BR102019027600A2 - Proteína quimérica recombinante, vacina contra ascaridiose e usos - Google Patents

Abstract

proteína quimérica recombinante, vacina contra ascaridiose e usos. a presente tecnologia trata de uma proteína quimérica recombinante, definida pela seq id n°1, composta por epítopos específicos para linfócitos b derivados de três proteínas de ascaris suum. a proteína quimérica é capaz de induzir proteção contra ascaridiose. a presente tecnologia trata também de uma vacina compreendendo tal proteína e seus usos.

Description

PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE, VACINA CONTRA ASCARIDIOSE E USOS

[01] A presente tecnologia trata de uma proteína quimérica recombinante, definida pela SEQ ID N°1, composta por epítopos específicos para linfócitos B derivados de três proteínas de Ascaris suum. A proteína quimérica é capaz de induzir proteção contra ascaridiose. A presente tecnologia trata também de uma vacina compreendendo tal proteína e seus usos.

[02] As enteroparasitoses são um grave problema de saúde pública mundial e estão relacionadas principalmente a condições precárias de saneamento básico, além da ausência de hábitos de higiene adequados, sobretudo na infância. Entre os patógenos, os parasitos intestinais são os mais encontrados em humanos, sendo que as helmintíases e protozooses representam as doenças mais frequentes no mundo.

[03] Ascaris lumbricoides é uma das principais espécies de geo-helmintos que infectam a população humana. Pertencente ao filo Nematoda, ordem Ascaridida, família Ascaridae, é causador da ascaridíase, doença que acomete cerca de 807 milhões de pessoas, e pode levar a obstrução intestinal e prejudicar o crescimento de crianças.

[04] Ascaris suum destaca-se como o parasito mais impactante no sistema de criação de suínos, afetando negativamente a fecundidade, o peso dos filhotes ao nascer e no desmame, redução no ganho de peso diário e, ainda, causando prejuízos devidos à alta taxa de condenação das vísceras nos abatedouros.

[05] A discussão a respeito da diferenciação das espécies do gênero Ascaris vem sendo realizada há anos e diversos estudos têm apontado que o Ascaris lumbricoides e o Ascaris suum são na verdade uma única espécie, infectando humanos e suínos (BETSON, M. et al. Molecular epidemiology of ascariasis: a global perspective on the transmission dynamics of Ascaris in people and pigs. J Infect Dis., v. 210, p. 932-941, 2014; SHAO, C. C. et al. Comparative analysis of microRNA profiles between adult Ascaris lumbricoides and Ascaris suum. BMC Vet Res., v. 10, p. 1-6, 2014).

[06] O Ministério da Saúde lançou, em 2005, o Plano de Vigilância e Controle das Enteroparasitoses, visando reduzir a prevalência, morbidade e mortalidade por esses parasitos no Brasil. As principais medidas profiláticas consistiam em desenvolver atividades de educação em saúde, particularmente com relação a hábitos pessoais de higiene, além de implantar saneamento básico e tratar as pessoas infectadas. Contudo, essas estratégias são limitadas, principalmente nas regiões endêmicas onde o saneamento básico e o sistema de educação em saúde são precários, o que leva a altas taxas de reinfecção após o tratamento específico, tornando o uso de vacinas uma ferramenta adicional e eficaz para a prevenção de doenças (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Doenças Infecciosas e Parasitárias. 2004. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_bolso_4ed.pdf>. Acesso em: 04 mar. 2017; BRASIL. SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE. Plano nacional de vigilância e controle das enteroparasitoses. 2005. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/enteroparasitoses_pano_nacio nal.pdf>. Acesso em: 04 mar. 2017; BRASIL. PORTAL BRASIL. Vacinas são armas eficazes para prevenir doenças. 2014. Disponível em: <http://www.brasil.gov.br/saude/2014/10/vacinas-sao-armas-eficazes-para-prevenir-doencas>. Acesso em: 04 mar. 2017).

[07] As vacinas são a estratégia de intervenção que possui melhor custo-benefício, sendo aquelas construídas a partir de peptídeos sintéticos uma das mais promissoras contra uma gama de patógenos e tumores. A vacinação contra helmintos é a melhor via de escolha para a erradicação da infecção. Requer além da identificação de antígenos alvo, a compreensão da imunologia na relação parasito-hospedeiro, uma vez que os mesmos desencadeiam respostas diferentes, dependendo do órgão em que se instalam.

[08] O desenvolvimento de vacinas com a finalidade de combater a infecção por helmintos vem sendo alvo de vários trabalhos. Soulsby em 1957 imunizou suínos utilizando extrato de ovos embrionados de Ascaris lumbricoides e obteve redução de 50% na migração de larvas e de 45% no crescimento de larvas depois da infecção desafio (SOULSBY, E. J. L. Immunization Against Ascaris lumbricoides in the Guinea Pig. Nature, v. 179, p.783-784,1957). Serrano et al. (2001), utilizando ovos de Ascaris suum, obtiveram um alto grau (97-99%) de resistência contra larvas no pulmão de porcos imunizados e uma proteção de 67-93% em suínos imunizados com as frações 14kDA e 42kDA de fluido pseudocoelômico (SERRANO, F. J. et al. Resistance against migrating Ascaris suum larvae in pigs immunized with infective eggs or adult worm antigens. Parasitology, v. 122, p.699-707, 2001).

[09] Tsuji et al. (2001) obtiveram redução de 64% de larvas recuperadas no pulmão de camundongos imunizados via intranasal com a proteína recombinante As14 juntamente com a subunidade B de toxina de cólera (rAs14-CTB) (Tsuji et al. Intranasal Immunization with Recombinant Ascaris suum 14-Kilodalton Antigen Coupled with Cholera Toxin B Subunit Induces Protective Immunity to A. suum Infection in Mice. Infection and Immunity, v. 69, p. 7285-7292, 2001). Em 2004, Tsuji et al., utilizando Escherichia coli expressando a proteína recombinante As16 (rAs16) juntamente com a toxina de cólera, obtiveram a redução de 58% de larvas recuperadas no pulmão de porcos imunizados via intranasal (Tsuji et al. Recombinant Ascaris 16-Kilodalton Protein-Induced Protection against Ascaris suum Larval Migration after Intranasal Vaccination in Pigs. The Journal of Infectious Diseases, v. 190, p. 1812-1820, 2004).

[010] Chen et al. (2012), utilizando a proteína recombinante pVAX-Enol do gene que codifica Ascaris suum enolase (As-enol-1), obtiveram a redução de 61,13% de larvas recuperadas no pulmão de camundongos imunizados (Chen et al. Ascaris suum enolase is a potential vaccine candidate against ascariasis. Vaccine, v. 30, p. 3478-82, 2012). Em 2018, Gazzinelli-Guimarães et al. obtiveram redução de 61% de larvas recuperadas no pulmão de camundongos imunizados com extrato bruto de larva infectante (L3), 59% em animais imunizados com extrato bruto da cutícula de larva adulta e 51% em imunizados com extrato bruto de larva adulta (Gazzinelli-Guimarães et al. IgG Induced by Vaccination With Ascaris suum Extracts Is Protective Against Infection. Front Immunol, v. 9, 2018).

[011] O documento de patente US3676547, intitulado “Ascaris suum vaccine”, cuja data de prioridade é 18 de setembro de 1970, trata de uma vacina composta por antígenos obtidos de Ascaris no segundo ou terceiro estágio larval.

[012] O documento de patente JP3613577, intitulado “16kDa antigen of Ascaris suum-infected larva, molecule of nucleic acid encoding the same and use thereof’, cuja data de prioridade é 07 de janeiro de 2002, refere-se à proteção imunológica conferida a porcos, induzida pela proteína recombinante de 16kDa de Ascaris suum.

[013] O documento de patente JP3692396, intitulado “14 kDa antigen of infectious larva Ascaris suum, nucleic acid molecule encoding the same and their uses”, cuja data de prioridade é 26 de fevereiro de 2001, trata de uma proteína recombinante de 14kDa e seu gene codificante, que confere proteção em camundongos contra Ascaris suum.

[014] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia desenvolvida para composição vacinal contra ascaridiose que compreenda a sequência peptídica da proteína quimérica recombinante descrita na presente tecnologia.

[015] A presente tecnologia trata de uma proteína quimérica recombinante composta por epítopos específicos de três proteínas de Ascaris suum. A proteína quimérica é capaz de induzir proteção contra ascaridiose e pode ser utilizada em uma composição vacinal, a qual também é objeto da presente tecnologia. A proteína quimérica é constituída de antígenos baseados em epítopos preditos de células B, que são a porção mais imunogênica de bons candidatos vacinais. Esse fato confere uma vantagem superior a proteínas completas que podem ter regiões não imunogênicas ou de baixa imunogenicidade. A imunização utilizando a proteína quimérica da presente tecnologia apresenta uma proteção, frente à infecção por A. suum em camundongos, maior do que as tecnologias existentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] A Figura 1 apresenta a sequência nucleotídica (A) e aminoacídica (B) da proteína quimérica. Na sequência nucleotídica, as regiões em vermelho, azul e rosa correspondem, respectivamente, às sequências imunogênicas das proteínas As14, As37 e As16. As regiões em verde correspondem às sequências espaçadoras, que codificam para os aminoácidos glicina e serina. Na sequência proteica, as regiões destacadas em amarelo correspondem aos peptídeos selecionados, enquanto as não destacadas correspondem aos espaçadores de glicina (G) e serina (S).

[017] A Figura 2 representa a análise do número de larvas recuperadas no pulmão após eutanásia dos camundongos. PBS: animais imunizados com tampão fosfato (veículo); PTN: animais imunizados com 25μg da proteína quimérica; PTN+ADJ: animais imunizados com 25μg da proteína quimérica e 25μg do adjuvante monofosforil lipídio A (MPLA); ADJ: animais imunizados com 25μg do adjuvante MPLA.

[018] A Figura 3 demonstra o gráfico da produção de IgG total em camundongos. T0: Antes da primeira imunização, T1: após primeira imunização, T2: após segunda imunização, T3: após terceira imunização, T4: após eutanásia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[019] A presente tecnologia trata de uma proteína quimérica recombinante, definida pela SEQ ID N°1, composta por epítopos específicos para linfócitos B derivados de três proteínas de Ascaris suum. A proteína quimérica é capaz de induzir proteção contra ascaridiose. A presente tecnologia trata também de uma vacina compreendendo tal proteína e seus usos.

[020] A proteína quimérica compreende a sequência aminoacídica definida pela SEQ ID N°1.

[021] A vacina contra ascaridiose compreende a proteína quimérica definida acima, além de excipientes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, preferencialmente o adjuvante monofosforil lipídio A (MPLA).

[022] A vacina pode ser administrada pelas vias intradérmica, intramuscular, oral, nasal, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser implantado e/ou injetado.

[023] A proteína quimérica e a vacina podem ser utilizadas para na preparação de composições vacinais o tratamento e/ou prevenção de ascaridíase em humanos e animais de produção.

[024] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes da tecnologia.

EXEMPLO 1. CONSTRUÇÃO DA QUIMERA RECOMBINANTE

[025] Para a construção do gene quimérico, foram identificadas e selecionadas as regiões responsáveis por proteção humoral contra infecções helmínticas em três proteínas completas de A. suum com conhecida eficiência vacinal, gerando uma nova molécula única que combina as partes mais imunogênicas dessas três proteínas anteriormente descritas por Tsuji (TSUJI, N. et al. Intranasal Immunization with Recombinant Ascaris suum 14-Kilodalton Antigen Coupled with Cholera Toxin B Subunit Induces Protective Immunity to A. suum Infection in Mice. Infection and Immunity, v.69, n.12, p.7285-7292, 2001; TSUJI, N. et al. Recombinant Ascaris 16-Kilodalton protein-induced protection against Ascaris suum larval migration after intranasal vaccination in pigs. The Journal of Infectious diseases, v.190, n.10, p.1812-1820, 2004; TSUJI, N. et al. Cloning and characterisation of a highly immunoreactive 37 kDa antigen with multi-immunoglobulin domains from the swine roundworm Ascaris suum. International journal for parasitology, v.32, n.14, p.1739-1746, 2002). Para a seleção das regiões mais potencialmente imunogênicas de cada um dos três antígenos, foi utilizada a ferramenta ImmunoRank, desenvolvida por nosso laboratório, para a identificação de epítopos de células B, usando os parâmetros: Raw cutoff 0,5; weight 1; minimun lenght: 9, e para a identificação das regiões de desordem estrutural (estrutura secundária). As regiões nucleotídicas que codificam para os epítopos identificados foram combinadas em um novo gene quimérico único.

[026] Para facilitar o dobramento da proteína codificada por estas regiões nucleotídicas, foram adicionados os códons que codificam para glicina e serina entre as regiões que codificam os peptídeos selecionados. A Figura 1 representa a sequência nucleotídica do gene quimérico gerado, assim como a sequência proteica codificada por ele.

[027] Esse novo gene quimérico foi sintetizado e acoplado ao plasmídeo pUC57 pela empresa GenScript, sendo expresso de forma recombinante em bactérias Escherichia coli e a proteína com aproximadamente 20kDa foi purificada por cromatografia de afinidade.

EXEMPLO 2. AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA QUIMERA EM PROTEGER CAMUNDONGOS APÓS INFECÇÃO POR ASCARIS

[028] Após a purificação foi realizado o teste in vivo com a proteína quimérica. Para tanto, camundongos BALB/c fêmeas (n = 8/grupo) foram imunizados, via subcutânea, em três doses com intervalo de 10 dias, com a formulação vacinal (25μg de proteína quimérica e 25μg de MPLA) ou somente a proteína quimérica (25μg). Grupos controles adicionais foram imunizados apenas com adjuvante (25μg) ou PBS.

[029] Após infecção desafio (2500 ovos de A. sunn) e posterior eutanásia dos animais pode-se constatar que animais imunizados com a proteína quimérica e o adjuvante apresentaram uma redução de 73,54% de carga de larva no pulmão em relação aos animais do grupo imunizado apenas com PBS (Figura 2).

[030] Quanto à produção de IgG, a partir de análise estatística foi possível verificar maior produção desta no grupo imunizado com a proteína quimérica e o adjuvante, até a terceira imunização (Figura 3).

Claims (5)

1. PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE, caracterizada por compreender a sequência aminoacídica definida pela SEQ ID N°1.
2. VACINA CONTRA ASCARIDIOSE, caracterizada por compreenderem a proteína quimérica definida na reivindicação 1 excipientes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, preferencialmente o adjuvante monofosforil lipídio A (MPLA).
3. VACINA CONTRA ASCARIDIOSE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser administrada pelas vias intradérmica, intramuscular, oral, nasal, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser implantado e/ou injetado.
4. USO da proteína recombinante quimérica definida pela reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de composições vacinais para o tratamento e/ou prevenção de ascaridiose em humanos e animais de produção.
5. USO da vacina definida pelas reivindicações 2 e 3, caracterizado por ser na preparação de composições vacinais para o tratamento e/ou prevenção de ascaridiose em humanos e animais de produção.

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