 g do composto obtido a partir das frações 4-33 (SM-0318-B) em um tubo de vidro de alta pressão. O tubo de vidro foi então fechado e a solução amarronzada foi aquecida durante a noite a 50°C para formar uma emulsão. Depois o tubo foi aberto e cloreto de metileno residual foi removido por evaporação. Resultaram 8,0 g de uma cera amarela (SM-0318-E) contendo um teor de cloreto de (2R,S)-DOTAP de 65,0% p/p e 1,3% p/p (2R,S)-DODAP ambos medidos por HPLC.
[0133] Adicionou-se 14,0 g de acetonitrila a esta cera (SM-0318- E). A emulsão assim obtida foi transferida com 80 mL de acetonitrila (para obter uma proporção de sólido para solvente de aproximadamente 1:12) em um frasco e resfriada a 20°C. Não foi observada nenhuma cristalização. A 20°C resultou um material amarelo- amarronzado como mel solidificado que, mesmo quando somente amornando lentamente, tendeu a se tornar um material amarronzado viscoso pegajoso. Conclusão
[0134] Os dados demonstram que cloreto de 1,2-dioleoil-3- propiltrimetilamônio (cloreto de (2R,S)-DOTAP) preparado de acordo com o procedimento acima, que está de acordo com a US 5,264,618 (Feigner et al), Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 a 47 não pode ser obtido na forma cristalina.
[0135] Ver também Figuras 6 e 7 ilustrando uma emulsão de clore to de (2R,S)-DOTAP (SM- 0318-E) em acetonitrila durante o resfriamento, e emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0318-E) em acetonitrila após ter sido resfriada a - 20°C, respectivamente. Exemplo Comparativo 2
[0136] Uma outra reprodução do experimento de Feigner et al., foi preparada confirmando a mesma constatação acima.
[0137] Todas as condições experimentais foram selecionadas para ficar tão próximas quanto possível às condições para a prepara- ção/isolamento do cloreto de (2R,S)-DOTAP conforme divulgado na US 5,264,618 (Feigner et al), Exemplo 5, coluna 27, linhas 15 a 47.
[0138] Neste experimento, uma ênfase especial foi feita no grau dos reagentes, o uso de piridina anidra, o tempo de metilação e a temperatura do tubo.
[0139] Dentro da US 5,264,618 (Feigner et al), Exemplo 5 não po de ser encontrada qualquer informação válida quanto à matéria prima empregada. Para o reprocessamento foram empregados cloreto de oleoíla da SIGMA-ALDRICH (Art. no 367850, lote 0733IAH) e 3- (dimetilamino)-1,2-propanodiol da TCI (Art. no D2072, lote FGC01EF).
[0140] Dietiléter (Art. no. 8.22270.1000, lote no K33237470), sulfato de sódio (Art. no 8.22286.5000, lote no TA603386), areia do mar (Art. no 1.07711.5000, lote no TA1417811), sílica-gel 60 F 63-200 μm (Art. no 1.07734.9025, lote no TA1570234) e acetonitrila (Art. no 1.15500.1000, lote no K38172000) todos da Merck KGaA. Clorofórmio (Art. no 34854, lote no 8178C) e piridina sobre peneira molecular, H2O< 0,005% (Art. no, 82704, lote no 1166921) da Fluka.
[0141] 5,0 g de 3-(dimetilamino)-1,2-propanodiol foi dissolvido à temperatura ambiente em 25 mL de piridina anidra e 37,5 mL de coro- fórmio recentemente destilado. A solução foi resfriada a 4°C. 31,5 g de cloreto de oleoíla foi dissolvida em 125 mL de clorofórmio destilado. A solução de cloreto de oleoíla foi adicionada gota a gota à solução de 3- (dimetilamino)-1,2-propanodiol fria por um período de uma hora. A solução amarela foi agitada durante a noite. Depois 125 mL de água fria e 125 mL de dietiléter foram adicionados. A fase orgânica foi lavada duas vezes com 100 mL de HCI a 0,5N e depois também duas vezes com 100 mL de solução de bicarbonato de sódio 0,5N. Depois adicionou-se 39 g de sulfato de sódio anidro. A suspensão assim obtida foi filtrada e o sólido residual foi lavado com 20 mL de clorofórmio. O produto filtrado foi então concentrado sob pressão reduzida. Resultaram 31,5 g de um líquido marrom (SM 0364 A) contendo um teor de 1,2- dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP) de 62,2% p/p medido por HPLC.
[0142] Uma coluna de sílica-gel foi preparada como se segue: Coluna: diâmetro 4 cm, altura 60 cm Silica gel: 200 g sílica-gel e 42,6 g de areia do mar (calculado relativo à quantidade de DODAP) Fluxo: aproximadamente 7 mL/min
[0143] Adicionou-se gota a gota 15 g do material preparado acima (SM 0364 A) na coluna de sílica-gel e enxaguou-se com 50 mL de clorofórmio. A coluna foi primeiro eluída com 1.000 mL de clorofórmio, depois com 1.000 mL de clorofórmio/metanol 95/5, depois com 1.250 mL de clorofórmio/metanol 90/10 e finalmente com 2.500 mL de metanol. Foram coletadas e combinadas frações de acordo com sua análise por cromatografia em camadas finas em placas de sílica-gel (Merck 60 F254), desenvolvidas com clorofórmio/acetona/metanol/ácido acéti- co/água 50/15/5/5/2 por volume, detecção por iodo. Após concentração sob pressão reduzida, as frações combinadas de 11-17 resultaram em 4,88 g (SM 0364 B) contendo um teor de DODAP de 73,2% p/p, as frações 18-27 resultaram em 7,24 g (SM 0364 C) contendo um teor de DODAP de 68,2% p/p e as frações 28-31 resultaram em 1,9 g (SM 0364 D) contendo um teor de DODAP de 40,4% p/p, tudo medido por HPLC. No total resultou um equilíbrio de massa de 93,5%.
[0144] 1,0 g do composto obtido a partir das frações mais puras de 11-17 (SM-0364- B) foi adicionado em um tubo de vidro de silicato de boro de parede pesada, altamente pressurizável (Sigma Aldrich Z181072-1 EA). Depois 10 mL de cloreto de metila foram condensados no tubo de vidro. O tubo de vidro foi fechado de forma estanque e mantido por 72 horas a 70°C. Depois o tubo foi resfriado a 0°C, aberto, e cloreto de metila residual foi removido por evaporação. Isto resultou em 1,11 g de uma cera amarelo-acastanhada (SM 0364 E) contendo um teor de cloreto de (2R,S)-DOTAP de 69,3% p/p e mostrando um teor de DODAP de 1,8% p/p e um teor de ácido oleico de 2,7% p/p (todos medidos por HPLC).
[0145] A 1,08 g do composto obtido conforme descrito acima (SM 0364 E) adicionou-se 10 mL de acetonitrila e aqueceu-se a 50°C. A emulsão assim obtida foi resfriada a -20°C. Nenhuma cristalização pode ser observada. A -20°C resultou uma cera amarelo-amarronzada. Conclusão
[0146] Conforme mostrado acima, quando se reelabora o(s) mo- do(s) de realização mais próximo(s) da US 5,264,618 (Feigner et al), apenas cloreto de (2R,S)- DOTAP amorfo pode ser obtido.
[0147] Ver também as Figuras 8 e 9 ilustrando a emulsão de clore to de (2R,S)-DOTAP (SM-0364-E) em acetonitrila antes de resfriá-la e emulsão de cloreto de (2R,S)-DOTAP (SM-0364-E) em acetonitrila após resfriá-la a -20°C, respectivamente.
[0148] Sem maior elaboração, acredita-se que uma pessoa com conhecimentos na técnica pode, usando a descrição precedente, utilizar a presente invenção em toda a sua extensão. Os modos de execução precedentes preferidos devem ser, portanto, construídos como meramente ilustrativos, e de maneira alguma limitantes do restante da divulgação.
[0149] Os exemplos precedentes podem ser repetidos com suces so similar por substituição dos reagentes e/ou condições de operação descritos genericamente ou especificamente nesta invenção por aqueles usados nos exemplos precedentes.
[0150] A partir da descrição anterior, uma pessoa com conheci mento na técnica pode facilmente determinar as características essenciais desta invenção e, sem sair do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições.
Claims (8)
1. Processo para preparação de uma forma cristalina de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP, caracterizado pelo fato de que compreende cristalizar cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP a partir de um ou solventes mais apróticos, sendo que a cristalização ocorre por resfriamento lento de 35°C a -12°C por um período de 12 horas ou resfriamento lento de uma temperatura inferior a 35°C por um período de 10 a 50 horas, cujo cloreto de (2R,S)-DOTAP cristalino apresenta uma das seguintes características: valores 2 teta compreendendo pelo menos os valores de 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 e 25,2; ou valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de 6,5, 12,6, 13,4, 19,5, 20,2, 21,5, 25,2 e 29,8; ou cujo cloreto de (2S)-DOTAP cristalino apresenta uma das seguintes características: valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de 12,8, 19,5, 19,8, 20,2 e 21,6; ou valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de 6,5, 12,8, 19,5, 19,8, 20,2, 20,7, 21,6 e 25,3; ou cujo cloreto de (2R)-DOTAP cristalino apresenta uma das seguintes características: valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de 12,8, 19,5, 19,8, 20,3 e 21,6; ou valores 2 teta compreendendo pelo menos valores de 6,6, 12,8, 19,5, 19,8, 20,3, 20,8, 21,6 e 25,3, determinado usando um comprimento de onda de radiação de 1,54060 Å (Cu); e/ou cujo cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalino apresenta uma pureza química de pelo menos cerca de 95% determinada por HPLC.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalino apresenta um ponto de fusão superior a 160°C e uma entalpia de fusão superior a -130J/g.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou mais solventes apróticos compreendem um ou mais solventes próticos.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cristalização ocorre sob uma atmosfera inerte.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cristalização é realizada diretamente a partir de uma solução de reação sem purificação prévia, cuja solução de reação é de um processo de preparação de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma recristalização de cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalino.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende cloreto de (2R,S)-, (2S)- ou (2R)-DOTAP cristalino, obtido pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais peptí- deos, nucleotídeos, antígenos, agentes citostáticos, lipossomas, lipoplexos, nanopartículas ou microemulsões, ou uma mistura dos mesmos.
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