NO20131703A1 - Stabile krystallmodifikasjoner av DOTAP-klorid - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse angår krystallmodifikasjoner av rasemisk (2R,S)- og enantiomert rent (2R)- repektive (2S)-DOTAP-klorid, fremgangsmåter for fremstilling derav, samt anvendelse derav for fremstilling av farmasøytiske preparater

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører krystallmodifikasjoner av racemisk og enantiomert rent DOTAP-klorid, fremgangsmåter for fremstilling derav, samt anvendelse derav for fremstilling av farmasøytiske preparater.

De krystallinske former av DOTAP-klorid og tilsvarende farmasøytiske preparater har de samme godt kjente anvendelser som de av ikke-krystallinske former av DOTAP-klorid.

DOTAP-klorid ovenfor og nedenfor betegner racemiske (2R,S)- eller isomert rene (2R)-respektive (2S)-former av N,N,N-trimetyl-2,3-bis [[(9Z)-l-okso-9-oktadecenyl]oksy]-l-propanaminium-klorid, også kjent som (Z, Z)-N,N,N-trimetyl-2,3-bis[(l-okso-9-oktadecenyl)oksy]-l-propanaminium-klorid eller l,2-dioleoyloksy-3-trimetylammonium-kloridpropan, og hydratene derav.

CAS-nummer: 132172-61-3 og 477274-39-8 (racemat),

197974-73-58 (racemat, monohydrat)

428506-51-8 (2S form), 328250-28-8 (2R-form)

DOTAP kan blant annet bygge liposomer og andre lipid-vesikuløse aggregater. Liposomer er syntetiske flerlags vesikler (kuleformede selvstendige membraner) omfattende amfifile stoffer, vanligvis naturlige lipider, inn i hvilken både hydrofile stoffer som kan innkapsles i det vandige indre og også lipofile stoffer kan innarbeides i innsiden av lipidmembranen.

De anvendes spesielt innen kosmetikk og innen medisin, spesielt innen dermatologi. Her er spesielt vitaminer, koenzymer, hudpleiemidler og solkremer innesluttet. Liposomer appliseres generelt topisk.

I tillegg oppnår liposomer i økende grad ytterligere betydning innen farmasøytisk teknologi, siden parenteral anvendelse at liposomer muliggjør at mer spesifikk organfordeling oppnås enn dersom de aktive forbindelser brukes i fri oppløst form.

Dersom DNA, RNA eller proteiner inkorporeres i liposomer og andre lipid-vesikuløse aggregater, dannes lipoplekser.

Tilsetning av oljer og anvendelse av høytrykks-homogenisatorer muliggjør at dannelse av såkalte nanopartikler (nanodeler) blir tvunget fra liposomene. Dette er partikler med omtrent samme størrelse som liposomer, men som ikke har en vann-fase, men i stedet en oljefase i deres indre. De er spesielt egnet for innkapsling av lipofile stoffer.

Mikroemulsjoner er kolliodalt disperse, enkeltfase systemer omfattende vannholdige, lipid-lignende og surfaktant komponenter. De har en partikkelstørrelse på 1-500 nm, og oppfører seg på en lignende måte som væsker (likvider).

Spesielt i forbindelse med peptidaktive forbindelser, nukleotider, vaksiner og andre biofarmasøytiske midler som vanligvis har dårlig oppløselighet, har den oppløseliggjørende virkning meget stor betydning i tilfelle av de anvendelser som er beskrevet ovenfor.

I tillegg kan nedbrytningen av de aktive forbindelser i kroppen bli bremset og en vedvarende frigjørende effekt oppnås på denne måte.

DOTAP-klorid tilhører klassen av kationiske lipider. I motsetning til naturlig forekommende fosfolipider, har disse ingen zwitterionisk karakter. Liposomer omfattende kationiske lipider, alene eller kombinert med fosfolipider eller andre lipid-lignende forbindelser, har en positivt ladet overflate. Dette gir opphav til høy affinitet for celler som har en negativt ladet overflate utvendig, for eksempel endotelceller.

Spesielt viktig er imidlertid muligheten til DOTAP-baserte og andre kationiske liposomer og lipoplekser å trenge inn i celler og således til å transportere de aktive forbindelser innlemmet deri inn i det indre av cellen (transfeksjon).

Alle disse egenskapene gjør DOTAP-klorid veldig interessant også for kreftbehandling. Disse egenskapene gir opphav til muligheten for å anvende konvensjonelle cytostatika innlemmet i kationiske DOTAP-liposomer.

Transfeksjonsegenskapene til DOTAP-klorid og andre DOTAP-salter, slik som for eksempel acetatet, bromid, dihydrogenfosfat, hydrogensulfat, jodid, mesylat, metylsulfat, trifluoracetat, sulfat eller disulfat og triflat, er tilstrekkelig kjent fra litteraturen.

I noen in vitro-studier har andre salter, slik som for eksempel DOTAP- metylsulfat oppnådd bedre transfeksjongrader enn DOTAP-klorid.

Anvendt in vivo skjer imidlertid anionebytte på liposomoverflaten sted i den levende kroppen, slik at fordelene med andre salter ikke oppstår her. Spesielt ved medisinsk bruk i mennesker, særlig for parenteral anvendelse, er DOTAP-salter med fysiologisk akseptable anioner, slik som for eksempel det tilsvarende klorid eller acetat, derfor foretrukket.

Medisinske, spesielt parenterale applikasjoner, har de høyeste krav til kvalitet og renhet av de aktive forbindelser og adjuvanser som anvendes. Myndighetene har derfor svært strenge regler med hensyn til fremstilling, reproduserbarhet ved fremstilling og biproduktprofil av disse forbindelsene. Når det gjelder stoffer som brukes parenteralt, må i tillegg mikrobiologisk forurensning av patogene mikroorganismer og endotoksiner strengt unngås og kontrolleres.

For tiden tilgjengelige amorfe former av DOTAP-klorid og andre DOTAP-salter er svært ustabile og er derfor vanskelig i seg selv å fremstille med akseptabel renhet, slik at de er egnet for anvendelse ved fremstilling av en medikamentformulering.

I likhet med alle lipider som bærer oljesyreradikaler, så som for eksempel de naturlige fosfolipider DOPC og DOPE, er alle DOTAP-salter svært sensitive for oksidasjon, og oksidasjonsproduktene av umettede fettsyre-derivater har generelt høy toksisitet.

Egnede fremstillings-, rensings- og stabiliseringsmetoder er påkrevet her. DOTAP-acetat er for eksempel i form av en høytkokende olje, og industrielt kan denne derfor bare oppnås med store vanskeligheter med adekvat kvalitet.

Konvensjonelle metoder for å overvinne ustabiliteten, slik som for eksempel tilsetning av antioksidanter i form av askorbinsyre eller redusert L-glutation, begrenser sterkt den generelle anvendbarheten av DOTAP-klorid ettersom interaksjoner med de aktive forbindelser som skal innesluttes senere ikke utelukkes. Fullstendig utelukkelse av oksygen under fremstilling, lagring og bruk er praktisk talt umulig, eller kan bare bli tilrettelagt med meget stor innsats.

DOTAP-klorid er kommersielt tilgjengelig som en kloroform-løsning eller som et amorft fast stoff.

I tillegg til sin sensitivitet for oksidasjon, er amorf DOTAP-klorid også svært hygroskopisk og løser seg opp i løpet av svært kort tid ved normale atmosfæriske luftfuktighets nivåer for å gi en oljeaktig film. Dette gjør håndtering av denne forbindelsen mye vanskeligere.

Teknisk sett er derfor enhver håndtering av tilgjengelige amorfe former av DOTAP-klorid kun mulig under kraftige vernetiltak. Således anbefaler produsenten av amorft DOTAP-klorid generelt lagring under beskyttende gass ved -20 °C, og garanterer kun en holdbarhet på ca. 6 måneder.

Eibel og Unger, DE4013632A1, skisserer syntesen av (2R,S)-DOTAP-klorid fra DOTAP-bromid ved hjelp av et ionebytte i kloroform/metanol/vandig HCl-løsningsmiddelsystem etterfulgt av rensing ved hjelp av kromatografi. DOTAP-bromid oppnås på forhånd in situ fra 1 -brom-2,3-dioleoyloksypropan.

Leventis og Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132, rapporterer om syntese av (2R,S)-DOTAP-klorid fra DOTAP-jodid ved hjelp av et ionebytting i to-fase løsemiddel/NaCl-løsnings-system. DOTAP-jodid oppnås på forhånd ved metylering av den tilsvarende dimetylamino-forbindelse ved hjelp av metyljodid.

Nantz et al, Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283, J. Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078, beskriver syntesen av (2R,S)-DOTAP-klorid ved ikke-vandig ionebytter-kromatografi. Den ønskede forbindelse dannes ved inndamping av eluatet.

Felgner et al. 5264618 US, utfører metylering av den tilsvarende dimetylaminoforbindelsen direkte til (2R,S)-DOTAP-klorid ved hjelp av metylklorid. De oppnår tilsynelatende en gul voks ved krystallisering fra acetonitril ved -20 °C. Imidlertid er (2R,S)-DOTAP-klorid praktisk talt uløselig i acetonitril ved romtemperatur. Forsøk på å reprodusere denne såkalte krystallisering ga kun amorft materiale ved størkning av den oljeaktige forbindelse oppnådd fra varm oppløsning til avkjøling. Det faktum at dette ikke er en krystallisering er også tydelig fra det faktum at forfatterne tilsynelatende ikke oppnådde en rensingseffekt og måtte rense stoffet ved kromatografi. Se også de komparative eksempler som viser at Felgner et al. ikke oppnådde krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid.

Spesielt hvis forbindelsene er beregnet for parenteral bruk, er et preparat som omfatter behandling med ionebytterharpiks, ekstremt problematisk med tanke på mulig mikrobiologisk forurensning, ettersom tilsvarende harpikser er et ideelt næringsmedium for bakterier, og selv etter at de er blitt drept, er det fremdeles en risiko for forurensning av endotoksiner.

WO 2006/056312 Al beskriver enantiomert rent DOTAP-klorid. En detaljert prosess for krystallisering er ikke angitt.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe krystallinske DOTAP - kloridsalter og hydrater med høy renhet og med tilstrekkelig kjemisk og fysisk stabilitet. Et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe disse krystallinske salter med lang holdbarhet, slik at de kan brukes for fremstilling av farmasøytiske formuleringer. Det er fortsatt et stort behov for en reproduserbar fremgangsmåte for fremstilling av stabile former av DOTAP-kloridsalter og hydrater som kan utføres i en industriell målestokk. Enantiomert rent DOTAP-klorid kan oppnås fra enantiomert rene utgangsmaterialer analogt med prosessene beskrevet for racematet, dvs.

via (R)- eller (S)-l-klor-2,3-dioleoyloksypropan,

via (R)- eller (S)-l-LG-2,3-dioleoyloksypropan og ionebytting (LG = forlatende gruppe) eller via (R)- eller (S)-l-dimetylamino-2,3-dioleoyloksypropan. Se WO 2006/056 312.

En ytterligere fremstillingsmetode som kan nevnes er rasematoppløsning av racemisk DOTAP-klorid.

Ved hjelp av forsøk er det nå overraskende blitt funnet at både racemisk og enantiomert rent krystallinsk DOTAP-klorid kan oppnås på en enkel måte, med høy kjemisk renhet, utmerket stabilitet og egnede håndteringsegenskaper for å håndtere disse forbindelser i en større teknisk målestokk. De krystallinske produkter som er oppnådd på denne måten har tilnærmet ubegrenset stabilitet ved romtemperatur under beskyttende gass. De er derfor egnet som bestanddel eller som utgangsmateriale for fremstilling av medikamentformer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig stabile krystallmodifikasjoner av racemisk og enantiomert rent DOTAP-klorid.

De stabile krystallmodifikasjoner kan være i krystallinsk og delvis krystallinsk form. De har en renhet som hittil aldri har blitt oppnådd på minst ca. 95 %, fortrinnsvis på > 98 %. Videre ble (2R,S)-DOTAP-klorid funnet å ha en stabilitet som hittil aldri har blitt oppnådd, høyere enn 99 vekt% og areal-% bestemt ved HPLC med hensyn til utgangsverdien når det lagres ved 25 °C i 36 måneder, eller i 40 °C i 12 måneder (se i denne forbindelse tabell 1 og tabell la).

En fagperson på området kan lett sette opp en passende HPLC-metode for å bestemme renheten og innholdet av DOTAP-klorid. For eksempel kan en Agilent 1200 HPLC med en Inertsil ODS-3-kolonne (150x3 mm, 15:00) (GL Sciences) benyttes som utstyr. Typiske eluenter er 10 mM pentan sulfonsyre-natriumsalt i vandig H3PO4(0,085 %) (eluent A) og 3,85 mM pentansulfonsyre-natriumsalt i 94 % acetonitril inneholdende vandig H3PO4(0,085 %) (eluent B). En egnet gradient er følgende (kjøringstid 25 min, post tid 5 min, strømning: 1,5 ml/min, 220 bar, 50 °C, injeksjons volum 10 ul):

DOTAP-kloird-krystallmodifikasj onene har et innhold på mindre enn 1 ekvivalent krystallvann eller -løsningsmiddel pr. ekvivalent DOTAP-klorid.

Krystallinsk (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP viser utmerkede og svært ønskelige håndteringsegenskaper, slik som en bemerkelsesverdig redusert hygroskopisitet og svært gode frittstrømmende egenskaper.

Krystallinsk (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP har et smeltepunkt over 160 °C, særlig mellom 183 og 185 °C, og en smelteentalpi på minst -130 J/g, fortrinnsvis over -140 J/g, spesielt mellom -143 og -159 J/g (se i denne forbindelse tabell 3).

De racemiske (2R,S)-DOTAP-kloridkrystallmodifikasjoner utviser moderat skarpe bånd i pulver-røntgendiffraksjonsmålinger (se i denne forbindelse fig. 1 og tabell 2). 2 Theta-verdier for krystallmodifisering er ca. 6,5; 12,6; 13,4; 19,5; 20,2; 21.5; 25,2 og 29,8, hvor de utvalgte 2 theta-verdiene er ca. 12,6; 19,5; 20,2; 21,5 og 25,2. Krystallinske former av (2R,S)-DOTAP-klorid tilsvarende røntgenpulverdiffraksjonsmønsteret vist i Fig.l, er innenfor rammen av oppfinnelsen.

Enantiomert rene (2S)-DOTAP-klorider er likeledes oppnådd i krystallinsk form. 2 Theta-verdier for krystallmodifikasjon er ca. 6,5; 12,8; 19,5; 19,8; 20,2; 20,7; 21,6 og 25,3, hvor utvalgte 2 theta verdier er ca. 12,8; 19,5; 19,8; 20,2 og 21,6 (se fig. 2 og tabell 2). Krystallinske former av (2 S)-DOTAP-klorid tilsvarende røntgenpulverdiffraksjonsmønsteret vist på fig. 2, er innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Enantiomert rene (2R)-DOTAP-klorider er likeledes oppnådd i krystallinsk form. 2 Theta-verdier for krystallmodifikasjon er ca. 6,6; 12,8; 19,5; 19,8; 20,3; 20,8; 21,6 og 25,3; hvor de utvalgte 2 theta-verdier er ca. 12,8; 19,5; 19,8; 20,3; og 21,6 (se fig. 3 og tabell 2). Krystallinske former av (2R)-DOTAP-klorid tilsvarende røntgenpulverdiffraksjonsrnønsteret vist på fig. 3, er innenfor rammen av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører dessuten en fremgangsmåte for fremstilling av (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP-klorid-krystallmodifikasjoner som er kjennetegnet ved at (2R)-, (2S)- og (2R,S )-DOTAP-klorid krystalliseres fra et aprotisk medium. Det aprotiske medium anvendt for dette formål kan være et aprotisk løsningsmiddel, eller en blanding av aprotiske løsningsmidler, eller en blanding av ett eller flere aprotiske løsningsmidler med et protisk løsningsmiddel eller en blanding av protiske løsningsmidler.

Egnede aprotiske løsningsmidler er aprotiske, oksygeninneholdende løsemidler, særlig

etere slik som for eksempel tetrahydrofuran, metyltetrahydrofuran, dioksan,

dietyleter, dipropyleter, diisopropyleter og metyl-tert-butyleter

ketoner slik som for eksempel aceton og 2-butanon, metylisobutylketon, metyl-isopropyl-keton, og

estere slik som for eksempel etylformat, metylacetat, etylacetat, propylacetat,

isopropylacetat, butylacetat, isobutyl acetat, dimetylkarbonat, dietylkarbonat og l,3-dioksolidin-2-on.

Anbefalte aprotiske løsemidler er ketoner.

Egnede protiske løsemidler er særlig

alkoholer slik som for eksempel metanol, etanol, n-propanol, isopropa-nol, n-butanol,

isobutanol, 2-butanol, tert-butanol, 3-metyl-l-butanol og etylen-glykol, metoksyetanol, etoksyetanol.

Dersom det aprotiske medium er en blanding av ett eller flere aprotiske løsningsmidler med et protisk løsningsmiddel, kan det aprotisk løsningsmiddel være et aprotisk, oksygenholdig løsningsmiddel som ovenfor definert, eller en

nitril slik som for eksempel acetonitril.

Løsningsmidlene kan i hvert tilfelle anvendes i ren form eller i form av en blanding, dvs. at det er mulig både å anvende de ulike aprotiske løsningsmidlene i en gruppe i form av en blanding, og også å anvende aprotiske løsningsmiddeltyper i form av en blanding med hverandre.

Dersom det aprotiske medium er en blanding av ett eller flere aprotiske løsningsmidler med et protisk løsningsmiddel, kan de protiske løsningsmidler være til stede fra > 0 vekt% til 40 vekt%, fortrinnsvis fra 10 vekt% til 20 vekt%, avhengig av anvendte betingelser, renheten av råmaterialer og målet for prosessen (utbytte, renhet av produktet, graden av krystallinitet). Fortrinnsvis bør et aprotisk medium som inneholder meget små mengder av vann anvendes. I en spesielt foretrukket utførelsesform er vann utelukket.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvendes aceton eller 2-propanol som aprotisk medium. I en meget foretrukket utførelsesform anvendes en blanding av aceton og 2-propanol. En blanding av 2-propanol og aceton omfatter typisk 0-25 % 2-propanol. Krystalliseringen av DOTAP-klorider kan utføres her direkte fra reaksjonsoppløsningen uten forutgående rensing. På samme måte kan krystallinsk DOTAP-klorid oppnås ved rekrystallisering av amorft, delvis krystallinsk eller krystallinsk materiale.

I en foretrukket utførelsesform er DOTAP-klorider som benyttes for fremstilling av krystallinske former derav, av høy kjemisk og optisk renhet, fortrinnsvis ved en renhet på ca.

> 95 % eller høyere, mer foretrukket omtrent 98 % eller mer, enda mer foretrukket omtrent 99 % eller høyere. I denne forbindelse anvendes, ved fremstilling av krystallinske DOTAP-klorider heri, meget ren oljesyre som en reaktant, noe som fører til meget rene DOTAP-klorider som krystalliserer lettere enn de DOTAP-klorider hittil tilgjengelige som har mindre renhet. Store urenheter som er typisk i for tiden tilgjengelige DOTAP-klorider, omfatter, men er ikke begrenset til, andre lipider eller derivater derav. Den aktuelle PhEUR-renheten (som derfor er "farma-kvalitet") av oljesyre i dag er fortsatt bare ca. 65-88 %. Ved meget ren oljesyre heri, er det ment en ultra-ren kvalitet som viser omtrent 95 % eller høyere, fortrinnsvis omtrent 99 % eller høyere. En passende svært ren oljesyre kan for eksempel kommersielt erholdes fra RCA. (lot OA 1 LG.01.2007) eller Acme Synthetic Chemicals (lot 060528).

Den enantiomere renhet kan for eksempel bestemmes ved måling av den optiske rotasjon.

I en foretrukket utførelse er DOTAP -klorider som benyttes for fremstilling av krystallinske former derav krystallisert eller rekrystallisert ut fra blandinger med passende løsningsmidler innenfor konsentrasjonsområder fra 1 del DOTAP-klorid til 4 deler løsningsmiddel opptil 1 del DOTAP-klorid til 100 deler løsningsmiddel, mest foretrukket innenfor konsentrasjonsområdene fra 1 del DOTAP-klorid til 4 deler løsningsmiddel opptil 1 del DOTAP-klorid til 10 deler løsningsmiddel.

Krystallisering av DOTAP-kloridmodifikasjoner oppnås som oftest spesifikt ved langsom avkjøling av den fremstilte løsning til temperaturer under 30 °C, for eksempel ved avkjøling ved en hastighet på 0,001 °C til 0,1 °C pr. minutt, for eksempel, 0,05 °C pr. minutt eller 0,004 °C pr minutt, som fører til kjøletider på ca. 5 til 200 timer, for eksempel ca. 10 timer til 50 timer. Spesifikke alternativer er å oppvarme oppløsningen til 35 °C og deretter sakte avkjøle til -12 °C over en periode på 12 timer, eller å oppvarme løsningen til lavere temperaturer, f.eks. 25 °C, eller å starte fra romtemperatur uten oppvarming, og deretter sakte avkjøling, f.eks. 10-50 timer, fortrinnsvis til -12 °C. Dannelsen av krystallene utføres enten spontant eller ved inokulering med den tilsvarende DOTAP-kloridkrystallmodifikasjonen.

Langsom avkjøling kan utføres ved hvilken som helst metode som er kjent for en fagperson innen teknikken. Vanligvis benyttes en kryostat.

Som nevnt tidligere er alle DOTAP-salter meget følsomme for oksidasjon, og som sådan foretrekkes utelukkelse av oksygen under fremstillingsmetodene beskrevet her, f.eks. ved å benytte en inert atmosfære, f.eks. nitrogenatmosfære og/eller ved hjelp av oppløsningsmidler med lavt oksygen- og peroksidinnhold.

Bruk av amorft eller delvis krystallinsk DOTAP-klorid som utgangsmateriale for foreliggende rekrystallisering gir, ved fremgangsmåten beskrevet, i det vesentlige krystallinske DOTAP-klorider med en hittil aldri oppnådd renhet sammen med en hittil aldri oppnådd stabilitet.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelsen av krystallinsk (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP-klorider for fremstilling av medikamentformuleringer siden de krystallinske (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP-klorider har utmerket stabilitet i fast form under gitte forhold og har konstant og svært god kvalitet i nesten ubegrenset tid.

Oppfinnelsen vedrører følgelig dessuten også de farmasøytiske sammensetningene som er resultat av bruken av de krystallinske (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP-kloridformer ifølge oppfinnelsen. Farmasøytiske preparater av denne typen kan omfatte krystallmodifikasj onene av (2R)-, (2S)- og (2R,S)-DOTAP-klorid sammen med andre farmasøytiske aktive forbindelser og kjente adjuvanser som normalt anvendes i medikamentfremstilling, så vel som ett eller flere løsemidler.

Disse farmasøytiske sammensetningene kan for eksempel være i form av liposomer, mikroemulsjoner, lipoplekser og nanopartikler, og inkluderer for eksempel en aktiv forbindelse fra gruppen av peptider, nukleotider, vaksiner eller cytostatiske midler.

Den foreliggende beskrivelse gjør det mulig for fagpersonen å anvende oppfinnelsen på en utstrakt måte. I tillegg kan de følgende eksempler tjene til bedre forståelse og som illustrasjon av mulige variasjoner av oppfinnelsen. Disse eksemplene bør derfor på ingen måte anses som begrensende.

Alle temperaturer som er nevnt i de følgende eksempler, er angitt i grader Celsius. Med mindre annet er oppgitt, innholdsdata er gitt som vekt%.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser røntgenspektra for krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid, fig. 2 viser røntgenspektra for krystallinsk (2S)-DOTAP-klorid.

Fig. 3 viser røntgenspektra for krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid.

Fig. 4 viser røntgenspektra for amorfe (2R,S)-DOTAP-klorid, fig. 5 viser røntgenspektra for krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid (a), krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid (b) og krystallinsk (2S)-DOTAP-klorid (c) i forhold til en kommersielt tilgjengelig prøve av (2R,S)-DOTAP-klorid (Avanti Polar Lipids) (d). Fig. 6 viser (2R,S)-DOTAP-klorid emulsjon (SM-0318-E) i acetonitril ved nedkjøling som i Felgner et al. Fig. 7 viser (2R,S)-D0TAP-kloridemulsjon (SM-0318-E) i acetonitril etter å ha avkjølt den ned til -20 °C, som i Felgner et al. Fig. 8 viser (2R,S)-DOTAP-klorid emulsjon (SM-0364-E) i acetonitril før nedkjøling som i Felgner et al. Fig. 9 viser (2R,S)-DOTAP-klorid emulsjon (SM-0364-E) i acetonitril etter å ha avkjølt den ned til -20 °C som i Felgner et al.

Fig. 10 illustrerer racemisk krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid.

Fig. 11 illustrerer faseovergangstemperaturer og smeltepunkter for ren krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid og ren krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid, så vel som to blandinger av begge de krystallinske formene. Fig. 12 illustrerer DVS-kurver for (2R,S)-DOTAP-klorid (øverst) og (2R)-DOTAP-klorid (nederst): amorfe former: diagrammer til høyre, krystallinske former (diagrammer til venstre)

(se karakteriseringseksempel 5).

Eksempler som illustrerer oppfinnelsen

Generelle merknader om eksperimentelle forhold:

Det er viktig å kjøle ned meget langsomt under krystallisering og rekrystallisering for å optimalisere utfelling av krystallinsk materiale.

Alle reagenser og løsningsmidler har svært lavt vanninnhold.

Alle operasjoner er utført i lukket utstyr under nitrogenatmosfære.

Det anvendes meget ren oljesyre med en renhet på mer enn 95 %, fortrinnsvis mer enn 98 %, enda mer foretrukket mer enn 99 %.

Måleparametere for røntgenpulverdiffraksjon er som følger:

STOE røntgenpulverdiffraksjon

Diffraksjon: Transmisjon

Monokromator: Buet Germanium (111)

Strålebølgelengde: 1,54060 Cu

Detektor: Lineær posisjonssensitiv detektor

Skannemetode: Debye-Scherrer/Moving Position Sensitive Detector/Fixed Omega

Det er vanlig i røntgenpulverdiffraksjonsstudier at små forskjeller i enkelte bånd kan oppstå hvis ulike instrumenter eller opptaksmetoder, slik som refleksjon eller overføring, eller kapillært eller vindu, blir utnyttet, eller om ulike opptaksforhold (f.eks. luftfuktighet eller temperatur) oppstår. En fagperson med vanlig kunnskap innen teknikken er godt kjent med slike små forskjeller og vil lett være i stand til å identifisere et gitt materiale i godt samsvar med et gitt røntgenpulverdiffraksjonsmønster med hensyn til metodene som er anvendt.

Fremstillingseksempel 1:

Utarbeidelse av krystallinsk racemisk ( 2 R. SVDOTAP- klorid r( R. SV1. 2- dioleovl- 3-propyltrimetylammoniumkloridl:

Startmaterialer

De følgende kjemikalier ble brukt:

N,N'-karbonyldiimidazol fra Sigma-Aldrich, lot 1252812

Oljesyre fra RCA, lot 11.G.Ol.2007 OA, 99,1 Areal-% (HPLC), hvor analysen kan være

99,5 % eller enda høyere siden linolsyre (hovedurenheten) viser mye høyere responsgrad i UV enn oljesyre.

(R,S)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol, fra MERCK EPROVA, lot MSCH-103-A, 0,11 %vann, 99,4 % (GC)

l,8-diazabisyklo[5.4.0]undec-7-en fra SIGMA ALDRICH, lot 1076841, 99,7 % (GC) Metylklorid fra LINDE, lot 61448

Natriumiodid fra SIGMA-ALDRICH, lot 1336385, 0,27 % vann

Aluminium oksid fra SIGMA-ALDRICH, lot 1336643

Acetonitril fra ICC, lot 0000426130, 100,0 % (GC), <0.015 % vann

n-Heptan fra BRENNTAG SCHWEIZERHALL, lot 0000278245, 96,4 % (GC)

2-propanol fra THOMMEN FURLER, lot 070920211487, 99,96 % (GC), 0,03 % vann Aceton fra THOMMEN FURLER, lot 080609324212, 99,98 % (GC), 0,16 % vann

Syntese av ( 2R, S)- DODAP[( R, S)- l, 2- dioleoyl- 3- dimethylammonium propan]

2,41 kg av N,N'-karbonyldiimidazol ble oppløst ved romtemperatur i 6,33 kg tørr acetonitril. Den resulterende løsning blir oppvarmet til 25 °C. Deretter ble 4,0 kg av oljesyre pumpet inn i oppløsningen over en periode på 60 minutter mens reaksjonstemperaturen ble regulert under 35 °C ved variasjon av tilsetningshastigheten (dannelse av karbondioksidgass). Etter at tilsetningen var fullstendig ble reaksjonsløsningen omrørt i ytterligere 90 minutter ved 30 °C (gassutvikling ble avsluttet). Deretter ble 11 g l,8-diazabisyklo[5.4.0]undec-7-en tilsatt, fulgt av en løsning på 0,83 kg av racemisk (R,S)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol i 0,37 kg tørr

acetonitril. Omrøring ved 30 °C fortsatte i 21 timer. Den resulterende emulsjon ble avkjølt til 25 °C, og omrøringen ble stoppet. To sjikt kom til syne. Det nedre sjikt ble isolert, avgasset ved 1 mbar/25 °C i 200 minutter og til slutt fortynnet med 11,7 kg n-heptan. Til oppløsningen ble det tilsatt 1,21 kg av basisk aluminiumoksid og suspensjonen ble omrørt i 3 timer ved 0 °C. Suspensjonen ble filtrert og filterkakeresten ble vasket med 1,5 kg n-heptan som

tidligere var avkjølt til 0 °C. De kombinerte filtrater ble homogenisert for å gi 15,9 kg løsning av 4,08 kg rent (2R,S)-DODAP i n-heptan (lot nr. MBA-116, prøve: 25,7 %, utbytte: 88,9 %).

En annen batch ble utført på samme måte, noe som resulterte i 16,6 kg løsning av 3,52 kg rent (2R,S)-DODAP i n-heptan (lot nr. MBA-117, prøve: 21,2 %, utbytte: 88,6 %).

Syntese av ( 2R, S)- DOTAP- klorid

23,4 kg løsning av 3,52 kg rent (2R,S)-DODAP i n-heptan (15,9 kg av lot nr. MBA-116 og 7,5 kg lot nr. MBA-117) ble tilført til reaksjonskaret og n-heptanble ble destillert av ved en kappetemperatur på 60 °C og redusert trykk. Når vakuumet forble stabilt ved 8 mbar ble kappetemperaturen regulert til 25 °C. Deretter ble 7,0 kg 2-propanol tilsatt etterfulgt av 3,1 g natriumjodid. Så ble reaksjonstemperaturen regulert til 30 °C, og nitrogen-atmosfæren ble erstattet med en metylkloridatmosfære med konstant absolutt trykk på 1200 mbar. Reaksjonsblandingen ble omrørt under disse betingelser i 137 timer inntil metylerings reaksjonen av (2R,S)-DODAP til (2R,S)-DOTAP-klorid var ferdig (96 % omdannelse). Forbruket av metylklorid var 1,39 kg.

Krystallisasjon av ( 2R, S)- DOTAP- klorid

Løsningen av (2R,S)-DOTAP-klorid i 2-propanol fremstilt som beskrevet ovenfor, ble

fortynnet med 35,8 kg tørr aceton ved 25 °C. Mengden av 2-propanol, som nevnt ovenfor, var 7 kg, og mengden av DOTAP-klorid basert på beregninger var 3,64 kg i løsningen. Den klare oppløsningen ble langsomt avkjølt til -12 °C med en kjølehastighet på 0,05 °C pr. minutt, dvs. nedkjølingen fant sted over en tidsperiode på 12 1/3 timer. Den resulterende suspensjon ble holdt ved -12 °C i ytterligere 14 timer og ble deretter filtrert gjennom et forhåndskjølt filter (-15 °C). Det urene (2R,S)-DOTAP-klorid ble vasket to ganger med 6,0 kg kald, tørr aceton (-18 °C).

Den oppnådde krystallmodifikasjon på dette punktet i dette bestemte eksperimentet ble ikke sjekket, men fra tidligere tilsvarende eksperimenter der det urene produktet ble isolert på dette punktet, er det kjent at krystallmodifikasjonen er som i krystallinsk (2R,S)-DOTAP.

For å oppnå et enda renere produkt, dvs. å fjerne noen mindre urenheter, ble et rekrystal-liseringstrinn utført.

Rekrystallisering av ( 2R, S)- DOTAP- klorid

Det våte urene (2R,S)-D0TAP-klorid ble oppløst i det lukkede filteret i en blanding av 44,1 kg tørr aceton og 3,5 kg 2-propanol ved 35 °C. Oppløsningen ble overført til reaksjons-beholderen og brakt til 0 °C. Oppløsningen ble langsomt avkjølt til -12 °C med en kjøle-hastighet på 0,004 °C pr. minutt, dvs. nedkjølingen fant sted over en tidsperiode på 50 timer. Den resulterende suspensjonen ble holdt ved -12 °C i ytterligere 16 timer og ble deretter filtrert med en avkjølt filter-tørker (-15 °C). Filterresten ble vasket to ganger med 0,8 kg kald tørr aceton (-18 °C) og tørket ved å anvende vakuum. Under tørking ble filtertørkeren oppvarmet til romtemperatur. Tørkingen ble avsluttet når vakuumet var stabilt ved 7,9 mbar. Utbytte: 3,46 kg krystallinsk racemisk (2R,S)-DOTAP-klorid (krystallinsk (2R,S)-DOTAP, lot nr. MBA-118, analyse: 100,0 %, utbytte: 37,8 % jfr. (R,S)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol, HPLC renhet: 99,9 % areal).

Et bilde av krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid kan finnes på figur 10.

Fremstillingseksempel 2:

Fremstilling av krystallinsk enantiomert ren (2R)-DOTAP-klorid [(R)-l,2-dioleoyl-3-propyltrimety lammoniumklorid]:

Startmaterialer

De følgende kjemikalier ble brukt:

N,N'-karbonyldiimidasol fra SIGMA-ALDRICH, lot 1252812

Oljesyre fra ACME SYNTHETIC CHEMICALS, lot 060528, 97,8 % (HPLC)

(R)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol, fra DAISO, lot RMA062151, 0,11 % vann, 99,6 %

(GC)

l,8-diazabisyklo[5.4.0]undec-7-en fra SIGMA ALDRICH, lot 1076841, 99,7 % (GC) Metylklorid fra LINDE, lot 61448

Natriumjodid fra SIGMA-ALDRICH, lot 1336385, 0,27 % vann

Acetonitril fra SIGMA ALDRICH, lot 7219K, 100,0 % (GC), 0,005 % vann

n-Heptan fra BRENNTAG SCHWEIZERHALL, 0000278245 lot, 96,4 % (GC)

2-propanol fra THOMMEN FURLER, lot 070629176434, 99,96 % (GC), 0,016 % vann Aceton fra THOMMEN FURLER, lot 061201101946, 99,98 % (GC), 0,10 % vann

Syntese av ( 2R)- DODAP[( R)- l, 2- dioleoyl- 3- dimetylammonium propan]

1,63 kg N,N'-karbonyldiimidazol ble oppløst ved romtemperatur i 4,3 kg tørr acetonitril. Oppløsningen ble oppvarmet til 25 °C. Deretter ble 2,7 kg av oljesyre pumpet inn i oppløsningen over en periode på 60 minutter mens reaksjonstemperaturen ble regulert under 35 °C ved variasjon av tilsetningshastighet (dannelse av karbondioksidgass). Etter at tilsetningen var fullstendig ble reaksjonsløsningen omrørt i ytterligere 105 minutter ved 30 °C (gassutvikling ble avsluttet). Da ble 7,5 g l,8-diazabicyklo[5.4.0 undec-7-en tilsatt, fulgt av en løsning av 0,56 kg enantiomert rent (R)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol i 0,25 kg tør acetonitril. Omrøring ved 30 °C ble fortsatt i 19 timer. Den resulterende emulsjon ble avkjølt til 10 °C, og omrøringen ble stoppet. To sjikt fremkom. Det nedre sjikt ble isolert, avgasset ved 0,1 mbar/20 °C i 30 minutter og til slutt fortynnet med 9,7 kg n-heptan. Suspensjonen ble omrørt i 1,5 timer ved 0 °C og filtrert for å gi 12,3 kg løsning av 2,66 kg ren (2R)-DODAP i n-heptan (lot nr. MBR-001, prøve: 21,6 %, utbytte: 88,4 %).

Syntese av ( 2R)- DOTAP- klorid

12,2 kg løsning av 2,66 kg ren (2R)-DODAP i n-heptan (lot nr. MBR-001) ble tilført reaksjonskaret og n-heptan ble destillert av ved en kappetemperatur på 60 °C og redusert trykk. Når vakuumet forble stabilt ved 1 mbar, ble kappetemperaturen justert til 20 °C. Deretter ble 3,26 kg 2-propanol tilsatt, etterfulgt av 1,4 g natriumjodid. Da ble reaksjonstemperaturen regulert til 30 °C, og nitrogenatmosfæren erstattet med en metylkloridatmosfære med konstant absolutt trykk på 1250 mbar. Reaksjonsblandingen ble omrørt under disse betingelser i 330 timer inntil metyleringen av (2R)-DODAP til (2R)-DOTAP-klorid var ferdig (97 % omdannelse). Forbruket av metylklorid var 0,58 kg.

Krystallisering av ( 2R)- DOTAP- klorid

Løsningen av (2R)-DOTAP-klorid i 2-propanol fremstilt som beskrevet ovenfor, ble fortynnet med 16,2 kg tørr aceton ved 25 °C. Mengden av 2-propanol, som nevnt ovenfor, var 3,26 kg og mengden av DOTAP-klorid basert på beregninger var 2,78 kg i løsningen. Den klare oppløsningen ble langsomt avkjølt til -12 °C med en kjølehastighet på 0,05 °C pr. minutt, dvs. nedkjølingen skjedde over et tidsrom på 12 1/3 timer. Den resulterende suspensjon ble holdt ved -12 °C i ytterligere en time og ble så filtrert gjennom et forkjølt filter (-12 °C). Det urene (2R)-DOTAP-klorid ble vasket to ganger med 3,2 kg av kald tørr aceton (-18 °C). Det krystallinske produktet var krystallinsk (2R)-DOTAP.

Den oppnådde krystallmodifikasjon ble ikke sjekket på dette punktet i dette bestemte eksperimentet, men fra tidligere tilsvarende eksperimenter der det urene produktet ble isolert på dette punktet, er det kjent at krystallmodifikasjonen er som i krystallinsk (2R)-DOTAP. For å oppnå et enda renere produkt, dvs. å fjerne noen mindre urenheter, ble et rekrystal-leringstrinn utført.

Rekrystallisering av ( 2R)- DOTAP- klorid

Det våte urene (2R)-DOTAP-klorid ble oppløst i det lukkede filter i en blanding av 20,5 kg tørr aceton og 1,63 kg 2-propanol ved 35 °C. Oppløsningen ble overført til reaksjons- beholderen og brakt til 25 °C. Oppløsningen ble langsomt avkjølt til -12 °C med en kjøle-hastighet på 0,05 °C pr. minutt, dvs. nedkjølingen skjedde over en tidsperiode på 12 1/3 timer. Den resulterende suspensjon ble holdt ved -12 °C i ytterligere 9 timer, og ble deretter filtrert med en avkjølt filtertørker (-12 °C). Filterresten ble vasket to ganger med 3,2 kg kald tørr aceton (-18 °C) og tørket ved å anvende vakuum. Under tørking ble filtertørkeren varmet opp til romtemperatur. Tørkingen ble avsluttet når vakuumet var stabilt ved 0,6 mbar. Utbytte: 1,47 kg krystallinsk enantiomert rent (2R)-DOTAP-klorid (lot nr. MBR-002, analyse: 99,7 %, utbytte: 44,7 % ref. til (R)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol, HPLC-renhet: 99,9 % areal).

Fremstilling Eksempel 3:

Fremstilling av krystallinske enantiomert rent ( 2S)- DOTAP- klorid r( S)- l, 2- dioleovl- 3-propyltrimetylammoniumklorid: (2S)-DOTAP-klorid [(S)-l,2-dioleoyl-3-propyltrimetylammoniumklorid] ble fremstilt på samme måte som (R)-DOTAP-klorid (se ovenfor) ved å begynne fra det enantiomert rene utgangsmaterialet (S)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol (lot SMA062281 fraDAISO, 0,14 % vann, GC: 99,8 %; alle andre kjemikalier var identiske) og girl ,67 kg krystallinsk enantiomert rent (2S)-DOTAP-klorid (lot nr. MBS-002, analyse: 99,6 %, utbytte: 50,4 % ref. til (S)-3-(dimetylamino)-l,2-propandiol, HPLC-renhet: 100,0 % areal).

Karakteriseringseksempel 1

Stabilitet

For å bestemme stabiliteten av krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid, ble forbindelsen lagret ved 25 °C og 60 % relativ fuktighet (tabell 1) eller ved 40 °C og 7 5% relativ fuktighet (tabell la) med utelukkelse av luft. Gjenværende innhold av (2R,S)-DOTAP-klorid ble målt med jevne mellomrom og notert i forhold til den opprinnelige verdi.

Renheten og innhold av DOTAP-klorid ble bestemt ved hjelp av HPLC under anvendelse av følgende metode:

Følgende verdier ble funnet:

Bestemmelse av stabiliteten kan gjentas ved ethvert ønsket tidspunkt, verdiene angitt i tabell 1 og la er reproduserbare.

Ovennevnte stabilitetsdata bekrefter at krystallinsk DOTAP-klorid er en stabil substans. Selv etter 36 måneder var ingen signifikant nedbrytning observert for prøvene lagret ved 25 ± 2 °C. Ovennevnte stabilitetsdata bekrefter at krystallinsk DOTAP-klorid er en stabil substans. Selv ved akselererte betingelser ble det etter 12 måneder ikke observert noen signifikant nedbrytning for prøvene lagres ved 40 ± 2 °C.

Krystallinske (2R)- og (2 S)-DOTAP-klorid viser sammenlignbare stabilitets verdier.

Karakteriseringseksempel 2

Pulver-røntgenstråle- diagrammer

For karakterisering av de strukturelle egenskapene (krystall-modifikasjoner) til krystallinske DOTAP-klorider, ble pulver-røntgenstråle-diagrammer (diffraksjonsspektra) av slike stoffer registrert.

Krystallinske (2R,S>, (2R)- og (2S)-DOTAP-klorider gir spektra med moderat skarpe band som har forholdsvis god oppløsning for lipider. Spektrene indikerer høyt krystallinsk innhold. Ingen amorfe fraksjoner er synlig under polariserende mikroskop.

Eksempler på spektra er vist i fig. 1, fig. 2 og fig. 3.

For sammenligning er et spektrum av et kommersielt tilgjengelige, amorfe prøver vist i fig. 4 (amorf). Fig. 5 viser sammenligningen av røntgenspektra for krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid (a), krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid (b) og krystallinsk (2S)-DOTAP-klorid (c) i forhold til et kommersielt tilgjengelig prøve av (2R,S)-DOTAP-klorid (Avanti Polar Lipids) (d).

Tabell 2 lister valgte 2 thetaverdier for de ulike krystallmodifikasjoner av racemisk og enantiomert rene DOTAP-klorider:

Karakteriseringseksempel 3

Smeltepunkt og smelte-entalpi

Smeltepunktet og smelte-entalpi av krystallinske DOTAP-klorider ble bestemt ved differensiert skanning-kalorimetri (DSC) (30-350 °C, 5,0 °C/min, N280 ml /min).

De resulterende smeltepunkter og smelte-entalpier for hhv. racemiske (2R,S)- og enantiomert rene (2R)- (2S)-DOTAP-klorider er listet opp i tabell 3.

Karakteriseringseksempel 4

Faseovergangstemperaturer og entalpier

Faseovergangstemperaturer og entalpi av de krystallinske DOTAP-kloridsaltene bestemt ved differensiert skanning-kalorimetri (DSC) (30-350 °C, 5,0 °C/min, N280 ml /min).

I tillegg til smeltepunktene (se Karakteriseringseksempel 3) ble flere overgangspunkter til krystallinske resp. væskekrystallinske faser observert.

Tilsvarende faseovergangstemperaturer og entalpier for hhv. racemiske (2R,S)- og enantiomert rene (2R)-(2S)-DOTAP-klorider er listet opp i tabell 4.

Når DSC-eksperimentet ble utført på blandinger av rent krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid og rent krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid, ble alle fase-overgangstemperaturer av både racematet og enantiomeren, observert. Fig. 11 illustrerer faseovergangstemperaturer og smeltepunkter for rent krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid og rent krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid, så vel som blandinger av begge krystallinske former i forholdet 100:50 og 63:100. Disse forholds-tallene er svarende til et innhold av 33,3 mol% resp. 19,3 mol% av (2S)-DOTAP-klorid i blandingene.

Konklusjon:

Krystallmodifikasjoner av krystallinsk enantiomert rent DOTAP-klorid og krystallinsk racemisk DOTAP-klorid er tydelig.

Karakteriseringseksempel 5

Vannopptak avhengig av relativ fuktighet

Vannabsorpsjonen av DOTAP-klorid bestemmes av Dynamic Vapor Sorption (DVS) med en Projekt Messtechnik SPS 11-100N vanndamp absorpsjonsanalysator. Prøvene plasseres i aluminiumdigler på toppen av en mikrovekt og får komme i likevekt ved 25 °C og 0 % r.h.

(relativ fuktighet) over natten før de utsettes for to fukte-/tørkesykluser ved 25 °C med en skannehastighet på A r.h. = 5% h"<1>og 'isohumide' ekvilibreringsperioder på de ekstreme verdiene.

Prøver av krystallinsk (2R,S)-DOTAP-klorid, krystallinsk (2R)-DOTAP-klorid, amorfe (2R,S)-DOTAP-klorid og amorfe (2R)-DOTAP-klorid ble undersøkt.

Resultater:

Sammenligningen av DVS-kurvene (se Figur 12: første syklus heltrukket linje, andre syklus stiplet linje) påpeker karakteristiske forskjeller mellom de krystallinske og amorfe prøver: De krystallinske prøvene (diagrammer til venstre på Figur 12) viser en stabil vekt på lav r.h., mens vekten av de amorfe prøver (diagrammer til høyre på figur 12) øker allerede rett over 0 % r.h. I tillegg til prøvene som hadde vært krystallinske ved begynnelsen, ble en betydelig større hysterese observert i begge sykluser. En forskjell kan også observeres mellom de racemiske (diagrammer på toppen av Figur 12) og de enantiomert rene (diagrammer på bunnen av Figur 12) prøver: De racemiske prøvene viser en kraftig økning i vanninnhold på ca. 10-15 % r.h., mens de isomerisk rene prøvene viser dette trinnet på ca. 20-25 % r.h.

Sammenligningseksempel 1

1 det heri reproduserte eksperiment til Felgner et al., har alle eksperimentelle forhold blitt valgt å være i nært samsvar med US 5264618 (Felgner et al.), Eksempel 5, kolonne 27, linjene 15-47.

31,5 g av oleoylklorid (FLUKA 0733IAH) oppløst i 125 ml kloroform ble tilsatt dråpevis ved 4 °C under avkjøling i løpet av en periode på 1 Vz time, til 5,0 g 3-(dimetylamino)-l,2-propandiol oppløst i 37,5 ml kloroform og 25 ml pyridin. Den gule oppløsningen ble omrørt natten over. Så ble 125 ml kaldt vann og 125 ml dietyleter tilsatt. Den organiske fasen ble vasket to ganger med 100 ml 0,5 N HC1 og også to ganger med 100 ml 0,5 N natrium-bikarbonatløsning. 39 g vannfritt natriumsulfat ble tilsatt og den således oppnådde suspensjon ble filtrert og vasket med 100 ml kloroform. Filtratet ble så konsentrert under redusert trykk ved 40 °C. 40,1 g av en brun væske (SM-0318-A) som hadde et (2R,S)-DODAP-innhold på 24,3 vekt% bestemt ved HPLC, ble resultatet. En ytterligere tørking under redusert trykk ved 60 °C resulterte i en reduksjon av vekten til 31,2 g.

31,0 g av dette materiale ble renset ved hjelp av kiselsyre-kolonnekromatografi som følger: Silikagel: 129 g (mengden av silikagel ble beregnet i forhold til mengden (2R,S)-DODAP) Merck 60 F 63-200um

Kolonne: diameter 4 cm, høyde 60 cm

Strømningshastighet: ca. 8 ml/min

Som mobil fase ble først 500 ml metylenklorid (fraksjoner 1-27), deretter 1 000 ml metylenklorid/metanol 95:5 (fraksjoner 28-47) og til slutt 1 000 ml metanol anvendt. Fraksjoner ble oppsamlet og kombinert i henhold til deres TLC-analyse. Så ble fraksjonene 4-33 ble konsentrert sammen under redusert trykk. 10,8 g av en brun olje (SM-0318-B) som har et (2R,S)-DODAP innhold på 65,6% vekt/vekt, bestemt ved HPLC, ble resultatet. Og fraksjoner 34-42 ga 12,6 g av en brun olje (SM 0318-D) som hadde et (2R,S)-DODAP innhold på 54,2 vekt% målt ved HPLC.

10,4 g Metylenklorid ble tilsatt til 9,6 g av forbindelsen oppnådd ut av fraksjonene 4-33 (SM-0318-B) i et høytrykks glassrør. Glassrøret ble så lukket og den brunaktige oppløsningen ble oppvarmet over natten ved 50 °C for å danne en emulsjon. Da ble røret åpnet og gjenværende metylenklorid ble fjernet ved fordampning. 8,0 g av en gul voks (SM-0318-E) som hadde et (2R,S)-DOTAP-kloridinnhold på 65,0 vekt% og 1,3 vekt% (2R,S)-DODAP, begge bestemt ved HPLC, ble resultatet.

14,0 g acetonitril ble tilsatt til denne voks (SM-0318-E). Den således oppnådde emulsjon ble overført med 80 ml acetonitril (for å få et forhold mellom fast stoff til væske på omtrent 1:12) til en kolbe og kjølt ned til 20 °C. Ingen krystallisering kunne observeres. Ved 20 °C ble et størknet honningaktig, gulbrunlig materiale resultatet, selv når bare litt oppvarming ga en tendens til å bli et klebrig, viskøst, brunaktig materiale.

Konklusjon

Dataene viser at l,2-dioleoyl-3-propyltrimetylammoniumklorid ((2R,S)-DOTAP-klorid) fremstilt i henhold til prosedyren ovenfor, som er i henhold til US-5.264.618 (Felgner et al), eksempel 5, kolonne 27, linjene 15-47, ikke kan oppnås i krystallinsk form.

Se også figurene 6 og 7 som illustrerer henholdsvis (2R,S)-DOTAP-kloridemulsjon (SM-0318-E) i acetonitril ved nedkjøling og (2R,S)-DOTAP-kloridemulsjon (S-0318-E) i acetonitril etter å ha vært nedkjølt til -20 °C.

Sammenligningseksempel 2

En videre reproduksjon av forsøket til Felgner et al. ble fremstilt, og bekrefter samme oppdagelse som ovenfor.

Alle eksperimentelle forhold er valgt for å være så nært som mulig til vilkårene for utarbeidelse/isolering av (2R,S)-DOTAP-klorid som beskrevet i US 5264618 (Felgner m.fl.) Eksempel 5, kolonne 27, linjene 15-47.

I dette forsøket ble spesiell vekt lagt på reaktantmålene, bruken av vannfritt pyridin, metyleringstiden og rørets temperatur.

Innenfor US 5264618 (Felgner m.fl.) Eksempel 5 ble ingen gyldige data på det anvendte råstoffet funnet. For omarbeiding ble oleoylklorid fra SIGMA-ALDRICH (Art. Nr. 367850, Lot 0733IAH.) og 3-(dimetylamino)-l,2-propandiol fra TCI (Art. Nr. D2072, Lot FGC01EF) brukt. Dietyleter (art. nr. 8.22270.1000, Lot Nr. K33237470), natriumsulfat (art. nr. 8.22286.5000, Lot Nr. TA603386), sjøsand (art. nr. 1.07711.5000, Lot. Nr. TA1417811), Silicagel 60 F 63-200 nm (art.nr. 1.07734.9025, Lot Nr. TA1570234) og acetonitril (art. nr. 1.15500.1000, Lot. Nr. K38172000) var alle fra Merck KGaA. Kloroform (art. nr. 34854, Lot Nr. 8178C) og pyridin over molekylærsil, H20 <0,005 % (art. nr. 82704, Lot Nr. 1166921) var fra Fluka.

5,0 g av 3-(dimetylamino)-l,2-propandiol ble oppløst ved romtemperatur i 25 ml vannfritt pyridin og 37,5 ml frisk destillert kloroform. Oppløsningen ble avkjølt til 4 °C. 31,5 g av Oleoylklorid ble oppløst i 125 ml destillert kloroform. Oleoylkloridløsningen ble tilsatt dråpevis til den kalde 3-(dimetylamino)-l,2-propandiolløsning over en periode på en time. Den gule oppløsningen ble omrørt natten over. Så ble 125 ml kaldt vann og 125 ml dietyleter tilsatt. Den organiske fasen ble vasket to ganger med 100 ml 0,5 N HCI og deretter også to ganger med 100 ml 0,5 N natriumbikarbonatoppløsning. Deretter ble 39 g vannfritt natriumsulfat tilsatt. Den således oppnådde suspensjon ble filtrert og det gjenværende faste stoffet ble vasket med 20 ml kloroform. Filtratet ble så konsentrert under redusert trykk. 31,5 g av en brun væske (SM 0364 A) som har et l,2-dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan (DODAP)-innhold på 62,2 vekt% målt ved HPLC, ble resultatet.

En silikagelkolonne ble fremstilt som følger:

Kolonne: diameter 4 cm, høyde 60 cm

Silikagel: 200 g silikagel og 42,6 g sjøsand (beregnet i forhold til mengden av DODAP) Flyt: omtrent 7 ml/min 15 g av materialet fremstilt ovenfor (SM 0364 A) ble tilsatt dråpevis på silikagelkolonnen og renset med 50 ml kloroform. Kolonnen ble først eluert med 1 000 ml kloroform, deretter med 1, 000 ml kloroform/metanol 95/5, deretter med 1250 ml kloroform/metanol 90/10 og til slutt med 2500 ml metanol. Fraksjoner ble oppsamlet og kombinert i henhold til deres tynnsjikts-kromatografi-analyse på silikagelplater (Merck 60 F254), utviklet med kloroform/aceton/- metanol/eddiksyre/vann i 50/15/5/5/2 volumdeler, deteksjon av jod. Etter konsentrering under redusert trykk resulterte kombinerte fraksjoner 11-17 i 4,88 g (SM 0364 B) som har et DODAP-innhold på 73,2 vekt%, fraksjoner 18-27 ga 7,24 g (SM 0364 C) med et innhold på 68,2 DODAP vekt%, og fraksjoner 28-31 ga 1,9 g (SM 0364 D) som har et DODAP- innhold på 40,4 vekt%, alle målt ved HPLC. Totalt ble en massebalanse på 93,5 % resultatet.

1,0 g av forbindelsen oppnådd ut fra de reneste fraksjonene 11-17 (SM-0364-B) ble tilsatt i et tungveggs borsilikatglassrør med mulighet for høyttrykk (Sigma Aldrich Zl 81072-1 EA). Deretter ble 10 ml metylklorid kondensert inn i glassrøret. Glassrøret ble deretter tett lukket

og holdt ved 70 °C i 72 timer. Så ble røret avkjølt til 0 °C, åpnet og rest-metylklorid ble fjernet ved fordampning. Dette resulterte i 1,11 g av en gul-brunlig voks (SM 0364 E) som hadde et (2R,S)-DOTAP-kloridinnhold på 69,3 vekt%, og som viste et DODAP-innhold på 1,8 vekt%, og et innhold av oljesyre på 2,7 vekt% (alle målt ved HPLC).

Til 1,08 g av forbindelsen erholdt som beskrevet ovenfor (SM 0364 E) blelO ml acetonitril tilsatt og oppvarmet til 50 °C. Den således oppnådde emulsjon ble avkjølt til -20 °C. Ingen krystallisering kunne observeres. Ved -20 °C ble en gul-brunlig voks resultatet.

Konklusjon:

Som vist ovenfor når man omarbeider utførelsen som ligger nærmest US 5264618 (Felgner et al) kunne bare amorft (2R,S)-DOTAP-klorid oppnås.

Se også figur 8 og 9 som illustrerer henholdsvis (2R,S)-DOTAP-kloridemulsjon (SM-03 64-E) i acetonitril før den avkjøles og (2R,S)-DOTAP-kloridemulsjon (SM-0364-E) i acetonitril etter å ha blitt avkjølt til -20 °C.

Uten ytterligere utdypning er det antatt at en fagmann på området, ved hjelp av den forutgående beskrivelse, kan utnytte den foreliggende oppfinnelse i sin fulle utstrekning. De foregående foretrukne, spesifikke utførelsesformer skal derfor tolkes som bare illustrerende, og ikke begrensende for det resterende av redegjørelsen på noen som helst måte.

De foregående eksempler kan gjentas med lignende suksess ved å substituere de generiske eller spesifikt beskrevne reaktanter og/eller driftsbetingelser ifølge oppfinnelsen som ble anvendt i de foregående eksempler.

Fra beskrivelsen ovenfor kan en fagmann lett fastslå de vesentlige karakteristika av denne oppfinnelsen og kan, uten å avvike fra ånden og omfanget derav, gjøre forskjellige endringer og modifikasjoner av oppfinnelsen for å tilpasse den til forskjellige anvendelser og betingelser.

Claims (15)

1. Krystallinsk (2R,S>, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid,karakterisert vedat det krystallinske (2R,S)-DOTAP-klorid har en av de følgende egenskaper: 2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 12,6, omtrent 19,5, omtrent 20,2, omtrent 21,5 og omtrent 25,2; eller

2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 6,5, omtrent 12,6, omtrent 13,4, omtrent 19,5, omtrent 20,2, omtrent 21,5, omtrent 25,2 og omtrent 29,8, eller et røntgenpulver-diffraksjonsmønster svarende til mønsteret angitt i fig. 1; eller det krystallinske (2S)-DOTAP-kloridet har et av de følgende kjennetegn: 2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 12,8, omtrent 19,5, omtrent 19,8, omtrent 20.2 og omtrent 21.6;

2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 6,5, omtrent 12,8, omtrent 19,5, omtrent 19,8, omtrent 20,2, omtrent 20,7, omtrent 21,6 og omtrent 25,3, eller et røntgenpulver-diffraksjonsrnønster svarende til mønsteret angitt i fig. 2; eller det krystallinske (2R)-DOTAP-kloridet har en av de følgende kjennetegn: 2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 12,8, omtrent 19,5, omtrent 19,8, omtrent 20.3 og omtrent 21.6;

2 thetaverdier omfattende minst verdier på omtrent 6,6, omtrent 12,8, omtrent 19,5, omtrent 19,8, omtrent 20,3, omtrent 20,8, omtrent 21,6 og omtrent 25,3, eller et røntgenpulver-diffraksjonsmønster svarende til mønsteret angitt i fig. 3.

2. Krystallinsk (2R,S>, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid, som har en stabilitet på mer enn 99 vekt% og areal-% bestemt ved HPLC ved oppbevaring ved 25 °C i 36 måneder, eller i 40 °C i 12 måneder.

3. Krystallinsk (2R,S>, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid, som har en kjemisk renhet på minst omtrent 95 % bestemt ved HPLC.

4. Krystallinsk (2R,S) -, (2S> eller (2R)-DOTAP-klorid i henhold til ett eller flere av kravene 1 til 3, som har et smeltepunkt høyere enn 160 °C og en smeltepunktentalpi på mer enn-130 J/g.

5. Farmasøytisk preparat som omfatter krystallinsk (2R,S)-, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid i henhold til ett eller flere av kravene 1 til 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 5, videre omfattende ett eller flere peptider, nukleotider, antigener, cytostatiske midler, liposomer, lipoplekser, nanopartikler eller mikroemulsjoner, eller en blanding derav.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av en krystallinsk form av (2R,S)-, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4, som omfatter krystallisering av (2R,S)-, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid fra en eller flere aprotiske oppløsningsmidler.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvori de ett eller flere aprotiske oppløsningsmidler omfatter ett eller flere protiske løsningsmidler.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, hvor krystallisering finner sted under en inert atmosfære.

10. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 7 til 9, hvor krystalliseringen finner sted ved langsom avkjøling i en hastighet på 0,001 °C til 0,1 °C pr. minutt i 5 til 200 timer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor langsom avkjøling skjer over en tidsperiode på omtrent 10 til 100 timer.

12. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 7-11, hvor krystallisering skjer direkte fra en reaksjonsoppløsning uten forutgående rensing, der reaksjonsoppløsningen er fra en fremstillingsprosess av (2R,S>, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid.

13. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 7-12, som videre omfatter en rekrystallisering av krystallinsk (2R,S)-, (2S> eller (2R)-DOTAP-klorid.

14. Krystallinsk (2R,S>, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid som oppnås ved en fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 7-13.

15. Fremgangsmåte for transfeksjon av en celle, omfattende å administrere til nevnte celle et krystallinsk (2R,S)-, (2S)- eller (2R)-DOTAP-klorid ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4.