BR112012021715B1 - Método para produzir fr901228, fr901465, templamida a, templamida b, templazol a, ou templazol b e método para modular a infestação de praga em uma planta - Google Patents

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Abstract

composto pesticida, composição, método para produzir um composto, método para isolar um composto de uma cepa de burkholderia, combinação, método para modular a infestação de praga em uma planta, método para modular emergência e/ou crescimento de ervas daninhas e uso de um composto. a presente invenção refere-se a uma espécie de burkholderia sp sem patogenicidade conhecida para vertebrados, mas com atividade pesticida (por exemplo, plantas, insetos, fungos, ervas daninhas e nematódeos) que é fornecida. ainda são fornecidos produtos naturais derivados de uma cultura da dita espécie e métodos de controlar pragas usando os ditos produtos naturais.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção refere-se a uma espécie de Burkholderia sp. sem patogenicidade conhecida para os vertebrados, como mamíferos, peixes e aves, mas atividade pesticida contra plantas, insetos, fungos e nematódeos. Também são fornecidos produtos naturais derivados de uma cultura dessas espécies e métodos de controle de germinação e crescimento de ervas daninhas dicotiledôneas, monocotiledôneas e junça, modulação do crescimento de fungos e controle de parasitas, tal como insetos e nematódeos, utilizando esses produtos naturais.
ANTECEDENTES
[0002] Os produtos naturais são substâncias produzidas por microrganismos, plantas e outros organismos. Produtos naturais microbianos oferecem uma abundante fonte de diversidade química, e não há uma longa história de utilização de produtos naturais para fins farmacêuticos. Um dito composto é FR901228 isolado a partir de Chromobacteriume foi considerado útil como um agente antibacteriano e um agente antitumoral (ver, por exemplo, Ueda et al., Patente US 7.396.665).
[0003] No entanto, metabolites secundários produzidos por micróbios também foram considerados com sucesso como tendo usos para controle de ervas daninhas e pestes em aplicações na agricultura (ver, por exemplo, Nakajima et al. 1991; Duke et al., 2000; Lydon & Duke, 1999; Gerwick et al., Patente US 7.393.812). Produtos naturais microbianos têm sido também desenvolvidos com sucesso em inseticidas agrícolas (ver, por exemplo, Salama et al. 1981; Thompson et al., 2000; Krieg et al. 1983). Às vezes, ditos produtos naturais têm sido combinados com pesticidas químicos (ver, por exemplo, Gottlieb, Patente US 4.808.207).
Burkholderia
[0004] O gênero Burkholderia, subdivisão β das proteobactérias, compreende mais de 40 espécies que habitam diversos nichos ecológicos (Compant et al., 2008). As espécies bacterianas no gênero Burkholderia são organismos ubíquos no solo e na rizosfera (Coenye e Vandamme, 2003; Parke e Gurian-Sherman, 2001). Tradicionalmente, elas têm sido conhecidas como agentes patogênicos de plantas, B. cepaciasendo o primeiro descoberto e identificado como patógeno causando doenças em cebolas (Burkholder, 1950). Várias espécies de Burkholderia desenvolveram interações benéficas com suas plantas hospedeiras (ver, por exemplo, Cabballero-Mellado et al., 2004, Chen et al., 2007). Algumas espécies de Burkholderia também demonstraram ser agentes patogênicos humanos oportunistas (ver, por exemplo, Cheng e Currie, 2005 e Nierman et al., 2004). Além disso, algumas espécies de Burkholderia demonstraram ter potencial como produtos de biocontrole (ver, por exemplo, Burkhead et al., 1994; Knudsen et al., 1987; Jansiewicz et al., 1988; Gouge et al., Pedido de Patente US 2003/0082147; Parke et al., Patente US 6.077.505; Casida et al., Patente US 6.689.357; Jeddeloh et al., W02001055398; Zhang et al., Patente US 7.141.407). Algumas espécies deste gênero foram eficazes na biorremediação para descontaminar solo poluído ou águas subterrâneas (ver, por exemplo, Leahy et al. 1996). Além disso, algumas espécies de Burkholderia demonstraram secretar uma variedade de enzimas extracelulares com as atividades proteolíticas, lipolíticas e hemolíticas, bem como toxinas, antibióticos e sideróforos (ver, por exemplo, Ludovic et al., 2007; Nagamatsu, 2001).
Oxazóis, Tiazóis e Indóis
[0005] Oxazois, tiazóis e indóis são amplamente distribuídas em plantas, algas, esponjas e microrganismos. Um grande número de produtos naturais contém um ou mais dos núcleos/frações de oxazol, tiazol e indol de cinco membros. Estes produtos naturais apresentam um amplo espectro de atividade biológica de valor terapêutico demonstrável. Por exemplo, bleomicina A (Tomohisa et al.), uma droga antineoplásica amplamente prescrita, efetua a degradação oxidativa do DNA e utiliza uma porção bitiazol para ligar as suas sequências alvo de DNA (Vanderwall et al., 1997). Bacitracina (Ming et al., 2002), um antibiótico peptídico tendo tiazolina, interdita a nova biossíntese da parede da célula bacteriana por complexação com bactoprenolpirofosfato C55. Thiangazol (Kunze et al., 1993) contém uma matriz em tandem de um oxazol e três tiazolinas e apresenta atividade antiviral (Jansen et al., 1992). Ainda outros produtos naturais tendo oxazol/tiazol, como tiostreptona (Anderson et al., 1970) e GE2270A (Selva et al., 1997) inibem etapas de tradução na síntese proteica bacteriana. Mais de 1000 alcaloides com o esqueleto indol foram relatados a partir de microrganismos. Um terço destes compostos são peptídeos com massas além de 500 Da, onde o indol é derivado de triptofano. A variedade estrutural dos dois terços restantes é maior e sua atividade biológica parece cobrir uma faixa mais ampla, incluindo antimicrobianos, antivirais, citotóxicos, inseticidas, antitrombóticos ou atividade inibitória de enzima.
BREVE SUMÁRIO
[0006] É fornecida aqui uma cepa isolada de um não-Burkholderia cepacia,não Burkholderia plantari, não Burkholderia gladioli, Burkholderia sp. que apresenta as características seguintes: a. tem uma sequência do gene 16S rRNA que compreende uma sequência direta tendo pelo menos 99,0% de identidade às sequências estabelecidas em SEQ ID N0:8, 11 e 12 e uma sequência reversa tendo pelo menos 99,0% de identidade à SEQ ID NO:9, 10, 13-15; b. tem atividade pesticida, em particular, herbicida, inseticida, fungicida e nematicida; c. produz pelo menos um dos compostos selecionados a partir do grupo consistindo em: (i) um composto tendo as seguintes propriedades: (a) um peso molecular de cerca de 525 a 555, como determinado por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa (LC/MS), (b) valores de 1H RMN de 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23. 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (c) tem valores 13C RMN de 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 e (c) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta pressão (HPLC) de cerca de 10 a 15 minutos, em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água: acetonitrila (CH3CN); (ii) um composto tendo uma estrutura oxazolil-indol compreendendo pelo menos uma fração indol, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um grupo alquila substituída e pelo menos um grupo éster carboxílico; pelo menos 17 carbonos e pelo menos 3 oxigénios e 2 nitrogénios; (iii) um composto tendo uma estrutura oxazolil-benzil compreendendo pelo menos uma fração benzila, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um grupo alquila substituída e pelo menos um grupo amida; pelo menos 15 carbonos e pelo menos 2 oxigénios e 2 nitrogénios; (iv) um composto tendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, pelo menos três grupos metilenos, pelo menos uma fração tetra-hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos vinte e cinco carbonos e pelo menos oito oxigénios e um nitrogênio e d. é não patogênica (não infecciosa) aos animais vertebrados, como mamíferos, pássaros e peixes; e. é suscetível a canamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, e uma combinação de sulfametoxazol e trimetoprima e f. contém os ácidos graxos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0 ωδc, 18:0.
[0007] Em uma modalidade particular, a cepa tem as características identificadores de uma cepa de Burkholderia A396 (NRRL No de Acessão. B-50319).
[0008] São revelados aqui compostos isolados que são opcionalmente obtidos ou derivados de espécies de Burkholderia, ou alternativamente, organismos capazes de produzir estes compostos que podem ser usados para controlar várias pragas, particularmente pragas fitopatogênicas de planta, exemplos dos quais incluem entre outros, insetos, nematódeos, bactérias e fungos. Estes compostos podem ainda ser usados como herbicidas.
[0009] Em particular, os compostos pesticidas isolados podem incluir, entre outros: (A) um composto tendo as seguintes propriedades: (i) um peso molecular de cerca de 525 a 555 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (ii) valores 1H RMN Õ6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31,3,93,3,22,3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62,2,26,2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (iii) tem valores 13C RMN ÕD172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 e (iv) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 10 a 15 minutos, em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN); (B) um composto tendo uma estrutura oxazolil-indol compreendendo pelo menos uma fração indol, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um gupo alquila substituída e pelo menos um grupo éster carboxílico; pelo menos 17 carbonos e pelo menos 3 oxigénios e 2 nitrogénios; (C) um composto tendo uma estrutura oxazolil-benzila compreendendo pelo menos uma fração benzila, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um gupo alquila substituída and pelo menos um grupo amida; pelo menos 15 carbonos e pelo menos 2 oxigénios e 2 nitrogénios; (D) um composto tendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, pelo menos três grupos metilenos, pelo menos uma fração tetra-hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos vinte e cinco carbonos e pelo menos oito oxigénios e um nitrogênio e (E) um composto tendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, um grupo epóxido metileno, pelo menos uma fração tetra- hidropiranose, pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos 25 carbonos, pelo menos 8 oxigénios e pelo menos 1 nitrogênio.
[00010] Em uma modalidade particular, os compostos isolados podem incluir, entre outros: (A) um composto tendo uma estrutura oxazolil-indol compreendendo pelo menos uma fração indol, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um grupo alquila substituído, pelo menos um grupo éster carboxílico, pelo menos 17 carbonos, pelo menos 3 oxigénios and pelo menos 2 nitrogénios; e que tem pelo menos um dos seguintes: (i) um peso molecular de cerca de 275-435; (ii) valores 1H RMN δ em 8,44, 8,74, 8,19, 7,47, 7,31, 3,98, 2,82, 2,33, 1,08; (iii) valores 13C RMN Dδ 163,7, 161,2, 154,8, 136,1, 129,4, 125,4, 123,5, 123,3, 121,8, 121,5, 111,8, 104,7, 52,2, 37,3, 28,1, 22,7, 22,7; (iv) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 10 a 20 minutos em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente e detecção UV de 210 nm; (v) bandas de absorção UV em cerca de 226, 275, 327 nm; (B) um composto tendo uma estrutura oxazolil-benzil compreendendo pelo menos uma fração benzila, pelo menos uma fração oxazol, pelo menos um gupo alquila substituída e pelo menos um grupo amida; pelo menos 15 carbonos e pelo menos 2 oxigénios, pelo menos 2 nitrogénios; e pelo menos uma das seguintes características: (i) um peso molecular de cerca de 240 a 290 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (ii) valores 1H RMN δ em cerca de 7,08, 7,06, 6,75, 3,75, 2,56, 2,15, 0,93, 0,93; (iii) valores 13C RMN δ de 158,2, 156,3, 155,5, 132,6, 129,5, 129,5, 127,3, 121,8, 115,2, 115,2, 41,2, 35,3, 26,7, 21,5, 21,5; (iv) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 6 a 15 minutos, em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) e (v) bandas de absorção de UV em cerca de 230, 285, 323 nm; (C) um composto não epóxido compreendendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, pelo menos três grupos metilenos, pelo menos uma fração tetra-hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos vinte e cinco carbonos, pelo menos oito oxigénios e um nitrogênio e pelo menos uma das seguintes características: (i) um peso molecular de cerca de 530 a 580 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (ii) valores 1H RMN δ de 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04; (iii) valores 13C RMN δ de 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41; (iv) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 7 a 12 minutos, em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente e detecção UV de 210 nm; (v) uma fórmula molecular de C28H45NO10 que foi determinado por interpretação de análise de dados ESI MS e RMN; (vi) bandas de absorção de UV entre cerca de 210 a 450 nm; (D) um composto compreendendo (i) pelo menos um éster, pelo menos uma amida, um grupo epóxido metileno, pelo menos uma fração tetra-hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos 25 carbonos, pelo menos 8 oxigénios e pelo menos 1 nitrogênio, (ii) valores 13C RMN δ de 174,03, 166,12, 143,63, 137,50, 134,39, 128,70, 126,68, 124,41, 98,09, 80,75, 76,84, 75,23, 69,87, 69,08, 68,69, 68,60, 48,83, 41,07, 35,45, 31,67, 29,19, 27,12, 24,55, 19,20, 18,95, 13,48, 11,39, 8,04, (iii) uma fórmula molecular de C28H43NO9 e pelo menos um de: (i) valores 1H RMN δ em cerca de 6,41, 6,40, 6,01, 5,97, 5,67, 5,55, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,64, 3,59, 3,54, 3,52, 2,44, 2,34, 2,25, 1,96, 1,81, 1,76, 1,42, 1,38, 1,17, 1,12, 1,04; (ii) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 6 a 15 minutos, em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN); (iii) banda de absorção de UV entre cerca de 210 a 450 nm e mais particularmente em cerca de 234 nm.
[00011] Em uma modalidade mais particular, são fornecidos compostos incluindo, entre outros: (A) um composto tendo a estrutura ##STR001##
Figure img0001
ou um sal pesticidamente aceitável ou estereoisômeros dos mesmos, em que M é 1, 2, 3 ou 4; n é 0, 1, 2, ou 3; p e q são independentemente 1 ou 2; X é O, NH ou NR; R1, R2 e R3 são os mesmos ou diferentes e independentemente uma fração de cadeia lateral de aminoácido ou um derivado de cadeia lateral de aminoácido e R é uma fração de cadeia inferior de alquila, arila ou arilalquila; (B) um composto tendo a estrutura ##STR002##
Figure img0002
##STR002##em que X, Y e Z são cada um independentemente --O, --NRi, ou --S, em que Ri é --H ou C1-C10 alquila; Ri, R2 e m são cada um independentemente --H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituído, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituído, hidróóxi, halogênio, amino, amido, carboxila, --C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila e "m" pode estar localizado em qualquer lugar do anel oxazol; (C) um composto tendo a estrutura ##STR002a##
Figure img0003
em que Ri é --H ou C1-C10 alquila; R2 é um éster alquil; (D) um composto tendo a estrutura ##STR003##
Figure img0004
em que: X e Y são cada um independentemente --OH, --NR1, ou --S, em que Ri é -H ou C1-C10alquila; Ri, R2 e m, um substituinte no anel oxazol, são cada um independentemente -H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituído, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróóxi, halogênio, amino, amido, carboxila, --C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila; (E) um composto tendo a estrutura ##STR003a##
Figure img0005
em que Ri é --H ou C1-C10 alquila; (F) um composto tendo a estrutura ##STR004a##
Figure img0006
em que X, Y e Z são cada um independentemente -O, -NR, ou -S, em que R é H ou C1-C10 alquila; Ri, R2, R3, FU, Rs, Re, R7, Rs, RΘ,R10, R11, R12, e R13 são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituído, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróóxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila. (G) um composto tendo a estrutura ##STR004b##
Figure img0007
em que Ri, R2, Rs, R4, Rs, Re, R7, Rs, RΘ, RIO- RL1>RI2>E RL3 SÂO CADA um independentemente H, alquila, alquila substituído, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila; (H) um composto tendo a estrutura ##STR004c##
Figure img0008
em que Ri, R2, Rs, R4, Rs, Re, R7, Rs, R11, são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfuril; (I) um composto tendo a estrutura ##STR005##
Figure img0009
em que X e Y são cada um independentemente --OH, --NRi, ou --S, em que Ri, R2 são cada um independentemente -H, alquila (por exemplo, C1-C10 alquila), alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila; (J) um composto tendo a estrutura ##STR006a##
Figure img0010
em que X, Y e Z são cada um independentemente -O, -NR, ou -S, em que R é H ou C1-C10alquila; Ri, R2, R3, R4, Rs, Re, R7, Rs, R11, R12, and Rn são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila.
[00012] Em uma modalidade mais particular, os compostos podem incluir, entre outros: (i) templazol A; (ii) templazol B; (iii) templamida A; (iv) templamida B; (v) FR90128; (vi)
Figure img0011
(vii)
Figure img0012
(viii)
Figure img0013
(xi)
Figure img0014
(x)
Figure img0015
(xi)
Figure img0016
(xii)
Figure img0017
(xiii)
Figure img0018
(xiv)
Figure img0019
(xv)
Figure img0020
(xvi)
Figure img0021
(xvii)
Figure img0022
(xviii)
Figure img0023
(xix)
Figure img0024
(xx)
Figure img0025
(xxi)
Figure img0026
(xxii)
Figure img0027
(xxiii)
Figure img0028
Figure img0029
(XL) FR901465
[00013] Ainda são fornecidos métodos de obtenção dos compostos estabelecidos acima. Em particular, o método compreende cultivar a cepa de Burkholderia revelada aqui e produzir o composto. Ainda é fornecido um método para isolar estes compostos pelo isolamento dos compostos produzidos por uma cepa de Burkholderia compreendendo isolar os compostos produzidos a partir de um sobrenadante de uma cultura de dita cepa de Burkholderia.
[00014] Ainda é fornecida uma combinação compreendendo (a) uma primeira substância estabelecida do grupo que consiste em (i) uma cultura pura, fração celular ou sobrenadante derivado de cepa de Burkholderia estabelecida acima ou extrato do mesmo para uso opcionalmente como um pesticida; (ii) um ou mais dos compostos estabelecidos acima (b) opcionalmente uma segunda substância, em que dita segunda substância é um pesticida químico ou biológico e (c) opcionalmente pelo menos um de um carreador, diluente, tensoativo, adjuvante, ou pesticida. Em uma modalidade particular, a combinação é uma composição. Em um aspecto relacionado, é fornecida aqui uma semente revestida com a dita composição.
[00015] Em um aspecto relacionado, é revelado um método para modular a infestação da praga em uma planta compreendendo aplicar à planta e/ou sementes dos mesmos e/ou substrato usado para crescer dita planta e/ou um método para modular a emergência e/ou crescimento de monocotiledôneas, junça ou ervas daninhas dicotiledôneas compreendendo aplicar a dita erva daninha ou solo uma quantidade de (I) (a) compostos isolados estabelecidos acima e (b) opcionalmente outra substância, em que dita substância é um pesticida (por exemplo, nematocídeo, herbicida, fungicida, inseticida) ou (II) composição ou combinação estabelecida acima em uma quantidade eficaz para modular infestação por praga e/ou emergência ou crescimentos de monocotiledôneas, junça ou ervas daninhas dicotiledôneas.
[00016] Em um aspecto relacionado, é fornecido o uso de cepas, culturas, extratos, sobrenadantes, combinações, os compostos estabelecidos acima para modulação de infestação de pragas em uma planta compreendendo aplicar à planta e/ou sementes das mesmas e/ou substrato usado para crescimento de dita planta e/ou um método para modular emergência e/ou crescimento de monocotiledôneas, junça ou ervas daninhas dicotiledôneas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00017] A figura 1 mostra a comparação da taxa de crescimento de Burkholderia A396 com Burkholderia multivorans ATCC 17616.
[00018] A figura 2 mostra o efeito de extrato de Burkholderia A396 em trepadeira.
[00019] A figura 3 mostra o efeito de extrato de Burkholderia A396 em erva-formigueira.
[00020] A figura 4 mostra o efeito de extrato de Burkholderia A396 em lagarta de repolho (Tricoplusia ni).
[00021] A figura 5 mostra o efeito de caldo de cultura de Burkholderia A396 em lagarta de cereais de beterraba (Spodoptera exigua).
[00022] A figura 6 mostra o efeito de caldo de cultura de Burkholderia A396 na motilidade de nematoides das galhas juvenis (Meloidogyne incognita).
[00023] A figura 7 é uma representação esquemática de esquema de purificação para obtenção de compostos templazol e templamida.
[00024] A figura 8 mostra os resultados de um ensaio in vitropara testar o efeito fungicida de FR90128 em Botrytis cinerea (esquerda) e Phytophtora sp. (direita).
[00025] A figura 9 mostra o efeito de caldo de cultura de Burkholderia A396 no índice médio de galhas (% de controle) de raízes de pepino cv. Toschka inoculadas com 3000 ovos de Meloidogyne sp. 14 dias após a inoculação e aplicação.
[00026] A figura 10: Efeito de caldo de cultura Burkholderia A396 no índice médio de galha de raízes de pepino cv. Toschka inoculadas com 3000 ovos de Meloidogyne sp. 14 dias após a inoculação e aplicação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES
[00027] Embora composições e métodos até este ponto sejam susceptíveis a várias modificações e formas alternativas, as modalidades exemplares serão aqui descritas em detalhes. Deve ser entendido, no entanto, que não há intenção de limitar a invenção às formas particulares reveladas, pelo contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que caiam dentro do espírito e escopo da invenção conforme definido pelas reivindicações anexadas.
[00028] Onde uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cada valor interveniente, do décimo da unidade do limite inferior salvo se o contexto claramente indicar de outra forma, entre o limite superior e inferior da faixa e qualquer outro declarado ou valor interveniente na faixa declarada, é incluído neste. Faixas menores são ainda incluídos. Os limites superiores e inferiores destes valores menores são ainda incluídos nestes, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada.
[00029] Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendidos por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora qualquer método e material semelhante ou equivalente àqueles descritos aqui possa ser usado na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são agora descritos.
[00030] Deve ser notado conforme usado aqui e nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um,""e" e "o/a" incluem as referências no plural salvo se o contexto claramente indicar o contrário.
[00031] Conforme definido aqui, "derivado de" significa diretamente isolado ou obtido de uma fonte particular ou alternativamente tendo características identificadoras de uma substância ou organismo isolado ou obtidos de uma fonte particular.
[00032] Como definido aqui, um "composto isolado" é essencialmente livre de outros compostos ou substâncias, por exemplo, pelo menos cerca de 20% puro, preferencialmente pelo menos cerca de 40% puro, mais preferencialmente cerca de 60% puro, ainda mais preferencialmente cerca de 80% puro, mais preferencialmente cerca de 90% puro, e ainda mais preferencialmente cerca de 95% puro, como determinado por métodos analíticos, incluindo, entre outros, métodos cromatográficos, métodos eletroforéticos.
[00033] Conforme usado aqui, o termo "alquil"refere-se a um grupo hidrocarboneto de cadeia monovalente linear ou ramificada tendo de um a cerca de 12 átomos de carbono, incluindo metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, tert-butila, n-hexila, e semelhantes.
[00034] Conforme usado aqui, "alquila substituída"refere-se aos grupos alquil ainda tendo um ou mais substituintes selecionados de hidróxi, alcóxi, mercapto, cicloalquila, cicloalquila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, arilóxi, arilóxi substituído, halogênio, ciano, nitro, amino, amido, --C(O)H, acila, oxiacila, carboxila, sulfonila, sulfonamida, sulfurila, e semelhantes.
[00035] Conforme usado aqui, "alquenila"refere-se a grupos hidrocarbila de cadeia linear ou ramificada tendo um ou mais ligações duplas carbono-carbono, e tendo na faixa de cerca de 2 até 12 átomos de carbono, e "alquenila substituída"refere-se aos grupos alquenila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00036] Conforme usado aqui, "alquinila"refere-se aos grupos hidrocarbila de cadeia linear ou ramificada tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, e tendo na faixa de cerca de 2 até 12 átomos de carbono, e "alquinila substituída"refere-se aos grupos alquinila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00037] Conforme usado aqui, "arila"refere-se aos grupos aromáticos tendo na faixa de 6 até 14 átomos de carbono e "arila substituída"refere-se aos grupos arila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00038] Conforme usado aqui, "heteroaril"refere-se aos anéis aromáticos tendo um ou mais heteroátomos (por exemplo, N, O, S, ou semelhantes) como parte da estrutura do anel, e tendo na faixa de 3 até 14 átomos de carbono e "heteroarila substituída"refere-se aos grupos heteroarila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00039] Conforme usado aqui, "alcóxi"refere-se à fração -O-alquil-, em que alquila é como definido acima, e "alcóxi substituído"refere-se aos grupos alcoxila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00040] Conforme usado aqui, "tioalquila"refere-se à fração --S- alquil-, em que alquil é como definido acima, e "tioalquila substituída"refere-se aos grupos tioalquil ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00041] Conforme usado aqui, "cicloalquil"refere-se aos grupos alquila tendo anel tendo na faixa de cerca de 3 até 8 átomos de carbono, e "cicloalquila substituída"refere-se aos grupos cicloalquila ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
[00042] Conforme usado aqui, "heterocíclico", refere-se aos grupos cíclicos (ou seja, tendo anel) tendo um ou mais heteroátomos (por exemplo, N, O, S, ou semelhantes) como parte do anel da estrutura, e tendo na faixa de 3 até 14 átomos de carbono e "heterocíclico substituído"refere-se aos grupos heterocíclico ainda tendo um ou mais substituintes como estabelecido acima.
A cepa de Burkholderia
[00043] A cepa de Burkholderia estabelecida aqui é um complexo não Burkholderia cepacia,não Burkholderia plantari, não Burkholderia gladioli, Burkholderia sp e não patogênico aos vertebrados, como pássaros, mamíferos e peixes. Esta cepa pode ser isolada de uma amostra de solo usando procedimentos conhecidos na técnica e descritos por Lorch et al., 1995. A cepa Burkholderia pode ser isolada de muitos tipos diferentes de solo ou meio de crescimento. A amostra é, então, plaqueada em ágar dextrose de batata (PDA). As bactérias são gram negativas e elas formam colônias de cor creme opacas redondas que mudam para rosa e marrom-rosado em cor e mucoide ou viscosa com o tempo.
[00044] As colônias são isoladas de placas de ágar dextrose de batata e tríadas para aquelas que têm características biológicas, genéticas, bioquímicas e/ou enzimáticas da cepa de Burkholderia da presente invenção estabelecida nos Exemplos abaixo. Em particular, a cepa de Burkholderia tem um gene 16S rRNA compreendendo uma sequência direta que é pelo menos cerca de 99,0%, preferencialmente cerca de 99,5%, mais preferencialmente cerca de 99,9% e mais preferencialmente cerca de 100% idêntica à sequência definida em SEQ ID NO: 8, 11 e 12 e uma sequência direta que é pelo menos cerca de 99,0%, preferencialmente cerca de 99,5%, mais preferencialmente cerca de 99,9% e mais preferencialmente cerca de 100% idêntica à sequência definida em SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 e 15 como determinado por análise clustal. Além disso, como estabelecido abaixo, esta cepa de Burkholderia pode, como definido abaixo, ter atividade pesticida, particularmente, virucida, herbicida, germicida, fungicida, nematicida, bactericida e insecticida e mais particularmente, atividade herbicida, insecticida, fungicida e nematicida. Não é patogênica para animais vertebrados, como mamíferos, pássaros e peixes.
[00045] Além disso, a cepa Burkholderia produz pelo menos os compostos pesticidas definidos na presente descrição.
[00046] A cepa de Burkholderiaé susceptível à canamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, e uma combinação de sulfametoxazol e trimetoprima e contém os ácidos graxos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0, 18:0.
[00047] Esta cepa de Burkholderia pode ser obtida por cultivo de um microrganismo tendo as características de identificação de Burkholderia A396 (N.° de Acessão NRRL B-50319) em Ágar Dextrose de Batata (PDA) ou em um meio de fermentação tendo fontes de carbono definidas como glicose, maltose, frutose, galactose, e fontes de nitrogênio indefinidas como peptona, triptona, soitona, e NZ amina.
Compostos Pesticidas
[00048] O composto pesticida revelado aqui tem as seguintes propriedades: (a) é obtido de uma nova espécie Burkholderia, por exemplo, A396; (b) é, em particular, tóxico às pragas mais comuns de insetos em agricultura; (c) tem um peso molecular de cerca de 525 a 555 e mais particularmente 540 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (d) tem valores 1H RMN de 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23. 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (d) tem valores de 13C RMN de 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 (e) tem um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 10 a 15 minutos, mais especificamente cerca de 12 minutos e ainda mais especificamente cerca de 12,14 min em uma coluna de fase reversa C-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5p C18 (2) 100A, 100 x 4,60 mm) usando um gradiente água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente (0 a 20 min 90 a 0% CH3CN aquoso, 20 a 24 min 100% CH3CN, 24 a 27 min, 0 a 90% CH3CN aquoso, 27 a 30 min 90% CH3CN aquoso) em fluxo de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm (f) tem uma fórmula molecular, C24H36N4O6S2, que é determinada por interpretação de dados 1H, 13C RMN e LC/MS (g) um espectro 13C RMN com sinais para todos os 24 carbonos, incluindo 5 metila, 4 metileno, 9 metina, e 6 carbonos quaternários e (g) espectro 1H RMN apresentando características de um típico depsipeptídeo, ilustrando três prótons amino [4,63, 4,31, 3,93], e um próton éster carbinol [5,69], Em uma modalidade particular, o composto tem a estrutura ##STR001##:
Figure img0030
ou um sal pesticidamente aceitável ou estereoisômeros do mesmo, em que M é 1, 2, 3 ou 4; n é 0, 1, 2, ou 3; p e q são independentemente 1 ou 2; X é O, NH ou NR; R1, R2 and R3 são os mesmos ou diferentes e independentemente uma fração de cadeia lateral de aminoácido ou um derivado de cadeia lateral de aminoácido e R é uma fração de cadeia inferior de alquila, arila ou arilalquila.
[00049] Em uma modalidade mais particular, o composto tem a estrutura de FR90128:
Figure img0031
[00050] Com isto são fornecidos compostos definidos em ##STR002##:
Figure img0032
em que: X, Y e Z são cada um independentemente --O, --NRi, ou --S, em que Ri é —H ou C1-C10 alquila; Ri, R2 e m são cada um independentemente --H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, --C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila.
[00051] Em uma modalidade ainda mais particular, compostos da Família ##STR002## podem ser os compostos definidos em (vi)-(xix).
Figure img0033
(vii)
Figure img0034
(viii)
Figure img0035
(ix)
Figure img0036
(x)
Figure img0037
(xi)
Figure img0038
(xii)
Figure img0039
(xiii)
Figure img0040
(xiv)
Figure img0041
(xv)
Figure img0042
(xvi)
Figure img0043
(xvii)
Figure img0044
(xviii)
Figure img0045
(xix)
Figure img0046
[00052] Estes são de materiais naturais ou compostos obtidos de fontes comerciais ou por síntese química. Fontes naturais de compostos da Família ##STR002## incluem, entre outros a, microrganismos, alga, e esponjas. Em uma modalidade mais particular, microrganismos que incluem compostos da Família ##STR002## incluem, entre outros, ou alternativamente, compostos da Família ##STR002## podem ser derivados de espécies como Streptoverticillium waksmanii (composto vi) (Umehara, et al., 1984), Streptomyces pimprína (composto vii) (Naiket al., 2001), Streptoverticillium olivoreticuli (compostos viii, ix, x) (Koyama Y., et al., 1981), Streptomyces sp (compostos xi, xii) (Watabe et al., 1988), Pseudomonas syringae (compostos xiii, xiv) (Pettit et al., 2002). Compostos da Família ##STR002## podem ainda ser derivados de algas incluindo, entre outros, alga vermelha (composto xv) (N'Diaye, et al., 1996), alga vermelha Martensia fragilis (composto xvi) (Takahashi S. et al., 1998), Diazona chinensis (compostos xvii & xviii) (Lindquist N. et al., 1991), Rhodophycota haraldiophyllum sp (composto xix) (Guella et al., 1994).
[00053] Ainda é fornecido ##STR003##:
Figure img0047
em que: X e Y são cada um independentemente --OH, --NRi, ou -S, em que Ri é --H ou C1-C10alquila; Ri, R2 e m, um substituinte no anel oxazol, são cada um independentemente --H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, --C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila.
[00054] Ainda é fornecido ##STR005##:
Figure img0048
em que X e Y são cada um independentemente --OH, --NR1, ou --S, em que Ri, R2 são cada um independentemente --H, alquil (por exemplo, C1-C10 alquila), alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila.
[00055] Em uma modalidade particular, compostos da Família ##STR005## como compostos de xx-xxiii definidos abaixo podem ser derivados de fontes naturais ou comerciais ou por síntese química: (xx)
Figure img0049
(xxi)
Figure img0050
(xxii)
Figure img0051
(xxiii)
Figure img0052
[00056] Fontes naturais de compostos da Família ##STR005## incluem, entre outros, plantas, corais, microrganismos, e esponjas. Os microrganismos incluem, entre outros Streptomyces griseus (composto xx) (Hirota et al., 1978), Streptomyces albus (composto xxi) (Werner et al., 1980). Compostos da Família STR004 podem ainda ser derivados de algas incluindo, entre outros, Haraldiophyllum sp (composto xxii (Guella et al., 2006), e algas vermelhas (composto xxiii) (N'Diaye et al., 1994).
[00057] Em uma modalidade, o composto pode ser derivado de ou é obtido de um microrganismo, e em particular de espécies de Burkholderia e caracterizados como tendo uma estrutura compreendendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, pelo menos três grupos metilenos, pelo menos uma fração tetra- hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos vinte e cinco carbonos e pelo menos oito oxigénios e um nitrogênio. O composto ainda compreende pelo menos uma das seguintes características: (a) propriedades de pesticida e em particular, propriedades nematicida, fungicida, inseticida e herbicida; (b) um peso molecular de cerca de 530 a 580 e mais particularmente, 555 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (c) valores de 1H RMN de δ 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04; (d) valores 13C RMN de δ 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81,9,41; (e) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 7 a 12 minutos, mais especificamente cerca de 10 minutos e ainda mais especificamente cerca de 10,98 min em uma coluna de fase reversa C-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5p C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente (0 a 20 min; 90 a 0% CH3CN aquoso, 20 a 24 min; 100% CH3CN, 24 a 27 min; 0 a 90% CH3CN aquoso, 27 a 30 min; 90% CH3CN aquoso) em fluxo de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm; (f) espectro de 13C RMN que apresenta sinais de 28 carbonos discretos que podem ser atribuídos a seis metilas, quatro carbonos metilenos, e treze metinas incluindo cinco carbonos sp2, quatro quaternários; (g) uma fórmula molecular de C28H45NO10 que foi determinado por interpretação de análise de dados ESIMS e RMN; (h) bandas de absorção de UV entre cerca de 210 a 450 nm e mais particularmente em cerca de 234 nm.
[00058] Ainda são fornecidos compostos tendo a estrutura ##STR004a##:
Figure img0053
em que X, Y e Z são cada um independentemente -O, -NR, ou -S, em que R é H ou C1-C10 alquila; Ri, R2, Rs, R4, Rs, Re, Rz, Rs- R9’ Rl0’ Rn, R12, e R13 são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfuril.
[00059] Em uma modalidade particular, o composto tem a estrutura definida em ##STR004b##:
Figure img0054
em que Ri, R2, Rs, R4, Rs, Re, R7, Re, R9, R10, R11, R12, e Rn são como anteriormente definidos para ##STR004a##.
[00060] Em uma modalidade mais particular, 0 composto é Templamida A com a seguinte estrutura:
Figure img0055
Templamida A
[00061] Em outra modalidade, é fornecido um composto tendo fórmula ##STR004c##:
Figure img0056
em que Ri, R2, R3, R4, Rs, RΘ, RZ, RS, e Rn são como definidos anteriormente para ##STR004a##.
[00062] Em outra modalidade, é fornecido um composto que pode ser derivado de uma espécie Burkholdθride caracterizado como tendo uma estrutura compreendendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, um grupo epóxido metileno, pelo menos uma fração tetra- hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos 25 carbonos e pelo menos 8 oxigênio e 1 nitrogênio, e atividade pesticida. O composto ainda compreende pelo menos uma das seguintes características: (a) propriedades pesticidas e em particular, propriedades inseticida, fungicida, nematicida e herbicida; (b) um peso molecular de cerca de 520 a 560 e particularmente 537 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (c) valores 1H RMN δ em cerca de 6,41, 6,40, 6,01, 5,97, 5,67, 5,55, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,64, 3,59, 3,54, 3,52, 2,44, 2,34, 2,25, 1,96, 1,81, 1,76, 1,42, 1,38, 1,17, 1,12, 1,04; (d) valores 13C RMN de δ 174,03, 166,12, 143,63, 137,50, 134,39, 128,70, 126,68, 124,41, 98,09, 80,75, 76,84, 75,23, 69,87, 69,08, 68,69, 68,60, 48,83, 41,07, 35,45, 31,67, 29,19, 27,12, 24,55, 19,20, 18,95, 13,48, 11,39, 8,04; (e) tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 6 a 15 minutos, mais especificamente cerca de 8 minutos em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando gradiente de água:acetonitrila (CH3CN), particularmente, um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 8-15 minutos, mais especificamente cerca de 11 minutos e ainda mais especificamente cerca de 11,73 min em uma coluna de fase reversa C-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5p C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando um gradiente água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente (0 a 20 min; 90 a 0% CH3CN aquoso, 20 a 24 min; 100% CH3CN, 24 a 27 min; 0 a 90% CH3CN aquoso, 27 a 30 min; 90% CH3CN aquoso) em fluxo de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm; (f) uma fórmula molecular de C28H43NO9 que foi determinado por interpretação da análise de dados ESIMS e RMN; (g) bandas de absorção de UV em cerca de 210 a 450 nm e mais particularmente em cerca de 234 nm.
[00063] Em uma modalidade particular, o composto tem a estrutura ##STR006a##:
Figure img0057
em que X, Y e Z são cada um independentemente -O, -NR, ou -S, em que R é H ou C1-C10alquil; Ri, R2, R3, R4, Rs, RΘ,R7, Rs, R11, R12, e R13 são cada um independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterocíclico, heterocíclico substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, tioalquila, tioalquila substituída, hidróxi, halogênio, amino, amido, carboxila, -C(O)H, acila, oxiacila, carbamato, sulfonila, sulfonamida, ou sulfurila.
[00064] Em uma modalidade particular, o composto tem a estrutura:
Figure img0058
Templamida A
[00065] Em outra modalidade, e fornecido um composto tendo formula ##STR006b##:
Figure img0059
em que R1, R2, Ra, R4, Rs, Re, Rz, Rs, e Rn são como definidos anteriormente para ##STR006a##.
[00066] Em uma modalidade mais particular, o composto é Templamida B com a seguinte estrutura:
Figure img0060
Templamida B
[00067] Ainda em outra modalidade particular, o composto pode ser derivado de espécies de Burkholderia e caracterizados como tendo uma estrutura compreendendo pelo menos um éster, pelo menos uma amida, um grupo epóxido metileno, pelo menos uma fração tetra- hidropiranose e pelo menos três ligações duplas olefínicas, pelo menos seis grupos metila, pelo menos três grupos hidroxila, pelo menos 25 carbonos e pelo menos 8 oxigénios e pelo menos 1 nitrogênio. O composto ainda compreende pelo menos uma das seguintes características: (a) propriedades pesticidas e em particular, propriedades inseticida, fungicida, nematicida e herbicida; (b) um peso molecular de cerca de 510-550 e particularmente cerca de 523 como determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (c) valores 1H RMN δ em cerca de 6,41, 6,40, 6,01, 5,98, 5,68, 5,56, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,65, 3,59, 3,55, 3,50, 2,44, 2,26, 2,04, 1,96, 1,81, 1,75, 1,37, 1,17, 1,04; (d) valores 13C RMN δ de 172,22, 167,55, 144,98, 138,94, 135,84, 130,14, 125,85, 123,37, 99,54, 82,19, 78,28, 76,69, 71,31, 70,13, 69,68, 48,83, 42,52, 36,89, 33,11, 30,63, 25,99, 21,20, 20,38, 18,14, 14,93, 12,84; (e) um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 6 a 15 minutos, mais especificamente cerca de 8 minutos em uma coluna C-18 HPLC de fase reversa usando um gradiente de água:acetonitrila (CH3CN), particularmente, um tempo de retenção de Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC) de cerca de 8-15 minutos, mais especificamente cerca de 10 minutos e ainda mais especificamente cerca de 10,98 min em uma coluna de fase reversa C-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5p C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando um gradiente água:acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solvente gradiente (0 a 20 min; 90 a 0% CH3CN aquoso, 20 a 24 min; 100% CH3CN, 24 a 27 min; 0 a 90% CH3CN aquoso, 27 a 30 min; 90% CH3CN aquoso) em fluxo de 0,5 mL/min e detecção UV de 210 nm; (f) uma fórmula molecular de C27H41NO9 que foi determinado por interpretação da análise de dados ESIMS e RMN; (g) bandas de absorção de UV em cerca de 210 a 450 nm e mais particularmente em cerca de 234 nm.
[00068] Em uma modalidade mais particular, o composto é um composto conhecido FR901465 que foi isolado anteriormente a partir do caldo de cultura de uma bactéria de Pseudomonassp. No. 2663 (Nakajima et al. 1996) e foi reportado por ter atividade anticâncer com a seguinte estrutura:
Figure img0061
[00069] Ainda em uma modalidade ainda mais particular, compostos da Família ##STR006a## podem ser os compostos definidos em xxiv a xxxix Estes são materiais naturais ou compostos obtidos de fontes comerciais ou por síntese química. Fontes naturais de compostos da Família ##STR006a## incluem, entre outros, microrganismos, algas e esponjas. Em uma modalidade mais particular, microrganismos que incluem os compostos da Família ##STR006a## que podem ser derivados de espécies como Pseudomonassp. No. 2663 (compostos xxiv-xxvi) (Nakajima et al., 1996). Os análogos sintéticos de FR901464 (xxvii-xxxix) que foram sintetizados e patenteados como compostos anticâncer (ver Koide et al., Pedido de Patente US 2008/0096879 A1).
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Composições
[00070] Uma cultura substancialmente pura, fração celular ou sobrenadante e compostos produzidos pela cepa Burkholderia da presente invenção, podem ser formulados em composições pesticidas.
[00071] As substâncias definidas acima podem ser formuladas de qualquer maneira. Exemplos não limitantes de formulação incluem, entre outras, concentrados emulsificados (EC), pós molháveis (WP), líquidos solúveis (SL), aerossóis, soluções de concentrado de volume ultra baixo (ULV), pós solúveis (SP), microencapsulação, grânulos dispersos em água, composições fluidas (FL), microemulsões (ME), nanoemulsões (NE), etc. Em particular, o concentrado, pós, grânulos e emulsões podem ser liofilizados. Em qualquer formulação descrita aqui, o percentual do ingrediente ativo está dentro da faixa de 0,01% a 99,99%.
[00072] As composições podem estar na forma de um líquido, gel ou sólido. Composições líquidas compreendem compostos pesticidas derivadas de dita cepa de Burkholderia, por exemplo, uma cepa tendo as características de identificação de Burkholderia A396 (N.° de Acessão NRRL B-50319).
[00073] Uma composição sólida pode ser preparada por suspensão de um carreador sólido em uma solução de compostos pesticidas e secagem da suspensão em condições brandas, como evaporação em temperatura ambiente ou evaporação em vácuo a 65°C ou inferior.
[00074] Uma composição da invenção pode compreender compostos encapsulados em gel derivados de cepa de Burkholderia da presente invenção. Os ditos materiais encapsulados em gel podem ser preparados por mistura de um agente formador de gel (por exemplo, gelatina, celulose, ou lignina) com uma solução de compostos pesticidas usados no método da invenção; e induzindo formação de gel do agente.
[00075] A composição pode adicionalmente compreender um tensoativo a ser usado para a finalidade da emulsificação, dispersão, molhante, espalhamento, integração, controle de desintegração, estabilização de ingredientes ativos e melhora de fluidez ou inibição de oxidação. Em uma modalidade particular, o tensoativo é um tensoativo não iônico não fitotóxico que preferencialmente pertence à Lista EPA 4B. Em outra modalidade particular, o tensoativo não iônico é monolaurato de polioxietileno (20). A concentração de tensoativos pode variar entre 0,1-35% da formulação total, faixa preferencial é 5 a 25%. A escolha de agentes de dispersão e emulsificantes, como agentes não iônicos, aniônicos, anfotéricos e catiônicos dispersantes e emulsificantes, e a quantidade empregada é determinada pela natureza da composição e a capacidade do agente para facilitar a dispersão destas composições.
[00076] A composição pode ainda compreender outros microrganismos e/ou pesticidas (por exemplo, nematocídeo, fungicida, inseticida). O microrganismo pode incluir, mas não está limitado a um agente derivado de Bacillussp., Pseudomonassp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., não Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichodermasp, Gliocladium sp. Alternativamente, o agente pode ser um óleo natural ou produto de óleo tendo atividade fungicida e/ou inseticida (por exemplo, óleo parafínico, óleo de árvore do chá, óleo de citronela, óleo de cravo, óleo de canela, óleo citrus, óleo de alecrim).
[00077] A composição, em particular, pode ainda compreender um inseticida. O inseticida pode incluir, entre outros, avermectina, Bacillus thuringiensis, óleo de neem e azadiractina, spinosades, Chromobacterium subtsugae, extrato de eucalipto, bactérias ou fungos entomopatogênicos como uma Beauveria bassiana, e Metarrhizium anisopliae e inseticidas químicos incluindo, entre outros, compostos organocorados, compostos organofosforados, carbamatos, piretroides, e neonicotinoides.
[00078] A composição pode ainda compreender um nematicida. O nematicida pode incluir, entre outros, a nematicidas químicos como fenamifos, aldicarb, oxamila, carbofurano, nematicida de produto natural, avermectina, os fungos Paecilomyces lilacinas e Muscodor spp., as bactérias Bacillus firmus e outras Bacillus spp. e Pasteuria penetrans.
[00079] A composição pode ainda compreender um biofungicida como extrato de R. sachalinensis (Regalia) ou um fungicida. Os ditos fungicidas incluem, entre outros, um agente antifúngico local único que pode incluir, entre outros, um benzimidazol, um inibidor de desmetilação (DMI) (por exemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarboneto aromático, ácido cinâmico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, benzenoide (xililalanina). Ainda em outra modalidade, o agente antifúngico é um inibidor de desmetilação selecionado do grupo que consiste em imidazol (por exemplo, triflumizol), piperazina, pirimidina e triazol (por exemplo, bitertanol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol, propiconazol).
[00080] O agente antimicrobiano pode ainda ser um fungicida químico multi-local, não inorgânico, selecionado do grupo que consiste em uma nitril (por exemplo, cloronitrila ou fludioxonila), quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridinamina, ciano-acetamida oxima.
[00081] As composições podem ser aplicadas usando métodos conhecidos na técnica. Especificamente, estas composições podem ser aplicados às plantas ou partes de plantas. As plantas são entendidas como significando no presente contexto todas as plantas e populações de plantas como desejados e plantas selvagens não desejadas ou plantas de colheita (incluindo plantas de colheita de ocorrência natural). Plantas de colheita são plantas que podem ser obtidas por reprodução convencional de planta e métodos de otimização ou métodos biotecnológicos e engenharia genética ou por combinações destes métodos, incluindo as plantas transgênicas e incluindo os cultivares de planta protegíveis ou não protegíveis por direitos de criadores de plantas. Partes de plantas devem ser entendidas como todas as partes e órgãos das plantas acima e abaixo do solo, como broto, folha, flor e raiz, exemplos que podem ser mencionados sendo folhas, agulhas, caules, hastes, flores, corpos das frutas, frutas, sementes, raízes, tubérculos e rizomas. As partes de planta ainda incluem material colhido, e material de propagação vegetative e germinativo, por exemplo, estacas, tubérculos, rizomas, ramificações e sementes.
[00082] O tratamento das plantas e partes das plantas com as composições definidas acima pode ser conduzido diretamente ou deixando as composições atuarem em suas redondezas, habitat ou espaço de armazenamento em, por exemplo, imersão, dispersão, evaporação, pulverização, espalhamento, injeção. No caso de a composição ser aplicada a uma semente, a composição pode ser aplicada à semente como um ou mais revestimentos antes do plantio da semente usando uma ou mais revestimentos usando métodos conhecidos na técnica.
[00083] Conforme notado acima, as composições podem ser composições herbicidas. A composição pode ainda compreender um ou mais herbicidas. Estes podem incluir, entre outros, um bioherbicida e/ou um herbicida químico. O bioherbicida pode ser selecionado do grupo que consiste em cravo, canela, erva limão, óleo de citrus, óleo de casca de laranja, tentoxina, cornexistina, AAL-toxina, leptospermona, taxtomina, sarmentina, momilactona B, sorgoleona, ascaulatoxina e ascaulatoxia aglicona. O herbicida químico pode incluir, entre outros, diflufenzopir e sais do mesmo, dicamba e sais do mesmo, topramezona, tembotriona, S-metolaclor, atrazina, mesotriona, primisulfuron-metila, ácido 2,4- diclorofenoxiacético, nicosulfuron, tifensulfuron-metila, asulam, metribuzina, diclofopmetila, fluazifop, fenoxaprop-p-etila, asulam, oxifluorfen, rimsulfuron, mecoprop, e quinclorac, tiobencarb, clomazona, cihalofop, propanila, bensulfuron- metila, penoxsulam, triclopir, imazetapir, halosulfuron-metila, pendimetalin, bispiribac-sódio, carfentrazona etila, bentazona de sódio/acifluorfen de sódio, glifosate, glufosinato e ortosulfamuron.
[00084] Composições herbicidas podem ser aplicadas em forma líquida ou sólida como formulações pré-emergência ou pós- emergência.
[00085] Para formulações secas pré-emergência, o tamanho do grânulo do veículo é tipicamente 1 a 2 mm (diâmetro), mas os grânulos podem ser menores ou maiores dependendo da cobertura de solo requerida. Os grânulos podem compreender partículas porosas ou não porosas.
[00086] Para formulações pós-emergência, os componentes da formulação usados podem conter argilas esmectitas, argilas atapulgitas e argilas de inchaço semelhantes, espessantes como gomas xantanas, goma arábica e outros espessantes polissacarídeos bem como estabilizadores de dispersão como tensoativos não iônicos (por exemplo, monolaurato de polioxietileno (20)).
Usos
[00087] As composições e compostos de pesticida derivados da cepa de Burkholderia definidas aqui podem ser usadas como pesticidas, particularmente como inseticidas, nematocídeos, fungicidas e herbicidas.
[00088] Especificamente, nematoides que podem ser controlados usando o método definido acima incluem, entre outros, nematódeos parasíticos como galhas, anel, ferrão, lança, cisto, e nematódeos de lesão, incluindo entre outros, Meloidogyne, Heterodera e Globodera spp; particularmente Meloidogyne incognita(nematódeos de galhas), bem como Globodera rostochiensis e globodera pailida (nematódeos de cisto de batata); Heterodera glycines(nematódeos de cisto de soja); Heterodera schachtii (nematódeo de cisto de beterraba); e Heterodera avenae (nematódeo de cisto de cereal).
[00089] Insetos fitopatogênciso controlados pelo método da presente invenção incluem, entre outros, insetos da origem (a) Lepidoptera, por exemplo, Aderis spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hell ui a undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Ma mestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis fiam mea, Pectinophora gossypiella, Ftorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; (b) Coleoptera, por exemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp-, Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. e Trogoderma spp.; (c) Orthoptera, por exemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. e Schistocerca spp.; (d) Isoptera, por exemplo, Reticulitermes spp.; (e) Psocoptera, por exemplo, Liposcelis spp.; (f) Anoplura, por exemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. e Phylloxera spp.; (g) Mallophaga, por exemplo, Damalinea spp. e Trichodectes spp.; (h) Thysanoptera, por exemplo, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci e Scirtothrips aurantii; (i) Heteroptera, por exemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp. e Tniatoma spp.; (j) Homoptera, por exemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lecanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratori a spp., Pemphigus spp., Pianococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pu Ivin aria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae e Unaspis citri; (k) Hymenoptera, por exemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia politoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. e Vespa spp.; (I) Diptera, por exemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bi bio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxis spp., Tabanus spp., Tannia spp. e Tipula spp.; (m) Siphonaptera, por exemplo, Ceratophyllus spp. e Xenopsylla cheopis e (n) da ordem de Thysanura, por exemplo, Lepisma saccharina. Os ingredientes ativos de acordo com a invenção podem ainda ser usados para controlar besouros-pulgas crucíferos (Phyllotreta spp.), larvas de raiz (Delia spp.), gorgulho de cápsula de repolho (Ceutorhynchus spp.) e pulgão em sementes oleaginosas como canola (colza), semente de mostarda, e híbridos dos mesmos, e ainda arroz e milho.
[00090] Em uma modalidade particular, o inseto pode ser um membro do Spodoptera, mais particularmente, Spodoptera exigua, Myzus persicae, Plutella xylostella ou Euschistus sp.
[00091] As substâncias e composições podem ainda ser usados para modular emergência em formulação pré-emergente ou pós- emergente de monocotiledôneas, junça ou ervas daninhas dicotiledôneas. Em uma modalidade particular, as ervas daninhas podem ser Chenopodium album, Abutilon theophrasti, Helianthus annuus, Ambrosia artemesifolia, Amaranthus retroflexus, Convolvulus arvensis, Brassica kaber, Taraxacum officinale, Solanum nigrum, Malva neglect,, Setaria lutescens, Brom us tectorum, Poa annua, Poa pratensis, Lolium perenne L. var. Pace, Festuca arundinaceae Schreb. var. Aztec II, Anthem II, LS1100, Echinochloa crus-galli, Lactuca sativa. A cepa de Burkholderia,compostos e composições definidos acima podem ainda ser usados como um fungicida. O fungo direcionado pode ser um Fusariumsp., Botrytis sp., Monilinia sp., Colletotrichum sp, Verticillium sp.', Microphomina sp., Phytophtora sp, Mucor sp., Podosphaera sp.Rhizoctonia sp., Peronospora sp., Geotrichum sp., Phoma, e Penicillium. Em outra modalidade mais particular, as bactérias são Xanthomonas.
[00092] A invenção irá agora ser descrita em detalhe por referência aos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLOS
[00093] As composições e métodos definidos acima irão ser mais bem ilustrados nos seguintes Exemplos não limitantes. Os exemplos são ilustrativos de várias modalidades somente e não limitam a invenção reivindicada em relação aos materiais, condições, proporções de pesos, parâmetros de processo e semelhantes mencionados aqui.
1. Exemplo 1. Isolamento e identificação do micróbio 1.1 Isolamento de microrganismo
[00094] O micróbio é isolado usando técnicas estabelecidas conhecidos na técnica a partir de uma amostra de solo sob uma árvore sempre viva no Rinnoji Temple, Nikko, Japão. O isolamento é feito usando ágar dextrose de batata (PDA) usando um procedimento descrito em detalhes por Lorch et al., 1995. Neste procedimento, a amostra de solo é primeiro diluída em água estérila, após o qual é plantado em um meio de ágar sólido como ágar dextrose de batata (PDA). As placas são crescidas a 25°C por cinco dias, após o qual as colônias microbianas são isoladas em placas de PDA separadas. As bactérias isoladas são gram negativas, e suas colônias de formas redondas, de cor creme opaca que mudam para rosa e marrom-rosa em cor e mucoide ou viscoso com o tempo.
1.2. Identificação no microrganismo
[00095] O micróbio é identificado em sequenciamento de gene usando iniciadores bacterianos universais para amplificar a região de 16S rRNA. O protocolo a seguir é usado: Burkholderia sp A396 é cultivada em placas de ágar de dextrose batata. Crescimento a partir de uma placa com 24 horas de idade é ranhurada com uma alça estéril em tampão de extração de DNA. O DNA é extraído usando o kit de extração Ultra Clean Microbial DNA. O extrato de DNA é verificado para qualidade/quantidade correndo 5pl em um gel 1% agarose.
[00096] As reações de PCR são ajustadas como a seguir: 2 pl extrato de DNA, 5 pl tampão de PCR, 1 pl dNTPs (10 mM cada), 1,25 pl iniciador direto (27F; 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO:1), 1,25 pl iniciador reverso (907R; 5'- CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3' (SEQ ID NO:2)) e 0,25 pl enzima Taq. O volume de reação é preparado até 50 pl usando água estéril livre de nuclease. A reação de PCR inclui uma etapa inicial de desnaturação a 95°C por 10 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C/30 s, 57°C/20 s, 72°C/30 s, e uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos.
[00097] A concentração aproximada do produto e tamanho é calculado correndo um volume de 5 pl em um gel 1% agarose e comparado a banda do produto em uma escada de massa.
[00098] Iniciadores em excesso, dNTPs e enzima são removidos do produto de PCR com o kit MoBio PCR clean up. O produto de PCR limpo como diretamente sequenciado usando iniciadores 27F (como acima), 530F (5'-GTGCCAGCCGCCGCGG-3' (SEQ ID NO:3)), 1114F (5-GCAACGAGCGCA ACCC (SEQ ID NO:4)) e 1525R (5'- AAGGAGGTGWTCCARCC-3' (SEQ ID NO:5)), 1100R (5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3' (SEQ ID NO:6)), 519R (5'- GWATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEQ ID NO:7).
[00099] A sequência de gene 16S rRNA da cepa A396 é comparado com a sequências de gene 16s rRNA disponíveis de representantes de β-proteobacteria usando BLAST. A cepa A395 A396 é intimamente relacionada aos membros do complexo de Burkholderia cepacia,com 99% ou maior similaridade para vários isolados de Burkholderia multivorans, Burkholderia vietnamensis, e Burkholderia cepacia.Uma pesquisa de BLAST excluindo o complexo B. cepacia, mostrou 98% similaridade a B. plantarii, B. gladiolie Burkholderia sp. isolados.
[000100] Uma árvore de resultados distante usando o método de união de vizinhança, mostrou que A396 está relacionado à Burkholderia multivorans e outros isolados do complexo Burkholderia cepacia. Burkholderia plantarii e Burkholderia glumae agrupados em um ramo separado da árvore.
[000101] A cepa isolada de Burkholderia demonstrou conter as seguintes sequências: sequência direta, sequência de DNA com iniciador 27F, 815 nucleotídeos (SEQ ID NO:8); sequência reversa, 1453 bp, usando iniciadores 1525R, 1100R, 519R (SEQ ID NO:9); sequência reversa 824 bp usando o iniciador 907R (SEQ NO: 10); sequência direta 1152 bp usando o iniciador 530F (SEQ ID NO: 11); sequência direta 1067 bp usando o iniciador 1114F (SEQ ID NO:12); sequência reversa 1223 bp usando o iniciador 1525R (SEQ NO: 13); sequência reversa 1216 bp usando iniciador 1100R (SEQ ID NO: 14); sequência reversa 1194 bp usando iniciador 519R (SEQ ID NO: 15).
1.3. Prova de que Burkholderia A396 não pertence ao complexo de Burkholderia cepacia 1.3.1 Trabalho de Biologia Molecular usando iniciadores de PCR específicos
[000102] Para confirmar a identificação de Burkholderia A396 como Burkholderia multivorans, sequenciamento adicional de genes housekeeping é realizado. Burkholderia multivorans é um membro conhecido de complexo de Burkholderia cepacia.Esforços são focados em PCR de genes recA, como descrito em Mahenthiralingam et al., 2000. Os seguintes iniciadores são usados: (a) BCR1 e BCR2 definidos em Mahenthiralingam et al., 2000 para confirmar combinação de complexo de B. cepacia e (b) BCRBM1 e BCRBM2 definidos em Mahenthiralingam et al, 2000 para conformar a combinação a B. multivorans. Uma reação de PCR gerando produto para o primeiro iniciador poderia confirmar que o micróbio pertence ao complexo de B. cepacia.Uma reação de PCR gerando produto para o segundo iniciador poderia confirmar que o micróbio é de fato B. multivorans.
[000103] Nenhum produto de PCR é obtido para um dos pares de iniciadores. O desempenho da reação de PCR e iniciadores é testado usando Burkholderia multivorans ATCC 17616 (controle positivo) e Pseudomonas fluorescens (controle negativo). As bandas fortes são observadas ambas para B. multivorans usando ambos os conjuntos de iniciadores. Nenhuma banda é observada para Pseudomonas fluorescens. Os resultados indicam que A396 é uma Burkholderia, mas não um membro do complexo B. cepacia,e não Burkholderia multivorans. Isto é ainda demonstrado em um experimento de cultura comparativo em que ambos A396 e um tipo de cultura de B. multivorans são crescidos lado a lado em uma cultura de agitação, e o crescimento é monitorado diariamente usando medições de densidade óptica a 600 nm. Sob as condições definidas, as novas espécies A396 cresceram muito mais rápido do que a cepa tipo B. multivorans (figura 1).
1.3.2 Hibridização DNA-DNA
[000104] Para confirmar que o isolado A396 é uma nova espécie de Burkholderia, um experimento de hibridização de DNA-DNA com Burkholderia multivorans (a sequência mais próxima combina 16S rRNA) é conduzido. A biomassa para ambos A396 e B. multivorans é produzida em caldo ISP2, crescido em 48 horas a 200 rpm/25°C em frasco Fernbach. A biomassa é assepticamente colhida por centrifugação. O caldo é decantado e o pélete de célula é ressuspenso em uma solução de 1:1 de água: isopropanol. Os experimentos de hibridização de DNA-DNA são realizados pelo DSMZ, a Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células na Alemanha. O DNA é isolado usando uma célula de pressão Francesa (Thermo Spectronic) e é purificado por cromatografia em hidroxiapatita como descrito em Cashion et al., 1977. Hibridização de DNA-DNA é conduzida como descrito em De Ley et al., 1970 sob consideração das modificações descritas por Huss et al., 1983 usando um modelo de espectrofotômetro Cary 100 Bio UV/VIS-equipado com um Peltier termoestatizado 6x6 trocador multicélula e um controlador de temperatura com sonda de temperatura in-situ (Varian). DSMZ reportou % DNA-DNA de similaridade entre A396 e Burkholderia multivorans de 37,4%. Os resultados indicam que a cepa de Burkholderia sp A396 não pertence à espécie Burkholderia multivorans quando as recomendações de um valor limiar de 70% DNA-DNA similaridade para a definição de espécie bacteriana pelo comitê ad hoc (Wayne et al., 1987) são consideradas. 1. 4. Perfil bioquímico usando placas Biolog GN2
[000105] Para o perfil de utilização de fonte de carbono, A396 é crescido durante a noite em Ágar dextrose de batata (PDA). A cultura é transferida a ágar BUG para produzir uma cultura adequada para experimentos Biolog como recomentado pelo fabricante (Biolog, Hayward, CA).
[000106] O perfil bioquímico de microrganismo é determinado pela inoculação em uma placa Biolog GN2 e lendo a placa após uma incubação de 24 horas usando o sistema de microestação automatizado MicroLog 4. A identificação das bactérias desconhecidas é tentada comparando seu padrão de utilização de carbono com a base de dados de Microlog 4 Gram negativo.
[000107] Nenhuma combinação definitiva clara é encontrada ao perfil Biolog. As combinações mais próximas todas tiveram menos do que 35% de similaridade com A396: Pseudomonas spinosa (Burkholderia), Burkholderia cepacia,e Burkholderia pseudomallei.Os resultados são mostrados na Tabela I. Tabela 1. Perfil bioquímico de A396
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1.5. Composição de ácido graxo
[000108] Após incubação por 24 horas a 28°C, uma alçada de células bem crescidas é colhida e ésteres metil de ácido graxo são preparados, separados e identificados usando o Sistema de Identificação Microbiano Sherlock (MIDI) como descrito (ver Vandamme et al., 1992). Os ácidos graxos predominantes presentes em Burkholderia A396 são como a seguir: 16:0 (24,4%), ciclo 17:0 (7,1%), 16:0 3- OH (4,4%), 14:0 (3,6%), 19:0 ωδc (2,6%) ciclo, 18:0 (1,0%). Somadas a característica 8 (compreendendo 18:1 ω7c) e somadas à característica 3 (compreendendo de 16:1 ω7c e 16:1 ω6c) corresponderam a 26,2% e 20,2% da área de pico total, respectivamente. Somadas a característica 2 compreendendo 12:0 ALDE, 16:1 iso I, e 14:0 3-OH) corresponderam a 5,8% da área total do pico enquanto somada a característica 5 compreendendo 18:0 ANTE e 18:2 ω6,9c corresponderam a 0,4%. Outros ácidos graxos detectados em A396 em menores quantidades incluíram: 13:1 a 12-13 (0,2%), 14:1 ω5c (0,2%), 15:0 3-OH (0,13%), 17:1 ω7c (0,14%), 17:0 (0,15%), 16:0 iso 3-OH (0,2%), 16:0 2-OH (0,8%), 18:1 ω7c 11-metil (0,15%), e 18:1 2-OH (0,4%).
[000109] Uma comparação da composição de ácido graxo de A396 com aquelas das cepas microbianas conhecidas na base de dados de MIDI que os ácidos graxos na nova cepa A396 foram o mais semelhante com aqueles de Burkholderia cenocepacia.
1.6. Resistência aos Antibióticos
[000110] A suscetibilidade a antibiótico de Burkholderia A396 é testado usando discos de antibióticos em meio Muller-Hinton como descrito em fichas técnicas de dados Microbiológicos PML #535. Os ‘resultados obtidos após 72 horas de incubação a 25°C são apresentadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Suscetibilidade de MBI-206 a vários antibióticos. +++ muito suscetível, ++ suscetível, - resistente
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[000111] Os resultados indicam que a susceptibilidade ao espectro de antibióticos de Burkholderia A396 é ligeiramente diferente das cepas patogênicas do complexo B. cepacia.A cepa de Burkholderia A396 é susceptível à canamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, e uma combinação de sulfametoxazol e trimetoprima. Como uma comparação, Zhou et al., 2007 testou a suscetibilidade de 2.621 cepas diferentes no complexo B. cepacia isolado de pacientes com fibrose cística, e demonstrou que somente 7% e 5% de todas as cepas foram suscetíveis a imipenem ou ciprofloxacina, respectivamente. Ainda demonstraram que 85% de todas as cepas são resistentes a cloranfenicol (15% suscetível), e 95% resistente (5% suscetível) à combinação de sulfametoxazol e trimetoprima. Resultados de Zhou et al., 2007 são semelhantes aos de Pitt et al., 1996 que determinou resistência ao antibiótico entre 366 isolados de B. cepaciae reportaram que a maior parte é resistente a ciprofloxacina, cefuroxima, imipenem, cloranfenicol, tetraciclina, e sulfametoxazol.
2. Exemplo 2. Burkholderia sp. como um Herbicida 2. 1. Estudo #1
[000112] Para confirmar a atividade encontrada em triagem inicial de herbicida, um estudo in vivo é conduzido usando o extrato de resina Amberlite 7 XAD derivado de um caldo de célula total de 5 dias de idade das espécies novas Burkholderia. O extrato bruto seco é ressuspenso em 4% etanol e 0,2% tensoativo não iônico (glicosperse) em uma concentração de 10mg/mL, e ainda diluído a uma concentração de 5,0 mg/mL. As duas amostras são dispersas em plantas de 4 semanas de idade de trepadeira (Convolvulus arvensis), e as plantas são mantidas sob crescimentos leves a 25°C por 2 semanas, em cujo ponto, as avaliações de fitotoxicidade são realizadas. No mesmo estudo, plantas amaranto de 2 semanas de idade são dispersas com concentrações aumentadas do extrato bruto derivado da cultura bacteriana. As concentrações teste são 1,25, 2,5, 5,0 e 10,0 mg/mL, e as plantas são incubadas conforme descrito acima antes das avaliações de fitotoxicidade.
[000113] Resultados apresentados nas figuras 2 (trepadeira) e 3 (erva-formigueira) mostram o efeito fitotóxico de extrato bruto de Burkholderia em concentrações diferentes, e mostram bom efeito herbicida em erva-formigueira mesmo em concentrações baixas de tratamento. Ambos os tratamentos do extrato (5 e 10 mg/mL) resultam em nanismo em trepadeira.
2.2. Estudo #2
[000114] Uma nova cepa de Burkholderia sp. A396 é crescida em um meio mineral indefinido por 5 dias (25°C, 200 rpm). O caldo de célula total é extraído usando resina XAD7. O extrato bruto seco é ressuspenso em 4% etanol e 0,2% tensoativo não iônico em uma concentração de 10 mg/mL, e ainda diluído a uma concentração de 5,0, 0,25 e 1,25 mg/mL. Todas as quatro soluções teste são então testados nas seguintes espécies de erva daninha de folha larga e de grama listadas na Tabela 3: Tabela 3. Espécies testadas de Ervas daninhas de Folha Larga e Grama
Figure img0067
[000115] Uma solução de 0,2% glicosperse e taxa de arredondamento a 6 fl oz por galão é usada como controles negativos e positivos, respectivamente.
[000116] Todas as espécies de planta são testadas em potes plásticos 4"x4" em três replicatas. As placas de controle não tratadas são espalhadas com a solução carreadora (4% Etanol, 0,2% glicosperse) e as plantas de controle positivo com arredondamento em uma taxa correspondendo a 6 fl. oz/acre. As placas tratadas são mantidas em uma estufa em condições de 12h luz/12h escuro. Os dados de fitotoxicidade tomados 22 dias após o tratamento para espécies #1 a 8 e 12 dias para as espécies #9 a 12 são apresentadas nas Tabelas 5 e 6, respectivamente. A escala de classificação para ambas as tabelas é mostrada na tabela 4: Tabela 4. Escala de Classificação
Figure img0068
Tabela 5. Dados de Fitotoxicidade para as Espécies #1 a 8
Figure img0069
Figure img0070
* retardamento de desenvolvimento que resultou em plantas de aproximadamente metade do tamanho de plantas não tratadas. Tabela 6. Dados de Fitotoxicidade para Espécies #9 a 12
Figure img0071
[000117] Baseado nos resultados obtidos nestes estudos, os compostos extraídos de caldos de fermentação das espécies isoladas de Burkholderia tiveram atividade herbicida contra várias espécies de ervas daninhas são testadas. Das doze espécies testadas, Ançarinha branca e mostarda são as mais susceptíveis, seguidas por malva e buva. A concentração do extrato tão baixa quando 1,25 mg/mL é capaz de fornecer quase um controle completo de Ançarinha branca e mostarda, enquanto que a concentração maior é requerida para a malva e buva.
[000118] Em um experimento separado, usando o mesmo desenho que o descrito acima, a atividade sistêmica é testada. 10 mg/ml de sobrenadante do extrato bruto de Burkholderia sp. A396 é pintado sobre as primeiras folhas verdadeiras de Tasneira, Mostarda, Erva- moura, Capim-da-roça, Trigo e Celeiro. As mudas são avaliadas 7 dias após o tratamento. Os sintomas observados incluem: ardência, deformação, branqueamento, atividade herbicida é observada na folha seguinte acima da folha tratada na Tasneira, Mostarda e Erva-moura. Nenhuma atividade sistêmica é observada nas gramas testadas. Em um segundo experimento. Cinco frações do mesmo extrato bruto (10 mg/ml) são avaliados usando o mesmo desenho experimental como descrito acima. Mudas de Mostarda, Trigo e Capim-da-roça são tratados. Sete e 20 dias após o tratamento, os sintomas de atividade de herbicida são observados em Mostarda de quatro das cinco frações (091113B4F6, 091113B4F7, 091113B4F8 e 091113B4F9)usando uma coluna C-18 (Fenomenex Sepra C18-E, 50 pm, 65Â). Os sintomas são observados na folha seguinte à folha tratada. Nenhuma atividade sistêmica é observada nas gramas testadas.
3. Exemplo 3. Burkholderia sp. como um Inseticida 3.1. Estudos de Atividade de Contato
[000119] O seguinte ensaio é usado na fase de triagem inicial para determinar se os compostos derivados de uma cultura das novas espécies Burkholderia tem atividade de contato contra uma praga Lepidopteran (larva). É ainda usado como uma ferramenta para o fracionamento guiado pelo bioensaio para determinar as frações ativas e picos derivados do extrato de caldo de célula completa. O teste é conduzido em copas plásticos individuais de 1,25 oz usando lagarta de repolho (Tricoplusia ni) larva de terceiro estágio tardio ou lagarta de cereais de beterraba (Spodoptera exigua) em terceiro estágio precoce. Uma peça de 1cm x 1cm de dieta sólida de lagarta de cereais de beterraba é colocada no centro de cada copo junto com uma larva. Uma alíquota de 1DX 1cm de dieta sólida de lagarta de cereais de beterraba é colocada no centro de cada copo juntBurkholderia A396) é injetado em cada tórax de larva (lado dorsal) usando uma seringa de precisão Hamilton. Cada tratamento é replicado dez vezes. A água é usada como um tratamento de controle negativo e malation como o tratamento de controle positivo. Após a injeção, cada copo é coberto com parafilme com um orifício para ar, e os copos são incubados por três dias a 26°C. As avaliações de mortalidade são feitas diariamente, começando em 24 após o tratamento.
[000120] As figuras 4 e 5 apresentam os resultados de testes de atividade de contato. De acordo com os resultados, o caldo esterilizado por filtro de uma cultura de Burkholderia sp matou cerca de 40% de todos os insetos dentro de 3 dias. O caldo diluído (50%) tem atividade inferior, resultando em cerca de 10% de controle em ambos os insetos testados.
3.2. Atividade Contra Larvas Através de Alimentação
[000121] A toxicidade direta através de alimentação é testada usando os testes de sobreposição de dieta seguindo o ensaio de placas de 96 poços usando placas de microtitulação com 200 pl de toxicidade direta através de lagarta de cereais de beterraba em cada poço. Cem (100) microlitros de cada amostra de teste é pipetada na parte superior da dieta (uma amostra em cada poço), e a amostra é deixada secar sob fluxo de ar até que a superfície esteja seca. Cada amostra (esterilizada por filtro através de filtro de 0,2 micron) é testada em seis replicatas, e água e um produto comercial Bt (B. thuringiensis) são usados como controles negativos e positivos, respectivamente. Uma larva em terceiro estágio do inseto teste (lagarta do repolho - Trichoplusia nr,lagarta de cereais de beterraba - Spodoptera exiqua; Nosema- Plutella xylostella) é colocada em cada poço, e a placa é coberta com cobertura plástica com orifícios para ar. As placas com insetos são incubados a 26°C por 6 dias com avaliações diárias de mortalidade.
[000122] A figura 5 representa dados de um estudo de sobreposição de direta com larvas de lagarta de cereais de beterraba (Spodoptera exigua) em terceiro estágio precoce tratada em quatro diferentes concentrações de caldo: 1x (100%) ,1/4x (25%), 1/8x (12,5%), 1/16x (6,125%). Os dados mostram que o caldo não diluído esterilizado em filtro é capaz de gerar 100% de controle no fim do período de incubação de 7 dias. O controle semelhante é obtido com uma diluição de 4 vezes do caldo, e no fim do estudo, ambos os caldos não diluído e de 4 vezes são comparáveis a Bt usada como um controle positivo. No entanto, nenhum efeito de Bt é significativamente mais rápido do que os caldos de Burkholderia. A eficácia contra larvas de lagarta de cartucho é dependente da concentração do caldo, e as duas menores concentrações de caldo (12,5% e 6,125%) forneceram menos controle do que as duas maiores. No entanto, o desempenho da diluição 12,5% não é muito inferior do que a diluição de 25%. A diluição 16 vezes de caldo é claramente não eficiente suficiente, e este somente forneceu controle parcial (33%) da larva de lagarta de cereais durante este estudo de 7 dias. As taxas de mortalidade correspondentes para a mesma diluição usada em lagarta do repolho e larva de lagarta são um pouco maior com caldo de 6,125% matando 80% e 50% das larvas, respectivamente.
3.3. Atividade in vitro contra insetos sugadores
[000123] Cinco percevejos (Euschistussp.) adultos são colocados em cada recipiente plástico de 16 oz alinhado com um pedaço de papel toalha. Um tubo de microcentrífuga tendo 2 ml_ de cada amostra teste (caldo completo esterilizado em filtro) é coberto com uma bola de algodão, e deitado no fundo do recipiente plástico. Uma semente de girassol é colocada próxima ao tubo como isca. Água e um produto comercial com uma mistura de piretrina e PBO em uma taxa recomendada são usadas como controles negativo e positivo, respectivamente. Cada recipiente é fechado com uma tampa, e são incubados a 25°C por 7 dias com verificações diárias de mortalidade.
[000124] Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 7 e mostraram cerca de 80% de controle de inseto sugador (percevejos) pelo dia 7 neste sistema in vitrocom caldo diluído a 50%. Neste estudo, o caldo de fermentação diluído de Burkholderia A396 é mais efetivo no controle de percevejos do que o produto comercial usado como um controle positivo. De modo interessante, o caldo não diluído resultou em controle inferior do inseto, que poderia ser uma indicação de propriedades antialimentares (inibição da alimentação) dos metabólicos ativos secundários produzidos por estas novas espécies de Burkholderia. Tabela 7. Efeito de A396 em Percevejos
Figure img0072
4. Exemplo 4. Teste de Inseto sugador in vivo
[000125] A eficácia in vivo do caldo de célula completa filtrado é testada em um ensaio de planta com plantas de mostarda e pulgão verde (Myzus persicae) com o inseto do teste. Plantas de mostarda Florida Broadleaf (Brassicasp.) de aproximadamente um mês de idade são pulverizadas com duas concentrações diferentes (1x e 0,5x) do caldo de célula completa esterilizada por filtro de Burkholderia sp. usando uma escova a ar Paasche. Água e um produto comercial de avermectina (Avid) são usados como controle negativo e positivo, respectivamente. As plantas são deixadas secar na bancada, após o qual são colocadas em um recipiente plástico de 6 copos com uma tampa com orifícios para ar. Dez pulgões em vários estágios de desenvolvimento são colocados em cada planta de teste, e as plantas são incubadas sob lâmpadas de crescimento por 7 dias a 25°C. As avaliações diárias para o número de pulgões em cada planta (sumarizado na Tabela 8 abaixo) são feitas e registradas em um caderno. Tabela 8. Eficácia in vivo de A396 em Pulgões de Pêssego Verde
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[000126] De acordo com os resultados, ambas as concentrações do caldo esterilizado em filtro derivado de uma cultura de uma nova espécie de Burkholderia são capazes de controlar o crescimento populacional de um inseto sugador, M. persicae.
5. Exemplo 5. Atividade Nematicida 5.1 Estudo #1
[000127] Para avaliar o efeito de caldo de cultura esterilizado em filtro de Burkholderia sp A396 na motilidade (e subsequente recuperação) de nematódeos juvenis de galhas (J2) (Meloidogyne incognita VW6), o seguinte teste é conduzido em placas plásticas de cultura de células de 24 poços:
[000128] Uma alíquota de 300 ul de cada solução teste (caldo esterilizado em filtro a 1x ou 0,5x) é adicionado em poços apropriados após o qual, quinze nematódeos dispensados em 10 pma alíquota de 300 ul de cada solução teste (caldo esterilizado em filtro a 1x ou 0,5x) 25°C por 24 horas. Água e Avid em diluição de 20.000x são usados como controles negativo e positivo, respectivamente. O efeito de cada composto na mobilidade de nematoide é verificado após 24 horas por sondagem de cada nematoide com uma agulha, e a proporção de nematódeos imóveis em cada tratamento é registrado em um caderno usando uma escala em %. Para avaliar a recuperação de mobilidade em cada tratamento, um volume de 200 pada tratamento, um volume de 200 a nematoide com uma agulha, e a proporção de nematódeos imóveis em As placas são novamente incubadas por 24 horas conforme descrito acima, após o qual a segunda avaliação de mobilidade é realizada.
[000129] Os resultados apresentados na figura 6 mostram o caldo esterilizado por filtro em ambas as concentrações de teste podem imobilizar os nematoides de vida livre das galhas juvenis. Este efeito dura pelo menos 24 horas, o que sugere que o caldo de Burkholderia A396 pode ser usado para prevenir as plantas de infecções por nematoides.
5.2 Estudo #2 Materiais e Métodos
[000130] Teste Mini Dose: Caldo de célula total de Burkholderia A396 é testado em um ensaio em estufa em potes de 45 ml. Sementes de pepino cv. Toshka são plantadas diretamente em potes preenchidos com um solo arenoso. Dez dias depois, os potes foram, cada um, tratados com 5 ml de uma suspensão. As quantidades específicas são mostradas na Tabela 9: Tabela 9.
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[000131] Como indicado na Tabela 9, os potes são inoculados com 3000 ovos de M. incognita.Quatro replicatas foram preparadas para cada tratamento e taxa. O ensaio foi colhido quatorze dias após aplicação e inoculação do ensaio. Galhada de raiz foi avaliada de acordo com o índice de galha de Zeck (Zeck, 1971). A fitotoxicidade foi medida como uma redução de galhada de raiz em comparação ao controle. Os resultados são mostrados nas figuras 9 e 10.
[000132] No Teste de Mini Poção no. 1 (ver figura 9), a atividade do tratamento foi muito alta e uma redução de quase 100% observada quando aplicado em uma concentração de 100 ml/L Burkholderia A396. Fostiazato desempenhou como usual (100% controle a 20 ppm). [000133] No Teste de Minipoção no. 2 (ver figura 10) 100% de redução de galhada de raiz foi obtido na concentração mais alta de 100 ml/L caindo para aproximadamente 50% a 1,5 ml/L.Fostiazato desempenhou como usual (100% controle a 20 ppm).
5.3 Estudo #3
[000134] Para demonstrar a atividade nematicida de Burkholderia A396, um estudo em estufa em pepino (Cucumis sativus) é realizado usando um caldo de célula completa de Burkholderia A396 como o produto de teste para controlar nematódeos de galhas (Meloidogyne incognita).Uma planta de pepino por pote é plantada em solo e crescida em uma estufa sob luz artificial a 28°C. Cada pote com uma planta é tratada com uma alíquota (cerca de 80 ml_) de produto teste não diluído ou um produto teste diluído a 5% com água. Cada tratamento com Burkholderia A396 bem como um tratamento com controle positivo com Temik (em uma taxa do rótulo) e um controle negativo sem adições consistiu de cinco replicatas. As plantas são crescidas em uma estufa por 60 dias, após o qual cada planta foi colhida e avaliada para pesos de broto e raízes frescos. O número de ovos de nematoides em cada pote foi registrado e um parâmetro indicando o número de ovos por um grama de massa de raiz foi calculado. Análise estatística (ANOVA) é realizada o e as diferenças estatísticas entre as médias de tratamento em p<0,1 foram calculadas. Os dados apresentados na Tabela 10 abaixo mostram que até embora não estatisticamente diferentes do controle não tratado, os potes tratados com caldo de célula completa de A396 continha menos ovos de nematoides do que os potes de controles não tratados. O efeito calculado como número de ovos por massa de raiz é mais claro quando o caldo não diluído é usado como um tratamento. Tabela 10.
[000135] Efeito de caldo de célula total de A396 no peso de broto e raiz de pepino, número total de ovos de M. incognitapor pote e o número de ovos por grama de massa de raiz.
Figure img0075
6. Exemplos 6. Isolamento de Templazol A e B Métodos e materiais
[000136] O seguinte procedimento é usado para a purificação de Templazol A e B extraído da cultura de célula de Burkholderia sp (ver figura 7):
[000137] O caldo de cultura derivado de fermentação de 10 L de Burkholderia (A396) em meio de crescimento Hy soja é extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) agitando a suspensão celular com resina em 225 rpm por duas horas em temperatura ambiente. A resina e massa de célula são coletadas por filtração através de talagarça e lavada com água Dl para remover sais. A resina, massa de células e talagarça são então submersos por 2 h em acetona após o qual a acetona é filtrada e seca em vácuo usando evaporador rotatório para gerar o extrato bruto. O extrato bruto é então fracionado usando cromatografia líquida de fase reversa C18 em vácuo (H2O/CH3OH; gradiente 90:20 a 0:100%) para gerar 10 frações. Estas frações são então concentradas até secagem usando evaporador rotatório e os resíduos secos resultantes são triados para atividade biológica usando placas de ensaio de semeadura de alface de 96 placas. As frações ativas são então submetidas à HPLC de fase reversa (sistema Spectra P4000 (Thermo Scientific)) para gerar compostos puros, que são então triados nos bioensaios acima mencionados para localizar /identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados adicionais de espectroscopia como LC/MS e RMN são registrados.
[000138] A fração ativa 4 é purificada ainda usando coluna HPLC C- 18 (Fenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema de solvente gradiente água:acetonitrila (0 a 10 min; 80% CH3CN aquoso, 10 a 25 min; 80 - 65% CH3CN aquoso, 25 a 50 min; 65 a 50% CH3CN aquoso, 50 a 60 min; 50 a 70% CH3CN, 60 a 80 min; 70 a 0% CH3CN aquoso, 80 a 85 min; 0 a 20% CH3CN aquoso) em fluxo 8 mL/min e detecção UV de 210 nm, para gerar templazol B, tempo de retenção de 46,65 min. A outra fração ativa 6 é ainda purificada usando coluna HPLC C-18 (Fenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema de solvente gradiente água:acetonitrila (0 a 10 min; 80% CH3CN aquoso, 10 a 25 min; 80 a 60% CH3CN aquoso, 25 a 50 min; 60 a 40% CH3CN aquoso, 50 a 60 min; 40% CH3CN, 60 a 80 min; 40 a 0% CH3CN aquoso, 80 a 85 min; 0 a 20% CH3CN aquoso) em fluxo 8 mL/min e detecção UV de 210 nm, para gerar templazol A, tempo de retenção 70,82 min.
[000139] Análise de espectroscopia de massa de compostos puros é realizada em um instrumento eletropulverização Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando ambos os modos de ionização positivo e negativo em um modo de varredura total (m/z 100-1500 Da) em um espectrômetro de massa LCQ DECA XPplus (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Instrumento Thermo de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detector Finnigan Surveyor PDA plus, autoamostrador plus, bomba MS e uma coluna 4,6 mm x 100 mm Luna C18 5 pm (Fenomenex). O sistema de solvente consiste em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel começa em 10% solvente B e é linearmente aumentada a 100% solvente B por 20 min e em seguida mantido por 4 min, e finalmente retomando a 10% solvente B por 3 min e mantido por 3 min o fluxo é 0,5 mL/min. O volume de injeção foi 10 pL e as amostras são mantidas em temperatura ambiente em um auto amostrador. Os compostos são analisados por LC-MS usando LC e cromatografia de fase reversa. Análise de espectroscopia de massa dos presentes compostos é realizada sob as seguintes condições: Fluxo de gás nitrogênio foi fixado em 30 e 15 arb para o invólucro e fluxo de gás aux/arraste, respectivamente. Ionização por eletropulverização foi realizada com uma voltagem de spray ajustado em 5000 V uma voltagem capilar a 35,0 V. A temperatura capilar foi ajustada para 400°C. Os dados foram analisados em Xcalibur software. O composto ativo templazol A tem uma massa molecular de 298 e mostrou íon m/z em 297,34 em modo de ionização negativo. O cromatograma LC-MS para templazol B sugere uma massa molecular de 258 e apresentou íon m/z em 257,74 modo de ionização negativo.
[000140] Espectros de 1H, 13C e 2D RMN foram medidos em um espectrômetro de campo gradiente Bruker 500 MHz & 600 MHz. A referência é ajustada no padrão interno tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm).
[000141] Para elucidação da estrutura de templazol A, o composto purificado com um peso molecular 298 é ainda analisado usando um instrumento 500 MHz RMN, e tem valores 1H RMN δ em 8,44, 8,74, 8,19, 7,47, 7,31, 3,98, 2,82, 2,33, 1,08 e tem valores 13C RMN δ de 163,7, 161,2, 154,8, 136,1, 129,4, 125,4, 123,5, 123,3, 121,8, 121,5, 111,8, 104,7, 52,2, 37,3, 28,1, 22,7, 22,7. Templazol A tem bandas de absorção de UV em 226, 275, 327 nm, que sugere a presença de anéis indol e oxazois. A fórmula molecular, C17H18N2O3, foi determinada por interpretação de dados de 1H, 13C RMN e HRESI MS m/z 299,1396 (M+H)+ (Calculados para C17H19N2O3, 299,1397), que implica um alo grau de insaturação mostrado por 10 duplas ligações equivalentes. O espectro de 13C RMN revelou sinais para todos os 17 carbonos, incluindo dois metis, um metóxi, um carbono metileno, uma metina alifática, um éster carbonila, e onze carbonos aromáticos. A presença de 3'-substituído indol foi revelada de dados espectrais 1H-1H COSY e HMBC. 1H-1H COSY e HMBC também indicaram a presença de um grupo éster metil de ácido carboxílico e uma cadeia lateral - CH2-CH-(CH3)2. A partir da análise detalhada de dados 1H-1H COSY, 13C, e HMBC foi derivado que o composto continha um núcleo oxazol. A partir de análise 2D foi demonstrado que a cadeia lateral iso-butil foi unida na posição C-2, um éster metil de ácido carboxílico na posição C-4 e a unidade indol na posição C-5 para gerar templazol A.
[000142] O segundo composto herbicidamente ativo, templazol B, com um peso molecular 258 é ainda analisado usando um instrumento 500 MHz RMN, e tem valores 1H RMN δ em 7,08, 7,06, 6,75, 3,75, 2,56, 2,15, 0,93, 0,93 e valores 13C RMN de δ 158,2, 156,3, 155,5, 132,6, 129,5, 129,5, 127,3, 121,8, 115,2, 115,2, 41,2, 35,3, 26,7, 21,5, 21,5. A fórmula molecular é designada como C15H18N2O2, que é determinada por interpretação de 1H, 13C RMN e dados de massa. O espectro 13C RMN revelou sinais para todos os 15 carbonos, incluindo dois metis, dois carbonos metilenos, uma metina alifática, uma amida carbonila, e nove carbonos aromáticos. A natureza geral de uma estrutura foi deduzida de espectros de 1H e 13C RMN que mostrou um anel aromático para-substituído [δ 7,08 (2H, d, J = 8,8 Hz), 6,75 (2H, d, J = 8,8 Hz), e 132,7, 129,5, 115,2, 127,3, 115,2, 129,5], O espectro de 1H RMN desta estrutura junto com os espectros 1H-1H COSY e HSQC, mostraram sinais característicos para uma fração isobutila [δ 0,93 (6H, d, J = 6,9 Hz), 2,15 (1H, sept, J = 6,9 Hz), 2,57 (2H, d, J = 6,9 Hz). Além disso, um próton olefínico/aromático (δ 7,06, s), e um grupo carbono carbonila (δ 158,9) foram ainda encontrados no espectro de 1H e 13C RMN. Na inspeção dos espectros HMBC, o sinal H-T na fração isobutila correlacionada com o carbono olefinico (C-2, δ 156,3), e o próton olefinico H-4 correlacionado com (C-5, δ 155,5; C-2, 156,3 e C-1", 41,2). O sinal de metileno em δ 3,75 correlacionado com C-5, C- 4 bem como C-2" da fração aromática para-substituida. Todas estas correlações observadas sugeriram a conectividade entre isobutila, e as frações benzila para-substituídas para o esqueleto da estrutura como mostrado. Além disso, o grupo carboxamida é designado na posição para da fração benzila baseado na correlação HMBC do próton aromático na posição H-4"e H-6". Assim, baseado nos dados acima, a estrutura foi designada como templazol B.
7. Exemplo 7. Isolamento de FR90128
[000143] O caldo de célula completa de fermentação de Burkholderia sp. em um meio de crescimento indefinido com resina Amberlite XAD- 7 (Asolkar et al., 2006) agitando a suspensão celular com resina em 225 rpm por duas horas em temperatura ambiente. A resina e massa de célula são coletadas por filtração através de talagarça e lavada com água Dl para remover sais. A resina, massa de células e talagarça são então submersos por 2 h em acetona após o qual a acetona é filtrada e seca em vácuo usando evaporador rotatório para gerar o extrato bruto. O extrato bruto é então fracionado usando cromatografia líquida de fase reversa C18 em vácuo (H2O/CH3OH; gradiente 90:20 a 0:100%) para gerar 10 frações. Estas frações são então concentradas até secagem usando evaporador rotatório e os resíduos secos resultantes são triados para atividade biológica usando bioensaio de inserto bem como bioensaio herbicida. As frações ativas são então submetidas à HPLC de fase reversa/normal (sistema Spectra P4000 (Thermo Scientific)) para gerar compostos puros, que são então triados nos bioensaios de herbicida, inseticida e nematicida descritos abaixo para localizar /identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados adicionais de espectroscopia como LC/MS e RMN são registrados.
[000144] Análise de espectroscopia de massa de picos ativos é realizada em um instrumento eletropulverização Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando ambos os modos de ionização positivo e negativo em um modo de varredura total (m/z 100 a 1500 Da) em um espectrômetro de massa LCQ DECA XPplus (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Instrumento Thermo de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detector Finnigan Surveyor PDA plus, autoamostrador plus, bomba MS e uma coluna 4,6 mm x 100 mm Luna C18 5 pm (Fenomenex). O sistema de solvente consiste em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel começa em 10% solvente B e é linearmente aumentada para 100% solvente B por 20 min e então mantido por 4 min, e finalmente retornado a 10% solvente B por 3 min e mantido por 3 min. O fluxo é 0,5 mL/min. O volume de injeção é 10 pL e as amostras são mantidas em temperatura ambiente em um auto amostrador. Os compostos são analisados por LC-MS usando LC e cromatografia de fase reversa. Análise de espectroscopia de massa dos presentes compostos é realizada sob as seguintes condições: Fluxo de gás nitrogênio foi fixado em 30 e 15 arb para o invólucro e fluxo de gás aux/arraste, respectivamente. Ionização por eletropulverização é realizada com uma voltagem de spray ajustado em 5000 V uma voltagem capilar a 35,0 V. A temperatura capilar foi ajustada para 400°C. Os dados são analisados em Xcalibur software. Baseado na análise LC-MS, o composto ativo inseticida da fração 5 tem uma massa molecular de 540 em modo de ionização negativo.
[000145] Para elucidação da estrutura, o composto purificado inseticida da fração 5 com peso molecular 540 é ainda analisado usando um instrumento 500 MHz RMN e tem valores 1H RMN em 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23. 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; e tem valores 13C RMN de 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51. Os dados RMN indicam que o composto contém amino, éster, ácido carboxílico, metil alifático, etila, metileno, oximetileno, metina, oximetina e grupos enxofre. A análise detalhada de 1D e 2D RMN confirma a estrutura para o composto como FR90128 como um composto conhecido.
8. Exemplo 8. Atividade Herbicida de FR90128
[000146] A atividade herbicida do composto ativo FR90128 (MW 540) é testada em um ensaio de laboratório usando mudas de grama celeiro de uma semana de vida (Echinochloa crus-gallí) em uma plataforma de placa de 96 poços. Uma muda de grama foi colocada em cada um dos poços tendo 99 microlitros de água Dl. Uma alíquota de um microlitro do composto puro em etanol (10 mg/mL) é adicionada em cada poço, e a placa é fechada com uma tampa. Um microlitro de etanol em 99 microlitros de água é usado como um controle negativo. Os tratamentos foram feitos em oito replicatas, e a placa fechada é incubada em uma estufa sob luz artificial (12 horas de ciclo de claro/escuro). Após cinco dias, os resultados são lidos. As mudas de grama em todos os oito poços que receberam o composto ativo são mortas sem tecido verde à esquerda, enquanto que as mudas nos poços de controle negativo foram ativamente crescidas.
9. Exemplo 9. Atividade Inseticida de FR90128
[000147] A atividade inseticida do composto ativo FR90128 (MW 540) é testada em um ensaio de laboratório usando um sistema de bioensaio de contato. O composto é dissolvido em 100% etanol em concentrações de 0,001, 0,005, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, e 0,5 pg/pL. lagarta de cereais de beterraba individuais no terceiro estágio precoce, Spodoptera exigua, as larvas são colocadas em copos plásticos de (1,25 onça) com uma peça de 1 cm2 de dieta artificial (Bio- Serv). Uma micropipeta Hamilton é usada para aplicar 1 pL de composto ao tórax de cada larva. Os copos são cobertos com parafilme esticado e um único orifício é cortado no parafilme para aeração. Dez larvas por concentração são tratadas. O ensaio é incubado a 25°C, 12h luz/12h escuro. As larvas são marcadas em 48 e 72 horas após a aplicação. Análise Probit é realizada para avaliar o valor de LCso que é encontrado para o composto (MW 540) como 0,213.
10. Exemplo 10. Isolamento de Templamida A, B, FR901465 e FR90128 Métodos e materiais
[000148] O seguinte procedimento é usado para a purificação de compostos extraídos da cultura de célula de Burkholderia sp (ver figura 7):
[000149] O caldo de cultura derivado de fermentação de 10 L de Burkholderia (A396) em meio de crescimento Hy soja é extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) agitando a suspensão celular com resina em 225 rpm por duas horas em temperatura ambiente. A resina e massa de célula são coletadas por filtração através de talagarça e lavada com água Dl para remover sais. A resina, massa de células e talagarça são então submersos por 2 h em acetona após o qual a acetona é filtrada e seca em vácuo usando evaporador rotatório para gerar o extrato bruto. O extrato bruto é então fracionado usando cromatografia líquida de fase reversa C18 em vácuo (H2O/CH3OH; gradiente 90:20 a 0:100%) para gerar 10 frações. Estas frações são então concentradas até secagem usando evaporador rotatório e os resíduos secos resultantes são triados para atividade biológica usando placas de ensaio de semeadura de alface de 96 placas (herbicida) e ensaio de lagartas de cartucho da beterraba no terceiro estágio (inseticida). As frações ativas são então submetidas repetidamente à HPLC de fase reversa (sistema Spectra P4000 (Thermo Scientific)) para gerar compostos puros, que são então triados nos bioensaios acima mencionados para localizar /identificar os compostos ativos. Para confirmar a identidade do composto, dados adicionais de espectroscopia como LC/MS e HRMS, RMN são registrados.
[000150] A fração ativa 5 é purificada ainda usando coluna HPLC C- 18 (Fenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema de solvente gradiente água:acetonitrila (0-10 min; 80% CH3CN aquoso, 10-25 min; 80 - 65% CH3CN aquoso, 25-50 min; 65 - 50% CH3CN aquoso, 50-60 min; 50 - 70% CH3CN aquoso, 60-80 min; 70 - 0% CH3CN aquoso, 80-85 min; 0 - 20% CH3CN aquoso) em fluxo de 8 mL/min e detecção UV de 210 nm, para gerar templamida A, tempo de retenção 55,64 min e FR901465, tempo de retenção 63,59 min e FR90128, tempo de retenção 66,65 min respectivamente. A outra fração ativa 6 é purificada ainda usando coluna HPLC C-18 (Fenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema de solvente gradiente água:acetonitrila (0 a 10 min; 70 a 60% CH3CN aquoso, 10 a 20 min; 60 a 40% CH3CN aquoso, 20 a 50 min; 40 a 15% CH3CN aquoso, 50 a 75 min; 15 a 0% CH3CN, 75 a 85 min; 0 a 70% CH3CN aquoso) em fluxo 8 mL/min e detecção UV de 210 nm, para gerar templamida B, tempo de retenção 38,55 min.
[000151] Análise de espectroscopia de massa de compostos puros é realizada em um instrumento eletropulverização Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando ambos os modos de ionização positivo e negativo em um modo de varredura total (m/z 100 a 1500 Da) em um espectrômetro de massa LCQ DECA XPpIus (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Instrumento Thermo de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com detector Finnigan Surveyor PDA plus, autoamostrador plus, bomba MS e uma coluna 4,6 mm x 100 mm Luna C18 5 pm (Fenomenex). O sistema de solvente consiste em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel começa em 10% solvente B e é linearmente aumentada para 100% solvente B por 20 min e então mantido por 4 min, e finalmente retornado a 10% solvente B por 3 min e mantido por 3 min. O fluxo é 0,5 mL/min. O volume de injeção é 10 pL e as amostras são mantidas em temperatura ambiente em um auto amostrador. Os compostos são analisados por LC-MS usando LC e cromatografia de fase reversa. Análise de espectroscopia de massa dos presentes compostos é realizada sob as seguintes condições: Fluxo de gás nitrogênio foi fixado em 30 e 15 arb para o invólucro e fluxo de gás aux/arraste, respectivamente. Ionização por eletropulverização é realizada com uma voltagem de spray ajustado em 5000 V uma voltagem capilar a 45,0 V. A temperatura capilar foi ajustada para 300°C. Os dados são analisados em Xcalibur software. O composto ativo templamida A tem uma massa molecular de 555 baseado no pico m/z em 556,41 [M + H]+ e 578,34 [M + Na]+ em um modo de ionização positivo. A análise LC-MS em modo de ionização positivo para templamida B sugere uma massa molecular de 537 baseado em íons m/z a 538,47 [M + H]+ e 560,65 [M + Na]+. O peso molecular para os compostos FR901465 e FR90128 são designados como 523 e 540 respectivamente com base na análise de LCMS.
[000152] Espectros 1H, 13C e 2D RMN são medidos em um espectrômetro de campo gradiente Bruker 600 MHz. A referência é ajustada no padrão interno tetrametilsilano (TMS, 0,00 ppm).
[000153] Para elucidação da estrutura de templamida A, o composto purificado com peso molecular 555 é ainda analisado usando um instrumento 600 MHz RMN, e tem valores 1H RMN δ em 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04 e tem valores 13C RMN de δ 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41. O espectro 13C RMN apresenta 28 sinais discretos de carbono que são atribuídos a seis metilas, quatro carbonos metilenos, e treze metinas incluindo cinco carbonos sp2, quatro quaternários. A fórmula molecular, C28H45NO10, é determinada por interpretação de dados 1H, 13C RMN e HRESI MS. A análise detalhada de dados espectrais de 1H- 1H COSY, HMBC e HMQC revelam as seguintes subestruturas (I - IV) e dois grupos isolados metileno & metil singletos. Estas subestruturas são conectadas posteriormente usando as correlações principais HMBC para gerar a estrutura planar para 0 composto, que ainda não foi reportado na literatura e designado como templamida A. Esta molécula policetida contém dois anéis tetra-hidropiranose, e uma amida conjugada.
Figure img0076
[000154] Subestruturas l-IV designada por análise de dados espectroscópicos de 1D e 2D RMN.
[000155] A análise de (+) para 0 segundo composto herbicida, mostra íons m/z em 538,47 [M + H]+ e 560,65 [M + Na]+ correspondendo ao peso molecular de 537. A fórmula molecular de C28H43NO9 é determinada por interpretação de análise de dados de ESIMS e RMN. O 1H e 13C RMN deste composto é semelhante ao de templamida A exceto que um novo-CH2- isolado aparece no grupo não acoplado de metileno em templamida A. A pequena constante de acoplamento germinal de 4,3 Hz é característica da presença de um grupo epóxido metileno. A presença deste epóxido é ainda confirmada a partir do deslocamento 13C RMN de 60,98 em templamida A para 41,07 no composto com MW 537. As diferenças de fórmulas moleculares entre estes dois compostos é razoavelmente explicada por eliminação da molécula de água seguida por formação de epóxido. Assim, com base em análise de RMN e MS a estrutura para o novo composto foi atribuída e foi designada como templamida B.
[000156] Para elucidação da estrutura, o composto purificado da fração 5 com peso molecular 523 é ainda analisado usando um instrumento 600 MHz RMN, e tem valores1H RMN δ a 6,41, 6.40, 6,01, 5,98, 5,68, 5,56, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,65, 3,59, 3,55, 3,50, 2,44, 2,26, 2,04, 1,96, 1,81, 1,75, 1,37, 1,17, 1,04; e tem valores 13C RMN δ a 172,22,167,55, 144,98, 138,94, 135,84, 130,14, 125,85,123,37, 99,54, 82,19,78,28,76,69,71,31,70,13, 69,68, 48,83, 42,52, 36,89, 33,11, 30,63, 25,99, 21,20, 20,38, 18,14, 14,93, 12,84. A análise detalhada de 1H e 13C RMN do composto sugeriu que este composto foi quase semelhante ao composto templamida B; a única diferença foi na cadeia lateral éster; uma fração acetato estava presente no lugar de uma fração propionato na cadeia lateral. A análise detalhada de 1D e 2D RMN confirma a estrutura para o composto como FR901465 como um composto conhecido.
[000157] Baseado na análise LC-MS, o outro composto ativo da fração 5 tem uma massa molecular de 540 em modo de ionização negativo. Para elucidação da estrutura, o composto purificado da fração 5 com peso molecular 540 é ainda analisado usando um instrumento 500 MHz RMN, e tem valores 1H RMN δde 6,22, 5,81, 5,69, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93,3,22, 3,21, 3,15,3,10, 2,69, 2,62, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; e tem valores 13C RMN de 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51. Os dados RMN indicam que o composto contém amino, éster, ácido carboxílico, metil alifático, etila, metileno, oximetileno, metina, oximetina e grupos enxofre. A análise detalhada de 1D e 2D RMN confirma a estrutura para o composto como FR90128 como um composto conhecido.
11. Exemplo 11. Atividade Herbicida de Templamida A, Templamida B, FR901465e FR90128
[000158] A atividade herbicida de templamida A, B, FR901465 e FR90128 são testados em um ensaio de laboratório usando mudas de grama de celeiro de uma semana de idade (Echinochloa crus-gallí) e alface (Lactuca sativa L.) em uma plataforma de 96 placas. Uma muda é colocada em cada um dos poços tendo 99 microlitros de água Dl. Em cada poço, uma alíquota de um microlitro do composto puro em etanol (10 mg/mL) é adicionada em cada poço, e a placa é fechada com uma tampa. Um microlitro de etanol em 99 microlitros de água é usado como um controle negativo. Os tratamentos são feitos em oito replicatas, e a placa fechada é incubada em uma estufa sob luz artificial (12 horas de ciclo de claro/escuro). Após cinco dias, os resultados são lidos. As mudas de grama em todos os oito poços que receberam o composto ativo são mortas sem tecido verde à esquerda, enquanto que as mudas nos poços de controle negativo foram ativamente crescidas. A atividade herbicida de templamida A contra mudas de alface é ligeiramente menor do que para a grama. Por outro lado, templamida B fornece um melhor controle (100%) de mudas de alface (usado como um sistema modelo para ervas daninhas de folhas amplas) do que templamida A (Tabela 11). Tabela 11: Dados de bioensaio de Herbicida para Templamida A, B, FR901465 e FR90128
Figure img0077
110 pg/mL concentração por poço.
12. Exemplos 12. Atividade Inseticida de compostos ativos
[000159] As atividades inseticidas de templamida A, B, FR901465 e FR90128 são testadas em um ensaio de laboratório usando um ensaio de sobreposição de dieta de 96 poços com larvas de lagarta de cartucho da beterraba de primeiro estágio usando placas de microtitulação com 200 pl de dieta sólida artificial de lagarta de cartucho da beterraba em cada poço. Cem (100) microlitros de cada amostra de teste é pipetada na parte superior da dieta (uma amostra em cada poço), e a amostra é deixada secar sob fluxo de ar até que a superfície esteja seca. Cada amostra foi testada em seis replicatas, e água e um produto comercial Bt (B. thuringiensis) são usados como controles negativo e positivo, respectivamente. Uma larva de primeiro estágio do inseto teste (lagarta de cereais de beterraba - Spodoptera exiqua) foi colocada em cada poço, e a placa foi coberta com cobertura plástica com orifícios de ar. As placas com insetos foram incubadas a 26°C por 6 dias com avaliações diárias de mortalidade. Baseado nos resultados apresentados na Tabela 12, templamida A e B resulta em 40% e 80% de mortalidade, respectivamente. Tabela 12:
[000160] Dados de Bioensaio de Inseticida para Templamida A, B, FR901465 e FR90128 contra lagarta de cereais de beterraba de primeiro estágio (Spodoptera exígua).
Figure img0078
110 pg/mL concentração por poço.
Exemplo 11. Atividade Fungicida de FR90128 (MW 540)
[000161] Atividade fungicida de FR90128 (MW 540) contra três fungos patogênicos de plantas (Botrytis cinerea, Phytophtora sp., Monilinia fructicolá)é testada em um ensaio in vitro de placa PDA (ágar dextrose de batata). As placas são inoculadas com os fungos usando um método de tampão. Após os fungos estabeleceram e começarem a crescer no meio de crescimento, oito discos de papeis estéreis são colocados em cada placa cerca de 1 cm da borda em um círculo. Dez microlitros de solução de etanol tendo 20, 15, 10, 7,5, 5, 2,5 1,25 mg FR90128/mL é adicionado em discos de papel filtro, e a solução é deixada evaporar. Um disco embebido com 10 plde etanol puro é usado como um controle negativo. O ensaio é realizado com três replicatas. As placas são incubadas em temperatura ambiente por 5 dias, após o qual a atividade fungicida é registrada por medição da zona de inibição ao redor de cada disco de papel filtro correspondente às diferentes concentrações de FR90128. De acordo com os resultados, FR90128 não tem efeito no crescimento de Monilinia, mas é efetivo no controle de crescimento de hifas de ambos Botrytis e Phytophtora. Parece haver uma clara relação dose-resposta na inibição com concentrações limiares de 10 mg/mL e 1,25 mg/mL para Botrytis e Phytophtora, respectivamente (figura 8).
DEPÓSITO DE MATERL BIOLÓGICO
[000162] O seguinte material biológico foi depositado nos termos do Tratado de Budapeste com a Coleção de Cultura de Pesquisa em Agricultura (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, e receberam os seguintes números:
Burkholderia sp. A396 NRRL B-50319
[000163] A cepa foi depositada em condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente a alguém determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas com direito ao mesmo de acordo com 37 C.F.R. §1,14 e 35 U.S.C. §122. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como requerido por leis internacionais de patentes em países em que as contrapartes do pedido objeto, ou sua descendência, são depositadas. No entanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção objeto em derrogação de direitos de patentes concedidos por ação governamental.
[000164] A invenção descrita e as reivindicações aqui não são limitadas no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são destinados a serem ilustrações dos vários aspectos da invenção. Pretende-se que qualquer aspecto equivalente tem a intenção de estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes aos especialistas na técnica da descrição anterior. Também se pretende que essas modificações caiam dentro do escopo das reivindicações anexadas. No caso de conflito, a presente revelação incluindo as definições prevalecerá.
[000165] Várias referências são citadas aqui, cujas descrições são incorporadas por referência em suas totalidades.
Literatura citada:
[000166] Anderson, et al. "The structure of thiostrepton," Nature 225: 233-235. 1970.
[000167] Andra, "Endotoxin-like properties of a rhamnolipid exotoxin from Burkholderia (Pseudomonas) plantarir. immune cell stimulation and biophysical characterization." Biol. Chem. 387: 301-310. 2006.
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Claims (12)

1. Método para produzir FR901228, FR901465, Templamida A, Templamida B, Templazol A, ou Templazol B, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma cepa de uma Burkholderia A396 (N.° de Acesso NRRL B-50319), e produzir ditos compostos, em que os compostos possuem a seguinte estrutura química:
Figure img0079
(FR901228)
Figure img0080
(FR901465)
Figure img0081
(Templamida A)
Figure img0082
(Templamida B)
Figure img0083
(Templazol A)
Figure img0084
(Templazol B)
2. Método para modular a infestação de praga em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende aplicar à planta e/ou sementes da mesma e/ou substrato usado para crescimento de dita planta uma quantidade de uma combinação compreendendo Burkholderia A396 (N.° de Acesso NRRL B-50319), ou uma composição compreendendo o composto isolado possuindo atividade pesticida selecionado de (i) um composto possuindo a estrutura
Figure img0085
(ii) um composto possuindo a estrutura
Figure img0086
Templamida A (iii) um composto possuindo a estrutura
Figure img0087
Templamida B (iv) um composto possuindo a estrutura
Figure img0088
(Templazol A) em que carboxílico; e (v) um composto possuindo a estrutura
Figure img0089
(Templazol B) em que R e isubutil. eficaz para modular dita infestacao dap raga.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a praga é um fungo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a praga é um inseto.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a praga é uma erva daninhas monocotiledôneas, junça ou dicotiledôneas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o método modula a emergência e/ou crescimento de ervas daninhas monocotiledôneas, junça ou dicotiledôneas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo a cepa isolada é aplicada.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o composto isolado possuindo a estrutura
Figure img0090
é aplicada.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o composto isolado possuindo a estrutura
Figure img0091
Templamida A e aplicada.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o composto isolado possuindo a estrutura
Figure img0092
Templamida B é aplicada.
11. Método, reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o composto isolado possuindo a estrutura
Figure img0093
(Templazol A) é aplicada, em que R1 é isobutil e R2 é éster metílico do ácido carboxílico.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o composto isolado possuindo a estrutura
Figure img0094
(Templazol B) é aplicada, em que R1 é isobutil.
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