JP2018203776A - Dotap塩化物の安定な結晶改質物 - Google Patents
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Abstract
Description
法、及び医薬組成物の調製のためのその使用に関する。
ものと同じ周知の用途を有する。
−ビス[(−1−オキソ−9−オクタデセニル)オキシ]−1−プロパンアミニウムクロ
ライド又は1,2−ジオレオイルオキシ−3−トリメチルアンモニウムプロパンクロライ
ドとしても知られている、N,N,N−トリメチル−2,3−ビス[[(9Z)−1−オ
キソ−9−オクタデセニル]オキシ]−1−プロパンアミニウムクロライドのラセミ(2
R,S)−形又は異性体的にそれぞれ純粋な(2R)−若しくは(2S)−形、及びその
水和物を示す。
197974−73−58(ラセミ体、一水和物)
428506−51−8(2S形態)、328250−28−8(2R形態
)。
リポソームは、親水性物質を水性の内部に封入することができ、また親油性物質を脂質膜
の内部に組み込むことができる両親媒性の物質で、通常、天然脂質を含む合成多層小胞(
球状で自己内蔵型の膜)である。
タミン、補酵素、スキンケア剤及び日焼け止めが組み込まれている。リポソームは、一般
に、局所的に適用される。
る場合よりも、より特徴的な器官分配を達成可能にするので、リポソームは製薬技術にお
けるさらなる重要性をますます博している。
場合、リポプレックスが得られる。
ナノ粒子(nanoparts)の形成を可能にする。これらは、リポソームとほぼ同じ
大きさの粒子であるが、水相を有さず、その代わりに、その内部に油相を有するものであ
る。それらは、親油性物質のカプセル化に特に適している。
である。それらは、1〜500nmの粒径を有し、液体と同様に振る舞う。
のバイオ医薬品に関連して、可溶化効果は、前述の用途の場合に非常に大きな重要性を有
する。
達成することができる。
に、これらは、両性イオン特性を有していない。カチオン性脂質を単独で、又はリン脂質
または他の脂質様化合物との組み合わせで含むリポソームは、正に帯電した表面を有する
。これは、外側に負に帯電した表面を有する細胞、例えば、内皮細胞に対して高い親和性
を生じさせる。
物を細胞の内部に輸送(形質移入:transfection)するDOTAPベースの及び他のカチ
オン性のリポソーム及びリポプレックスの能力である。
のとする。これらの特性は、カチオン性DOTAPリポソームに組み込まれた従来の細胞
増殖抑制剤の適用の可能性を生じさせる。
メシル酸塩、メチル硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩または二硫酸塩及びトリフレー
トなどの他のDOTAP塩類の形質移入特性は、文献から十分に公知である。
DOTAP塩化物よりも優れた形質移入率を達成している。
き、他の塩の長所がここでは発現しないことを意味している。特にヒトにおける医療用途
、中でも非経口応用のために、例えば、生理学的に許容されるアニオンとのDOTAP塩
、例えば、相当する塩化物または酢酸塩は、それ故好ましい。
質と純度の最大要求を生じさせる。そのため、これら化合物の調製、調製の再現性及び副
生物プロファイルに関して、当局側に非常に厳しい規制がある。非経口的に使用される物
質の場合には、病原性微生物及びエンドトキシンによる微生物汚染は、さらに、厳密に回
避され、制御されなければならない。
定であり、それらが医薬製剤の製造のための使用に適するように、それ自体を許容される
純度で調製することは困難である。
うに、すべてのDOTAP塩は、酸化に対して非常に敏感であり、不飽和脂肪酸誘導体の
酸化生成物は、一般に、高い毒性を有する。
ば、高沸点油状形態であり、それ故工業的には、適切な品質は大きな困難を伴ってのみ得
ることができる。
安定性を克服する従来の方法は、後から投入されるべき活性化合物との相互作用を除外で
きないことからDOTAP塩化物の一般的な使い勝手を大いに制限する。製造、保存及び
使用中の酸素の完全排除は、事実上不可能であるか、極めて多大な努力によってのみ可能
性が高められる。
の大気湿度レベルで極めて短時間にグリース状の膜を与えるように潮解する。これは、こ
の化合物の取り扱い性を遙かに困難なものとしている。
措置下でのみ可能である。つまり、非晶質DOTAP塩化物の製造者は一般的に−20℃
で保護ガス下に保存することを勧めており、約六ヶ月の貯蔵寿命を保証しているに過ぎな
い。
臭化物からクロロホルム/メタノール/HCl水溶液の溶媒系でのイオン交換、それに
続くクロマトグラフィーを用いた精製による(2R,S)−DOTAP塩化物の合成を概
説している。DOTAP臭化物は、1−ブロモ−2,3−ジオレオイルオキシプロパンか
らインサイチュで予め得られる。
1023(1990) 124-132に、二相溶媒/NaCl溶液系でイオン交換によるDOTAPヨウ
化物からの(2R,S)−DOTAP塩化物の合成を報告している。DOTAPヨウ化物
は、対応するジメチルアミノ化合物のヨウ化メチルを用いたメチル化によって予め得られ
る。
. 40(1997)4069-4078に、非水性イオン交換クロマトグラフィーによる(2R,S)−D
OTAP塩化物の合成を記載している。所望の化合物は溶離液の蒸発によって得られる。
を用いて直接(2R,S)−DOTAP塩化物への対応するジメチルアミノ化合物のメチ
ル化を実施している。彼らは明らかに−20℃でアセトニトリルからの結晶化により黄色
ワックスを得ている。しかしながら、(2R,S)−DOTAP塩化物は、室温でアセト
ニトリルに事実上不溶である。このいわゆる結晶化の再現の試みは、熱溶液からの冷却に
より得られた油状物の凝固を介して非晶質材料のみを与えた。これが結晶化ではないとい
う事実は、また、著者らが明らかに精製効果に達しておらず、クロマトグラフィーにより
物質を精製する必要があるという事実から明らかである。また、フェルグナーらが、結晶
質(2R,S)−DOTAP塩化物に達しないことを実証している比較例を参照されたい
。
む製造は、相当する交換樹脂がバクテリアにとって最適な栄養培地であり、それらが殺菌
された後でもエンドトキシンによる汚染危機が依然として残ることから、考え得る微生物
汚染の点から非常に問題である。
て開示している。結晶化のための詳細なプロセスは開示されていない。
び物理的安定性を伴って提供することである。本発明のさらなる目的は、それらを医薬製
剤の調製のために使用されることを可能にする長期貯蔵寿命を伴ってこれらの結晶質の塩
を提供することである。工業的規模で実施できるDOTAP塩化物塩及び水和物の安定形
態を再現可能な製造方法の大きな需要が引き続き存在する。
鏡像異性的に純粋な出発物質から、すなわち、
(R)−または(S)−1−クロロ−2,3−ジオレオイルオキシプロパンを介して、
(R)−または(S)−1−LG−2,3−ジオレオイルオキシプロパン及びイオン交
換を介して(LG=脱離基)、又は
(R)−または(S)−1−ジメチルアミノ−2,3−ジオレオイルオキシプロパンを
介して得ることができる。WO 2006/056312を参照されたい。
る。
質物に関する。
化物は、高い化学純度、優れた安定性、及びかなりの技術的規模でこれらの化合物を処理
するための適切な取り扱い性をもって単純な方法で得られることが見出された。この方法
で得られた結晶製品は、保護ガス下、室温で実質的に制限のない安定性を有する。それら
は、薬剤形態の調製のための成分として、または出発物質としても好適である。
いない、少なくとも約95%、好ましくは>98%の純度を有する。また、(2R,S)
−DOTAP塩化物は、従来到達していない、25℃で36ヶ月間又は40℃で12ヶ月
間保存した時に、開始値に関連して質量基準及びHPLCにより測定した面積%基準で9
9%より高い安定性を有する(これに関しては、表1及び表1aを参照)。
準備することが可能である。例えば、Inertsil ODS−3カラム(150×3
mm、3μm)(GIサイエンス社製)を備えたAgilent 1200 HPLC
はその装置として使用することができる。典型的な溶離液は、H3PO4水溶液(0.0
85%)中の10mMのペンタンスルホン酸ナトリウム塩(溶離液A)及びH3PO4水
溶液(0.085%)を含む94%アセトニトリル中の3.85 mMのペンタンスルホ
ン酸ナトリウム塩(溶離液B)である。適切なグラジエントは以下の通り(走査時間25
分、ポスト時間5分;流速:1.5ml/分;220バール;50℃;注入量;10μl
):
は結晶溶媒の含量を有する。
湿性と非常に優れた自由流動機能など優れた非常に望ましい取り扱い性を示す。
特に183℃と185℃との間に融点と、少なくとも−130J/g、好ましくは少なく
とも−140J/g、特に−143J/gと−159J/gの間に融解エンタルピーとを
有する(これに関して表3を参照)。
適度に鋭いバンド(これに関して図1及び表2参照)を示す。
0.2、21.5、25.2及び29.8であり、ここで選択した2シータ値は約12.
6、19.5、20.2、21.5及び25.2である。図1に示されるX線粉末回折パ
ターンに対応した結晶質(2R,S)−DOTAP塩化物は、本発明の範囲内である。
晶改質物のための2シータ値は約6.5、12.8、19.5、19.8、20.2、2
0.7、21.6及び25.3であり、選択された2シータ値は約12.8、19.5、
19.8、20.2、及び21.6である(図2、表2を参照)。図2に示されるX線粉
末回折パターンに対応する(2S)−DOTAP塩化物の結晶形は、本発明の範囲内であ
る。
晶改質物のための2シータ値は約6.6、12.8、19.5、19.8、20.3、2
0.8、21.6及び25.3であり、選択された2シータ値は約12.8、19.5、
19.8、20.3、及び21.6である(図3、表2を参照)。図3に示されるX線粉
末回折パターンに対応する(2R)−DOTAP塩化物の結晶形は、本発明の範囲内であ
る。
改質物の製造方法に関し、(2R)−、(2S)−及び(2R,S)−DOTAP塩化物
を非プロトン性媒体から結晶化させることを特徴する。この目的のために使用される非プ
ロトン性媒体は、1種の非プロトン性溶媒、または非プロトン性溶媒の混合物、又は1種
又はそれ以上の非プロトン性溶媒と1種のプロトン性溶媒またはプロトン性溶媒の混合物
との混合物であることができる。
例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエー
テル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルtert−ブチルエーテル
などのエーテル類、
例えば、アセトン、2−ブタノン、メチルイソブチルケトン、メチルイソプロピルケト
ンなどのケトン類、
例えば、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢
酸ブチル、酢酸イソブチル、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート及び1,3−
ジオキソリジン−2−オンなどのエステル類、である。
例えば、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノ
ール、イソブタノール、2−ブタノール、tert−ブタノール、3−メチル−1−ブタ
ノール、エチレングリコール、メトキシエタノール、エトキシエタノールなどのアルコー
ル類である。
であるならば、非プロトン性溶媒は上記で定義した非プロトン性の酸素含有溶媒であり得
るか、または例えばアセトニトリルなどのニトリルであり得る。
すなわち、混合物の形態で1つのグループ内の様々な非プロトン性溶媒を使用することも
、互いに混合物の形態で非プロトン性溶媒の様々な種類を使用することの両方が可能であ
る。
物であるならば、プロトン性溶媒は、適用された条件、原料の純度や処理の目標(収率、
生成物の純度、結晶化度)に応じて、0質量%を超え40質量%まで、好ましくは10質
量%〜20質量%で存在させることが可能である。好ましくは、水の非常に少量を含有す
る非プロトン性媒体を用いるべきである。特に好ましい実施形態では、水は除外される。
して使用される。非常に好ましい実施形態では、アセトンと2−プロパノールの混合物が
使用される。典型的には、2−プロパノールとアセトンの混合物は、0〜25%の2−プ
ロパノールを含む。
うことができる。同様に、結晶質DOTAP塩化物は、非結晶質、部分的結晶質または結
晶質材料の再結晶により得ることができる。
ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上、さらに好ましくは約99%以上の
、高い化学純度及び光学純度のものである。この点において、結晶質DOTAP塩化物の
調製は、反応物質として非常に純粋なオレイン酸を使用し、これにより、低い純度を有す
る従来入手可能なDOTAP塩化物よりも、より容易に結晶化する高純度DOTAP塩化
物をもたらす。現在入手可能なDOTAP塩化物の典型的な主要な不純物が含まれるが、
これらは他の脂質やその誘導体に限定されない。オレイン酸の実際のPhEUR純度(そ
れ故、「医薬品品質」である)は、最近までたかだか約65〜88%である。ここで非常
に純粋なオレイン酸とは、約95%以上、好ましくは約99%以上を示す超高純度の品質
を意味する。適した非常に純粋なオレイン酸は、例えば、RCA社(ロットOA 11.
G.01.2007)またはAcme Synthetic Chemicals社(ロ
ット060528)から商業的に取得することができる。
当な溶媒と共に、1部のDOTAP塩化物:4部の溶媒から1部のDOTAP塩化物:1
00部の溶媒までの範囲、最も好ましくは1部のDOTAP塩化物:4部の溶媒から1部
のDOTAP塩化物:10部の溶媒までの範囲の濃度で晶出されるか再晶出される。
℃、例えば、毎分0.05℃又は毎分0.004℃の冷却速度によって、約5〜200時
間、例えば、約10〜50時間で、30℃以下の温度に調製された溶液をゆっくりと冷却
することにより、通常達成される。特定のオプションは溶液を35℃に加熱し、その後−
12℃まで12時間かけて徐冷するか、又はより低い温度、例えば、25℃に溶液を加熱
するか、または加熱することなく室温から始め、その後好ましくは−12℃に、10〜5
0時間かけて徐冷する。結晶の形成は、自発的にまたは対応するDOTAP塩化物の結晶
改質物の種入れ(inoculation)によって実施される。
イオスタットが使用される。
えば不活性雰囲気を用いる、窒素雰囲気を用いる、及び/又は低い酸素及び過酸化物含有
量の溶媒を用いることにより、本明細書に開示される製造方法中の酸素の排除が好ましい
。
載された製造過程によって、従来達成されなかった安定性と共に、従来達成されなかった
純度の本質的に結晶質のDOTAP塩化物を与える。
が規定の条件下で固形における優れた安定性を有し、事実上無制限の時間、定常的に非常
に良好な品質を有していることから、結晶質(2R)−、(2S)−及び(2R,S)−
DOTAP塩化物の医薬製剤の調製のための使用に関する。
S)−DOTAP塩化物形態の使用から得られる医薬組成物に関する。この種の医薬組成
物は、通常の医薬製剤に用いられる他の医薬活性化合物や公知のアジュバントと、並びに
一つ以上の溶剤と共に、(2R,S)−、(2S)−及び(2R)−DOTAP塩化物の
結晶改質物を含むことができる。
及びナノ粒子の形態であって、例えば、ペプチド、ヌクレオチド、ワクチン又は細胞増殖
抑制剤の群からの活性化合物を含むことができる。
、理解を容易にするためであり、本発明の可能な変形について示すのに役立つ。これらの
例は、従って、決して限定的とみなされるべきではない。
、内容物データは質量%として与えられる。
実験条件に関する一般備考:
結晶質物質の沈殿を最適化するために、結晶化及び再結晶化の間は非常にゆっくりと冷
却することが重要である。
非常に純粋なオレイン酸が使用される。
回折:透過
モノクロメータ:湾曲ゲルマニウム(111)
線波長:1.54060 Cu
検出器:リニア位置感知型検出器
スキャンモード:デバイ−シェラー/移動位置検出器/固定オメガ
反射か透過か、又はキャピラリかウィンドウか等の異なる装置又は記録方法が利用され
る場合、あるいは異なる記録条件(例えば、大気湿度または温度)が使用されている場合
、各バンドのわずかな違いが発生する可能性があることが、X線粉末回折研究において一
般的である。当業者は、そのようなわずかな違いに非常に精通しており、容易に使用され
る方法を考慮した所定のX線粉末回折パターンに近似した一致により、所与の物質を識別
することができるであろう。
結晶質ラセミ体(2R,S)−DOTAP塩化物[(R,S)−1,2−ジオレオイル
−3−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド]の製造:
出発物質
以下の化学物質が使用された:
・シグマアルドリッチ社からのN,N’−カルボニルジイミダゾール、ロット12528
12。
・RCA社からのオレイン酸、ロットOA 11.G.01.2007、99.1面積%
(HPLC)。アッセイ(assay)は、オレイン酸よりもUVにおいてはるかに高い
応答を示すリノール酸(主要不純物)として、99.5%又はより高いかもしれない。
・MERCK EPROVA社からの(R,S)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プ
ロパンジオール、ロットMSCH−103−A、0.11%の水、99.4%(GC)。
・シグマアルドリッチ社からの1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エ
ン、ロット1076841、99.7%(GC)。
・LINDE社からの塩化メチル、ロット61448。
・シグマアルドリッチ社からのヨウ化ナトリウム、ロット1336385、0.27%水
。
・シグマアルドリッチ社からの酸化アルミニウム、ロット1336643。
・ICC社からのアセトニトリル、ロット0000426130、100.0%(GC)
、<0.015%の水。
・BRENNTAG SCHWEIZERHALL社からのn−ヘプタン、ロット000
0278245、96.4%(GC)。
・THOMMENN FURLER社からの2−プロパノール:、ロット0709202
11487、99.96%(GC)、0.03%水。
・THOMMENN FURLER社からのアセトン、ロット080609324212
、99.98%(GC)、0.16%の水。
ニウムプロパン]の合成
2.41kgのN,N’−カルボニルジイミダゾールを室温で、6.33kgの乾燥ア
セトニトリルに溶解する。得られた溶液を25℃まで加熱する。次いで、添加速度の変更
により反応温度を35℃以下に規制しつつ、4.0kgのオレイン酸を60分間にわたっ
て溶液にポンプで送る(二酸化炭素ガスの生成)。添加が完了した後、反応溶液を30℃
でさらに90分間撹拌する(ガスの発生が終了)。次いで、11gの1,8−ジアザビシ
クロ[5.4.0]ウンデカ−7−エンを添加し、次に乾燥アセトニトリル0.37kg
中0.83kgのラセミ体(R,S)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオ
ールの溶液を加える。30℃での攪拌を21時間継続する。得られたエマルションを25
℃に冷却し、攪拌を停止する。2つの層が現れる。下層を分離し、1 mbar/25℃
で200分間脱気し、最終的に、11.7kgのn−ヘプタンで希釈する。溶液に、塩基
性酸化アルミニウムの1.21kgを添加し、懸濁液を0℃で3時間撹拌する。懸濁液を
濾過し、濾過残渣を予め0℃に冷却したn−ヘプタン1.5kgで洗浄する。合わせた濾
液を均質化して、純粋な(2R,S)−DODAP4.08kgのn−ヘプタン溶液15
.9kgを得る(ロットNo.MBA−116、アッセイ:25.7%、収率:88.9
%)。
ン溶液16.6kgとなるように実施される(ロットNo.MBA−117、アッセイ:
21.2%、収率:88.6%)。
純粋な(2R,S)−DODAP3.52kgのn−ヘプタン溶液23.4kg(ロッ
トNo.MBA−116の15.9kgとロットNo.MBA−117の7.5kg)を
反応容器に投入し、n−ヘプタンを60℃のジャケット温度で減圧蒸留する。真空が8m
barで安定した時、ジャケット温度を25℃に調整する。次に、7.0kgの2−プロ
パノール、次いで3.1gのヨウ化ナトリウムを加える。次に、反応温度を30℃に調整
し、窒素雰囲気を1200mbarの一定の絶対圧で塩化メチル雰囲気に置き換える。こ
の反応混合物は(2R,S)−DODAPの(2R,S)−DOTAP塩化物へのメチル
化反応が終了するまで137時間にわたってこれらの条件下で撹拌する(96%の転化率
)。塩化メチルの消費量は1.39kgである。
上記のように調製された(2R,S)−DOTAP塩化物の2−プロパノール溶液を、
乾燥アセトン35.8kgを用いて25℃で希釈する。2−プロパノールの量は、上記の
ように、7kgであり、溶液中のDOTAP塩化物の量は計算に基づいて3.64kgで
ある。透明な溶液は毎分0.05℃の冷却速度でゆっくり−12℃まで冷却する、すなわ
ち、12 1/3時間(12時間20分)の期間にわたって冷却が行われる。得られた懸
濁液はさらに14時間−12℃に維持し、その後予冷フィルタ(−15℃)で濾過する。
粗(2R,S)−DOTAP塩化物を、冷乾燥アセトン(−18℃)の6.0kgで2回
洗浄する。
で原料生成物が単離された対応する以前の実験から、結晶改質物が結晶質(2R,S)−
DOTAPの結晶改質物であることが分かっている。
ために、再結晶化工程を行う。
湿った粗(2R,S)−DOTAP塩化物を乾燥アセトン44.1kgと2−プロパノ
ール3.5kgの混合物に密閉フィルタ中、35℃で溶解する。その溶液を反応容器に移
し、0℃とする。溶液を毎分0.004℃の冷却速度、すなわち、50時間かけてゆっく
り−12℃まで冷却する。得られた懸濁液を−12℃でさらに16時間保持し、その後冷
却したフィルタドライヤー(−15℃)で濾過する。濾過残渣は0.8kgの冷乾燥アセ
トン(−18℃)で2回洗浄し、真空乾燥する。乾燥中にフィルタドライヤーを室温まで
温める。真空度が7.9mbarで安定したら、乾燥が完了する。収量:3.46kgの
結晶ラセミ(2R,S)−DOTAP塩化物(結晶質(2R,S)−DOTAP、ロット
No.MBA−118、アッセイ:100.0%、収率:(R,S)−3−(ジメチルア
ミノ)−1−プロパンジオールを参照として37.8%、HPLC純度:99.9%面積
)。
結晶質の鏡像異性的に純粋な(2R)−DOTAP塩化物[(R)−1,2−ジオレオ
イル−3−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド]の製造:
出発物質
以下の化学物質が使用された:
・シグマアルドリッチ社からのN,N’−カルボニルジイミダゾール、ロット12528
12。
・ACME SYNTHETIC CHEMICALS社からのオレイン酸、ロット06
0528、97.8%(HPLC)。
・DAISO社からの(R)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール、ロ
ットRMA062151、0.11%の水、99.6%(GC)。
・シグマアルドリッチ社からの1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エ
ン、ロット1076841、99.7%(GC)。
・LINDE社からの塩化メチル、ロット61448。
・シグマアルドリッチ社からのヨウ化ナトリウム、ロット1336385、0.27%水
。
・シグマアルドリッチ社からのアセトニトリル、ロット7219K、100.0%(GC
)、0.005%の水。
・BRENNTAG SCHWEIZERHALL社からのn−ヘプタン、ロット000
0278245、96.4%(GC)。
・THOMMENN FURLER社からの2−プロパノール、ロット07062917
6434、99.96%(GC)、0.016%の水。
・THOMMENN FURLER社からのアセトン、ロット061201101946
、99.98%(GC)、0.10%の水。
ロパン]の合成
N,N’−カルボニルジイミダゾール1.63kgを、室温で、4.3kgの乾燥アセ
トニトリル中に溶解する。溶液を25℃まで加熱する。添加速度の変更により反応温度を
35℃以下に規制しつつ、オレイン酸2.7kgを60分かけて溶液にポンプで送る(二
酸化炭素ガスの生成)。添加が完了した後、反応溶液を30℃でさらに105分間撹拌す
る(ガスの発生終了)。次に、7.5gの1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデ
カ−7−エンを、次いで、乾燥アセトニトリル0.25kg中0.56kgの鏡像異性的
に純粋な(R)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオールの溶液を添加した
。30℃での攪拌を19時間継続する。得られたエマルションを10℃に冷却し、攪拌を
停止する。2つの層が現れる。下層は分離し、0.1 mbar/20℃で30分間脱気
し、最後にn−ヘプタンの9.7kgで希釈した。この懸濁液を0℃で1.5時間撹拌し
、濾過して、2.66kgの純粋な(2R)−DODAPのn−ヘプタン溶液12.3k
gを得る(ロットNo.MBR−001、アッセイ:21.6%、収率:88.4%)。
2.66kgの純粋な(2R)−DODAPのn−ヘプタン溶液12.2kg(ロット
No.MBR−001)を反応容器に投入し、n−ヘプタンを60℃のジャケット温度で
減圧下に留去する。真空度が1mbarで安定したら、ジャケット温度を20℃に調整す
る。次に、2−プロパノール3.26kgを、次いで1.4gのヨウ化ナトリウムを添加
する。次いで、反応温度を30℃に調整し、窒素雰囲気を1250mbarの一定の絶対
圧で塩化メチル雰囲気に置き換える。反応混合物を、(2R)−DODAPの(2R)−
DOTAP塩化物のメチル化反応が終了するまで(97%転化率)、330時間にわたっ
てこれらの条件下で撹拌する。塩化メチルの消費量は0.58kgである。
上記のように調製された(2R)−DOTAP塩化物の2−プロパノール溶液を、25
℃で16.2kgの乾燥アセトンで希釈する。2−プロパノールの量は、上述したように
、3.26kgであり、計算に基づく溶液中のDOTAP塩化物の量は2.78kgであ
る。
透明な溶液を−12℃まで毎分0.05℃の冷却速度、すなわち、12 1/3時間か
けてゆっくりと冷却する。得られた懸濁液はさらに1時間、−12℃に保たれ、その後、
予め冷却したフィルタ(−12℃)を通して濾過する。粗(2R)−DOTAP塩化物を
、冷乾燥アセトン(−18℃)3.2kgで2回洗浄する。結晶生成物は、結晶質(2R
)−DOTAPの結晶である。
で原料生成物が単離された対応する以前の実験から、結晶改質物が結晶質(2R)−DO
TAPの結晶改質物であることが分かっている。
ために、再結晶化工程を行う。
湿った粗(2R)−DOTAP塩化物を乾燥アセトン20.5kgと2−プロパノール
1.63kgの混合物に密閉フィルタ中、35℃で溶解する。その溶液を反応容器に移し
、25℃とする。溶液を、毎分0.05℃の冷却速度、すなわち、12時間20分かけて
ゆっくり−12℃まで冷却する。得られた懸濁液を−12℃でさらに9時間保持し、その
後冷却したフィルタドライヤー(−12℃)で濾過する。濾過残渣を3.2kgの冷乾燥
アセトン(−18℃)で2回洗浄し、真空乾燥する。乾燥中にフィルタドライヤーを室温
まで温める。真空度が0.6mbarで安定したら、乾燥が完了する。収量:1.47k
gの鏡像異性的に純粋な結晶質(2R)−DOTAP塩化物(ロットNo.MBR−00
2、アッセイ:99.7%、収率:(R)−3−(ジメチルアミノ)−1−プロパンジオ
ールを参照して44.7%、HPLC純度:99.9%面積)。
鏡像異性的に純粋な結晶質(2S)−DOTAP塩化物[(S)−1,2−ジオレオイ
ル−3−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド]の調製:
(2S)−DOTAP塩化物[(S)−1,2−ジオレオイル−3−プロピルトリメチ
ルアンモニウムクロライド]は、鏡像異性的に純粋な出発物質の(S)−3−(ジメチル
アミノ)−1−プロパンジオール(DAISO社からのロットSMA062281、0.
14%の水、GC:99.8%、他のすべての化学物質が一致)から開始して(R)−D
OTAP塩化物(上記参照)と同じ方法で製造され、1.67kgの鏡像異性的に純粋な
結晶質(2S)−DOTAP塩化物(ロットNo.MBS−002、アッセイ:99.6
%、収率:50.4%[(S)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール参
照]、HPLC純度:100.0%面積)として得る。
安定性
結晶質(2R,S)−DOTAP塩化物の安定性を決定するために、物質は25℃、相
対湿度60%(表1)又は40℃、相対湿度70%(表1a)で空気を排除して保存する
。(2R,S)−DOTAP塩化物の残量を周期的な間隔で測定し、初期値と比較して引
用している。
カラム:ODS−3:150×3mm、3μm、GIサイエンス社:イナートシル
溶離液A:0.085%H3PO4水溶液中の10mMペンタンスルホン酸ナトリウム
塩
溶離液B:0.085%H3PO4水溶液を含む94%アセトニトリル中の3.85m
Mのペンタンスルホン酸ナトリウム塩
グラジエント:0分 75%B
1分 75%B
6分 90%B
7分 100%B
20分 100%B
25分 75%B
ポスト時間: 5分 75%B
ランタイム:25分
流量:1.5ml/分
圧力:約220バール
カラム温度:50℃
注入量:10μl
以下の値が検出された:
安定性判定は任意の時点で繰り返すことができ、表1及び表1aに示される値が再現可
能である。
36ヶ月後でさえ、25±2℃で保存されたサンプルに有意な低下は認められなかった。
加速された条件でさえ、40±2℃で保存されたサンプルに12ヶ月後では有意な低下は
認められなかった。
粉末X線図
結晶質DOTAP塩化物の構造的特徴(結晶改質物)の特性評価のために、これらの物
質の粉末X線回折図(回折スペクトル)が記録される。
比較的良好な解像度を有する適度にシャープなバンドでスペクトルを与える。スペクトル
は、高結晶質の内容を示している。非晶質フラクションは、偏光顕微鏡下で表示されない
。
。図5は、X線スペクトルの比較であり、結晶質(2R,S)−DOTAP塩化物(a)
、結晶質(2R)−DOTAP塩化物(b)及び結晶質(2S)−DOTAP塩化物(c
)、比較として(2R,S)−DOTAP塩化物の市販サンプル(Avanti Pol
ar Lipids)(d)である。
て選択された2シータ値を示す。
融点と融解エンタルピー
結晶質DOTAP塩化物の融点と融解エンタルピーは、示差走査熱量測定(DSC)(
30〜350℃、5.0℃/分、N2 80ml/分)で決定される。
OTAP塩化物の得られた融点及び溶融エンタルピーを表3に示す。
相転移温度とエンタルピー
結晶質DOTAP塩化物の相転移温度とエンタルピーが、示差走査熱量測定(DSC)
(30〜350℃、5.0℃/分、N2 80ml/分)で決定される。
される。
DOTAP塩化物に対して対応する相転移温度及びエンタルピーを表4に記載する。
−DOTAP塩化物の混合物において行われ、ラセミ体と鏡像異性体の両方のすべての相
転移温度が観察される。図11は、純粋な結晶質(2R,S)−DOTAP塩化物の相転
移温度及び融点を、両結晶形の100:50及び63:100の比の混合物と共に示して
いる。これらの比率は、混合物中でそれぞれ33.3モル%と19.3モル%の(2S)
−DOTAP塩化物の量に相当する。
結晶質で鏡像異性的に純粋なDOTAP塩化物及び結晶質のラセミDOTAP塩化物の
結晶改質物は区別される。
相対湿度に依存する吸水率
DOTAP塩化物の吸水率は、Projekt Messtechnik社製 SPS
11−100n水蒸気吸着分析器を使用して動的蒸気吸着(Dynamic Vapor Sorption:
DVS)によって決定される。
の走査速度及び極端な値での等湿度(isohumid)平衡期間の2回の加湿/乾燥サイクルに
曝す前に、25℃、0%r.h.(相対湿度)で一晩平衡化されている。
ファス(2R,S)−DOTAP塩化物及びアモルファス(2R)−DOTAP塩化物の
サンプルを評価した。
DVS曲線の比較(図12参照、第1サイクルを実線、第二サイクルを破線)は、結晶
質と非晶質のサンプル間の特性差を指摘している。結晶質のサンプル(図12の左図)は
、低湿度で安定質量を示すが、対して、非晶質のサンプル(図12の右図)の質量は0%
r.h.を超えるとすぐに、既に増加している。また、開始時に結晶であったサンプルに
ついて、かなり大きなヒステリシスが両サイクルにおいて観察される。違いはまた、ラセ
ミ体サンプル(図12の上図)と鏡像異性的に純粋なサンプル(図12の下図)との間に
観察することができる。ラセミ体サンプルは約10〜15%r.h.で含水量の急激な増
加を示すのに対し、異性体的に純粋なサンプルは約20〜25%r.h.で、このステッ
プを示す。
ここでのフェルグナーらの再現実験において、すべての実験条件は、米国特許5,26
4,618(フェルグナーら)のカラム27、15−47行の例5に緊密に準拠するよう
に選択された。
−1,2−プロパンジオール5.0gに、125mlのクロロホルムに溶解した塩化オレ
オイル(FLUKA 0733IAH)31.5gを、冷却下に4℃で1時間半かけて滴
下した。黄色溶液を一晩撹拌した。次いで、125mlの冷水及び125mlのジエチル
エーテルを加えた。有機相を100mlの0.5N HClで2回、また100mlの0
.5N炭酸水素ナトリウム溶液で2回洗浄した。39gの無水硫酸ナトリウムを添加し、
そうして得られた懸濁液を濾過し、100mlのクロロホルムで洗浄した。その後、濾液
を40℃で減圧下に濃縮した。HPLCにより測定された24.3%w/wの(2R,S
)−DODAP含量を有する褐色の液体(SM−0318−A)40.1gが得られた。
さらに60℃、減圧下での乾燥は、31.2gへの質量減少をもたらした。
算された)、メルク社製、60 F 63−200μm
カラム:直径4cm、高さ60cm
フロー:約8ml/分
移動相としてまず1,500mlの塩化メチレン(画分1−27)、次いで、1,00
0mlの塩化メチレン/メタノール95:5(画分28−47)、最後に1,000ml
のメタノールを使用した。画分は、それらのTLC分析に従って採取混合した。それで画
分4−33を減圧下に一緒に濃縮した。HPLCにより測定した65.6%のw/wの(
2R,S)−DODAP含量を有する褐色のオイル(SM−0318−B)10.8gが
得られた。そして画分34−42は、HPLCにより測定した54.2%w/wの(2R
,S)−DODAP含量を有する褐色のオイル(SM−0318−D)12.6gをもた
らした。
化合物9.6gに高圧ガラスチューブ中で加えた。ガラスチューブを閉じ、茶色がかった
溶液を50℃で一晩加熱し、エマルションを形成した。次いで、チューブを開放し、残留
塩化メチレンを蒸発除去した。HPLCにより測定した65.0%w/wの(2R,S)
−DOTAP塩化物含量と1.3%w/wの(2R,S)−DODAP含量を有する黄色
ワックス(SM−0318−E)8.0gが得られた。
ようにして得られたエマルションを80mlのアセトニトリルでフラスコに移し(約1:
12の固液比を得るよう)、20℃に冷却した。結晶化は観察できなかった。20℃で固
形蜜状の黄褐色の物質は、わずかに暖めただけで、どろどろの粘性茶色物質になる傾向に
あった。
データは、米国特許5,264,618(フェルグナーら)の、カラム27、47〜1
5行の実施例5にしたがって、上記手順で得られた1,2−ジオレオイル−3−プロピル
トリメチルアンモニウムクロライド((2R,S)−DOTAP塩化物)は、結晶形態で
得ることができないことを示す。
SM−0318−E)の冷却開始時、及びアセトニトリル中の(2R,S)−DOTAP
塩化物エマルション(SM−0318−E)が−20℃まで冷却された後を示す図6及び
7を参照されたい。
フェルグナーらの実験の更なる再現は、上記と同様の知見を確認して準備した。
15−47行の例5に記載されるように、(2R,S)−DOTAP塩化物の調製/分離
が可能な限り緊密に準拠するように選択された。
チューブの温度において設定されている。
なデータを見出すことはできない。再現実験の塩化オレオイルには、シグマアルドリッチ
社製(製品番号367850,ロット0733IAH)を、3−(ジメチルアミノ)−1
,2−プロパンジオールには、TCI社製(製品番号D2072,ロットFGC01EF
)を用いた。ジエチルエーテル(製品番号8.22270.1000,ロット番号K33
237470)、硫酸ナトリウム(製品番号8.22286.5000,ロット番号TA
603386)、海砂(製品番号1.07711.5000、ロット番号TA14178
11)、シリカゲル60 F 63−200μm(製品番号1.07734.9025、
ロット番号TA1570234)及びアセトニトリル(製品番号1.15500.100
0、ロット番号K38172000)はすべてメルクKGaA社のものであった。クロロ
ホルム(製品番号34854、ロット番号8178C)とモレキュラーシーブを通したH
2O≦0.005%のピリジン(製品番号82704,ロット番号1166921)はフ
ルカ(Fluka)社のものであった。
ジンと37.5mlの新たに蒸留したクロロホルムに室温で溶解した。溶液を4℃に冷却
した。31.5gの塩化オレオイルを125mlの蒸留クロロホルムに溶解した。塩化オ
レオイル溶液を1時間かけて冷3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール溶液
に滴下した。黄色溶液を一晩撹拌した。次いで、125mlの冷水及び125mlのジエ
チルエーテルを添加した。有機相を100mlの0.5N HClで2回、さらに100
mlの0.5N重炭酸ナトリウム溶液で2回を洗浄した。その後、39gの無水硫酸ナト
リウムを加えた。このようにして得られた懸濁液を濾過し、残留固体を20mlのクロロ
ホルムで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮した。HPLCで測定による62.2%w/wの
1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)含量を有する
31.5gの茶色液体(SM 0364 A)となった。
シリカゲル:200gシリカゲル及び42.6g海砂(DODAPの量に対して計算
)
フロー:約7 ml/分
上記で製造した材料(SM 0364 A)15gを、シリカゲルカラムに滴下し、5
0mlのクロロホルムですすいだ。カラムはまず1,000mlのクロロホルムで、次い
で、1,000mlのクロロホルム/メタノール 95/5で、次いで、1,250ml
のクロロホルム/メタノール 90/10、最後に2,500mlのメタノールで溶出し
た。画分を、体積比50/15/5/5/2のクロロホルム/アセトン/メタノール/酢
酸/水で展開し、ヨウ素で検出するシリカゲルプレート(メルク社製、60 F254)
上での薄層クロマトグラフィー分析に従って採取混合した。減圧下で濃縮した後、以下す
べてHPLCにより測定した73.2%w/wのDODAP含量を有する混合画分11−
17の4.88g(SM 0364 B)、68.2%w/wのDODAP含量を有する
画分18−27の7.24g(SM 0364 C)、40.4%w/wのDODAP含
量を有する画分28−31の1.9グラム(SM 0364 D)をもたらした。合計で
93.5%の質量バランスをもたらした。
加圧可能な、厚肉ホウケイ酸ガラスチューブ(シグマアルドリッチ社製 Z181072
−1 EA)に加えた。次いで10mlの塩化メチルをガラスチューブに圧入した。ガラ
スチューブを密閉し、次いで、70℃で72時間保持した。次にチューブを0℃に冷却し
、解放して、残留塩化メチルを留去した。これにより、69.3%w/wの(2R,S)
−DOTAP塩化物含量を有し、1.8%w/wのDODAP含量及び2.7%w/wの
オレイン酸含量を示す黄褐色のワックス(SM 0364 E)1.11gをもたらした
(すべてHPLCにより測定)。
mlを添加し、50℃まで加熱した。このようにして得られたエマルションを−20℃に
冷却した。結晶化は観察することができなかった。−20℃で黄褐色ワックスが得られた
。
上記のように米国特許5,264,618(フェルグナーら)の最も近接した実施形態
を再現しても、非晶質(2R,S)−DOTAP塩化物しか得られなかった。
SM−0364−E)の冷却前、及びアセトニトリル中の(2R,S)−DOTAP塩化
物エマルション(SM−0364−E)が−20℃まで冷却された後を示す図8及び9を
参照されたい。
ができると考えられる。前述の好ましい具体的な実施形態は単なる例示であり、いかなる
方法でも本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。
発明の一般的又は具体的に説明した反応物及び/または動作条件を代入して同様の成功を
繰り返すことができる。
本質的な特徴を確認することができ、種々の用途及び条件に適合させるために、本発明の
様々な変更及び修正を行うことができる。
結晶質ラセミ体(2R,2S)−DOTAP塩化物[(R,S)−1,2−ジオレオイル−3−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド]の製造:
出発物質
以下の化学物質が使用された:
・シグマアルドリッチ社からのN,N’−カルボニルジイミダゾール、ロット1252812。
・RCA社からのオレイン酸、ロットOA 11.G.01.2007、99.1面積%(HPLC)。アッセイ(assay)は、オレイン酸よりもUVにおいてはるかに高い応答を示すリノール酸(主要不純物)として、99.5%又はより高いかもしれない。
・MERCK EPROVA社からの(R,S)−3−(ジメチルアミノ)−1,2−プロパンジオール、ロットMSCH−103−A、0.11%の水、99.4%(GC)。
・シグマアルドリッチ社からの1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン、ロット1076841、99.7%(GC)。
・LINDE社からの塩化メチル、ロット61448。
・シグマアルドリッチ社からのヨウ化ナトリウム、ロット1336385、0.27%水。
・シグマアルドリッチ社からの酸化アルミニウム、ロット1336643。
・ICC社からのアセトニトリル、ロット0000426130、100.0%(GC)、<0.015%の水。
・BRENNTAG SCHWEIZERHALL社からのn−ヘプタン、ロット0000278245、96.4%(GC)。
・THOMMENN FURLER社からの2−プロパノール:、ロット070920211487、99.96%(GC)、0.03%水。
・THOMMENN FURLER社からのアセトン、ロット080609324212、99.98%(GC)、0.16%の水。
純粋な(2R,2S)−DODAP3.52kgのn−ヘプタン溶液23.4kg(ロットNo.MBA−116の15.9kgとロットNo.MBA−117の7.5kg)を反応容器に投入し、n−ヘプタンを60℃のジャケット温度で減圧蒸留する。真空が8mbarで安定した時、ジャケット温度を25℃に調整する。次に、7.0kgの2−プロパノール、次いで3.1gのヨウ化ナトリウムを加える。次に、反応温度を30℃に調整し、窒素雰囲気を1200mbarの一定の絶対圧で塩化メチル雰囲気に置き換える。この反応混合物は(2R,2S)−DODAPの(2R,2S)−DOTAP塩化物へのメチル化反応が終了するまで137時間にわたってこれらの条件下で撹拌する(96%の転化率)。塩化メチルの消費量は1.39kgである。
上記のように調製された(2R,2S)−DOTAP塩化物の2−プロパノール溶液を、乾燥アセトン35.8kgを用いて25℃で希釈する。2−プロパノールの量は、上記のように、7kgであり、溶液中のDOTAP塩化物の量は計算に基づいて3.64kgである。透明な溶液は毎分0.05℃の冷却速度でゆっくり−12℃まで冷却する、すなわち、12 1/3時間(12時間20分)の期間にわたって冷却が行われる。得られた懸濁液はさらに14時間−12℃に維持し、その後予冷フィルタ(−15℃)で濾過する。粗(2R,2S)−DOTAP塩化物を、冷乾燥アセトン(−18℃)の6.0kgで2回洗浄する。
湿った粗(2R,2S)−DOTAP塩化物を乾燥アセトン44.1kgと2−プロパノール3.5kgの混合物に密閉フィルタ中、35℃で溶解する。その溶液を反応容器に移し、0℃とする。溶液を毎分0.004℃の冷却速度、すなわち、50時間かけてゆっくり−12℃まで冷却する。得られた懸濁液を−12℃でさらに16時間保持し、その後冷却したフィルタドライヤー(−15℃)で濾過する。濾過残渣は0.8kgの冷乾燥アセトン(−18℃)で2回洗浄し、真空乾燥する。乾燥中にフィルタドライヤーを室温まで温める。真空度が7.9mbarで安定したら、乾燥が完了する。収量:3.46kgの結晶ラセミ(2R,2S)−DOTAP塩化物(結晶質(2R,2S)−DOTAP、ロットNo.MBA−118、アッセイ:100.0%、収率:(R,S)−3−(ジメチルアミノ)−1−プロパンジオールを参照として37.8%、HPLC純度:99.9%面積)。
安定性
結晶質(2R,2S)−DOTAP塩化物の安定性を決定するために、物質は25℃、相対湿度60%(表1)又は40℃、相対湿度70%(表1a)で空気を排除して保存する。(2R,2S)−DOTAP塩化物の残量を周期的な間隔で測定し、初期値と比較して引用している。
カラム:直径4cm、高さ60cm
フロー:約8ml/分
移動相としてまず1,500mlの塩化メチレン(画分1−27)、次いで、1,000mlの塩化メチレン/メタノール95:5(画分28−47)、最後に1,000mlのメタノールを使用した。画分は、それらのTLC分析に従って採取混合した。それで画分4−33を減圧下に一緒に濃縮した。HPLCにより測定した65.6%のw/wの(2R,2S)−DODAP含量を有する褐色のオイル(SM−0318−B)10.8gが得られた。そして画分34−42は、HPLCにより測定した54.2%w/wの(2R,2S)−DODAP含量を有する褐色のオイル(SM−0318−D)12.6gをもたらした。
データは、米国特許5,264,618(フェルグナーら)の、カラム27、47〜15行の実施例5にしたがって、上記手順で得られた1,2−ジオレオイル−3−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド((2R,2S)−DOTAP塩化物)は、結晶形態で得ることができないことを示す。
上記のように米国特許5,264,618(フェルグナーら)の最も近接した実施形態を再現しても、非晶質(2R,2S)−DOTAP塩化物しか得られなかった。
Claims (15)
- 結晶質(2R,S)−、(2S)−または(2R)−DOTAP塩化物であって、
結晶質(2R,S)−DOTAP塩化物は、以下の特徴のうちの1つを有する:
少なくとも約12.6,約19.5、約20.2、約21.5及び約25.2の値を
含む2シータ値;
少なくとも約6.5、約12.6、約13.4、約19.5、約20.2、約21.
5、約25.2及び約29.8の値を含む2シータ値;又は
図1に示されているパターンに対応するX線粉末回折パターン、
結晶質(2S)−DOTAP塩化物は、以下の特徴のうちの1つを有する:
少なくとも約12.8、約19.5、約19.8、約20.2及び約21.6の値を
含む2シータ値;
少なくとも約6.5、約12.8、約19.5、約19.8、約20.2、約20.
7、約21.6及び約25.3の値を含む2シータ値;又は
図2に示されているパターンに対応するX線粉末回折パターン、
または
結晶質(2R)−DOTAP塩化物は、以下の特徴のうちの1つを有する:
少なくとも約12.8、約19.5、約19.8、約20.3及び約21.6の値を
含む2シータ値;
少なくとも約6.6、約12.8、約19.5、約19.8、約20.3、約20.
8、約21.6及び約25.3の値を含むシータ値;又は
図3に示されたパターンに対応するX線粉末回折パターン。 - 25℃で36ヶ月間又は40℃で12ヶ月間保存した時に、質量基準及びHPLCによ
り測定した面積%基準にて99%より高い安定性を有する結晶質(2R,S)−、(2S
)−または(2R)−DOTAP塩化物。 - HPLCによって測定される、少なくとも約95%の化学的純度を有する結晶質(2R
,S)−、(2S)−または(2R)−DOTAP塩化物。 - 160℃よりも高い融点及び−130J/gを超える融解エンタルピーを有する請求項
1〜3の一つ以上に記載の結晶質(2R,S)−、(2S)−または(2R)−DOTA
P塩化物。 - 請求項1〜4の一つ以上に記載の結晶質(2R,S)−、(2S)−または(2R)−
DOTAP塩化物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 - さらに、ペプチド、ヌクレオチド、抗原、細胞増殖抑制剤、リポソーム、リポプレック
ス、ナノ粒子又はマイクロエマルションの1種又はそれ以上、またはそれらの混合物を含
む、請求項5に記載の医薬組成物。 - 1種又はそれ以上の非プロトン性溶媒から(2R,S)−、(2S)−または(2R)
−DOTAP塩化物を結晶化することを含む、請求項1〜4の一つ以上に記載の(2R,
S)−、(2S)−または(2R)−DOTAP塩化物の結晶形の製造方法。 - 1種又はそれ以上の非プロトン性溶媒は、1種又はそれ以上のプロトン性溶媒を含む、
請求項7に記載の方法。 - 結晶化が不活性雰囲気下で行われることを含む、請求項7または8に記載の方法。
- 結晶化が毎分0.001℃〜0.1℃の速度で5〜200時間、徐冷することによって
行われる請求項7〜9の一つ以上に記載の方法。 - 前記徐冷は約10〜100時間の期間である請求項10に記載の方法。
- 結晶化は、先行精製することなく、(2R,S)−、(2S)−または(2R)−DO
TAP塩化物の製造工程からの反応溶液から直接実施される、請求項7〜11の一つ以上
に記載の方法。 - さらに、結晶質(2R,S)−、(2S)−または(2R)−DOTAP塩化物の再結
晶を含む、請求項7〜12の一つ以上に記載の方法。 - 請求項7〜13の一つ以上に記載の方法によって得られる結晶質(2R,S)−、(2
S)−または(2R)−DOTAP塩化物。 - 請求項1〜4の一つ以上に記載の結晶質(2R,S)−、(2S)−または(2R)−
DOTAP塩化物を細胞に投与することを含む、細胞に形質移入する方法。
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