BR112012013968B1

BR112012013968B1 - métodos e composições para reparo de osso e cartilagem

Info

Publication number: BR112012013968B1
Application number: BR112012013968-1A
Authority: BR
Inventors: Graham Matheson; William Walsh
Original assignee: Cimtech Pty Limited
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2020-10-27
Also published as: BR112012013968A2; US20130071359A1; EP2509612B1; EP2509612A4; US9750777B2; CN102770148B; US20180125904A1; AU2010330704B2; EP2509612A1; WO2011069214A1; AU2010330704A1; CN102770148A; SG181571A1

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA REPARO DE OSSO E CARTILAGEM são descritos o extrato biologicamente ativo de Hibiscus tiliaceus L. e composições que compreendem o extrato. A invenção também fornece usos terapêuticos do extrato e composições, em particular, para a promoção de cura de lesões ósseas e de cartilagem, e a promoção de formação de osso ou cartilagem.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, em geral, ao uso de extratos de planta e composições que compreendem os mesmos para o tratamento de ferimentos, doenças ou defeitos cartilaginosos ou ósseos, a promoção da cura de ferimentos cartilaginosos ou ósseos e a promoção da formação cartilaginosa e óssea. As modalidades particulares conforme aqui reveladas encontram aplicação, entre outras, no tratamento de fraturas ósseas e na formação e regeneração óssea.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O osso é um tecido vivo que compreende inúmeros constituintes incluindo carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, colágeno e água e é continuamente reabastecido pela reabsorção e deposição de matriz óssea.

Quando um osso se fratura, o tratamento comum é recolocar o osso fraturado de volta pra o lugar, a fim de estabilizar a posição do osso e, então, esperar que ocorra o processo de cura do osso. A cura óssea é um processo complexo que é geralmente considerado como envolvendo três fases: fase reativa, fase reparadora e fase de remodelagem.

Durante a fase reativa um hematoma se forma no local da fratura e células inflamatórias e fibroblastos se infiltram no osso sob a intervenção de prostaglandina. Isso resulta na formação de tecido de granulação, crescimento interno de tecido vascular e migração de células mesenquimais. Durante a fase reparadora, os fibroblastos começam a estabelecer o estroma que ajuda a suportar o crescimento interno vascular. À medida que o crescimento interno vascular progride, uma matriz de colágeno é estabelecida enquanto que o osteoide é secretado e subsequentemente mineralizado, o que leva à formação de um calo macio (cartilagem) ao redor do local de reparação. Após um período de tempo que dura de semanas a meses, a cartilagem se ossifica, formando uma ponte de osso não lamelar entre os fragmentos da fratura. Durante a fase de remodelagem, o osso neoformado é restaurado ao seu formato, estrutura e resistência mecânica originais. A fase de remodelagem ocorre lentamente ao longo de meses a anos, contudo, a resistência óssea adequada é tipicamente alcançada em três a seis meses.

A cura de fraturas ósseas é claramente um processo prolongado. De maneira notável, a cartilagem, diferente de outros tecidos conectivos, não contém vasos sanguíneos e, portanto, comparada com outros tecidos conectivos, seu crescimento e reparação são mais lentos. Ainda, a cura óssea pode ser atrasada ou impedida quando qualquer um dos processos de cura não funciona adequadamente ou em tempo hábil. Isso pode ser uma desvantagem principal ao indivíduo e um problema clínico dispendioso. Em conformidade, abordagens que aumentam a velocidade do processo de regeneração óssea e cartilaginosa natural do corpo são evidentemente vantajosas.

Os presentes inventores constataram de maneira surpreendente que extratos de planta revelados no presente documento e composições que compreendem os mesmos, promovem a reparação óssea e cartilaginosa induzindo uma nova formação óssea e um novo crescimento cartilaginoso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da invenção é fornecido um extrato biologicamente ativo de Hibiscus tiliaceus L.

O extrato pode compreender adicionalmente um extrato de um ou mais dentre Vigna marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L. ou Terminate catappa L.

O(s) extrato(s) pode(m) ser derivado(s) de um ou mais dentre os seguintes: casca de árvore, folha, vieira, feijão, casca ou noz. Em uma modalidade o extrato de Hibiscus tiliaceus L. é derivado de casca de árvore, tipicamente, casca de árvore esmagada fresca.

O extrato pode ser preparado com o uso de e/ou compreender, um óleo à base de planta, um hidrocarboneto e/ou um álcool. O óleo à base de planta pode ser derivado de sementes de planta ou fruta. Em uma modalidade particular, o óleo à base de planta é derivada de Cocos nucifera. O óleo de Cocos nucifera pode ser, por exemplo, óleo de Cocos nucifera virgem, óleo de Cocos nucifera refinado, óleo de Cocos nucifera hidrogenado ou óleo de Cocos nucifera fracionado.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende um extrato de acordo com o primeiro aspecto e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e/ou excipientes.

Em modalidades particulares, a composição serve para o tratamento de ferimento ósseo ou cartilaginoso e/ou para a promoção de formação, reparação ou regeneração óssea ou cartilaginosa.

A composição pode ser formulada com a finalidade de ser adequada para a administração por qualquer rota, por exemplo, tópica ou parenteral. A administração parenteral pode compreender, por exemplo, infusão intraóssea ou injeção intratecal.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para promover a formação, reparação ou regeneração de osso ou cartilagem em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo em necessidade disso uma quantidade eficaz de um extrato de acordo com o primeiro aspecto, uma composição de acordo com o segundo aspecto, ou osteoblastos, células progenitoras osteoblásticas ou segmentos ou fragmentos ósseos cultivados na presença do dito extrato ou composição.

O indivíduo pode sofrer de um ferimento, defeito ou doença óssea ou cartilaginosa ou pode ser suscetível ou predisposto a esse ferimento, defeito ou doença. O ferimento pode ser, por exemplo, uma fratura óssea. A doença pode ser uma doença óssea degenerativa, por exemplo, osteoporose. O indivíduo pode passar ou ter passado por um procedimento de enxerto ósseo ou cartilaginoso, como um procedimento de fusão esquelética, por exemplo, um procedimento de fusão espinhal.

Os osteoblastos ou células progenitoras osteoblásticas podem ser autogênicas, alogênicas ou xenogênicas.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para tratar um ferimento, defeito ou doença óssea ou cartilaginosa em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um extrato de acordo com o primeiro aspecto, uma composição de acordo com o segundo aspecto, ou osteoblastos, células progenitoras osteoblásticas, ou segmentos ou fragmentos ósseos cultivados na presença do dito extrato ou composição.

O ferimento pode ser, por exemplo, uma fratura óssea. A doença pode ser uma doença óssea degenerativa, por exemplo, osteoporose. O extrato ou composição pode acentuar a taxa ou extensão de cura do ferimento ou doença. O extrato ou composição pode promover a formação, reparação ou regeneração óssea ou cartilaginosa.

De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecido um método para promover o crescimento ósseo ou cartilaginoso ao redor de um enxerto ósseo ou cartilaginoso ou de um dispositivo implantável, sendo que o método compreende administrar a um indivíduo antes de, durante ou após um procedimento de enxerto ou implantação, uma quantidade eficaz de extrato de acordo com o primeiro aspecto, uma composição de acordo com o segundo aspecto, ou osteoblastos, células progenitoras osteoblásticas ou segmentos ou fragmentos ósseos cultivados na presença do dito extrato ou composição.

O enxerto pode ser um autoenxerto ou aloenxerto. O procedimento de enxerto pode ser, por exemplo, para a reparação de uma fratura óssea ou para os propósitos de fusão esquelética como fusão espinhal. O dispositivo implantável pode ser um dispositivo de fixação óssea ou uma prótese. O extrato de acordo com o primeiro aspecto, a composição de acordo com o segundo aspecto, ou osteoblastos, células progenitoras osteoblásticas ou segmentos ou fragmentos ósseos cultivados na presença do dito extrato ou composição podem ser revestidos na prótese, usados como um adjunto para um dispositivo de fixação óssea, ou usado como um adjunto para um cimento ósseo usado para ancorar uma prótese ou dispositivo de fixação óssea.

De acordo com os aspectos e modalidades acima, a administração ao indivíduo pode ser durante um procedimento artroscópico ou cirúrgico aberto.

De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido um método para a formação ou crescimento ósseo, sendo que o método compreende incubar osteoblastos, células progenitoras osteoblásticas ou segmentos ou fragmentos ósseos na presença de uma quantidade eficaz de um extrato de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, sob condições adequadas para induzir a formação ou crescimento ósseo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A presente invenção será agora descrita, a título de exemplos não limitadores apenas, com referência aos desenhos anexos nos quais:

A Figura 1 mostra perfis histológicos da pele de ratos fêmeas com 10 a 14 semanas de idade. A, nenhum tratamento; B, aplicação diária por 7 dias de óleo de coco; C, aplicação diária por 7 dias de Hibiscus tiliaceus L. em etanol; e D, aplicação diária por 7 dias de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco. As amostras da pele foram manchadas com hematoxilina e eosina e são mostradas a uma ampliação de x400.

A Figura 2 mostra perfis histológicos da pele de coelhos neozelandeses fêmeas com 12 semanas de idade. A e B, nenhum tratamento; C e D, aplicação diária por 7 dias de um extrato de combinação entre Vigna marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L., Terminate catappa L. e Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco; E e F, aplicação diária por 7 dias de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco. As amostras da pele foram manchadas com hematoxilina e eosina e são mostradas a uma ampliação de x40 (A, C, E) e x400 (B, D, F).

A Figura 3 mostra diferenças histológicas em ratos com deficiência estrogênica com 18 meses de idade (ovários removidos com 6 semanas de idade) não tratados (A e B) e tratados (C a F); e ratos com deficiência não estrogênica (procedimento cirúrgico de controle executado com 6 semanas de idade e foi permitido que os ratos se recuperassem) com 18 meses de idade não tratados (G e H) e tratados (I a L), seguindo uma fratura cirurgicamente criada do fêmur por osteotomia, e reparação operativa com fixação interna. Os ratos tratados foram submetidos a uma aplicação diária de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco no local da fratura por 21 dias. As amostras histológicas da fratura foram manchadas com hematoxilina e eosina (A, C, E, G, I, K) e mancha Saffron-0 (B, D, F, H, J, L) que mancha de roxo proteoglicano em cartilagem; e são mostradas a uma ampliação de xl2.

A Figura 4 mostra um gráfico de pontuação histológica nos locais da fratura em ratos com deficiência estrogênica (ovários removidos com 6 semanas de idade) com 18 meses de idade não tratados (Controle Ovx) (o procedimento cirúrgico de controle foi executado com 6 semanas de idade e foi permitido que os ratos se recuperassem); e ratos com deficiência de estrogênio (ovários removidos com 6 semanas de idade) com 18 meses de idade tratados (Ovx rx), seguindo uma fratura cirurgicamente criada do fêmur por osteotomia, e reparação operativa com fixação interna. Os ratos tratados foram submetidos a uma aplicação diária de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco no local da fratura por 3 semanas.

A Figura 5 mostra modelos de computador (A e C) e radiográficos (B e D) de defeitos da ulna de 20 mm criados cirurgicamente (incluindo periósteo) por osteotomia, e sem enxerto ou carga substituta em coelhos brancos neozelandeses com 12 semanas de idade, seguindo uma aplicação diária por 7 dias na superfície epitelial das costas, não no limbo do local da fratura de: A e C; óleo de coco com ext5rato de hidrocarboneto intermediário e; C e D; extrato de hidrocarboneto de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco.

A Figura 6 mostra perfis histológicos em coelhos neozelandeses fêmeas com 12 semanas de idade seguindo uma aplicação diária por 7 dias na superfície epitelial no local da fratura (defeito da ulna de 20 mm cirurgicamente criado (incluindo periósteo) por osteotomia, e sem nenhum enxerto ou carga substituta) de: um extrato de combinação entre Vigna marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L., Terminate catappa L. e Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco (Ce D); um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco (E e F). A e B, controles não tratados. As amostras foram manchadas com pentacromo e são mostradas a uma ampliação de xl2,5 (A, C, E) e x25 (B, D, F).

A Figura 7 mostra perfis histológicos de coelhos neozelandeses fêmeas com 12 semanas de idade seguindo uma aplicação diária na superfície epitelial no local da fratura (defeito da ulna de 20 mm cirurgicamente criado (incluindo periósteo) por osteotomia, e sem enxerto ou carga substituta) por 7 dias de: A e B, um extrato de combinação entre Vigna. marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L., e Terminate catappa L. (sem Hibiscus tiliaceus L.) em óleo de coco; C e D, um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em etanol; E e F, um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol; e G e H, um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol e hidrocarboneto. As amostras foram manchadas com pentacromo e são mostradas a uma ampliação de xl2,5.

A Figura 8 mostra um gráfico da pontuação de crescimento ósseo em defeitos de ulna de 20 mm criados cirurgicamente (incluindo periósteo) por osteotomia, em coelhos brancos neozelandeses com 12 semanas de idade, seguindo uma aplicação diária por 7 dias na superfície epitelial no local da fratura de: precipitado de Hibiscus tiliaceus L. de densidade intermediária em etanol (intermediário HeA); Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração com etanol (eAo); Hibiscus tiliaceus L. em etanol (etanol eA); e um extrato de combinação entre Vigna marina (Burm.) Mere., Cocos nucifera L., e Terminate catappa L. em óleo de coco seguindo a extração com etanol (eNPKo).

A Figura 9 mostra raios x (A a D) e uma varredura TC (E) da espinha de coelhos neozelandeses fêmeas submetidas a uma fusão póstero-lateral de nível único bilateral com o uso de um autoenxerto colhido da crista ilíaca com 12 semanas de idade. A cirurgia foi seguida de cuidados rotineiros (A e B) ou aplicação diária por 5 dias e, depois, aplicação duas vezes na semana até 6 semanas na superfície rostral epitelial no, mas não sobrepondo o local da fratura de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol e hidrocarboneto (C a E). Os raios x mostram a reparação espinhal bilateral, com A sendo massa de fusão de cura pós-operativa de seis semanas não tratada e C a tratada, e o local de coleta do doador na crista ilíaca em animais com 6 semanas não tratados (B) e tratados (D). A varredura TC mostra a crista ilíaca de um animal tratado em seis semanas (E).

A Figura 10 mostra perfis histológicos da espinha de coelhos neozelandeses fêmeas que foram submetidos à fusão póstero- lateral de nível único bilateral com o uso de autoenxerto coletado da crista ilíaca com 12 semanas de idade. A cirurgia foi seguida de cuidados rotineiros (A) ou aplicação diária por 5 dias e, depois, aplicação duas vezes por semana até 6 semanas na superfície epitelial rostral no, mas sem sobrepor, o local da fratura de 5 ml de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol e hidrocarboneto (B). As amostras foram manchadas com hematoxilina e eosina e são mostradas como um compósito de imagens a uma ampliação de xl2,5 que mostra o processo transverso e a massa de fusão espinhal de 2 a 3 mm lateral ao corpo vertebral.

A Figura 11 mostra os resultados da realização de testes mecânicos de autoenxertos tratados com 8 semanas e controles não tratados com 12 semanas.

A Figura 12 mostra cromatogramas de massa de: A, Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol e hidrocarboneto e; B, a camada intermediária de hidrocarboneto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os artigos "um" e "uma" são usados no presente documento para se referirem a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

Em todo este relatório descritivo e nas reivindicações que seguem, exceto se o contexto exigir de outra forma, a palavra "compreender", e variações como "compreende" ou "que compreende", serão compreendidas como implicando a inclusão de um número inteiro fixo ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

Conforme usado no presente documento, os termos "quantidade eficaz" e "dose eficaz" incluem em seu significado uma quantidade ou dose não tóxica, mas suficiente de um extrato ou composição para fornecer o efeito desejado. A quantidade ou dose exata exigida irá variar de aplicação para aplicação e de indivíduo para indivíduo, dependendo de fatores como se o extrato ou composição é administrada in vitro, ex vivo ou in vivo, as espécies a serem tratadas, a idade e condição geral do indivíduo, a gravidade da afecção a ser tratada, o extrato ou composição particular a ser administrada e o modo de administração e por aí em diante. Dessa forma, não é possível especificar uma quantidade ou dose eficaz exata. Entretanto, para qualquer caso dado, uma quantidade ou dose adequada eficaz pode ser determinada por um elemento versado na técnica com o uso apenas de experimentação rotineira.

Conforme usado no presente documento, o termo "extrato" refere-se a uma preparação ativa derivada de uma ou mais plantas. No contexto do relatório descritivo, compreende-se por "ativo" que o extrato é capaz de produzir um benefício terapêutico desejado conforme revelado no presente documento. Um extrato é obtido por um processo de "extração" que será compreendido pelos elementos versados na técnica como, em termos gerais, compreendendo tratar um material de planta com um solvente, um líquido ou um fluido supercrítico para dissolver a preparação ativa e separar a mesma do material de planta residual indesejado. Um extrato pode estar em uma forma líquida (por exemplo, como uma decocção, solução, infusão ou tintura) ou forma sólida (por exemplo, como um pó ou grânulos). O termo "extrato de combinação" conforme usado no presente documento se refere a um extrato preparado a partir de mais de uma espécie de planta. Em um extrato de combinação, o material de planta de cada uma das espécies de planta pode ser submetido ao processo de extração junto ou separadamente. Ou seja, o material de algumas ou de todas as espécies pode ser combinado antes da adição do solvente, líquido ou fluido supercrítico, e/ou material de algumas ou de todas as espécies pode ser tratado independentemente com um solvente, líquido ou fluido supercrítico e as preparações assim obtidas são subsequentemente combinadas. Como tal, os solventes iguais ou diferentes (ou líquidos ou fluidos supercríticos) podem ser usados para extrair a preparação ativa de espécies diferentes. Os termos "extrato" e "extrato de combinação" podem ser usados intercambiavelmente em todo este relatório descritivo.

Os termos "promover", "promoção" e variações dos mesmos conforme usados no contexto de formação, reparação ou regeneração óssea ou cartilaginosa se referem à capacidade de um extrato ou composição conforme revelado no presente documento de induzir, estimular, acentuar ou, de outra forma, efetuar ou causar, direta ou indiretamente, a formação de um novo osso ou cartilagem, ou o reparo ou regeneração de osso ou cartilagem. A promoção pode ocorrer in vivo, ex vivo ou in vitro. Os termos "acentuar", "acentuação" e variações dos mesmos conforme usados no presente documento no contexto de formação, reparação ou regeneração óssea ou cartilaginosa se referem à capacidade de um extrato ou composição conforme revelado no presente documento de acentuar ou aumentar, direta ou indiretamente, a taxa ou grau de ação de processo(s) fisiológico(s) natural(is) envolvido(s) na formação, reparação e/ou regeneração óssea ou cartilaginosa.

Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo" inclui seres humanos, primatas, animais de criação (por exemplo, ovelhas, porcos, gado, cavalos, burros), animais de teste de laboratório (por exemplo, camundongos, coelhos, ratos, porcos da índia), animais domésticos (por exemplo, cães e gatos), animais de exposição (por exemplo, cães, gatos, porcos, gado, ovelhas, cavalos) e animais selvagens capturados (por exemplo, raposas, cangurus, cervos). Tipicamente, o indivíduo é um ser humano ou um animal de teste de laboratório. Ainda mais tipicamente, o indivíduo é um ser humano.

Conforme usado no presente documento, os termos "tratar", "tratamento", "prevenir" e "prevenção" referem-se a qualquer e todos os usos que remediam uma afecção ou sintomas, previnem o estabelecimento de uma doença ou, senão, evita, adia, retarda ou reverte a progressão de uma afecção ou doença ou outros sintomas indesejados de qualquer forma. Portanto, os termos "tratamento" e "prevenção" e similares devem ser considerados em seu contexto mais amplo. Por exemplo, o tratamento não necessariamente implica um paciente ser tratado até a recuperação total.

No contexto desse relatório descritivo, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o composto ao qual se refere é adequado para uso em contato com tecidos do corpo sem indevida toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação, reação alérgica ou similares, comensurado com um razão de benefício/risco razoável.

A presente invenção é estabelecida sobre a constatação surpreendente do inventor, conforme exemplificado no presente documento, de que o uso de extratos de várias plantas das ilhas do Pacífico possui atividade biológica quando administradas à pele mamífera, promovendo a reparação óssea e cartilaginosa e a formação de novos ossos e cartilagem.

Em conformidade, são fornecidos no presente documento extratos biologicamente ativos de Hibiscus tiliaceus L. e composições que compreendem o mesmo.

Embora exemplificado com o uso de extratos de Hibiscus tiliaceus, também é contemplado que o extrato pode ser, também, derivado de uma ou mais de qualquer uma de Hibiscus sp. incluindo, mas sem limitação, Hibiscus acetosella, Hibiscus brackenridgeí, Hibiscus cannabinus, Hibiscus diversifolius, Hibiscus lavaterioide, Hibiscus ludwigii, Hibiscus macrophyllus, Hibiscus macropodus, Hibiscus elatus, Hibiscus escobariae, Hibiscus ficulneus, Hibiscus pa ram uta bilis, Hibiscus pedunculatus, Hibiscus platanifolius, Hibiscus radiatus, Hibiscus rosa-sinensis, Hibiscus sabdariffa, Hibiscus schizopetalus, Hibiscus scottii, Hibiscus socotranus, Hibiscus sinosyriacus, Hibiscus splendens, Hibiscus stenanthus, Hibiscus striatus, Hibiscus syriacus, Hibiscus trilobus, ou Hibiscus waimeae.

Extratos e composições, de acordo com algumas modalidades, podem, ainda, compreender extratos de Vigna sp. e/ou Terminate sp. Em modalidades particulares, a Vigna sp. é Vigna marina (Burm.) e/ou a Terminate sp. é Terminate catappa. Também se contempla que o extrato de Vigna sp. pode ser derivado de um ou mais dentre, mas sem limitações, Vigna aconitifolia, Vigna angularis, Vigna caracalla, Vigna debilis, Vigna dinteri, Vigna lanceolata, Vigna luteola, Vigna maritime, Vigna mungo, Vigna o-wahuensis, Vigna parkeri, Vigna radia ta, Vigna speciosa, Vigna subterrânea, Vigna trilobata, Vigna umbellata, Vigna unguiculata ou Vigna vexillate. Também se contempla que o extrato de Terminalia sp. pode ser derivado de um ou mais dentre, mas sem limitação, Terminalia acuminata, Terminalia alata, Terminalia altíssima, Terminalia amazonia, Terminalia angustifolia, Terminalia arbórea, Terminalia arbuscula, Terminalia archipelagi, Terminalia arjuna, Terminalia australis, Terminalia avicennioides, Terminalia bellinca, Terminalia bialata, Terminalia brachystemma, Terminalia brassii, Terminalia bucidoides, Terminalia buceras (Bucida buceras), Terminalia bursarina, Terminalia calamansanai, Terminalia chebula, Terminalia cherrieri, Terminalia ciliata, Terminalia citrina, Terminalia copelandii, Terminalia corticosa, Terminalia eddowesii, Terminalia edulis, Terminalia elliptica, Terminalia eriostachya, Terminalia erythrophylla, Terminalia ferdinandiana, Terminalia foetidissima, Terminalia franchetii, Terminalia glabrescens, Terminalia glaucifolia, Terminalia hararensis, Terminalia hecistocarpa, Terminalia intermedia, Terminalia ivorensis, Terminalia januariensis, Terminalia kaernbachii, Terminalia kangeanensis, Terminalia kuhlmannii, Terminalia latifolia, Terminalia mantaly, Terminalia molinetii Terminalia muelleri, Terminalia myriocarpa, Terminalia nitens, Terminalia novocaledonica, Terminalia oblongata, Terminalia obovata, Terminalia oliveri, Terminalia paniculata, Terminalia parviflora, Terminalia pellucida, Terminalia phanerophlebia, Terminate phellocarpa, Terminalia prunioides, Terminalia reitzii, Terminalia rerei, Terminalia schimperiana, Terminalia sericea, Terminalia seriocarpa, Terminalia subspathulata, Terminalia superba, Terminalia tripteroides ou Terminalia volucris.

Também são fornecidos métodos para a promoção ou acentuação de formação, reparação ou regeneração óssea ou cartilaginosa empregando extratos e composições, conforme apresentado no presente documento. Tais métodos encontram aplicação, dentre outros, no tratamento de ferimentos, defeitos ou doenças ósseas ou cartilaginosas. O ferimento, defeito ou doença pode ser agudo ou crônico. Aqueles versados na técnica apreciarão prontamente o escopo de ferimentos, defeitos e doenças aos quais as modalidades descritas no presente documento se referem, sendo aqueles em que a formação de novos ossos ou cartilagem, a reparação de osso ou cartilagem danificado ou, de outra forma, defective, ou a regeneração óssea ou cartilaginosa são desejados ou vantajosos. A título de exemplo, apenas, o ferimento pode ser, por exemplo, consequência de trauma, como fratura óssea ou ferimento meniscal. A título de exemplo, defeitos e doenças incluem defeitos ósseos congênitos, deformação óssea ou espinhal, osteosarcoma, displasia óssea, osteoporose, osteomalacia (raquitismo), osteogênese imperfeita (doença dos ossos frágeis), doença óssea de Paget, osteoartrite e outras doenças e afecções caracterizadas por ou associadas ao metabolismo ósseo anormal, formação ou reabsorção.

As modalidades, conforme apresentadas no presente documento, também encontram aplicação no contexto de procedimentos cirúrgicos para corrigir ferimentos, deformações ou doenças ósseas, em que a promoção ou acentuação de crescimento ou regeneração óssea é vantajosa. Por exemplo, as modalidades apresentadas no presente documento podem ser usadas em conjunto com um procedimento de fusão esquelética (por exemplo, fusão espinhal), reconstrução ou remoção de disco espinhal, ou o implante de material de preenchimento ósseo (como blocos de hidroxipatita, tampões de matriz óssea desmineralizada, matrizes de colágeno), um dispositivo de fixação (como um bastão, um parafuso, pino, placa ou similares), implante cirúrgico ou dispositivo prostético (como um quadril ou joelho prostético), ou com um cimento ósseo (como aquele usado para preencher um espaço entre um osso e m dispositivo prostético e ou para ancorar um dispositivo prostético a um osso). O material implantado, implante ou dispositivo pode ser reabsorvível ou não reabsorvível.

Em modalidades particulares, a aplicação de extratos e composições para os fins de tratamento de ferimentos, defeitos e distúrbios ósseos pode ser alcançada com om uso de procedimentos ex vivo. Por exemplo, no caso de ferimentos, como fraturas ósseas, um fragmento(s) ósseo(s) ou segmento(s) ósseo(s) pode ser removido do sujeito a ser tratado e cultivado ex vivo com um estrato ou composição, conforme apresentado na presente invenção. O(s) fragmento(s) ósseo(s) ou segmento(s) ósseo(s) e extrato ou composição também podem ser cultivados juntos com um dispositivo de fixação óssea ou uma prótese, se apropriado. Seguindo a cultura sob condições adequadas e por um período de tempo adequado, para pelo menos iniciar a formação, reparação ou regeneração óssea, o(s) fragmento(s) ósseo(s) ou segmento(s) ósseo(s), e, opcionalmente, o dispositivo de fixação óssea ou prótese pode ser reintroduzido no sujeito. As condições de cultura dependerão da aplicação, entretanto, as condições adequadas podem ser prontamente determinadas por um indivíduo versado na técnica sem a necessidade de experimentação indevida. Alternativamente, as circunstâncias podem precisar do uso de fragmento(s) ou segmento(s) ósseo(s) de outros indivíduos ou organismos.

De modo similar, os osteoblastos ou células progenitoras osteoblásticas podem ser cultivadas ex vivo com um extrato ou composição, conforme descrito no presente documento anteriormente à sua introdução em um sujeito que necessita de tratamento. As células podem ser autólogas (autogênicas), alogênicas ou xenogênicas. A terapia celular ex vivo também pode ser empregada como uso de células tronco mesenquimais retiradas, por exemplo, de medula óssea ou sangue periférico adulto, células tronco embrionárias, células tronco adultas ou quaisquer outras células multipotentes, pluripotentes ou totipotentes, ou células projetadas geradas in vitro. O termo "células progenitoras osteoblásticas", conforme usado no presente documento, abrange todas as células multipotentes, pluripotentes e totipotentes, seja de derivação natural ou criação artificial, que têm a habilidade de se diferenciarem em osteoblastos.

Extratos da invenção podem ser extratos aquosos, baseados em óleo e/ou solvente orgânico, obtidos por extração única, combinada e/ou sucessiva de qualquer material de planta disponível, como folhas, raízes, casca de árvore, caules, frutos, brotos, nozes, cascas de nozes, sementes, capsulas de sementes, grãos, flores, videira e/ou madeira. Processos de extração adequados, e solventes e líquidos adequados para a extração, são conhecidos para aqueles versados na técnica. Solventes aquosos (por exemplo, água, ácidos, bases); óleos (por exemplo, óleo derivado de Cocos nucifera); e solventes orgânicos, que podem ser polares (como álcoois, por exemplo, etanol), não polares (por exemplo, hexano) e/ou halogenados (por exemplo, diclorometano), usados para a extração pode ser usados ou sequencialmente para a extração ou em mistura de combinação. Significativamente, conforme exemplificado no presente documento, a atividade do extrato é mantida quando extraída em óleo de Cocos nucifera, solventes polares (por exemplo, etanol) ou solventes não polares (por exemplo, isopentano). A extração de fluido supercrítica como uso, por exemplo, de nitrogênio supercrítico ou dióxido de carbono, também pode ser usada de acordo com a invenção para a obtenção de extratos.

Ademais, será observado por aqueles versados na técnica que um extrato da invenção pode ser submetido a uma ou mais etapas de extração para, por exemplo, aumentar ou manter a estabilidade do extrato, modificar a forma física do extrato ou auxiliar na formulação do extrato em uma composição para a administração a um indivíduo. A título de exemplo, apenas um extrato em forma líquida pode ser liofilizado para produzir uma forma sólida do extrato.

Os extratos da presente invenção podem ser derivados de qualquer material de planta adequado. Material de planta adequado inclui folhas, raízes, casca de árvore, caules, frutos, nozes, cascas de nozes, sementes, cápsulas de sementes, grãos, videiras ou madeira. O material de planta pode ser, por exemplo, fresco, seco ou seco por congelamento. Para qualquer dada espécie de planta, mais que um material de planta pode ser usado para a produção de extratos. Onde derivado de Hibiscus tiliaceus L, tipicamente, o extrato é um extrato de folha, videira e/ou feijão.

O(s) extrato(s) da invenção pode(m) ser administrado(s) de acordo com a presente invenção na forma de composições farmacêuticas, sendo que essas composições podem compreender um ou mais carreadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Os extratos podem, além disso, ser combinados a outros agentes terapêuticos, por exemplo, mas sem limitação a, antibióticos, agentes microbianos, antissépticos, anestésicos e/ou outros agentes de promoção de crescimento ou reparação óssea ou cartilagionsa.

Será compreendido que o nível de dose específico de uma composição da invenção para qualquer indivíduo particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, a atividade do(s) extrato(s) específico(s) empregado(s), a idade, peso corporal, saúde geral e dieta do indivíduo a ser tratado, o tempo de administração, a estabilidade do(s) extrato(s), o sítio de aplicação no corpo, e a combinação com qualquer outro tratamento ou terapia. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com níveis e padrão de dose sendo determinados, conforme exigido dependendo das circunstâncias e dos indivíduos a serem tratados. Regimes de dosagem adequados podem ser determinados prontamente pelo destinatário versado na técnica. Uma faixa ampla de doses pode ser aplicável. Levando em consideração um sujeito humano, por exemplo, de cerca de 0,1 mg a cerca de 1 mg de extrato pode ser administrado por quilograma de peso corporal por dia. Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a reação terapêutica ótima. Por exemplo, diversas dosagens divididas podem ser administradas por hora, dia, semana, mês ou em outros intervalos de tempo adequados ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conforme indicado pelas exigências da situação.

Em geral, espera-se que uma dosagem eficaz esteja na faixa de cerca de 0,0001 mg a cerca de 1.000 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; tipicamente, cerca de 0,001 mg a cerca de 750 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 500 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 0,1 mg a cerca de 250 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 1.0 mg a cerca de 250 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas. Mais tipicamente, espera-se que uma faixa de dosagem eficaz esteja na faixa de cerca de 1,0 mg a cerca de 200 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 1,0 mg a cerca de 25 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 20 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas; cerca de 5,0 mg a cerca de 15 mg por quilograma de peso corporal por 24 horas.

O extrato pode estar presente em uma quantidade entre cerca de 0,001% (p/p) e cerca de 15% (p/p), ou entre cerca de 0,001% e cerca de 12%, ou entre cerca de 0,001 % e cerca de 10%, ou entre cerca de 0,005% e cerca de 10%, ou entre cerca de 0,01% e cerca de 10%, ou entre cerca de 0,05% e cerca de 10%, ou entre cerca de 0,05% e cerca de 5% na composição tópica.

As composições, conforme apresentadas no presente documento, podem ser administradas através de qualquer rota conveniente ou adequada, como, por exemplo, pelas rotas parenteral, tópica, oral ou nasal. A administração parenteral pode compreender, por exemplo, infusão intraóssea, ou administração intratecal, intravenosa, intraarterial, intramuscular ou subcutânea. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser realizado com o uso de métodos e composições, conforme descrito no presente documento, durante procedimentos antrocópicos ou cirúrgicos.

As formulações tópicas compreendem, tipicamente, um ou mais extratos da invenção junto com um ou mais carreadores aceitáveis e, opcionalmente, quaisquer outros ingredientes terapêuticos. As formulações adequadas para a administração tópica podem estar em qualquer forma adequada, formulada, por exemplo, como unguentos, loções, cremes, géis, pomadas ou pastas. Exemplos de carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis carreadores são água desmineralizada ou destilada; solução salina; óleos de base vegetal, como óleo de amendoim, óleo de açafrão, azeite, óleo de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim, óleo de arachis ou óleo de coco; óleos de silicone, incluindo polisiloxanos, como polisiloxano de metila, polisiloxano de fenila e polisolpoxano de metilfenila; silicones voláteis; óleos minerais, como parafina líquida, parafina ou esqualeno macio; derivados de celulose, como metil celulose, etil celulose, carboximetilcelulose, carboximetilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanois inferiores, por exemplo, etanol ou iso-propanol; aralcanois inferiores; polialquileno glicois ou alquileno glicois inferiores, por exemplo, polietileno glicol, poliproprileno glicol, etileno glicol, propileno glicol, 1,3-butileno glicol ou glicerina; ésteres de ácido graxo, como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinilpirridona; ágar; carragena; goma tragacanto ou goma acácia, e vaselina. Tipicamente, o carreador ou carreadores formarão de 10% a 99,9% em peso das composições.

As loções, de acordo com a presente invenção, incluem aquelas adequadas para a aplicação à pele ou uma porção epidérmica. As loções ou unguentos para a aplicação à pele também podem incluir um agente para acelerar a secagem e resfriar a pele, como um álcool ou acetona, e/ou um hidratante, como glicerol, ou óleo, como óleo de coco, óleo de rícino ou óleo de arachis.

Cremes, pomadas ou pastas, de acordo com a presente invenção, são formulações semi-sólidas do extrato para a aplicação externa. Podem ser feitas ao misturar o extrato em forma dividida de maneira refinada ou em pó, sozinho ou em solução ou suspensão em um fluido aquoso ou não aquoso, com uma base gordurosa ou não gordurosa. A base pode compreender hidrocarbonetos como parafina rígida, macia ou líquida, glicerol, cera de abelha, um sabonete metálico; uma mucilagem; um óleo de origem natural, como óleo de coco, amêndoa, milho, arachis, de rícino ou azeite; lanolina ou seus derivados, ou um ácido graxo, como esteárico ou oleico junto com um álcool, como propileno glicol ou macrogóis.

As composições da invenção podem ser incluídas em veículos tópicos em uma quantidade entre cerca de 0,001% (p/p) e cerca de 90% (p/p), ou entre cerca de 1% (p/p) e cerca de 50% (p/p), ou entre cerca de 1% (p/p) e cerca de 40% (p/p), ou entre cerca de 1% (p/p) e cerca de 20% (p/p) ou cerca de 0,01%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%.

Os extratos e/ou composições também podem ser impregnados de qualquer forma em ataduras transdérmicas, emplastros e curativos, como bandagens ou curativos hidrocoloides, por exemplo, em forma líquida ou semilíquida. Os extratos e/ou composições também podem ser revestidos sobre ou usados como um auxiliar ou um dispositivo de fixação óssea, uma prótese ou um cimento ósseo. Os extratos e/ou composições também podem ser usados como um aditivo a um extensor de enxerto ósseo ou substituto ósseo, por exemplo, osso de aloenxerto, hidroxiapatita, fosfato de tricálcio ou volanosita.

Em circunstâncias particulares, por exemplo, na promoção pós-cirúrgica de reparação, regeneração ou formação óssea e cartilaginosa, a administração de composições por administração parenteral, tipicamente injeção, pode ser apropriada. As formas farmacêuticas para o uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (em que são solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis. Devem estar estáveis sob as condições de produção e armazenamento e devem ser protegidas contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. O carreador pode ser um meio de solvente ou de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido e similares), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, como lecitina, através da conservação do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser causada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada pelo uso, nas composições, de agentes retardadores de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas através da incorporação dos compostos ativos na quantidade exigida no solvente apropriado com diversos outros ingredientes enumerados acima, conforme exigido, sucedido pela esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas através da incorporação de diversos extrato(s) esterilizado(s) em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparo são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pó do extrato mais qualquer extrato desejado adicional a partir de uma solução estéril previamente filtrada do mesmo.

As composições da invenção também podem ser convenientemente apresentadas em forma de unidade de dosagem e preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. O método pode incluir a etapa de colocar os componentes da composição oral em associação com um carreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas ao colocar de maneira uniforme e íntima em associação os componentes da composição oral com um carreador líquido ou carreador sólido dividido de maneira refinada, ou ambos, e, então, se necessário, conformar o produto na composição desejada.

As composições adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas (isto é, formas de dosagem) como gelatina ou cápsulas, pílulas ou tabeles de HPMC, cada um contendo uma quantidade predeterminada de cada componente da composição como um pó, grânulos, como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso, ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo.

Quando a composição é formulada como cápsulas, os componentes da composição oral podem ser formulados com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como amido, lactose, celulose microcristalina e/ou dióxido de silício. Os ingredientes adicionais podem incluir lubrificantes, tal como estearato de magnésio e/ou estearato de cálcio.

Tabletes podem ser preparados por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes adicionais. Os tabletes comprimidos podem ser preparados ao comprimir em uma máquina adequada os componentes da composição oral em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio ou estearato de cálcio), diluente inerte ou um agente dispersante/de superfície ativa. Os tabletes moldados podem ser feitos através de moldagem de uma mistura da composição em pó umedecida com um diluente líquido inerte, em uma máquina adequada. Os tabletes podem, opcionalmente, ser revestidos, por exemplo, com um revestimento entérico e podem ser formulados de modo a fornecer uma liberação controlada ou lenta da composição no mesmo.

A presente invenção contempla terapias de combinação, em que extratos ou composições, conforme descritas na presente invenção, são coadiministradas com outros agentes adequados ou tratamentos que podem facilitar o efeito terapêutico desejado. Por exemplo, pode-se buscar administrar antibióticos, agentes antimicrobianos, anestésicos, analgésicos ou outros agentes de promoção de reparo ou crescimento de cartilagem ou ósseo em combinação com os extratos ou composições reveladas na presente invenção. Por "coadministrado", entende-se a administração simultânea na mesma formulação ou em duas diferentes formulações através das mesmas ou diferentes rotas ou administração sequencial pelas mesmas ou diferentes rotas. Por administração "sequencial", entende-se uma diferença de tempo de segundos, minutos, horas ou dias entre a administração dos dois tipos de agentes. Os agentes podem ser administrados em qualquer ordem. Por exemplo, as modalidades da presente invenção contemplam a administração de um lipídeo ou um óleo, por exemplo, óleo de Cocos nucifera antes de ou após o extrato ou composição ser administrada.

A referência, neste relatório descritivo, a qualquer publicação anterior (ou informações derivadas dessa) ou a qualquer assunto que seja conhecido não é e não deve ser considerada como de que um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão de que essa publicação anterior (ou informações derivadas dessa) ou assunto conhecido forme parte do conhecimento geral comum no campo de empenho ao qual este relatório descritivo se refere.

A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos específicos, que não devem ser interpretados como limitante, de qualquer maneira, do escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1 Preparação de um extrato de combinação de Vigna marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L, Terminalia catappa L. e Hibiscus tiliaceus L em óleo de coco

Óleo de coco (200 ml) foi adicionado a folhas fragmentadas frescas de Vigna marina (Burm.) Merr. (100 g) e folhas fragmentadas frescas de Terminalia catappa L. (100 g). A mistura foi colocada em um cadinho em um banho de água a 100°C por 20 minutos. A mistura foi removida do calor e imediatamente filtrada e pressionada para extrair o óleo de coco. O óleo de coco resultante, contendo os extratos de Vigna marina (Burm.) Merr. e Terminalia catappa L, foi adicionado à casca triturada fresca de uma noz verde de Cocos nucifera L (100 g) e a casca de árvore raspada de Hibiscus tiliaceus L. (100 g). Deixou-se que a mistura fosse assentada por 4 horas e, então, filtrada e prensada para extrair o óleo de coco.

O óleo de coco foi, então, invertido e armazenado a menos que 20°C até que o óleo de coco solidificou. Qualquer sólido ou umidade restante na mistura foi removido pela decantação do óleo de coco solidificado. O óleo de coco foi, então, aquecido em um banho de água quente a aproximadamente 56°C e filtrado. O filtrado resultante continha um extrato de combinação de Vigna marina (Burm.) Merr., Cocos nucifera L, Terminalia catappa L e Hibiscus tiliaceus L.

Exemplo 2 - Preparação de extratos de Hibiscus tiliaceus L. 2.1 Extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco

A casca de árvore triturada fresca de Hibiscus tiliaceus L. (100 g) foi imersa em óleo de coco (100 ml). O extrato foi preparado através de prensagem a frio da mistura de Hibiscus tiliaceus L. e óleo de coco; ou através do aquecimento da mistura. A prensagem a frio foi executada ao colocar a mistura de Hibiscus tiliaceus L. e óleo de coco dentro de um êmbolo de café novo e deixando a mistura assentar por 1 hora, o êmbolo foi, então, pressionado, assim, extraindo o óleo. Deixou-se a mistura assentar por 5 minutos adicionais e o êmbolo foi pressionado novamente para liberar mais óleo. Esse processo foi repetido 5 vezes até que nenhum óleo adicional fosse obtido. Quando o extrato foi preparado por aquecimento, a mistura de Hibiscus tiliaceus L. e óleo de coco foi aquecida em um cadinho em um banho de água a 100°C por 20 minutos, removida do calor e, então, imediatamente filtrada e prensada para extrair o óleo de coco. Qualquer sólido ou umidade restante no extrato após a prensagem a frio ou aquecimento e filtragem foi removido invertendo-se o extrato de óleo de coco e armazenando o mesmo a menos que 20°C até que o óleo de coco solidificou e, então, decantando o óleo de coco solidificado; ou pela decantação em um funil separado.

2.2 Extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco após a extração em etanol

A casca de árvore triturada fresca de Hibiscus tiliaceus L. (1.000 g) foi imersa em etanol 95 a 100% (2.000 ml) e deixada a impregnar por 6 horas. O etanol foi, então, removido e o Hibiscus tiliaceus L. impregnado em uma segunda parte alíquota de etanol (2.000 ml) por 6 horas adicionais. Os extratos de etanol resultantes foram adicionados ao óleo de coco (250 ml). Mais que a metade do volume de etanol foi removida pelo aquecimento acima do ponto de ebulição do etanol. O óleo de coco foi, então, extraído pela decantação da solução seguindo o repouso por pelo menos 2 horas em um vaso de decantação; ou invertendo-se o óleo de coco extrato e armazenando o mesmo a menos que 20°C até que o óleo de coco solidificou e, então, decantando o óleo de coco solidificado.

2.3 Extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco após a extração em etanol e hidrocarboneto

A casca de árvore triturada fresca de Hibiscus tiliaceus L. (1.000 g) foi imersa em etanol 95 a 100% (2.000 ml) e deixada a impregnar por 6 horas. O etanol foi, então, removido e o Hibiscus tiliaceus L. impregnado em uma segunda parte alíquota de etanol (2.000 ml) por 6 horas adicionais.

A solução de etanol resultante foi agitada com hexano, pentano, metil butano ou um hidrocarboneto equivalente ou fluoro/cloro/bromo-hidrocarboneto (250 ml). A camada de hidrocarboneto e a camada de espuma oleosa foram decantadas a partir da solução seguindo o repouso por pelo menos 2 horas em um vaso de decantação; ou pela diluição da solução de etanol de 95% a uma concentração inferior, nominalmente, mas não necessariamente etanol a 50% e, então, decantada após assentamento das camadas. Água (250 ml) ou álcool (250 ml) foi adicionado à camada de hidrocarboneto extraída. A esse óleo de coco (250 ml) foi adicionado, a mistura foi agitada e permitiu-se que a mesma fosse assentada. O hidrocarboneto foi removido a partir do aquecimento da mistura ao ponto de ebulição do hidrocarboneto.

2.4 Extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco após a extração em etanol

A casca de árvore triturada fresca de Hibiscus tiliaceus L. (1.000 g) foi imersa em etanol 95 a 100% (2.000 ml) e deixada a impregnar por 6 horas. O etanol foi, então, removido e o Vigna marina (Burm.) Merr. impregnado em uma segunda parte alíquota de etanol (2.000 ml) por 6 horas adicionais. A solução de etanol resultante foi agitada com óleo de coco (250 ml). O hidrocarboneto foi decantado a partir da solução seguindo constante por pelo menos 2 horas em um vaso de decantação; ou pela diluição da solução de etanol a 95% a uma concentração inferior, nominalmente, mas não necessariamente etanol a 50% e, então, decantada após o assentamento das camadas. A decantação do óleo de coco pode ser facilitada pela adição de um hidrocarboneto de ponto de ebulição baixo à mistura conforme a mesma agita e assenta. O óleo de coco foi, então, invertido e armazenado a menos que 20°C até que o óleo de coco solidificou ou pela decantação em vasos de separação.

Exemplo 3 - Efeito de extratos individuais de Hibiscus tiliaceus L. na pele

Uma avaliação da atividade dos extratos preparados conforme descrito no Exemplo 2 na pele foi executada. Uma dose diária de 1 ml do extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco (Exemplo 2.1) e 1 ml do extrato de Hibiscus tiliaceus L. em etanol (Exemplo 2.2). Os extratos foram aplicados topicamente à superfície epitelial das costas de ratos fêmeas de 10 a 14 semanas de idade. Os controles foram ratos fêmeas de 10 a 14 semanas de idade tratados diariamente com 1 ml de óleo de coco ou deixados sem tratamento.

As Figuras IA a 1D mostram a histologia da pele a 7 dias do controle não tratado (IA) após uma aplicação diária de óleo de coco (1B); uma preparação de extrato de Hibiscus tiliaceus L. em etanol (1C); e a extração seguinte de óleo de coco com etanol (1 D). Os perfis histológicos mostram que o extrato tem uma atividade limitada em etanol, mas que no óleo de coco o extrato induz a hipertrofia do epitélio e apêndices epiteliais, particularmente, folículos capilares.

Uma avaliação da atividade dos extratos preparados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2.2 na pele foi executada. Uma dose diária de 1 ml dos extratos foi aplicada topicamente à superfície epitelial das costas de coelhos da Nova Zelândia fêmeas de 12 semanas de idade. O controle foi a pele não tratada de coelhos da Nova Zelândia fêmeas de 12 semanas de idade.

As Figuras 2A a 2F mostram a histologia da pela a 7 dias do controle não tratado (2A e B); e após uma aplicação diária de um extrato de combinação de Vigna marina (Burm.) Mem, Cocos nucifera L, Terminalia catappa L. e Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco preparado conforme descrito no Exemplo 1 (2C e D); e Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco preparado conforme descrito no Exemplo 2.2 (2E e F). Os perfis histológicos mostram que o extrato induz a hipertrofia do epitélio e apêndices epiteliais, particularmente, folículos capilares.

Exemplo 4 - Tratamento de fraturas em ossos deficientes de estrogênio ou não estrogênio

Um estudo realizado para avalizar o efeito de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. preparado conforme descrito no Exemplo 2.1, no reparo de fratura óssea em ratos deficientes de não estrogênio ou deficientes de estrogênio. No estudo, uma dose diária de 1 ml do extrato foi aplicada topicamente à superfície epitelial de ratos deficientes de estrogênio (ovários removidos com a idade de 6 semanas) de 18 meses de idade e ratos de 18 meses de idade com seus ovários intactos (um procedimento cirúrgico de controle foi realizado a 6 semanas de idade e permitiu-se que os ratos se recuperassem), seguindo uma fratura criada cirurgicamente do fêmur por osteotomia e reparo operativo com fixação interna. O extrato foi aplicado diariamente os animais de teste por um total de 3 semanas. Os animais de controle eram ratos deficientes de estrogênio (ovários removidos com a idade de 6 semanas) de 18 meses de idade e ratos de 18 meses de idade com seus ovários intactos sem nenhuma aplicação tópica do extrato. Em 3 semanas, a histologia dos animais foi avaliada, com atenção particular prestada à nova formação óssea e cartilagem na fratura cicatrizando.

As Figuras 3A a 3H mostram a histologia no local de fratura. Os resultados indicam crescimento extensivo de cartilagem nova e nova formação óssea seguindo as tampas de cartilagem nos grupos tratados, particularmente digno de nota é a quantidade ocorrendo nos ossos deficientes de estrogênio.

A Figura 4 é um gráfico que mostra a pontuação histológica dos locais de fratura de ratos deficientes de estrogênio não tratados (Controle Ovx) e ratos deficientes de estrogênio tratados (Ovx rx). A fim de determinar a pontuação histológica total, os seguintes parâmetros de resposta de tecido e cicatrização de fratura foram pontuados: formação de calo, união óssea, alterações da medula e remodelação de córtex. Cada parâmetro foi pontuado de 0 (nenhuma formação de calo; nenhum osso novo na fratura; tecido fibroso ou vermelho; e nenhuma remodelação) a 3 (formação de calo completa em todo o defeito; união de ponte óssea completa; medula gordurosa do tipo adulto; e córtex de remodelação completa), com uma pontuação de 1 indicando cicatrização branda (<50%) e uma pontuação de 2 indicando cicatrização moderada (>50%, mas menos que a resposta de tecido ou cicatrização de fratura completa). Após 3 semanas, houve uma pontuação histológica total significantemente mais alta para a resposta de tecido e cicatrização de fratura nos locais de fratura de ratos deficientes de estrogênio tratados em comparação a ratos deficientes de estrogênio não tratados.

Exemplo 5 - Tratamento de fraturas

Um estudo foi realizado para avaliar o efeito de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. preparado, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2.1, na cicatrização de fratura óssea. No estudo, uma dose diária de 1 ml do extrato foi aplicada topicamente à superfície epitelial de coelhos brancos NZ de 12 semanas de idade, seguindo um defeito de 20 mm criado cirurgicamente da ulna (incluindo periósteo) pela osteotomia e sem nenhum enxerto ou preenchimento substituto. O extrato foi aplicado diariamente aos animais de teste por um total de 1 semana.

Os animais de controle foram coelhos brancos NZ de 12 semanas de idade sem nenhuma aplicação tópica do extrato. Em 1 semana, a histologia e radiologia dos animais foram avaliadas, com atenção particular prestada à nova formação óssea e de cartilagem.

As Figuras 5A a 5D são radiografias do osso e as Figuras 6A a 6F e 7A a 7D mostram a histologia do defeito ósseo no local de fratura. As figuras ilustram o efeito dos extratos de Hibiscus tiliaceus L. na cicatrização da fratura. Após sete dias, houve significantemente mais formação óssea, nova formação de cartilagem e maior vascularidade no local de fratura que nas frações de tratamento de controle ou não tratadas.

A Figura 8 é um gráfico da pontuação de crescimento ósseo que mostra a cicatrização óssea do defeito avaliado com o uso de uma definição de pontuação de cicatrização com base no porcentual do espaço ocupado por cartilagem ou osso. O seguinte sistema de pontuação foi usado: 0 = nenhum osso visível; 1 = novo crescimento ósseo mínimo (1% a 20%); 2 = cartilagem branda (1 a 20%) com novo crescimento ósseo; 3 = crescimento de ossos e cartilagem moderado (20% a 40%); 4 = crescimento de ossos e cartilagem marcado (60 a 80%); 5 = defeito completo preenchido com osso e cartilagem; 6 = defeito preenchido com osso e nenhuma cartilagem; 7 = osso cortical substituindo osso não lamelar; e 8 = nova formação de espaço de medula. Após 7 dias, houve significantemente mais formação de ossos no local de fratura tratado com Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração com etanol (eAo) que os locais de fratura tratados com precipitado de Hibiscus tiliaceus L. de densidade intermediária em etanol (HeA Intermediário) em frações de tratamento de controle ou não tratadas; Hibiscus tiliaceus L. em etanol (eA Etanol); ou um extrato de combinação de Vigna marina (Burm.) Merr,

Cocos nucifera L, e Terminate catappa L. em óleo de coco seguindo a extração com etanol (eNPKo).

Exemplo 6 - Formação óssea após um autoenxerto de fusão espinhal

Um estudo foi realizado para avaliar o efeito de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. preparado conforme descrito no Exemplo 2.4 no reparo de fratura óssea. No estudo, uma dose diária de 1 ml do extrato foi aplicada topicamente à superfície epitelial de coelhos brancos NZ de 12 semanas de idade, seguindo a anestesia e uma fusão póstero- lateral de nível único bilateral com o uso de um autoenxerto retirado das cristas ilíacas. O extrato (5 ml) foi aplicado diariamente aos animais de teste por 5 dias e, então, duas vezes semanalmente até o sacrifício. Os animais de controle foram coelhos brancos NZ de 12 semanas de idade sem nenhuma aplicação tópica do extrato.

As Figuras 9A a 9E mostram raios x e uma tomografia computadorizada da espinha em controles tratados e não tratados. As Figuras mostram o efeito dos extratos de Hibiscus tiliaceus L. no crescimento ósseo que cerca o local do autoenxerto. Após somente sete dias, houve significantemente mais formação óssea, nova formação de cartilagem e maior vascularidade no local de fratura que nas fraturas de tratamento de controle ou não tratadas.

As Figuras 10A e 10B mostram a histologia da espinha em 6 semanas. A Figura 10A mostra a histologia do autoenxerto de controle em 6 semanas, colorido com Haematoxilina e Eosina cobrindo a massa de fusão espinhal inteira. Os processos transversos podem ser vistos em cada extremidade da massa com os espaços de medula bem formados e osso cortical denso (A) e adjacente ao processo transverso é uma pequena quantidade de cartilagem (B). Os fragmentos de osso do autoenxerto são ainda visíveis e são necróticos, com a perda de lacunas (C). O centro da massa de fusão é predominantemente tecido fibroso (D) e algum osso não lamelar novo (E).

A Figura 10B mostra a histologia do autoenxerto de controle em 6 semanas, colorido com Haematoxilina e Eosina cobrindo a massa de fusão espinhal inteira. Os processos transversos podem ser vistos em cada extremidade da massa com os espaços de medula bem formados e osso cortical denso (A) e é adjacente ao processo transverso um novo osso corticado (B). Os fragmentos de osso do autoenxerto são pouco visíveis e são principalmente absorvidos e substituídos (C). O centro da massa de fusão é predominantemente cartilagem (D), novos espaços de medula (E) e algum osso não lamelar novo (E).

A Figura 11 mostra os resultados do teste mecânico do autoenxerto tratado em 8 semanas em comparação aos controles não tratados em 12 semanas. Os ligamentos e discos intervertebrais foram cortados cirurgicamente em todas as espinhas deixando a massa de fusão espinhal de processo transverso como a ponte entre os corpos vertebrais. Foi aplicada carga até a massa de fusão quebrar. A carga de pico foi gravada para cada amostra. Os dados mostrados na Figura 11 sugerem que o grupo tratado de 8 semanas é pelo menos tão forte quanto o controle de 12 semanas com uma tendência direcionada a maior resistência óssea.

Exemplo 7 - Análise de extratos de Hibiscus tiliaceus L.

Um método de investigar a composição dos extratos foi desenvolvido com o uso da análise de cromatografia gasosa- espectrometria de massa (GC-MS). Por exemplo, a análise de GC-MS foi realizada em um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco seguindo a extração em etanol e hidrocarboneto (Exemplo 2.3) e a camada intermediária de hidrocarboneto.

A Figura 12A mostra cromatogramas de massa de um extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco com um pico principal 5 a 30,99 minutos. A camada intermediária também continha um pico a 30,99 minutos (Figura 12B), entretanto, o pico foi pelo menos sete vezes menos que o observado no extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco. Em resumo, os picos dominantes nos cromatogramas de massa do extrato de Hibiscus tiliaceus L. em óleo de coco foram a 10 30,99, 35,47, 37,48, 39,56, 42,85, 43,28, 49,04, 52,51, 55,97 e 58,54 minutos. A maioria dos picos menores corresponde a ésteres etílicos de ácidos graxos encontrados no óleo de coco.

Claims

1. USO DE UM EXTRATO DE CASCA DE HIBISCUS TILACEUS caracterizado pelo fato de ser obtido pela extração da casca de Hibiscus tiliaceus com álcool para formar um extrato de álcool e extraindo o extrato de álcool com óleo de coco para fornecer o extrato da casca de Hibiscus tiliaceus na fabricação de um medicamento tópico para formação, reparo ou regeneração de osso ou cartilagem em um sujeito com fratura, lesão óssea ou de cartilagem.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é destinado à aplicação antes, durante ou após um enxerto de osso ou cartilagem ou procedimento de implante.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda uma quantidade eficaz de um extrato de ao menos um material vegetal selecionado do grupo que consiste em folhas de Vigna marina (Burm.) Merr., Casca de Cocos nucifera e folhas de Terminalia catappa L, obtidas pela extração de pelo menos um material vegetal em óleo de coco.

4. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento melhora a cicatrização de uma lesão.

5. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento promove o crescimento de osso ou cartilagem em torno de um enxerto de osso ou cartilagem ou dispositivo implantável.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o enxerto é um autoenxerto ou aloenxerto.

7. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o procedimento de enxerto é para reparar uma fratura óssea ou para fusão esquelética.

8. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é aplicado durante um procedimento cirúrgico artroscópico ou aberto.

9. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o álcool é etanol.

10. USO DE UM EXTRATO DE ÓLEO DE COCO DE CASCA DE HIBISCUS TILACEUS, caracterizado pelo fato de ser obtido pela extração da casca de Hibiscus tiliaceus com óleo de coco para formar um extrato de óleo de coco de casca de Hibiscus tiliaceus na fabricação de um medicamento tópico para formação, reparo ou regeneração de osso ou cartilagem em um sujeito com fratura, lesão óssea ou de cartilagem.