BG99234A - Пречистени форми на дезоксирибонуклеаза - Google Patents

Пречистени форми на дезоксирибонуклеаза Download PDF

Info

Publication number
BG99234A
BG99234A BG99234A BG9923494A BG99234A BG 99234 A BG99234 A BG 99234A BG 99234 A BG99234 A BG 99234A BG 9923494 A BG9923494 A BG 9923494A BG 99234 A BG99234 A BG 99234A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
dnase
human dnase
deamidated
human
deaminated
Prior art date
Application number
BG99234A
Other languages
English (en)
Other versions
BG62335B1 (bg
Inventor
John Frenz
Steven Shire
Mary Sliwkowski
Original Assignee
Genentech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech, Inc. filed Critical Genentech, Inc.
Publication of BG99234A publication Critical patent/BG99234A/bg
Publication of BG62335B1 publication Critical patent/BG62335B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21001—Deoxyribonuclease I (3.1.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретението осигурява идентификация и охарактеризиране на два компонента на рекомбинантния продукт дезоксирибонуклеаза (DN-аза). Тези компоненти сапречистените дезаминирана и недезаминирана DN-ази. Целта е разделянето им и използването на недезаминираните видове като фармацевтични средства, по-специално в състави, които се поставят в пластмасови епруветки за прилагане на пациенти, страдащи от белодробни неразположения.

Description

Настоящето описание е свързано по своята същност с разкритото в Международна патентна заявка, публикувана под No. WO 90 / 07572. Съдържанието на тази по- ранна заявка е включено в приложената литературна справка
Област на изобретението
Настоящето изобретение е свързано с резултатите, получени при изследване на дезоксирибонуклеаза ( DN аза), фосфодиестеразата на която е способна да хидролизира полидезоксирибонуклеинова киселина То се отнася главно до разделянето на различни форми на дезоксирибонуклеазата, до тези форми per se, до фармацевтични състави, чрез които техните полезни свойства могат да бъдат използвани клинично, и до методи за приложение на тези дезоксирибонуклеази и техните състави.
Ниво на. изобретението
DN-азата е фосфодиестераза, способна да хибридизира полидезоксирибонуклеинова киселина. DN- азата е пречиствана от различни видове до различни степени. Пълната амино киселинна последователност за DN- аза от бозайници е постигната за първи път през 1973 г. Вж. Liao, et al.,
J. Biol. Chem. 248 :1489 (1973).
DN- азата притежава редица известни свойства и се използва за w терапевтични цели. Нейното принципно терапевтично приложение е да редуцира визкоеластичността на белодробни секреции в такива заболявания като пнеумония и цистични фибрози, като по този начин се постига прочистване на респираторния тракт. Вж. Lourenco, et al., Arch. Intm. Med.
142 : 2299 (1982); Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188 (9188); Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326:812 (1992).
Изолирана е и е съгласувана ДНК, кодираща човешка DN-аза I и тази ДНК е експресирана в рекомбинантни гостоприемникови клетки, като по този начин става възможно продуцирането на човешка DN-аза в необходимите за търговски цели количества. Виж Shak, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87:9188- 9192 (1990). Установено e , че рекомбинантната човешка DN- аза (rhDN-аза) е клинично приложима, по-специално вв пречистена форма, така че да е свободна от протеази и други протеини, с които обикновено се асоциира в природата. Виж Hubbard, et al., New Engl. J. Med. 326: 812 (1992).
Средствата и методите чрез които може да бъде получена човешката DN-аза във фармацевтично ефективна форма, са цитирани в патентното описание, посочено по-горе. Известни са и различни специфични методи за пречистване на DN-азата - виж Khouw, et al., U.S. Patent No 4 065 355 ( публикуван на 27 Декември 1977); Markey, FEBS Letters 167:155 (1984); Nefsky, et al., Eur. J. Biocliem. 179:215 (1989).
• · * · · « · ······· • · · · · · · •· ···· ······· · · ·
Макар това да не е било оценено към времето на заявяването на цитираното по-горе патентно описание, DN-азният продукт, получен от културите на рекомбинантните гостоприемникови клетки, обикновено е включвал смес от дезаминирани и недезаминирани форми на DN-ази. Съществуването на дезаминирани форми на DN-аза е останало недооценено независимо че феномена на дезаминиране на аспарагиновите и глутаминови остатъци в някои протеини е известно. Виж Eipper et al., Ann. Rev. Physiol. 50: 333 (1988); Kossiakoff, Science 240:191 (1988); Bradbury et al., Trends in Biochem. Sci. 16:112 (1991); and Wright, Protein Engineering 4: 283 (1991). Настоящето изобретение е предсказано от недооценения по- рано факт, че рекомбинантната DN-аза може да съществува като смес от дезаминирани и недезаминирани форми. С помощтта на методите на настоящето изобретение, е установено, че дезаминираната човешка DN-аза е по- малко ензимно активна от недезаминираната човешка DN-аза. Така, присъствието на дезаминирана и недезаминирана DN-аза заедно в смес, и възможността за по- нататъшно дезаминиране, както е установено че се случва при in vitro съхраняване на препаратите на човешка DN-аза, може да затруднят усилията за осъществяване на постоянна еднородност в DN-азния продукт, прилаган клинично. Поради това, тъй като съществуването и характеристиките на дезаминирана DN-аза не са били известни преди настоящето изобретение, методите за идентифициране на дезаминирана DN-аза и разделянето и от продуктите на DN-аза, в които може да бъде намерена, са се считали за незадължителни към бремето когато е създавано това изобретение.
• · • · • ·
Общо за изобретението
Настоящето изобретение е насочено към процесите за разделяне на дезаминирани и недезаминирани човешки DN-азни форми от техни смеси. Тези методи в предпочитаните варианти включват подлагане на сместа на хроматографиране с помощта на смола, и\и друга носеща среда, притежаваща свързани към нея катийонен полимер като хепарин или нехидролизуем дезоксирибонуклеиново киселинен (ДНК) аналог, или хроматография, използваща така наречената октоподна (клонеста) катийонообменна смола Настоящето изобретение също така е насочено към онези хроматографски методи с DN-ази от нечовешки произход, като говежда DN-аза.
Настоящето изобретение също е насочено към дезаминирана човешка DN-аза като пречистен продукт, по същество свободна от недезаминирана човешка DN-аза
Настоящето изобретение освен това е насочено към недезаминирана човешка DN-аза като пречистен продукт, по същество свободна от дезаминирана човешка DN-аза Тук е установено, че човешката DN-аза е напълно ензимно активна в сравнение с дезаминираната човешка DN-аза
Настоящето изобретение е насочено също така към фармацевтични състави, включващи както пречистена дезаминирана DN-аза или пречистена недезаминирана човешка DN-аза като активен компонент, незадължително заедно с фармацевтично подходящ ексципиент.
Настоящето изобретение също е насочено към метод, включващ въвеждането на терапевтично ефективно количество пречистена дезаминирана човешка DN-аза или пречистена недезаминирана човешка DNаза за лечение на болни, например такива имащи натрупване на вискозен, • ·
ДНК- съдържащ материал. Въвеждането на такгва DN-ази за предпочитане се осъществява чрез директна инхалация на сливиците.
Настоящето изобретение по-специално е насочено към метод за лечение на болни, притежаващи белодробни заболявалия като хронични бронхити, цистофибрози или емфизема, който включва въвеждането на терапевтично ефективно количество пречистена недезаминирана човешка DN-аза, за предпочитане директно в белодробния тракт.
Настоящето изобретение също така е насочено към фармацевтични w състави, включващи недезаминирана човешка DN-аза, поместени в пластмасови епруветки, незадължително в присъствието на фармацевтично подходящ ексципиент.
Кратко описание на чертежите фигура 1 показва амино киселината (SEQ.1D.NO. 1) и ДНК последователностите ( SEQ. ID. NO 2 ) на човешка DN -аза. Природната сигнална последователност е подчертана, вероятните иницииращи кодони са оградени, а зрялата последователност е поставена в скоби.
** фигура 2 показва съответствието между ензимната активност и разпростирането на дезаминирането на проби от човешка DN-аза. Специфичната активност е определена чрез нормализиране на DN-азната активност както е определена с метиленово зелена (MG) проба ( в концентрационни единици, съответстващи на стандартна крива) спрямо DN-азната концентрация, измерена чрез ензимно-свързана аминоадсорбционна проба (ЕИ8А).Г1роцента на дезаминиране се определя чрез картиране на триптона. Пробите, представляващи човешка DN-аза след еднодневно култивиране се пречистват от културата на рекомбинантни овариални клетки на Китайски хамстер (СНО), които • · · · · · · ······· • · · · · · · • · ···· ······· ·· · високо pH са от 13-тия ден, проби на пречистена DN-аза, които се инкубират in vitro за два дни при pH 8 при 37° С. Стабилните проби са пречистена DN-аза от 13-тия ден, съхранявани in vitro при 5 о , 25 о или 37о С за различен период от време.
фигура 3 е пример за триптично картиране на DN-аза, използвана за определяне размера на дезаминирането. Пробата, показана тук е 65% дезаминирана DN-аза. mAU показва мулти- абсорбционните единици при 214 пМ.
фигура 4 е схематично представяне на дезаминирането на аспарагинови остатъци при амино киселинна позиция 74 (Asn-74) в природна човешка DNаза. Дезаминирането превръща Asn-74 или в аспартатен (Asp) или в изоаспартатен (iso-Asp) остатък. Всяка от трите форми на DN-азата показва, при разграждане с трипсин, двойка пептиди, показателни за идентичността на специфична форма на DN-аза.
фигура 5 е хроматограма на проба от човешка DN-аза, фракционирана на октоподна (клонова) катийонообменна (ТСХ) колона. Показаната проба е 67% дезаминирана DN-аза.
фигура 6 показва триптични карти на двата пика фракции от ТСХ разделяния, показани на фигура 5. Липсата на триптичен nenmug Т6-7 от картата на Пик 2 показва отсъствие на дезаминирана DN-аза.
фигура 7 показва хроматограми на няколко човешки DN-азни проби, фракционирани върху ТСХ колона. Пробата, означена Ml-28 STD. е човешка DN-аза, получена от култура на овариални клетки на Китайски хамстер (СНО), трансформирани с ДНК, кодираща природна DN-аза 1. Пробата, означена като DN-азен мутант е DN-аза, притежаваща аспартазен остатък (вместо аспарагинов остатък) при амино киселинна позиция 74, и който по този начин притежава същата амино киселинна последователност • ·· · ··· · · · · ·· · · · ···· t · · · · · · е······ • · · · · · · ·· ···· ······· ·· · като Asp от дезаминираната DN-аза, показана на фигура 4. DN-азния Asp мутант е получен от клетъчна култура, трансформирана с ДНК, кодираща тази мутантна форма на човешка DN-аза. ДНК, кодираща DN-азен Asp Мутант се получава чрез сайт-насочена мутагенеза на ДНК, кодираща природна човешка ДНК-аза. Сравняването на хроматограмите показва, че една от формите на човешка DN-аза в Ml-28 STD се елуира от ТСХ колона при същата позиция както DN-азния Asp мутант.
фигура 8 показва хроматограми на няколко човешки DN-азни проби, фракционирани върху TSK- хепаринова колона (Toso Haas, Montgoveryville, Pensilvania). Пробата, обозначена като ’Ί2Κ #8 е получаване на човешка DNаза, получена от култура на овариални клетки на Китайски хамстер (СНО), трансформирани с ДНК, кодираща природна DN-аза 1. Пробата, обозначена като дезаминиран стандарт е пречистена дезаминирана човешка DN-аза Пробата, обозначена като недезаминиран стандарт се отнася до пречистена недезаминирана човешка DN-аза Пречистена дезаминирана човешка DN-аза и пречистена недезаминиран човешка DN-аза се получават чрез ТСХ хроматография.
*·* фигура 9 показва хроматограми на няколко различни DN-азни проби, фракционирани на имобилизирана ДНК аналожна колона. Пробата, обозначена като М1-28 представлява човешка АХ-аза, получена от клетъчна култура на овариалниклетки от Китайски хамстер (СНО), трансформирана с ДНК, кодираща природна човешка DN-аза I. Пробата, обозначена като дезаминиран стандарт е пречистена дезаминирана човешка DN-аза. Пробата, обозначена като недезаминиран стандарт се отнася до пречистена недезаминирана човешка DN-аза Пречистена дезаминирана човешка DN-аза и пречистена недезаминирана човешка DN-аза се получават чрез ТСХ хроматография. Пробата, обозначена като DN-азен • · · · ····· • · · · · · · ······· • · · · · · · ·· ···· ······· ·· ·
ASP мутант е DN-аза, притежаваща един аспартатен остатък (вместо аспарагинов остатък) при позиция на амино киселината 74.
Подробно описание на изобретението
А Дефиниции
Под термина човешка DN-аза се подразбира полипептид, притежаващ амино киселинната последователност на човешка зряла DN-аза I, показана на фигура 1, както и нейни амино киселинни варианти ( включително алелни варианти), които са ензимно активни при хидролизиране на ДНК. По този начин термина човешка DN-аза маркира широк обхват от материали, разкрити и получени съгласно настоящето патентно описание.
Терминът човешка DN-аза по необходимост обхваща природната зряла човешка DN-аза, притежаваща един аспарагинов остатък (Asn) при амино киселинна позиция 74 от полипептид а. Установено е, че този аспарагин е чувствителен на дезаминиране, което може да продуцира смес от дезаминирани и недезаминирани форми на човешка DN-аза. Вместо Asn остатъка при амино киселинна позиция 74, дезаминираната DN-аза притежава един аспартатен (Asp) или изо-аспататен (iso-Asp) остатък (виж фигура 4).
Терминът дезаминирана човешка DN-аза както е използван тук означава, човешка DN-аза, която е едзаминирана при аспарагиновия остатък, който се намира при позиция 74 в амино киселинната последователност на природната зряла човешка DN-аза. Установено е , че дезаминирана човешка DN-аза може да възникне по време на получаването на човешка DN-аза по рекомбинантен път и може да бъде намерена при получаване на човешка DNаза от рекомбинантни клетки. В допълнение, дезаминирана човешка DN-аза може да възникне при съхраняване in vitro на дезаминирана човешка DN-аза.
• - · · · · ···· • · · · · · · ······· • · · · · · · ·· ···· ··· ···· ·· ·
Макар че аспарагиновия остатък при амино киселинна позиция 7 в амино киселинната последователност на природната зряла човешка DN-аза също може да бъде дезаминиран, (в допълнение към аспарагиновия остатък при амино киселинна позиция 74), установено е , че такава двойно дезаминирана DN-аза може да бъде ензимно неактивна.
Терминът смес както е използван тук в литературната справка за препаратите на човешка DN-аза означава, че присъстват както дезаминирани, така и недезаминирана форми на човешка DN-аза. Установено е например, че при получаване на човешка DN-аза, получена при рекомбинантна експресия, повече от около 50% до 80% и дори повече от човешката DN-аза е дезаминирана.
Терминът пречистена дезаминирана човешка DN-аза както е използван тук означава дезаминирана човешка DN-аза, която е по същество чиста от недезаминирана човешка DN-аза. С други думи, недезаминирана човешка DN-аза ще включва по-малко от около 10%, за предпочитане помалко от около 5% и най-предпочитано - по-малко от около 1% тегл. от общото количество DN-аза в пречистен дезаминиран човешки DN-азен състав.
Терминът пречистена недезаминирана овешка DN-аза” както е употребен тук означава недезаминирана човешка DN-аза, която е по същество свободна от дезаминирана човешка DN-аза. С други думи, дезаминирана човешка DN-аза ще включва по- малко от около 25%, за предпочитане по-малко от около 5% и най-предпочитано по-малко от около 1% тегл. от общото количество DN-аза в пречистен недезаминиран човешки DN-азен състав.
Под терминът ексципиент тук се разбира фармацевтично подходящ материал, който се използва заедно с DN-аза за успешно осъществяване на • · · · · • · · · · • · · · · • · ·♦····· въвеждане на DN-азаша у пациент. По същество ексципиентите са добре познати на специалистите в областта и са описани, например, в Physicians Desk Reference, the Merck Index, and Remington's Pharmaceutical Sciences.
Предпочитана форма за човешка DN-аза е буфериран или небуфериран воден разтвор, и за предпочитане изотоничен солев разтвор като 150 тМ натриев хлорид, съдържащ 1.0 тМ калциев хлорид при pH 7. Тези разтвори са специално адаптирани за използване в подходящи за търговски цели разпрашители, включително джет разпрашители и ултразвукови разпрашители, приложими за въвеждане, например директно в дихателния тракт или сливиците на заболял пациент. За повече детайли относно формулирането и въвеждането на DN-аза при посочените по-горе начини за приложение върху пациенти е направена литературна справка.
С термина терапевтично ефективно количество се означават дозите от около 1 pg до около 100 Mg човешка DN-аза за килограм телесно тегло на пациента, включени във фармацевтичните състави, описани погоре. Терапевтично ефективното количество от човешка DN-аза ще зависи, например, при терапевтични цели, от начина на въвеждане и състоянието на пациента Съответно, би било необходимо за терапевтите да титруват дозата и да модифицират начина на въвеждане с оглед получаване на терапевтичен ефект.Съобразно различията в ензимната активност между дезаминираните и недезаминирани DN-ази, описани тук, може това количество от пречистената недезаминирана DN-аза, необходима за достигане на терапевтичен ефект да бъде по-малко от количеството на пречистената дезаминирана човешка DN-аза или смес от двете форми, необходими за постигане на същия ефект при същите условия.
Така пречистените DN-ази, специално недезаминираната форма, се използват за ензимно повлияване на вискоеластичността на мукозата.
• · · · · · ·
Такива пречистени човешки DN-ази са практически приложими за лечение на пациенти с белодробни заболявалия, които притежават абнормена лепкавост, пурулентни секрети и състояние като при акутно бронхиално заболяване, включително инфекциозна пневмония, бронхит или трахеобронхит, систична фиброза, астма, туберколоза и гъбни инфекции. За подобни лечения, в бронхите се въвежда по подходящ начин, например аерозолен, разтвор от напълно разделен сух препарат на пречистена дезаминираначовешка DN-аза или пречистена недезаминирана човешка DNаза.
В, Предпочитан Вариант на изпълнение
След успешно клониране и експресия на човешка DN-аза в рекомбинантни гостоприемникови клетки, след детайлно изследване е установено, че DN-азният продукт, получен от такава рекомбинантна експресия обикновено съществува като смес от все още недефинирани компоненти. По-специално, изоелектричният фокусен (IEF) анализ на човешка DN-аза, пречистена от рекомбинантна култура на овариални клетки на Китайски хамстер (СНО), показва комплекс от образци на DNазни видове. Различните DN-азни видове са определени като резултат от няколко пост- транслационни модификации на DN-аза, включително дезаминиране.
За определяне присъствието и размера на дезаминирането на DN-азата в подобни препарати са използвани два начина на изследване. Един метод включва триптично разграждане на стандартни препарати на DN-аза и анализ на получените в резултат пептиди чрез обратно фазова HPLC.
Другият метод включва хроматографиране на изходни препарати на DN-аза върху октоподна (клонова) катийонообменна (ТСХ) колона.
• · · ····· • · · · · · ·······
Установено е, че ТСХ колоната е спобна да разтвори дезаминираната човешка DN-аза и недезаминираната човешка DN-аза, така че всяка от формите DN-аза да може да бъде разделена ефективно и да се получи в чист вид. В този метод, количеството на дезаминираната и недезаминирана DNаза в изходните препарати е определена чрез измерване върху хроматоарами на пиковите области, съответстващи на разделените форми DN-аза.
Макар тези два метода да са почти еднакво ефективни при качественото и количествено определяне на дезаминираната DN-аза, ТСН методът е особено ефикасен, тъй като изисква значително по-малко време и усилия в сравнение с другия метод. Нещо повече, ТСН хроматографията осигурява средства за разделяне на дезаминираната от недезаминирана форми на DN-аза, където обикновените катийонообменни смоли и различни други изпробвани за дадената цел хроматографски смоли не са способни на такова разделяне.
Основните принципи на ТСН хроматографията са описани, например от Miller, J. Chromatography 510:133 (1990); Janzen et al., J. Chromatography 522: 77 (1990); and Hearn et al., J. Chromatography 548-177 (1991). Без да ограничаваме изобретението до който и да е специален механизъм или теория за опериране, счита се, чс Asn-74 остатъка в човешка DN-аза, която е чувствителна на дезаминиране, е локализирана в ДНК- свързващите бразди на ензима, по аналогия с добре известната кристална структура на говеждата DN-аза. ДНК- свързващите бразди съдържат основни амино киселинни остатъци (за да свържат ДНК) и тази бразда е очевидно достъпна за лигандите от октоподната катийонообменна смола, но не и за такива къси лиганди като тези на обикновените катийонообменни смоли. Вероятно лигандите на октоподната катийонообменна смола имитират природните субстрати от нуклеинови киселини. Поради това, очаква се че октоподната катийонообменна хроматография би била приложима за пречистване на други нуклеази, като например рибонуклеази (RN-ази) или рестрикционни ендонуклеази, така както и ДНК- свързващи протеини.
Обратно, разделянето на дезаминираната от недезаминирана форми DN-аза може да бъде осъществено чрез хроматографиране с помощта на смола или друга носеща матрица, съдържаща ковалентно свързани катийонови полимери, като хепарин или синтетичен нехидролизуем ДНК аналог. Имобилизирани хепаринови хроматографски колони са търговско достъпни (например, от Toso Haas Co., Montgomeryville, Pensilvania). Нехидролизуеми ДНК аналози са описани, например от Spitzer et al., Nuc. Acad. Res. 16: 11691 (1988). Имобилизирана нехидролизуема ДНК аналогова колона се изготвя по конвенционален начин чрез синтезиране на такъв ДНК аналог с амино киселинна група при 3'- края на едната или двете комплементарни вериги. След това амино групата е подходяща за куплиране върху епокси-активирана колона, както е описано например в литературата, публикувана от Rainin Biochemical LC Products ( Woburn, Massachusetts).
Благодарение на успешното разделяне на дезаминираните от w недезаминирани човешки DN-ази съгласно методите от настоящето изобретение се установи, че дезаминираната човешка DN-аза притежава отслабена ензимна активност в сравнение с недезаминираната човешка DNаза, както е определено с пробата с метиленово зелено (MG). Kumick, Arch. Biochem. 29:41 (1950). Установено е, че дезаминираната човешка DN-аза проявява точно една втора по-голяма ензимна активност от недезаминираната човешка DN-аза. Така, чрез комбиниране на пречистената дезаминирана DN-аза с пречистена недезаминирана DN-аза от настоящето изобретение в различни съотношения, е възможно да се приготвят фармацевтични състави от човешка DN-аза притежаваща която и да е от • ·
желаните специфични активности в интервала между специфичните активности на отделните компоненти, така че да бъдат оптимални за третиране на специфични неразположения.
С оглед илюстриране на изобретението са предложени следните примерни изпълнения, без обаче да го ограничават по който и да е начин.
С. Примери
1. Триптично картиране
Процедурата, използвана за триптично картиране на човешка DN-аза може да бъде обобщена по следния начин :
Етап 1. Довеждане концентрацията на 1 mg проба от DN-аза до 4 mg/ml чрез концентриране в Amicon Centricon-10 разделител или чрез разреждане с ексципиент. Краен обем : 250 μΐ.
Етап 2. Добавяне на 250 μΐ претретиращ буфер (40 пП BisTris, 10 тМ EGTA, pH 6.0) към пробата. Инкубира се 1 час при 37°.
Етап 3. Промяна на буфера в пробата в разграждащ буфер (100 мМ Tris, pH 8 ) с помощта на Pharmacia NAP-5 колона. Краен обем : 1 ml.
Етап 4. Добавяне на 10 μ! трипсинов разтвор ( 1 mg/ml трипсин, 1 тМ HCL) към пробата и инкубиране за два часа при 37°.
Етап 5. Добавяне на втора 10 μΐ-ова порция от трипсиновия разтвор към пробата и инкубиране за допълнителни 2 часа при 37°.
Етап 6. Спиране на разграждането чрез добавяне на 6 μΐ трифлуороцетна киселина (TFA). Съхраняване на пробите при или под 5° 0 до хроматографирането им.
Етап 7. Разделяне на пептидната смес чрез HPLC при следните условия:
• · · · ··· · · · « • · · · ··-<- * * * · · · л ··«·»«· • · · «ν ν « • · «··· ······· ·· «
Колона: Нуклеозил Cl8,5pm, 100 Λ, 2.0 χ 150 mm (Alltech, Co.,
Deerfield, Illinois).
Температура на колоната : 40°.
Елуент A: 0.12% TFA Във вода
Елуент В : 0.10% TFA в ацетонитрил
Градиентен профил :
Вр.шеХмш1)%А%В
0 100 0
5 100 0
65 40 60
69 5 95
70 5 95
Бавна скорост : 0.25 ml/min. Инжекционен обем на пробата: 250 μΐ.
Време за възстановяване на колоната при 100% А: 20 мин. Температура на дозатора : 5°.
Откриване: Абсорбция при 214 и 280 пт.
Етап 8 : Идентифициране на Т7 (D) Т7, Т7-8, Т6-7-8, и Т6-7 триптични пептиди чрез сравняване времето на съхранение спрямо стандарт.
Етап 9: Интегриране на хроматограма, получена при 280 пт. Проверка на качеството на интеграция чрез инспектиране на основата и отделянето на близко елуиращи пикове. Специално внимание следва да се обърне на рано елуиращите Т7 и (D)T7 пептиди, които могат да не бъдат добре разтворени.
Етап 10 : Нормализиране на пиковите области от шестте докладвани пептиди до тирозиново съдържание. Пептидите Т7, (D) Т7, '17-8 и (D)T7-8 всеки съдържа единичен Туг остатък, докато Т6-7-8 и Т6-7 съдържа три Туг остатъка. Калкулиране на съотношението на дезамидираните видове, • ·
основани на нормализираните пикови области от (D)T7, (D)T7-8, Т6-7-8 и Т67 релативно на общите нормализирани области от шестте пептида.
За правилно провеждане на триптичното картиране с оглед определяне дезаминизирана DN-аза съгласно описаната по-горе процедура, се изисква един милиграм DN-аза в обем от 250 μΐ. Следователно, приготвянето на началната проба за този метод изисква или концентриране или разреждане на пробата за получаване на този резултат. DN-аза в присъствието на Сг калций е силно устойчива на протеази, включително трипсин. Поради това, следващият етап в процедурата е да се отстранят частично калциевите йони чрез третиране с [етилен бис (оксиетиленнитрило)] тетраоцетна киселина (EGTA). Претретиране с EGTA може да денатурира и агрегира DNаза, поради това този етап следва да бъде осъществяван внимателно. Третираната с EGTA проба в обем от 0.5 ml след това се обменя в 1 ml от буфера за разграждане, добавя се трипсин и пробата се инкубира при 37° за два часа. След това се добавя втора порция трипсин и пробата се инкубира за допълнителни два часа. Разграждането се спира чрез подкиселяване и пробата или се съхранява за по-късни анализи или се натоварва на HPLC колона директно.
250 μΐ (250 mg) от пептидната смес, получена в резултат на триптичното разгражадане се разделя върху обратно фазова HPLC колона съгласно посочените по-горе условия. На фигура 3 е показана типична триптична карта на човешка DN-аза. HPLC се осъществява с модел HewlettPackard 1090М HPLC. Изтичането от колоната се наблюдава едновременно на 214 и 280 пт с диодният детектор, който е особеност на този инструмент. Докато ранната част от пептидната карта е кретечна за колитественото определяне на дезаминиранта DN-аза, както е описано подолу, други инструменти с по-голям градиент на забавяне и други екстра• · колонийни обеми не биха могли да бъдат пригодени за този анализ. Всеки анализ по тази процедура изисква 70 минути за градиентно разделяне и 20 минути за рееквилибриране на колоната за общо HPCL време от 90 минути. Рационалното и подхода при интегрирането на пиковете за определяне на дезаминирана DN-аза в проба са описани по-долу.
Дезаминиране на човешка DN-аза се среща поне при аспарагиновия остатък, който се намира при амино киселинна позиция 74 (Asn) в зрялата природна човешка DN-аза. Asn-74 е на С-крайната страна от триптичният сайт на разграждане при аргининовия остатък при амино киселинна позиция 73 (Arg-73), както се вижда в списъка на очакваните триптични пептиди от човешка DN-аза, показан на Таблица I.
Ш__Остатъци_____Амино киселинна последователност на пептида
Т1 1-2 LK
Т2 3-15 IAAFNIQTFGETK (SEQ. ID. NO. 3)
Ί3 16-31 MSNATLVSY1VQILSR (SEQ.ID. NO.4 )
Т4 32-41 YDIALVQEVR (SEQ. ID. NO. 5)
Т5 42-50 DSHLTAVGK (SEQ. ID. NO. 6.)
Т6 51 - 73 LLDNLNQDAPDTYHYWSEPLGR
(SEQ. ID. NO. 6)
Т7 74 - 77 NSYK (SEQ. ID. NO. 7)
ТЗ 78 - 79 ER
T9 80-111 YLFVYRPDQVSAVT)SYYYDDGCEPCGNDTFNR
( SEQ. ID. NO. 9)
ТЮ 112 -117 EPAIVR ( SEQ. ID. NO. 10)
ТИ 118-121 FFSR (SEQ. ID. NO. 11)
Т12 122 -126 FTEVR ( SEQ. ID. NO. 12 )
« · ·
Т13 127 -157 EFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEK (SEQ. ID. NO. 13)
Т14 158 -185 WGIJEDVMLMGDFNAGCSYVRINQWSSIR
(SEQ. ID. NO. 14)
Т15 186 - 213 LWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDR
(SEQ. ID. NO. 15)
Т16 214 - 222 IWAGMLLR (SEQ. ID. NO. 16)
Т17 223 - 260 GAWPDSALPFNFQAAYGLSD
QLAQAISDHYPVEVMLK (SEQ. ID. NO. 17)
Вместо Asn (еднобуквено обозначение Ν') остатъка при остатък 74 6 природата, недезаминирана човешка DN-аза, дезаминирана човешка DN-аза притежава или един Asp, il\u изо-Asp остатък, както е показано на фигура 4. Iso- Asp е изомерна, бета амино киселинна форма на аспарагиновата киселина. Пептида, свързан между Arg-73 и iso-Asp е резистентен на разграждане с трипсин, така че дезаминизираната човешка DN-аза достига характеристиката на триптичен пептид, съдържащ остатъци 51-77 и е наречен Т6-7, доколкото представлява съединение на пептидите Т6 и Т7. При условията, използвани за триптично картиране, Arg-73-Asn-74 свързан в недезаминираната човешка DN-аза и Arg-73-Asp-74 пептида, свързан в Asp форма на дезаминираната човешка DN-аза, се разграждат от трипсин. Следователно, недезаминираната DN-аза се индикира в триптичната карта с присъствието на Т7 пептида, показан на Таблица 1, докато Asp-74 формата от дезаминирата DN-аза се индикира на триптичната карта с присъствието на дезаминирания Т7 пептид, наречен (D)T7. Тези три пептида са маркирани на фигура. 3. За съжаление, трипсинът само частично разгражда • · • · • · · * * · · ·· · · · · ······· ·· · nenmuga, свързан npu C- края om T7, между остатъци 77 и 78, така че всеки от докладваните пептиди Т7, (D)T7 и Т6-7 притежава Т8- конюаат, Т7-8, (D)T7-8 и Т6-7-8, съответно. Поради това тези шест докладвани пептида следва да бъдат обяснени с оглед количествено определяне на дезаминираната човешка DN-аза чрез метода на триптичното картиране.
По принцип, (D)T7, (D)T7-8, Т6-7 и Т7-8 пептиди представят дезаминираната човешка DN-аза и Т7 и Т7-8 пептидите, представят недезаминираната човешка DN-аза и познаването на съответните съотношения от тези пептиди позволява директно изчисляване на размера на дезаминиране в препаратите от DN-аза. За изчисляване фракцията от пробата, която е дезаминирана DN-аза, се изисква познаването на моларните съотношения на дезаминираните и недезаминирани видове, но налице са два други различни проблема в процедурата на триптичното картиране, които селдва да бъдат избегнати : един свързан с хроматографирането и един - с откриването. Хроматографичният проблем е , че Т2 пептида се коелуира с Т6-7, и така препятства интегрирането на правилна пикова област от този индикиращ дезаминирането пептид. Този проблем може да бъде заобиколен чрез свързването в едно цяло на хроматограмата, получена при 280пт, докато всичките шест от релевантните пептиди притежават поне един тирозинов (Туг) остатък и така силно абсорбира при 280 пт, докато Т2 не съдържа Туг или триптофанов (Тгр) остатъци и по този начин абсорбира незначително при тази дължина на вълната. Проблема на откриване се състои в това, чеТ6-7 и Т6-7-8 пептиди всеки съдържа три Туг остатъка, докато другите четири пептида всеки съдържа само един. По този начин Т6съдържащите пептиди притежават по-висока способност за моларна абсорбция отколкото пептидите, съдържащи само Ί7 и простото сравняване на пиковите области води до преценка на съдържанието на ···* · · · ♦ ··· ·· · · ··«.«· • * · · · · · ···»*·· дезаминирани видове в пробата. Този проблем може да бъде преодолян чрез нормализиране на пиковите области от шестте пептида до броя на Туг остатъци в пептида. Нормализирането на пиковите области от шестте пептида по този начин предполага, че всички тирозинови остатъци във всеки от пептидите е в еквивалентна химична среда, което е вероятно добро предположение за релативно малки пептиди, както се счита тук. При нормализиране могат да бъдат сравнени коректните пикови области за *’ дезаминирани и недезаминирани пешпиди, така че да се прецени на съдържанието на дезаминирана DN-аза в пробата.
Октоаодна (клонова.) катийонообмснна-.хр.омап10фаф.ия Октоподните (клонови) катийонообменни смоли, за разлика от традиционните катийоообменни смоли, притежават полийонни връзки със силициева повърхност. Връзките от колона LiChrospher <S> 1000 SOj (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), използвани в този пример са рекламирани като съдържащи между 25 и 50 сулфопролилови групи по продължение на полиетиленовата структура, която е присъединена с единия край към *·*- силициевата повърхност.
ТСХ хроматограмата на проба от рекомбинантна човешка DN-аза, пропусната през LiChrosper ® 1000 SO3 колона е показана на фигура 5 Рекомбинантна човешка DN-аза е пречистена от овариални клетъчни култури на китайски хамстер (СНО), трансформирани с ДНК, кодираща човешка DN-аза. Shakq et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 9188- 9192 (1990); Shak, et al., International Patent Publication No. WO 90/ 07572 (публикувано 12. 07. 1990).
Получените два пика се събират и подлагат на няколко анализа за идентифицирането им като форми на DN-аза, различни само по остатъка при амино киселинна позиция 74. фигура 6 показва триптичи карти на двата
• · · · · · · пика, събрани om ТСХ колона, потвърждавайки по този начин, че те са съответно дезаминираната и недезаминирана форми на човешка DN-аза. Триптичната карта показва също, че двете форми на дезаминирана DN-аза (притежаващи Asp и iso-Asp при амино киселинна позиция 74), са представени в първия пик при ТСХ разделянето. Таблица II показва специфичните активности, измерени за двата пика, потвърждаващи взаимовръзката между дезаминирането и специфичната активност, произтичаща от корелацията, показана на фигура 2, и по- нататък потвърждаваща идентифицирането на ТСХ фракциите. Активността на DN-азната ракция е определена чрез пробата с метиленово зелено (MG).
ТАБЛИЦА II. Активности на фракциите, събрани .от ТСХ колона
MG и ELISA концентрации са средните от определянията в две проби
Проба
Изходен препарат от рекомбинантна човешка DN-аза (натоварване)
ТСХ Пик 1 (дезаминиран)
ТСХ Пик 2 (недезаминиран)
MG/itg/ml)_____ELISA____Специф, акт.
8315 7828 1.06
85.3 119.7 0. 71
149. 2 99.4 1. 50
Чрез сайт- насочена мутагенеза на ДНк, кодираща природна зряла човешка DN-аза, е получена мутантна форма на човешка DN-аза, притежаваща един Asp остатък при амино киселинна позиция 74 . Този мутант коелуира с първият пик, получен при хроматографирането, както е описано по-горе и показано на фигура 7.
• · · ·
• · • · · • ·
По- долу следва процедурата, използвана за напълване на LiChrospher® 1000 SO3 октоподна катийонообменна смола. Друга октоподна катийонообменна смола приложима по аналогичен начин за разделяне на дезаминирани от недезаминирани форми на човешка DN-аза е Fraktogel® октоподна катийонообменна смола (EM Separations, Gibbstown, New Jersey). LiChrospher u Fractogel са регистрирани търговски марки на EM Industries, Inc., Hawthorne, N. Y., или Merck, Darmstadt, West Germany. Силните форми от октоподните катийонообменни смоли ( независимо дали са LiChrosper или Fractogel), притежаващи SO 3 функционална група, понастоящем дават найдобри резултати.
3. Процедура повреждане наНРЬС колона за.1дОшзарег®. .1000. смола
а. Материали и съоръжения:
1. стъклен патрон 1. 0 см х 5. 0 см
2. напълващ буфер : 10 тМ натриев ацетат, 1 тМ СаС12, pH до
4. 5 с оцетна киселина, филтрува се през 0.2 μ филтър
3. напълване резервоара на колона с капацитет от 20 ml.
(Alltech part # 9501 или е еквивалентен)
4. празна 4. 6 тт х 50 тт стоманена колона с 0. 5 μ нарязани плодове
5. HPLC помпа, способна да поддържа обратно налягане от 2 000 psi ( Waters Model 510 или еквивалент).
в^Процедура.до зареждането
1. Определяне на смолата :
а) Разопакова се Superformans стъклена колона 1. 0 см х 5. 0 (обем = • ·
3. 93 ml смола). Смолата се ресуспендира до 20 mis в чист стъклен затворен съд с буфер за зареждане на колоната, превръща се в еднородна суспенсия и се разделя на 2 х 10 ml равни части Добавят се 10 mis от зареждащия колоната буфер към всяка част за получаване на суспенсия от приблизително 1. 95 mis смола в 20 mis зареждащ буфер.
в) Смолата се суспендира до получаване на еднородна суспенсия. Оставя се да отстои докато частиците формират твърдо легло на дъното на съда (2-4 часа). Внимателно се отлива супернатантата, съдържаща фини частици
с) Добавят се 20 mis зареждащ буфер и се повтаря етап в). Тази процедура следва да бъде повторена поне четири пъти за да се обезпечи отстраняването на фините частички от смолата.
2. Зареждане на колоната
а) Празна 4.6 х 50 тт празна HPLC колона се свързва със зареждащ резервояр. Смолата се суспендира в 20 mis от зареждащия буфер.
в) В резервоара се налива суспендираната смола и бързо се запушва. Зареждащият буфер се напомпва под налягане, което не достига 2000 psi.
V Поддържа се бавна скорост, така че налягането при зареждането да остане постоянно при около 2000 psi и се оставя за 15 мин след стабилизиране на налягането. Отстранява се колоната и се прикрепя горния край. Колоната може да се използва директно или да се съхранява в 0.02% натриев азид.
За повече проби, включително DN-аза, формулирана в 150 тМ NaQ, не се изисква приготвяне на предварителна проба преди инжектирането на пробата върху колоната. Колоната се еквилибрира с pH 4.5 ацетатен буфер, съдържащ калциеви йони, пробата се инжектира и след това колоната се елуира със солев градиешп. Използва се следната процедура за малко мащабни разделяния на дезаминирани от недезаминирани форми на човешка DN-аза.
• · · ·· ··· • · · · · · ······· • · · · · · ···· ······· ·· ·
Съотношенията на пиковите области в получената хроматограма са еднакви на съотношенията между дезаминираната и недезаминирана DN-ази в пробата.
Етап 1. Пробата, съдържаща до 150 тМ NaCl, с pH до 9 се зарежда в контеанера на автоматичния дозатор. Регулира се pH на събраната клетъчно културална течна проба до 4. 5 и се центрофугира за отстраняване на протеините, които са неразтворими в използваните в тази процедура буфери.
:<w·'
Етап 2. Двете форми на DN-аза се разделят с HPLC при следните условия:
Колона: ТСХ LiChrospher ® 1000 SO3 се зарежда в стоманена колона. Размерите на колоната са 4. 6 х 50 тт и 4. 6 х 150 тт.
Температура на колоната: стайна.
Елуент А 10 тМ натриев ацетат, 1 тМ СаС12, pH 4. 5.
Е\уент В: 1 М NaCl в буфер А
Профилен градиент:
Време %.А......
0 100 0
4 100 0
30 30 70
30.1 5 95
37 5 95
Бавна скорост: : 0. 8 mV min (50 тт колона), 0.5 ml/min ( 150 тт колона)
Обем на инжектираната проба: до 250 μ!
Пост- еквилибрационно време на отработената колона при 100 % А 20 min.
Температура на автоматичния дозатор : 5°
• · · · · • ·· • ·· • · ·· • · · · · · · • ·
Откриване: Абсорбция при 280 пт.
Етап 3. Съединяване на хроматограмите. Изчисляване на съотношенията на дезаминизираните видове на базата на пиковите зони от най-ранното елуиране на дезаминизираната DN-аза по отношение на цялата пикова зона от двете форми
Октоподната катийонообменна хроматография също така осигурява средство за разделяне в голям обем на дезаминираните от недезаминирани форми на човешка DN-аза. Разделянията 8 голям обем се провеждат обикновено при опростени условия за провеждане на елуирането отколкото са опсани по-горе за разделянията в малък обем на двете форми DN-аза В противовест на това, разделянията в голям обем се провеждат на укрепен с Fractogel октоподен катийонообменник съгласно следната pH - елуационна процедура:
Етап 1. Зарежда се 31. 6 колона (1. 6 см i. d. х 15. 7 см височина) с Fractogel EMD SO3 - 650М октоподна катийонообменна смола (ЕМ Separations, Gibbstown, New Jersey).
Етап 2. Диафилтрува се DN- аза, натоварена с еквилибрационен буфер (30 тМ натриев ацетат (NaAc), 1 тМ калциев хлорид (СаС1а), 50 тМ натриев хлорид (NaCl), pH 5). Концентрира се чрез ултрафилтрация до обем 355 nils и концентрация 2. 5 mg/ml.
Етап 3. Колоната се промива с 2% натриев хидрохлорид (NaOH) в количество, възлизащо на 2. 5 пъти от обема й (CV).
Етап 4. Колоната се промива с 2. 5 CV от пре- еквилибрационният буфер (300 тМ NaAc, 1 М NaCL, pH 5 ).
Етап 5. Колоната се промива с 2. 5 CV еквилибрационен буфер.
• · • · ·· • · · · · · · •· • ··
V
Етап 6. Колоната се натоварва с 1-1л 3 g диафилтрирана/ ултрафилтрирана DN-аза (от Етап 2). Започва събирането на фракциите от колонийния елуент от началото натоварването на DN-азата.
Етап 7. Промиване на колоната с 5 CV от еквилибрационния буфер.
Етап 8. Промиване на колоната с 5 CV от промиващия буфер с pH 5. 3 (25 тМ сукцинат, 1 тМ СаС12, pH 5. 4).
Етап 9. Промиване на колоната с 10 CV от промиващия буфер с pH 5. 4 (25 тМ сукцинат, 1 тМ CaQ 2, pH 5. 4).
Етап 10. Промиване на колоната с 10 CV от промиващия буфер с pH 6 (25 тМ MES, 1 тМ СаС12, pH 6.0).
Етап 11. Комбинират се фракциите, събрани по време на Етапите 6- 8 за получаване на общ обем, състоящ се предимно от дезаминирана DN-аза. Образуваните по време на Етап 10 фракции се събират за получаване на общ обем от недезаминирана DN- аза. фракциите, събрани по време на Етап 9 съдържат смес от двете форми DN-аза и могат да бъдат рециклирани.
Описаният по- горе протокол е един пример за използването на октоподната катийонообменна смола за препаративно пречистване на двете форми на рекомбинантна човешка DN-аза по начин, който дава възможност за възстановяване на голям обем пречистена дезаминирана и пречистена недезаминирана DN-аза.
хромашография
На фигура 8 са построени хроматограми от анализите върху TSKхепаринова колона (Ί oso Haas, Montgomeryville, Pennsilvania) на проби, съдържащи както смес от дезаминирани, така и от недезаминирани форми
на човешка DN-аза, пречистена дезаминирана човешка DN-аза или пречистена недезаминирана човешка DN-аза. TSK-хепариновата колона се пуска при същите условия, както са описани по- горе за аналитичната ГСХ колона. Постороените хроматограми показват, че колоната на имобилизиран хепарин разтваря дезаминирани и недезаминирани форми на DN-аза.
Както е описано по- горе, друг начин за разделяне на дезаминирани от недезаминирани форми на DN-аза е използването на колона, съдържаща имобилизиран аналог на ДНК, който е устойчив на хидролиза с DN-аза. Примерът за такъв подход включва синтезата на фосфоротиоат олигонуклеотид 5'-GCGC(K:GCGCGCGCGCGCGCGC-NH3 -3’. Тази комплементарна сама на себе си последователност може да бъде ренатурирана в двойно-верижна форам и да се куплира в Rainin Hydropore-EP колона (Rainin Co., Woburn, Massachusetts), фигура 9 показав ренатурационни хроматограми от анализите на проби, съдържащи смес от дезаминирани и от недезаминирани форми на човешка DN-аза, пречистена дезаминирана човешка DN-аза, пречистена недезаминирана човешка DN-аза или пречистена мутантна човешка DN-аза, притежаваща аспартатен остатък (вместо един аспарагинов остатък) при амино киселинна позиция 74. Колоната се пуска за тези анализи в буфер, съдържащ 1 тМ калциев хлорид, 5 тМ MES при pH 6 и се елуира с линеарсн градиент при концентрация на сол до 1 М натриев хлорид над 20 мин при бавна скорост от 1 ml/min. Както е показано на фигура 9, при тези условия дезаминираните и недезаминирани форми на DNаза са частично разделени една от друга. В допълнение, двете изомерни форми на дезаминирана DN-аза, които се различават по аминокиселинна позиция 74 от DN-азната последователност по една аспартатна или изоаспартатна киселина в тази позиция, също се разтварят на тази колона.
Така се получава едно допълнително преимущество от този хроматографски метод, а именно че позволява изолирането на двете изомерни форми, получени при дезаминирането на човешка DN-аза.
5. Ензцмна^ипцвносш надааминираиа човешка DN-аза и недезаминирана човешка DN-аза
За изпитване ефекта на дезаминиране върху ензимната активност на човешка DN-аза са използвани няколко аналитични метода. Пречистена дезаминирана човешка Dn-аза и пречистена недезаминирана човешка DN-аза за използване в тези изследвания се изготвят посредством ТСХ хроматография, както е описано по-горе.
В един метод за определяне на DN-азна ензимна активност, синтетична двойно верижна ДНК, с 25 двойки бази в дължина, се бележи с динитрофенол (DNP) в единия край и с биотин в другия край. Хидролиза на субстрата от DN-аза се установява чрез улавяне на реакционните продукти върху микротитърни пластинки, покрити с антитяло go DNP и чрез количествено определяне на интактната проба със стрептавидин пероксидаза. Специфичната активност на стабилните проби се свързва (г2 = 0.613; п=5) с увеличената DN-азно дезаминиране ( в обхват 27%- 93%). Екстраполираното на най- малкото квадратно линейно отклонение дава възможност да се прецени, че специфичната активност на дезаминираната човешка DN-аза е приблизително 77% по-ниска от тази на недезаминираната човешка DN-аза.
Друг метод за определяне на DN-азната ензимна активност включва хидролизата на хромогенния субстрат р-нитрофенил фенилфосфонат (PNPP) както е описано от Liao, et al., Biochem. J. 255: 781-787 (1988). Кинетиката на PNPP хидролизата чрез човешка DN-аза е сигмоидална и пасва с уравнението • · · ····· • · · · · · ······· на Hill за нелинеарна регресия. По този метод на напълно дезаминираната човешка DN-аза се определя като възлизаща на 77% по-ниска от тази на недезаминираната човешка DN-аза. Субстратната концентрация за една втора от максималната активност (So5) не се отличава значимо за дезаминираните и недезаминирани проби от човешка DN-аза.
Друг метод за определяне на DN-азна ензимна активност е изпитването, описано от Kunitz, J. Gen. Physiol. 33: 349 (1950), за
War предпочитане модифициран така, че ензимната реакция се провежда при около pH 7. 0 - 7. 5. По този метод също е определено, че ензимната активност на дезаминираната човешка DN-аза е по- ниска от тази на недезаминираната човешка DN-аза.
6. Съхраняване in vitro на човешка DN-аза
Човешка DN-аза, пречистена от рекомбинантни СНО клетки се разтваря при концентрация 4 mg/ml в небуфериран воден разтвор на 150 тМ NaCl и 1 тМ СаС12. Пробите от полученият в резултат DN-азен разтвор f*“·
V след това се поставят в стъклени и пластмасови епруветки. Използват се два различни типа пластмасови епруветки, едните направени от пластмаса на Dupont 20 (произведена от Е. I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware USA), а другите - от плас.маса на Escorene ( произведена от Exxon Corp.) . Двата вида пластмаси са от полиетилен с ниска плътност, но могат да бъдат използвани и контейнери, направени от друга пластмаса, като например полипропилен, полистирен или други полиолефини. Епруветките, съдържащи DN-азния разтвор се съхраняват както при -70° С, 2- 8° С, така и при 25°С. Отначало се дезамшшра около 60%- 65% от DN-азата в разтвора.
• · · · · * · ······· • · · · · · · • · · · · · ······· ·· ·
DN-азншпе разтоори в епруветките се изпитват през различни интервали от време след първоначалното съхранение за определяне размера на дезаминиранета на DN-азата. Резултатите от тези изпитвания са показани на Таблица Ш.
ТАБЛИЦА III. % Дезаминиране на рекомбинантна човешка DN-аза.
съхранявана, в стъкления пластмасови епруветки.
Проба Ден -70°С 2- 8°С 25°С
Стъкло 83 66 66 78
174 63 66 81
Dupont 20 83 65 66 71
174 63 63 70
Escorene 83 65 66 71
174 64 62 70
След съхраняване в продължение на 83 и 174 дни при -70°С или 2- 8°С, не са установени различия в количествата на дезаминирана DN-аза в пластмасови епруветки и в стъклени епруветки. Във всеки такъв случай, приблизително 64% (+/- 2%) от DN-азата в епруветките е дезаминирана DN-аза.
Неочаквано, обаче, след 83 или 174 дни съхранение при 25°С се установява разлика в количеството на дезаминираната DN-аза в пластмасовите епруветки и количеството на дезаминирана DN-аза в стъклени епруветки. Значително по- малко дезаминирана DN-аза присъства в пластмасовите епруветки. По- специално, след 83 дни съхраняване при 25°С, 78% от DN-азата в стъклени епруветки е дезаминирана DN-аза, докато само около 70% от DN-азата в пластмасови епруветки е дезаминирана DNаза. След 174 дни съхраняване при 25°С, 81% от DN-азата в стъклени с » • · ’’ht*
епруветки е дезаминирана DN-аза, докато само около 71% от DN-азата в пластмасови епруветки е дезаминирана DN-аза.
Без да се ограничава изобретението до каквъвто и да е механизъм или теория, възможно е разликите 0 дезаминирането на DN-азата в пластмасови и стъклени епруветки да е следствие от различието в pH на разтворите в епруветките (приблизително pH 6.7 и приблизително 6. 5, съответно). pH на DN-азния разтвор в стъклените епруветки продължава да се повишава слабо (до приблизително pH 6. 9 след 83 дни съхранение на 25° С и приблизително pH 7. 0 след 174 дни съхранение на 25°С), вероятно като следствие от силикатите или йоните от стъклената повърхност, преминаващи в разтвора. При по- високо pH ,скоростта на дезаминиране на човешка DN-аза се повишава Доколкото не е било ясно, че дезаминирането на човешка DN-аза се осъществява при повишаване на pH, варианта на изпълнение на настоящето изобретение представя формулирането и/или съхраняването на човешка DN-аза в разтвори, притежаващи кисело pH, поспециално при pH 4. 5 - 6. 8 и за предпочитане при около 5. 0 - 6. 8.
Така, значително подобряване на стабилността на човешка DN-аза в разтвор е получено чрез поставяне на такъв DN-азен разтвор в пластмасови епруветки вместо В стъклени епруветки, с очевидно по- малко дезаминиране на DN-аза, появяваща се свръхсрочно в пластмасовите епруветки вместо в стъклените. Този факт може да бъде специално релевантен при избора на начина на опаковане на човешка DN-аза за терапевтични цели, когато специално е необходимо човешката DN-аза да може да бъде съхранявана за продължителен период от време без да губи своята ензимна активност. Разбира се, стъклени епруветки с покритие, различно от стъклено, например пластмасови облицовки, биха били еднакво полезни. Това, което е важно е да • · · · ····· * · · · · · · *······ • · · · · · · се избегне съхраняването на DN-азата в съприкосновение със стъкло, поспециално при съхраняване за повече от 15- 30 дни.
Общи бележки
Изложеното по- горе описание представя специфичните методи, които могат да бъдат използвани, за да се приложи в практиката настоящето изобретение. Разполагайки с детайлите на специфичните методи за идентифициране, охарактеризиране, разделяне и приложение на чистата човешка дезаминирана и недезаминирана DN-аза, специалиста в областта ще знае достатъчно, за да създаде алтернативни надеждни методи за получаване, използвайки същата информация от настоящето изобретение. Така, макар детайлите да произтичат от горния текст, той не следва да се възприема като ограничаващ; нещо повече -обхвата на настоящето изобретение се определя само от позволените от закона граници на приложените патентни претенции.
ЛИСТИНГ НА СЕКВЕНЦИИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:
(ί) Заявител : Genentech, Inc.
(ii) Наименование на изобретението :
Пречистени форми на DN-аза (iii) Номер на секвенциите : 17 (iv) Адрес за кореспонденция :
(A) Адресат : Genentech, Inc.
(B) Улица : 460 Point San Bruno Blvd (C) Град : South San Francisco (D) Щат : California (E) ДържаВа: USA (F) ZIP: 94080 (v) Компютърно читаема форма:
(A) Среден тип : 5. 25 инча, 360 kb флопи диск (B) Компютър : IBM PC compatible (C) Оперираща сестема : PC- DOS/ MS - DOS (D) Софтуер : patin ( Genentech) (vi) Данни no заявяването :
(A) Номер на заявката:
(B) Дата на заявяване :
(C) Класификация (vii) Ранни данни на заявяване :
(A) Номер на заявяване (B) Дата на заявяване (viii) Информация за патентния представител :
(A) Име : Johnston, Sean A (B) Номер в регистъра: 35, 910 (C) Номер на документа / Референс номер: 747 (ix) Информация за телекомуникация :
(A) Телефон : 415 / 225 - 3562 (B) Телефакс : 415/ 952 - 9881 (C) Телекс : 910 / 371 - 7168
2. Информация за SEQ. ID. NO: 1:
(I) Секвенционна характеристика :
(A) Дължина : 346 амино киселини (B) Тип амино киселина (D) Топология: линеарна ίλή
I*·
Описание на
Ser 1 Μ (i Η) \ϊ) ’ · Ser Ala Leu Lys Cys Phe Phe Arg Asp Leu Ser
Cys Thr Gly
5 10 15
Ser Xaa Thr Thr Phe Phe Ser Leu Ser Ser Lys Arg Arg Lys Leu
20 25 30
Ser Ser Lys Asp He Pro Asp Ser Xaa Gin His Ser Arg His Leu
35 40 45
Xaa Gly His His His His Leu Arg Met Arg Gly Met Lys Leu Leu
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Gin Gly Ala Vai Ser
65 70 « 75
Leu Lys He Ala Ala Phe Asn He Gin Thr Phe Gly Glu Thr Lys
80 85 90
Met Ser Asn Ala Thr Leu Vai Ser Tyr He Vai Gin He Leu Ser
95 100 105
Arg Tyr Asp lie Ala Leu Vai Gin Glu Vai Arg Asp Ser His Leu
110 115 120
Thr Ala Vai Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gin Asp Ala Pro
125 130 135
Asp Thr Tyr His Tyr Vai Vai Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser
140 145 150
Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Vai Tyr Arg Pro Asp Gin Vai Ser
155 160 165
Ala Vai Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly
170 175 180
Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala He Vai Arg Phe Phe Ser
185 190 195
Arg Phe Thr Glu Vai Arg Glu Phe Ala He Vai Pro Leu His Ala
200 205 210
Ala Pro Gly Asp Ala Vai Ala Glu He Asp Ala Leu Tyr Asp Vai
215 220 225
Tyr Leu Asp Vai Gin Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Vai Met Leu
230 235 240
Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Vai Arg Pro Ser Gin
245 250 255
Trp Ser Ser He Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gin Trp Leu
260 265 270
lie Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala
275 280 285
Tyr Asp Arg He Vai Vai Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Vai
290 295 300
Vai Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gin Ala Ala Tyr Gly
305 310 315
Leu Ser Asp Gin Leu Ala Gin Ala He Ser Asp His Tyr Pro Vai
320 325 330
Glu 1 Vai Met Leu . Lys Xaa . Ala Ala . Pre i Pro • His Thr Ser Xaa . Thr
335 340 345
Ala
346 • · • · (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА Si.-.O Н.) NO : 2.- ..
• · · · • · · (i* '.'екосниис-нг:^. ларакп.1еристи£з.· .:*.
[А/Дължин- - И Го /ви (В) Tun : hvAhuhuK;· кнсслшп (i'N Bug на ^сриггнпа : единична.
Я Н 4 опо.ло<‘н.н ; линсарня
Мч* Ми .сагшс на. m след оВ amt :лноспш1а : SlQ и.) ,М ).М
TCCTGCACAG GCAGTGCCTT GAAGTGCTTC TTCAGAGACC ТТТСТТСАТА 50
GACTACTTTT ТТТТСТТТАА GCAGCAAAAG GAGAAAATTG TCATCAAAGG 100
ATATTCCAGA TTCTTGACAG CATTCTCGTC ATCTCTGAGG АСАТСАССАТ 150
CATCTCAGGA TGAGGGGCAT GAAGCTGCTG GGGGCGCTGC TGGCACTGGC 200
GGCCCTACTG CAGGGGGCCG TGTCCCTGAA GATCGCAGCC ТТСААСАТСС 250
AGACATTTGG GGAGACCAAG ATGTCCAATG CCACCCTCGT CAGCTACATT 300
GTGCAGATCC TGAGCCGCTA TGACATCGCC CTGGTCCAGG AGGTCAGAGA 350
CAGCCACCTG ACTGCCGTGG GGAAGCTGCT GGACAACCTC AATCAGGATG 400
CACCAGACAC СТАТСАСТАС GTGGTCAGTG AGCCACTGGG ACGGAACAGC 450
TATAAGGAGC GCTACCTGTT CGTGTACAGG CCTGACCAGG TGTCTGCGGT 500
GGACAGCTAC TACTACGATG ATGGCTGCGA GCCCTGCGGG AACGACACCT 550
TCAACCGAGA GCCAGCCATT GTCAGGTTCT TCTCCCGGTT CACAGAGGTC 600
AGGGAGTTTG CCATTGTTCC CCTGCATGCG GCCCCGGGGG ACGCAGTAGC 650
CGAGATCGAC GCTCTCTATG ACGTCTACCT GGATGTCCAA GAGAAATGGG 700
GCTTGGAGGA CGTCATGTTG ATGGGCGACT TCAATGCGGG CTGCAGCTAT 750
GTGAGACCCT CCCAGTGGTC ATCCATCCGC CTGTGGACAA GCCCCACCTT 800
CCAGTGGCTG ATCCCCGACA GCGCTGACAC CACAGCTACA CCCACGCACT 850
GTGCCTATGA CAGGATCGTG GTTGCAGGGA TGCTGCTCCG AGGCGCCGTT 900
GTTCCCGACT CGGCTCTTCC СТТТААСТТС CAGGCTGCCT ATGGCCTGAG 950
TGACCAACTG GCCCAAGCCA TCAGTGACCA CTATCCAGTG GAGGTGATGC 1000
TGAAGTGAGC AGCCCCTCCC CACACCAGTT GAACTGCAG 1039 • · · · · · · · · · · ·· · · ····· • · * · · · · ······· • · · · · · · ·· ···· ··· ···· ·· · (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 13 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 3: lie Ala Ala Phe Asn lie Gin Thr Phe Gly Glu Glu Thr Lys 15 10 13 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 16 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 4:
Met Ser Asn Ala Thr Leu Vai Ser Tyr lie Vai Gin He Leu Ser Arg
10 15 16 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 5 :
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина : 10 амино киселини (B) Тип : амино киселина (C) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността :
Tyr Asp He Ala Leu Vai Gin Glu Vai Arg
5 10 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 6:
(i) Секвенционна характеристика :
(А) Дължина: 9 амино киселини • · • · · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · (B) Tun : амино киселина (C) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността:
Asp Ser His Leu Thr Ala Vai Gly Lys
5 9 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 7 :
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 23 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология; линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 7:
Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gin Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Vai Vai Ser Glu
10 15
Pro Leu Gly Arg
23 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 8:
(i) Секвенционна характеристика :
(A) Дължина: 4 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността : SEQ ID NO: 8:
Asn Ser Tyr Lys
4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 9:
(i) Секвенционна характеристика :
(A) Дължина: 32 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 9:
Tyr Leu Phe Vai Tyr Arg Pro Asp Gin Vai Ser Ala Vai Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp
10 15 20
Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg
30 32 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 10:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 6 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO : 10:
Glu Pro Ala He Vai Arg
5 6 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 11:
(i) Секвенционна характеристика:
( А) Дължина: 4 амино киселини (В) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността:
Phe Phe Ser Arg
4 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 12:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 5 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна • · · · · · · (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 12:
Phe Thr Glu Vai Arg
5
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 13:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 31 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 13:
Glu Phe Ala lie Vai Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp .Ala Vai Ala Glu lie Asp
Ala Leu Tyr Asp Vai Tyr Leu Asp Vai Gin Glu Lys
25 30 31 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 14:
(i) Секвенционна характеристика:
(А) Дължина: 28 амино киселини (В) Тип : амино киселина
(D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността : SEQ ID NO : 14:
Trp Gly Leu Glu Asp Vai Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Vai
5 10
Arg Pro Ser Gin Trp Ser Ser He Arg
25 28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 15:
(i) Секвенционна характеристика :
(A) Дължина : 28 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO : 15 :
Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gin Trp Leu lie Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr
15
Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg
28 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 16:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 9 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 16:
He Vai Vai Ala Gly Met Leu Leu Arg
5 9 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 17:
(i) Секвенционна характеристика:
(A) Дължина: 38 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линеарна (») Описание на последователността : SEQ ID NO: 17:
Gly Ala Vai Vai Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asp Phe Gin Aa Aa Tyr Gly Leu Ser
5 10 15 20
Asp Gin Leu Aa Gin Aa He Ser Asp His Tyr Pro Vai Glu Vai Met Leu Lys • · · · ····· • · · · · · · ······· • · · · · · · ·· ···· ··· ···· ·· ·

Claims (22)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Метод, Включващ разделяне на дезаминирана от недезаминирана човешка DN-аза от тяхна смес.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, в който се използва октоподна катийонообменна смола.
  3. 3. Метод съгласно претенция 1, в който се използва имобилизирана '** хепаринова смола.
  4. 4. Метод съгласнопретенция 1, в който се използва имобилизирана нехидролизуема ДНК аналогова смола.
  5. 5. Пречистена дезаминирана човешка DN-аза.
  6. 6. фармацевтичен състав, включващ дезаминирана човешка DN-аза и незадължително фармацевтично приемлив ексципиент.
  7. 7. фармацевтичен състав, състоящ се от дезаминирана човешка DNаза като активен елемент и незадължително фармацевтично приемлив ексципиент.
  8. 8. фармацевтичен състав съгласно претенция 6 или 7, където ексципиента е стерилна вода.
  9. 9. фармацевтичен състав съгласно претенция 6 или 7, където ексципиента е стерилен небуфериран воден разтвор с pH от около 4. 5 до 6. 8.
  10. 10. фармацевтичен състав съгласно претенция 6 или 7, където посоченият състав е в аерозолна форма.
  11. 11. фармацевтичен състав съгласно претенция 8 или 9, поставен в контакт с контейнер, произведен от вещество, различно от стъкло.
  12. 12. фармацевтичен състав, включващ дезаминирана човешка DN-аза в пластмасови епруветки.
    • · · · ····· • · · · · · · ······· • · - · ·· ·· ·· ···· ··· ···· ·· · (
  13. 13. фармацевтичен състав съгласно претенция 6 или 12, който по същество е свободен от човешки протеини, различни от човешка DN-аза.
  14. 14. Метод за съхраняване на човешка DN-аза, включваща изготвянето на състав, съдържащ недезаминирана човешка DN-аза във воден разтвор с pH от около 4. 5 до 6. 8 и съхраняване на състава за повече от около три седмици.
  15. 15. Метод за лечение на болни с акумулиран пурулентен материал, включващ въвеждане на състав, съдържащ дезаминирана човешка DN-аза у болния в терапевтично ефективно количество, достатъчно да редуцира вискоеластичността на материала.
  16. 16. Метод съгласно претенция 15, където този състав е по същество свободен от протеази.
  17. 17. Метод за лечение на пациенти с белодробни заболявалия, включващ въвеждане у пациентите на терапевтично ефективно количество от състава, съдържащ дезаминирана човешка DN-аза.
  18. 18. Метод съгласно претенция 17, където белодробното заболяване е цистофиброза.
  19. 19. Метод съгласно претенция 17, където белодробното заболяване е бронхит.
  20. 20. Метод съгласно претенция 17, където белодробното заболяване е бронхиектазис.
  21. 21. Метод съгласно претенция 17, където белодробното заболяване е пнеумониа.
  22. 22. Метод съгласно претенция 17, където белодробното заболяване е туберколоза.
BG99234A 1992-06-08 1994-12-02 Пречистени форми на дезоксирибонуклеаза BG62335B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/895,300 US5279823A (en) 1992-06-08 1992-06-08 Purified forms of DNASE
PCT/US1993/005136 WO1993025670A1 (en) 1992-06-08 1993-05-28 Purified forms of dnase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG99234A true BG99234A (bg) 1995-07-28
BG62335B1 BG62335B1 (bg) 1999-08-31

Family

ID=25404292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG99234A BG62335B1 (bg) 1992-06-08 1994-12-02 Пречистени форми на дезоксирибонуклеаза

Country Status (30)

Country Link
US (4) US5279823A (bg)
EP (2) EP1013284B1 (bg)
JP (1) JP3383307B2 (bg)
KR (2) KR100302092B1 (bg)
AT (2) ATE455557T1 (bg)
AU (1) AU682822B2 (bg)
BG (1) BG62335B1 (bg)
BR (1) BR9306670A (bg)
CA (1) CA2137237C (bg)
CZ (1) CZ293105B6 (bg)
DE (3) DE4392749T1 (bg)
DK (1) DK0644932T3 (bg)
ES (1) ES2150447T3 (bg)
FI (1) FI945549A0 (bg)
GB (1) GB2282140B (bg)
GE (1) GEP20002300B (bg)
GR (1) GR3034718T3 (bg)
HU (1) HU219549B (bg)
IL (1) IL105724A (bg)
MD (1) MD960288A (bg)
NO (1) NO318644B1 (bg)
NZ (1) NZ253559A (bg)
PL (1) PL175873B1 (bg)
PT (1) PT644932E (bg)
RO (1) RO117188B1 (bg)
RU (1) RU2238320C2 (bg)
SK (1) SK282957B6 (bg)
TJ (1) TJ396B (bg)
UA (1) UA46693C2 (bg)
WO (1) WO1993025670A1 (bg)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929551T2 (de) * 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE
DE69533128T2 (de) * 1994-03-04 2005-06-09 Genentech, Inc., South San Francisco Pharmazeutische akzeptabel dnase zusammensetzung
DE69535787D1 (de) * 1994-03-04 2008-08-28 Genentech Inc Verbesserte dnase flüssige lösungen
US5830744A (en) * 1995-06-06 1998-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
WO1995030428A1 (en) * 1994-05-05 1995-11-16 Human Genome Sciences, Inc. Human dnase
US6251648B1 (en) 1998-04-03 2001-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US5602110A (en) * 1994-08-31 1997-02-11 Case Western Reserve University Method and composition for treating cystic fibrosis
EP0754751B1 (en) * 1994-09-06 2001-09-19 Seiichi Tanuma Novel deoxyribonuclease
US5863563A (en) * 1994-10-20 1999-01-26 Alphagene Inc. Treatment of pulmonary conditions associated with insufficient secretion of surfactant
SK284191B6 (sk) 1995-02-24 2004-10-05 Genentech, Inc. Aktín-rezistentný variant humánnej DNázy I
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
JP4118334B2 (ja) * 1996-02-05 2008-07-16 ジェネンテック・インコーポレーテッド ヒトｄｎアーゼ
US6482626B2 (en) * 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6391607B1 (en) * 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
US6489447B1 (en) † 1998-05-06 2002-12-03 Genentech, Inc. Protein purification
AU3500901A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Medic Aid Ltd Drug delivery apparatus
US8820316B2 (en) * 2000-02-11 2014-09-02 Respironics Respiratory Drug Delivery (Uk) Ltd Drug delivery apparatus
DE60135983D1 (de) * 2000-05-31 2008-11-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur reinigung von alphaviralen replikon partikeln
MD20010375A (ro) * 2001-11-19 2003-06-30 АНДРИЕВСКИ Сергей Malaxor
MD2260C2 (ro) * 2001-11-22 2004-03-31 АНДРИЕВСКИ Сергей Malaxor
LT1543038T (lt) 2002-09-11 2017-07-10 Genentech, Inc. Baltymo gryninimas
US7067298B2 (en) * 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7595179B2 (en) 2004-04-19 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Recombinant reverse transcriptases
US20080160577A1 (en) * 2005-02-04 2008-07-03 Glaxo Group Limited Optimization of Heterologous Polypeptide Expression
KR100655438B1 (ko) * 2005-08-25 2006-12-08 삼성전자주식회사 자기 기억 소자 및 그 형성 방법
US20080044851A1 (en) * 2006-06-02 2008-02-21 Epicentre Technologies Compositions and methods for removal of DNA from a sample
PL2086642T3 (pl) * 2006-10-18 2015-02-27 Periness Ltd DNaza do leczenia męskiej subpłodności
PL2840090T3 (pl) 2007-10-30 2018-07-31 Genentech, Inc. Oczyszczanie przeciwciał za pomocą chromatografii kationowymiennej
WO2009123950A2 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimera comprising bacterial cytotoxin and methods of using the same
GB2474225A (en) * 2009-07-21 2011-04-13 Biotec Pharmacon Asa DNase for decontamination of reverse transcription and amplification reactions
EP3318634A1 (en) 2011-04-21 2018-05-09 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating diseases involving dominant-negative or gain of function mutations
US9603906B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Inhalable liquid formulations of DNase I
CN103920144B (zh) * 2013-01-15 2016-09-14 吴庄民 重组人的脱氧核糖核酸酶i的新应用
MX2016017115A (es) 2014-06-25 2018-01-12 Jhl Biotech Inc Metodos y reactivos para la purificacion de proteinas.
JP6071018B2 (ja) 2014-10-31 2017-02-01 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えヒトＤＮａｓｅＩの製造方法
CA2988471A1 (en) * 2015-07-28 2017-02-02 University Of Massachusetts Transgenic expression of dnase i in vivo delivered by an adeno-associated virus vector
CA3012344A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR102618948B1 (ko) 2016-11-17 2023-12-27 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 잔유 종양 침윤 림프구 및 그의 제조 및 사용 방법
EP3351263A1 (en) 2017-01-20 2018-07-25 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Pharmaceutical preparation for treating or preventing tissue adhesion
WO2021244964A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 Black Cat Bio Limited Compositions and methods for treating infections and netopathy

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2801956A (en) * 1954-08-24 1957-08-06 Merck & Co Inc Process for preparing pancreatic desoxyribonuclease
US2834710A (en) * 1955-06-29 1958-05-13 Merck & Co Inc Pancreatic desoxyribonuclease penicillin composition and process of preparation
US3208908A (en) * 1961-11-16 1965-09-28 Parke Davis & Co Fibrinolysin-desoxyribonuclease for enzymatic debridement
US3663690A (en) * 1969-08-12 1972-05-16 Hoechst Co American Mucolytic composition and method of treatment of broncho-pulmonary disorders therewith
CA1059937A (en) * 1975-03-25 1979-08-07 Boen T. Khouw Isolation and purification of deoxyribonuclease
US5077211A (en) * 1988-07-06 1991-12-31 Applied Genetics, Inc. Purification and administration of dna repair enzymes
DE68929551T2 (de) * 1988-12-23 2008-03-06 Genentech, Inc., South San Francisco Menschliche DNase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE

Also Published As

Publication number Publication date
CZ293105B6 (cs) 2004-02-18
UA46693C2 (uk) 2002-06-17
RU94046424A (ru) 1997-03-10
NO944752D0 (no) 1994-12-08
MD960288A (ro) 1998-01-31
CA2137237A1 (en) 1993-12-23
KR100323357B1 (ko) 2002-02-19
GB2282140A (en) 1995-03-29
EP0644932B1 (en) 2000-08-09
US5783433A (en) 1998-07-21
AU682822B2 (en) 1997-10-23
FI945549A (fi) 1994-11-25
BR9306670A (pt) 1998-12-08
US20030077267A1 (en) 2003-04-24
JP3383307B2 (ja) 2003-03-04
US5279823A (en) 1994-01-18
GB9423695D0 (en) 1995-01-11
WO1993025670A1 (en) 1993-12-23
GR3034718T3 (en) 2001-01-31
IL105724A0 (en) 1993-09-22
SK282957B6 (sk) 2003-01-09
HU219549B (hu) 2001-05-28
HU9403512D0 (en) 1995-02-28
DE69329200T2 (de) 2001-04-26
NZ253559A (en) 1996-11-26
CA2137237C (en) 2004-10-26
HUT70468A (en) 1995-10-30
US6440412B1 (en) 2002-08-27
EP1013284B1 (en) 2010-01-20
BG62335B1 (bg) 1999-08-31
GEP20002300B (en) 2000-11-25
DK0644932T3 (da) 2001-01-02
TJ396B (en) 2004-12-29
AU4398193A (en) 1994-01-04
EP1013284A3 (en) 2000-08-30
PL175873B1 (pl) 1999-02-26
ATE195340T1 (de) 2000-08-15
JPH07507455A (ja) 1995-08-24
ES2150447T3 (es) 2000-12-01
DE69334317D1 (de) 2010-03-11
EP0644932A1 (en) 1995-03-29
EP1013284A2 (en) 2000-06-28
IL105724A (en) 1997-06-10
PT644932E (pt) 2001-02-28
DE4392749T1 (de) 1995-07-20
KR100302092B1 (ko) 2001-10-22
RU2238320C2 (ru) 2004-10-20
FI945549A0 (fi) 1994-11-25
US6932965B2 (en) 2005-08-23
CZ303294A3 (en) 1995-06-14
SK149594A3 (en) 1996-01-10
DE69329200D1 (de) 2000-09-14
RO117188B1 (ro) 2001-11-30
GB2282140B (en) 1996-04-17
ATE455557T1 (de) 2010-02-15
NO318644B1 (no) 2005-04-25
NO944752L (no) 1994-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG99234A (bg) Пречистени форми на дезоксирибонуклеаза
Whiteheart et al. Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment proteins (SNAPs) bind to a multi-SNAP receptor complex in Golgi membranes.
CA2264484C (en) Human plasma hyaluronidase
Dahl et al. Isolation and sequence of a cDNA clone which contains the complete coding region of rat phenylalanine hydroxylase. Structural homology with tyrosine hydroxylase, glucocorticoid regulation, and use of alternate polyadenylation sites.
US4900673A (en) Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression
CA2188159A1 (en) Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof
Aakerloef et al. Identification of apolipoprotein A1 and immunoglobulin as components of a serum complex that mediates activation of human sperm motility
Sugimoto et al. Inter-and intramolecular interactions of highly purified Rous sarcoma virus-transforming protein, pp60v-src.
Bennett et al. Phylogeny of immunoglobulins. Characterization of a 14S immunoglobulin from the gar, Lepisosteus osseus
Quinn et al. Reconstitution of defective respiratory burst activity with partially purified human neutrophil cytochrome B in two genetic forms of chronic granulomatous disease: possible role of Rap1A
JP4549439B2 (ja) ヒトｄｎアーゼ変異体
Feller et al. Identification and characterization of a cytosolic protein tyrosine kinase of HeLa cells
Li et al. Cancer-associated lactate dehydrogenase is a tyrosylphosphorylated form of human LDH-A, skeletal muscle isoenzyme
BG64061B1 (bg) Варианти на човешка дезоксирибонуклеаза i
JP4624380B2 (ja) ヒトｄｎアーゼ変異体
JP2009060900A (ja) ヒトｄｎアーゼｉ変異体
JPH07163393A (ja) 抗一酸化窒素合成酵素モノクローナル抗体、その製造法および用途