BR112012008040B1

BR112012008040B1 - composição antimicrobiana aquosa

Info

Publication number: BR112012008040B1
Application number: BR112012008040A
Authority: BR
Inventors: m phillips David; Thorn Mitchell; Rutenberg Naomi; A Maguire Robin
Original assignee: The Population Council Inc
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2010-10-04
Publication date: 2019-12-24
Also published as: IN2012DN02879A; JP2013506712A; RU2540423C2; ZA201202526B; RU2012118600A; CA2775603A1; EP2485710B1; AU2010303721B2; CN102665677A; JP5911425B2; CN102665677B; AU2010303721A1; CA2775603C; US8367098B2; EP2485710A1; WO2011044034A1; MX2012004008A; BR112012008040A2; CO6531457A2; US20100256089A1

Abstract

"composição antimicrobiana aquosa" são expostas composições para inibir a transmissão de uma infecção sexualmente transmitida, que contém um ou mais microbicidas polianiônicos, tais que os carragenanos, incluindo um carragenano lambda, assim como sais de metal solúvel em água e agentes antivirais, que compreendem nnrtis e nrtis. são também expostos métodos para a produção e o uso das composições.

Description

“COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA AQUOSA”

Referência cruzada a Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de N° Serial 12/ 587. 405, depositado em 6 de outubro de 2009, intitulado, UNIQUE COMBINATIONS OF ANTIMICROBIAL COMPOSITIONS, que é uma continuação em parte do Pedido de Patente US N° 10/ 977. 001, depositado em 29 de outubro de 2004, que é uma continuação do Pedido internacional N° PCT/US 03/ 13456, depositado em 30 de abril de 2003, que reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório N° 60/ 376.400, depositado em 30 de abril de 2002, e do Pedido de Patente Provisório US N° 60/377.050, depositado em 1 de maio de 2002, cujas exposições são incorporadas a este, a título referencial.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os carragenanos são polissacarídeos, obtidos a partir de algas vermelhas comumente conhecidas como algas marinhas. Eles constituem um componente estrutural das algas marinhas e são extraídos como três tipos principais, ou seja, iota, capa e lambda, embora existam ainda outros tipos, que incluem nos capa-II, mu e nu carragenanos. Os carragenanos têm sido extensivamente usados nas indústrias alimentícias, farmacêuticas e cosméticas como espessantes, agente de gelação e agentes de estabilização e de dispersão. Estudos farmacológicos e toxicológicos extensivos têm sido conduzidos. O carragenano foi verificado como sendo não- tóxico por meio das vias oral, dérmica e de inalação de administrações, mesmo em doses extremamente altas. Os carragenanos foram portanto classificados como “reconhecidos geralmente como seguros” (GRAS) pela FDA em 1972 . Outros estudos farmacocinéticos orais extensivos conduzidos em porcos, ratos, camundongos, gerbos, porquinhos da índia, furões, cricetos, cachorros e macacos³'¹¹ demonstraram que a ruptura dos carragenanos no trato gastrointestinal foi, no melhor dos casos, mínima, e que a absorção foi virtualmente não-existente.

A Publicação de Patente Internacional WO 94/ 15624 ensina o uso de polissacarídeos sulfatados, tais que iota carragenano, sulfato de dextrano, capa carragenano, carragenano lambda, agentes miméticos de heparina, sulfato de heprina, polissulfato de pentosano, sulfato de condroitina, sulfato de lentinano, sulfato de curdlano, Heparina de-N- sulfatada e fucoidano, de um modo a inibir a transmissão célula-a-célula de HIV e, deste modo, a transmissão sexual da Síndrome de Deficiência Imune Adquirida (AIDS), assim como do organismo Chlamydia. Esta publicação ensina que o iota carragenano é o mais eficaz dos carregananos sulfatados comericlamente disponíveis na prevenção de HIV e no bloqueio da infecção de Chlamydia in vitro e in vivo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os requerentes descobriam que um certo carragenano ou misturas ou combinações de vários carragenanos apresentam propriedades físicas e químicas específicas, e que, quando eles são formulados para a administração vaginal, eles podem prover um efeito antimicrobiano prolongado, e que eles inibem ou reduzem a possibilidade de transmissão de uma infecção sexualmente transmitida (STI).

Deste modo, um primeiro aspecto da presente invenção é dirigido a uma composição antimicrobiana, que compreende uma quantidade efetiva de um agente antimicrobiano que compreende carragenanos (aqui referidos como “os carragenanos” ou uma “mistura de carragenano”, que são o carragenano lambda em uma quantidade de pelo menos 50%, em peso seco, dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo pelo menos um não- carragenano lambda, e um agente de controle de pH fisiologicamente aceitável. Para os propósitos da presente invenção, o termo “antimicrobiano” tem a intenção de abranger a atividade antibacteriana e/ ou a atividade antiviral.

Um aspecto relacionado da presente invenção é dirigido a uma composição que inibe uma infecção sexualmente transmitida (STI), compreendendo uma quantidade efetiva de pelo menos cerca de 50%, em peso seco, dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo pelo menos um não-carragenano lambda, e um agente de controle de pH fisiologicamente aceitável.

As composições podem ainda incluir um outro agente antimicrobiano e/ ou uma droga administrável por via vaginal, em cujo caso o componente de carragenano pode ser um carragenano lambda, sem qualquer não-carragenano lambda. O agente adicional pode estar misturado e/ou associado com os carragenanos, tal que sob a forma de um complexo. Deste modo, um outro aspecto da presente invenção está dirigido a uma composição antimicrobiana aquosa, que compreende : (a) um agente de controle do pH fisiologicamente aceitável; e (b) uma quantidade efetiva de um agente antimicrobiano, que compreende um complexo de carragenano lambda ou de carragenanos, que são constituídos por carragenano lambda em uma quantidade de, pelo menos, 50%, em peso seco dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo pelo menos um não-carragenano lambda, e um sal metálico catiônico solúvel em água fisiologicamente aceitável, antimicrobiano.

Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a uma composição aquosa, que compreende: (a) um agente de controle de pH fisiologicamente aceitável; (b) uma quantidade efetiva de um agente antimicrobiano, que compreende um complexo de carragenano lambda ou carragenanos, que são constituídos pelo carragenano lambda em uma quantidade de, pelo menos, 50%, em peso seco, dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo constituído por pelo menos um nãocarragenano lambda; e (c) um ácido lignossulfônico.

Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a uma composição antimicrobiana, que compreende : (a) um agente de controle do pH fisiologicamente aceitável; (b) uma quantidade efetiva de um agente antuimicrobiano, que compreende um complexo de um carragenano lambda ou de carragenanos, que são constituídos pelo carragenano lambda em uma quantidade de pelo menos 50%, em peso, seco dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo constituído por pelo menos um nãocarragenano lambda; e (c) uma droga administrável por via vaginal, tal que um agente contraceptivo ou um agente para a terapia de reposição hormonal.

Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a uma composição antimicrobiana aquosa, que compreende uma quantidade efetiva de um agente antimicrobiano, que compreende um microbicida polianiônico, tais que os carragenanos, que são constituídos por carragenano lambdas em uma quantidade de pelo menos cerca de 50%, em peso seco, dos carragenanos, o restante dos carragenanos sendo constituído por pelo menos um não-carragenano lambda, um sal metálico catiônico solúvel em água, e um inibidor de transcriptase reversa de não-nucleosídeo ou um inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeo.

Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a um método de processamento, de refino, ou de estabilização dos carragenanos da presente invenção. O método acarreta uma mistura de um carragenano lambda ou dos carragenanos em uma forma pulverizada ou anidra, com a forma seca do agente de controle de pH, seguido pela hidratação dos carragenanos, por exemplo, através da adição de água ou de uma outra solução aquosa. O método supera várias desvantagens associadas com as técnicas correntes para o processamento de altas concentrações de carragenanos sob a forma de soluções aquosa homogêneas e facilita o processamento ulterior sob a forma de formulações farmacêuticas, tais que as composições e os complexos antes mencionados.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico, que apresenta a atividade a longo termo de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção. Os camundongos foram desafiados com uma dose infecciosa de 95- 100% de HSV-2, em vários intervalos de tempo, após a aplicação da composição. A composição retém algum nível de atividade contra HSV-2, mesmo após 24 horas. Isto sugere que uma mulher podería estar protegida, mesmo se um período de tempo considerável tivesse decorrido entre o uso da composição e o coito.

A Figura 2 é um gráfico de hibridização de Borrão de Southern de produtos de RT PCR de RNA, extraídos a partir do baço. As trilhas 2 e 3 são os controles positivos. As trilhas 4 e 8 são os camundongos, que foram previamente tratados com uma composição contendo os carragenanos da presente invenção, 5 minutos antes do desafio viral. As trilhas 9 a 14 são de camundongos inoculados, por via vaginal, com o HIV.

A Figura 3 é um gráfico de barras, que mostra a concentração de p24 (HIV) contra a concentração de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção, uma outra composição da presente invenção, que contém um complexo de carragenanos e um sal de zinco solúvel em água ( “zinco-carragenano”, e o ácido lignossulfônico (LSA).

A Figura 4 é um gráfico, que mostra uma comparação entre uma composição da presente invenção contendo os carragenanos e LSA, e uma composição da presente invenção contendo os carragenanos, no sistema de HSV-2/ Camundongo. Os resultados mostram que a composição contendo o LSA e os carragenanos é mais eficaz do que uma composição contendo apenas os carragenanos isoladamente.

A Figura 5 consiste em uma plotagem da inibição percentual através de LSA da replicação viral, tal como medido por ELISA de p24.

A Figura 6 é um gráfico, que representa a eficácia de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção, e uma outra composição da presente invenção, que contém zinco-carragenano, na prevenção da formação de placa de HSV-2 em células Vero, como uma função da dose.

A Figura 7 é um gráfico, que mostra a eficácia de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção, e uma outra composição da presente invenção, que contém zinco-carragenano, na proteção de camundongos contra a infecção a partir de HSV-2, seguindo-se ao desafio vaginal.

À Figura 8 é um gráfico, que mostra a comparação da atividade a longo termo de uma composição da presente invenção contendo zinco-carragenano, comparada a dois produtos conhecidos, o Conceptrol e o Advantage S, em uma dose de desafio viral de 10⁴ ou em uma dose de 100% de infecção de HSV-2.

A Figura 9 é um gráfico, que mostra a proteção contra o desafio viral através de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção, e uma outra composição da presente invenção, que contém zinco-carragenano.

A Figura 10 é um gráfico, que representa a quantidade de Nestorone liberada a partir de uma composição contendo os carragenanos da presente invenção.

A Figura 11 é um gráfico de barras, que compara a eficácia de várias diluições de composições de carragenano da presente invenção na proteção de camundongos contra a infecção por HSBV-2. Os resultados mostram que, mesmo quando os carragenanos são diluídos a 1:200, eles são ainda capazes de prover 40 % de proteção contra a infecção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os microbicidas polianiônicos, usados nas composições da presente invenção, são microbicidas que interferem com a ligação viral, de um modo a reduzir a transmissão de HIV através das superfícies das mucosas.

Estes microbicidas polianiônicos incluem compostos, tais que PRO 2000, Buffergel, sulfato de dextrina, sulfato de celulose, e de um modo ainda mais preferido, os carragenanos.

Os carragenanos, presentes nas composições da presente invenção, incluem um carragenano lambda. Na extensão em que os nãocarragenano lambdas estão presentes (em cujo caso o componente de carragenano das composições pode ser referido como “ os carragenanos” ou como “mistura de carragenanos”), a mistura de carragenanos contém pelo menos cerca de 50% (e de um modo preferido pelo menos 50% de carragenano lambda, com base no peso total dos carragenanos na composição. Em modalidades mais preferidas, a quantidade de carragenano lambda é de pelo menos cerca de 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% do peso seco total dos carragenanos (isto é, lambda e não-carragenano lambdas). Outras quantidades preferidas são de pelo menos 75%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 85 a cerca de 99%, e de cerca de 94 a cerca de 97% de carragenano lambda.

O carragenano lambda está comercialmente disponível (FMC Corp., Filadélfia). De um modo alternativo, o carragenano lambda pode ser produzido a partir de plantas de algas marinhas diplóides (esporofitas), por exemplo, Gigartina radula, Gigartina skottsbergii, Gigartina chamissoi, Gigartina stellata, Iridaea cordata, Chondrus chrispus, e Sarcothalia crispata. O isolamento do carragenano a partir de algas marinhas é conduzido de acordo com as técnicas convencionais. Por exemplo, a alga marinha é separada, limpada e secada. O carragenano lambda é extraído em hidróxido de sódio diluído quente, fornecendo uma pasta, que contém tanto quanto uma concentração de 4 % de carragenano lambda. A pasta resultante é clarificada através de centrifugação e de filtração, de um modo a fornecer uma solução de carragenano lambda, clara. A água é removida através de qualquer combinação de evaporação, precipitação com álcool, ou lavagem, e secagem.

O restante dos carragenanos nas composições da presente invenção pode incluir pelo menos um de não-carragenano lambda. Por “ nãolambda” carragenano” é compreendido qualquer carragenano outro que o carragenano lambda, tal que capa carragenano, lota carragenano, capa-II carragenano (que contém capa e iota carragenanos), mu carragenano, e nu carragenano. Os não-carragenano lambdas estão também comercialmente disponíveis ( por exemplo, FMC Corp.) ou podem ser extraídos a partir de algas marinhas, de acordo com as técnicas convencionais. Por exemplo, o capa-II carragenano está também naturalmente presente na espécie de alga marinha acima descrita. Em modalidades preferidas, os carragenanos nãolambida incluem capa carragenano, iota carragenano, e capa-II carragenanos, e misturas de dois ou mais dos mesmos. Em modalidades mais preferidas, o não-carragenano lambda inclui o capa II carragenano. Em modalidades preferidas, o componente não-carragenano lambda dos carragenanos constitui menos do que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou cerca de 25% do peso seco total dos carragenanos. Em modalidades mais preferidas, o componente não-lambda é de cerca de menos do que 25%, menos do que cerca de 15%, menos do que 5%, cerca de 1 a cerca de 15%, ou cerca de 3 a cerca de 6% do peso seco total dos carragenanos. Em ainda outras modalidades preferidas, a mistura de carragenano é substancialmente ou inteiramente livre de dextrose, um ingrediente comumente encontrado nos carragenanos usados na indústria alimentícia.

De um modo a prover um efeito antimicrobiano, o carragenano lambda ou os carragenanos estão geralmente presentes em quantidades de cerca de 1 a cerca de 5%, com base no peso total da composição. Nas modalidades preferidas, os carragenanos estão presentes em uma quantidade de cerca de 3 %, em peso total, da composição. Por “antimicrobiano” ou “efeito antimicrobiano”, é compreendido que a composição inibe ou reduz a probabilidade de transmissão de uma infecção sexualmente transmitida, causada por uma bactéria, um outro micróbio, ou um vírus. As composições da presente invenção são úteis na proteção contra as infecções sexualmente transmitidas, por exemplo, através da inibição da infecção por HIV, HPV, HSV-2 e Neisseria gonorrhoeae. Por um outro lado, os termos “antimicrobiano” e “efeito antimicrobiano” não têm a intenção de transmitir, implicar em, ou estar limitados a qualquer meio particular, através do qual a inibição ou a transmissão da infecção venha a ser efetuada. Sem a intenção de estarmos ligados a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que os carragenanos não se ligam, de um modo específico , ao vírus, bactéria ou a outros micróbios, que são agentes etiológicos de STIs, deste modo bloqueando os sítios receptores. As composições contendo o carragenano lambda ou os carragenanos em quantidades inferiores a 1 % ou maiores do que 5% podem ser usadas, desde que elas possam prover um efeito antimicrobiano e reter a aceitabilidade vaginal. Por “aceitabilidade vaginal “ é compreendido que as propriedades reológicas, tais que a viscosidade da composição, permitam com que ela seja usada para o propósito intencionado ( por exemplo, a composição mantém uma viscosidade tal, que ela possa ser aplicada pelo usuário e retida na cavidade vaginal, assim como possa prover propriedades estéticas, tais que ser substancialmente inodora, suave, clara, incolor, e sem sabor). A viscosidade é selecionada de um modo a permitir com que a composição possa revestir, de um modo uniforme, o forro epitelial da cavidade vaginal. De um modo geral, a viscosidade das composições é de cerca de 10. 000 a cerca de 50.000 cP. De um modo preferido de cerca de 20.000 a cerca de 50. 000 cP, e de um modo ainda mais preferido de cerca de 30.000 a cerca de 50. 000 cP. O carragenano possui um contínuo de pesos moleculares. De um modo geral, as misturas de carragenano da presente invenção podem apresentar um peso molecular de até cerca de 2 x 10⁶ daltons, com menos do que cerca de 1 % de moléculas de carragenano tendo um peso molecular médio de 1 x 10⁵ daltons (conforme determinado através de cromatografia de permeação gasosa e de dispersão luminosa). De um modo ainda mais particular, um carragenano lambda na invenção possui um peso molecular médio em peso de cerca de 600.000 a cerca de 1.200.000 daltons. Este propriedade física confere não- absorção à formulação final, o que, por sua vez, provê uma atividade antimicrobiana prolongada.

Dentre os outros microbicidas polianiônicos, outros que os carragenanos, que podem ser também usados nas composições da presente invenção, está o PRO 2000. Este microbicida é um microbicida vaginal para a prevenção de HIV. De um modo adicional, outros tais microbicidas polianiônicos incluem o Buffergel, um espermicida microbicida, que provê uma atividade de tamponamento, de um modo a manter a acidez protetora , branda da vagina, na presença de sêmen. De um modo adicional, o sulfato de dextrina, um poliânion, que bloqueia a entrada do HIV na superfície da célula, e o sulfato de celulose podem ser também utilizados para isto.

A composição contém ainda um agente de controle de pH fisiologicamente aceitável, tal que uma solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em adição à estabilização do pH da composição (por exemplo, em um nível de cerca de 3,5 a cerca de 8,5, e de um modo preferido de cerca de 5,8 a cerca de 7,2, tal que de cerca de 6,8 a 7,2). O agente de controle do pH evita ou reduz qualquer alteração da alteração na composição, uma vez que ele seja introduzido no corpo, em que o pH pode variar de um modo significativo. O pH vaginal pode variar em uma faixa de entre 3,5 a 5,5. Deste modo, a presença do agente de controle de pH estende o efeito antimicrobiano dos carragenanos. As composições incluem de cerca de 0,001% a cerca de 1,0% dos agentes de controle de pH. A formulação das composições pode ainda conter outros ingredientes ativos e/ou ingredientes inertes, dependendo do uso intencionado (tal como descrito abaixo).

Os carragenanos da presente invenção proporcionam vários outros benefícios. Eles permanecem estáveis se expostos a temperaturas de congelamento, ambiente, ou de fervura. A mistura é compatível com o ambiente vaginal humano. Sem desejarmos estar limitados por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que os carragenanos são compatíveis com o ambiente vaginal humano e que não atuam como um substrato ou, de um outro modo, causam ou estimulam o crescimento da flora vaginal natural, nem são tóxicos de um modo a romper o equilíbrio da flora natural na vagina. À parte das propriedades atribuíveis aos carragenanos da presente invenção, a sua atividade antimicrobiana estende-se ao longo de um período de tempo, porque eles não são absorvidos de um modo sistêmico, ou são degradados a quaisquer subprodutos absorvíveis, prejudiciais aos seres humanos.

Um outro aspecto da presente invenção é dirigido a um complexo entre um sal metálico solúvel em água e os carragenanos. Nas modalidades preferidas, o sal metálico é um sal de zinco (e a composição antimicrobiana é referida como a um “carragenato de zinco”). O zinco é um inibidor de tais patógenos sexualmente transmissíveis, tais que o HIV e o HSV-2. O acetato de zinco e o sulfato de zinco foram demonstrados como sendo capazes de inibir a infecção de HIV em uma cultura celular, e o HSV-2, tanto em uma cultura celular, como em animais laboratoriais. Os sais de zinco foram demonstrados como sendo efetivos em bloquear a infecção de HIV in vitro³⁹, o vírus de pé-e-boca, o rinovírus humano, o influenza A e Β, o vírus florestal semliki e o vírus sindbis⁴⁰. Haraguchi , et al.³⁹ verificaram que o cloreto de zinco, o acetato de cádmio e o cloreto de mercúrio inibiram a produção de HIV-1, tal como testado através de ELISA p24 e de RT. O cloreto de zinco não exibiu citotoxicidade significativa quando presente em concentrações de até 550 pg/ ml.

Os sais de zinco solúveis em água, úteis na presente invenção, incluem tanto sais inorgânicos, como sais orgânicos, que exibem propriedades antimicrobianas, sem causar uma irritação inaceitável, quando usados de acordo com a presente invenção. Os sais de zinco solúveis em água preferidos incluem acetato de zinco, propionato de zinco, butirato de zinco, formato de zinco, gluconato de zinco, glicerato de zinco, glicolato de zinco, lactato de zinco, sulfato de zinco, cloreto de zinco, e brometo de zinco. ZnSO₄, ZnCl₂, ZnBr₂, Zn (Ac)₂, etc. Os sais de contraparte de cobre e de prata são também úteis na presente invenção, contanto que eles sejam não-irritantes in vivo, e que não causem uma degradação a quaisquer subprodutos absorvíveis, prejudiciais a seres humanos. As composições desta invenção irão, deste modo, incluir entre cerca de 0,03 % e 1, 5% dos sais de metal solúveis em água, de um modo preferido de cerca de 0,3 % a 1,0%. A atividade antimicrobiana da composição é maior do que a de uma formulação contendo os carragenanos como o único agente antimicrobiano. Nas modalidades da presente invenção com sais de zinco específicos, existe um aumento significativo nesta atividade antimicrobiana. Sem desejarmos estar limitados por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a atividade antimicrobiana da formulação seja aumentada, porque a taxa, na qual o sal metálico é absorvido pelo corpo, é relativamente controlada e, ao mesmo tempo, a irritação do sal metálico é reduzida.

Os complexos da presente invenção podem ser preparados através de processos convencionais, em que os íons metálicos substituem os cátions, que estão naturalmente presentes sobre a espinha dorsal do polissacarídeo. Por exemplo, o zinco carragenano (que se refere a um complexo entre os cátions de zinco e os carragenanos da presente invenção ) é um composto sintetizado através de um procedimento, em que o zinco (II) está ligado, de um modo não-covalente, aos grupos de sulfato dos carragenanos. O carragenano é um polissacarídeo, que consiste da repetição de unidades de D-galactose e de D-galactose 3,6-anidro, arranjadas em um modo linear. O polímero é altamente sulfatado, tendo 3 grupos SO3 por cada unidade de dissacarídeo. A ligação de zinco aos carragenanos é efetuada através de um processo químico, desenvolvido para substituir o sódio ligado ao carragenano nativo com zinco. Uma solução aquosa de um sal de zinco altamente solúvel (tal que o acetato de zinco) é usada neste processo como uma fonte de cátions de zinco. Os carragenanos são dializados contra uma solução concentrada de acetato de zinco, permitindo com que os ions de zinco positivamente carregados sejam difundidos e sejam complexados com os grupos sulfatos negativos dos carragenanos. O excesso de zinco é então removido através de diálise contra água.

A inclusão de um complexo de cátions de metal de zinco II com os carragenanos na presente invenção pode ser alcançada através do uso de carragenato de zinco II. O carragenato de zinco é sintetizado a través da substituição dos cátions de carragenano naturais (sódio, potássio, cálcio) por cátions de zinco. O carragenato de zinco é tradicionalmente preparado através da diálise de uma solução de carragenano contra uma solução concentrada de acetato de zinco II. Os cátions de zinco em excesso são então removidos através de diálise contra água, antes da concentração, e, por exemplo, secagem por congelamento. O uso de carragenato de zinco II pode evitar o uso de ânions, tais que o lactato ou o acetato, na presente invenção.

Um outro processo acarreta (a) o embebimento dos carragenanos em cerca de 2,5 % de lactato de zinco ou um outro sal de zinco solúvel adequado) em um licor de álcoohágua a 50:50 durante duas horas , (b) é então separado, e (c) é lavado com álcool, antes da secagem. Os estágios (a) a (c) podem necessitar ser repetidos, várias vezes, de um modo a que seja alcançado o conteúdo de metal desejado nos carragenanos. Dois ciclos são normalmente requeridos, de um modo a que sejam alcançados acima de 50% de zinco carragenano, em uma base equivalente.

Os procedimentos acima geram um composto, que é solúvel em água e ativo contra vírus envelopados, tais que o HIV e o HSV-2.

Diferentemente dos sais de zinco orgânicos simples ou inorgânicos, o zinco carragenano mantém as propriedades reológicas preferidas e possui um alto peso molecular (até 2.000.000 Da), tomando-o apropriado para que seja formulado como um produto vaginal, que seja não-irritante e que não seja absorvido. A composição é aqui referida como a um “ complexo”, devido à presença de interações moleculares entre o metal e os carragenanos, que desfavorecem ou desencorajam a sua dissociação a cátions metálicos livres. Os presentes complexos de um sal metálico e de um complexo de polissacarídeo sulfatado negativamente carregado são distintos de misturas de sais de metal solúveis em água e de carragenanos, em termos de suas propriedades físicas, químicas e/ ou antimicrobianas.

Em um outro aspecto da presente invenção, os requerentes descobriram que uma combinação do complexo entre um sal metálico insolúvel em água e os carragenanos junto com agentes antiretrovirais específicos, proporciona vantagens inesperadas e propriedades sinérgicas. De um modo ainda mais particular, esta combinação particular de ingredientes foi verificada como fornecendo resultados inesperados em termos de inibição de infecções sexualmente transmitidas e de um modo particular em bloquear infecções de SHIVT-RT vaginais (vírus de imunodeficiência simiana/humana - transcriptase reversa). Os agentes antiretrovirais são drogas usadas para o tratamento de infecção através de retrovirus, primariamente o HIV. Existe um número de diferentes classes de drogas antiretrovirais, que atuam em diferentes estágios do ciclo vital de HIV, e estas incluem, por exemplo, os inibidores de transcriptase reversa de não-nucleosídeo (NNRTIs), inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo (NRTIs), inibidores de integrase, inibidores de fusão, e antagonistas de CCR5.

Os NNRTIs são compostos, que se ligam, em si mesmos, à transcriptase reversa e que evitam com que a enzima seja convertida de RN A para DNA, de um modo a que o material genético do HIV não possa ser incorporado no material genético saudável das células, e que as células possam assim ser impedidas de vir a produzir novos vírus. Estes incluem as drogas, tais que neviparina, delavirdina, efavirenz, etravirina, MIV-150, MIV160, MIV-170, dapirivirina (TMC-120) e UC-781. De um modo ainda mais preferido, o NNRTI seria o MIV-150, um NNRTI desenvolvido por Medivir para o uso como um agente terapêutico antivirial. O MIV-150 é um inibidor da enzima HIV-RT de ligação hermética, caracterizado por uma formação rápida e uma taxa de dissociação lenta, que é eficaz em desativar os isolados químicos de HIV em concentrações muito baixas. Em uma modalidade preferida da presente invenção, os requerentes descobriram, deste modo, que a combinação específica dos carragenanos desta invenção com os sais de metal solúveis em água, de um modo preferido tais que o zinco, assim como de NNRTIs, tais que o MIV- 150, são efetivas em bloquear totalmente a infecção de SHIV-RT vaginal. Além disso, esta combinação específica foi verificada como sendo significativamente mais eficaz do que a combinação individual dos carragenanos com os sais de metal solúveis em água, tais que o zinco; ou dos carragenanos com os NNRTIs, ou dos carragenanos em si mesmos. Em uma modalidade preferida, a combinação dos carragenanos da presente invenção, dos sais de metal solúveis em água, e do NNRTI incluem, de um modo preferido, os carragenanos acima discutidos, incluindo o carragenano lambda, em quantidades de pelo menos cerca de 50%, em peso seco, dos carragenanos com o restante dos carragenanos sendo pelo menos um não-carragenano lambda, e de um modo ainda mais preferido uma combinação de 95% de carragenano lambda e de 5 % de capa carragenano, com a composição total, sob a forma de um gel, incluindo entre 1 % e 5 % de carragenano, de um modo preferido cerca de 3 % de carragenano; as composições incluem os sais de metal solúveis em água, que compreendem, de um modo preferido, os sais de zinco, e de um modo ainda mais preferido sob a forma de acetato de zinco ou de lactato de zinco, incluindo de cerca de

0,1 %, em peso, e 1, 5%, em peso, do metal, tal que o zinco, na composição total, e de um modo ainda mais preferido cerca de 0,3 %, em peso, do mesmo; e incluem os NNRTIs, e de um modo ainda mais preferido o MIV- 150, em quantidades de entre 5 μΜ a 5.000 μΜ (ou de 0,000185% a 0, 185%), e preferivelmente entre 10 μΜ e 250 μΜ (ou de 0,00074% a 0,00925% do NNRTI, tal que o MIV-150, e de um modo ainda mais preferido de 50 μΜ (ou de 0,00185%) do MIV-150.

Os NRTIs são compostos, que são incorporados ao DNA do vírus, de um modo a interromper o processo de construção. Deste modo, eles resultam em um DNA incompleto, que não pode criar um novo vírus. Estes incluem drogas, tais que abacavir, tenofovir, e zidovudina.

Foi verificado pelos requerentes que o NNRTIs e os NRTIs exibem propriedades inesperadas específicas, quando usados nas composições da presente invenção.

Em ainda um outro aspecto da presente invenção, o ácido ligno-sulfônico (“LSA”) é combinado com um carragenano lambda ou com os carragenanos (aqui referidos como a LSA- carragenano), de um modo a alcançar um efeito antimicrobiano aumentado. O LSA é usado comercialmente como um estabilizador industrial, como um agente de dispersão, e como um reforçador. Ele é também usado como uma fonte de fibra de massa na alimentação de gado, e como um agente de emulsificação e de dispersão no processamento de certos alimentos para o consumo humano. Ele existe nas paredes celulares de plantas superiores. As fibras da parede celular são geralmente feitas de polissacarídeo, celulose, o mais abundante polissacarídeo sobre a terra. Em adição à celulose, a parede da célula secundária contém um outro material muito abundante denominado lignina, que é o polissacarídeo que faz a planta endurecer. Através do cozimento de aparas de madeira em uma solução de bissulfato de cálcio sob calor e pressão, a lignina é convertida a uma solução do ácido ligno-sulfônico solúvel em água (LSA), conhecida como licor de sulfito gasto^31,32. Este é um composto de baixa massa molar, com um peso molecular médio de aproximadamente 5000 Daltons. Como as ligninas são polímeros naturais muito complexos, com muitos acoplamentos aleatórios, a estrutura química exata não é conhecida, mas é considerada como sendo aquela de um polímero sulfonado, no qual a unidade básica é uma estrutura de propil benzeno, similar àquela do álcool coniferílico³¹. A utilidade do lignossulfonato comercial advém de suas propriedades de dispersão, ligação, complexação e emulsificação. A estrutura de anel aromática do ácido ligno-sulfônico confere às plantas a capacidade para resistir a ataques a partir de micróbios. O LSA foi demonstrado como tendo uma atividade anti-HIV in vitro.

As formulações, que compreendem os carragenanos e o LSA, podem ser preparadas através da adição do LSA aos carragenanos, de um modo geral em uma razão, em peso, de LSA- carragenano total de a partir de cerca de 2:1 a cerca de 1:20. Como no caso de composições contendo um sal metálico, um sal tamponante sólido pode ser misturado com os carragenanos, de um modo usual em uma razão, em peso, de a partir de cerca de 1:1 a cerca de 10:1. A mistura resultante é então solubilizada em uma solução aquosa. O pH da formulação de carragenano-LSA pode ser então ajustado para que seja de a partir de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, através da adição de um ácido, tal que o HC1, ou de uma base, tal que NaOH. O LSA em soluções aquosas produz uma coloração de castanho a marrom, a intensidade da qual aumenta de um modo proporcional à concentração usada. Deste modo, um agente de branqueamento, tal que o dióxido de titânio, pode ser incluído na composição. De um modo geral, o agente de branqueamento está presente em uma quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 3,0%, com base no peso total da composição. O agente de branqueamento pode também contribuir para o efeito antimicrobiano.

Sem desejarmos estar limitados a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que, ao lado de qualquer que seja a atividade antiviral que o LSA exerça em si mesmo, o LSA também funcione como um agente de dispersão para os carragenanos, e desemaranhe e alongue os mesmos, deste modo criando uma maior densidade deste material e uma maior potência antimicrobiana. Por um outro lado, os carragenanos proporcionam as propriedades reológicas preferidas, necessárias para a administração vaginal aceitável e eficaz ( e mesmo retal), que não pode ser alcançada pelo LSA em si mesmo devido à sua natureza preferivelmente aquosa. Em algumas modalidades, a combinação dos carragenanos e do LSA atua, de um modo sinérgico, na prevenção ou na inibição de infecções sexualmente transmitidas.

As composições da presente invenção podem também conter uma droga vaginalmente administrável na formulação aquosa, junto com o agente de controle de pH, e o carragenano lambda ou os carragenanos. As drogas preferidas são os agentes contraceptivos, tais que os hormônios esteróides, expostos em Saleh, et al., Patente U.S. 5.972.372 ( “Saleh”), cuja exposição é incorporada a esta, a título referencial. Exemplos de agentes contraceptivos, úteis na presente invenção, incluem as progestinas, ACTH, andrógenos, estrógenos, gonadotropina, hormônio do crescimento humano, menotropinas, progesterona, progestinas (por exemplo, levonorgestrel, noretindrona, 3-ceto-desogestrel e gestodeno), progestógeno, urofolitropina, vasopressina e combinações dos mesmos. Os agentes preferidos incluem os compostos progestacionais ( por exemplo, o acetato de noretindrona e NESTORONE™ (“NES”), (isto é, 16-metileno-17.alfa-acetóxi-19norpregneno-3, 20- diona)), e progestinas ( por exemplo, levonorgestrel ( LNG)).

Um agente contraceptivo preferido é Nestorone, 16-metileno17a-acetóxi-19-norpregn-4-ene-3,20-diona (a seguir “NES”), que foi identificado na literatura como “ST-1435”. Em estudos comparativos, que utilizam o bioensaio clássico de medir a potência progestacional, o NES foi verificado como tendo uma atividade progestacional 00 vezes mais alta do que aquela da progesterona e 10 vezes mais alta do que aquela do levonorgestrel⁵³. Deste modo, quantidades menores do NES são requeridas para que seja alcançada a inibição da ovulação. Esta potência combinada com uma falta de atividade androgênica, estrogênica e similar a glicocorticóide (deposição de glicogênio hepático) e a falta de efeitos sobre os parâmetros da química de lipídeos ou clínica, confere vantagens especiais para o uso de NES em contraceptives⁵³’⁵⁵. No entanto, o NES demonstrou ser submetido a um rápido metabolismo e desativação mediante a administração oral, tomando-o adequado para o uso em mulheres que amamentam, quando fornecido através de implantes ou de anéis vaginais⁵⁶’⁵⁷. Uma dose de distribuição preferida de NES, quando combinada com a mistura de κ/ λ carragenano em forma de gel está entre cerca de 75 e cerca de 100 pg por dia, a qual irá alcançar os níveis plasmáticos de NES em tomo de 200 pmol/ L e alcançar bons padrões de sangramento durante as menstruações. Outras drogas administráveis vaginalmente preferidas incluem os agentes para a terapia de reposição hormonal, tais que as substâncias estrogênicas (por exemplo, etinil estradiol) e outros compostos esteroidais.

Sem a intenção de estarmos limitados por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que os carregenanos possuem uma função dupla de conferir propriedades microbiocidas, ao mesmo tempo em que fornecem um sistema de distribuição de liberação prolongada para um agente contraceptivo ou para um agente para a reposição hormonal, deste modo aumentando a atividade do agente.

Qualquer das composições aqui descritas podem ainda conter pelo menos um ingrediente fisiologicamente inerte, tal que um conservante fisiologicamente aceitável. Os conservantes incluem os ésteres alquílicos do ácido para-hidroxibenzóico, tais que paraoxibenzoato de metila, paraoxibenzoato de propila, derivados de hidantoína, parabeno, tais que metil parabeno, sais de propioniato, triclosano tricarbanilida, óleo da árvore do chá, alcoóis, farnesol, acetato de farnesol, hexaclorofeno e sais de amônio quaternários, tais que benzolconjure, sais de zinco e de alumínio, benzoato de sódio, álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, e clorobutanol. De um modo geral, o conservante está presente em uma quantidade de até cerca de 0,3 % , com base no peso total da composição. Em adição a inibir o crescimento de microrganismos, que podem ser introduzidos, de um modo inadvertido, durante a manufatura, o conservante evita quaisquer efeitos deletérios, que possam ocorrer os agentes ativos na composição, devido à presença da flora corpórea normal, uma vez que a composição seja introduzida no interior do corpo. Isto irá prolongar o período de tempo, durante o qual os agentes ativos na composição permanecem ativos.

Em modalidades preferidas, as composições da presente invenção, por exemplo, contendo os carragenanos como o único agente antimicrobiano, com ou sem uma droga vaginalmente administrável, e as composições que contêm um agente antimicrobiano adicional, tais que o sal metálico catiônico ou LSA, são administradas vaginalmente. A presente invenção também inclui a administração retal. As composições podem ser formuladas, de um modo adequado, por exemplo, sob a forma de géis, cremes, espumas, filmes e supositórios, de acordo com as técnicas convencionais na indústria farmacêutica. Os géis são preferidos. As formulações são administradas, de um modo preferido, antes da atividade sexual, tal que um intercurso, de um modo usual, de cerca de uma hora antes de um tal período de tempo. A aplicação da formulação à base de carragenano em seres humanos previne ou inibe a transmissão de uma infecção sexualmente transmitida (STI), tal que Neisseria gonorrhoeae, papilomavírus humano, HSV-2 e HIV.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para o refino de um carragenano, não- absorvível. A formulação é preparada, de um modo típico, através da mistura de um sal tamponante sólido e de carragenano lambda, ou da mistura de carragenano, em uma razão, em peso, de a partir de cerca de 1:1 a cerca de 10:1. A mistura do sal tamponante sólido e de carragenano é então solubilizada em água ou em uma solução aquosa, de um modo a produzir a formulação. O pH da formulação é então ajustado, de um modo a que seja de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Este é, de um modo típico, alcançado através da adição de um ácido, tal que o HC1, ou de uma base, tal que NaOH. De um modo geral, a viscosidade da formulação é de cerca de 20.000 a cerca de 100.000 CPS, e de um modo preferido de cerca de 30.000 a cerca de 35.000 CPS. Pelo menos um conservante fisiologicamente aceitável pode ser adicionado à formulação. Exemplos de tais conservantes são aqui expostos. O conservante pode então estar presente nas proporções indicadas nas várias farmacopéias e, de um modo particular, em uma razão, em peso, de carragenanos, de a partir de cerca de 80:1 a cerca de 10:1, e de um modo preferido a partir de cerca de 40:1 a cerca de 15:1.

Os sais tamponantes sólidos incluem os sais de metal alcalino de ácido acético, ácido cítrico, ácido fosfórico, e de ácido láctico. No caso do ácido fosfórico, o tampão de fosfato de metal alcalino sólido inclui a mistura sólida de sais alcalinos dibásicos ou tribásicos de fosfato, de um modo preferido em forma anidra, em que o metal alcalino inclui, mas não está limitado, a potássio e sódio. Qualquer tampão fisiologicamente aceitável pode ser usado. No entanto, no caso em que sejam utilizados sais de zinco solúveis em água, os fosfatos são menos preferidos, e nestas formulações, os acetatos, citratos e lactatos são os mais preferidos. Nas modalidades preferidas, estas soluções de tamponante compreendem misturas de ácido acético e de acetato de sódio; de ácido cítrico e citrato de sódio; e de ácido láctico e lactato de sódio.

Sem desejarmos estar limitados a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que os carragenanos são pós secos, que são extremamente hidroscópicos quando expostos à atmosfera. A absorção da umidade atmosférica ao interior do ingrediente seco causa a aglomeração do material. O problema é gerado quando o material é então introduzido na solução de base aquosa, de um modo tal que a incorporação completa dos carragenanos em uma solução aquosa homogênea não pode ser obtida. Acredita-se também que, através da mistura dos carragenanos e de pelo menos um sal tamponante sólido de um modo conjunto, o sal tamponante sólido absorve a umidade atmosférica que os carragenanos teriam absorvido quando expostos à atmosfera, deste modo evitando ou reduzindo, de um modo substancial, a aglomeração dos carragenanos. Acredita-se ainda que o processo sirva para aumentar a solubilidade dos carragenanos em água, e que alcance a estabilização do pH.

Os exemplos que se seguem têm a intenção de ilustrar, de um modo adicional, certas modalidades da invenção, e não têm a intenção de limitar a invenção, de modo algum.

Exemplo 1. Produção de 500 litros de Carragenanos

Na preparação de carragenano lambda ou da mistura de carragenano, (1) os ingredientes da formulação devem ser pesados individualmente em um vaso de pesagem a seco, limpo; (2) o peso “efetivo” do ingrediente, não o peso protocolar, deve ser registrado no gabarito de produção de manufatura, independentemente de quão leve seja a variação entre os dois; (3) qualquer recipiente de ingrediente em massa contendo um artefato(s) ou uma substância contaminada não deve ser usado e o recipiente deve ser fechado, vedado, e marcado com “CONTAMINADO” e removido a partir da área de produção; (4) em um processo de batelada de produção, não deve ser transferido a partir de um vaso para o outro antes que a manufatura seja completada e que a formulação tenha passado nos testes de controle de qualidade; e (5) o vaso de produção deve permanecer fechado durante a manufatura, de um modo a evitar a perda de água devido à evaporação, em especial durante quaisquer estágios que requeiram o aquecimento.

De um modo adicional, o carragenano comprovou ser estável em estado sólido e no estado de produção sob uma variedade de condições adversas, que incluem o congelamento ou a autoclavagem, durante 24 meses.

O que se segue refere-se a um procedimento, para o qual foi usada a produção de uma formulação contendo uma mistura de carragenano de lambda (λ) e capa-II (K-II) carragenanos (a mistura de K-II/ λ carragenano). No curso da preparação da mistura de K-II/ λ carragenano de bateladas de um tamanho laboratorial de 100 ml em uma escala de bateladas laboratoriais de até 15 a 30 litros, para finalizar o procedimento de manufatura de bateladas de 500 litros, tomou-se difícil a obtenção da consistência batelada-a-batelada da formulação desejada. O presente método superou estas dificuldades de um modo surpreendente e produziu as formulações das misturas de K-II/ λ carragenano tendo uma qualidade batelada-a-batelada consistente.

EQUIPAMENTO:

Vaso de Produção- IKA, EMA 9/500 AIUTE, é um vaso de produção com camisa d'água, que permite um rápido aquecimento e resfriamento da solução durante a produção.

INGREDIENTES:

Mistura de K-II/ λ carragenano;

Solução salina tamponada com fosfato (PBS) [contendo: NaCl -120 mmol/ L, KC1 - 2,7 mmmol/ L, tampão de fosfato (fosfato de potássio monobásico e fosfato de sódio dibásico) - 10 mmol/ L (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO);

Éster metil p-hidroxibenzóico (Metil parabeno) - (Nipa Laboratoires, Pontypirid, UK);

Ácido clorídrico (HC1) -Merck, Darmstadt, Alemanha;

Água purificada - Clean Chemical Sweden AB, Borlange, Suécia.

Procedimento (1) Ingredientes pesados nas quantidades que se seguem:

INGREDIENTE	QUANTIDADE
Água purificada (3 partes)	484,0 kg
Mistura de K-IV λ carragenano	15,0 kg
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	4,8 kg
Metil parabeno	0,5 kg
Ácido clorídrico (10%)	0,5 kg

(2) os ingredientes secos foram cuidadosamente a inteiramente misturados, a mistura de K-II/ λ carragenano e a solução salina tamponada com fosfato, de um modo conjunto;

(3) o vaso de produção foi inspecionado, de um modo a assegurar que a câmara de mistura estivesse limpa, seca e livre de artefatos, e que o valor base estivesse fechado;

(4) O vaso de produção foi enchido com 100,0 L (Parte I) de água purificada e a agitação foi iniciada:

Turbina de 500 rpm e âncora de 20 rpm. A água é adicionada em 3 partes. A primeira parte foi suficiente para dissolver o metil parabeno. A segunda parte auxiliou na redução da temperatura, diluiu suficientemente o HC1, de um modo a que a hidrólise ácida do carragenano não ocorresse, ao mesmo tempo em que foi mantido um nível de solução suficientemente baixo, de um modo a que, quando a adição da mistura de carregano/ PBS, a peneira de distribuição pudesse ser abaixada ao interior do vaso de misturação, de um modo a que ele não entrasse em contato com a solução base e que estivesse mais baixa do que o gancho de acesso do vaso, de um modo que a formação de pó excessiva da mistura não fosse perdida. A terceira parte completou a concentração final.

(5) . Agitação continuada e adição de 0,5 kg de metil parabeno e de 0, 5 kg de HC1. Gancho de acesso do vaso fechado e água quente a de 75° a 85°. Uma vez alcançada esta temperatura, a agitação foi continuada durante um período mínimo de 10 minutos, até que o metil parabeno fosse dissolvido.

(6) . Aquecimento descontinuado e adição de 250,0 kg (Parte II) de água purificada. A solução foi resfriada a de 25°C a 30°C. A adição de água acelerou o processo de resfriamento. A solução necessitou ser resfriada, de um modo a que não estivesse produzindo vapor quando fosse efetuada a próxima adição de ingredientes. Além de evitar a perda de água quando o vaso foi aberto para a próxima adição, o vapor causou com que a mistura de carragenano/ PBS fosse aglomerada e aderisse à peneira que foi usada na adição;

(7) . Gancho de acesso aberto e foi iniciada a adição da mistura de carragenano/ PBS através de uma peneira, com uma agitação suave. A adição levou aproximadamente 20 minutos. A adição da mistura coincidiu com o aumento da velocidade de agitação a uma velocidade máxima de turbina de 1200 rpm e de âncora de 20 rpm. A viscosidade da solução aumentou exponencialmente com a adição dos carragenanos. Se a velocidade de agitação não fosse significativa, o carragenano formaria grumos “hidrovedados”, que nunca seriam dissolvidos e incorporados na solução, deste modo tomando a batelada inaceitável. ( Os grumos “hidro-vedados” são bolsas de carragenano seco, que são circundadas com um revestimento externo de carragenano, que se toma impenetrável à água, devido a um peso molecular extremamente grande do carragenano e a uma estrutura flexível);

(8) . Gancho de acesso fechado e agitação continuada em velocidade máxima, turbina a 1200 rpm, e âncora a 20 rpm. Foram adicionados 134,0 kg de água purificada ( Parte III) e a linha d'água foi desconectada, valor fechado. A solução foi aquecida a de 75° a 85°C através da aplicação de 52% de calor; e (9) . Foi verificado que todos os valores estavam fechados e foi aplicado vácuo ao vaso a 400 mbar. A solução foi agitada em uma velocidade ligeiramente reduzida, a turbina a 1100 rpm e a âncora a 20 rpm, sob vácuo, durante 1,5 horas, a de 75 °C a 80°C. A agitação constante da solução, que foi necessária para a distribuição uniforme e a completa incorporação dos ingredientes, causou uma retenção de ar excessiva. O vácuo extraiu este ar a partir da solução.

(10) . O aquecimento foi desligado, a agitação foi desligada e o vácuo foi desligado. A Amostra de Teste foi Removida a partir do vaso de produção e testada quando ao Teste de Controle # 1. A incorporação foi completada e a distribuição foi uniforme;

Teste de Controle # 1: Incorporação completa e distribuição uniforme

Foram removidos aproximadamente 90 μΐ da mistura do processo (foi usada uma ponta de pipeta de 200 μΐ de orifício grande, de um modo a auxiliar na remoção da solução de carragenano) e misturada em 10 Q1 de azul de metila a 0,1 % TS (1:1, álcool isopropílico; dH20) em um tubo Eppendorf de 500 μΐ. A mistura no tubo deve aparecer como uma cor azul uniforme. Isto indica que a mistura de K-11/λ carragenano é distribuída, de um modo uniforme, dentro da solução. E preparada uma lâmina de microscópio com 10 μΐ desta mistura ; é coberta com uma lâmina de cobertura e observada em uma baixa ampliação (10X). A mistura de K-11/λ carragenano deve aparecer como filamentos púrpura grandes. Isto indica que a mistura de K-11/λ carragenano foi completamente incorporada e que a solução foi “APROVADA”. Se os filamentos forem azuis ou se grumos azuis grandes forem visíveis, então a mistura de K-11/λ carragenano não é completamente incorporada e a solução é “REPROVADA”, O processamento da solução foi continuado sob as condições do estágio # 9. A solução foi novamente verificada em intervalos de 0,5 hora, até que a solução seja “APROVADA”.

(11) . Quando a solução “aprovada” quanto ao Teste de Controle # 1, executar então o Teste de Controle # 2, pH;

Teste de Controle # 2; pH

A amostra de teste deve ser resfriada a 25°C ± 2 ( uma faixa de 23°C a 27°C) para os testes. O pH deve ser de 7, 0 ± 0,1 (uma faixa de 6,9 a 7,1). Isto indica que o pH da solução é uniforme e que a solução está “APROVADA”. Se a solução não estiver dentro da faixa de pH aceitável ( 6,9 a 7,1) a solução está “REPROVADA”. Se a solução estiver “REPROVADA”, a solução precisa ser ajustada, tal como necessário, ou com 10% de HC1 ( de um modo a diminuir o pH) ou em NaOH ( de um modo a aumentar o pH) em incrementos de 25 ml, até que a solução seja “APROVADA”. Com cada adição incrementai, ou de ácido ou de base, durante toda a agitação ( estágio de agitação e de condicionamento a vácuo # 9, sem adição de calor) é requerido com que seja assegurada uma distribuição uniforme ao longo de toda a batelada, antes de testar novamente o pH. Verificar novamente a solução após agitação /vácuo durante 0,5 horas. Continuar deste modo até que a solução seja “APROVADA”.

(12) . Quando a solução é “APROVADA” quanto ao Teste de Controle # 2, iniciar o resfriamento da mistura para 25°C.

± 2^o (23°C a 27°C). A velocidade de agitação, que deve estar desligada neste ponto, necessitará ser aumentada, à medida em que a solução é espessada mediante o resfriamento. No início, a turbina é desligada e âncora está a 20 rpm, a turbina é aumentada para 20 rpm/15 mm e a âncora é aumentada para 10 rpm/ 30 mm, finalizando com a turbina a 1000 rpm e a âncora a 40 rpm. É preferido não aumentar a agitação muito rapidamente; pois pode resultar uma retenção de ar. Se isto ocorrer, aplicar um vácuo de 400 mbar até que a solução esteja livre de bolhas de ar;

(13) . Remover a Amostra de Teste Final a partir do vaso de produção e testar novamente quanto ao Teste de Controle # 2, pH e quanto ao

Teste de Controle # 3, Viscosidade.

Teste de Controle # 3: Viscosidade

A amostra de teste deve ser aquecida a de 35°C ± 2° ( uma faixa de 33°C a 37°C). De um modo a otimizar o desempenho, a viscosidade deve ser de cerca de 30.000 a cerca de 40.000 cP. As medições quanto à viscosidade indicam que a viscosidade da solução é uniforme com a amostra de Referência PC e que as bateladas de produção CCS e a solução estão “APROVADAS”. Se a solução for “REPROVADA”, obter amostras de teste a partir do topo e do fundo do vaso de produção e conduzir o Teste de Controle # 2 e o Teste de Controle # 3, Viscosidade em cada amostra. Se a solução for ainda “REPROVADA”, repetir o estágio # 9 e o estágio # 12 e testar novamente a solução quanto ao Teste de Controle # 3, Viscosidade. Se a solução for 'REPROVADA” um Estudo de Fora de Especificação deve ser efetuado, de um modo a determinar a fonte da produção fora de especificação.

Foi descoberto que o ajuste da viscosidade com a adição de água fornece uma concentração/ percentual desconhecida na batelada de produção final, tomando a batelada de produção inaceitável.

(14). Quando a solução é “APROVADA” quanto aos Testes de Controle # 1, # 2, e # 3, ela é uma batelada de produção aceitável, que pode ser processada quanto ao teste de controle final. Conectar então o tubo de transferência contendo uma sacola de filtro ao valor base do vaso de produção e transferir a formulação ao interior de recipientes de armazenamento. Reter uma Amostra de Teste para Testes Microbiológicos, antes que sejam enchidas aos aplicadores.

A formulação final preparada no processo acima discutido possui os componentes que se seguem.

Peso/Percentual: 500 Litros de Formulação

Componente	Peso	Percentual
Água Purificada	484,0 kg	96,8

Metil parabeno	500 g	0,1
PBS:
NaCl	120 mmol/L
KC1	2,7 mmol/L
Sais de fosfato	10 mmol/L
10%HCl	500g	0,1
a mistura de 15 kg 3,0 K- ΙΙ/λ carragenano	15 kg	3,0

A formulação final possui um pH de cerca de 7,0, que foi ajustado através da adição de uma solução de HC1 e uma razão a 1:1 de K3PO4 e Na₂PO₄.

Exemplo 2 : Efeito de Carragenano sobre Infecções de HIV in vitro

O carragenano demonstrou bloquear o HIV e outros vírus envelopados por vários laboratórios, incluindo o laboratório do Pl¹⁵'¹⁹. Vários tipos diferentes de células alvo e cepas de HIV foram empregados nestes estudos. De um modo geral, 50% de bloqueio são observados em alguns microgramas / ml. Este resultado é similar a outros polissacarídeos sulfatados, tais que a heparina e o sulfato de dextrano.

Exemplo 3. Estudos de infecção viral intravaginal - HSV-2/ Camundongos

O sistema de HSV-2/ camundongo (Balb/ C) é amplamente utilizado pela maioria dos grupos investigatórios engajados no desenvolvimento de um microbicida. Uma diferença importante entre o sistema estabelecido por Phillips²⁰'²² e os outros sistemas é a utilização de uma comparação de faixa de dose viral. A dose de desafio viral padrão, 100% de dose de infecção ou 10⁴pfu, usada por outros para a avaliação de um microbicida é taxa limitativa. A grande maioria dos microbicidas sob desenvolvimento, assim como muitos dos espermicidas OTC irão apresentar uma taxa significativa de proteção contra infecção de HSV-2 nestas doses de desafio viral. No entanto, Phillips utilizou um método de concentração de vírus , que irá permitir a avaliação em doses de desafio virais de 10⁵, 10⁶ e 1.000 x 100% de dose de infecção.

Usando este sistema de dose de desafio viral, um estudo comparativo foi conduzido, de um modo a avaliar as taxas de proteção comparativas de um número de microbicidas sob desenvolvimento, espermicidas OTC e lubrificantes, e possíveis formulações para o uso como um placebo em ensaios clínicos para avaliar a eficácia de um microbicida. Em adição a uma composição da presente invenção contendo a mistura de K-11/λ carragenano (também referida aqui como a “composição de K-11/λ carragenano”), as formulações de teste comparativas foram: microbicidas sob desenvolvimento, tais que o BufferGel™ e No Fértil, espermicidas OTC: K-Y Plus®, GynolII®, e Advantage S™; lubrificantes vaginais OTC; Replens® e K-Y Jelly®; e as possíveis formulações de placebo: 2,5% de Carbopol® e 2, 5% de metil celulose.

As formulações recaem em três categorias com relação à eficácia em proteger os camundongos contra a infecção de HSV vaginal. Na dose de desafio viral de 10⁴ pfú, com a exceção de K-Y Jelly, Carbopol e metil celulose, todas as formulações proporcionaram um nível significativo de proteção contra a infecção de HSV-2. No entanto, na dose de desafio viral de 10⁵, com a exceção da composição de K-11/λ carragenano, todas as formulações proporcionaram apenas um nível mínimo de proteção. A composição de K-11/λ carragenano foi a única formulação que forneceu ainda um nível de proteção contra a infecção viral na dose de desafio viral de 10⁶pfú ²⁰. Através da avaliação de várias formulações no sistema de comparação de faixa de dose viral, os dados resultantes constituíram a primeira demonstração do alto nível inesperado de proteção conta a infecção viral, que a composição de K-11/λ provê.

Portanto, pode ser concluído que o sistema de HSV-2/ camundongo pode ser empregado como um meio, pelo qual os microbicidas podem ser avaliados e comparados, sob as mesmas condições de teste, de um modo a identificar os microbicidas efetivos potenciais.

Exemplo 4. Duração da atividade - HSV-2/Camundongo

Um dos critérios expostos pela UNAIDS (World Health Organization, ramificação AIDS) para um microbicida ideal menciona “ ele deve ser ativo mediante a inserção e durante um longo período de tempo”, proporcionando a uma mulher maior flexibilidade no uso do produto. De um modo adicional, o período de tempo de curso para a infecção através de hlV associado a célula ou de célula livre para que venha a ocorrer, pode não ser imediato. O sistema HSV-2/ camundongo pode ser empregado de um modo a avaliar a duração do período de tempo, em que um microbicida iria reter a atividade. Isto é efetuado através de uma aplicação intravaginal de uma formulação de teste, aguardando um período de tempo estabelecido, e então desafiando os camundongos com uma dose de vírus conhecida. Os testes de “Duração de atividade “ foram conduzidos usando o Gynol II® ( um N-9 a 2% contendo espermicida OTC), BufferGel® ( um microbicida de baixo pH sob desenvolvimento) e a composição de K-11/λ carragenano,em cinco minutos el,5,3,6el8 horas seguindo-se à aplicação da formulação. Acerca de um período de tempo de 1 e meia hora, o Gynol II® não mais forneceu qualquer proteção contra a infecção e BufferGel® havia caído a apenas 30% de efetividade. A eficácia do BufferGel continuou a cair ao longo do tempo e não mais forneceu qualquer proteção durante 6 horas. Em contraste acentuado, a composição de K-11/λ carragenano permaneceu de 85- 100% efetiva na proteção contra a infecção de HSV-2 durante até 6 horas, e permaneceu 72% efetiva em 18 horas. A composição de K-11/λ carragenano continuou a reter algum nível de atividade durante até 24 horas. Vide Figura

1. A duração estendida da proteção contra a infecção viral é única para o carragenano, de um modo particular para a composição de K-11/λ carragenano.

Exemplo 5. Estudos de infecção viral intrarretal- HSV-2/ Camundongos

De um modo ideal, um microbicida que foi efetivo na proteção contra a infecção por HIV poderia ser usado, tanto por via retal, como por via vaginal. Usando uma modificação de desafio viral intrarretal do sistema de HSV-2/ camundongo, foi então explorada uma avaliação quanto à eficácia e segurança de um microbicida.

O tratamento prévio do reto com a composição de K-11/λ carragenano reduziu, de um modo significativo, o número de animais que se tomaram infectados seguindo-se ao desafio viral com o HSV-2, comparado ao tratamento prévio com PBS ou com metil celulose ( um placebo inerte) . Exemplo 6. Efeito da composição de K-II/λ carragenano sobre a flora vaginal.

É importante que o uso de um microbicida não rompa o equilíbrio da flora vaginal natural. Estudos in vitro indicaram que o carragenano não aumentou ou inibiu a taxa de crescimento de Lactobacillus acidophilus, a bactéria mais comum, presente na flora vaginal. Um estudo conduzido em 35 mulheres, que participaram em um ensaio clínico da Fase I quanto à segurança vaginal da composição de K-II/λ carragenano, não demonstrou uma alteração significativa na flora vaginal, conforme medido pela presença ou pela ausência de vaginose bacteriana .

Exemplo 7. Sistema de transporte viral de HIV/ Camundongo

Embora os camundongos possam não ser infectados com o HIV, foi demonstrado que, quando o vírus ativo ou inativado é instilado na vagina do camundongo, o vírus pode ser subsequentemente detectado nos nodos linfáticos através do uso de reação de cadeia de polimerase — transcriptase reversa ( RT-PCT)²⁴. Foi apresentada evidência de que as células dendítricas desempenharam uma função na absorção do vírus e o transporte subsequente aos nodos linfáticos. Esta conclusão está de acordo com os estudos que implicam as células dendríticas no estágio inicial da transmissão sexual de HIV²⁵.

Os resultados indicam que a composição de K-11/λ carragenano é eficaz em evitar com que o HIV alcance o nodo linfático, presumivelmente através do bloqueio do transporte de HIV partir da vagina por meio de células dendríticas.

O transporte de HIV usando um sistema de camundongo e o vírus inativado Aldrithol™ 2 foram usados. Este é um método convencional para a inativação do HIV, que não altera o envelope viral. O baço e os nodos linfáticos foram testados quando à detecção de HIV, de um modo a estabelecer o baço como um sítio repositório alternativo para o HIV. O baço (em oposição aos nodos linfáticos) permite a obtenção de quantidades relativamente maiores de RNA para que seja executado o RT- PCR para a detecção de HIV. De um modo adicional, a extração de baços consome menos tempo do que a remoção dos nodos linfáticos, deste modo diminuindo a probabilidade de degradação do RNA.

De um modo a determinar a eficácia da composição de K-11/λ carragenano em evitar com que o HIV possa cruzar a barreira cervical/ vaginal, os camundongos foram distribuídos, de um modo aleatório, em três grupos: 1) camundongos de controle de PBS não-tratado; 2) camundongos previamente tratados com metil celulose (placebo inerte); e 3) camundongos previamente tratados com a composição de K-11/λ carragenano. Os resultados são apresentados no Borrão de Southern, na Figura 2, e na tabela abaixo.

Tratamento	PT-PCR+/total	Percentagem Positiva (Infectada)
PB5	16/22	72%
Metil celulose	7/10	70%
Composição de K- ΙΙ/λ carragenano	2/22	9%

Os dados a partir de PBS (controle) e de camundongos tratados com metil celulose e tratados com a composição de K-11/λ carragenano mostraram que a composição de Κ-ΙΙ/λ carragenano reduziu, de um modo significativo, o número de animais positivos ( isto é, infectados), e que a metil celulose não apresentou nenhum efeito, quando comparada com o PBS ( controle). Os dados também indicam que a composição de K-11/λ carragenano foi eficaz em evitar com que o HIV possa deixar a cavidade vaginal.

Exemplo 8. Sistema de tráfego celular/ camundongo

Foi previamente sugerido que a transmissão sexual de HIV poderia ser mediada através de linfócitos infectados com HIV ou de macrófagos no semen, que cruzam o epitélio do trato vaginal ’ . De um modo a testar a hipótese de que as células sanguíneas mononucleares trafegam a partir da cavidade vaginal intactas através de epitélios, células sanguíneas mononucleares ativadas por manchamento duplo vitalmente (camundongos) foram colocadas na vagina de camundongos. Quatro horas após, os animais foram sacrificados, e os nodos linfáticos ilíaco e inguinal e o baço foram removidos e as células foram dissociadas e contadas através de microscopia de fluorescência. Numerosas células com manchamento duplo foram observadas nos nodos linfáticos ilíaco e inguinal e no baço ’ . De um modo a avaliar o efeito que a composição de K-II/λ carragenano pode ter sobre o bloqueio deste processo, os animais foram previamente tratados coma formulação de teste anteriormente à instilação das células rotuladas.

Camundo	Inoculação	Nodos linfáticos	Baço
ngo		ilíaco & inguinal
1	Macrófagos	36	555
2	Macrófagos	52	366
3	Macrófagos	59	672
4	Macrófagos	87	786
5	Macrófagos	61	357
6	Macrófagos	40	859
7	Macrófagos	54	312
8	K-11/λ carragenano +	4	30
9	Macrófagos	4	6
10	K-11/λ carragenano +	6	48
11	Macrófagos	3	53
12	K-11/λ carragenano +	3	3
13	Macrófagos	14	120
14	K-11/λ carragenano +	27	245
15	Macrófagos K-11/λ carragenano + Macrófagos Metil celulose + Macrófagos Metil celulose + Macrófagos Metil celulose + Macrófagos	38	96

As células de doador estavam presentes tanto nos nodos linfáticos ilíaco e inguinal e no baço. Quando os camundongos receberam apenas uma inoculação vaginal de macrófagos, os animais receptores tinham 5 uma média de 55 células de doador rotuladas nos nodos linfáticos de drenagem e 558 células no baço, respectivamente. Nos camundongos, que receberam uma inoculação prévia vaginal da composição de K-11/λ carragenano (indicadas na tabela acima como “ K-11/λ carragenano”), uma média de apenas 4 células foram contadas nos nodos linfáticos de drenagem, e uma média de apenas 28 foram observadas no baço. A diferença entre os animais não-tratados e os animais tratados com a composição de K-11/λ carragenano foi significativa. Quando os receptores foram previamente inoculados com metil celulose, o número de células de doador que alcançaram os nodos linfáticos e o baço foi, em média, de 26 nos nodos linfáticos e de 153 no baço. A diferença entre os camundongos tratados com a composição de K-11/λ carragenano e dos camundongos tratados com metil celulose foi significativa, enquanto que a diferença entre os camundongos não-tratados e os camundongos previamente inoculados com metil celulose não foi significativa. Não foram observadas células fluorescentes nos camundongos de controle, que haviam sido inoculados com macrófagos manchados com CMTMR congeladosdescongelados.

Exemplo 9. Efeito microbicida sobre o papilomavírus

A composição de K-11/λ carragenano foi também comprovada como sendo eficaz no bloqueio da formação de focos de papilomavírus bovino (BPV) in vitro (dados não mostrados). A composição de K-11/λ carragenano é eficaz em evitar com que o papilomavírus humano (HPV) transforme os explantes vaginais humanos em um sistema de xenoenxerto. O sistema de xenoenxerto do camundongo SKID emprega explantes do tecido vaginal humano, enrolados em tubos cilíndricos, que são enxertados subcutaneamente em camundongos²⁹ NOD/ SKID (imunodeficientes). Os enxertos são deixados ser curados durante duas semanas, em cujo tempo uma extremidade do tubo é aberta e um composto de teste é instilado, seguido por um desafio de HPV. Nos experimentos que avaliam a composição de K-11/λ carragenano, 14 de 14 explantes de controle tratados com solução salina foram transformados. Em contraste, apenas 1 de 17 explantes tratados com a composição de Κ-ΙΙ/λ carragenano foram transformados (dados não mostrados).

Exemplo 10. Efeitos da mistura de K-11/λ carragenano no ensaio de diluição

A mistura de K-11/λ carragenano é também efetiva em altas taxas de diluição, conforme demonstrado no sistema de HSV-2 camundongo. Uma composição de K-11/λ carragenano a 3 % foi diluída em PBS, de um modo a produzir diluições de 1:1, 1:5, 1:25, 1:100, e 1:200. As soluções diluídas foram administradas através da via vaginal a camundongos, seguido por 10⁴ (100% de dose de infecção) de HSV-2. Os resultados destes experimentos são inesperados. Em vez de observar um decréscimo dependente de dose na taxa de proteção antiviral, a diluição da composição de K-11/λ carragenano a 1:50 reteve a maior parte da taxa de proteção antiviral como soluções menos diluídas. Além disso, uma atividade significativa foi retida mesmo com a solução a 1:200. Vide a Figura 11.

Exemplo 11. Efeitos das formulações à base da composição d e K-11/λ carragenano contra o HSV-2

Os compostos, que foram identificados para serem adicionados a, ou ligados aos carragenanos da presente invenção, aumentam, de um modo significativo, a eficácia quanto ao bloqueio da infecção de HIV de PBMCs in vitro. Os estudos quanto à eficácia do Zn- carragenano e do LSAcarragenano sobre o bloqueio da infecção de HIV de PBMCs demonstraram que ambas as formulações são mais efetivas do que uma composição contendo os carragenanos isoladamente, em concentrações mais baixas. Os resultados dos testes são apresentados na Figura 3.

Exemplo 12. Efeitos de LSA-carragenano contra HSV-2

Os resultados indicam que o LSA- carragenano é mais eficaz no bloqueio da infecção de HIV do que os carragenanos. (Vide a Figura 4). Originalmente, o LSA não pareceu ser um composto candidato ideal para um microbicida, devido ao fato de possuir uma coloração marrom. No entanto, foi verificado que uma concentração de 0,25% de LSA é altamente eficaz, e que confere uma coloração desprezível, quando formulada. De um modo a assegurar que o LSA não iria conferir uma descoloração, o tecido de algodão branco foi embebido durante a noite em 3 % de LSA, e então enxaguado com água da bica; os resultados não revelaram alteração na cor do tecido. O carragenano- LSA foi comparado com o carragenano no sistema de HSV-2/ camundongo, de um modo a determinar a eficácia quanto ao bloqueio da infecção viral in vivo. Os resultados preliminares demonstraram que o LSAcarragenano era mais eficaz do que o carragenano quanto ao bloqueio da infecção viral.

Em adição aos resultados apresentados acima, o LSAcarragenano foi comparado à composição de K-11/λ carragenano isoladamente, em uma dose de desafio viral de 10⁶ pfu, em três experimentos separados. O LSA-carragenano foi significativamente mais efetivo do que a composição de K-11/λ carragenano isoladamente, em todos os experimentos. A adição de outros polímeros sulfatados à composição de K-11/λ carragenano não aumentou a eficácia da formulação. Por exemplo, a adição de 5% de sulfato de dextrano ou de 5% de heparina à composição de K-11/λ carragenano não teve efeito sobre a eficácia contra a infecção de HSV-2 em camundongos.

Avaliação das Formulações da composição de K-11/λ carragenano (referida nas três tabelas abaixo como “Carragenano”) com e sem LSA

A dose viral de 10⁶ pfu de HSV-2 é equivalente a 100 vezes a dose viral que iria infectar todos os camundongos desprotegidos. E necessário usar tais altas doses de vírus, porque o carragenano é extremamente eficaz em inibir a infecção viral.

[0125] Cada formulação é inicialmente testada em um total de 20 camundongos. Os compostos ou formulações, que apresentam um efeito de bloqueio, são testados novamente em outros 20 camundongos. O número de camundongos infectados é uma média.

/ 14/ 20/70

1% de Carragenano / 20/ 20 / 100

0,5% de Carragenano / 20/ 20 / 100

3% de Carragenano / 4/20 / 20

3% de LSA

3% de Carragenano / 2/20 / 10 +1 % de LSA 3% de

Carragenano / 4/20 / 20 + 0,5% de LSA 3% de Carragenano / 5/20 / 25 +

0,25% de LSA 3% de Carragenano / 7/20 / 35 + 0,1% de LSA

FORMULAÇÃO	# DE CAMUNDONGOS INFECTADOS	% INFECTADOS
	# CAMUNDOGOS TOTAL
3% de Carragenano	14/20	70
1% de Carragenano	20/20	100
0,5% de Carragenano	20/20	100
3% Carragenano + 3% LSA	4/20	20
3% Carragenano + 1% LSA	2/20	10
3% Carragenano + 0,5% LSA	4/20	20
3% Carragenano + 0,25% LSA	5/20	25
3% Carragenano + 0,1% LSA	7/20	35

A dose viral é de 100 vezes a taxa de 100% de infecção e nenhum composto, outro que o efeito mínimo de 3% de carragenano, possui 15 qualquer efeito em uma tal alta dose de vírus.

Subsequentemente, o LSA foi testado sem o Carragenano, de um modo a melhor avaliar as suas propriedades inibitórias. O LSA foi adicionado ao espessante inerte, metil celulose, de um modo a manter a mesma viscosidade que os produtos vaginais (lubrificantes, espermicidas, e microbicidas) geralmente possuem. (Os dados são mostrados abaixo).

Avaliação do LSA sem o carragenano

FORMULAÇÃO	# DE CAMUNDONGOS INFECTADOS	% INFECTADOS
	# CAMUNDOGOS TOTAL
3% de Carragenano	14/20	70
3% de LSA- metil celulose	8/20	40
1% de LSA-metil celulose	8/20	40

O LSA comprovou ser mais eficaz do que o carregenano, apresentando um melhor bloqueio da infecção de HSV-2 do que o carragenano. No entanto, a combinação dos dois ingredientes superou qualquer uma das duas isoladamente.

Exemplo 13. Uso de LSA em Microbicidas

O LSA é efetivo como um microbicida conta a infecção de HSV-2, HIV, e de outros STIs, com ou sem o carragenano. O polímero sulfatado LSA é efetivo na proteção de células epiteliais in vitro contra a infecção de HIV e em camundongos contra a infecção de HSV-2. O efeito inibitório pode ser observado com outros vírus envelopados, tais que o patógeno humano, a célula T humana, o vírus de leucemia. De um modo adicional, as células epiteliais são protegidas contra o papilomavírus humano, que não é um vírus envelopado. A eficácia inibitória do LSA pode, deste modo, estender-se a uma faixa mais ampla de STIs. Os resultados dos restes são apresentados na Figura 5.

Exemplo 14. Efeitos de Zn-Carragenano contra o HSV-2

Estudos quanto à eficácia de Zn-carragenano contra a infecção de HSV-2 foram conduzidos in vitro e in vivo. Os estudos in vitro testaram ο efeito dos sais de Zn isoladamente na prevenção da formação de placa no ensaio de placa de HSV-2⁴¹. Foi verificado que os sais de Zn possuíam um

IC50 em uma concentração de 50 mM, na redução da formação de placa. Foi observado que o Zn- carragenano é significativamente mais eficaz do que o carragenano ou os sais de Zn isoladamente na prevenção da formação de placa, IC₅₀ < 10 pg/ ml, ou < 25 mM. Os resultados dos testes são apresentados na Figura 6.

O Zn- carragenano foi também avaliado no sistema de HSV-2/ camundongo (vide a Figura 7). De um modo a comparar o Zn-carragenano com o OTC, o espermicida K-Y Plus e a composição de K-11/λ carragenano, as doses de desafio viral de HSV-2 na faixa de 10³ pfu ou de 50% de dose de infecção, a 10⁷ pfu ou 1.000 x 100% de dose de infecção, foram também usados. Os requerentes determinaram que a composição de K-11/λ carragenano poderia proteger algumas animais em uma dose de desafio viral de 10⁶ pfu ou de 100 x 100% da dose de infecção. Nenhum outro microbicida candidato testado foi capaz de proporcionar proteção nesta dose viral. Em estudos preliminares, foi observado que o Zn-carragenano protege, de um modo significativo, os camundongos contra a infecção de HSV-2 nesta dose, assim como em uma dose de desafio viral de 10⁷ ou de 1.000 x 100% de dose de infecção. O fato de que a adição de Zn à composição de K-11/λ carragenano ( para formar um complexo) tenha aumentado o nível de proteção antiviral foi inteiramente inesperado.

Exemplo 15. Duração de atividade de Zn-carragenano

A composição de K-11/λ carragenano permanece ativa na vagina do camundongo durante um período de tempo estendido. Experimentos similares foram executados, de um modo a comparar o Zncarragenano a dois espermicidas de OTC, Advantage S e Conceptrol, durante a duração da atividade. Foi observado que o Zn- carragenano não perdeu qualquer nível de atividade em 6 horas, quando o Advantage Seo Conceptrol demonstraram uma redução de 50% na atividade em 1,5 horas e em 3 horas não eram mais capazes de proporcionar proteção (vide a Figura 8).

Exemplo 16. Desafio pós-viral de eficácia de Zn-carragenano

Um microbicida, que foi capaz de ser efetivo, mesmo se administrado seguindo-se à exposição a um vírus, iria estender o uso do produto, de um modo a incluir mulheres que não eram capazes de usar o produto até que o intercurso já tivesse ocorrido, por exemplo, mulheres que fossem vítimas de estupro. Previamente, os pesquisadores foram incapazes de identificar um microbicida que pudesse proporcionar uma tal proteção. O Zncarragenano é capaz de proporcionar proteção contra a infecção de HSV-2 em um desafio pós- viral de camundongos. Como os dados abaixo demonstram, o Zn- carragenano é excepcional pelo fato de que ele demonstrou atividade até 4 horas após a exposição pós-viral (vide a Figura 9). Esta descoberta é notável à luz das observações dos Requerentes de que a composição de K-11/λ carragenano não evitou a infecção de desafio pós- viral, a não ser que administrada imediatamente, seguindo-se ao desafio de HSV-2. Exemplo 17. Microbicida Contraceptive para a Proteção Dupla

A composição de K-11/λ carragenano permanece na vagina por até 24 horas, permitindo uma aplicação apenas uma vez ao dia para a proteção contra o HIV e o seu uso como um sistema de distribuição vaginal para um hormônio contraceptivo. A exequibilidade da distribuição de vários esteróides vaginalmente foi inteiramente investigada com o recente desenvolvimento de anéis vaginais contraceptives⁴³. Foi demonstrado que os esteróides aplicados diretamente à mucosa vaginal são rapidamente absorvidos, e que apenas doses muito pequenas são requeridas para que seja alcançado o efeito contraceptivo desejado⁴⁸'⁵². De um modo adicional, a distribuição vaginal é usualmente acompanhada por efeitos colaterais indesejáveis diminuídos, que estão, de um modo frequente, associados com os contraceptivos orais.

As formulações vaginais da presente invenção proporcionam uma proteção dupla como uma combinação de microbicida/ contraceptivo que possui uma vantagem adicional de aumentar a motivação do usuário quanto à aquiescência. O hormônio contraceptivo NES é um agente contraceptivo preferido. Esta progestina sintética tem demonstrado ser uma molécula excepcionalmente potente. Usando os bioensaios clássicos para medir a potência progestacional, o NES comprovou ser 100 vezes mais ativo do que a progesterona e apenas quantidades muito pequenas de NES são requeridas para suprir a atividade luteal. De um modo adicional, estudos toxicológicos extensivos de NES foram conduzidos.

Exemplo 18. Difusão de NES a partir da mistura de K-11/λ carragenano

De um modo a que a formulação contendo a composição de KΙΙ/λ carragenano e NES (a seguir CARRA/ NES) para que seja efetiva como um contraceptivo, é essencial que o NES seja liberado a partir do carragenano e absorvido através da vagina. Executamos ensaios in vitro, de um modo a determinar se o NES é liberado a partir de CARRA/NES.

Examinamos a difusão de NES através de uma membrana de diálise com um corte de peso molecular de 1000. O peso molecular de NES é 370. O NES difundido a partir do saco de diálise em uma taxa constante, tal como medido através de HPLC. Os resultados estão ilustrados na Figura 10. Estes resultados demonstram que no NES não está ligado ao carragenano. No entanto, a taxa de difusão observada através da membrana de diálise não pode estar relacionada à taxa de difusão que seria observada na vagina humana, pois a taxa de difusão era dependente da área superficial do saco de diálise. As condições na vagina seriam diferentes.

Também conduzimos um experimento, que envolveu a centrifugação de CARRA/NES através de um filtro centrifugo Ultrafree - 15 e um conjunto de tubo a 2000 g durante 99 minutos, de um modo a calcular o percentual de NES liberado. O filtro centrífugo é um dispositivo que é ajustado no interior de um tubo centrífugo. O dispositivo possui um filtro em forma de flauta no fundo, o que permite com que as moléculas com um MW abaixo de 500 possam passar através do mesmo. Usando este dispositivo, acima de 98% do NES adicionado foi recuperado no filtrado. Este experimento confirma que o NES não está ligado ao carragenano.

Exemplo 19. CARRA/ NES (Taxas de Liberação) [CARRA/NES]

Soluções de concentrações crescentes de NES foram formuladas sob a forma da composição de K-11/λ carragenano, de um modo a estabelecer a compatibilidade dos dois compostos. Uma concentração de 500 pg/ml de NES na composição de K-11/λ carragenano reteve as propriedades reológicas, tais que medidas por pH, viscosidade, homogeneidade e aparência ocular, e exibiu a retenção da concentração, tal como medida através do ensaio de HSV-2/ camundongo. Esta concentração de NES é 40 vezes mais alta do que a concentração prevista, requerida para uma formulação de alta dose de 100 pg/ ml.

A difusão de NES a partir de CARRA/NES foi investigada através de dois métodos diferentes, diálise de membrana e centrifugação de Ultrafree- 15. Nos experimentos de diálise de membrana, o corte da membrana é de 1.000, e difusão de NES foi medida através de HPLC. Os resultados indicam que o NES não está ligado ao carragenano negativamente carregado e, embora a taxa de difusão através de uma membrana de diálise seja diferente da absorção sistêmica in vivo, a difusão ocorre em um modo dependente do tempo. Nos experimentos de centrifugação de Ultrafree-15, um filtro centrífugo Ultrafree-15, Millipore, e o conjunto de tubo foi empregado, o que permite a passagem de moléculas de um MW < 500 possa passar; O MW de NES é 370. O uso desta técnica demonstrou que 98, 6% de NES foram recuperados.

Exemplo 20. Zn/ Carragenano / MIV-150

A combinação dos carragenanos mais preferidos da presente invenção, junto com o acetato de zinco como o metal solúvel em água e MIV150 como o NNRTI foi comparada com combinações de zinco/ carragenano (PC-107), MIV- 150 /carragenano (PC-815), e carragenano (Carraguard®). De um modo particular, quando os animais foram desafiados com SHIV- RT, 8 horas ou 24 horas após a última dose de cada um destes géis, PC-707 e PC815, separadamente, bloquearam a infecção vaginal de SHIV- RT a cerca do mesmo nível que o Carraguard® (com um valor de p maior do que 0,05) e ao mesmo tempo, em ambos os pontos de tempo, PC- 1005 bloqueou a infecção de SHIV-RT vaginal melhor do que estes compostos (com um valor de p inferior a 0,03). Deste modo, embora o PC-707 e o PC- 815 não tivessem bloqueado a infecção de SHIV-RT vaginal em alguma extensão durante até 24 horas, não foi previsível que a combinação de acetato de zinco, carragenanos e de MIV- 150 pudesse bloquear totalmente a infecção de SHIV- RT vaginal durante até 24 horas.

Os procedimentos experimentais foram executados como se segue:

Uma jarra de misturação de vidro de 700 ml foi carregada com

1,5 gramas de diidrato de acetato de zinco, 15,0 gramas dos carragenanos (neste caso, 95% de carragenano lambda e 5% de capa carragenano), e 300, 3 gramas de água purificada estéril. Os conteúdos foram misturados com um agitador aéreo, a 300 rpm, durante três horas, em temperatura ambiente. De um modo separado, um frasco Erlenmeyer de 250 ml foi carregado com 1,0 gramas de metil parabeno e 150,9 gramas de água purificada estéril. O frasco Erlenmeyer foi aquecido a 60°C, com agitação, de um modo a fornecer uma solução clara, e os conteúdos do frasco foram imediatamente adicionados à mistura de água zinco- carragenano, contida na jarra de misturação de 700 ml. A mistura foi agitada durante duas horas, em temperatura ambiente, em cujo período de tempo 5 ml de uma solução de material de MIV- 150/ DMSO, preparada através da dissolução de 18,5 mg de MIV-150, em 10 ml de sulfóxido de dimetila, foi adicionada aos conteúdos da jarra de misturação de 700 ml. Esta mistura foi então agitada a 300 rpm, durante 35 minutos, em temperatura ambiente, e 26 gramas de água estéril purificada foram então adicionados à jarra de misturação e os conteúdos foram agitados, durante 30 minutos, em temperatura ambiente.

Macacos foram injetados com Depo- Provera e três semanas após, foi fornecido aos mesmos 2 ml do gel preparado como acima discutido, por dia, durante duas semanas, antes de serem desafiados com 1.000 TCID₅₀de SHIV-RT nos períodos de tempo indicados, após o último gel ter sido aplicado. Os números dos animais infectados, tal como exposto abaixo na Tabela 1, reflete o número com a viremia típica (cópias de SIV RNA no plasma).

Tabela 1- A aplicação repetida de PC-1005 protege contra a infecção de SHIV-RT vaginal durante até 24 horas.

Microbicida #	Desafio após a ultima aplicação de gel	Número infectados /total	Percentual infectado	Significància' (valor p; MC contra teste)	Significância^A(valor p; Carr contra teste)
MC	4h, 8h, 24h	12/14	85.71%
PC-1005	4h	0/7	0%	<0.0003

Carraguard	8h	5/7	71.43%	<0.6
PC-815	8h	2/7	28.57%	<0.02	<0.3
PC-707	8h	1/7	14.29%	<0.004	<0.2
PC-1005	8h	0/7	0%	<0.0003	<0.03

Carraguard	24h	4/7	57.1%	<0.3
PC-815	24h	4/7	57.1%	<0.3
PC-707	24h	2Π	28.57%	<0.02	<0.3
PC-1005	24h	0/7	0%	<0.0003	<0.03

ü MC = placebo de metí celulose; PC-707 = Carraguard + 0.3 % de acetato de zinco

PC-815 = Carraguard 4- 50 μΜ MIV-150; PC- 1005 = Carraguard + 0,3 % de acetato de zinco + 50 μΜ de M1V-150 ^Λ Calculado usando os testes exatos de Fisher

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Embora a invenção tenha sido aqui descrita com referência a modalidades particulares, deve ser entendido que estas modalidades são meramente ilustrativas dos princípios e das aplicações da presente invenção. Deve, portanto, ser entendido, que numerosas modificações podem ser introduzidas nas modalidades ilustrativas, e que outros arranjos podem ser projetados, sem que haja afastamento do espírito e do escopo da presente invenção, tal como definido pelas reivindicações apensas.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

A presente invenção provê composições antimicrobianas, que podem ser utilizadas, de um modo específico, para a inibição antimicrobiana prolongada com seres humanos, de um modo preferido para as fêmeas, através de administração vaginal. Elas são, deste modo, especificamente úteis para inibir a transmissão de infecções sexualmente transmitidas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição antimicrobiana aquosa, compreendendo uma quantidade efetiva de um agente antimicrobiano, que compreende carragenanos, que são o carragenano lambda em uma quantidade de pelo menos 50%, em peso seco, dos referidos carragenanos, o restante dos referidos carragenanos sendo, pelo menos, um carragenano não-lambda, e um sal metálico solúvel em água fisiologicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende um agente antirretroviral compreendendo MIV-150.
2. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que inclui um agente de controle do pH fisiologicamente aceitável.
3. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que inclui um conservante fisiologicamente aceitável.
4. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

2, caracterizada pelo fato de que o referido agente de controle do pH fisiologicamente aceitável é selecionado a partir do grupo, que consiste de acetato, citrato e de tampões de lactato.
5. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido tampão de acetato compreende uma mistura de ácido acético e de acetato de sódio.
6. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido tampão de citrato compreende uma mistura de ácido cítrico e de citrato de sódio.
7. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido tampão de lactato compreende uma mistura de ácido láctico e de lactato de sódio.
8. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

3, caracterizada pelo fato de que o referido conservante fisiologicamente

Petição 870190091103, de 13/09/2019, pág. 13/23 aceitável compreende o metil parabeno.
9. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido MIV-150 está presente em quantidades de a partir de cerca de 5 μΜ a cerca de 5.000 μΜ.
10. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o referido MIV-150 está presente em quantidades de a partir de cerca de 20 μΜ a 250 μΜ.
11. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

I, caracterizada pelo fato de que a referida quantidade efetiva do referido agente antimicrobiano é de cerca de 1 % a cerca de 5%, em peso total, da referida composição.
12. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

II, caracterizada pelo fato de que a referida quantidade efetiva do referido agente antimicrobiano é de cerca de 3 %, em peso total, da referida composição.
13. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem um pH de cerca de 3,5 a cerca de 8,5.
14. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,2.
15. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que o referido metal é zinco, cobre ou enxofre.
16. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

15, caracterizada pelo fato de que o referido sal metálico é o acetato de zinco.
17. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

15, caracterizada pelo fato de que o referido sal metálico é o lactato de zinco.
18. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que o referido sal metálico está presente em uma quantidade de a partir de cerca de 0,03 % a cerca de 1,5%, com base no peso total da referida composição.

Petição 870190091103, de 13/09/2019, pág. 14/23
19. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o referido sal metálico está presente em uma quantidade de a partir de cerca de 0,3 % a cerca de 1,0%, com base no peso total da referida composição.