BR112012017188B1

BR112012017188B1 - Agonistas de glutamato metabotrópico (mglu2), e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112012017188B1
Application number: BR112012017188-7A
Authority: BR
Inventors: James Allen Monn
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2021-06-22
Also published as: SI2516406T1; HN2012001160A; DK2516406T3; MX2012007332A; JP2013514974A; AR079343A1; KR20120094056A; TN2012000281A1; EP2516406A1; TWI477490B; PE20121688A1; RS53063B; PT2516406E; CN102695701B; CN102695701A; KR101395356B1; SG181836A1; BR112012017188A2; JO2978B1; PL2516406T3

Abstract

agonistas de mglu2. a presente invenção refere-se a novos agonistas de mglu2 úteis no tratamento de distúrbios bipolar, esquizofrenia, depressão e distúrbio de ansiedade generalizada. os novos agonistas são representados pela fórmula

Description

[0001] A presente invenção se refere a compostos agonistas de mGlu2, seus profármacos em particular e seus sais e solvatos e, mais especificamente a novos compostos biciclo[3.1.0]hexano 4- substituídos, seus profármacos em particular e seus sais e solvatos, assim como composições farmacêuticas e usos terapêuticos de tais compostos, profármacos em particular e seus sais e solvatos.

[0002] L-glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central e é referido como um aminoácido excitatório. Os receptores de glutamato metabotrópico (mGlu) são receptores acoplados a proteína G que modulam a excitabilidade neuronal. O tratamento de distúrbios neurológicos ou psiquiátricos tem sido relacionado à ativação seletiva de receptores de aminoácido excitatório mGlu. Vários estudos apoiam a ativação do Grupo II do receptor de mGlu (que inclui mGlu2 e/ou mGlu3) para o tratamento da esquizofrenia. Mais particularmente, dados recentes demonstram que um agonista do receptor de mGlu2/3 tem propriedades antipsicóticas e podem fornecer uma nova alternativa para o tratamento da esquizofrenia. Estudos demonstram que a atividade antipsicótica de mGlu2/3 é mediada por mGlu2. Estudos também demonstram que os agonistas de mGlu2/3 possuem propriedades ansiolíticas, antidepressivas e neuroprotetoras. Portanto, os agonistas de mGlu2 podem ser úteis no tratamento de distúrbios psiquiátricos, tais como distúrbio bipolar, também conhecido como distúrbio maníaco depressivo, esquizofrenia, depressão e distúrbio de ansiedade generalizada.

[0003] WO9717952 descreve certos compostos biciclo[3.1.0]hexano 4-substituídos declarados serem antagonistas ou agonistas de receptores metabotrópicos de glutamato. WO03104217 descreve compostos biciclo[3.1.0]hexano e heterobiciclo[3.1.0]hexano declarados serem formas de profármaco de compostos agonistas de receptor de mGluR2.

[0004] O tônus glutamatérgico excessivo tem sido implicado em vários estados de doença do sistema nervoso central; entretanto, agentes eficazes para corrigir tais estados fisiopatológicos estão ausentes na prática clínica. Em particular, a aplicação clínica não tem sido realizada devido à inexistência de agonistas de mGlu2 com propriedades semelhantes a um fármaco apropriadas. portanto, ainda existe a necessidade de agonistas potentes e eficazes de mGlu2. A presente invenção fornece novos biciclo[3.1.0]hexanos 4-substituídos, incluindo seus profármacos em particular que fornecem biodisponibilidade aumentada adequada para o desenvolvimento clínico, que são agonistas potentes e eficazes de mGlu2. Tais novos compostos da presente invenção podem ser direcionados para a necessidade de tratamentos potentes e eficazes de distúrbios psiquiátricos tais como distúrbio bipolar, esquizofrenia, depressão e distúrbio de ansiedade generalizada.

[0005] A presente invenção fornece um composto da Fórmula

em que R1é hidrogênio, R2é hidrogênio, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-aminopropanoíla, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoíla, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-amino-4-metil-pentanoíla, e R3 é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é 2-aminoacetila, e R3é hidrogênio; R1é benzila, R2é hidrogênio, e R3é benzila; ou R1é (2-flúorfenil)metila, R2é hidrogênio, e R3é (2- flúorfenil)metila; ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos ou um solvato do sal.

[0006] A presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0007] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

[0008] A presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- [[(2S)-2-aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0009] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

[00010] A presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- [[(2S)-2-amino-4-methilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00011] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4- metilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

[00012] A presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- [[(2S)-2-amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00013] Como uma modalidade particular, presente invenção fornece cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4-metil- pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico.

[00014] A presente invenção fornece ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00015] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico.

[00016] A presente invenção fornece dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2- amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00017] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece dibenzil(1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato.

[00018] A presente invenção fornece bis[(2-flúorofenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00019] Como uma modalidade particular, a presente invenção fornece cloridrato de bis[(2-flúorofenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2- amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato.

[00020] A presente invenção fornece ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico, sal de 2-[[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4- triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato.

[00021] A presente invenção fornece ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato em forma cristalina.

[00022] A presente invenção fornece ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato em forma cristalina caracterizado por um padrão de difração ao raio X que apresenta picos em 2θ ± 0,2 iguais a 18,61 e 21,07.

[00023] A presente invenção também fornece ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato em forma cristalina caracterizado por um padrão de difração ao raio X que apresenta picos em 2θ ± 0,2 a 18,61 em combinação com um ou mais picos selecionados do grupo que consiste em 21,07, 15,34, 14,74 e 19,20.

[00024] São compostos da presente invenção ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4-metil-pentanoil]amino]-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílicoo, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2-aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato e/ou bis[(2- flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

[00025] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil(1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

[00026] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato de, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilthio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

[00027] A presente invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio psiquiátrico, que compreende administrar a um paciente necessitado uma quantidade eficaz de um ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00028] A presente invenção fornece o uso de um ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio psiquiátrico.

[00029] A presente invenção fornece um ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2- amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato, para uso na terapia. A presente invenção também fornece um ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H- 1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-methil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou seu sal farmaceuticamente aceitável, dibenzil(1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato ou seu sal farmaceuticamente aceitável, bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)- 2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato ou seu sal farmaceuticamente aceitável, ou ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato, para uso no tratamento de um distúrbio psiquiátrico.

[00030] Adicionalmente, a presente invenção fornece modalidades preferidas dos métodos e usos como aqui descritos, nas quais o distúrbio psiquiátrico é selecionado do grupo que consiste em distúrbio bipolar, esquizofrenia, depressão e distúrbio de ansiedade generalizada.

[00031] Como usadas acima e ao longo da descrição da invenção, as seguintes expressões, a menos que estabelecido de outra maneira, devem ser compreendidas como possuindo os seguintes significados: "Sais farmaceuticamente aceitáveis"se referem a sais não tóxicos, inorgânicos ou orgânicos de compostos da presente invenção.

[00032] "Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" significa a quantidade do composto ou de seu sal farmaceuticamente aceitável ou de um solvato do sal da presente invenção ou de uma composição farmacêutica que contenha o composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável ou o solvato do sal da presente invenção, que desencadeie uma resposta biológica ou médica ou o efeito terapêutico desejado sobre um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que esteja sendo observado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro profissional de saúde.

[00033] As expressões "tratamento", "tratar", "tratando" e semelhantes são pretendidas incluir retardar ou reverter a progressão de uma doença. Essas expressões também incluem aliviar, melhorar, atenuar, eliminar ou reduzir um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição, mesmo que o distúrbio ou condição não seja realmente eliminado e mesmo que a progressão do distúrbio ou da condição não seja, por si só, retardada ou revertida.

[00034] Sob a nomenclatura padronizada usada através dessa descrição, a porção terminal da cadeia lateral designada é descrita primeiro, seguida pela funcionalidade adjacente em direção ao ponto de acoplamento. Por exemplo, um substituinte metilsulfonila é equivalente a CH3-SO2-.

[00035] Os compostos da presente invenção são capazes de reagir, por exemplo, com vários ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição ácida ou sais de adição básica farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e a metodologia comum para prepará-los são bem conhecidos na técnica, Veja, por exemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977.

[00036] Os compostos da presente invenção são formulados, preferivelmente como composições farmacêuticas que usam um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e administrados por uma variedade de vias. Preferivelmente, tais composições são para administração oral ou intravenosa. Tais composições farmacêuticas e processos para prepará-las são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro et al., eds. 21st. ed. Mack Publishing Co., 2005).

[00037] O composto ou compostos da presente invenção administrados na prática serão determinados por um médico sob circunstâncias relevantes, que incluem a condição a ser tratada, a escolha da via de administração, o composto ou compostos da invenção realmente administrados, a idade, peso e resposta do paciente individual e a severidade dos sintomas do paciente. As dosagens por dia normalmente caem dentro da faixa de cerca de 0,1 a cerca de 300 mg. Em algumas circunstancias, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa acima mencionada podem ser mais adequados, enquanto que em outros casos, doses ainda maiores podem ser empregadas.

[00038] Os compostos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, assim como aqueles descritos nas Preparações e Exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas de diferentes maneiras para preparar os compostos da presente invenção.

[00039] Os substituintes, a menos que indicado de outra maneira, são como definidos previamente. Os reagentes e materiais de partida estão prontamente disponíveis de modo geral para aquele versado na técnica. Outros podem ser feitos por técnicas padronizadas de química orgânica e de heterocíclicos, técnicas que são análogas à síntese de compostos estruturalmente similares conhecidos e os procedimentos descritos nas Preparações e Exemplos a seguir incluem quaisquer procedimentos novos. A nomenclatura das Preparações e Exemplos 1 a 7 a seguir é feita usando Symyx Draw 3.1. A nomenclatura do Exemplo 8 é feita usando o nome CAS de ACD Labs.

[00040] Como usadas aqui, as seguintes expressões possuem os significados indicados: "HPLC" se refere à cromatografia líquida de alta pressão; "LC" se refere a cromatografia líquida; "MS" se refere a espectroscopia de massa; "RMN" se refere a ressonância nuclear magnética; "TLC" se refere a cromatografia de camada fina; "EDTA" se refere ao ácido etlinodiaminotetracético; "PBS" se refere a salina tamponada com fosfato; "PCR" se refere a reação em cadeia da polimerase; "SCX" se refere à troca de cátion forte; e "HLB" se refere ao balanço hidrofílico-lipofílico. Preparação 1 diterc-butil (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(p- tolilsulfonilóxi) biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00041] Carrega-se um frasco de fundo redondo com 2 gargalos sob uma atmosfera de nitrogênio com diterc-butil (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-hidroxi-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (20,7 g, 0,5 mol, veja Wo03/104217/A2 para os detalhes da síntese), 4- dimetilaminopiridina (10,4 g, 0,85 mol), trietilamina (6,98 mL, 0,5 mmol) e cloreto de p-toluenossulfonila (10,6 g, 0,55 mol) em diclorometano (200 mL), e agita-se a mistura em temperatura ambiente por uma noite. Adiciona-se uma solução de sulfato de potássio hidrogênio 1N (200 mL), água (100 mL) e extrai-se a camada orgânica. Lava-se com água (200 mL), salmoura (200 mL), seca-seca-se sobre sulfato de magnésio, filtra-se e evapora-se até secar. Adicionam-se tetra-hidrofurano (30 mL) depois heptanos (90 mL). A mistura é aquecida é aquecida a 60°C e adicionam-se lentamente mais heptanos (200 mL). Resfria-se a mistura até a temperatura ambiente. Filtra- se o sólido e seca-seca-se a vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco (24,6 g, 87%). MS (m/z): 590 (M+23). Preparação 2 diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

Método 1:

[00042] Carrega-se sob atmosfera de nitrogênio um frasco de fundo redondo com diterc-butil (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4- (p-tolilsulfonilóxi) biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (462 g, 813,8 mmol), 1 H-1,2,4-triazol-3-tiol (88,2 g, 854,5 mmol), carbonato de potássio (123,7 g, 895,2 mmol) N,N-dimetilformamida (2,3 L) e agita-se a mistura a 80°C por 2 horas. Resfria-se a mistura de reação até a temperatura ambiente e depois adiciona-se éter metil-t-butílico (2,3 L) e água (4,6 L). Observa-se a evolução de gás que acompanha a lenta adição de hidrgenossulfato de potássio 1M (1,85 L). Extrai-se a mistura com éter metil-t-butilico (2,3 L) e descarta-se a fase aquosa. Lava-se sucessivamente com água (2,5 L), salmoura (2 L) e descartam-se as fases aquosas. Concentra-se até secar para fornecer um sólido (440 g). Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (20:80 to 70:30) para fornecer o composto do título como um sólido branco (305,6 g, 76%). MS (m/z): 497 (M+1).

Método 2:

[00043] Dissolvem-se diterc-butil (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-(p-tolilsulfonilóxi) biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato (1,31 g, 2,31 mmol) e 1H-1,2,4-triazol-3-tiol (0,31 g, 3 mmol) em N,N-dimetilformamida (7 mL), depois adiciona-se carbonato de potássio (639 mg, 4,62 mmol) e agita-se a mistura por uma noite a 80°C. Concentra- se até secar, dissolve-se novamente em acetato de etila e lava-se com uma solução de ácido cítrico 10% e salmoura 10%. Seca-seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se até secar. Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (10:90 a 80:20) para fornecer o composto do título (830 mg, 72%). MS (m/z): 497 (M+1). Preparação 3 Cloridrato de dietil(1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato.

Método 1:

[00044] Carrega-se um frasco de fundo redondo com diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de (305,6 g, 0,61 mol) e etanol (1,53 L). Adiciona-se cloreto de tionila lentamente (179,3 mL, 2,46 mol) (reação exotérmica a 45°C) e agita-se a mistura a 80°C por uma noite. Remove-se o solvente sob vácuo para obter uma espuma branca. Adiciona- se éter metil-t-butílico (2,5 L) e remove-se o solvente sob vácuo. Adiciona-se éter metil-t-butílico (2,5 L) e agita-se por uma noite. Filtra-se o sólido e lava- se com éter metil-t-butílico. Seca-se sob uma cortina de nitrogênio para obter o composto do título como um sólido branco (264,6 g, 0,7 mol). MS (m/z): 341 (M+1).

Método 2:

[00045] Dissolve-se diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato (830 mg, 1,67 mmol) em etanol (6,7 mL), resfria-se a mistura para 5oC e adiciona-se cloreto de tionila (487 μL, 6,69 mmol). A mistura é aquecida é aquecida a 80°C por uma noite. Remove-se a o solvente sob vácuo para obter um sólido branco, depois adiciona-se éter dietílico e concentra-se até secar. Seca-se o material por mais 48 horas para obter o composto do título (714 mg, 1,89 mmol). MS (m/z): 341 (M+1). Preparação 4 dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

Método 1:

[00046] A um reator de 5 L sob atmosfera de nitrogênio, adicionam-se cloridrato de dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (264 g, 0,7 mol) e tetra- hidrofurano (1,32 L) e resfria-se a mistura até 0-5°C com um banho de água e gelo. Depois adicionam-se clorodimetoxitriazina (125,5 g, 0,7 mol) e ácido (2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)propanoico (141,3 g, 0,73 mol). Adiciona- se lentamente N-metilmorfolino (231,8 mL, 2,1 mol) e agita-se por 3 horas. Filtra-se a mistura e lava-se o sólido branco com tetra-hidrofurano. Descarta-se o sólido e concentra-se a solução até secar. Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (60:40 a 100:0) para obter o composto do título (195 g, 54%). MS (m/z): 512 (M+1), 534 (M+23).

Método 2:

[00047] Combinam-se o cloridrato de dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino- 4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (354 mg, 0,94 mmol), ácido (2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)propanoico (271 mg, 1,41 mmol), 4-dimetilaminopiridino (11,5 mg, 94 μmol), hidrato de 1- hidroxibenzotriazol (219 mg, 1,41 mmol) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (274 mg, 1,41 mmol) em diclorometano (9,4 mL) depois adiciona-se trietilamina (393 μL, 2,82 mmol) e agita-se a mistura em temperatura ambiente por uma noite sob uma atmosfera de hidrogênio. Lava-se com uma solução de ácido cítrico 10%, solução saturada de hidrogênio carbonato de sódio e salmoura. Descartam- se as camadas aquosas, filtra-se a camada orgânica através de um cartucho de terra de diatomáceas e remove-se o solvente sob vácuo. Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (20:80 a 100:0) para obter o composto do título (319 mg, 66%). MS (m/z): 512 (M+1), 534 (M+23).

[00048] Os compostos a seguir são preparados essencialmente seguindo o método 1 da preparação 4.

Preparação 7 (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- Butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico

Método 1:

[00048] Carrega-se um frasco de fundo redondo com 2 gargalos dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (195 g, 0,38 mol) e tetra-hidrofurano (1,17 L) e resfria-se a mistura até 4°C usando um banho de gelo e água. Adiciona-se lentamente uma solução fria (4°C) de hidróxido de sódio aquoso 50% (81 mL) em água (1,17 L) durante 30 minutos (pouca exotermia a 8°C). Remove-se o banho de gelo e água e agita-se a mistura a 15°C. Depois de três horas, acidifica-se a mistura até pH=3 usando ácido clorídrico concentrado e água (1:3, 500 mL aproximadamente) mantendo a temperatura abaixo de 20°C. Extrai-se a solução turva com uma solução de acetato de etila (600 mL depois 2 x 100 mL). Combinam-se as camadas orgânicas, lava-se com salmoura (100 mL) e descarta-se a fase aquosa. Seca-se sobre sulfato de magnésio, filtra-se e concentra-se até seca-se para fornecer o composto do título como um sólido branco (187 g, 0,41 mol). MS (m/z): 456(M+1).

Método 2:

[00050] Dissolve-se dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanyl)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (319 mg, 0,62 mmol) em tetra-hidrofurano (4,2 mL) depois adiciona-se hidróxido de lítio 2M (2,5 mL, 5 mmol). Agita-se a mistura em temperatura ambiente por uma noite. Dilui-se a mistura de reação com água e lava-se com acetato de etila. Descarta-se a camada orgânica. Ajusta-se a fase aquosa para pH=2 com ácido clorídrico 1N e extrai-se com acetato de etila. Seca-se a fase orgânica através de um cartucho de terra de diatomáceas e concentra-se até secar para obter o composto do título (244 mg, 86%). MS (m/z): 456 (M+1).

[00051] Os compostos a seguir são preparados essencialmente de acordo com o método 2 da preparação 7.

*:A base usada é LiOH 2,5 M. Preparação 10 dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[2-(terc-butoxicarbonilamino)acetil]amino]-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00052] Adiciona-se cloreto de tionila (2,5 mL, 34,32 mmol) a uma solução sob agitação de diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (2,1 g, 4,23 mmol) em etanol (40 mL) a 0-5°C gotejando durante 5 minutos com cuidado (reação exotérmica). Remove-se o banho de resfriamento e A mistura é aquecida de reação é aquecida até a temperatura de refluxo por 16 horas. Evaporam-se os voláteis e seca-seca-se o resíduo sob alto vácuo por 7 horas para obter uma espuma incolor de cloridrato de dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato. Adiciona-se depois ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)acético (0,89 g, 5,07 mmol) e hexaflúorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N- tetrametiluronio (1,93 g, 5,07 mmol) a uma solução de cloridrato de (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato de dietila em N,N- dimetilformamida anidra (20 mL) em temperatura ambiente e depois adiciona-se di-isopropiletilamina (2 mL, 11,47 mmol) e agita-se a solução amarela resultante sob nitrogênio por 18 horas. Concentra-se o solvente e fraciona-se o resíduo entre acetato de etila (40 mL) e uma solução saturada de carbonato de sódio hidrogênio em água (40 mL). Agita-se a mistura por 20 minutos, separam-se as camadas e extrai-se a camada aquosa com mais acetato de etila (40 mL). Combinam-se as camadas orgânicas, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se até secar. Purifica-se o resíduo por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila: iso-hexano (80:20 a 100:0) para dar o composto do título como um sólido incolor (2,42 g, 4,86 mmol). MS (m/z): 498 (M+1), 520 (M+23). Preparação 11 ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[2-(terc-Butoxicarbonilamino)acetil]amino]- 4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico

[00053] Adiciona-se hidróxido de sódio 2M (4,5 mL, 9 mmol) a uma solução agitada de dietil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[2-(terc- butoxicarbonilamino)acetil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (1,4 g, 2,81 mmol) em tetra-hidrofurano (8 mL) em temperatura ambiente. Agita-se a mistura bifásica por 2 horas, dilui-se a mistura de reação com água (50 mL) e lava-se com éter dietílico (50 mL). Resfria-se a camada aquosa até 05°C, acidifica-se até pH=2 com ácido clorídrico 2M e extrai-se com acetato de etila (2 x 60 mL). Combinam-se as fases orgânicas, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se para obter o composto do título como um sólido branco (0,75 g, 1,69 mmol). 1H RMN (D2O) δ 1,181,27 (m, 1H), 1,32 (s, 9H), 1,44-1,49 (m, 1H), 2,0-2,6 (m, 1H), 2,122,19 (m, 1H), 2,65-2,75 (m, 2H), 3,57-3,68 (m, 2H), 4,12-4,21 (m, 1H), 8,23 (s, 1H) assim como algum composto do título na camada aquosa remanescente (aproximadamente 1,12 mmol). MS (m/z): 442 (M+1), 464 (M+23). Preparação 12 cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-Amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico

[00054] Adiciona-se uma solução de cloreto de hidrogênio 4M em 1,4-dioxana (10 mL, 40 mmol) a uma solução de diterc-butila (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (1,97 g, 3,97 mmol) em 1,4-dioxana (10 mL). A mistura é aquecida é aquecida a 50°C com agitação por uma noite (um sólido branco começa a precipitar na solução logo depois que o aquecimento começa). Adiciona-se acetato de etila (50 mL) à mistura de reação (solução branca turva). Deixa-se a mistura esfriar até a temperatura ambiente, depois coleta-se o sólido por filtração e seca-se para obter um sólido branco (1,97 g). Seca-se o sólido por um fim de semana sob pressão reduzida a 40°C para obter o composto do título como um sólido branco contaminado com um pouco de 1,4-dioxana e uma pequena quantidade de monoéster de terc-butila (1,936 g, 65% pureza p/p%, 3,95 mmol). MS (m/z): 285 (M+1). Preparação 13 ácido (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-Butoxicarbonilamino)-4-oxo- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico

[00055] Adiciona-se hidróxido de sódio 2,5M (15,55 mL, 38,88 mmol) a uma solução agitada de diterc-butil (1S,2S,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (2,0 g, 4,86 mmol) em tetra-hidrofurano (24,3 mL) e etanol (9,72 mL). A mistura é aquecida de reação é aquecida a 60°C e mantém-se a agitação por uma noite. Continua o aquecimento por 4 horas, depois lava-se com acetato de etila. Resfria-se a fase aquosa em um banho de gelo e acidifique para pH=2-3 com uma solução de ácido clorídrico 1N. Extrai-se com acetato de etila (3 vezes), seca-se o orgânico sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se para obter o composto do título como um sólido laranja (1,4 g, 96%). MS (m/z): 322 (M+23). Preparação 14 bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4- oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00056] Adiciona-se brometo de 2-flúorobenzila (0,21 mL, 1,7 mmol) por gotejamento a uma suspensão sob agitação de ácido (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico (0,17 g, 0,57 mmol) e carbonato de césio (0,37 g, 1,14 mmol) em N,N-dimetilformamida seca (1,42 mL). Agita-se a mistura resultante em temperatura ambiente por uma noite sob nitrogênio. Paralisa-se com água e dilui-se com acetato de etila. Extrai-se a fase aquosa com acetato de etila (3 vezes) e lavam-se as camadas orgânicas com salmoura e água. Seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se para obter o material bruto como um óleo marrom-claro. Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila: hexano (20:80 para 30:70) para obter o composto do título como um óleo amarelo-claro (229 mg, 79%). MS (m/z): 538 (M+23). Preparação 15 bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4- hidróxi-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00057] Adiciona-se uma solução de L-selectride 1M em THF (6,78 mL, 6,78 mmol) por gotejamento a uma suspensão sob agitação de bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4- oxo-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (2,33 g, 4,52 mmol) em tetra-hidrofurano (20.3 mL) a -78°C. Agita-se a mistura laranja resultante sob nitrogênio por 1 hora e 45 minutos. Paralisa-se com uma solução saturada de hidrogênio carbonato de sódio a -78°C. Diluise com água e acetato de etila. Separam-se as camadas e lava-se a fase orgânica com salmoura e água. Seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se até desidratar para obter o material bruto como um óleo amarelo pálido contaminado com aproximadamente 6% do isômero menor bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,4R,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-hidróxi-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato como detectado por MS. Combina-se o material bruto com um Segundo lote preparado similarmente a partir de bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo- biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (0,23 g, 0,44 mmol). Purifica-se o material combinado por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila: hexano (20:80 para 50:50) para obter o produto do título como um isômero único (2,49 g, 4,81 mmol). MS (m/z): 540 (M+23). Preparação 16 bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4- (p-tolilsulfonilóxi)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00058] Adiciona-se cloreto de p-toluenossulfonila (1,02 g, 5,31 mmol) de uma solução de bis[(2-flúorfenil)metil] (1S,2S,4S,5R,6R)-2- (terc-butoxicarbonilamino)-4-hidróxi-biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilato (2,5 g, 4,83 mmol) em diclorometano (19.32 mL) em temperatura ambiente. Resfria-se em um banho de gelo e água e depois adiciona-se trietilamina (0,74 mL, 5,31 mmol) e N,N-dimetil 4- aminopiridina em porções (1 g, 8,21 mmol). Deixa-se aquecer até a temperatura ambiente e mantém-se-se a agitação por uma noite sob nitrogênio. Paralisa-se com água e separam-se as camadas. Lavam- se as camadas orgânicas com uma solução de hidrogênio sulfato de potássio 1M, salmoura e água. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se até secar sob vácuo para obter uma espuma amarela-clara (2,72 g). Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (20:80 para 40:60) para obter o produto do título como um óleo incolor (2,7 g, 4,02 mmol). MS (m/z): 672 (M+1). Preparação 17 bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)- 4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00059] Adiciona-se 4H-1,2,4-triazol-3-tiol (0,59 g, 5,87 mmol) e carbonato de potássio (0,81 g, 5,87 mmol) a uma solução de bis[(2- flúorfenil)metil] (1S,2S,4S,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(p- tolilsulfonilóxi)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (2,63 g, 3,92 mmol) em N,N-dimetilformamida seca (15,66 mL). A mistura é aquecida resultante é aquecida a 70°C sob nitrogênio em um tubo lacrado e mantém-se a agitação por uma noite. Paralisa-se com água e dilui-se com acetato de etila. Lava-se a camada orgânica com uma solução de ácido cítrico (10% em água), salmoura. Seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se para obter o material bruto como um óleo marrom-claro (2,3 g). Purifica-se por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:hexano (30:70 para 70:30) para obter o produto do título como um óleo incolor (1,84 g, 3,06 mmol). MS (m/z): 601 (M+1), 623 (M+23). Exemplo 1 ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-Amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico

Método 1:

[00060] Adiciona-se cloreto de hidrogênio 4M em 1,4-dioxana (18,42 mL, 7,37 mmol) a uma solução de diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil) biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (3,66 g, 7,37 mmol) em 1,4-dioxana, (17,69 mL) e agita-se a mistura durante um fim de semana a 50°C. Adiciona-se acetato de etila e resfria-se a mistura em um banho de gelo. Coleta-se o sólido branco por decantação e lava-se várias vezes com acetato de etila. Seca-se o sólido sob vácuo e purifica-se por cromatografia de troca de íon. Pré-condiciona-se uma coluna de troca de íon (coluna SCX-2) com acetonitrila. Dissolve-se o material em uma quantidade mínima de água e carrega-se na coluna. Elui-se com acetonitrila (2 volumes de coluna), amônia 2N em metanol: acetonitrila (1:1) (2 volumes de coluna), amônia em metanol e amônia 7N metanol. Concentra-se a amônia 2N na fração de metanol até secar para obter o material desejado (1,39 g) como um sólido branco. Seca-se o sólido por 48 horas a 40°C para obter o composto do título (1,24 g, 66%). 1H RMN (D2O) δ 1,41-1,55 (m, 2H), 2,02 (dd, J= 3,1 and 6,4 Hz, 1H), 2,15-2,20 (m, 1H), 2,40 (dd, J= 8,1 e 14,1 Hz, 1H), 3,22 (s, 1H), 4,20-4,28 (m, 1H), 8,30 (s, 1H).

Método 2:

[00061] Dissolve-se diterc-butil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (433 mg, 0,87 mmol) em 1,4-dioxana (7 mL) e adiciona-se cloreto de hidrogênio 4M em 1,4dioxana (7 mL, 2,8 mmol). Deixa-se a mistura agitar a 50°C por uma noite. Concentra-se até secar. Purifica-se por cromatografia de troca de cátion (Dowex Marathon C, Na+ Form altamente ácida). Dissolve-se o resíduo em uma quantidade mínima de água para solubilizar o material e carrega-se sobre a resina. Lava-se a resina sucessivamente com 2 volumes de coluna de água, depois 2 volumes de coluna de água:tetra-hidrofurano (1:1) e 2 volumes de coluna de água. Elui-se o produto desejado com 2 volumes de coluna de piridina 10% em água. Concentra-se até secar para obter o composto do título (202 mg, 82%). MS (m/z): 285 (M+1). Exemplo 2 cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- Aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico

Método 1:

[00062] Carrega-se um frasco de fundo redondo de 5 L com 3 gargalos equipado com um agitador mecânico com ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (186 g, 0,41 mol), em acetona (1,12 L). A essa pasta, adiciona-se ácido clorídrico 37% em água (100 mL) por gotejamento durante 15 minutos. Agita-se a mistura a 40°C durante uma hora. Resfria-se até a temperatura ambiente e adiciona-se acetona (3,72 L). Agita-se a mistura por 2 horas até a formação complete de uma goma branca. Repita-se a adição de acetona (3 L) até a formação da goma branca. Remove-se a acetona, adiciona-se tolueno e concentra-se para obter um óleo. Dissolve-se novamente o produto bruto em água (400 mL) e liofiliza-se o material para obter o composto do título como um sólido branco (143 g; 89%). MS (m/z): 356 (M+1), 378 (M+23). 1H RMN (D2O) δ 1,37-1,43 (m, 4H), 1,61 (t, J= 3,2 Hz, 1H), 2,31-2,34 (m, 1H), 2,44 (dd, J= 2,9 e 6,4 Hz, 1H), 2,77 (dd, J= 8,1 e 14,4 Hz, 1H), 3,92 (q, J= 7,1 Hz, 1H), 4,20-4,25 (m, 1H), 8,55 (s, 1H).

Método 2:

[00063] Dissolve-se o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(tert- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (244 mg, 0,54 mmol) em acetato de etila (24,5 mL) e borbulha-se gás cloreto de hidrogênio por 1-2 minutos a 0°C. Depois de 5 minutos a 0°C, agita-se a reação em temperatura ambiente por 90 minutos. Remove-se o solvente sob vácuo e dissolve-se novamente o sólido em água. Liofiliza-se a solução para fornecer o composto do título 180 mg, 86%) como um sólido branco. MS (m/z): 356 (M+1), 378 (M+23). Exemplo 3 cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-Amino-4-metilsulfanil- butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilico

[00064] Adiciona-se cloreto de hidrogênio 4M em 1,4-dioxana (19,35 mL, 77,38 mmol) por gotejamento a uma solução de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilsulfanil- butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxilico (2,66 g, 5,16 mmol) em 1,4-dioxana (26,6 mL) em temperatura ambiente em um banho de água e mantém-se a agitação por uma noite em temperatura ambiente. Adiciona-se éter metil-t- butílico (200 mL) e agita-se a mistura por for 2 horas. Filtra-se o sólido e seca-se a vácuo por uma noite. Dissolve-se novamente o material em água e liofiliza-se por uma noite. Tritura-se o sólido em acetona (10 volumes) sob refluxo, filtra-se e seca-se a vácuo sob nitrogênio por 48 horas para obter o composto do título (2,33 g, 5,16 mmol) como um sólido branco. MS (m/z): 416 (M+1). Exemplo 4 cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-Amino-4-metil- pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxilico.

[00065] Adiciona-se cloreto de hidrogênio 4M em 1,4-dioxana (3,01 mL, 12,06 mmol) a uma solução de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)- 2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (0,4 g, 0,8 mmol) em 1,4-dioxana (4 mL). Agita-se o precipitado branco que parece se formar imediatamente depois da adição noturna. Adiciona- se éter metil-t-butilico (16 mL) e coleta-se o sólido branco por decantação lavando várias vezes com éter metil-t-butílico para obter 330 mg do material desejado. Combina-se com um segundo lote de material preparado similarmente a partir de ácido (1R,2R,4S,5R,6R)-4- [[(2S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metil-pentanoil]amino]-2-(4H- 1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-4,6-dicarboxilico (100 mg, 0,2 mmol) e cloreto de hidrogênio 4M em 1,4-dioxana (0,75 mL, 3,01 mmol) para obter 374 mg de material. Purifique metade do material (190 mg) com o cartucho OASIS® HLB (1 g). Acidifica-se o eluente que contém o material desejado para pH=2-3 com ácido clorídrico 1N e seca-se sob vácuo por uma noite a 45°C para obter 170 mg de um sólido branco. Purifica-se similarmente o material remanescente e combina-se para obter o composto do título (290 mg, 0,67 mmol). MS (m/z): 398 (M+1), 795 (2M+1). Exemplo 5 cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2-Aminoacetil)amino]-4-(4H- 1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico

[00066] Adiciona-se ácido clorídrico 5M (10 mL, 50 mmol) à solução aquosa de ácido ((1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[2-(terc- butoxicarbonilamino)acetil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (aproximadamente 1,12 mmol) e agita-se em temperatura ambiente por 5 horas. Concentra-se até secar e purifica-se o resíduo por cromatografia de troca de cátion (DOWEX® 50WX8-100). Dissolve-se o composto em água e ajusta-se para pH=2. Deixa-se o composto fluir através da coluna com uma taxa de gotejamento de cerca de 1 gota a cada 1-2 segundos. Depois que o volume de carga inicial gotejou sobre a superfície da resina, enxagua- se com água (5 a 10 mL) e repite-se 3 vezes. Monitora-se o pH do efluente e continua-se enxaguando com água até a aplicação completa (ciclo do pH observado: efluente da coluna inicialmente em pH=7 depois cai para pH=1 e retorna para pH=7). Lava-se a coluna com pelo menos um volume de coluna de água, água:tetra-hidrofurano (1:1) e depois água. Remove-se o produto da resina com piridina 10%: água. Continua-se a eluir com piridina 10%: água até que nenhum produto adicional seja detectado por TLC. Concentram-se as frações contendo o produto para obter um sólido incolor (173 mg). Dissolve-se o sólido em água (8 mL), adiciona-se ácido clorídrico 5M (0,11 mL, 0,55 mmol) e liofiliza-se a solução por 48 horas para obter o composto do título como um sólido branco (195 mg, 0,52 mmol). MS (m/z): 342 (M+1). Exemplo 6 dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00067] Adiciona-se cloreto de acetila (2,5 mL, 35,14 mmol) a uma mistura de álcool benzílico (18,18 mL, 175,68 mmol) e cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (1,61 g, 3.,51 mmol) em temperatura ambiente. A mistura de reação turva é aquecida a 60°C sob nitrogênio. Depois de 3 dias, resfria-se até a temperatura ambiente, dilui-se a mistura de reação cuidadosamente com acetonitrila (10 mL) e purifica-se por coluna SCX-2 (20 g). Carrega-se a mistura de reação sobre uma coluna pré-condicionada com acetonitrila, lava-se com acetonitrila (x 2) e depois elui-se com uma solução de amônia 2N em metanol: acetonitrila (2 volumes de coluna), depois evapora-se o solvente sob vácuopara obter uma goma branca (576 mg) consistente com o produto bruto desejado. Elui-se depois com amônia 7N em metanol (1 volume de coluna) e remove-se o solvente sob vácuo para obter um sólido branco consistente com ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-6-benziloxicarbonil-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2-carboxilico (750 mg). MS (m/z): 372 (M+1). Purifica-se o produto bruto por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:ciclo-hexano (60:40 para 100:0) duas vezes para dar o compostos do título como um sólido branco (430 mg). Dissolve- se em uma mistura de diclorometano: acetato de etila: acetonitrila, concentra-se até secar e seca-se sob alto vácuo em temperatura ambiente por uma noite para obter o composto do título como um sólido branco (402 mg, 25%). MS (m/z): 465 (M+1)

[00068] Obtém-se um segundo lote do composto do título similarmente pela adição de cloreto de acetila (998 μL, 14,02 mmol) a uma mistura de álcool benzílico (7,26 mL, 70,11 mmol) em temperatura ambiente e ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-6- benziloxicarbonil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2- carboxilico (0,75 g, 1,40 mmol). A reação é aquecida a 60oC sob nitrogênio. Depois de 3,5 dias, adiciona-se com cuidado cloreto de tionila (204,31 μL, 2,8 mmol) à mistura de reação e mantém o aquecimento por 24 horas. Resfria-se a reação até a temperatura ambiente e dilui-se com acetonitrila (10 mL). Purifica-se por coluna SCX-2 (20 g) para obter um sólido branco (567 mg). Purifica-seca-se o produto bruto por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:ciclo-hexano (60:40 para 100:0). Purifica-se adicionalmente por cromatografia rápida eluindo com acetato de etila:ciclo-hexano (60:40 para 80:20) para obter depois da secagem um lote adicional do composto do título (140 mg, 21%). MS (m/z): 465 (M+1). Exemplo 7 cloridrato de bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H- 1.2.4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato

[00069] Adiciona-se uma solução concentrada de cloreto de hidrogênio em acetato de etila (7,91 mL) a uma solução de bis[(2- flúorofenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4H- 1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato (0,48 g, 0,79 mmol) em acetato de etila (7,91 mL). Agita-se a mistura resultante em temperatura ambiente por uma noite. Remove-se o cloreto de hidrogênio pelo borbulhamento de nitrogênio através da mistura de reação. Concentra-se e seca-se o óleo incolor resultante no forno a vácuo a 40°C por uma noite. Redissolve-se o material em água, mantém-se no freezer por 48 horas e liofiliza-se para obter o composto do título (379 mg, 89%). MS (m/z): 501 (M+1), 523 (M+23). Exemplo 8 ácido Biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, 2-[[(2S)-2-amino-1- oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato

[00070] À água purificada (28,0 kg) é adicionado ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-(terc- butoxicarbonilamino)propanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico (11,05 kg) com agitação. Adiciona-se ácido clorídrico (5N, 8,5kg) à mistura com temperatura abaixo de 50oC. A mistura é aquecida a 50oC-55oC por 1,5-2,0 horas. Resfria-se a mistura até 15oC-25oC. Ajuste o pH para 9 pela adição de hidróxido de amônia (25%, 4,8kg) por gotejamento e mantém-se a temperatura a 45oC-50oC. Depois adiciona-se etanol (34 kg) e resfria- se para 20oC-25oC. Em um vaso separado, carrega-se água purificada (6.5 kg), etanol absoluto filtrado em filtro de polimento (45kg of) e uma semente de cristal de ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, 2- [[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato preparado separadamente (0,1 kg). A mistura é aquecida a 45oC-50oC, depois adiciona-se o hidróxido de amônia (filtrada em filtro de polimento) à solução de reação por gotejamento. A mistura é aquecida a 50oC-55oC por 2-3 horas e adiciona-se etanol absoluto (72 kg) por gotejamento e mantém-se a temperatura em 50oC-55oC. Traz-se a mistura de reação para 40oC-45oC sob uma cortina de nitrogênio por 1-1,5 hora. Resfria- se a mistura para 30oC-35oC e mantém-se essa temperatura por 1-1,5 hora. Resfria-se a mistura para 20oC-25oC e mantém-se essa temperatura por 3-4 horas ainda sob uma cortina de nitrogênio. Filtra- se os precipitados e enxague o bolo com água/etanol purificados (1:10). Seca-se o bolo sob vácuo a 50oC-55oC para dar o composto do título como um sólido branco (6,82kg). MS (m/z): 391(M+1)

[00071] Os padrões de difração ao raio X (XRD) dos sólidos cristalinos são obtidos em um difratômetro de raio X pelo método de pó Bruker D4 Endeavor, equipado com uma fonte de CuKα (À = 1.54060 Â) e um detector Vantec que opera a 35 kV e 50 mA. A amostra é rastreada entre 4° e 40° em 2θ, com um tamanho de etapa de 0,009° em 2θ. O pó seco é embalado em um recipiente de amostra de quartzo e uma superfície lisa é obtida usando uma lamina de vidro. Os padrões de difração da forma de cristal são coletados em temperatura ambiente e umidade relativa. No presente caso, a variabilidade da posição do pico de ± 0,2 em 2θ leva em consideração as variações em potencial sem impedir a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. A confirmação de um cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos distintos (em unidades de ° 2θ), tipicamente os picos mais proeminentes. Os padrões de difração da forma de cristal, coletados em temperatura ambiente e umidade relativa, são ajustados com base nos picos padronizados NIST 675 a 8,85 e 26,77 graus 2-theta.

[00072] Portanto, uma amostra de forma cristalina do composto é caracterizada pelo padrão XRD usando a radiação de CuKα que apresenta picos de difração (valores 2θ) como descrito na tabela 1 abaixo e, em particular, que apresenta picos a 18,61 em combinação com um ou mais picos selecionados do grupo que consiste em 21,07, 15,34, 14,74 e 19,20; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 1: Picos de difração de raio X pelo método de pó do Exemplo 8.

[00073] Os receptores de mGlu são receptores acoplados à proteína G que modulam a excitabilidade neuronal. Mais particularmente, a neurotransmissão alterada de glutamato tem sido ligada a esquizofrenia, mas todos os antipsicóticos comumente prescritos atuam em receptores de dopamina. Vários estudos apoiam a ativação do Grupo II de receptor de mGlu (que inclui mGlu2 e/ou mGlu3) para o tratamento da esquizofrenia. Em particular, dados recentes demonstram que um agonista do receptor mGlu 2/3 tem propriedades antipsicóticas e podem fornecer uma nova alternativa para o tratamento da esquizofrenia (Patil et al., Nature Medicine (2007) 13(3), 1102-1107). Estudos demonstram que agonistas de mGlu2/3 possuem propriedades ansiolíticas, antidepressivas e neuroprotetores. Portanto, agonistas de mGlu2 podem ser úteis no tratamento de distúrbios psiquiátricos, tais como distúrbio bipolar, esquizofrenia, depressão e distúrbio com ansiedade generalizada.

[00074] Como os compostos da presente invenção são agonistas de mGlu2, eles podem ser adequados para tratar os distúrbios acima mencionados.

Ensaio FLIPR de Agonista de mGlu2 Humana

[00075] Linhagens celulares AV-12, derivadas de fibroblastos de hamster sírio e expressando estavelmente o receptor mGlu2 humano e co-transfectadas com o transportador de glutamato de rato EAAT1 (Transportador 1 de Aminoácido Excitatório) e a subunidade Gα15, são usados para esses estudos. A expressão de Gα15 permite que os receptores acoplados a Gi sinalizem através da via da fosfolipase C, resultando na habilidade de medir a ativação do receptor por um ensaio de resposta flúorométrica ao cálcio. Essas linhagens celulares são mantidas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com glicose alta e cloridrato de piridoxina suplementado com soro fetal bovino 5% dialisado, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 10 mM (ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico), L-glutamina 1 mM e blasticidina 5 μg/mL (todos os meios foram adquiridos da Invitrogen). As culturas confluentes são passadas bissemanalmente usando uma solução de dissociação sem enzima (Chemicon S-004-B). As células foram coletadas 24 horas antes do ensaio e dispensadas usando um semeador celular Matrix Well-Mate a 85.000 (mGlu2) ou 115.000 (mGlu3) células por poço em placas de 96 poços de paredes pretas revestidas com poli-D-lisina (BD BioCoat #354640) em meio que contém apenas 250 (mGlu2) ou125 (mGlu3) μM de L-glutamina (recentemente adicionada).

[00076] Os níveis de cálcio intracelulares são monitorados antes e depois da adição dos compostos usando um Flúorometric Imaging Plate Reader (FLIPR, Molecular Devices). O tampão de ensaio é compreendido por Solução Salina Tamponada de Hank (HBSS; Sigma) suplementada com HEPES 20 mM. O meio é removido e as células são incubadas com Fluo-3AM 8 μM (Molecular Probes, F-1241; 50 μL por poço) em tampão de ensaio por 90 minutos a 25°C. A solução corante é removida e substituída por tampão de ensaio fresco (50 μL por poço). Uma única adição de ensaio FLIPR que gera uma curva de resposta concentração de 11 pontos (diluições de 3X começando com 10 μM) para o agonista de glutamato (Fisher A125- 100) é realizada antes de cada experimento para confirmar a típica resposta de EC50. Os resultados são analisados usando Prism v4.03 (GraphPad Software). Os compostos da presente invenção são testados em um ensaio com adição única de FLIPR, usando um perfil de resposta de concentração de 10 pontos usando diluições de 3X começando com uma concentração final de 25 μM. Os compostos da presente invenção são solubilizados como estoques a 10 mM em NaOH 0,1 N e armazenados a -20C. Eles são diluídos através de uma série de diluições de três vezes em tampão de ensaio. Depois de tomar uma leitura flúorescente inicial com 5 seg. no instrumento de FLIPR, um composto da presente invenção é adicionado a uma placa de célula (50 μL por poço). os dados são coletados a cada segundo nos primeiros 30 segundos e depois a cada 3 segundos para um total de 90 segundos a fim de detectar a atividade do agonista. A resposta máxima é definida como aquela induzida por ECmax (glutamato 100 μM). O efeito do composto é medido como as alturas máximas menos a mínima dos picos em unidades relativas de flúorescência (RFUs) corrigidas para a flúorescência basal medida na ausência de glutamato. As determinações são realizadas usando placas simples. Os efeitos do agonista são quantificados como um percentual da estimulação induzida pelo composto sozinho em relação à resposta máxima ao glutamato. Todos os dados são calculados em relação aos valores de EC50 usando um programa de ajuste de curva logística de quatro parâmetros (ActivityBase v5.3.1.22).

[00077] O composto do Exemplo 1 foi medido no ensaio FLIPR de hmGlu2 corrido substancialmente como acima para ter uma EC50 de 23,0 nM ± 3,9 (n = 5, erro calculado como SEM). esse resultado demonstra que o Exemplo 1, o composto ativo para os Exemplos 2 a 8 é um agonista de mGlu2. O composto ácido 1SR, 2RS, 4SR, 5SR, 6SR-2-amino-4-(feniltio)-biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilico, como descrito no WO9717952medido no ensaio FLIPR de hmGlu2 corrido substancialmente como acima teve uma EC50 de>25,000 nM.

Reversão de Atividade Hiperlocomotora Induzida por Fenciclidina (PCP) em Ratos

[00078] A administração de antagonistas do receptor de NMDA, tal como quetamina ou fenciclidina (PCP), produz efeitos semelhantes a psicotomiméticos em humanos que são similares aqueles sintomas observados em pacientes com esquizofrenia. A habilidade dos agentes para reverter os efeitos estimulantes locomotores de antagonistas de NMDA são geralmente usados como um modelo animal de psicose, demonstrando boa validade preditiva para a detecção da eficácia clínica de medicações para esquizofrenia e distúrbio bipolar.

[00079] A atividade motora é monitorada pela colocação individualmente de ratos machos Sprague-Dawley (Harla, Indianapolis, IN) em gaiolas de plástico transparente com as dimensões 45 x 25 x 20 cm, com 1 cm de profundidade de raspas de madeira como acomodação e uma grade de metal no topo da gaiola. Os monitores motores (Kinder Scientific) consistem em uma prateleira com 12 feixes de luz arranjados em uma formação de 8 x 4 (ou um agrupamento de alta densidade de 22 em um padrão de 15 x 7) em uma altura de 5 cm, com uma segunda prateleira (para avaliar comportamentos posteriores) em uma altura de 15 cm. A gaiola é colocada dentro dessas prateleiras, com as prateleiras sobre uma mesa com 90 cm de altura em uma sala isolada. Um composto da presente invenção é administrado (via intraperitoneal (i.p.), não profármaco) dentro de uma faixa de 0,3 a 10 mg/kg, 30 minutos antes da inoculação de uma dose de 5 mg/kg de fenciclidina (PCP). Um composto da presente invenção é administrado (via oral, profármaco) dentro de uma faixa de 0,3 a 30 mg/kg em ratos em jejum por uma noite, 4 horas antes de uma dose de inoculação de 5 mg/kg de PCP. No dia do teste, os ratos são colocados na gaiola de teste e deixados se aclimatar por 30 minutos antes da inoculação de PCP; os ratos são monitorados por um adicional de 60 minutos depois da administração de PCP.

[00080] A análise dos dados e os cálculos de ED50 são conduzidos usando GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Análises de força determinaram que 8 a 10 ratos por grupo são necessários para haver força estatística apropriada para detectar as diferenças de tratamento (força=0,8). Uma análise de variância simples (ANOVA) com um teste de comparação múltipla de Dunnett posterior é conduzido na atividade locomotora total de 60 minutos. Os cálculos de ED50 são realizados usando uma curva de regressão não linear ajustando o percentual reverso de dados transformados para cada dose.

[00081] O composto do Exemplo 1 foi medido nesse ensaio corrido substancialmente como acima para ter uma ED50 de 1,23 mg/kg (i.p.). Os compostos dos Exemplos 2 e 3 foram avaliados nesse ensaio corrido substancialmente como acima para ter uma ED50 de 2,94 mg/kg (p.o.) e 5,46 mg/kg (p.o), respectivamente. Esses resultados demonstram que os compostos dentro do escopo da presente invenção são medicações úteis para a esquizofrenia e o distúrbio bipolar.

Reversão de Atividade Hiperlocomotora Induzida por Fenciclidina (PCP) em Camundongos

[00082] Esse ensaio para a Reversão da Atividade Hiperlocomotora Induzida por Fenciclidina (PCP) em Camundongos é corrido substancialmente como o ensaio para a Reversão da Atividade Hiperlocomotora Induzida por Fenciclidina (PCP) em Ratos fornecido acima, usando camundongos ao invés de ratos e com as alterações observadas abaixo.

[00083] A atividade motora é monitorada pela colocação de camundongos machos ICR (CD-1) (Harlan, Indianapolis, IN) individualmente em gaiolas de plástico com as dimensões 45 x 25 x 20 cm, com 0,5 cm de profundidade de raspas de madeira como acomodação e uma tampa plástica no topo da gaiola. Os monitores motores (Kinder Scientific) consistem em uma prateleira com 12 feixes de luz arranjados em uma formação de 8 x 4 (ou um agrupamento de alta densidade de 22 em um padrão de 15 x 7) em uma altura de 2,5 cm. A gaiola é colocada dentro dessas prateleiras, com as prateleiras sobre uma mesa com 90 cm de altura em uma sala isolada. Um composto da presente invenção é administrado (via intraperitoneal, não profármaco) dentro de uma faixa de 0,3 a 30 mg/kg; apesar de doses maiores poderem ser usadas, 30 minutos antes da inoculação de uma dose de 7,5 mg/kg de fenciclidina (PCP). No dia do teste, os camundongos são colocados na gaiola de teste e deixados se aclimatar por 45 minutos antes da inoculação de PCP; os camundongos são monitorados por um adicional de 60 minutos depois da administração de PCP. Análises de força determinaram que 7 a 8 camundongos por grupo são necessários para haver força estatística apropriada para detectar as diferenças de tratamento (força=0,8).

[00084] Em um experimento com dose única de 10 mg/kg, o composto do Exemplo 1 foi avaliado nesse ensaio corrido substancialmente como acima para produzir 78 ± 9% de inibição de ambulações evocadas por PCP (i.p.). Em um experimento com múltiplas doses, o composto do Exemplo 1 foi avaliado nesse ensaio corrido substancialmente como acima para produzir 81 ± 5% de inibição de ambulações evocadas por PCP (i.p.) em uma dose de 10 mg/kg. Esses resultados demonstram que os compostos dentro do escopo da presente invenção são medicações úteis para a esquizofrenia e o distúrbio bipolar. O composto de ácido 1SR, 2RS, 4SR, 5SR, 6SR-2-amino-4-(feniltio)-biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico medido no ensaio corrido substancialmente como acima produziu inibição de 18 + 11% de ambulações evocadas por PCP (i.p.) em um experimento com dose única de 10 mg/kg, inibição de 5 + 10% de ambulações evocadas por PCP (i.p.) em um experimento com doses múltiplas para a dose de 10 mg/kg e inibição de 19 + 8% de ambulações evocadas por PCP (i.p.) em um experimento com doses múltiplas para a dose de 100 mg/kg.

Atenuação da Hipertermia Induzida pelo Estresse em Ratos

[00085] A hipertermia, um aumento na temperatura corporal central, é um fenômeno comum que tem sido demonstrado confiavelmente em vários mamíferos, incluindo humanos, em resposta ao estresse. Em vários distúrbios de ansiedade, a hipertermia ocorre como parte da patologia e é considerada um sintoma da doença. Os compostos que podem atenuar a hipertermia induzida pelo estresse em animais são considerados serem úteis no tratamento de distúrbios da ansiedade em humanos. O distúrbio com ansiedade generalizada é um exemplo de tais distúrbios que podem ser tratados com tais compostos. O método convencional e minimamente invasivo para analisar a hipertermia induzida pelo estresse é pela medição da temperatura corporal e de aumentos induzidos pelo estresse na temperatura corporal, através de um termômetro retal. Ratos machos Fischer F-344 (Harlan, Indianápolis, IN, USA), pesando entre 275 e 350 g são testados. Todos os animais são abrigados individualmente com alimento e água automatizada a vontade e mantidos em um ciclo de 12 h de claro/escuro (luzes acesas as 06:00). Os animais são deixados em jejum por aproximadamente 12 a 18 horas antes do experimento, que é realizado durante a fase com luz. Os ratos são tratados duas horas antes do experimento ou por via intraperitoneal (i.p., não profármaco) ou por via oral (p.o., profármaco) pela administração de um volume de dose de 1 mL/kg. Os compostos da presente invenção foram tratados com 0,3, 1, 3 e 10 mg/kg (i.p.) e 4, 13, 13,78 e 41,35 mg/kg (p.o.). Essas doses orais correspondem a doses da substância farmacológica ativa de 3, 10, e 30 mg/kg, respectivamente. O veículo usado nesses estudos é salina com NaOH adicionado para obter um pH entre 5 e 7. O antagonista de mGluR5 MTEP (3-[(2-metil-1,3-tiazol-4-il)etinil]piridina), que tem demonstrado uma atividade ansiolítica robusta em modelos pré-clínicos, é usado como um comparador (5 mg/kg, via i.p., dissolvidos em água). Imediatamente depois da dosagem, os ratos são recolocados em suas gaiolas e o experimentador desliga as luzes e deixa a sala. A sala de dosagem é escurecida durante o período restante de pré-tratamento de 1 h.

[00086] Depois do período de pré-tratamento, os ratos são levados individualmente para uma sala adjacente intensamente iluminada onde as temperaturas corporais basais são determinadas pela inserção de uma sonda retal lubrificada com óleo mineral. A temperatura corporal é avaliada usando um PHYSITEMP BAT-12® Microprobe Thermometer com uma sonda retal para rato PHYSITEMP RET-2® (Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, USA). A sonda é inserida aproximadamente 2 cm no reto para medir a temperatura corporal central (essa é a temperatura corporal basal, T1, em graus Celsius). Dez minutos mais tarde, uma segunda medida da temperatura corporal é registrada (T2). A diferença na temperatura corporal (T2 - T1) é definida como a resposta hipertérmica induzida pelo estresse. A dose na qual o composto da presente invenção produz uma redução de 35% na resposta hipertérmica induzida pelo estresse, em relação à resposta ao veículo é definida como a dose T35.

[00087] O composto do Exemplo 1 foi avaliado nesse ensaio realizado substancialmente como acima para ter uma T35 de 1,27 mg (i.p.). O composto do Exemplo 2 foi avaliado nesse ensaio realizado substancialmente como acima para ter uma T35 de 16,2 mg/kg (p.o.). Esses resultados demonstram que os compostos dentro do escopo da presente invenção são medicações úteis para distúrbios da ansiedade. Mais particularmente, os compostos dentro do escopo da presente invenção são medicações úteis para distúrbios generalizados da ansiedade.

Teste do nado forçado em roedores

[00088] O ensaio do teste do nado forçado em roedor está bem caracterizado e exibe boa validade preditiva para detectar a atividade antidepressiva similar de medicações atuais para o distúrbio depressivo principal. Nesse ensaio, os mecanismos da suposta atividade antidepressiva similar diminuem a imobilidade em um breve episódio de nado forçado sem escapatória.

[00089] O teste do nado forçado é conduzido com ambos camundongos (camundongos machos, NIH-Swiss, 20-25g, Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) e ratos (ratos machos, Sprague- Dawley, 250-350g, Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN). Os camundongos são colocados em cilindros de plástico claros (diâmetro de 10 cm; altura: 25 cm) preenchidos com 6 cm de água a 22-25 °C por seis minutos. A duração da imobilidade é registrada durante os últimos 4 min de um teste de seis minutos. Os ratos são tratados similarmente, embora em cilindros de plástico claros de dimensões maiores (diâmetro de 18 cm; altura: 40 cm) preenchidos com água (2225°C) a uma profundidade de 16 cm por 15 min. Adicionalmente, os camundongos recebem uma única exposição ao nado forçado; os ratos recebem duas, sessões de 5 min separadas por 24 horas (dados são registrados apenas no Dia 2). O composto do Exemplo 1 é testado em camundongos usando uma dosagem intraperitoneal (1, 3 ou 10 mg/kg), 60 min antes do teste. O composto do Exemplo 2 é testado em ratos depois da dosagem oral (1,4, 4,1 ou 13,8 mg/kg; corresponde a 1, 3 ou 10 mg/kg do equivalente ativo). O Exemplo 2 é administrado 5 min depois da primeira exposição ao nado forçado e 120 min antes da sessão de teste no Dia 2. A imipramina é usada como controle positivo para esses estudos. Os compostos são formulados em um veículo aquoso, com um mínimo de NaOH sendo adicionado ao Exemplo 1 e ao Exemplo 2. Os compostos estão em uma solução clara. A quantidade de tempo despendido na imobilidade (definida como movimentos apenas necessários para manter a cabeça do indivíduo acima da água) é uma medida dependente e registrada por um observador não ciente do tratamento com fármaco dos indivíduos. Os dados são analisados pelo teste de Dunnett post-hoc com nível alfa ajustado para 0,05. A versão com camundongo do teste do nado forçado é a mais comumente usada. Um valor de ED60 (60% da quantidade de imobilidade em relação aos controles com veículo) é calculada para avaliar a potência dos compostos de teste. Sob essas condições de teste, os ratos não respondem tão robustamente como fazem os camundongos e a significância estatística e a eficácia máxima em relação ao controle positivo com imipramina são usadas para avaliar a resposta ao tratamento.

[00090] O Exemplo 1 foi avaliado nesse ensaio corrido substancialmente como acima e produziu efeitos antidepressivos proeminentes em camundongos (F4,39 = 9,9, p < 0,0001). A ED60 é 10,5 mg/kg e o efeito máximo é de 61% dos níveis de imobilidade do veículo na dose de 10 mg/kg em relação aos níveis de controle com veículo. Em quatro repetições separadas desse estudo, a (+ o erro padrão da média) ED60 média é 6,1 + 2,5 mg/kg e o efeito máximo é de 49,5 + 11,5% dos níveis de imobilidade tratados com veículo. Em comparação, o efeito do antidepressivo imipramina depois de múltiplos estudos é de 8,6 + 1,2 mg/kg (ED60) e 39 + 1,2% dos níveis de imobilidade com veículo. Em ratos, o Exemplo 2 foi avaliado nesse ensaio realizado substancialmente como acima e o tempo de imobilidade diminuiu significativamente [F(4,29)= 14,72, p<,0001] depois da dosagem de 4,1 e 13,8 mg/kg. O efeito máximo do Exemplo 2 reduz a imobilidade para 68% dos ratos tratados com veículo. Por comparação, 30 mg/kg de imipramina reduzem a imobilidade para 70% dos controles com veículo. Esses resultados demonstram que os compostos dentro do escopo da presente invenção são medicações úteis para a depressão. Rastreamento da Inibição In Vitrode PepT1 GlySar e Determinação da IC50

[00091] Os ensaios para PepT1 são estabelecidos para determinar a habilidade dos compostos de profármaco de aminoácido de interagir com a absorção intestinal do transportador de PepT1.

[00092] Células HeLa derivadas do intestino humano (American Type Culture Collection) são cultivadas em meio Hyclone (Invitrogen, Cat# SH30243) contendo soro fetal bovino 10% (FBS), aminoácidos não essenciais 0,1 mM (NEAA) e 100 unidades/mL de penicilina com 100 μg/mL de estreptomicina a 37oC em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. A linhagem celular é usada por até 40 passagens e depois é descartada. As células congeladas em frascos de 1 mL são descongeladas em banho de água por 1 a 2 minutos e adicionadas a 5 mL de meio celular a 37oC. Cada um dos frascos T é fornecido com 8,5 mL de meio fresco e 1,5 mL de concentrado de célula. As células são passadas duas vezes durante uma semana. Isso é obtido pela lavagem dos frascos com 10 mL de salina tamponada com fosfato- ácido etileno diaminotetracético (PBS-EDTA), adicionando 2 mL de tripsina por 2 a 5 minutos para separar as células e adicionando 8 mL de meio fresco para inibir a atividade posterior da tripsina. Cada novo frasco recebe uma combinação de 8,5 mL de meio fresco e 1,5 mL de concentrado de célula, a fim de obter uma diluição celular de 1:6. As células são incubadas a 37°C, até estarem prontas para o estudo de absorção.

[00093] As células que estão 70 a 80% confluentes nos frascos T são plaqueadas um dia antes do procedimento de transfecção. O frasco com o concentrado de célula é tratado com PBS-EDTA e tripsina para separar as células e o meio de transfecção é usado a partir desse ponto. O meio de transfecção consiste em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + NEAA. A cada poço, 0,5 mL da mistura celular são adicionados (1,3x105 é a concentração celular desejada) e as células são incubadas a 37°C por uma noite. Vinte e quatro horas antes do ensaio, as células foram transfectadas com PEPT1. A mistura de transfecção é preparada pela mistura de 600 μL de soro sem meio de transfecção, 18 μL de FuGene6 (Roche Diagnostics), e 11 μg do DNA de PepT1. O complexo reagente de transfecção-DNA é incubado por 20 minutos e 24 μL do complexo reagente -DNA são adicionados a cada poço.

[00094] A inibição da atividade de absorção de [glicil-1-2- 14C]Gliclisarcosina (GlySar) mediada por PepT1 é medida nas células cultivadas em placas de 24 poços 24 horas depois da transfecção como previamente publicado (Zhang et al. 2004. J. Pharm. Exper Ther. 310:437-445). Para medira a habilidade de um composto da presente invenção em inibir a absorção de [14C]Gly-Sar, compostos de profármaco são incubados com 80 a 90% de células HeLa confluentes transitoriamente transfectadas com PepT1 em meio de absorção 5 mM em pH 6.0 na presença de [14C]Gly-Sar 5 μM (Moravek Biochemicals) e de Gly-Sar gelado 20 μM. O meio de absorção consiste em NaCl 140 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgSO4 0,8 mM, Glicose 5 mM, tampão tris(hidroximetil)aminometano 25 mM (TRIS). A solução é trazida depois para pH 6.0 usando ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico. O volume de incubação é de 500 μL e é realizada em temperatura ambiente por 3 minutos. Para parar a absorção na conclusão do tempo de incubação, o meio de absorção é aspirado da monocamada de célula e 500 μL de PBS gelado são adicionados ao poço. As células são lavadas 3 vezes com 500 μL de PBS em temperatura ambiente sem Ca+2 e Mg+2. As células são lisadas com 300 μL de uma solução de Triton X100 1% e H2O. Uma alíquota de 200 μL é removida e a radioatividade é determinada pela contagem de cintilação líquida para medir a [14C]Gly-Sar presente em cada um dos poços de incubação. Um controle não inibidor é estabelecido e o percentual de inibição de cada profármaco é calculado com relação a esse controle. Um controle negativo (Glicina) e dois controles positivos (Cefadroxil e Cefalexina) são realizados em paralelo com cada experimento para demonstrar a viabilidade do sistema de ensaio. Os compostos de profármaco com inibição da absorção de GlySar igual ou superior à Cefalexina são considerados aceitáveis. Valores médios ± desvio padrão são 10,1±9,5% (n=19) para Glicina, 53,2 ± 13,2% (n=19) para Cefadroxil, e 37,5±14,7% (n=18) para Cefalexina.

[00095] Para o ensaio de IC50 de PepT, compostos de profármaco são incubados em uma faixa de concentrações (0,0625 a 25 mM) na presença de [14C]Gly-Sar 5 μM e Gly-Sar 20 μM gelada, os procedimentos de incubação e amostragem são exatamente os mesmos como o rastreamento de PepT1 descrito acima. Os dados da absorção de [14C]Gly-Sar são avaliados para cada uma das concentrações de composto de profármaco e os valores de IC50 são calculados.

[00096] Os compostos dos Exemplos 2, 3, 4, e 5 foram avaliados nesse ensaio corrido substancialmente como acima para ter a inibição de absorção de hPepT1 [3H]Gly-Sar a 5mM de 38% (n=3, SD=18,4), 51% (n=1), 32% (n=1), e 44% (n=1), respectivamente. Os compostos dos Exemplos2 e 3 foram avaliados nesse ensaio corrido substancialmente como acima para ter a IC50 da inibição de absorção de hPepT1 [3H]Gly-Sar de 1,84 mM (SE=0,42) e 5,36 mM (SE=1,69), respectivamente. Esses resultados demonstram que compostos de profármaco de aminoácido dentro do escopo da presente invenção são absorvidos oralmente através do transportador PepT1.

Ensaio In Vitrode Hidrólise Intestinal de Profármaco

[00097] Homogenatos intestinais de duodeno humano congelados (proporção tecido:tampão 1:2 usando tampão Tris Fosfato 100 mM, pH 7.4) são obtidos a partir de Celsius In vitro Technologies (Baltimore, MD) que eram isentos de flúoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e EDTA.

[00098] Cada lote de duodeno humano é obtido de um único doador e o intestino é raspado e as seções são congeladas em separado. Todas as coleções originais de tecido são realizadas a 4°C e imediatamente congeladas a -70°C. Os homogenatos intestinais humanos são descongelados e diluídos até uma concentração final de proteína de 0,5 mg/mL em tampão PBS 100 mM, pH 7.4 imediatamente antes das incubações.

[00099] As incubações são realizadas em placas de 96 poços e todos os compostos de pré-fármaco são corridos em duplicata em cada dia. Soluções estoque de composto de pró-farmaco são preparadas em água em uma concentração de 1 mM. Uma alíquota de 200 μL de 0,5 mg/mL de homogenato intestinal e 196 μL de tampão PBS 100 mM são colocados em uma placa de 96 poços a 37°C em banho de água. Usando uma pipeta de 96 canais, 4 μL da solução de composto de profármaco1 mM são transferidos para o homogenato. Imediatamente depois da adição do composto de profármaco (tempo zero) e depois de 1 hora de incubação, amostras de 50 μL da mistura de incubação são removidas usando uma pipeta de 96 canais simultâneos automatizada descartável e adicionadas diretamente a 200 μL de solução supressora de metanol contendo 100 ng/mL de Padrão Interno. As amostras são centrifugadas a 3500 rpm por 5 minutos a 10 °C. O sobrenadante (200 μL) é transferido para uma placa de PCR de 96 poços final e lacrada para analise por LC/MS/MS.

[000100] As concentrações de compostos hidrolisados da presente invenção nas misturas de incubação são determinadas usando a detecção por LC/MS/MS em um espectrômetro de massa quadripolar Sciex API 4000 com Analyst versão 1.4.2, TurboIonSpray, ionização positiva e Selected Reaction Monitoring (SRM). Uma coluna de HPLC Waters Atlantis® T3 (20 x 2,1 mm, 5 μM) é usada em temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min e um gradiente de fase móvel de 0,1% na fase móvel A para 99% da fase móvel A. A fase móvel A é água:ácido heptaflúorbutérico 1000:5 e a fase móvel B é metanol:ácido acético glacial 1:1.

[000101] As concentrações de compostos hidrolisados da presente invenção nas misturas de incubação intestinais são determinadas a partir de curvas padronizadas preparadas pela replicação de uma diluição de duas vezes começando com 10 μM em PBS 100 mM pH 7.4 e subseca-sentemente extintas com uma solução de metanol- padrão interno idêntica às amostras. As médias e os desvios padrão são calculadas usando Microsoft® Office Excel® 2007. A quantidade de hidrólise é determinada como um percentual molar do composto formado em relação à concentração de composto de profármaco adicionado. A hidrólise do controle positivo, Composto de Profármaco Interno A para Composto de Fármaco Interno A, corrida em cada lote resultou em 75,3% (n=20). Os valores finais são então normalizados em relação à formação do Composto de Fármaco Interno A.

[000102] Os compostos dos Exemplos 2, 3, 4, 5, e 6 foram avaliados nesse ensaio realizado substancialmente como acima para ter uma hidrólise intestinal humana para Composto de Profármaco Interno A de 61% (n=3, SD = 11,1), 53% (n=3, SD=11,9), 45% (n=1), 35% (n=2; 34,1, 35,2), e 2% (n=1), respectivamente. Esses resultados demonstram que os compostos de profármaco dentro do escopo da presente invenção são hidrolisados no intestino humano.

Ensaio de Hidrólise de Homogenato S-9 de Fígado Humano In Vitro

[000103] As frações S9 de fígado são obtidas de Xenotech LLC (Lenexa, MO). O lote é de um pool de dois doadores, um masculino e um feminino. A fração S9 de fígado é preparada e diluída usando tampão de homogeneização que consiste em Tris 50 mM, pH 7.4 a 4°C e cloreto de potássio 150 mM sem EDTA. Os compostos de profármaco são incubados no homogenato de fígado por 2 horas a 37°C, depois do que a concentração de composto é determinada por LC/MS/MS. A hidrólise de Clopidogrel para Ácido Carboxílico de Clopidogrel é utilizada como um ensaio de controle positivo.

[000104] As incubações são conduzidas no formato de 96 poços e todos os compostos de profármaco são corridos em duplicata em cada dia. As soluções concentradas de composto de profármaco são preparadas em água em uma concentração de 1 mM. A fração S9 de fígado humano é diluída até uma concentração final de proteína de 0,5 mg/mL em tampão PBS 100 mM, pH 7.4.

[000105] Uma alíquota de 200 μL de homogenato de S9 de fígado humano 0,5mg/mL e 196μL de tampão PBS 100mM são colocados em uma placa de 96 poços em um banho de água a 37°C. Usando uma pipeta de 96 canais, 4μL da solução de profármaco 1 mM são transferidos para o homogenato. Para assegurar que a hidrólise não seja devida a instabilidade química, os compostos de profármaco também são incubados apenas com tampão PBS sem S-9 de fígado. Imediatamente depois da adição do composto de profármaco (tempo zero) e depois de 1 hora de incubação, amostras de 50 μL da mistura de incubação são removidas usando uma pipeta de 96 canais simultâneos automatizada descartável e adicionadas diretamente a 200 μL de solução supressora de metanol contendo 100 ng/mL de Padrão Interno. As amostras são centrifugadas a 3500 rpm por 5 minutos a 10°C. O sobrenadante (200uL) é transferido para uma placa de 96 poços de PCR final e lacrada para análise por LC/MS/MS.

[000106] A quantificação por LC/MS/MS do composto formado durante a incubação é realizada em um Sciex API 4000, Analyst version 1.4.2, TurboIonSpray, e ionização positiva e Selected Reaction Monitoring (SRM). A coluna de HPLC usada é Waters Atlantis® T3 (20 x 2,1 mm, 5μm) em temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,0 mL/min. A fase móvel A é água:ácido heptaflúorbuterico 1000:5 e a fase móvel B é metanol:ácido acético glacial 1:1. Um gradiente de fase móvel é utilizado começando com uma proporção de fase móvel A/B de 99,9/ 0,1 e finalizando a 1/99.

[000107] As concentrações de composto hidrolisado nas misturas de incubação são determinadas a partir de curvas padronizadas preparadas pela replicata da diluição de duas vezes começando em 10μM em 100 mM PBS pH 7.4 e subsequentemente extintas com uma solução de metanol-padrão interno idêntica às amostras. As médias e os desvios padrão são calculados usando Microsoft® Office Excel® 2007. Os valores finais são apresentados como um percentual molar do composto formado em relação à concentração de composto de profármaco adicionado. A hidrólise de Clopidogrel para Ácido Carboxílico de Clopidogrel é usada como controle positivo e é em média 73.0% (n=27).

[000108] Os compostos dos Exemplos 2, 3, 5, 6 e 7 são avaliados nesse ensaio corridor substancialmente como acima para obter a hidrólise de S9 de fígado humano de 1% (n=1), 8% (n=1), 0,4% (n=1), 9% (n=2; 4,4, 13,6), e 29% (n=1), respectivamente. Esses resultados demonstram que compostos de profármaco dentro do escopo da presente invenção são hidrolisados no fígado humano.

[000109] Os dados demonstram que os compostos de profármaco de aminoácido dentro do escopo da presente invenção inibem a absorção do substrato de PepT1 de GlySar tão bem quanto ou melhor do que cefadroxil e cefalexina (Zhang et al, 2004. JPET 310:437-445), que é preditivo da absorção oral através do transportador de PepT1. Em adição a absorção do composto de profármaco, depois de entrar no corpo, a hidrólise do composto de profármaco a fim de fornecer o composto ativo é esencial. Os presentes estudos de hidrólise in vitro demonstram que compostos de profármaco dentro do escopo da presente invenção podem ser hidrolisados no intestino humano. A hidrólise de compostos de profármaco de diester ocorrem em homogenatos de fígado humano que demonstram que os compostos de profármaco de diéster dentro do escopo da presente invenção são hidrolisados em humanos depois da exposição oral. Juntos, esses dados predizem os compostos de profármaco de aminoácido e os compostos de profármaco dentro do escopo da presente invenção são hidrolisados em seres humanos.

Claims

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula

na qual R1é hidrogênio, R2é hidrogênio, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-aminopropanoíla, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoíla, e R3é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é (2S)-2-amino-4-metil-pentanoíla, e R3 é hidrogênio; R1é hidrogênio, R2é 2-aminoacetila, e R3é hidrogênio; R1é benzila, R2é hidrogênio, e R3é benzila; ou R1é (2-flúorfenil)metila, R2é hidrogênio, e R3é (2- flúorfenil)metila; ou um sal ou mono-hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é o cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-aminopropanoil]amino]-4-(1H-1,2,4- triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é o cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4-metilsulfanil-butanoil]amino]-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2- amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é o cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[[(2S)-2-amino-4-metil-pentanoil]amino]-4-(4H- 1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2- aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano- 2,6-dicarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é o cloridrato de ácido (1R,2S,4R,5R,6R)-2-[(2-aminoacetil)amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxílico.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é dibenzil (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4- (4H-1,2,4-triazol-3-ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é o cloridrato de bis[(2-flúorfenil)metil] (1R,2S,4R,5R,6R)-2-amino-4-(4H-1,2,4-triazol-3- ilsulfanil)biciclo[3.1.0]hexano-2,6-dicarboxilato.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico, sal de 2-[[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4- triazol-3-iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o ácido biciclo[3.1.0]hexano-2,6- dicarboxílico, 2-[[(2S)-2-amino-1-oxopropil]amino]-4-(4H-1,2,4-triazol-3- iltio)-, sal de monoamônia, (1R,2S,4R,5R,6R)-, mono-hidrato em forma cristalina definido por um padrão de difração ao raio X, que apresenta picos em 2θ ± 0,2 iguais a 18,61 e 21,07.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, sal ou mono-hidrato, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.