CN109172594A - 适体在自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的用途 - Google Patents

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Charite Universitaetsmedizin Berlin
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Abstract

本发明涉及适体在自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的用途。本发明是针对一种用于自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的适体，所述适体包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的核酸序列和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列或由其组成，其中所述自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。

Description

适体在自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的用途
本申请是申请日为2012年3月2日、申请号为201280012243.6、发明名称为“适体在自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的用途”的申请的分案申请。
背景技术
免疫系统形成了每一动物的必需部分。哺乳动物利用其免疫系统来防御微生物、检测和移除异常细胞(如例如肿瘤细胞)以及使组织再生。因此，生物体依靠两个互相关联的防御机制，即体液免疫和细胞免疫。
抗体在与其抗原结合时会触发体液免疫反应。抗体可以按多种方式起作用。除中和抗原以外，抗体也活化补体系统。还存在针对自身抗原的抗体。为了产生这些所谓的自体抗体，可了解分子模拟和/或旁观活化(bystander activation)。自体抗体与自身抗原的特异性结合可活化自然杀伤细胞(NK细胞)，这些自然杀伤细胞能够促进这些抗原的降解。
自体免疫疾病是基于抗体针对身体自身的组成部分的这种特异性识别和结合，由此触发针对自身细胞或组织的免疫反应。除此种免疫刺激效应以外，自体抗体也可通过其他机制引起致病表型的发展。众所周知，还存在可以特异性针对G蛋白偶联受体，如肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1 ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或蛋白酶活化受体(PAR)受体的胞外部分，并且在特异性结合后可活化或阻断这些受体的自体抗体。生物体中这些自体抗体的存在对于可在疾病发展中起作用的相应受体的永久性活化或阻断可以产生激动或拮抗效应。
扩张型心肌病(DCM)是有较高百分比的患者存在这种活化的自体抗体与肾上腺素能β-1受体的胞外部分，尤其是肾上腺素能β-1受体的第一环或第二环的结合的一种疾病。因此，提出了这些患者中DCM的自体免疫发病机制。在结合这些自体抗体后，受体被持续活化(亚恩斯(Jahns)等人(2004),有关β-1肾上腺素能受体引导的自体免疫攻击作为特发性心肌病成因的直接证据(Direct evidence for a beta-1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic cardiomyopathy),临床研究杂志(J.Clin.Invest.)113,1419至1429)。
在近期的研究中，可以显示，经由免疫球蛋白吸附从血液中移除这些自体抗体有助于心肌的再生(华鲁卡G(Wallukat G)、雷因克P(Reinke P)、多福WV( WV)、路德HP(Luther HP)、百斯瓦特K(Bestvater K)、费利克斯SB(Felix SB)、鲍曼G(Baumann G)(1996),通过免疫吸附来移除扩张型心肌病中的自体抗体(Removal of autoantibodiesin dilated cardiomyopathy by immunoadsorption.),国际心脏病学杂志(Int JCardiol.),54:191-195；穆勒J(Müller J)、华鲁卡G、丹德尔M(Dandel M)、比达H(BiedaH)、布兰德斯K(Brandes K)、斯皮格伯格S(Spiegelsberger S)、尼森E(Nissen E)、昆泽R(Kunze R)、赫泽尔R(Hetzer R)(2000),特发性扩张型心肌病患者中的免疫球蛋白吸附(Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilatedcardiomyopathy.),循环(Circulation.),101:385-391；W.V.多福(W.V.)、S.B.费利克斯(S.B.Felix)、G.华鲁卡(G.Wallukat)、S.布雷默(S.Brehme)、K.百斯瓦特(K.Bestvater)、T.霍夫曼(T.Hofmann)、F.K.克莱伯(F.K.Kleber)、G.鲍曼(G.Baumann)、P.雷因克(P.Reinke)(1997),免疫吸附对扩张型心肌病的短期血液动力学效应(Short-termhemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy.),循环,95,1994-1997；和W.V.多福、G.华鲁卡、Y.多福(Y.)、S.B.费利克斯、G.鲍曼(2004),特发性扩张型心肌病中的免疫吸附，3年随访(Immunoadsorption in idiopathic dilatedcardiomyopathy,a 3-year follow-up.),国际心脏病学杂志,97,529-534)。
有其他心血管系统疾病被提出与针对G蛋白偶联受体的自体抗体的存在有关，如查加斯心肌病(Chagas cardiomyopathy)、围产期心肌病、心肌炎、肺动脉高血压和恶性高血压。也在例如患有青光眼、糖尿病、阿兹海默氏病(Alzheimer disease)、良性前列腺肥大、硬皮病、雷诺综合症(Raynaud syndrome)、牛皮癣以及先兆子痫和慢性查加斯疾病(chronic Chagas disease)的患者中以及具有同种异体肾移植排斥的那些患者中发现了针对G蛋白偶联受体的自体抗体。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于与患者体内自体抗体的存在相关的自体免疫疾病的疗法和/或诊断的新颖方法。
本发明提供一种用于自体免疫疾病的疗法和/或诊断的适体，所述适体包含SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的核酸序列和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列或由其组成。
本发明的适体的特征在于，其包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的15个核苷酸的核酸序列和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列或由所述核酸序列组成。15-mer：GGT TGG TGT GGT TGG(SEQ ID No.1)、26-mer：CGC CTA GGT TGG GTAGGG TGG TGG CG(SEQ ID No.2)和12-mer：GGT TGG TGT GGT(SEQ ID No.3)都彼此独立地有本发明适体的目标特异性能力并且是引起本发明适体的目标特异性的原因。其他核酸分子或序列可以被添加到SEQ ID No.1、2和/或3的核酸序列的5'端和/或3'端。所述15-mer(SEQ ID No.1)最先是因其与结合于凝血酶而被分离，参见US 5,543,293，此也适用于26-mer(SEQ ID No.2)，其在WO/2010/033167中首次描述。15-mer已经以名称ARC183用于凝血酶抑制的I期临床试验中，即，作为可能在急性心血管事件中使用的抗凝血剂。26-mer已经以名称NU172(ARC 2172)用于II期临床试验(clinical trial gov.标识符：NCT 00808964)中。然而，针对15-mer(SEQ.ID No.1)的试验证明，获得期望的抗凝血作用所需的适体量引起次最佳的剂量分布。
已意外地发现，本发明的适体可用于干扰特异性针对自体免疫疾病相关性G蛋白偶联受体的抗体，尤其是自体抗体的相互作用。具体说来，可以显示，本发明的适体能够结合于特异性针对肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体的自体抗体并且抑制这些自体抗体与其目标蛋白质的特异性相互作用。通过抑制这些相互作用，本发明的适体减弱或甚至消除了相应G蛋白偶联受体的永久性活化，而无需移除这些抗体。因此，本发明提供了一类化合物，这些化合物首次被描述为适用于治疗和/或诊断自体免疫疾病，尤其是与识别G蛋白偶联受体的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病，即，与特异性针对肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病。此外，在固定后，本发明的适体能够捕获以上指出的自体抗体。因此，首先提供了一个建立用于清除患者血清中的自体抗体的血浆分离置换技术(apheresis technology)的平台，其次，开发出一种用于测量自体抗体的分析工具。最后可以特别用于自体免疫疾病的诊断。
出于本发明的目的，术语“适体”是指包含核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列或由其组成，并且能够以高亲和力特异性结合于特定目标分子，例如针对G蛋白偶联受体(如例如肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体)的自体抗体的寡核苷酸。
本发明的适体包含核酸分子(即，核苷酸)序列或由其组成。本发明的适体优选包含未修饰和/或经过修饰的D-核苷酸和/或L-核苷酸。根据常用的核酸碱基单字母代码，“C”代表胞嘧啶，“A”代表腺嘌呤，“G”代表鸟嘌呤，并且“T”代表胸腺嘧啶，而“U”代表尿嘧啶。如果下文未作相反指示，那么术语“核苷酸”应指核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。术语“2'-氟修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”和/或“2-氨基修饰的核苷酸”分别是指经过修饰的核糖核苷酸和经过修饰的脱氧核糖核苷酸。
如果适体包含在全长SEQ ID No.1、2或3内分别与SEQ ID No.1、2或3的核苷酸序列显示至少80％序列一致性的连续核苷酸序列，那么认为所述适体是由与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列组成或包含与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列。测定序列一致性的方法为此项技术中众所周知的并且可包含例如使用算法blastn。
本发明的适体可包含≥15个核苷酸到≤160个核苷酸、优选≥15个核苷酸到≤120个核苷酸的核酸序列。
本发明的适体可包含DNA核苷酸序列或RNA核苷酸序列或者由其组成，并且因此可以被分别称为DNA适体或RNA适体。应了解，如果本发明的适体包含RNA核苷酸序列，那么在本发明通篇详细说明的序列基元内，胸腺嘧啶被尿嘧啶置换。本发明的RNA核苷酸序列与本发明的DNA核苷酸序列一致，不过T被U置换。为本发明通篇的简洁性起见，仅明确提到DNA核苷酸序列。然而，应了解，本发明也包含相应的RNA核苷酸序列。
尤其优选使用DNA适体。DNA适体在血浆中一般比RNA适体稳定。
本发明的适体可包括含有2'-修饰的核苷酸，例如2'-氟、2'-甲氧基和/或2'-氨基修饰的核苷酸的核苷酸序列。本发明的适体还可包含脱氧核糖核苷酸、经过修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或经过修饰的核糖核苷酸的混合物。
本发明的适体可包含修饰。这些修饰涵盖例如至少一个核苷酸的烷基化(即，甲基化)、芳基化或乙酰化，包括对映异构体和/或适体与一个或一个以上其他核苷酸或核酸序列的融合物。这些修饰可包含例如5'-和/或3'-CAP修饰或5'-和/或3'-PEG结构。或者或另外，本发明的适体可包含经过修饰的核苷酸，优选从锁核酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸和/或2'-氨基修饰的核苷酸选出。
锁核酸(LNA)表示相应RNA核苷酸的类似物，其中构象已固定。锁核酸的寡核苷酸包含一个或一个以上双环核糖核苷，其中2'-OH基团经由亚甲基与C4-碳原子连接。与相应未修饰的RNA适体对应物相比，锁核酸针对核酸酶展现出改良的稳定性。杂交性质也得到改良，由此使适体的亲和力和特异性增强。
另一优选的修饰是将所谓3'-CAP结构、5'-CAP结构和/或经过修饰的鸟苷核苷酸(例如7-甲基-鸟苷)添加到适体的3'端和/或5'端。这种3'端和/或5'端的修饰具有保护适体免于被核酸酶快速降解的作用。
或者或另外，本发明的适体可展现聚乙二醇化的5'端和/或3'端。5'-PEG和/或3'-PEG修饰包含添加至少一个聚乙二醇(PEG)单元，优选PEG基团包含1至900个亚乙基，更优选1至450个亚乙基。在一个优选实施例中，适体包含了具有HO-(CH2CH2O)n-H的线性PEG单元，其中n为1至900的整数，优选n为1至450的整数。
本发明的适体可包含具有硫代磷酸酯主链的核酸序列或由其组成，或者可完全或部分配置为肽核酸(PNA)形式。
通过上文提到的一种或一种以上方式修饰本发明适体的一个益处在于，可使适体针对如例如使用适体的环境中存在的核酸酶等不利影响保持稳定。所述修饰也适合于调整适体的药理学性质。修饰优选不改变适体的亲和力或特异性。
本发明的适体还可以与载体分子和/或报道分子连结。载体分子包含当与适体连结时，例如通过增强稳定性和/或通过影响排泄速率来延长连结的适体在人血浆中的血浆半衰期的分子。合适载体分子的一个实例为PEG。报道分子包含允许检测连结的适体的分子。这些报道分子的实例为GFP、生物素、胆固醇、染料(如例如荧光染料)、电化学活性报道分子和/或包含放射性残基的化合物，尤其是适用于PET(正电子发射断层摄影法)检测的放射性核素，如例如18F、11C、13N、15O、82Rb或68Ga。技术人员将充分了解合适的载体分子和报道分子，并且了解将其与本发明适体连结的方式。
本发明的适体抑制抗体的激动作用或阻断作用。出于本发明的目的，术语“抗体”是指天然存在的抗体，包括例如自体抗体，尤其是罹患与特异性针对G蛋白偶联受体(如例如肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体)的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病的患者的自体抗体，以及经过修饰或基因工程改造的抗体。自体抗体是由个体的免疫系统产生的针对一种或一种以上个体自身的蛋白质的抗体。然而，术语抗体不局限于具有经典的重链和轻链架构的抗体。如本文中所用，术语“抗体(antibody/antibodies)”是此项技术公认的术语并且应理解为指结合于给定抗原的分子或分子的活性片段，具体说来，这些术语是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原的结合位点的分子。免疫球蛋白是包含一个或一个以上实质上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε及μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因编码的多肽的一种蛋白质。轻链被分为κ或λ轻链。重链被分为γ、μ、α、δ或ε重链，这些重链又分别定义免疫球蛋白种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的子类也是已知的。举例来说，人体中的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4子类中的任一种。抗体可优选属于IgM和/或IgG种类或其任何子类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
在本发明范围内的“抗体”意欲包括自体抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、类人猿化(simianized)抗体、人类抗体和人源化抗体以及其活性片段。结合于已知抗原的分子的活性片段的实例包括分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'和F(ab')2片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物及上文提到的任何抗体和片段的表位结合片段。
本发明的适体可用于治疗和/或诊断自体免疫疾病。如出于本发明的目的所使用，术语“自体免疫疾病(autoimmune disease/autoimmune diseases)”是指自体免疫疾病，特别是人类的自体免疫疾病，其中这些自体免疫疾病与特异性针对G蛋白偶联受体的自体抗体的存在相关。所述自体抗体可优选涉及自体免疫疾病的发病机制，并且因此可能存在于罹患所述自体免疫疾病的患者的血清中。更优选地，自体免疫疾病是与患者血清中特异性针对肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病。甚至更优选地，自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病(Chagas'cardiomyopathy)、查加斯巨结肠(Chagas'megacolon)、查加斯巨食道症(Chagas'megaesophagus)、查加斯神经病(Chagas'neuropathy)、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。最优选术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
本发明的适体的制造或大量生产为此项技术中众所周知的并且仅仅表示常规活动。
本发明还针对一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本发明的适体和任选的至少一种药学上可接受的赋形剂。本发明还针对一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的适体或本发明的不同适体的混合物和药学上可接受的赋形剂(如例如合适载剂或稀释剂)。
本发明的适体优选构成药物组合物的活性成分和/或以有效量存在。
术语“有效量”表示对于疾病或病理状况具有预防、诊断或治疗相关作用的本发明适体的量。预防作用防止疾病的发作。治疗相关作用在一定程度上减轻疾病的一种或一种以上症状，或者使与疾病或病理状况相关或引起疾病或病理状况的一个或一个以上生理或生化参数部分或完全地恢复正常。给予本发明适体的相应量应高到足以获得期望的预防、诊断或治疗作用。技术人员应了解，对任何特定哺乳动物给药的具体剂量、频率和时段将取决于多种因素，包括所用具体组分的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、膳食、给药时间、给药途径、药物组合和具体疗法的严格程度。本领域技术人员可以使用众所周知的方式和方法测定确切量作为常规实验的内容。
在本发明的药物组合物中，总适体含量的至少20％、优选至少50％、更优选至少75％、最优选至少95％是由本发明的适体构成。
当用于疗法时，药物组合物一般将以与一种或一种以上药学上可接受的赋形剂结合的制剂形式给予。术语“赋形剂”在本文中用以描述除本发明适体以外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上取决于具体给药模式。赋形剂可以是合适的载剂和/或稀释剂。
本发明的药物组合物可以经口给予。经口给药可涉及吞咽，由此使组合物进入胃肠道，或者可以采用口腔或舌下给药，借此使组合物从口直接进入血流。
适于经口给予的制剂包括：固体制剂，如片剂；包衣片剂；含有颗粒、液体或粉末的胶囊；锭剂(包括填充液体的锭剂)；和咀嚼片；多颗粒和纳米颗粒制剂；凝胶剂；固溶体；脂质体；膜剂、胚珠制剂、喷雾剂和液体制剂。
液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这些制剂可作为填充剂用于软质或硬质胶囊中，并且典型地包含载剂，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或者合适的油，及一种或一种以上乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可以通过使例如药囊中的固体复水来制备。
对于片剂剂型，取决于剂量，本发明的适体可以占所述剂型的0,1重量％至80重量％，更典型地占所述剂型的5重量％至60重量％。除本发明的适体之外，片剂一般还含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低碳数烷基取代的羟基丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉和海藻酸钠。崩解剂一般占所述剂型的1重量％至25重量％，优选占5重量％至20重量％。
片剂可包含另外的赋形剂，如例如粘合剂、表面活性剂、润滑剂和/或其他可能的成分，如例如抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和/或掩味剂。
片剂掺合物可以直接或通过滚筒压缩以形成片剂。或者，可以在压片之前对片剂掺合物或部分掺合物进行湿式造粒、干式造粒或熔融造粒、熔融凝结或挤出。最终制剂可包含一个或一个以上层并且可包覆包衣或未包覆包衣；它甚至可被囊封。
经口给予的固体制剂可被配制为速释型和/或缓释型。缓释制剂包括延迟释放型、持续释放型、脉冲释放型、控制释放型、靶向释放型和程序化释放型(programmedrelease)。
本发明的药物组合物还可以直接给予至血流中、肌肉中或内脏器官中。适于不经肠给药的方式包括静脉内、动脉内、腹膜內、鞘内、心室内、尿道内、胸骨內、颅内、肌肉内和皮下给药。适于不经肠给药的装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器及输注技术。
不经肠制剂典型地为可含有赋形剂(如盐、碳水化合物)和缓冲剂(优选pH值为3至9)的水溶液，但对于某些应用来说，其可更合适地配制为无菌非水性溶液或欲结合适合媒剂(如无菌、无热原质水)使用的干燥形式。
不经肠制剂在无菌条件下例如通过冻干进行的制备可易于使用本领域的普通技术人员众所周知的标准制药技术来实现。
用于制备不经肠溶液的本发明药物组合物的溶解性可通过使用适当配制技术(如并入溶解性增强剂)来增加。
不经肠给予的制剂可被配制为速释型和/或缓释型。缓释型制剂包括延迟释放型、持续释放型、脉冲释放型、控制释放型、靶向释放型和程序化释放型。因此，本发明的化合物可被配制为固体、半固体或触变性液体形式作为植入式药物储槽给予，从而提供活性化合物的缓释。这些制剂的实例包括药物涂布的支架和PGLA聚(dl-乳酸-共乙醇酸)(PGLA)微球体。
本发明的药物组合物也可以局部(即，经皮或透皮)给予皮肤或粘膜。用于此目的的典型制剂包括凝胶剂、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏剂、软膏剂、撒粉剂、敷料、泡沫剂、膜剂、皮肤贴片、糯米纸囊剂(wafer)、植入剂、海绵(sponge)、纤维、绷带和微乳液。还可以使用脂质体。典型载剂包括醇、水、矿物油、液体矿脂、白矿脂、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可以并入渗透增强剂。其他局部给药方式包括通过电穿孔法(electroporation)、离子导入疗法(iontophoresis)、超声导入疗法(phonophoresis)、超声导入疗法(sonophoresis)和微针或无针(例如Powderject(TM)、Bioject(TM)等)注射来递送。局部给予的制剂可被配制为速释型和/或缓释型。缓释制剂包括延迟释放型、持续释放型、脉冲释放型、控制释放型、靶向释放型和程序化释放型。
对于给予人类患者来说，本发明适体和/或本发明药物组合物的总日剂量典型地在0.001mg至5000mg的范围内，当然，此将取决于给药模式。举例来说，静脉内日剂量可能仅需要0.001mg至40mg。总日剂量可以按单次剂量或分次剂量给予并且可由医师的酌情而在本文中给出的典型范围以外。
这些剂量是基于具有约65kg至70kg体重的平均人类受检者。医师将能够容易地确定体重在此范围以外的受检者(如婴儿和老年人)的剂量。
本发明还涵盖一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的适体、药物组合物、容器和任选地关于使用和/或给药方式的书面说明。
本发明的适体、药物组合物和/或试剂盒可用于自体免疫疾病，特别是人类自体免疫疾病的疗法和/或诊断中。优选地，自体免疫疾病是与特异性针对G蛋白偶联受体的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病，其中这些自体抗体存在于罹患所述自体免疫疾病的患者的血清中。更优选地，自体免疫疾病是与患者血清中特异性针对肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体的自体抗体的存在相关的自体免疫疾病。甚至更优选地，自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。最优选地，术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
如本文中所用，术语“疗法”、“治疗(treatment)”和“治疗性(therapeutically)”是指治疗活动，而“治疗(treating)”定义如下。如本文中所用，术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制此术语适用的疾病、病症或病状的进展，或所述疾病、病症或病状的一种或一种以上症状。如本文中所用，“治疗”还可以指与未治疗的对照群体相比，或与治疗之前的同一哺乳动物相比，降低哺乳动物的疾病、病症或病状发生的概率或发病率。举例来说，如本文中所用，“治疗”可以指预防疾病、病症或病状，并且可以包括延迟或预防疾病、病症或病状的发作，或延迟或预防与疾病、病症或病状相关的症状。如本文中所用，“治疗”还可以指在哺乳动物受疾病、病症或病状困扰之前，降低疾病、病症或病状或者与所述疾病、病症或病状相关的症状的严重程度。这种在受病痛困扰之前对疾病、病症或病状的严重程度的预防或降低涉及向在给药时未受疾病、病症或病状困扰的受检者给予如本文所述的本发明组合物。如本文中所用，“治疗”还可以指预防疾病、病症或病状或者与所述疾病、病症或病状相关的一种或一种以上症状的复发。
对于疾病的治疗和/或诊断，不管给药途径如何，本发明的适体都是以每一治疗周期不超过每公斤体重20mg，优选不超过每公斤体重10mg，更优选从每公斤体重1μg至20mg范围内选出，最优选从每公斤体重0.01mg至10mg范围内选出的日剂量给予。
本发明还针对本发明适体或本发明药物组合物在制造用于治疗和/或诊断自体免疫疾病的药物方面的用途。优选地，自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。甚至更优选地，术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
在另一个方面中，本发明针对一种治疗或诊断自体免疫疾病的方法，其中需要所述治疗的个体被给予有效量的本发明适体或本发明药物组合物。优选地，自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。甚至更优选地，术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
本发明的适体当用于治疗或诊断自体免疫疾病时不一定需要给予个体或患者。治疗或诊断作用也可以通过使用本发明适体除去身体或体液中的抗体(如例如自体抗体)来获得。所述除去可包含例如在免疫吸附和/或血浆分离置换期间，在使本发明适体仅与离体体液接触的环境中施加本发明适体，因此本发明适体不进入待治疗的个体或患者的身体。因此，本发明还针对一种包含本发明适体的血浆分离置换柱。
血浆分离置换是使供体或患者的血液通过一种设备以析出一种特定成分并且使剩余物返回供体或患者的循环的一种医学技术。本发明适体可以在血浆分离置换期间用作选择性成分。选择性成分负责特异性析出期望的特定成分，即样品或血液中存在的受本发明适体特异性靶向的抗体或自体抗体。优选使用本发明适体作为来源于罹患自体免疫疾病的患者的血液或其部分的治疗性血浆分离置换中的选择性成分。更优选地，自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。甚至更优选地，术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
本发明还涉及一种与固体支撑物偶联的本发明适体。技术人员将充分了解可用于制造这种与固体支撑物偶联的适体的技术和材料。在一个优选实施例中，固体支撑物包含适用于医学、生化或生物检验中的固体材料，如例如用于血浆分离置换或ELISA检验中的材料。所述固体材料包含一般在医学、生化或生物检验中用作支撑物的聚合物。具体说来，本发明适体可与固体支撑物偶联，从而允许使用所得产物制造适用于血浆分离置换的柱，优选适用于血浆分离置换中以从液体样品，优选从体液中移除由本发明适体特异性结合的抗体的柱。
在另一个方面中，本发明是针对本发明适体用于体外检测和/或表征特异性针对G蛋白偶联受体的抗体(如例如自体抗体)的用途，这些G蛋白偶联受体优选为肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体。
所述用途可包含在有效量本发明适体存在和不存在的情况下，在大鼠心肌细胞搏动频率检验中测试样品。根据样品和本发明适体对于搏动频率的影响，技术人员可以推断出相应抗体的存在。也可得到关于样品中这些抗体的总量或相对量的数据以及关于这些抗体的其他性质的数据。
所谓的大鼠心肌细胞搏动频率检验是一种用于检测和表征特异性针对许多人类G蛋白偶联受体的抗体(例如来源于患者的自体抗体)的完善检验，这些人类G蛋白偶联受体如例如为人类肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体。所述检验详细描述于以下文献中：华鲁卡(Wallukat)等人(1987),过敏性哮喘和扩张型心肌病患者的血清γ球蛋白部分对培养的新生大鼠心肌细胞中β肾上腺素受体变时功能的影响(Effects of the serumgamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilatedcardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in culturedneonatal rat heart myocytes)，生物医学与生物化学学报(Biomed.Biochim.Acta)46,634-639；华鲁卡等人(1988),培育的心肌细胞—用于检测针对β肾上腺素能受体的自体抗体的功能测试系统(Cultivated cardiac muscle cells-a functional test system forthe detection of autoantibodies against the beta adrenergic receptor)，组织化学学报(Acta Histochem)35增刊,145-149；和华鲁卡等人(2010),查加斯心肌病和巨结肠中针对G蛋白偶联受体的自体抗体的不同作用模式。其对于无症状查加斯患者的早期风险评估的潜在影响(Distinct patterns of autoantibodies against G-protein coupledreceptors in Chagas'cardiomyopathy and megacolon.Their potential impact forearly risk assessment in asymptomatic Chagas'patients)，美国心脏病协会杂志(J.Am.Coll.Cardiol.)55,463-468。因此，技术人员将充分了解此检验的性质并且知道如何应用它。
本发明适体可特别适用于检测和/或表征相应抗体，其中这些抗体存在于体液中或来源于体液，优选人类体液，更优选人类血液、血浆、血清、尿液、粪便、滑液、间质液、淋巴液、唾液、汗液、脊髓液和/或泪液。在一个优选实施例中，体液是从罹患或疑似罹患自体免疫疾病的个体获取。优选自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、查加斯巨食道症、查加斯神经病、良性前列腺肥大、硬皮病、牛皮癣、雷诺综合症、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压和/或阿兹海默氏病。甚至更优选术语“自体免疫疾病”是指自体免疫疾病扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、查加斯心肌病、查加斯巨结肠、青光眼、高血压、肺动脉高血压、恶性高血压、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症和/或阿兹海默氏病。
关于这些抗体的检测和/或表征，所用本发明适体可以呈溶液或固定的形式。
本发明适体可用于直接或间接检测和/或表征所述抗体。
在下文中，本发明将借助于实例作进一步解释及例示。
附图说明
图1示出了如图中所示的不同AAB的功能活性的中和的剂量-反应曲线。
图2示出了人类IgG-3[73nM]的存在对于凝血酶-适体中和β1-受体AAB的功能活性的剂量-反应曲线的影响。
图3示出了凝血酶-适体对于ETA-AB介导的新生心肌细胞搏动频率降低的影响。
图4示出了凝血酶-适体(SEQ.ID No.1)对于固定的ETA-AB、用作对照的固定的兔IgG和固定的人类IgG子类的结合。A和C：25nM的每一固定的蛋白质，B和D：250nM的固定的蛋白质。A和B：凝血酶-适体SEQ.ID No.1的结合，以及C和D：其混杂对照序列的结合。使用生物素化的凝血酶-适体并且生物素部分用于检测。结合的生物素的量是经由中性亲和素-POD(Neutravidin-POD)和TMB/H2O2反应来定量。
图5示出了ETA-AB(SP 4122P)结合至固定的凝血酶-适体(SEQ.ID No.1)上，A：1μMB：0.1μM凝血酶-适体进行固定。用二级抗兔IgG-POD抗体(1:10.000)和TMB/H2O2反应进行检测。未涂布和中性亲和素涂布的平板充当对照(中性亲和素＝NA)。
图6示出了ETA-AB(SP 4122P)结合至固定的凝血酶-适体(SEQ.ID No.1)和用作对照的固定的混杂凝血酶-适体上。
图7示出了在从凝血酶-适体柱洗脱和对应的对照实验(对照柱)后，所结合的ETA-AB的回收。ETA-AB活性是在生物检验中测量。
图8示出了在ELISA实验中从加料血清回收的ETA-AB。A：示出了与洗脱液样品(透析)同等处理的ETA-AB标准曲线。B：示出了在从凝血酶-适体柱(ARC183柱)和对应的对照柱(混杂的凝血酶-适体)洗脱后，穿流物(flow-throughs)、洗涤液和洗脱液中所回收的ETA-AB的量。用抗兔IgG-POD抗体(1:10,000)和TMB/H2O2检测进行检测。
图9示出了使用自发搏动的新生大鼠心肌细胞进行的生物检验进行的5'-FITC标记的凝血酶-适体的AAB中和能力的测试。当存在100nM FITC-凝血酶-适体时，由β1受体AAB所引起的搏动频率的增加有约50％减少。条形图为两个独立实验的平均值(n＝2)。
图10示出了使用凝血酶-适体//FITC-凝血酶-适体夹心检验进行的患者样品中ETA-AAB的检测。用对照IgG样品和混杂的凝血酶-适体作为对照。数据来自一个实验。(FITC-throm-a＝FITC-凝血酶-适体，throm-apta＝凝血酶-适体)。
图11示出了在自发搏动的新生心肌细胞进行的生物检验中所测量的100nM dT-凝血酶-适体对AAB活性(β1受体AAB、α1+β2受体AAB、亲和纯化的β2受体AAB，每种AAB n＝1)的中和作用。
图12示出了在自发搏动的大鼠心肌细胞进行的生物检验中比较截短的凝血酶-适体序列(12-mer序列，SEQ ID No.3，Throm K1)与原始15-mer序列(ARC183，SEQ ID No.1)和26-mer序列(NU172，SEQ ID No.2)中和β1受体AAB的正性变时活性的功能的测试。
具体实施方式
实例：
概述
分别由具有SEQ.ID No.1和2的核酸序列组成的适体为靶向G蛋白偶联受体的自体抗体的亲和性和特异性结合剂。这些适体能够在可溶状态下中和AAB(自体抗体)的功能。固定在表面上的适体能够捕获AAB。后续洗脱将移除所捕获的AAB。
因此，已显示本发明适体是用于治疗与针对G蛋白偶联受体的功能活性AAB相关的疾病的治疗和诊断目的的适当分子。
材料和方法
心肌细胞的准备和培养
在无菌条件下取出1至3天大的大鼠的心脏并且转移到含有青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(PBS)中。分离心室组织，切成数块并且用10ml含有青霉素/链霉素的PBS洗涤两次，并且最后一次仅使用PBS洗涤。将心室块悬浮于30ml含有0.2％胰蛋白酶的PBS中。在37℃下培育20分钟后，用10ml冰冷的热灭活小牛血清停止胰蛋白酶化。将所得悬浮液在130×g下离心6分钟，并且将离心块转移到20ml SM20-I培养基。关于细胞数估算，将100μl此悬浮液添加到100μl台盼蓝(trypanblue)溶液中。对于细胞培养，将2.4×106个细胞悬浮于与湿空气平衡并且补充有10％热灭活小牛血清、0.1mU胰岛素和2μM氟代脱氧尿苷(由非肌细胞防止肌细胞过度生长)的2.5ml含葡萄糖的SM 20-I培养基中，将其转移到12.5cm2福尔肯烧瓶(Falcon flask)中并且在37℃下以单层形式培养4天。在两天后更新培养基。
生物检验的原理
为鉴定和定量AAB，使用一种生物检验，所述生物检验最先是由华鲁卡和伍伦伯格(Wollenberger)为测量针对G蛋白偶联受体的AAB而建立的(华鲁卡G，伍伦伯格A.，过敏性哮喘和扩张型心肌病患者的血清γ球蛋白部分对培养的新生大鼠心肌细胞中β肾上腺素受体变时功能的影响，生物医学与生物化学学报，1987；46:S634-9)并且近来我们详细描述了慢性查加斯疾病中针对肾上腺素能β1和β2受体及蕈毒碱M2受体的AAB的测量(华鲁卡G，穆尼奥斯萨拉维亚SG(Mu？？oz Saravia SG)，哈伯兰A(Haberland A)，巴特尔S(Bartel S)，阿劳约R(Araujo R)，瓦尔达G(Valda G)，杜贞D(Duchen D)，迪亚兹拉米雷斯I(Diaz RamirezI)，博格斯AC(Borges AC)，斯基米克I(Schimke I.)，查加斯心肌病和巨结肠中针对G蛋白偶联受体的自体抗体的不同作用模式。其对于无症状查加斯患者的早期风险评估的潜在影响，美国心脏病协会杂志，2010；55:463-8.)。
在此生物检验中，记录下所培养的自发搏动的新生大鼠心肌细胞的变时反应，所述变时反应为通过刺激AAB(如靶向肾上腺素能β1和β2受体或肾上腺素能α1受体的AAB)所引起的正性变时反应和通过抑制AAB(如靶向蕈毒碱M2受体或A型内皮素受体(ETA受体)的AAB)所引起的负性变时反应的总和(1个单位AAB活性＝1次搏动/分钟频率变化)。
为关于对变时反应(正性或负性变时)的贡献来区分AAB种类，在特定拮抗剂存在下进行分析，如针对β2受体AAB的ICI-118.551、针对M2-AAB的阿托品(atropine)、针对β1/β2受体AAB的普萘洛尔(propranolol)、针对ETA受体的BQ 610或BQ 123、针对α1-肾上腺素受体的哌唑嗪(prazosine)和针对AT1受体的厄贝沙坦(Ibesartan)或洛沙坦(Losartan)。除特定地阻断的情形外，其余活性变化都是由AAB引起。
以上证明的不同受体AAB的进一步表征是通过使用与受体的胞外环对应的AAB-表位提呈肽来进行。
所述生物检验可以检测并定量靶向细胞表面上的受体的所有人类血清AAB和其他分子，所述受体的序列与人类受体同源(就AAB靶向来说)并且关联到调控细胞搏动频率(收缩性、变时性)的机构，如G蛋白系统。
用于AAB鉴定和区分及AAB活性测量的血清样品的制备
将1ml对照血清和患者血清与660μL饱和硫酸铵溶液混合(最终浓度为40％硫酸铵)并且在40℃下培育18小时。在6,000×g下离心15分钟后，将离心块再悬浮于750μL PBS中，与750μL饱和硫酸铵溶液混合(最终浓度为50％硫酸铵)并且再次离心。在此之后，将离心块悬浮于700μl PBS中并且针对100倍体积的PBS进行透析。所得IgG部分可以在-20℃下储存直至测量。
结果
通过特异性适体抑制不同AAB针对G蛋白偶联受体的AAB功能
在下文中，研究适体SEQ.ID No.1(也称为凝血酶-适体SEQ ID No.1或ARC 183，描述于US 5,543,293中)及适体SEQ.ID No.2(也称为凝血酶-适体SEQ ID No.2或ARC 2172或NU172，描述于WO/2007/025049中)对抗体(来自患者血清的自体抗体)活性的中和作用(表1)。
在进行此研究时，研究以下抗体(自体抗体＝AAB)：肾上腺素能α1受体AAB、肾上腺素能β1受体AAB、β2受体AAB、蕈毒碱M2受体-AAB、内皮素1ETA受体-AAB(ETA-AAB)、血管紧张素II AT1受体-AAB和PAR受体AAB。
已在以下病理状况中描述所述AAB的出现，不排除也可能为所述AAB或类似AAB的载体的其他病理状况：DCM、查加斯心肌病、慢性查加斯疾病、查加斯巨结肠、围产期心肌病、青光眼、肺动脉高血压、高血压、恶性高血压、糖尿病、阿兹海默氏病、同种异体肾移植排斥、雷诺综合症。表1显示，使用具有SEQ.ID No.1的适体中和或使用具有SEQ ID No.2的适体部分中和所有测试自体抗体针对G蛋白偶联受体的功能活性。
表1.显示适体SEQ.ID No.1和SEQ.ID No.2[100nM]中和AAB针对G蛋白偶联受体的功能活性的能力。AAB的功能活性是经由其改变细胞脉搏率的能力[Δ搏动速率/15秒]来测量。
凝血酶-适体介导的AAB中和的剂量-反应曲线
在下文中，测量单一凝血酶-适体培育的剂量-反应曲线(图1)。这样做不仅中和了针对G蛋白偶联受体的人类AAB，而且还中和了来自SHR大鼠血液的β1受体AAB。事实上，针对β1受体的第一或第二环的人类AAB、针对AT1受体和肾上腺素能α1受体的AAB得到中和。大鼠中的β1受体AAB是自发形成的AAB。
很明显，不同剂量-反应曲线显示出微小差异。虽然中和作用对于人类α1受体AAB最有效，但它对大鼠β1受体AAB显示的效率最低。如果采用的AAB浓度可为IgG部分的约0.1％(华鲁卡博士的个人信息)，那么不同适体浓度将面临约1.4nM的AAB最终浓度(正常IgG浓度约10g/L＝68.5μM细胞培养基中1:50的AAB稀释液)。因此，针对某种AAB(如α1受体AAB)的中和作用在约1nM的适体浓度下起始就变得非常合乎逻辑，而100nM适体一般是完全抑制AAB功能必需的。
在竞争性人类IgG-3存在下的适体-AAB亲和力
早先测试凝血酶-适体SEQ ID No.1对于人类IgG亚型的亲和力的实验已显示，凝血酶-适体SEQ ID No.1对IgG-3具有较高亲和力，随后是IgG-4、IgG-2和IgG1。虽然最后三种亚型之间的差异仅为微小的，但对亚型IgG-3的亲和力很显著(数据未显示)。
现在，为了测试，如果凝血酶-适体SEQ ID No.1对AAB的亲和力比其对IgG-3子类的常见亲和力高，那么进行以下竞争实验：在测量凝血酶-适体SEQ ID No.1针对人类患者血清AAB(β1受体AAB第二环，1:50稀释液)的剂量-反应曲线时，在一个实验设置中，添加73nM人类IgG-3，使其与β1受体AAB竞争关于凝血酶-适体结合(图2)。尤其是在使IgG-3浓度相对于凝血酶-适体明显摩尔过量的低浓度凝血酶-适体SEQ ID No.1(1、5和10nM凝血酶-适体)下，在存在与不存在IgG-3情况下的AAB中和作用之间未观察到差异。
使用以下模型自体抗体证明凝血酶-适体与自体抗体之间的结合：针对受体第二胞外环的兔抗人类内皮素受体抗体(阿瑞斯抗体(acris antibody)，SP 41222P)
1.在生物检验中及通过凝血酶-适体SEQ ID No.1的中和作用来测试ETA-AB功能产生针对人类内皮素受体第二胞外环的兔内皮素受体抗体(ETA-AB)。所述抗体在生物检验中显示出功能活性。ETA-AB导致自发搏动的新生大鼠心肌细胞的搏动频率减小(图3)。添加100nM凝血酶-适体引起此导致搏动频率变化的ETA-AB的完全中和(图3)。仅仅将凝血酶-适体(SEQ.No.1)添加到新生大鼠心肌细胞上未对细胞产生任何可见的作用，并且也未对基础搏动频率产生影响(数据未显示)。
2.测试凝血酶-适体SEQ ID No.1与ETA-AB之间的直接结合
在ELISA实验中测试凝血酶-适体与ETA-AB之间的直接结合，测试了两种不同的实验设置。首先，将ETA-AB固定至ELISA板上并且测试其结合凝血酶-适体SEQ ID No.1的能力(图4)。在第二组实验中，将凝血酶-适体SEQ ID No.1固定并且提供ETA-AB用于结合(图5)。
对于第一组实验，选择两种不同的蛋白质浓度以固定在ELISA板上：25nM(图4A)和250nM(图4B)。用相同浓度的兔IgG、人类IgG子类(IgG-1、2、3和4)，以及未涂布的塑料板作为对照。另一对照为提供用于结合的混杂的凝血酶-适体序列(图4C、D)。
第二组实验在反过来的实验中测试ETA-AB与凝血酶-适体SEQ.ID No.1之间的结合。现在，将生物素化的凝血酶-适体经由预先固定的中性亲和素而固定在ELISA板上。之后，提供ETA-AB用于结合(图5A、B)。
比较图5B与5A之间的消光度显示，在给定实验中0.1μM凝血酶-适体(SEQ.IDNo.1)的涂层已达到饱和。
另一对照为ETA-AB结合到固定的混杂凝血酶-适体上(图6)。
ETA-AB对混杂的凝血酶-适体的亲和力是在提供凝血酶-适体(SEQ.ID No.1)用于结合的情况下所达到的亲和力的约50％。
用于从血清移除AAB的凝血酶适体柱
1.加有兔ETA-AB的人类血清
在下文中，制得凝血酶-适体柱用于从血清移除AAB。用携带混杂的凝血酶-适体的柱作为对照。
将适体(凝血酶-适体SEQ.ID No.1)和混杂的对照序列以0.1μmol的浓度结合到柱材料(NHS活化的琼脂糖(Sepharose)，通用电气医疗集团(GE healthcare))上。
在第一组实验中，血清加有兔ETA-AB(50nM)，以便获得不仅经由生物检验(图7)而且经由ELISA(图8)测量ETA-AB活性的机会。在所述柱和对照柱上给予加料血清。获取穿流物并且储存。使用3M KSCN溶液洗脱所结合的ETA-AB。在测量洗脱液中的AAB活性之前，在4℃下将样品针对生理缓冲液透析3天。
在生物检验中，测量分两部分获取的洗脱液(图7)。凝血酶-适体柱在洗脱后显示出ETA-AB活性，但对照柱没有。主要ETA-AB部分是在第二个洗脱液部分中，这归因于使用的体积。柱体积为500μl，而对于所有操作步骤，选择250μl。
为了检测在ELISA中穿流物或柱洗脱液中的ETA-AB，ELISA的ETA-AB标准曲线也需要进行透析程序，可与洗脱液样品材料相比较(图8A)。使用此标准材料，测试样品中ETA-AB的存在(图8B)。
经显示，仅特定的凝血酶-适体柱能够结合加料对照血清中的ETA-AB，而混杂的对照适体不结合ETA-AB。此处在穿流物中发现ETA-AB，而使用所述特定柱，洗脱液部分中含有ETA-AB。
仅为了排除对照血清中结合的人类IgG可能经由与二级抗体交叉反应来模拟ETA-AB存在，也将血清(40％和100％)施加于ELISA板上。测量交叉反应的最大可能量，其小于特异性抗兔AB检测量。此外，在独立实验中已显示，洗脱液含有不到穿流物样品中的1/10的人类IgG(数据未显示)，排除二级抗体交叉反应性的巨大影响。
2.含有人类AAB的血清
在第二组实验中，使用凝血酶-适体柱移除血清AAB。用混杂的凝血酶-适体柱作为对照。
为此，在柱上给予250μl含有ETA-AAB和α1受体AAB的血清。捕集穿流物和洗脱液并且使用生物检验估计AAB活性(表2)。使用3M KSCN进行洗脱。在进行AAB活性测量之前，将样品针对生理缓冲液透析3天。
表2在柱实验的单一部分中测量人类血清中ETA-AAB和α1受体AAB活性
n.d.＝未测定
经由适体-磁性珠粒纯化血清AAB的可能试剂盒
经由凝血酶-适体-磁性珠粒来纯化血清AAB或富集AAB的试剂盒。
表3血清-AAB(人类和大鼠)结合到固定的凝血酶-适体(SEQ.ID No.1；抗生蛋白链菌素磁性珠粒和生物素化的凝血酶-适体)上
引入核酸外切酶防护作用
在下文中，测试引入3′-dT帽对于适体SEQ.ID No.1功能活性的影响。3′-dT帽被认为可保护核苷酸序列免受核酸外切酶活性影响并且增加其在生物流体中的稳定性。在测试3′-dT帽对于适体功能的影响时，使用来自DCM患者的β1受体AAB(2.环)和来自阿兹海默氏病患者的β2受体AAB(表4)。当与100nM的3′-dT帽修饰的适体一起培育时，两种AAB的功能活性都被中和。3′-帽修饰不影响适体SEQ.ID No.1的功能活性。
仅受帽保护的适体并不影响新生心肌细胞的基础搏动速率。
表4用3′-dT帽修饰的凝血酶-适体SEQ.ID No.1处理或未处理(无适体)的AAB的血清AAB变时活性[Δ搏动/15秒]的生物检验测量
疾病 AAB类型 无适体 +适体-3′-dT帽
DCM β1受体-A-AB 6.0 0.0
阿兹海默氏病 β2受体-AAB 5.17 0.0
用于检测AAB的FITC标记的凝血酶-适体
使用直接荧光标记物标记的凝血酶-适体检测血清AAB
这些实验旨在产生靶向针对G蛋白偶联受体的自体抗体的直接标记的适体，所述适体最终将用于检测这些AAB。
为此，用FITC标记凝血酶-适体的5′端。
在第一实验中，测试FITC标记的凝血酶-适体与其未标记型式相比是否显示中和自体抗体的全部功能/活性。使用生物检验对此进行测试。
图9示出了100nM 5′-FITC-凝血酶-适体中和β1受体AAB的能力。FITC标记降低凝血酶-适体的活性，但在此选定的100nM浓度下，仍中和50％的β1受体AAB活性。在此适体浓度下观察到AAB活性的部分抑制。
因为FITC标记的凝血酶-适体显示出AAB活性的部分抑制(如果与相同浓度的未标记适体相比)，所以用所述分子来测试使用此标记的凝血酶-适体进行夹心检验是否是一种可能的策略。为此，将未标记的生物素化凝血酶-适体经由中性亲和素固定到ELISA板上并且用于捕获AAB，而应当用FITC标记的抗凝血酶-适体最终检测吸附AAB的材料。
自孔中移出样品，将一式两份的样品合并(最终体积200μl)并且用300μl PBS稀释，并且使用荧光分光光度计RF-5001PC(日本岛津(Shimadzu,Japan))，分别使用494nm和519nm的激发波长和发射波长测量相对荧光。
如图10所见，与对照IgG样品相比，检测患者样品(含有ETA-AAB的IgG部分)是可能的。使用混杂的凝血酶-适体作为另一对照也未显示任何荧光。
dT帽对于凝血酶-适体功能的影响
在接下来的实验中，测试引入保护基(如防止核酸外切酶活性的dT帽)是否可能对凝血酶-适体中和针对G蛋白偶联受体的自体抗体的活性无影响。引入dT帽可能不影响凝血酶-适体中和针对G蛋白偶联受体的AAB的功能(图11)。
截短凝血酶-适体产生12-mer序列
在接下来的一组实验中，测试截短凝血酶-适体是否产生仍能中和针对G蛋白偶联受体的自体抗体的产物。
因此，将凝血酶-适体的原始15-mer序列(ARC183)截短成12-mer序列SEQ D No.3，称为Throm-K1。在生物检验中测试截短的序列中和AAB的能力(针对β1受体AAB进行证明，图12)。
12-mer序列显示全部活性。
序列表
<110> 柏林夏瑞蒂医科大学
马克斯·德尔布吕克分子医学中心
<120> 适体在自体免疫疾病的疗法和/或诊断中的用途
<130> P08553WO
<150> EP 11 157 229.3
<151> 2011-03-07
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 适体序列 1
<400> 1
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 适体序列 2
<400> 2
cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> SEQ ID No. 1的截短的12mer
<400> 3
ggttggtgtg gt 12

Claims (14)

1.一种适体在制备用于自体免疫疾病的疗法和/或诊断的药物组合物、试剂盒或血浆分离置换柱中的应用，所述适体包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3之一至少80％一致的核酸序列，所述适体特异性结合于针对G蛋白偶联受体的自体抗体，并且干扰特异性针对自体免疫疾病相关性G蛋白偶联受体的自体抗体与所述G蛋白偶联受体的相互作用，所述自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病(Chagas'cardiomyopathy)、查加斯巨结肠(Chagas'megacolon)、查加斯巨食道症(Chagas'megaesophagus)、查加斯神经病(Chagas'neuropathy)、硬皮病、雷诺综合症(Raynaud syndrome)、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、糖尿病、青光眼和/或肺动脉高血压。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述适体为≥12个核苷酸到≤160个核苷酸的核酸序列。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述适体被用于人类的疗法和/或诊断中。
4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述适体为DNA适体。
5.如权利要求1或2所述的应用，所述适体用于体外检测特异性针对G蛋白偶联受体的自体抗体，所述G蛋白偶联受体为人类G蛋白偶联受体肾上腺素能α-1受体、肾上腺素能β-1受体、肾上腺素能β-2受体、内皮素1ETA受体、蕈毒碱M2受体、血管紧张素II AT1受体和/或PAR受体。
6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述适体由与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.3之一至少80％一致的核酸序列构成。
7.如权利要求1或2所述的应用，其中所述抗体存在于体液中或来源于体液，优选人类体液，更优选人类血液、血浆、血清、尿液、粪便、滑液、间质液、淋巴液、唾液、脊髓液和/或泪液。
8.一种血浆分离置换柱，其包含适体，所述适体包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3的核酸序列和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列。
9.如权利要求8所述的血浆分离置换柱，所述血浆分离置换柱用于自体免疫疾病的疗法和/或诊断中，其中所述自体免疫疾病与特异性针对G蛋白偶联受体的自体抗体的存在相关。
10.如权利要求8或9所述的血浆分离置换柱，其中所述适体为≥12个核苷酸到≤160个核苷酸的核酸序列。
11.如权利要求8或9所述的血浆分离置换柱，其中所述适体为DNA适体。
12.如权利要求8或9所述的血浆分离置换柱，其中所述适体由SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3的核酸序列和/或与SEQ ID No.1、2和3之一至少80％一致的核酸序列构成。
13.如权利要求8或9所述的血浆分离置换柱，其中所述适体由SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和/或SEQ ID No.3的核酸序列构成。
14.如权利要求8或9所述的血浆分离置换柱，其中所述自体免疫疾病为心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、查加斯心肌病(Chagas'cardiomyopathy)、查加斯巨结肠(Chagas'megacolon)、查加斯巨食道症(Chagas'megaesophagus)、查加斯神经病(Chagas'neuropathy)、良性前列腺肥大、硬皮病、雷诺综合症(Raynaud syndrome)、先兆子痫、同种异体肾移植排斥、心肌炎、糖尿病、青光眼和/或肺动脉高血压。
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