BR112013016164A2 - direcionamento de câncer com o uso de inibidores da isoforma ix da anidrase carbônica - Google Patents

Abstract

DIRECIONAMENTO DE CÂNCER COM O USO DE INIBIDORES DA ISOFORMA IX DA ANIDRASE CARBÔNICA Trata-se de novos inibidores de anidrase carbônica IX que compreendem uma porção nitroimidazol e seu uso na terapia de condições hipóxicas, em particular, tratamento de câncer, especialmente quimioterapia e radioterapia. Os compostos da invenção têm uma especificidade aumentada para enzima de anidrase carbônica IX em comparação com a técnica. A presente invenção se refere a novos derivados de nitroimidazol representados pela fórmula (1).

Description

1U17 “DIRECIONAMENTO DE CÂNCER COM O USO DE INIBIDORES DA ISOFORMA - IX DA ANIDRASE CARBÔNICA” Campo da invenção " A presente invenção se refere a novos inibidores de anidrase carbônica IX que compreende uma porção nitroimidazol que inclui seu uso nenhum tratamento de câncer, especialmente, radioterapia.

Fundamentos O câncer é uma causa principal de morte e responde por aproximadamente 13% de todas as mortes no mundo. A maioria dos cânceres forma tumores sólidos em tecidos como cabeçae pescoço, cólon, mama, pulmão, fígado e estômago, e são muitas vezes caracteri- zados por baixas concentrações de oxigênio (hipoxia) e acidificação do microambiente que circunda as células de tumor. Tanto a hipoxia como a acidificação do ambiente extratumoral estão associadas com o crescimento de tumor agressivo, formação de metástase e resposta insatisfatória à radioterapia, cirurgia e/ou quimioterapia anticâncer. A via mais importante que age sobre as mudanças em concentração de oxigênio consiste na “via Fator 1 induzível por hipoxia' (via HIF-1). Sob condições hipóxicas, o fator de transcrição HIF-1a é estabiliza- - do e se liga ao HIF-18B. O complexo formado pode se translocar para o núcleo e se ligar aos elementos responsivos a hipóxico (HRE's) de genes envolvidos no metabolismo anaeróbico, - regulação de pH, angiogênese, proliferação e sobrevivência celular.

As anidrases carbônicas (CAs) formam uma grande família de metaloenzimas de zinco ubíquas de grande importância fisiológica. Como catalisadores de hidratação reversí- vel de dióxido de carbono a bicarbonato e prótons (CO; + HO 11 H* + HCO;)), estas enzi- mas participam de uma variedade de processos biológicos, que incluem respiração, calcifi- cação, equilíbrio de ácido-base, reabsorção óssea, formação de humor aquoso. Até este momento, 16 isozimas são caracterizadas, das quais 15 estão presentes em humanos. CAs em humanos estão presentes em vários tecidos (por exemplo, trato Gl, trato reprodutivo, pele, rins, pulmões, olhos, ...) e são localizados em diferentes partes da célula. Basicamen- te, existem várias formas citosólicas (CA |-I!l, CA VII), quatro isozimas ligadas por membra- na (CA IV, CA IX, CA XIl e CA XIV), uma forma mitocondrial (CA V), assim como uma isozi- —maCA:secretada, CA VI.

Tem sido mostrado que algumas células de tumor expressam predominantemente somente algumas isozimas CA associadas á membrana, tais como CA IX e CA XII. Os CAs mostram diversidade considerável em sua distribuição de tecido, níveis e funções biológicas estabelecidas ou putativas. Alguns dos CAs são expressos em quase todos os tecidos (CA |l), enquanto que a expressão de outros parece ser mais restrita (por exemplo, CA Vl e CA VII em glândulas salivares).

CAIA As sd A A AA AA A A AN NA A NA A a em tumores, uma vez que os tumores muitas vezes exibem um gradiente de pH invertido atra- ' vés da membrana de plasma quando comparado com os tecidos normais, que indica que a con- tribuição de CAs no fornecimento de prótons para a acidificação do ambiente extracelular e íons , de bicarbonato para manter um ambiente intracelular neutro. Em adição ao efeito de acidificação sobreopH extracelular, isto pode influenciar a absorção de fármacos anticâncer e modular a resposta de células de tumor à terapia convencional, tal como terapia de radiação. Uma das isozimas CA, CA IX, mostra expressão restrita em tecidos normais, mas é fortemente associada com diferentes tipos de tumores. CA IX, originalmente detectado em células HeLa de carcinoma humano como um antígeno regulado por densidade (Pastorekova et a/, 1992), é fortemente in- —duzido por hipoxia de tumor, através de uma ativação transcricional pela via HIF-1. A associação forte entre a expressão de anidrase carbônica CA IX e hipoxia intratumoral tem sido demonstra- da em carcinomas. A distribuição de CA IX é muitas vezes examinada em relação à extensão de necrose como um indicador de hipoxia severa e à densidade microvascular como uma medi- ção de angiogênese. Adicionalmente, CA IX associado com a pior sobrevivência livre de reinci- dênciae sobrevivência completa em pacientes com tumores invasivos. CA IX também é um indicador de prognóstico significante da sobrevivência completa e sobrevivência livre de metás- - tase após a radioterapia e quimioradioterapia.

A hipoxia é ligada com a acidificação de ambiente extracelular que facilita a invasão de . tumor e acredita-se que o CA IX desempenhe um papel neste processo através de sua ativida- de catalíica(Svastova et al, 2004). O CA IX tem uma atividade catalítica muito alta com a taxa de transferência de próton maior entre os CAs conhecidos, tem sido mostrado acidificar o ambi- ente extracelular e é, portanto, um alvo interessante para a terapia anticâncer, de preferência, em combinação com as programações de tratamento convencionais. O direcionamento de CA IX seria preferido ante o direcionamento de HIF-1, o principal regular da resposta transcricional de células de mamífero à privação de oxigênio, uma vez que os resultados controversos têm sido relatados dependendo do tipo de célula usada, a subunidade alvo, o local do tumor e o tempo da inibição de HIF-1 (precoce ou posteriormente no crescimento de tumor). Adicional- mente, devido ao fato de que a maioria dos inibidores de moléculas pequenas de HIF-1 afeta múltiplas vias de sinalização e/ou alvos indiretamente associados com HIF, a avaliação de sua atividade como inibidores de HIF não pode ser com base na eficácia terapêutica, o qual pode não estar relacionado com a inibição de HIF (Melillo, 2006).

Recentemente, tem sido revelado que os inibidores de anidrase carbônica (CAls) poderiam ter potencial, além do papel estabelecido como diuréticos e fármacos antiglauco- ma, como novo fármacos antiobesidade, anticâncer e anti-infeccioso. Existem 2 classes principais de inibidores de anidrase carbônica: os ânions de complexação de metal e as sul- fonamidas não substituídas e seus derivados, os quais se ligam ao íon de zinco da enzima nação de metal (Supuran, 2008). No entanto, o problema crítico no projeto destes inibidores : consiste no alto número de isozimas, na localização difusa em tecidos e na falta de seletivi- dade de isozima dos inibidores presentemente disponíveis. ' Todos os seis CAls clássicos (acetazolamida, metazolamida, etoxzolamida, dicloro- fenamida, dorzolamida e diclorofenamida) usados em medicina clínica ou como ferramentas de diagnóstico, mostram algumas propriedades inibitórias de crescimento de tumor.

A maioria das sulfonamidas clinicamente usadas mencionadas acima consiste em ini- bidores que agem de forma sistemática que mostram vários efeitos colaterais indesejados devi- do à inibição de muitas das diferentes isozimas CA presentes no tecido/órgão alvo (15 isoformas são atualmente conhecidas em humanos). Portanto, muitas tentativas para projetar e sintetizar novas sulfonamidas foram recentemente relatadas, com a finalidade de evitar tais efeitos colate- rais. As isozimas associadas às membranas de célula (CA IV, CA IX, CA Xll e CA XIV), com o local ativo de enzima geralmente orientado de forma extracelular, fornecem uma base racional para direcionamento. Tanto CA IX como CA XII são localizados de forma extracelular em células detumorhipóxicas e são, portanto, os melhores candidatos.

As características ideais para os inibidores de CA IX específicos deveriam demonstrar - uma constante de inibição relativamente baixa (Ki na faixa nanomolar) e deveriam ser relativamen- te específicas sobre as enzimas citosólicas CA | e CA Il. Uma série de sulfonamidas aromáticas “ tem sido apresentada (vide, por exemplo, o documento sob o nº. WO2004048544) que se liga especificamente aos componentes extracelulares da enzima CAIX em particular, o qual mostra uma especificidade maior do que aquela até agora conhecida na técnica. Os agentes de sulfona- mida de diagnóstico e terapêutico são descritos no documento sob o nº. WO2006137092. Em WOZ200807 1421, foi mostrado que o efeito inibitório de sulfonamidas heterocíclicas pode ser adici- onalmente aumentado por substituintes oxidativos, em particular, substituintes nitrosados ou nitro- —silados, uma vez que tais grupos podem aumentar a acidez dos grupos de ligação de zinco e co- mo tal sendo benéfico para as propriedades inibitórias de anidrase carbônica. Os complexos de quelato de metal à base de sulfonamida para obtenção de imagem são descritos no documento sob o nº. WO2009089383. No entanto, uma grande variação é relatada em constantes inibitórias de CA IX para as sulfonamidas, assim como a variação na seletividade dos inibidores. Os inibido- resdesulfamato e sulfamida também têm sido propostos como candidatos (Winum et a/, 2009).

A terapia anticâncer tradicional como cirurgia, irradiação e quimioterapia são usa- das para tratar pacientes de câncer como um tratamento único ou combinado. O princípio básico da irradiação consiste em danificar as células de câncer a tal ponto em que irão mor- rer. Os radicais livres são formados e danificam o DNA imediatamente ou reagem com oxi- gênio, criando espécies reativas a oxigênio que danificam a célula e, mas especificamente, o DNA na célula. No entanto, quando nenhum ou pouco oxigênio está presente, o qual é o

E O não é tão.

Tem sido mostrado que uma dosagem de radiação 3 vezes maior é exigida para ' matar a mesma quantidade de células hipóxicas conforme comparado em concentrações de oxigênio normais.

O conceito de radiossensibilização de células hipóxicas emergidas quan- Í do determinados compostos foram capazes de imitar oxigênio e, deste modo, otimizar o da- node radiação.

Os primeiros compostos que demonstraram radiossensibilização foram ni- trobenzenos, seguido por nitrofuranos e 2-nitroimidazóis, tais como misonidazol (vide, por exemplo, o documento sob o nº.

WO2006102759). Embora em modelos de tumor experi- mentais o dano de radiação otimizado fosse observado, a maioria dos testes clínicos que utilizam misonidazol foi incapaz de demonstrar um aperfeiçoamento significante em resposta àradiação, embora o benefício fosse observado em determinados subgrupos de pacientes (Overgaard, 1989). A explicação mais provável consiste no fato de que as dosagens de mi- sonidazol foram baixas demais, limitadas pelo risco de neurotoxicidade.

Alternativamente, os melhores fármacos de radiossensibilização, tais como etanidazol e pimonidazol, foram sinte- tizados e testados, mas os resultados clínicos não resultariam em um benefício terapêutico significante.

Os fármacos menos tóxicos, tais como, nimorazol, poderiam alcançar teorica- mente a capacidade de sensibilização menor em comparação com misonidazol, mas devido - ao fato da toxicidade bem menor, doses clinicamente relevantes muito maiores podem ser obtidas.

Somente os estudos clínicos em pacientes com carcinomas supraglóticos e farin- - geos (DAHANCA 5) resultaram em benefício altamente significante em termos de controle detumorloco-regional aperfeiçoado e sobrevivência livre de doença (Overgaard et a/, 1998). Mais especificamente, o direcionamento em direção à célula de tumor hipóxico com o uso de doses menores é, portanto, um requisito importante para os novos compostos.

Agora, descobriu-se surpreendentemente que os compostos da invenção, conforme representado pela fórmula (1): R2 No Rm NO, em que Z é Z1 representado pela fórmula (2a): o R3 v C E R7 Rs Re ou Z é Z2 representado pela fórmula (2b): (CH2),.CH2X ou Z é Z3 representado pela fórmula (2c):

Y R3 | AO) À, sa H HO" Re R1 e R2 podem ser, cada um independentemente, H, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, ciano ou átomo de halogênio, R3, R4, R6 e R7 podem ser, cada um independentemente H, alquila, alquenila, al- quinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, átomo de halogênio, ciano, alcóxi, sulfonamida, sul- famatoousulfamida, R5 pode ser sulfonamida, sulfamato ou sulfamida, X= sulfonamida, sulfamato ou sulfamida, Y=OouS, e n=0,1,2,3,4ou5, demonstram não somente uma especificidade maior para CA IX doque qualquer composto conhecido a técnica, mas também têm um efeito de radios- sensibilização muito aumentado. Isto é o mais inesperado, à medida que a orientação este- Ú reoquímica dos diversos grupos ativos nos compostos da invenção é completamente dife- rente daquela dos compostos conhecidos na técnica, sendo sulfonamidas ou nitroimidazóis. ' Em outras palavras, é surpreendente que a atividade de radiossensibilização dos nitroimida- zóistem sido retida, embora o grupo agora seja parte de uma entidade maior e os compos- tos sejam menos neurotóxicos.

Portanto, os compostos da invenção têm um perfil geral significantemente aperfei- çoado para o tratamento de tumores sólidos, tais como os tumores da mama, cérebro, rim, colorretal, pulmão, cabeça e pescoço, bexiga etc., em comparação com os inibidores de —anidrase carbônica conhecidos na técnica. Também outros campos terapêuticos, tais como tratamento de distúrbios oculares, em particular, glaucoma, hipertensão ocular, degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, retinopatia diabética, retinopatia hi- pertensiva e vasculopatias retinianas, epilepsia, distúrbios de alta altitude e doenças neuro- musculares se incluem na faixa de aplicações dos compostos da invenção.

Outra descoberta consiste no fato de que os compostos da invenção também mos- tram um efeito positivo inesperado sobre a radiossensibilidade. Acredita-se que a acidose extracelular consista no resultado da produção em excesso de ácido láctico. No entanto, as células deficientes glicolíticas (células em que a produção de ácido láctico é dificultada) re- sultam em tumores com uma extensão similar de acidose extracelular, indicando outros par- ticipantes envolvidos além do ácido láctico. Vários estudos têm mostrado que a acidose ex- tracelular torna tumores menos sensíveis ao tratamento de irradiação (Brizel et al, 2001;

zir a acidose extracelular em tumores e são, portanto, uma possível ferramenta para aper- - feiçoar a sensibilidade à irradiação de tumores. Além disso, o fato de que a expressão de CA IX é limitada em tecido saudável! normal, enquanto que altamente superexpressa em ' tumores, torna a isozima IX de anidrase carbônica um alvo atraente dentro do conceito.

Por outro lado, as condições hipóxicas em tumores tornam os mesmos menos sen- síveis à radiação por ionização comumente usada em radioterapia (Thomlinson & Gray, 1955). A atração dos compostos inibitórios de CA em direção às células hipóxicas, iria au- mentar em muito o possível efeito terapêutico. Isto pode ser feito com o uso de nitroimida- zóis que são capturados em células hipóxicas após uma redução de elétron de duas vezes sob condições de baixo oxigênio.

Em outras palavras, por um lado, há uma necessidade em aumentar os efeitos anti- tumorigênicos e antiácidos e a especificidade de sulf(on)>amidas que inibem CA IX e, por outro lado, há uma necessidade de direcionar especificamente células hipóxicas com o uso de nitroimidazóis substituídos para fazer compostos mais adequados para a terapia de radi- — ossenbilização.

Estas necessidades são atendidas pela presente invenção, a qual fornece compos- . tos fármacos de direcionamento de CAIX duplo multifuncionais e preparações para o trata- mento de câncer em um paciente que necessite desse tratamento, que compreende os r compostos da fórmula 1a-c acima.

Os objetivos adicionais da presente invenção também consistem em composições farmacêuticas que contêm ao menos um composto da presente invenção da fórmula (1a-c) em conjunto com adjuvantes não tóxicos e/ou veículos usualmente empregados no campo farmacêutico.

A invenção será agora descrita em maiores detalhes abaixo, com referência às figu- ras,emque A Figura 1 mostra a síntese de compostos 4a-d; A Figura 2 mostra a síntese de compostos 6a-d; A Figura 3 mostra um composto preferido (7) da invenção; A Figura 4 mostra outro composto preferido (9) da invenção; A Figura 5a-b; mostra o efeito de compostos (6a, 6c, 7 e 9) da invenção sobre a acidose em um modelo de cultura de célula de tumor in vitro.

A Figura 6a-k mostra o efeito de compostos da invenção em combinação com agentes quimioterapêuticos ou radiação em um modelo de tumor in vivo.

A Figura 1 mostra o Esquema 1.

Reagentes e condições : (i) 1 equiv. de 2-nitroimidazol, 1 equiv. de terc-butil bro- moacetato, 4 equiv. de carbonato de potássio, MeCN, RT, 1 noite; (ii) coquetel de ácido tri-

dimetilaminopiridina (DMAP), 1 equiv. de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida cloridra- : to (EDC), N, N-dimetilacetamida (DMA), temperatura ambiente, 2 dias.

A Figura 2 mostra o esquema 2: ' Reagentes e condições: (i) 1 equiv. de 1-(2-aminoetil)-2-metil-S-nitroimidazol diclo- ridrato monoidrato, 1 equiv.

SCN-Ph-SO,NH,, 2 equiv. de trietilamina, MeCN, temperatura ambiente, 1 hora.

A Figura 3 mostra o esquema do composto preferido da invenção.

Reagentes e condições: (i) 1 equiv. de 1-(2-aminoetil)-2-metil-S-nitroimidazol diclo- ridrato monoidrato, 4 equiv. de trietilamina, 1 equiv. de clorosulfonilisocianato, 1 equiv. de terc-butanol, CH2CL, rt, 1 hora; (ii) ácido trifluoroacético CH2Cl, 7/3, rt, 6 horas.

A Figura 4 mostra o esquema do segundo composto preferido da invenção.

Reagentes e condições : (i) 1 equiv. de 2-metil-5-nitro-1-imidazoliletanol, N,N- dimetilacetamida, 3 equiv. sulfamoil cloreto, rt, 1 noite.

Os compostos da presente invenção podem ser sintetizados de acordo com os se- guintes procedimentos.

Todos os reagentes e solventes eram de qualidade comercial e usa- dos sem purificação adicional, exceto onde especificado em contrário.

Todas as reações . foram realizadas sob uma atmosfera inerte de nitrogênio.

As análises de TLC foram execu- tadas em placas de gel de sílica 60 F254 (Merck Art.1.05554). Os pontos foram visualizados . sob iluminação de UV 254 nm, ou por aspersão de solução de ninidrina.

Os pontos de fusão foram determinados em um ponto de fusão Búchi 510 e não são corrigidos.

Os espectros de 1H e *C NMR foram registrados no espectrômetro Bruker DRX-400 com o uso de DMSO-ds como solvente e tetrametilsilano como padrão interno.

Para os espectros de "H NMR, os deslocamentos químicos são expressos em 3 (ppm) campo mais baixo a partir de tetrametil- silano, e as constantes de acoplamento (J) são expressas em Hertz.

Os espectros de massa deionização de elétron foram registrados em modo positivo ou negativo em um Water Mi- croMass ZQ.

Isto é mencionado na Figura 1 e 2 em anexo. acetato de ferc-butil-(2-nitro-imidazol-1-i1) (2): A uma mistura de 2-nitroimidazo! 1 (17,7 mmol, 1 equiv.) e carbonato de potássio anidro (70,74 mmol, 4 equiv.) em 20 mL de acetonitrla é adicionada por gotejamento uma solução de terc-butilbromoacetato (17,7 mmol, 1 equiv.) em 10 ml de acetonitrila.

A mistura é agitada uma noite em temperatura am- biente e concentrada sob vácuo.

O resíduo é purificado por cromatografia em gel de sílica com o uso de uma mistura CH,Cl// MeOH 95/5 como eluente para gerar o composto espe- rado como pó branco em 71 % de rendimento. mp 95 a 97ºC; *H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 51,46(s, 9H), 4,99(s, 2H), 7,06(d, 1H, J=1,01 Hz), 7,17 (d, 1H, J=1,01 Hz). MS (ESI/ESTI) m/z 226,15 [M-H], 262,13 [M+CI], 250,20 [M+H]"

de um coquetel de TFA, água, tioanisol 95-2,5-2,5 e agitado em temperatura ambiente por ' uma noite.

A mistura é, então, concentrada sob vácuo e coevaporada várias vezes com éter de dietila até a formação de um pó.

Após a filtração, o precipitado é lavado com diclorome- , tano e acetonitrila para gerar de forma quantitativa o produto esperado.

Mp 143ºC (decom- —posição);'HNMR(DMSO-ds, 400 MHz) 5 5,21 (s, 2H), 7,21 (d, 1H, J=1,01 Hz), 7,64 (d, 1H, J=1,01Hz). PC (DMSO-ds, 101 MHz) 5 50,65, 127,69, 128,44, 168,56, 168,57; MS (ESI'/ESI ) m/2 170,12 [M-H], 341,05 [2M-H]', 194,14 [M+Na]”. Procedimento geral para a preparação de compostos (4a-d) A uma solução de composto 3 (1,17 mmol, 1 equiv) em 8 mL de NN- dimetilacetamida foi adicionado aminoalquilbenzeno sulfonamida (1,417 mmol, 1 equiv.), 4- dimetilaminopiridina (1,17 mmol, 1 equiv.) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (1,17 mmol, 1 equiv.). A mistura foi agitada dois dias em temperatura ambiente, então, diluída com acetato de etila e lavada três vezes com água.

A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo.

O resíduo foi, então, purificado por cro- matografia em gel de sílica com o uso de cloreto de metileno — metanol 98-2 v-v como elu- ente. . 2-(2-nitro-imidazol-1-il)-N-(4-sulfamoilfenil)acetamida (4a, DH296): Rendimento: 68%; mp 163 a 165ºC; 'H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 5 5,36 (s, 2H), 7,24 (d, 1H, J=1,01Hz), . 7,28 (s, 2H), 7,67 (d, 1H, J=1,01Hz), 7,70 (d, 2H, J=8,9Hz), 7,77 (d, 2H, J=8,9Hz), 10,7 (s, 1H); "*C (DMSO-d., 101 MHz) 5 52,20, 118,70, 126,81, 127,57, 128,84, 138,76, 141,18, 144,79, 165,02; MS (ESI/ESI) m/z 324,09 [M-H], 359,92 [M+CI], 649,15 [2M-HT, 685,01 [2M+CI], 348,14 [M+Na]". 2-(2-nitro-imidazol-1-il)-N-(3-sulfamoilfenil)acetamida (4b, DH304): Rendimento: 79%; mp 195 a 197ºC; *H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 5 5,35 (s, 2H), 7,24 (d, 1H, J=1,01H2z), 7,38(s,2H) 7,52 (m, 2H), 7,65 (m, 1H), 7,67 (d, 1H, J=1,01Hz), 8,14 (s, 1H), 10,81 (s, 1H); "CC (DMSO-ds, 101 MHz) 5 52,16, 116,10, 120,72, 121,92, 127,59, 128,86, 129,67, 138,67, 144,72, 164,87, 167,75; MS (ESI/ESI) m/z 324,24 [M-H], 360,18 [M+CI], 685,13 [2M+CI], 326,24/M+H]*, 348,07 [M+Na]”, 364,17 [M+K]' 673,18 [2M+Na]". 2-(2-nitro-imidazol-1-il)- N-(4-sulfamoilbenzil)acetamida (4c, DH305): Rendimento: 83%; mp181a183ºC; 'H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 5 4,37 (d, 2H, J=5,7Hz), 5,22 (s, 2H), 7,18 (d, 1H, J=1,01Hz), 7,35 (s, 2H), 7,43 (d, 2H, J=8,4Hz), 7,67 (d, 1H, J=1,01H2z), 7,76 (d, 2H, J=8,4Hz), 9,15 (t, 1H, J=6,06Hz); **C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 41,81, 51,55, 106,87, 125,58, 127,39, 138,91, 142,66, 142,99, 156,82, 165,88; MS (ESI/ESI) m/z 338,15 [M-H], 374,22 [M+CI], 713,16 [2M+CI], 340,15 [M+H]", 362,17 [M+Na]". 2-(2-nitro-imidazol-1-il)- N-[2-(4-sulfamoilfenil)etiJacetamida (4d, DH302): Rendimen- to: 89%; mp 139 a 141ºC; 'H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 5 2,80 (t, 2H, J=6,9Hz), 3,16 (m IN EATON SAO A A A ADA A A NA A AA AA a ada

J=1,01Hz), 7,74 (d, 2H, J=8,2H2z), 8,46 (t, 1H, J=5,6H2z); *C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 34,59, 51,49, 125,64, 127,38, 128,74, 129,09, 142,05, 143,39, 144,87, 165,57; MS (ESI/ESI) m/z 352,19 [M-H], 388,07 [M+CI], 354,12 [M+H]', 376,09 [M+Na]*, 729,21 [2M+Na]”. ' Procedimento geral para a preparação de compostos (6a-d): A uma solução do composto 5 comercialmente disponível (0,76 mmol, 1 equiv.) em 10 mL de acetonitrila, foi adicionado o isotiocianato correspondente (0,76 mmol, 1 equiv.). A reação foi agitada por uma hora em temperatura ambiente e, então, filtrada. O filtrado foi concentrado sob vácuo, e o resíduo obtido purificado por cromatografia em gel de sílica com o uso de cloreto de meti- leno — metanol 95 — 5 como eluente. N-(4-sulfamoilfenil)-N-((2-aminoetil)-2-metil-5-nitroimidazolil) tioureia (6a, DH307): Rendimento: 72%; mp 186 a 188ºC; *H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) ô 2,42 (s, 3H), 3,91 (m, 2H), 4,5 (t, 2H, J=5,68Hz), 7,3 (s, 2H), 7,46 (d, 2H, J=8,7Hz), 7,71 (d, 2H, J=8,7Hz), 8,05 (s, 2H), 10,0 (s, 1H); *C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 13,81, 42,87, 44,86, 122,46, 126,30, 133,19, 138,66, 139,14, 141,88, 151,35, 180,88; MS (ESI//ESI) m/z 385,17 [M+H]", 407,07 [M+Na]', 769,22 [2M+H]*, 383,21 [M-H]J, 419,18 [M+CI], 767,16. [2M-H]. N-(3-sulifamoilfenil)- N-((2-aminoetil)-2-metil-S-nitroimidazolil) tioureia (6b, DH309): Rendimento: 75%; mp 66 a 68ºC; '*H NMR (DMSO-dçs, 400 MHz) 5 2,43 (s, 3H), 3,91 (m, 2H), 4,49 (t, 2H, J=5,68Hz), 7,39 (s, 2H), 7,51 (m, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,57 (m, 1H), 7,81 (s, - 1H, 1H), 7,93 (m, 1H), 8,04 (s, 1H), 9,94 (s, 1H); *C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 13,81, 42,82, 44,99,120,29, 121,39, 126,62, 129,09, 133,18, 138,65, 139,51, 144,35, 151,37, 181,28, MS (ESI'/ESI) m/z 385,23 [M+H]', 406,94 [M+Na]*, 791,19 [2M+Na]*, 383,12 [M-H], 419,09 [M+ CIJ, 767,26 [2M-HJ. N-(4-sulfamoilbenzil)-N-((2-aminoetil)-2-metil-S-nitroimidazolil) tioureia (6c, DH310): Rendimento: 82%; mp 67 a 69ºC; 'H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 5 2,37 (s, 3H), 2,87 (m, 2H) 4,43(t,2H,J=5,18Hz), 4,70 (br s, 2H), 7,32 (s, 2H), 7,34 (d, 2H, J=8,4H2z), 7,68 (s, 1H), 7,75 (d, 2H, J=8,4Hz), 8,03 (s, 1H), 8,15 (s, 1H); *C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 13,84, 30,64, 42,70, 45,44, 125,52, 127,23, 133,17, 138,61, 142,48, 151,41, 181,44; MS (ESI/ESI) m/z 399,23 [M+H]", 421,16 [M+Na]*, 797,08 [2M+H]", 819,26 [2M+Na]”, 397,10 [M-H], 433,09 [M+CI], 795,33 [2M-H]. N-(4-sulfamoilfeniletil)- N-((2-aminoetil)-2-metil-S-nitroimidazol/il) tioureia (6d; DH308): Rendimento: 86%; mp 75 a 77ºC; '*H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) 5 2,35 (s, 3H), 2,83 (m, 2H), 3,62 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 4,41 (m, 2H), 7,31 (s, 2H), 7,37 (d, 2H, J=8,2H2z), 7,52 (s, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,74 (d, 2H, J=8,2Hz), 8,03 (s, 1H),; *C (DMSO-ds, 101 MHz) ô 13,78, 30,64, 45,4, 125,65, 129,05, 133,18, 138,54, 142,03, 143,45, 151,42, 180,83; MS (ESIVESI) m/z 413,06 [M+H]", 435,02 [M+Na]', 825,09 [2M+H]*, 847,21 [2M+Na]”, 411,06 [M-H], 447,20 [M+CI], 822,99 [2M-H], 859,26 [2M+CI].

AAA AAA AIN AI

N-[2-(2-metil-S-nitro-imidazol-1-il)Jetillsulfamida (7; DH348): A uma solução de 5 (3,83 mmol, 1 equiv.) e trietilamina (30,63 mmol, 4 equiv.) em 10 mL de cloreto de metileno foi adicionada uma solução de clorosulfonil isocianato (4,59 mmol, 1,2 equiv), ferc-butano! (4,59 mmol, 1,2 equiv.) em 2 mL de cloreto de metileno (preparado ab-initio). A mistura foi agitadaem temperatura ambiente por uma hora, então, diluída com acetato de etila e lavada com água.

A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo.

O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica com o uso de cloreto de metileno — metanol 98-2 como eluente.

Este intermediário foi, então, diluído em uma so- lução de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno (30 % em volume), e agitado em tem- peratura ambiente por 6 horas.

A mistura foi, então, concentrada sob vácuo e coevaporada várias vezes com éter de dietila para gerar a sulfamida esperada como um pó branco.

Ren- dimento geral: 70%; mp 122ºC; *H NMR (DMSO-ds, 400 MHz) ô 2,52 (s, 3H), 3,26 (m, 2H), 4,37 (t, 2H, J=5,81Hz), 6,65 (s, 2H), 6,86 (s, 1H), 8,1 (s, 1H); *C (DMSO-ds, 101 MHz) õ 14,03, 41,8, 46,0, 132,68, 138,26, 151,65; MS (ESI/ESI) m/z 250,19 [M+H]', 272,34 — [M+Na]', 499,32 [2M+H]*, 249,09 [M-H], 284,12 [M+CI], 533,14 [2M+CI]. N-[2-(2-metil-S-nitro-imidazol-1-il)etillsulfamato (9; DH338): A uma solução do com- - posto 8 comercialmente disponível (1,75 mmol, 1 equiv.) em N,N-dimetilacetamida, foi adici- onado cloreto de sulfamoil (5,25 mmol, 3 equiv.). A mistura foi agitada em temperatura am- - biente por uma noite, então, diluída com acetato de etila, e lavada três vezes com água.

À camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada sob vá- cuo.

O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica com o uso de cloreto de me- tileno — metanol 9-1 como eluente.

Rendimento: 81%; mp 166 a 168ºC; *H NMR (DMSO-d;, 400 MHz) 5 2,45 (s, 3H), 4,35 (t, 2H, J=5,05Hz), 4,61 (t, 2H, J=5,05H2z), 7,57 (s, 2H), 8,06 (s, 1H); *C (DMSO-ds, 101 MHz) 5 14,04, 44,98, 57,21, 133,10, 138,32, 151,82; MS (ESI/ESI) m/z250,3[M+H]', 272,32 [M+Na]”, 521,30 [2M+Na]*,770,16 [3M+Na]”. Experimentos in vitro.

Os compostos da invenção foram testados acerca de seus efeitos sobre a inibição de CA e o efeito resultante sobre a acidose extracelular com o uso de ensaios de biologia e química clássicos.

Atividade de inibição de CA.

Os compostos da invenção foram testado em sua atividade inibitória sobre anidrase carbônica no seguinte experimento: As constantes de inibição (K)) dos compostos para isozimas de CA, CA |, II, IX e XII foram determinadas.

Um instrumento de fluxo interrompido de fotofísica aplicada (Oxford, —UK)tem sido usado para avaliar a atividade de hidratação de CO, catalisada por CA (Khali- fah, 1971). Vermelho de fenol (em uma concentração de 0,2 mM) tem sido uado como indi- A At AA ns A A AAA A A A IE o A NA Adv mo tampão, 0,1 M de NazSO, (para manter constante a intensidade iônica), após a reação de hidratação de CO, catalisada por CA por um período de 10 a 100 s.

As concentrações de CO, se situaram na faixa a partir de 1,7 a 17 mM para a determinação dos parâmetros de É cinética e constantes de inibição.

Para cada inibidor, ao menos seis traços dos 5 a 10% ini- ciais da reação têm sido usados para a determinação da velocidade inicial.

As taxas não catalisadas foram determinadas da mesma maneira e subtraídas das taxas totais observa- das.

As soluções de estoque de inibidor (1 mM) foram preparadas em água destilada e dei- onizada com 10 a 20% (v/v) de DMSO (o qual não é inibitório nestas concentrações) e dilui- ções até 0,1 nM foram feitas posteriormente com água destilada e deionizada.

As soluções deinibidore enzima foram pré-encubadas em conjunto por 15 min. em temperatura ambien- te antes do ensaio, com a finalidade de permitir a formação de complexo inibidor de CA IX.

As constantes de inibição foram obtidas por meio de métodos dos mínimos quadrados não lineares com o uso de PRISM 3 e representam a média a partir de ao menos três determi- nações diferentes.

Os resultados são relacionados na tabela 1 abaixo.

Compostos K, (nM) - hCAl hCA 1 hCA IX hCA XII ' 7 (DH348) 9576 10,1 20,4 81 6a (DH307) 105 5,5 7,3 8,0 6d (DH308) 84 6,6 78 76 6b (DH309) 483 74 7,2 77 6c (DH310) 79 29 8,3 8,5 4a (DH296) 3203 330 7O 64 4d (DH302) 101 3,8 7,3 8,0 4b (DH304) 107 37 7,9 8,1 4c (DH305) 79 4,8 8,0 67 tabela 1 Acidose.

Os efeitos de compostos da invenção sobre a acidose em células de tumor foram medidos no seguinte experimento.

O objetivo dos experimentos in vitro consistiu em avaliar a eficácia de 4 compostos (7, 9, 6a e 6c) na redução da acidificação extracelular sob hipoxia.

O experimento foi estabelecido conforme descrito anteriormente (Dubois et al, 2007). Uma linha de célula de carcinoma colorretal (HT-29) (Figura 5a) e cervical (HeLa) (Figura 5b) foram testadas em condições normóxicas (concentração de oxigênio ambiente) e de CA IX (expressão de CA IX sob normoxia e expressão de CA IX aumentada sob hipoxia) induzível por hipoxia constitutiva.

Portanto, os compostos foram adicionados após 1 h de exposição hipóxica (para assegurar CA IX ativo) e a incubação foi feita por outras 23 h (total ' de 24 h de hipoxia). As células HeLa consistem em células de expressão de CA IX induzível —porhipoxia(em densidade menor). Portanto, HeLa foram primeiramente incubadas por 24 h de hipoxia para assegurar a expressão de CA IX no primeiro lugar (ponto no tempo avaliado em experimento em série temporal). Posteriormente, os compostos foram adicionados e as células foram incubadas por outras 24 h.

Os experimentos foram executados em três vias para cada condição.

As condições descritas foram feitas tanto para HT-29 como para HeLa sob condições normóxicas e hipó- xicas.

As seguintes condições foram avaliadas: - Branco 1 mM ou 0,1 mM (nenhuma adição de composto, somente DMSO/PBS) - DH307 1 mM ou 0,1 mM - DH310 1 mM ou 0,1 mM - DH338 1 mM ou 0,1 mM ' - DH348 1 mM ou 0,1 mM - S = AEBS (4-(2-aminoetilbenzenosulfonamida); Sigma) 1mM ou 0,1 mM (conheci- - do por reduzir pH extracelular conforme descrito por (Svastova et al, 2004)) As células foram semeadas em pratos de 6 cm (HT-29: 10e6; HeLa: 4x10º: para compensar o tamanho da célula) em 5 ml! de DMEM suplementado com 10% de FCS.

No dia seguinte, o meio foi substituído por 3,6 ml de DMEM/FCS a 10% recém preparado, a partir do qual o pH foi medido = pH em incubação), depois disto os pratos foram colocados na câmara hipóxica (os pratos normóxicos permaneceram em ar ambiente no incubador: 37ºC, 95% de umidade, 5% de CO,). Os compostos foram adicionados (1h para HT-29 ou 24h para Hela após a exposição hipóxica inicial) para ter uma concentração final de 1 mM ou 0,1 mM, mediante a adição de 400 ul aos pratos, começando a partir de um estoque a 10 ou 1 mM (concentração final de DMSO de 0,1%). Os controles em branco receberam DMSO/PBS sem composto.

O pH do meio foi medido após 24h (HT-29) ou 48h (HeLa) den- troda câmara hipóxica após a calibração do eletrodo até as concentrações de oxigênio re- duzidas.

O pH delta (pH em exposição hipóxica final — pH de meio de substituição antes da incubação) foi calculado e mostrado no gráfico da figura fig.

Sa e 5b.

Os resultados importantes são descritos abaixo: - Resultados de hipoxia em uma acidificação extracelular.

O meio é mais ácido em condiçõesem branco sob hipoxia em comparação com normoxia. - O composto de controle (S) reduziu de modo eficaz a acidificação extracelular sob hinravia Am ANnnaAAntranãía da 1 v7M manaãS Arm DA MV ara ambas às linhas da Áa4álda NMa nhum efeito foi observado sob a exposição normóxica - - Todos os compostos foram capazes de reduzir a acidificação extracelular.

Para as células HT-29, DH348 (composto 7) e DH338 (composto 9) geraram os melhores resultados " (1 mM). Em 0,1 mM, DH348 gerou uma redução adicional em comparação com os outros compostos.

Para HeLa, todos os compostos reduziram de modo eficaz a acidificação extra- celular.

DH310 até tornou o meio alcalino (1 MM) e também 0,1 mM causou uma forte redu- ção.

Uma vez que este efeito não foi observado em HT-29, a interpretação deveria ser feita de modo cuidadoso.

DH348 demonstrou os melhores resultados em HeLa, e confirma os dados obtidos para HT-29. Experimentos in vivo.

O objetivo destes experimentos consistiu em avaliar o efeito terapêutico in vivo de DH348 em combinação com as modalidades de tratamento convencionais, tais como radio- terapia e quimioterapia.

Supõe-se que o bloqueio de CA IX pode tanto diminuir a acidose extracelular, e, deste modo, aumentar o efeito de irradiação, assim como aumentar a absor- çãoda doxorubicina de base fraca e, portanto, seu efeito terapêutico.

Adicionalmente, uma sulfonamida clinicamente aprovada Acetazolamida (AZA) — um inibidor de anidrase carbôni- . ca geralmente conhecido (significando nenhuma preferência por um CA) — foi usada para comprovar a especificidade de CA IX dos compostos investigados. . Dois procedimentos experimentais foram usados.

Os primeiros experimentos foram realizados em xeno-enxertos de HT-29 parental.

Os segundos foram feitos em xeno- enxertos de HT-29 hospedando uma redução de expressão para CA IX.

Uma construção de ShRNA contra CA IX foi introduzida nas células HT-29 com o uso do vetor pPRETRO-super.

Após a seleção e triagem, as células com uma redução de expressão eficiente de 95% para CA IX foram selecionadas e designadas células KD.

Como um controle, uma construção de —shRNA misturada foi usada e aquelas células foram designadas células EV.

Estas células ainda demonstram expressão de proteína e CA IX MRNA.

Os xeno-enxertos de tumor foram produzidos por meio da injeção das células de carcinoma colorretal (1,5 1066) de modo subcutâneo no flanco lateral de camundongos NMRI-nu (28 a 32 g). O crescimento de tumor foi monitorado 3xX/semana por meio da medição das dimensões do tumor em 3 direções or- togonais.

As medições foram corrigidas acerca da espessura da pele (-0,5 mm) e os volu- mes de tumor foram calculados com o uso da fórmula A x B x C x pi/6, onde A, B e C repre- sentam os diâmetros ortogonais.

Em um volume de tumor médio de 250 mm?, DH348 foi injetado de modo intravenoso (5 x 5 mg/kg de modo intravenoso) com o uso da veia dorsal lateral.

No dia 3, os animais foram anestesiados com o uso de Pentobarbital sódico (Nembu- tal /0,1mMl/100g de peso corpóreo) e posicionados no campo de irradiação com o uso de um suporte construído sob medida e submetido à irradiação com uma única dose de 10 Gy (fei- va da aAlídtexsno da A4E mm VA saxo A (ia da uam aqnsalhenadar VáâsAr [(OiamAanAtv Qidtres AmnA da animais começou no dia 3 com tratamento de doxorubicina (5 mg/kg i.v. 1x/semana por 3 : semanas). O crescimento de tumor e toxicidade do tratamento potencial foram monitorados (3x/semana), por meio da avaliação diária do peso corporal.

Quando os tumores alcançaram " quatro vezes o volume inicial do tratamento, os animais foram sacrificados e os tumores extirpados para a avaliação histopatológica adicional.

Em suma, os grupos de tratamento são dispostos conforme exposto a seguir, com os resultados apresentados nas Figuras: 6a: Tumores parentais HT-29 (WT): efeito da irradiação de 10 Gy sozinha em com- paração com nenhum tratamento (controles) 6b: Tumores parentais HT-29 (WT): efeito do tratamento de combinação (DH348 + irradiação de 10 Gy) em comparação com DH348, irradiação ou nenhum tratamento 6c: Efeito de irradiação de 10 Gy sozinha em comparação com nenhum tratamento sobre tumores sh misturados HT-29 (EV) e shCA IX (KD) 6d: Efeito de tratamento de DH348 em comparação com nenhum tratamento sobre tumores EV e KD 6e: Efeito de tratamento de AZA em comparação com nenhum tratamento sobre tumores EV e KD . 6f: Efeito de tratamento de combinação com DH348 e irradiação de 10 Gy em com- paração com as modalidades de tratamento único sobre os tumores EV - 6g: Efeito de tratamento de combinação com DH348 e irradiação de 10 Gy em comparação com as modalidades de tratamento único sobre os tumores KD 6h: Efeito de tratamento de combinação com AZA e irradiação de 10 Gy em compa- ração com as modalidades de tratamento único sobre os tumores EV 6i: Efeito de tratamento de combinação com AZA e irradiação de 10 Gy em compa- ração com as modalidades de tratamento único sobre os tumores KD 6j: Tumores parentais HT-29 (WT): efeito de tratamento de doxorubicina em compa- ração com nenhum tratamento (controles) 6k: Tumores parentais HT-29 (WT): efeito de tratamento de combinação (DH348 + doxorubicina) em comparação com as modalidades de tratamento único As curvas de crescimento de tumor são mostradas nas Figuras 6a a 6d.

Os volu- mes de tumor são normalizados ao tratamento inicial = 100 mmº?. Nenhuma toxicidade de tratamento significante foi observada conforme monitorado pelas mudanças de peso corpo- ral totais durante o tratamento.

O tratamento com o composto desta invenção resulta em um retardo de crescimento em comparação com nenhum tratamento.

Quando combinado com os programas de tratamento clinicamente disponíveis e convencionais, o mesmo resulta em uma sensibilização para radioterapia e a uma extensão menor para a quimioterapia.

Isto é indicado pelo retardo de crescimento otimizado para o tratamento de combinação, em com- nararão AeeAem ramaoo da tratamantas individual Adinsisnalnanta ca tam AamaAnoctrada raácidta dos similares para os tumores contendo sShRNA difuso e parental.

Mais importante, tem-se ' mostrado um efeito específico dos compostos sobre CA IX, uma vez que (1) o composto não tinha efeito terapêutico sobre os tumores CA IX shRNA (KD) e (2) nenhum retardo de cres- " cimento otimizado foi observado quando combinado com a irradiação em comparação com airradiação sozinha.

A especificidade do composto para CA IX foi adicionalmente confirma- da por meio da avaliação do inibidor de CA geral AZA, o qual também demonstrou um efeito sobre os tumores KD.

Uma vez que vários outros isozimas CA, nesse momento, CA IX, es- tão presentes em tecidos saudáveis e AZA tem propriedades inibitórias contra aqueles, a toxicidade de tecido normal em tratamentos prolongados pode ser esperada, um fenômeno que será grandemente reduzido com o uso dos compostos específicos de CA IX desta in- venção.

Preparações farmacêuticas.

A dosagem diária de ingrediente ativo pode ser administrada a um hospedeiro em uma única dose ou pode consistir em uma quantidade eficaz dividida em várias doses me- —nores que são administradas ao longo do dia.

O regime farmacoterapêutico para o tratamen- to das doenças mencionadas anteriormente com um composto da invenção e/ou com as . composições farmacêuticas da presente invenção será selecionado de acordo com uma variedade de fatores, que incluem, por exemplo, idade, peso corporal, sexo e condição mé- . dica do paciente, assim como a severidade da doença, via de administração, considerações farmacológicas e terapia concomitante eventual com outros fármacos.

Em alguns casos, os níveis de dosagem abaixo ou acima da faixa mencionada anteriormente e/ou mais frequen- tes podem ser adequados e isto logicamente estará dentro do julgamento do médico e irá depender do estado da doença.

Os compostos da invenção podem ser administrados de forma oral, parenteral, retal ou tópica, por meio de aerossol ou aspersão de inalação, em formulações de dosagem unitária que contêm veículos, adjuvantes e portadores farmaceuti- camente aceitáveis não tóxicos e convencionais, conforme desejado.

As preparações tópi- cas podem ser administradas como soluções, suspensões ou emulsões (dispersões) em um veículo aceitável.

A administração tópica também pode envolver o uso de administração transdérmi- ca, talcomo emplastros transdérmicos ou dispositivos de iontoforese.

O termo "parenteral", para uso na presente invenção, inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramus- cular, intra-esternal ou técnicas de infusão.

As preparações injetáveis, por exemplo, suspen- sões oleaginosas ou aquosas injetáveis esteriles podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida, com o uso de agentes de dispersão ou umectantes e agentes de sus- —pensão.A preparação injetável estéril também pode consistir em uma suspensão ou solução injetável estéril em um solvente ou diluente parenteralmente aceitável não tóxico.

Entre os dio isotônico. : Os supositórios para a administração retal do fármaco podem ser preparados por meio da mistura do ingrediente ativo com um excipiente não irritante adequado, tal como ' manteiga de cacau e polietileno glicóis.

As formas de dosagem sólidas para a administração oral podem incluir cápsulas, comprimidos, pílulas, pós, grânulos e géis. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo pode ser misturado com ao menos um composto inerte, tal como sucrose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem também podem compreender, conforme na prática normal, substâncias adicionais, por exemplo, agentes lubrificantes, tais como estearato de magné- sio. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes de tamponamento. Os comprimidos e pílulas podem ser adicional- mente preparados com revestimento entéricos. As formas de dosagem líquidas para a ad- ministração oral podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farma- ceuticamente aceitáveis que contêm diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como água. Tais composições também podem compreender adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes e flavorizantes, e similares.

. Considera-se adicionalmente que os compostos da presente invenção podem ser usados com outros medicamentos conhecidos como úteis no tratamento de carcinomas.

- Os exemplos acima devem ser somente considerados como uma ilustração da in- vençãoe não limitam o escopo da invenção de forma alguma. Por conseguinte, as variantes e variações óbvias da invenção serão evidentes para um elemento versado na técnica.

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Anticancer Agents Med Chem 9: 693-702

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de ser da fórmula (1), Ra

NA

RE Z NO, em que Z é Z1 com a fórmula (2a): o R3 Ar R n|

H R7 Rs Re ou Z é Z2 com a fórmula (2b):(CH2),CH2X ou Z é Z3 com a fórmula (2c): Y R3

R Ads 4

H H R7 Rs Re e R1 e R2 podem ser, cada um independentemente, H, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, ciano ou átomo de halogênio; R3, R4, R6 e R7 podem ser, cada um independentemente H, alquila, alquenila, al- quinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, átomo de halogênio, ciano, alcóxi, sulfonamida, sul- famato ou sulfamida; R5 pode ser sulfonamida, sulfamato ou sulfamida; X = sulfonamida, sulfamato ou sulfamida; Y=OouS; n=0 1,2/3,/40U5e se n=0, R2=2-CH3, Z=Z1 , R3=R4=R6=R7=H e R5=SO2NH2, o NO2 não está na posição 4, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ter a fórmula (3a)

R2 RNA O R3 = NU N Ra N= 8

NO 2 R Rs Re fórmula (3b) R> Nes As Ho x XxX R; n NO, ou fórmula (3c) Ra À Y R3

NOW A R 4

A VONONTR R; H H NO, R Rs Rs e R1 e R2 podem ser, cada um independentemente, H, alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, ciano ou átomo de halogênio; R3, R4, R6 e R7 podem ser, cada um independentemente H, alquila, alquenila, al- quinila, cicloalquila, heterocíclico, arila, átomo de halogênio, ciano, alcóxi, sulfonamida, sul- famato ou sulfamida; R5 pode ser sulfonamida, sulfamato ou sulfamida; X= sulfonamida, sulfamato ou sulfamida; Y=OouS; n= 0, 1,2,3,40u5e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são, cada um independentemente, H ou CH3, de preferência, R1 = R2 = H.

4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 = R4 = R7, de preferência, R3 = R4 = R7 = H.

5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 ou R6 é sulfonamida, de preferência, R5 = sulfona- mida.

6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que n= O, 1 ou 2.

7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 = R2 = H, R3 = R4 = R6 = R7 = H, R5 = sulfonami- daeemqguen=O0,n=1oun=2.

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 = R2 = H, R3 = R4 = R5 = R7 = H, R6 = sulfonami- daen=O0.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 = H e R2 = CH3.

10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 9, CARACTERIZADO pelo fato de que n = 1.

11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 9 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que X é sulfamato ou sulfamida.

12. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 = R4 = R7, de preferência, R3 = R4 = R7 = H.

13. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 9 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 ou R6 é sulfonamida, de preferência, R5 = sulfona- mida.

14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 90u 12a13, CARACTERIZADO pelo fato de que Y = S.

15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 90u 12a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 = H, R2 = CH3, R3 = R4 = R6 = R7 = H, R5 = sulfo- namida, Y = S e em que n = 0, em que n = | ou em que n= 2.

16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 90u 12a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 = H, R2 = CH3, R3 = R4 = R5 = R7 = H, R6 = sulfo- namida, Y=Sen=O0.

17. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que ser na preparação de um medicamento para tratar uma doença que tem como característica a superexpressão de uma ou mais enzimas de anidra- se carbônica, de preferência, em que a doença tem como característica a superexpressão da proteína MN/CA IX, de preferência, em que a dita doença é cancerígena e consiste em um câncer de mama, cérebro, rim, colorreto, pulmão, cabeça e pescoço ou bexiga, de prefe- rência, em que a doença cancerígena consiste em câncer colorretal.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto consiste no composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7, 9 a1liloutl4al6.