BR112013022883B1

BR112013022883B1 - Aptâmeros, composição farmacêutica, kit, usos de um aptâmero e coluna de aférese

Info

Publication number: BR112013022883B1
Application number: BR112013022883-0A
Authority: BR
Inventors: Ingolf Schimke; Annekathrin Haberland; Gerd Wallukat
Original assignee: Charité - Universitätsmedizin Berlin; Max-Delbrück - Centrum Für Molekulare Medizin
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2021-10-13
Also published as: CA2828896C; JP2019134709A; ES2589796T3; CN109106722A; AU2012224729B2; BR112013022883A2; EP3085786A2; CN116298268A; US9862953B2; DK2683826T3; WO2012119938A3; EP2683826B1; JP2023038284A; EP2683826A2; US20160160218A1; JP2017153479A; CN109106722B; US10266830B2; US20180127757A1; JP2021100408A

Abstract

APTÂMERO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, USO DE UM APTÂMERO E COLUNA DE AFÉRESE. A presente invenção é dirigida a um aptâmero que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 e/ou uma sequência de ácido nucleico sendo pelo menos 80°6 idêntica a uma de SEQ ID No. 1, 2 e 3 para uso em terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes, em que a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer.

Description

[001] O sistema imunológico forma uma parte essencial de cada animal. Os mamíferos fazem uso de seu sistema imunológico na defesa contra microrganismos, na detecção e remoção de células aberrantes como, por exemplo, células tumorais e na regeneração de tecidos. Através disso, o organismo conta com dois mecanismos de defesa interconectados, imunidade humoral e celular.

[002] Os anticorpos, quando ligados aos seus antígenos são acionadores da resposta imune humoral. Os anticorpos podem atuar de várias maneiras. Além de neutralização do antígeno, os anticorpos também ativam o sistema de complemento. Há também anticorpos, que são dirigidos a antígenos do próprio corpo. Como razão para a geração desses autoanticorpos assim chamados, são vistos mimetismo molecular e/ou ativação bystander. A ligação específica dos autoanticorpos para antígenos próprios pode ativar células natural killer (NK) que são capazes de facilitar a degradação desses antígenos.

[003] Doenças autoimunes são baseadas nesse reconhecimento específico e ligação de anticorpos dirigidos a partes constituintes próprias do corpo, que acionam uma resposta imunológica contra as próprias células ou tecidos. Além desse efeito imunoestimulatório, os autoanticorpos podem contribuir para o desenvolvimento de fenótipos patogênicos também por outros mecanismos. É bem conhecido que também existem autoanticorpos que podem ser específicos para a parte extracelular dos receptores acoplados à proteína G, como: receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores ativados por proteinase (PAR) e, após ligação específica, podem ativar ou bloquear esses receptores. A presença desses anticorpos em um organismo pode levar a efeitos agonísticos ou antagonísticos, no sentido de uma ativação permanente ou bloqueio dos respectivos receptores, que poderiam desempenhar um papel no desenvolvimento da doença.

[004] A cardiomiopatia dilatada (DCM) é uma das doenças em que uma elevada porcentagem dos pacientes apresenta essa ativação de ligação de autoanticorpos a partes extracelulares do receptor adrenérgico beta 1, em particular à 1- ou 2- alça do receptor adrenérgico beta 1. Consequentemente, foi sugerida uma patogênese autoimune de DCM nesses pacientes. Sob ligação desses autoanticorpos os receptores são continuamente ativados (Jahns et al. (2004) Direct evidence for a beta-1 -adrenergic receptor- directed autoimmune attack as a cause of idiopathic cardiomyopathy. J. Clin. Invest. 1 13, 1419 a 1429).

[005] Em estudos recentes, demonstrou-se que a remoção desses autoanticorpos a partir do sangue através de adsorção de imunoglobulina contribui para a regeneração do músculo cardíaco (Wallukat G, Reinke P, Dorffel WV, Luther HP, Bestvater K, Felix SB, Baumann G. (1996) Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption. Int J Cardiol. 54: 191-195; Muller J, Wallukat G, Dandel M, Bieda H, Brandes K, Spiegelsberger S, Nissen E, Kunze R, Hetzer R (2000) Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation. 101 :385-391. W.V. Dorffel, S.B. Felix, G. Wallukat, S. Brehme, K. Bestvater, T. Hofmann, F.K. Kleber, G. Baumann, P. Reinke (1997) Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circulation 95, 19941997 e W.V. Dorffel, G. Wallukat, Y. Dorffel, S.B. Felix, G. Baumann (2004Immunoadsorption in idiopathic dilated cardiomyopathy, a 3-year followup. Int J. Cardiol. 97, 529-534).

[006] Existem outras doenças do sistema cardiovascular, as quais foram sugeridas serem em relação à presença de autoanticorpos contra receptores acoplados à proteína G, como, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia periparto, miocardite, hipertensão pulmonar e hipertensão maligna. Autoanticorpos contra receptores acoplados à proteína G também foram encontrados em pacientes, por exemplo, com glaucoma, Diabetes mellitus, doença de Alzheimer, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, síndrome de Raynaud, psoríase, pré-eclampsia e em doença de Chagas crônica, bem como as com a rejeição de aloenxerto de rim.

[007] É um objeto da presente invenção fornecer novas modalidades para uso em terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes, que estão associadas à presença de autoanticorpos no paciente.

[008] A presente invenção fornece um aptâmero compreendendo ou consistindo da sequência de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 e/ou uma sequência de ácido nucleico sendo, pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID No. 1, 2 e 3 para uso em terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes.

[009] Os aptâmeros da invenção são caracterizados pelo fato de compreenderem ou consistirem de uma sequência de ácido nucleico de 15 nucleotídeos com SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 e/ou uma sequência de ácido nucleico sendo, pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID No. 1, 2 e 3. Os 15-mer: GGT TGG TGT GGT TGG (SEQ ID No. 1), os 26- mer: CGC CTA GGT TGG GTA GGG TGG TGG CG (SEQ ID No. 2) e os 12- mer: GGT TGG TGT GGT (SEQ ID No. 3) são todos independentemente uns dos outros, capazes e responsáveis pela especificidade alvo do aptâmero da invenção. Além disso, moléculas ou sequências de ácido nucleico podem ser adicionadas às extremidades 5’ e/ou à 3’ da sequência de ácido nucleico com SEQ ID No. 1, 2 e/ou 3. O dito 15-mer (SEQ ID No. 1) foi primeiro isolado quanto a sua ligação a trombina, consulte a patente US 5.543.293, que também contém o válido para o 26-mer (SEQ ID No. 2) que foi descrito pela primeira vez no documento WO/2010/033167. O primeiro mencionado já foi usado sob o nome ARC183 em ensaios clínicos de Fase I para a inibição de trombina, isto é, como um anticoagulante para uso potencial em configurações cardiovasculares agudas. O 26-mer foi usado sob o nome NU172 (ARC 2172) em ensaio clínico de fase II (identificador gov. de ensaio clínico: NCT 00808964). No entanto, constatou-se que para os 15-mer (SEQ ID No. 1) que a quantidade de aptâmero necessária para atingir a anticoagulação desejada resultou em um perfil de dose sub-ótima.

[010] Surpreendentemente, descobriu-se que, os aptâmeros da invenção podem ser usados para interferir com a interação de anticorpos, em particular de autoanticorpos, específicos para receptores acoplados à proteína G associada a doenças autoimunes. Em particular, foi demonstrado que os aptâmeros da invenção são capazes de se ligar a autoanticorpos específicos para receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II, e/ou receptores PAR e de inibir a interação específica desses autoanticorpos com as suas proteínas alvo. Por inibição dessas interações, os aptâmeros da invenção diminuem ou mesmo suprimem a ativação permanente dos respectivos receptores acoplados à proteína G, sem a necessidade de remoção desses anticorpos. Dessa forma, a presente invenção fornece compostos que são descritos pela primeira vez quanto a sua adequabilidade para uso em tratamento e/ou diagnóstico de doenças autoimunes, em particular de doenças autoimunes associadas à presença de autoanticorpos que reconhecem receptores acoplados à proteína G, quer dizer, doenças autoimunes associadas à presença de autoanticorpos específicos para receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptores AT1 de angiotensina II, e/ou receptores PAR. Além disso, após a imobilização, os aptâmeros da invenção são capazes de capturar os autoanticorpos indicados acima. Dessa maneira, é fornecido uma plataforma 1° para estabelecer uma tecnologia de aférese para limpar o soro do paciente a partir dos autoanticorpos e 2° para desenvolver uma ferramenta analítica para a medição dos autoanticorpos. A última pode ser usada, em particular, para diagnóstico de doenças autoimunes.

[011] Para o propósito dessa invenção, o termo “aptâmero” refere-se a um oligonucleotídeo que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 e/ou uma sequência de ácido nucleico sendo, pelo menos, 80% idêntica a uma das SEQ ID No. 1, 2 e 3 e é capaz de se ligar especificamente e com alta afinidade a uma molécula alvo específica, por exemplo, a um autoanticorpo dirigido contra um receptor acoplado à proteína G, por exemplo, semelhante ao receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II, e/ou receptores PAR.

[012] O aptâmero da invenção compreende ou consiste em uma sequência de moléculas de ácidos nucleicos, os nucleotídeos. O aptâmero da invenção preferencialmente compreende D- e/ou L- nucleotídeos não modificados e/ou modificados. De acordo com o código de uma letra comum de bases de ácidos nucleicos “C” corresponde a citosina, “A” corresponde a adenina, “G” corresponde a guanina, e “T” corresponde a timina, enquanto que “U” corresponde a uracila. Se não for indicado abaixo em contrário, o termo “nucleotídeo” deve se referir a ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Respectivamente, os termos “nucleotídeo 2’-fluoro modificado”, “nucleotídeo 2’-metóxi modificado”, e/ou “nucleotídeo 2-amino modificado” referem-se a ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos modificados.

[013] Um aptâmero é considerado consistir ou compreender uma sequência de ácido nucleico sendo, pelo menos 80% idêntica a uma das SEQ ID No. 1, 2 e 3, se o dito aptâmero compreender uma sequência contígua de nucleotídeos que mostra, pelo menos 80% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID No. 1, 2 ou 3 para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1, 2 ou 3, respectivamente. Meios para determinar a identidade de sequência são bem conhecidos na técnica e podem compreender, por exemplo, o uso do algoritmo BLASTN.

[014] O aptâmero da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucleico 15 nucleotídeos a 160 nucleotídeos, preferencialmente 15 nucleotídeos a 120 nucleotídeos.

[015] O aptâmero da invenção pode compreender ou consistir de uma sequência de nucleotídeos de DNA ou de RNA e, dessa forma, pode ser referido como o aptâmero de DNA ou aptâmero de RNA, respectivamente. Entende-se que, se o aptâmero da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos de RNA, dentro dos motivos de sequências especificadas ao longo da presente invenção, timina é substituída por uracila. As sequências de nucleotídeos de RNA da presente invenção são idênticas às sequências de nucleotídeos de DNA da invenção, com a condição de que T seja substituído por U. Por uma questão de concisão ao longo da presente invenção, é feito referência somente para explicitar sequências de nucleotídeos de DNA. No entanto, entende-se que as respectivas sequências de nucleotídeos de RNA também são compreendidas pela presente invenção.

[016] O uso de aptâmeros de DNA é particularmente preferencial. Aptâmeros de DNA são geralmente mais estáveis no plasma do que os aptâmeros de RNA.

[017] Os aptâmeros da invenção podem compreender uma sequência de nucleotídeos contendo nucleotídeos 2’-modificados, por exemplo, nucleotídeos 2’-fluoro-, 2’-metóxi- e/ou 2’-amino-modificados. O aptâmero da invenção também pode compreender uma mistura de desoxirribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos modificados, ribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos modificados.

[018] O aptâmero da invenção pode compreender modificações. Essas modificações englobam, por exemplo, alquilação, isto é, metilação, arilação ou acetilação de pelo menos um nucleotídeo, a inclusão de enantiômeros e/ou a fusão de aptâmeros com uma ou mais sequências de nucleotídeos ou ácidos nucleicos. Essas modificações podem compreender, por exemplo, modificações 5’- e/ou 3’-CAP ou estruturas 5’- e/ou 3’- PEG. De maneira alternativa ou além disso, o aptâmero da invenção pode compreender nucleotídeos modificados, preferencialmente selecionados a partir de ácidos nucleicos bloqueados, nucleotídeos 2’-fluoro-, 2’-metóxi- e/ou 2’ -amino modificados.

[019] Ácidos nucleicos bloqueados (LNA) representam análogos dos respectivos nucleotídeos de RNA em que a conformação foi corrigido. Os oligonucleotídeos de ácidos nucleicos bloqueados compreendem um ou mais ribonucleosídeos bicíclicos, em que o grupo 2’-OH é conectado ao átomo de carbono C4 através de um grupo metileno. Os ácidos nucleicos bloqueados exibem uma estabilidade melhorada versus nucleases em comparação às respectivas contrapartes de aptâmeros de RNA não modificadas. Além disso, as propriedades de hibridização são melhoradas o que permite um aumento de afinidade e especificidade do aptâmero.

[020] Outra modificação preferencial é a adição de uma assim chamada estrutura 3’-CAP, uma 5’-CAP e/ou de um nucleotídeo de guanosina modificado (por exemplo, 7-metil-guanosina) para a extremidade 3’ e/ou 5’ do aptâmero. Essa modificação da extremidade 3’ e/ou 5’ tem o efeito de que o aptâmero está protegido de uma degradação rápida por nucleases.

[021] De maneira alternativa ou além disso, o aptâmero da invenção pode exibir uma extremidade 5’ e/ou extremidade 3’ peguilada. Uma modificação 5’-PEG e/ou 3’-PEG compreende a adição de pelo menos uma unidade de polietileno glicol (PEG), preferencialmente o grupo PEG compreende de 1 a 900 grupos etileno, mais preferencialmente de 1 a 450 grupos etileno. Em uma realização preferencial, o aptâmero compreende unidades PEG lineares com HO-(CH2CH20)n-H, em que n é um número inteiro de 1 a 900, preferencialmente n é um número inteiro de 1 a 450.

[022] O aptâmero da invenção pode compreender ou consistir de uma sequência de ácido nucleico com uma cadeia principal de fosfo-tioato ou pode ser completamente ou parcialmente configurado como um ácido nucleico peptídico (PNA).

[023] Uma vantagem de modificar o aptâmero da invenção por uma ou mais das formas mencionadas acima é que o aptâmero pode ser estabilizado contra influências prejudiciais, como, por exemplo, nucleases presentes no ambiente em que o aptâmero é usado. As ditas modificações também são adequadas para adaptar as propriedades farmacológicas do aptâmero. As modificações preferencialmente, não alteram a afinidade ou a especificidade do aptâmero.

[024] O aptâmero da invenção também pode ser conjugado com uma molécula carreadora e/ou a uma molécula repórter. Moléculas carreadoras compreendem essas moléculas que, quando conjugadas ao aptâmero, prolongam a meia vida do plasma do aptâmero conjugado em plasma humano, por exemplo, melhorando a estabilidade e/ou afetando a taxa de excreção. Um exemplo de uma molécula carreadora adequada é o PEG. Moléculas repórteres compreendem moléculas que permitem a detecção do aptâmero conjugado. Exemplos dessas moléculas repórter são GFP, biotina, colesterol, corantes como, por exemplo, corantes fluorescentes, moléculas repórter eletroquimicamente ativas e/ou compostos que compreendem resíduos radioativos, em particular radionuclídeos adequados para detecção de PET (tomografia por emissão de pósitrons) como, por exemplo, 18F, 11C, 13N, 150, 82Rb ou 68Ga. O técnico no assunto está bem ciente do carreador adequado e das moléculas repórter, e das formas como conjugá-los ao aptâmero da invenção.

[025] O aptâmero da invenção inibe o efeito agonístico ou de bloqueio de um anticorpo. Para o propósito da presente invenção, o termo “anticorpo” refere-se a anticorpos que ocorrem naturalmente, incluindo, por exemplo, autoanticorpos, em particular autoanticorpos de um paciente que sofre de uma doença autoimune relacionada à presença de autoanticorpos específicos para o receptor acoplado à proteína G, como, por exemplo, receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II, e/ou receptores PAR, e anticorpos modificados ou elaborados geneticamente. Um autoanticorpo é um anticorpo produzido pelo sistema imunológico de um indivíduo que é dirigido contra uma ou mais das proteínas do próprio indivíduo. No entanto, o termo anticorpo não está limitado a um anticorpo com a arquitetura da cadeia pesada e leve clássica. Os termos “anticorpo” ou “anticorpos” como usados no presente pedido são termos reconhecidos na técnica e são entendidos para se referir a moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos, particularmente os termos referem-se a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação que se liga especificamente a um antígeno. Uma imunoglobulina é uma proteína que compreende um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pela imunoglobulina kappa e lambda, alfa, gama, delta, épsilon e genes de região constante mi, bem como genes de região variável de imunoglobulina miríade. As cadeias leves são classificadas tanto como kappa como lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mi, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Também são conhecidas subclasses da cadeia pesada. Por exemplo, as cadeias pesadas de IgG em humanos podem ser de subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo pode preferencialmente ser da classe IgM e/ou IgG ou de qualquer subclasse das mesmas (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4).

[026] “Anticorpos” são destinados a incluir dentro do escopo da presente invenção autoanticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, de cadeia única, biespecíficos, de símios, humanos e humanizados, bem como fragmentos ativos dos mesmos. Exemplos de fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos incluem as cadeias leves e pesadas separadas, fragmentos Fab, Fab/c, Fv, Fab’ e F(ab’)2, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina de Fab e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos anticorpos e fragmentos acima mencionados.

[027] Os aptâmeros da invenção são usados no tratamento e/ou diagnóstico de doenças autoimunes. Como usado para o propósito da presente invenção, o termo “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” refere-se a doenças autoimunes, em particular para doenças autoimunes em um humano, em que as doenças autoimunes estão associadas à presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G. Os ditos autoanticorpos podem estar preferencialmente envolvidos na patogênese da doença autoimune e, como tal, podem estar presentes no soro de um paciente que sofre da dita doença autoimune. Mais preferencialmente, as doenças autoimunes são doenças autoimunes associadas à presença de anticorpos específicos no soro do paciente de receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II, e/ou receptores PAR. Ainda mais preferencial, a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer. Com a máxima preferência, o termo “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” refere-se às doenças autoimunes, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[028] A fabricação ou produção em massa de aptâmeros da invenção é bem conhecida na técnica e representa uma mera atividade de rotina.

[029] A presente invenção também é dirigida a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma aptâmero da invenção e, opcionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção também é dirigida a uma composição farmacêutica que compreende um aptâmero da invenção ou uma mistura de diferentes aptâmeros da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável, como, por exemplo, um carreador ou diluente adequado.

[030] Preferencialmente, o aptâmero da invenção constitui um ingrediente ativo da composição farmacêutica e/ou está presente em uma quantidade efetiva.

[031] O termo “quantidade efetiva” denota uma quantidade do aptâmero da invenção com um relevante efeito profilático, diagnóstico ou terapêutico em uma doença ou condições patológicas. Um efeito profilático previne o surto de uma doença. Um efeito terapêutico relevante alivia a uma certa extensão um ou mais sintomas de uma doença ou retorna ao normal, tanto parcial como totalmente, um ou mais parâmetros físicos ou bioquímicos associados ou causadores da doença ou das condições patológicas. A respectiva quantidade para a administração do aptâmero da invenção é suficientemente alta para atingir o efeito profilático, diagnóstico ou terapêutico desejado. Um técnico no assunto entenderá que o nível da dose, frequência e período de administração específica a quaisquer mamíferos dependerão de uma variedade de fatores, incluindo a atividade dos componentes específicos utilizados, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, combinação da droga e gravidade da terapia específica. Com o uso de meios e métodos bem conhecidos, a quantidade exata pode ser determinada por um técnico no assunto por uma questão de experimentação de rotina.

[032] Na composição farmacêutica da invenção, pelo menos 20% do conteúdo total de aptâmero é composto por um aptâmero da invenção, preferencialmente, pelo menos 50%, mais preferencialmente, pelo menos 75% e com a máxima preferência pelo menos 95%.

[033] Quando usada para terapia, a composição farmacêutica geralmente será administrada como uma formulação em associação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O termo “excipiente” é usado no presente pedido para descrever qualquer ingrediente outro que não o aptâmero da invenção. A escolha do excipiente dependerá, em uma grande extensão, do modo específico de administração. Os excipientes podem ser carreadores e/ou diluentes adequados.

[034] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada oralmente. A administração oral pode envolver a deglutição, de modo que a composição entre no trato gastrintestinal, ou as administrações bucal ou sublingual podem ser empregadas, através das quais a composição entra na corrente sanguínea diretamente a partir da boca.

[035] As formulações adequadas para a administração oral incluem: formulações sólidas, como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas contendo partículas, líquidos ou pós; pastilhas (incluindo aquelas preenchidas com líquido); e pastilhas mastigáveis; multi e nanopartículas; géis; soluções sólidas; lipossomos; filmes, óvulos, sprays e formulações líquidas.

[036] As formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. Essas formulações podem ser empregadas como filtros em cápsulas macias ou duras, e tipicamente compreendem um carreador, por exemplo, água, etanol, polietileno glicol, metilcelulose ou um óleo adequado, e um ou mais agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensão. As formulações líquidas também podem ser preparadas pela reconstituição de um sólido, por exemplo, a partir de sachê.

[037] Para as formas de dosagem por comprimidos, dependendo da dose, o aptâmero da invenção pode constituir de 0,1 a 80%, em peso, da forma de dosagem, mais tipicamente de 5 a 60%, em peso, da forma de dosagem. Além do aptâmero da invenção, os comprimidos normalmente contêm um desintegrante. Os exemplos de desintegrantes incluem amido glicolato de sódio, carboximetilcelulose sódica, carboximetilcelulose cálcica, croscarmelose sódica, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulose, celulose microcristalina, hidroxipropil celulose substituída por aquila mais baixa, amido, amido pré-gelatinisado e alginato de sódio. Geralmente, o desintegrante compreenderá de 1 a 25%, em peso, preferencialmente de 5 a 20%, em peso, da forma de dosagem.

[038] Os comprimidos podem compreender excipientes adicionais como, por exemplo, ligantes, agentes ativos de superfície, lubrificantes e/ou outros ingredientes possíveis como, por exemplo, antioxidantes, corantes, agente aromatizantes, conservantes e/ou agentes de mascaramento do sabor.

[039] As misturas de comprimido podem ser compactadas diretamente ou por rolo para formar comprimidos. As misturas de comprimido ou porções da mistura podem, alternativamente, ser úmidas, secas ou granuladas derretidas, congeladas derretidas ou extrudadas antes da formação dos comprimidos. A formulação final pode compreender uma ou mais camadas e podem ser revestidas ou não revestidas; ela pode ainda ser encapsulada.

[040] As formulações sólidas para a administração oral podem ser formuladas para a liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, em pulsos, controlada, direcionada e programada.

[041] A composição farmacêutica da invenção também pode ser administrada diretamente na corrente sanguínea, em músculos ou em um órgão interno. Os meios adequados para a administração parenteral incluem intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraniana, intramuscular e subcutânea. Os dispositivos adequados para a administração parenteral incluem injetores com agulhas (incluindo microagulhas), injetores sem agulhas e técnicas de infusão.

[042] As formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que podem conter excipientes, como sais, carboidratos e agentes tamponantes (preferencialmente a um pH de 3 a 9) mas, para algumas aplicações, elas podem ser mais adequadamente formuladas como uma solução aquosa estéril ou como uma forma seca para ser usada em conjunto com um veículo adequado, como água estéril, livre de pirógeno.

[043] A preparação de formulações parenterais sob condições estéreis, por exemplo, por liofilização, podem ser prontamente realizadas com o uso de técnicas farmacêuticas padrões bem conhecidas por técnicos no assunto.

[044] A solubilidade da composição farmacêutica da invenção usada na preparação de soluções parenterais pode ser aumentada pelo uso de técnicas de formulação apropriadas, como a incorporação de agentes aprimoradores de solubilidade.

[045] As formulações para a administração parenteral podem ser formuladas para ser de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, em pulsos, controlada, direcionada e programada. Dessa forma, os compostos da invenção podem ser formulados como um sólido, semi-sólido ou tixotrópico líquido para administração como um depósito implantado, que fornece liberação modificada do composto ativo. Os exemplos dessas formulações incluem endopróteses revestidas com a droga e microesferas de poli(ácido dL- lático-co-ácido glicólico) (PGLA).

[046] A composição farmacêutica da invenção também pode ser administrada topicamente na pele ou mucosa, ou seja, dermicamente ou transdermicamente. As formulações típicas para esse fim incluem géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, pomadas, pós, curativos, espumas, filmes, emplastos da pele, pastilhas, implantes, esponjas, fibras, bandagens e microemulsões. Os lipossomos também podem ser usados. Os carreadores típicos incluem álcool, água, óleo mineral, vaselina líquida, vaselina branca, glicerina, polietileno glicol e propileno glicol. Os aprimoradores de penetração podem ser incorporados. Outros meios de administração tópica incluem entrega por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e injeção com microagulha ou sem agulha (por exemplo, PowderjectTM, BiojectTM, etc). As formulações para administração tópica podem ser formuladas para serem de liberação imediata e/ou modificada. As formulações de liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, em pulsos, controlada, direcionada e programada.

[047] Para a administração em pacientes humanos, a dose diária total do aptâmero da invenção e/ou da composição farmacêutica da invenção está tipicamente na faixa de 0,001 a 5000 mg dependendo, é claro, do modo de administração. Por exemplo, uma dose diária intravenosa pode requerir somente de 0,001 a 40 mg. A dose diária total pode ser administrada em doses únicas ou divididas, e pode, a critério do médico, estar fora da faixa típica dada no presente pedido.

[048] Essas dosagens são baseadas em um sujeito humano médio com um peso de cerca de 65 a 70 kg. O médico será prontamente capaz de determinar as doses para os sujeitos com peso fora dessa faixa, como os infantes e idosos.

[049] A presente invenção também engloba um kit compreendendo um aptâmero da invenção, uma composição farmacêutica, um recipiente e, opcionalmente, instruções escritas para uso e/ou com os meios para a administração.

[050] O aptâmero, a composição farmacêutica e/ou o kit da invenção são usados na terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes, em particular, doenças autoimunes em humanos. Preferencialmente, as doenças autoimunes são doenças autoimunes associadas com a presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G, em que os autoanticorpos estão presentes no soro de um paciente acometido por essa dita doença autoimune. Mais preferencialmente, as doenças autoimunes são doenças autoimunes associadas com a presença de autoanticorpos específicos para o receptor adrenérgico alfa 1, adrenérgico beta 1, adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor muscarínico M2, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores PAR no soro do paciente. Ainda mais preferencialmente, a doença autoimune é a cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardimiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoaríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheirmer. Mais preferencialmente, os termos “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” se referem às doenças autoimunes cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPMC), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[051] Os termos ”terapia”, “tratamento” e “terapeuticamente”, como usado no presente pedido, referem-se ao ato do tratamento, como “tratamento” é definido abaixo. Como usado no presente pedido, o termo “tratamento” refere-se à reversão, alívio ou inibição do progresso de uma doença, disfunção ou condição, ou um ou mais sintomas dessa doença, disfunção ou condição, ao qual o termo se aplica. Como usado no presente pedido, “tratamento” também pode se referir ao decréscimo da probabilidade ou incidência de ocorrência de uma doença, disfunção ou condição em um mamífero em comparação a uma população controle não tratada, ou em comparação ao mesmo mamífero antes do tratamento. Por exemplo, como usado no presente pedido, “tratamento” pode se referir à prevenção de uma doença, disfunção ou condição, e pode incluir o retardamento ou prevenção do surgimento de uma doença, disfunção ou condição, ou o retardamento ou prevenção dos sintomas associados a uma doença, disfunção ou condição. Como usado no presente pedido, “tratamento” também pode se referir à redução da gravidade de uma doença, disfunção ou condição ou dos sintomas associados a essa doença, disfunção ou condição antes do acometimento de um mamífero com a doença, disfunção ou condição. Essa prevenção ou redução da gravidade de uma doença, disfunção ou condição antes do acometimento refere-se à administração da composição da presente invenção, como descrito no presente pedido, a um sujeito que no momento da administração não esteja acometido pela doença, disfunção ou condição. Como usado no presente pedido, “tratamento” também pode se referir a uma doença, disfunção ou condição ou a um ou mais sintomas associados a essa doença, disfunção ou condição.

[052] Para o tratamento e/ou diagnóstico de uma doença, independentemente da via de administração, o aptâmero da invenção é administrado a uma dose diária por ciclo de tratamento inferior a 20 mg/kg de peso corporal, preferencialmente inferior a 10 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente selecionado a partir da faixa de 1g/kg a 20 mg/kg de peso corporal e, com máxima preferência, selecionado a partir de uma faixa de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal.

[053] A presente invenção também é direcionada ao uso de um aptâmero da invenção ou composição farmacêutica da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou diagnóstico de uma doença autoimune. Preferencialmente, a doença autoimune é a cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer. Ainda mais preferencialmente, os termos “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” se referem às doenças autoimunes cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[054] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada para um método de tratamento ou diagnóstico de uma doença autoimune, em que um indivíduo em necessidade desse tratamento é submetido à administração de uma quantidade efetiva de um aptâmero da invenção ou de uma composição farmacêutica da invenção. Preferencialmente, a doença autoimune é a cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré- eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer. Ainda mais preferencialmente, os termos “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” se referem às doenças autoimunes cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[055] O aptâmero da invenção, quando usado para o tratamento ou diagnóstico de uma doença autoimune não necessariamente precisa ser administrado a um indivíduo ou paciente. O efeito terapêutico ou diagnóstico também pode ser atingido pelo uso do aptâmero da invenção para a eliminação dos anticorpos como, por exemplo, autoanticorpos do corpo ou dos fluidos corpóreos. Essa eliminação pode compreender a aplicação do aptâmero da invenção em uma configuração na qual o aptâmero da invenção está em contato com um fluido corpóreo somente ex vivo, por exemplo, durante a adsorção imune e/ou aférese, de modo que o aptâmero da invenção não entre no corpo do indivíduo ou paciente a ser tratado. Dessa forma, a presente invenção também é direcionada a uma coluna de aférese que compreende um aptâmero da invenção.

[056] Aférese é uma tecnologia médica, na qual o sangue de um doador ou paciente passa através de um aparato que separa um constituinte específico e retorna o restante de volta à circulação do doador ou paciente. O aptâmero da invenção pode ser usado como ingrediente seletivo durante a aférese. O ingrediente seletivo é responsável pela separação específica dos constituintes desejados, isto é, os anticorpos ou autoanticorpos presentes na amostra ou sangue que são alvos específicos do aptâmero da invenção. Preferencialmente, o aptâmero da invenção é usado como ingrediente seletivo na aférese terapêutica do sangue ou partes do mesmo, derivados de um paciente acometido de uma doença autoimune. Mais preferencialmente, a doença autoimune é a cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer. Ainda mais preferencialmente, os termos “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” se referem às doenças autoimunes cardiomiopatia dilatada cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[057] A presente invenção também se refere a um aptâmero da invenção acoplado a um suporte sólido. Um técnico no assunto está bem ciente das técnicas e materiais que podem ser usados para produzir esses aptâmeros acoplados a um suporte sólido. Em uma realização preferencial, o suporte sólido compreende um material sólido que é aplicável nos ensaios médicos, bioquímicos ou biológicos como, por exemplo, materiais usados em aférese ou ensaios ELISA. O dito material sólido compreende polímeros que são normalmente usados como suporte nos ensaios médicos, bioquímicos ou biológicos. Em particular, o aptâmero da invenção pode ser acoplado a um suporte sólido que permita o uso do produto final na fabricação de uma coluna adequada para aférese, preferencialmente uma coluna que é adequada para o uso em uma aférese para remover anticorpos que podem ser especificamente ligados pelo aptâmero da invenção a partir de uma amostra líquida, preferencialmente, a partir de um fluido corpóreo.

[058] Em um aspecto adicional, a presente invenção é direcionada para o uso de um aptâmero da invenção para a detecção in vitro e/ou caracterização de anticorpos como, por exemplo, autoanticorpos, que é específico para um receptor acoplado à proteína G, preferencialmente, receptores acoplados à proteína G adrenérgicos alfa 1, adrenérgicos beta 1, adrenérgicos beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor muscarínico M2, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores PAR.

[059] Esse uso pode compreender o teste de uma amostra em um ensaio de frequência de batimento de cardiomiócito de rato na presença e ausência de uma quantidade efetiva de um aptâmero da invenção. Dependendo do efeito da amostra e do aptâmero da invenção na frequência de batimento, um técnico no assunto pode concluir a presença dos respectivos anticorpos. Os dados da quantidade total ou relativa desses anticorpos na amostra também podem ser obtidos, assim como outras propriedades desses anticorpos.

[060] O ensaio de frequência de batimento de cardiomiócito de rato é um ensaio bem estabelecido para a detecção e caracterização de anticorpos, por exemplo, autoanticorpos derivados de pacientes, específicos para um número de receptores humanos acoplados à proteína G como, por exemplo, receptor adrenérgico alfa 1, adrenérgico beta 1, adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor muscarínico M2, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores PAR humanos. O ensaio está descrito em detalhe em: Wallukat et al. (1987) Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes, Biomed. Biochim. Acta 46, 634-639; Wallukat et al. (1988) Cultivated cardiac muscle cells - a functional test system for the detection of autoantibodies against the beta adrenergic receptor, Acta Histochem. Supl. 35, 145-149; e Wallukat et al. (2010) Distinct patterns of autoantibodies against G-protein coupled receptors in Chagas’ cardiomyopathy and megacolon. Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas’ patients, J. Am. Coll. Cardiol. 55, 463468. Dessa forma, um técnico no assunto está bem ciente da natureza desse ensaio e sabe como aplicá-lo.

[061] O aptâmero da invenção pode, particularmente, ser usado na detecção e/ou caracterização dos respectivos anticorpos, os quais estão presentes ou são derivados de um fluido corpóreo, preferencialmente um fluido de um corpo humano, mais preferencialmente de sangue, plasma, soro, urina, fezes, fluido sinuvial, fluido intersticial, linfa, saliva, suor, fluido espinhal, e/ou fluido lacrimal humano. Em uma realização preferencial, o fluido corpóreo é coletado de um indivíduo acometido ou com suspeita de estar acometido por uma doença autoimune. Preferencialmente, a doença autoimune é a cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer. Ainda mais preferencialmente, os termos “doença autoimune” ou “doenças autoimunes” se referem às doenças autoimunes cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud e/ou doença de Alzheimer.

[062] Para a detecção e/ou caracterização desses anticorpos, o aptâmero da invenção pode ser usado em solução ou em uma forma imobilizada.

[063] O aptâmero da invenção pode ser usado para detecção direta ou indireta e/ou caracterização dos ditos anticorpos.

[064] A seguir, a invenção será explicada e exemplificada em mais detalhe por meio de exemplos.

FIGURAS

[065] Figura 1 mostra as curvas de resposta de dose da neutralização da atividade funcional de diferentes AABs, como indicado na figura.

[066] Figura 2 mostra a influência da presença de IgG-3 [73 nM] na curva de resposta de dose neutralizando a atividade funcional dos AABs para o receptor beta 1 pela trombina-aptâmero.

[067] Figura 3 mostra a influência da trombina-aptâmero na redução da frequência de batimento de cardiomiócitos neonatais mediada por ETA-AB.

[068] Figura 4 mostra a ligação da trombina-aptâmero (SEQ ID NO: 1) ao ETA-AB imobilizado, IgG de coelho imobilizado e subclasses de IgG humana imobilizadas como controle. A e C: 25 nM de cada proteína imobilizada. B e D: 250 nM das proteínas imobilizadas. A e B: ligação da trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1; e C e D: ligação de sua sequência embaralhada. A trombina-aptâmero biotinilada foi usada e o componente biotina serviu para a detecção. A quantidade de biotina ligada foi quantificada por meio de Neutravidina-POD e da reação de TMB/H2O2.

[069] Figura 5 mostra a ligação do ETA-AB (SP 4122P) a trombina-aptâmero imobilizada (SEQ ID NO: 1). A: 1 B: 0,1 da trombina-aptâmero para imobilização. Para a detecção, usou-se o anticorpo secundário anti-IgG-POD de coelho (1:10000) e a reação de TMB/H2O2. As placas não revestidas e revestidas com Neutravidina foram usadas como controle (Neutravidina = NA).

[070] Figura 6 mostra a ligação do ETA-AB (SP 4122P) a trombina-aptâmero imobilizada (SEQ ID NO: 1) e a trombina-aptâmero embaralhada como controle.

[071] Figura 7 mostra a recuperação do ETA-AB ligado após eluição da coluna de trombina-aptâmero e o correspondente experimento controle (coluna controle). A atividade de ETA-AB foi medida no bioensaio.

[072] Figura 8 mostra a recuperação do ETA-AB a partir do soro enriquecido no experimento ELISA. A: mostra a curva padrão do ETA-AB que foi tratada de maneira comparável às amostras do eluído (diálise). B: mostra a quantidade de ETA-AB recuperada a partir dos fluxos, da solução de lavagem e dos eluídos após a eluição a partir da coluna de trombina-aptâmero (coluna ARC183) e da correspondente coluna controle (trombina-aptâmero embaralhada). Para a detecção, usou-se um anticorpo anti-IgG-POD de coellho (1:10000) e a reação de TMB/H2O2.

[073] Figura 9 mostra o teste da capacidade de neutralização de AAB mediada por trombina-aptâmero marcada com 5’-FITC com o uso do bioensaio de batimento espontâneo de cardiomiócitos de rato neonato. O aumento da frequência de batimento provocado pelos AABs para o receptor beta 1 foi reduzido em cerca de 50% quando 100 nM de FITC-trombina- aptâmero estava presente. As barras são a média de dois experimentos independentes (n=2).

[074] Figura 10 mostra a detecção de ETA-AAB de uma amostra de paciente com o uso de um ensaio sanduíche de trombina-aptâmero // FITC- trombina-aptâmero. Como controle, usou-se uma amostra de IgG controle e trombina-aptâmero embaralhada. Os dados são de um experimento. (FITC- throm-a = FITC-trombina-aptâmero, throm-apta = trombina-aptâmero).

[075] Figura 11 mostra a neutralização da atividade do AAB (AAB receptor beta 1, AAB receptor alfa 1 + beta 2, afinidade do AAB receptor beta 2 purificado, cada AAB n = 1) por dT-trombina-aptâmero a 100 nM, medida no bioensaio de batimento espontâneo de cardiomiócitos neonatais.

[076] Figura 12 mostra o teste de funcionalidade da sequência da trombina-aptâmero truncada (sequência 12-mer, SEQ ID NO: 3, Throm K1) em comparação à sequência 15-mer original (ARC183, SEQ ID NO: 1) e a sequência 26-mer (NU172, SEQ ID NO: 2) neutralizando a atividade cronotrópica positiva dos AABs receptor beta 1 no bioensaio de batimento espontâneo de cardiomiócitos de rato.

EXEMPLOS RESUMO

[077] Os aptâmeros que consistem de uma sequência de ácido nucleico com SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente, são ligantes afins e específicos dos autoanticorpos dirigidos aos receptores acoplados à proteína G. Os aptâmeros são capazes de neutralizar a função dos AABs (autoanticorpos) no estado solúvel. Os aptâmeros imobilizados na superfície foram capazes de capturar os AABs. Uma eluição posterior removerá os AABs capturados.

[078] Foi, portanto, mostrado que os aptâmeros da presente invenção são moléculas adequadas para propósitos terapêuticos e diagnósticos para o tratamento de doenças que estão associadas aos AABs funcionais ativos dirigidos aos receptores acoplados à proteína G.

MATERIAL E MÉTODOS PREPARAÇÃO E CULTURA DE CARDIOMIÓCITOS

[079] Corações de ratos com 1 a 3 dias de vida foram removidos sob condições estéreis e transferidos para solução salina fosfato tamponada (PBS) contendo penicilina/estreptomicina. O tecido do ventrículo foi separado, dissecado em pedaços e lavado duas vezes com 10 mL de PBS contendo penicilina/estreptomicina e, por último, lavado uma vez com PBS somente. Os pedaços do ventrículo foram ressuspensos em 30 mL de PBS contendo tripsina 0,2%. Após incubação por 20 min a 37°C, a tripsinação foi interrompida com 10 mL de soro fetal bovino inativado por calor resfriado. A suspensão resultante foi centrifugada a 130 x g por 6 min e o pélete transferido para 20 mL do meio SM20-I. Para a estimativa de contagem celular, 100 μL dessa suspensão foi adicionada a 100 μL de solução de azul de tripano. Para a cultura celular, 2,4 x 106 células foram ressuspendidas em meio SM20-I contendo 2,5 mL de glicose, equilibrado com ar úmido e suplementado com soro bovino fetal inativado por calor 10%, insulina 0,1 mU e fluordeoxiuridina 2 μM (prevenindo o supercrescimento dos miócitos por não-miócitos), transferidas para frascos Falcon 12,5 cm2 e cultivadas como monocamadas por 4 dias a 37°C. O meio foi renovado após dois dias.

PRINCÍPIO DO BIOENSAIO

[080] Para a identificação e quantificação do AAB, um bioensaio foi usado, o qual foi primeiramente estabelecido para a medição do AAB dirigido aos receptores acoplados à proteína G por Wallukat e Wollenberger (Wallukat G, Wollenberger A. Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes. Biomed Biochim Acta 1987; 46:S634-9) e que foi descrito recentemente em detalhe para a medição do AAB dirigido aos receptores beta adrenérgicos 1 e 2, e receptores muscarínicos M2 na doença de Chagas crônica (Wallukat G, Munoz Saravia SG, Haberland A, Bartel S, Araujo R, Valda G, Duchen D, Diaz Ramirez I, Borges AC, Schimke I. Distinct patterns of autoantibodies against G-protein- coupled receptors in Chagas’ cardiomyopathy and megacolon. Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas’ patients. J Am Coll Cardiol. 2010;55:463-8).

[081] Nesse bioensaio, a resposta cronotrópica do batimento espontâneo de cardiomiócitos de ratos neonatos em cultivo foi registrada, sendo a soma da cronotropia positiva provocada pelo estímulo do AAB, como aquele dirigido aos receptores beta adrenérgicos 1 e 2 ou ao receptor adrenérgico alfa 1, e a cronotropia negativa provocada pela inibição do AAB, como aquela direcionada aos receptores muscarínicos M2 ou ao receptor de endotelina tipo A (receptor ETA) (1 unidade de atividade de AAB = alteração da frequência em 1 batimento/min).

[082] Para diferenciar as espécies de AAB com respeito às suas contribuições para a resposta cronotrópica (cronotropia positiva ou negativa), a análise foi conduzida na presença de antagonistas específicos, como I CI- 1 18.551 para o AAB receptor beta 2, atropina para o M2-AAB, propranolol para AAB receptor beta 1/2, BQ 610 ou BQ 123 para o receptor ETA, prazosina para o alfa adrenoreceptor 1 e Ibesartan ou Losartan para o receptor AT1. A alteração da atividade remanescente é provocada pelo AAB, exceto uma vez que foi especificamente bloqueada. Uma caracterização adicional dos AABs dirigidos a diferentes receptores, demonstrada acima, foi realizada pelo uso de peptídeos representantes do epítopo do AAB correspondentes às alças extracelulares dos receptores.

[083] O bioensaio pode detectar e quantificar todos os AAB do soro humano e outras moléculas direcionadas aos receptores de superfície celular cujas sequências são homólogas aos receptores humanos (no caso do direcionamento de AAB) e que estão ligados a uma maquinaria que regula a frequência de batimento (contratilidade, cronotropia) das células, como o sistema da proteína G.

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SORO PARA IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE AAB E MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE AAB

[084] 1 mL de soro controle e de paciente e 660 μL de solução saturada de sulfato de amônio foram misturados (concentração final de 40% de sulfato de amônio) e incubados por 18 h a 4°C. Após centrifugação por 15 min a 6.000 x g, o pélete foi ressuspenso em 750 μL de PBS, misturado com 750 μL de solução saturada de sulfato de amônio (concentração final de 50% de sulfato de amônio) e centrifugado de novo. Após isso, o pélete foi ressuspenso em 700 μL de PBS e dialisado contra 100 vezes do volume de PBS. A fração de IgG resultante pode ser armazenada a -20°C até a medição.

RESULTADOS INIBIÇÃO DA FUNCIONALIDADE DE DIFERENTES AABs DIRIGIDOS AOS RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA G POR APTÂMEROS ESPECÍFICOS

[085] A seguir, a neutralização da atividade dos anticorpos (autoanticorpos do soro do paciente) pelo aptâmero SEQ ID NO: 1 (também conhecido como trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1, ou ARC 183, descrito na Patente US 5.543.293) e pelo aptâmero SEQ ID NO: 2 (também conhecido como trombina-aptâmero SEQ ID NO: 2, ou ARC 2172 ou NO 172, descrito no documento WO 025049/2007) foi investigada (Tabela 1).

[086] Por meio disso, os anticorpos a seguir (autoanticorpos = AAB) foram investigados: AAB receptor adrenérgico alfa 1, AAB receptor adrenérgico beta 1, AAB receptor beta 2, AAB receptor muscarínico M2, AAB receptor de endotelina 1-ETA (ETA-ABB), AAB receptor angiotensina II-AT1 e AAB receptor PAR.

[087] A ocorrência desses AABs foi descrita nas situações patológicas a seguir, não excluindo outras situações patológicas que também podem ser carreadoras dos mesmos AABs ou similares: DCM, cardiomiopatia de Chagas, doença crônica de Chagas, megacólon de Chagas, cardiomiopatia periparto, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão, hipertensão maligna, diabete mellitus, doença de Alzheimer, rejeição de aloenxerto de rim, síndrome de Raynaud. A Tabela 1 mostra que a atividade funcional de todos os autoanticorpos testados dirigidos aos receptores acoplados à proteína G foi neutralizada com o uso do aptâmero de SEQ ID NO: 1 ou parcialmente neutralizada com o uso do aptâmero de SEQ ID NO: 2.

TABELA 1

[088] Mostra a capacidade dos aptâmeros de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 [100 nM] na neutralização da atividade funcional de ABBs dirigidos aos receptores acoplados à proteína G.

[089] A atividade funcional dos AABs foi medida através de sua capacidade de alterar a taxa de pulso dessas células [ taxa de batimento/15 s].

CURVAS DE RESPOSTA DE DOSE NA NEUTRALIZAÇÃO DE AABS MEDIADA POR TROMBINA-APTÂMERO

[090] A seguir, as curvas de resposta de dose das incubações únicas de trombina-aptâmero foram medidas (Figura 1). Por meio disso, não apenas os AABs dirigidos aos receptores acoplados à proteína G foram neutralizados, mas também os AABs receptor beta 1 do sangue de ratos SHR. De fato, os AABs humanos dirigidos à primeira ou à segunda alça do receptor beta 1, AABs dirigidos ao receptor AT1 e ao receptor adrenérgico alfa 1 foram neutralizados. O AAB receptor beta 1 em ratos é um AAB espontaneamente formado.

[091] Tornou-se evidente que as diferentes curvas de resposta de dose mostraram-se sutilmente diferentes. Enquanto o efeito de neutralização foi o mais eficiente para o AAB receptor alfa 1 humano, ele mostrou-se o menos eficiente para o AAB receptor beta 1. Assumindo que a concentração de AAB pode estar em torno de 0,1% da fração de IgG (informação pessoal do Dr. Wallukat), então as concentrações de diferentes aptâmeros estariam a uma concentração final de cerca de 1,4 nM de AAB (concentração normal de IgG de cerca de 10 g/L = 68,5 μM, diluição do AAB no meio do cultivo celular 1:50). Dessa forma, torna-se lógico que o efeito de neutralização inicia-se para alguns AABs, como o AAB receptor alfa 1, a uma concentração de aptâmero de cerca de 1 nM, enquanto em geral 100 nM de aptâmero são necessários para uma completa inibição da funcionalidade do AAB.

AFINIDADE DO APTÂMERO-AAB NA PRESENÇA DO COMPETIDOR IGG-3 HUMANO

[092] Experimentos anteriores testaram a afinidade da trombina- aptâmero SEQ ID NO: 1 em direção aos subtipos de IgG humana que mostraram que a trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1 tinha uma afinidade mais alta por IgG-3, seguido por IgG-4, IgG-2 e IgG-1. Enquanto as diferenças entre os últimos subtipos foram apenas marginais, a afinidade pelo subtipo IgG-3 foi marcante (dados não mostrados).

[093] No presente pedido, para testar se a afinidade da trombina- aptâmero SEQ ID NO: 1 pelo AAB é mais alta em comparação à sua afinidade comum pela subclasse de IgG-3, o experimento de competição a seguir foi realizado: enquanto medindo a curva de resposta de dose da trombina- aptâmero SEQ ID NO: 1 ao AAB do soro de um paciente humano (AAB receptor beta 1, segunda alça, diluição 1:50), em um conjunto experimental, 73 nM de IgG-3 humana foi adicionada, permitindo-se a competição com o AAB receptor beta 1 pela ligação da trombina-aptâmero (Figura 2). Especialmente, a baixa concentração de trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1 (1, 5 e 10 nM de trombina-aptâmero), na qual a concentração de IgG-3 está claramente em excesso molar em relação à da trombina-aptâmero, nenhuma diferença foi observada entre os efeitos de neutralização do AAB, com ou sem a presença de IgG-3.

DEMONSTRAÇÃO DA LIGAÇÃO ENTRE TROMBINA-APTÂMERO E AUTOANTICORPO COM O USO DE UM AUTOANTICORPO MODELO: ANTICORPO RECEPTOR DE ENDOTELINA HUMANA DE COELHO DIRIGIDO À SEGUNDA ALÇA EXTRACELULAR DO RECEPTOR ( ACRIS ANTIBODIES, SP 41222P) 1. TESTE DE FUNCIONALIDADE DE ETA-AB NO BIOENSAIO E NEUTRALIZAÇÃO POR TROMBINA-APTÂMERO SEQ ID NO: 1

[094] O anticorpo de coelho contra o receptor de endotelina (ETA-AB) foi gerado contra a segunda alça extracelular do receptor de endotelina humana. O anticorpo mostrou atividade funcional no bioensaio. O ETA-AB provocou uma redução da frequência de batimento espontâneo de cardiomiócitos de rato neonato (Figura 3). A adição de 100 nM de trombina- aptâmero que provocou a completa neutralização desse ETA-AB causou alteração na frequência de batimento (Figura 3). A adição de apenas trombina- aptâmero (SEQ ID NO: 1) aos cardiomiócitos de rato neonato não provocou nenhum efeito visual nas células, nem influenciou na frequência basal de batimentos (dados não mostrados).

2. TESTE DE LIGAÇÃO DIRETA ENTRE TROMBINA-APTÂMERO SEQ ID NO: 1 E ETA- AB

[095] Para o teste de ligação direta entre trombina-aptâmero e ETA-AB no experimento ELISA, dois conjuntos experimentais diferentes foram testados. Primeiro, o ETA-AB foi imobilizado na placa de ELISA e sua capacidade de se ligar a trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1 foi testada (Figura 4). Em um segundo conjunto de experimentos, trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1 foi imobilizada e o ETA-AB foi oferecido para ligação (Figura 5).

[096] Para o primeiro conjunto de experimentos, duas concentrações diferentes de proteína para imobilização na placa de ELISA foram escolhidas: 25 nM (Figura 4A) e 250 nM (Figura 4B). Como controle, usou-se IgG de coelho, subclasses de IgG humana (IgG-1, 2, 3 e 4) nas mesmas concentrações e a placa de plástico não revestida. Um controle adicional foi a sequência embaralhada de trombina-aptâmero que foi oferecida para ligação (Figura 4C e D).

[097] Um segundo conjunto de experimentos testou a ligação entre ETA-AB e trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1 em um experimento vice- versa. No presente pedido, a trombina-aptâmero biotinilada foi imobilizada nas placas de ELISA através da pré-imobilização de neutravidina. Posteriormente, o ETA-AB foi oferecido para ligação (Figura 5A, B).

[098] Comparando o desaparecimento entre a Figura 5B e 5A mostra que um revestimento de 0,1 μM de trombina-aptâmero (SEQ ID NO: 1) já atingiu a saturação no dado experimento.

[099] Um controle adicional foi a ligação de ETA-AB na trombina- aptâmero embaralhada imobilizada (Figura 6).

[0100] A afinidade de ETA-AB pela trombina-aptâmero embaralhada foi de cerca de 50% da afinidade atingida se a trombina-aptâmero (SEQ ID NO: 1) fosse oferecida para ligação.

COLUNA DE TROMBINA-APTÂMERO PARA REMOÇÃO DE AAB DO SORO 1. SORO HUMANO ENRIQUECIDO DE ETA-AB DE COELHO

[0101] A seguir, uma coluna de trombina-aptâmero foi produzida, a qual foi usada para a remoção de AAB do soro. Para o controle, usou-se uma coluna provida de trombina-aptâmero embaralhada.

[0102] Os aptâmeros (trombina-aptâmero SEQ ID NO: 1) e a sequência controle embaralhada foram ligados ao material da coluna (Sefarose ativada por NHS, GE Healthcare) a uma concentração de 0,1 μmol.

[0103] Em um primeiro conjunto de experimentos, o soro foi enriquecido com ETA-AB de coelho (50 nM) para obter a alteração não apenas na medida da atividade de ETA-AB pelo bioensaio (Figura 7), como também por um ELISA (Figura 8). Os soros enriquecidos foram passados pela coluna e pela coluna controle. O fluxo foi coletado e estocado. Os ETA-ABs ligados foram eluídos com o uso de solução de KSCN 3 M. Antes da medição da atividade de AAB nos eluídos, as amostras foram dialisadas contra tampão fisiológico por 3 dias a 4°C.

[0104] No bioensaio, os eluídos que foram coletados em duas frações foram medidos (Figura 7). Enquanto a coluna de trombina-aptâmero mostrou atividade de ETA-AB após a eluição, a coluna controle não. A fração principal de ETA-AB estava na segunda fração eluída devido aos volumes usados. O volume da coluna foi de 500 μL, enquanto que para todas as etapas de manipulação, escolheu-se 250 μL.

[0105] Para a detecção do ETA-AB no fluxo ou no eluído das colunas por ELISA, a curva padrão de ETA-AB do ELISA também tinha de ser submetida ao procedimento de diálise, comparável ao material da amostra- eluída (Figura 8A). Com o uso dessa material padrão, as amostras foram testadas para a presença de ETA-AB (Figura 8B).

[0106] Mostrou-se que somente a coluna trombina-aptâmero específica foi capaz de se ligar ao ETA-AB do soro controle enriquecido, enquanto o aptâmero controle embaralhado não se ligou ao ETA-AB. No presente pedido, o ETA- AB foi encontrado no fluxo, enquanto que com a coluna específica, eram as frações eluídas que continham o ETA-AB.

[0107] Somente para excluir a possibilidade de IgG humana ligada no soro controle reagir de forma cruzada com a presença do ETA-AB mimético do anticorpo secundário, o soro (40 e 100%) também foi aplicado na placa de ELISA. A quantidade máxima possível de reação cruzada foi medida, a qual foi menor do que a detecção do anti-AB de coelho específico. Além disso, mostrou-se nos experimentos independentes que os eluídos continham menos do que 1/10 IgG humana em comparação às amostras do fluxo (dados não mostrados), excluindo uma enorme influência da reatividade cruzada do anticorpo secundário.

2. SORO CONTENDO AAB HUMANO

[0108] Em uma segunda série de experimentos, a coluna de trombina- aptâmero foi usada para a remoção de AAB do soro. Como controle, usou-se a coluna de trombina-aptâmero embaralhada.

[0109] Com esse fim, 250 μL de soro contendo ETA-AAB e AAB receptor alfa 1 foram passados pelas colunas. Os fluxos e os eluídos foram capturados e realizou-se uma estimativa da atividade de AAB com o uso do bioensaio (Tabela 2). A eluição foi feita com KSCN 3 M. As amostras foram dialisadas contra tampão fisiológico por 3 dias antes que a medição da atividade de AAB fosse realizada.TABELA 2MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DO ETA-AAB E DO AAB RECEPTOR ALFA 1 DE SOROHUMANO NAS FRAÇÕES ÚNICAS DO EXPERIMENTO DE COLUNA

n.d. = não determinado

POSSÍVEL KIT PARA PURIFICAÇÃO DO SORO DOS AABs ATRAVÉS DE MICROESFERAS MAGNÉTICAS DE APTÂMERO

[0110] Um kit tanto para a purificação do soro dos AABs ou para o enriquecimento de AAB através de microesferas magnéticas de aptâmero. TABELA 3 LIGAÇÃO DO SORO-AAB (HUMANO E RATO) NA TROMBINA-APTÂMERO IMOBILIZADA (SEQ ID NO: 1; MlCROESFERAS MAGNÉTICAS DE ESTREPTAVIDINA E TROMBINA- APTÂMERO BIOTINILADA)

INTRODUÇÃO DE PROTEÇÃO A EXONUCLEASES

[0111] A seguir, a influência da introdução de um capeamento 3’- dT na atividade funcional do aptâmero SEQ ID NO: 1 foi testada. Acredita-se que um capeamento 3’-dT proteja a sequência de nucleotídeo da atividade de exonuclease e aumente sua estabilidade nos fluidos biológicos. Para testar o efeito do capeamento 3’-dT na funcionalidade do aptâmero, AAB receptor beta 1 (segunda alça) de um paciente com DCM e AAB receptor beta 2 de um paciente com doença de Alzheimer foram usados (Tabela 4). A atividade funcional de ambos os AABs foi neutralizada quando incubados com 100 nM do aptâmero modificado capeado 3’-dT. A modificação do capeamento 3’ não influenciou a atividade funcional do aptâmero SEQ ID NO: 1.

[0112] O aptâmero protegido apenas pelo capeamento não influenciou a taxa basal de batimento de cardiomiócitos neonatais.TABELA 4MEDIÇÃO-BIOENSAIO DA ATIVIDADE CRONOTRÓPICA DE AABs DO SORO[MlCROESFERAS DELTAS S] DOS AABS TRATADOS COM TROMBINA-APTÂMEROSEQ ID NO: 1 MODIFICADA PELO CAPEAMENTO 3’-DT OU NÃO (SEM APTÂMERO)

TROMBINA-APTÂMERO MARCADA COM FITC PARA A DETECÇÃO DE AABS USO DE TROMBINA-APTÂMERO MARCADA DIRETAMENTE COM MARCADOR FLUORESCENTE PARA A DETECÇÃO DE AABs DE SORO

[0113] O objetivo desses experimentos é a geração de um aptâmero marcado diretamente, o qual é dirigido aos autoanticorpos contra receptores acoplados à proteína G, que será no final usado para a detecção desses AABs.

[0114] Para esse fim, a trombina-aptâmero foi marcada na extremidade 5’ com FITC.

[0115] Nos primeiros experimentos, testou-se se a trombina- aptâmero marcada com FITC mostrava funcionalidade/atividade completa para neutralizar autoanticorpos em comparação à sua versão não marcada. Isso foi testado com o uso de um bioensaio.

[0116] A Figura 9 mostra a capacidade de 100 nM da 5’-FITC- trombina-aptâmero de neutralizar os AABs receptores beta 1. A marcação FITC reduziu a atividade da trombina-aptâmero, mas 50% da atividade do AAB receptor beta 1 estava ainda neutralizada nessa concentração escolhida de 100 nM. Uma inibição parcial da atividade de AAB foi observada nessa concentração de aptâmero.

[0117] Uma vez que a trombina-aptâmero marcada com FITC mostrou - se comparada com o aptâmero não marcado na mesma concentração - uma inibição parcial da atividade de AAB, a molécula foi testada para investigar se seria uma estratégia possível o uso dessa trombina- aptâmero marcada para um ensaio sanduíche. Para esse fim, trombina- aptâmero biotinilada não marcada foi imobilizada na placa de ELISA por meio de Neutravidina e foi usada para capturar os AABs, enquanto a trombina- aptâmero marcada com FITC foi usada ao final para a detecção do material AAB adsorvido.

[0118] As amostras foram removidas dos poços, as duplicatas foram misturadas (volume final de 200 μL) e diluídas com 300 μL de PBS, e a fluorescência relativa foi medida com o uso de espectrofluorfotômetro RF-5001 PC (Shimadzu, Japão) com o uso dos comprimentos de onda de excitação e emissão de 494 e 519 nm, respectivamente.

[0119] Como observado na Figura 10, foi possível detectar uma amostra de paciente (fração de IgG contendo ETA-AABs) em comparação à amostra IgG controle. O uso da trombina-aptâmero embaralhada como controle adicional também não mostrou nenhuma fluorescência.

INFLUÊNCIA DO CAPEAMENTO DT NA FUNCIONALIDADE DA TROMBINA-APTÂMERO

[0120] Nos experimento seguintes, testou-se se a introdução de um grupo de proteção, como o capeamento dT, para a proteção contra a atividade de exonucleases seria possível sem influenciar a atividade da trombina-aptâmero na neutralização dos autoanticorpos dirigidos aos receptores acoplados à proteína G. A introdução de um capeamento dT foi possível sem influenciar a funcionalidade da trombina-aptâmero na neutralização de AABs dirigidos aos receptores acoplados à proteína G (Figura 11).

TRUNCAMENTO DA TROMBINA-APTÂMERO RESULTA NA SEQUÊNCIA 12 MER

[0121] Em um próximo conjunto de experimentos foi testado se o truncamento da trombina-aptâmero resultaria em produtos que são ainda capazes de neutralizar os autoanticorpos dirigidos aos receptores acoplados à proteína G.

[0122] A sequência 15-mer original da trombina-aptâmero (ARC183) foi, portanto, truncada em uma sequência de 12-mer com SEQ ID NO: 3, chamada Throm-K1. A sequência truncada foi testada quanto à sua capacidade de neutralizar AABs no bioensaio (demonstrado por AABs receptor beta 1, Figura 12).

[0123] A sequência de 12-mer mostrou atividade completa.

Claims

1. Uso de um aptâmero compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar doenças autoimunes em um humano, em que a doença autoimune é associada com a presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G, em que o aptâmero se liga especificamente e tem alta afinidade com os referidos autoanticorpos, em que a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer.

2. Uso de um aptâmero compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, caracterizado por ser como ingrediente seletivo durante aférese, preferencialmente durante aférese terapêutica de sangue ou constituintes do mesmo, de um paciente que sofre de uma doença autoimune, em que a doença autoimune é associada com a presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G, em que a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré- eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer.

3. Uso de um aptâmero compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, caracterizado por ser para o diagnóstico de uma doença autoimune, em que a doença autoimune é associada com a presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G, em que o aptâmero se liga especificamente e tem alta afinidade com os referidos autoanticorpos, em que a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer.

4. Uso de um aptâmero compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, caracterizado por ser para a detecção in vitro de um anticorpo, sendo específico para um receptor acoplado à proteína G, preferencialmente o receptor acoplado à proteína G humana, receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores PAR.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o aptâmero é um aptâmero de DNA.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo a ser detectado é um autoanticorpo.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está presente ou deriva de um fluido corporal, preferencialmente um fluido de um corpo humano, mais preferencialmente de sangue, plasma, soro, urina, fezes, fluido sinovial, fluido intersticial, linfa, saliva, fluido espinhal e/ou fluido lacrimal humanos.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é tirado de um indivíduo que sofre ou é suspeito de sofrer de uma doença autoimune, preferencialmente uma doença autoimune associada à presença no soro do paciente de autoanticorpos específicos para receptor acoplado à proteína G, mais preferencialmente doenças autoimunes associadas à presença no soro do paciente de autoanticorpos específicos para receptor adrenérgico alfa 1, receptor adrenérgico beta 1, receptor adrenérgico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina II e/ou receptores PAR.

9. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um aptâmero compreendendo uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável para uso em terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes.

10. Kit caracterizado por compreender pelo menos um aptâmero compreendendo uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3, e um recipiente para uso em terapia e/ou diagnóstico de doenças autoimunes.

11. Coluna de aférese caracterizada por compreender um aptâmero compreendendo uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 e/ou SEQ ID No. 3.

12. Coluna de aférese, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por ser para uso em terapia e/ou diagnóstico de uma doença autoimune, preferencialmente em que a doença autoimune é associada com a presença de autoanticorpos específicos para um receptor acoplado à proteína G, mais preferencialmente em que a doença autoimune é cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopática, cardiomiopatia de Chagas, megacólon de Chagas, megaesôfago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostática benigna, escleroderma, psoríase, síndrome de Raynaud, pré-eclampsia, rejeição de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensão, hipertensão pulmonar, hipertensão maligna e/ou doença de Alzheimer.