PT644932E

PT644932E - Formas purificadas de adnase

Info

Publication number: PT644932E
Application number: PT93914258T
Authority: PT
Inventors: John Frenz; Mary B Sliwkowski; Steven J Shire
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-06-08
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 2001-02-28
Also published as: NO944752L; DE69334317D1; FI945549A; GB9423695D0; WO1993025670A1; GB2282140A; RO117188B1; DK0644932T3; BR9306670A; DE69329200D1; PL175873B1; NO944752D0; BG62335B1; US5783433A; US5279823A; JPH07507455A; BG99234A; UA46693C2; TJ396B; HUT70468A

Description

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DESCRICÀO “Formas purificadas de ADNase”

Pedidos de Patente Relacionados O presente pedido refere-se, em relação à matéria objecto, à divulgação contida no Pedido de Patente Internacional Publicado com o N° WO 90/07572. O teor deste pedido anterior é deste modo expressamente aqui incorporado por referência.

Campo do Invento O presente invento refere-se a resultados obtidos da investigação sobre a desoxirribonuclease (ADNase), uma fosfodiesterase que é capaz de hidrolisar o ácido polidesoxirribonucleico. Refere-se em geral à separação de várias formas da referida .ADNase, a estas formas per se, a composições farmacêuticas através das quais a sua utilidade pode ser ciinicamente explorada e a métodos para utilização destas ADNases e suas composições. .Antecedentes do Invento A .ADNase é uma fosfodiesterase capaz de hidrolisar o ácido polidesoxirribonucleico. A ADNase foi purificada a partir de várias espécies em vários graus. .A sequência de aminoácidos completa para uma ADNase de mamífero foi pela primeira vez tomada disponível em 1973. Ver p. ex., Liao, et al, J. Biol. Chem., 248: 1489 (1973). A ADNase tem várias utilidades conhecidas e tem sido utilizada para fins terapêuticos. A sua utilização terapêutica principal tem sido para reduzir a viscoelasticidade de secreções pulmonares em doenças tais como pneumonia e fibrose cística, ajudando assim na desobstrução das vias respiratórias. Ver p. ex., Lourenco, et al., Arch. Intem. Med. 142: 2299 (1982); Shak, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 9188 (1990); Hubbard, et al, New England. J. Med. 326: 812 (1992). O ADN que codifica a ADNase I humana foi isolado e sequenciado e esse ADN foi expresso em células hospedeiras recombinantes, permitindo desse modo a produção de ADNase humana em quantidades comercialmente úteis. Ver p. ex., Shak, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 9188-9192 (1990). Verificou-se que a ADNase humana recombinante

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 2 (hrADNase) era clinicamente útil. especialmente numa forma purificada em que a ADNase esteja isenta de proteases e outras proteínas com as quais está normalmente associada na natureza. Ver p. ex., Hubbard, et al., New Engl. J. Meei 326: 812 (1992).

Os meios e métodos pelos quais a .ADNase humana pode ser obtida numa forma farmaceuticamente eficaz são descritos nos pedidos de patente citados acima. Vários métodos específicos para a purificação da ADNase são conhecidos na arte. Ver p. ex., Khouw, et al., Patente U.S. N° 4065355 (concedida em 27 de Dezembro de 1977); Markey, FEBS Letters 167: 155 (1984); Nefsky, et al., Eur. J. Biochem. 179: 215 (1989).

Embora não tivesse sido notado na altura em que os pedidos de patente acima referenciados foram apresentados, o produto de ADNase obtido a partir de culturas de células hospedeiras recombinantes compreende tipicamente uma mistura de formas de ADNase desamidadas e não desamidadas. A existência de formas desamidadas de ADNase permaneceu sem ser considerada apesar de ser conhecido o fenómeno de desamidação dos resíduos de asparagina e glutamina nalgumas proteínas. Ver p. ex., Eiper et al., Ann. Rev. Physiol. 50: 333 (1988); Kossiakoff, Science 240: 191 (1988); Bradbury et al., Trends in Biochem. Sei. 16: 112 (1991); e Wright, Protein Engmeering 4: 283 (1991). O presente invento tem como base o facto anterior não considerado de que a ADNase humana recombinante pode existir na forma de uma mistura de formas desamidadas e não desamidadas. Utilizando os métodos do presente invento, verificou-se que a ADNase humana desamidada é menos activa enzimaticamente que a ADNase humana não desamidada. Assim, a presença de ADNase desamidada e de ADNase não desamidada juntas numa mistura, e o potencial para posterior ocorrência de desamidação, tal como se verificou ocorrer após armazenamento in vitro de preparações de ADNase humana, podem complicar os esforços para proporcionar uniformidade consistente num produto de ADNase a ser administrado clinicamente. Portanto, uma vez que a existência e as características da ADNase desamidada não eram conhecidas antes do presente invento, os métodos para a identificação de ADNase desamidada e sua separação de preparações de ADNase nas quais esta pode ser encontrada não eram óbvios no momento em que este invento foi feito.

Sumário do Invento O presente invento é dirigido a processos para separação das formas de ADNase humana, desamidada e não desamidada a partir de uma mistura destas. Este processo em concretizações preferidas compreende a sujeição da mistura a cromatografia utilizando uma

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 3 resina, ou outro meio de suporte, possuindo ligado a si um polímero catiónico tal como heparina ou um análogo de ácido desoxirribonucleico (ADN) não hidrolisável; ou cromatografia utilizando uma resina designada de permuta catiónica com tentáculos. O presente invento também é dirigido à utilização destes métodos cromatográficos com ADNases não humanas, tais como ADNase bovina. O presente invento também é dirigido a ADNase humana desamidada como produto purificado, substancialmente isento de ADNase humana não desamidada. O presente invento é também dirigido a ADNase humana não desamidada como produto purificado, substancialmente isento de ADNase humana desamidada. Verificou-se aqui que a ADNase humana não desamidada purificada é totalmente activa enzimaticamente em comparação com a ADNase humana desamidada. O presente invento é também dirigido a composições farmacêuticas que consistem em .ADNase humana desamidada purificada ou ADNase humana não desamidada purificada como princípio activo, opcionalmente em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. O presente invento é também dirigido a um método que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de .ADNase humana desamidada purificada ou de ADNase humana não desamidada purificada para o tratamento de um doente, por exemplo os que possuem uma acumulação de material viscoso contendo ADN. A administração de tais ADNases purificadas é efectuada de preferência através de inalação para os pulmões. O presente invento é particularmente dirigido a um método de tratamento de um doente com uma doença pulmonar tal como bronquite crónica, fibrose cística ou enfisema, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADNase humana não desamidada purificada, de preferência directamente nas passagens respiratórias. O presente invento é também dirigido a composições farmacêuticas compreendendo ADNase humana não desamidada que são apresentadas num frasco de plástico, opcionalmente na presença de um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Breve Descrição do Desenhos A Figura 1 representa as sequências de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e de ADN (SEQ ID NO: 2) da ADNase I humana. A sequência sinal nativa está sublinhada, os

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 4 potenciais códões de iniciação estão em caixas e a sequência madura está dentro de parêntesis. A Figura 2 representa a correlação entre a actividade enzimática e a extensão da desamidação em amostras de ADNase humana. A actividade específica foi determinada através da normalização da actividade de ADNase tal como determinada por um ensaio com verde de metilo (VM) (em unidades de concentração em relação a uma curva padrão) para a concentração de ADNase medida através de um ensaio de imunossorção com ligação de enzimas (ELISA). A percentagem de desamidação foi determinada por mapeamento tríptico. As amostras do “Dia de Colheita” de ADNase humana foram purificadas a partir de uma cultura de células de ovário de hamster Chinês (CHO) recombinantes que expressam ADN que codifica a ADNase I humana. Tais amostras foram recolhidas nos dias 3. 5, 7, 9, 11, 13 e 20 após o início da cultura. As amostras de “pH elevado” eram amostras do dia 13 de ADNase purificada que foram incubadas in vitro durante dois dias a pH 8 a 37°C. As amostras de “estabilidade” eram amostras do dia 13 de ADNase purificada que foram armazenadas in vitro a 5o, 25" ou 37"C durante vários períodos de tempo. A Figura 3 é um exemplo de um mapa tríptico de ADNase empregue na determinação da extensão da desamidação. A amostra mostrada aqui é ADNase desamidada a 65%. “mAU” indica unidades de mili-absorvância a 214 nm. A Figura 4 é uma representação esquemática da desamidação do resíduo de asparagina na posição de aminoácido 74 (Asn-74) na ADNase humana nativa. A desamidação converte o Asn-74 num resíduo de ácido aspártico (Asp) ou iso-aspartato (iso-Asp). Cada uma das três formas de ADNase origina, após digestão com tripsina, um par de péptidos que indica a identidade da forma específica de ADNase. A Figura 5 é um cromatograma de uma amostra de ADNase humana ffaccionada numa coluna de permuta catiónica com tentáculos (TCX). A amostra mostrada é ADNase desamidada a 67%. A Figura 6 mostra mapas trípticos das ffacções dos dois picos da separação em TCX mostrada na Figura 5. A ausência do péptido tríptico T6-7 no mapa do digerido do Pico 2 indica a ausência de ADNase desamidada. A Figura 7 mostra cromatogramas de várias amostras de ADNase humana ffaccionadas numa coluna de TCX. A amostra designada “Ml-28 Padrão” é uma preparação

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EP 0 644 932/PT 5 de ADNase humana obtida a partir de uma cultura de células de ovário de hamster Chinês (CHO) transformadas com ADN que codifica a ADNase I humana nativa. A amostra designada “ADNase ASP Mutante” é ADNase possuindo um resíduo de ácido aspártico (em vez de um resíduo de asparagina) na posição de aminoácido 74, e que assim possui a mesma sequência de aminoácidos que a forma Asp da ADNase desamidada mostrada na Figura 4. A ADNase ASP Mutante foi obtida a partir de uma cultura de células transformadas com ADN que codifica essa forma mutante de ADNase humana. O ADN que codifica a ADNase ASP Mutante foi preparado por mutagénese dirigida ao local, de ADN que codifica a ADNase humana nativa. A comparação dos cromatogramas mostra que uma das formas de ADNase humana na Ml-28 Padrão elui da coluna TCX na mesma posição que a ADNase Asp Mutante. A Figura 8 mostra cromatogramas de várias amostras de ADNase humana fraccionadas numa coluna de TSK-Heparina (Toso Haas. Montgomeryville, Pennsylvania). A amostra designada ‘Τ2Κ #8” é uma preparação de ADNase humana obtida a partir de uma cultura de células de ovário de hamster Chinês (CHO) transformadas com ADN que codifica a ADNase I humana nativa. A amostra designada “Padrão Desamidado” é ADNase humana desamidada purificada. A amostra designada “Padrão Não Desamidado” refere-se a ADNase humana não desamidada purificada. A ADNase humana desamidada purificada e a ADNase humana não desamidada purificada foram preparadas por cromatografia de TCX. A Figura 9 mostra cromatogramas de várias amostras de ADNase humana fraccionadas numa coluna de análogo de ADN imobilizado. A amostra designada “Ml-28” é uma preparação de ADNase humana obtida a partir de uma cultura de células de ovário de hamster Chinês (CHO) transformadas com ADN que codifica a ADNase I humana nativa. A amostra designada “Padrão Desamidado” é ADNase humana desamidada purificada. A amostra designada “Padrão Não Desamidado” refere-se a ADNase humana não desamidada purificada. A ADNase humana desamidada purificada e a ADNase humana não desamidada purificada foram preparadas por cromatografia de TCX. A amostra designada “ADNase ASP Mutante” é ADNase possuindo um resíduo de ácido aspártico (em vez de um resíduo de asparagina) na posição de aminoácido 74.

Descrição Detalhada A. Definições O termo “ADNase humana” incluso pretende significar um polipéptido possuindo a

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 6 sequência de aminoácidos da ADNase I madura humana exposta na Figura 1 bem como variantes da sua sequência de aminoácidos (incluindo variantes alélicas) que sejam enzimaticamente activas na hidrólise de ADN. Assim, o termo “ADNase humana” incluso denota uma ampla definição dos materiais divulgados e preparados nos pedidos de patente descritos acima. O termo “ADNase humana” engloba necessariamente ADNase humana madura nativa possuindo um resíduo de asparagina (Asp) na posição de aminoácido 74 do polipéptido. Verificou-se aqui que essa asparagina era susceptível à desamidação, desamidação essa que pode produzir uma mistura de formas desamidadas e não desamidadas de ADNase humana. Em vez do resíduo de Asn na posição de aminoácido 74, a ADNase desamidada possui um resíduo de ácido aspártico (Asp) ou iso-aspartato (iso-Asp) (ver Figura 4). O termo “ADNase humana desamidada” tal como aqui se utiliza significa ADNase humana que é desamidada no resíduo de asparagina que ocorre na posição 74 na sequência de aminoácidos da ADNase humana madura nativa. Verificou-se que a ADNase humana desamidada pode surgir durante a produção de ADNase humana por meios recombinantes e pode ser encontrada em preparações de ADNase humana obtidas a partir de células hospedeiras recombinantes. Adicionalmente, a ADNase humana desamidada pode surgir após armazenamento in vitro de ADNase humana não desamidada.

Embora o resíduo de asparagina na posição de aminoácido 7 na sequência de aminoácidos da ADNase humana madura nativa também possa ser desamidado (para além do resíduo de asparagina na posição de aminoácido 74), verificou-se que tal ADNase duplamente desamidada era enzimaticamente inactiva. O termo “mistura” tal como aqui se utiliza em relação a preparações de ADNase humana significa a presença de ambas as formas, desamidada e não desamidada, de ADNase humana. Verificou-se, por exemplo, que em preparações de ADNase humana obtidas a partir de expressão recombinante, cerca de 50% a 80% ou mais da ADNase humana é desamidada. O termo “ADNase humana desamidada purificada” tal como aqui se utiliza significa ADNase humana desamidada que está substancialmente isenta de ADNase humana não desamidada. Por outras palavras, a ADNase humana não desamidada corresponderá a menos de cerca de 10%, de preferência menos de cerca de 5%, sendo mais preferível menos de cerca de 1% em peso da ADNase total na composição de ADNase humana desamidada

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ purificada. Ο termo “ADNase humana não desamidada purificada" tal como aqui se utiliza significa ADNase humana não desamidada que está substancialmente isenta de ADNase humana desamidada. Por outras palavras, a ADNase humana desamidada corresponderá a menos de cerca de 25%, de preferência menos de cerca de 5%, sendo mais preferível menos de cerca de 1% em peso da ADNase total na composição de ADNase humana não desamidada purificada. O termo “excipiente" incluso pretende significar um material farmaceuticamente aceitável que é empregue juntamente com ADNase para a administração correcta e bem sucedida da ADNase a um doente. Os excipientes adequados são bem conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em Physicians Desk Reference, Merk Index e Remington ’s Pharmaceutical Sciences.

Uma formulação preferida para a ADNase humana é uma solução aquosa tamponada ou não tamponada, e é de preferência uma solução salina isotónica tal como cloreto de sódio 150 mM contendo cloreto de cálcio 1,0 mM a pH 7. Estas soluções são particularmente adaptáveis à utilização em nebulizadores comercialmente disponíveis incluindo nebulizadores de jacto e nebulizadores ultra-sónicos úteis para administração, por exemplo directamente na vias respiratórias ou pulmões de um doente afectado. É feita referência aos pedidos de patente acima identificados para mais pormenor em relação a como a ADNase humana pode ser formulada e administrada para uma utilização eficaz. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” incluso pretende significar dosagens de cerca de 1 pg a cerca de 100 mg de ADNase humana por quilograma de peso corporal do doente, administradas em composições farmacêuticas, tal como aqui descrito. A quantidade terapeuticamente eficaz de ADNase humana dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, da via de administração e da condição do doente. De forma concordante, será necessário que o terapeuta titule a dosagem e modifique a via de administração conforme necessário de forma a obter o efeito terapêutico óptimo. Tendo em conta as diferenças na actividade enzimática entre as ADNases desamidada e não desamidada aqui descritas, pode acontecer que a quantidade de ADNase não desamidada purificada necessária para alcançar um efeito terapêutico seja menor que a quantidade de ADNase humana desamidada purificada ou de uma mistura das duas formas, necessária para alcançar o mesmo efeito sob as mesmas condições. 8 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ

As ADNases purificadas daqui, particularmente a forma não desamidada, são empregues para alteração enzimática da viscoelasticidade de mucos. Tais ADNases humanas purificadas são particularmente úteis para o tratamento de doentes com doença pulmonar que possuem secreções viscosas, purulentas anormais e condições tais como doença pulmonar brônquica aguda ou crónica, incluindo pneumonia infecciosa. bronquite ou traqueobronquite, bronquiectasia, fibrose cística, asma, tuberculose e infecções fúngicas. Para tais terapias, é instilada uma solução ou uma preparação seca fínamente dividida de ADNase humana desamidada purificada ou de ADNase humana não desamidada purificada, de modo convencional, para os brônquios, por exemplo através de aplicação de aerossóis. B. Concretizações Preferidas

Após a clonagem e a expressão bem sucedidas de .ADNase humana em células hospedeiras recombinantes, verificou-se, após substancial investigação, que o produto de ADNase obtido a partir de tal expressão recombinante existia tipicamente na forma de uma mistura de componentes na altura ainda não definidos. Em particular, a análise por focagem isoeléctrica (IEF) de .ADNase humana purificada a partir de culturas de células de ovário de hamster Chinês (CHO) recombinantes revelou um padrão complexo de espécies de ADNase. Determinou-se que as várias espécies de ADNase resultavam de várias modificações pós-tradução da ADNase, incluindo desamidação.

Foram utilizados dois ensaios para determinar a presença e a extensão da ADNase desamidada em tais preparações. Um método envolveu digestão tríptica da preparação inicial de ADNase e análise dos péptidos resultantes por HPLC de fase inversa. Neste método, a quantidade de ADNase desamidada na preparação inicial foi determinada através da medição das quantidades de seis péptidos trípticos indicadores de desamidação. O outro método envolveu cromatografia da preparação inicial de .ADNase numa coluna de permuta catiónica com tentáculos (TCX). Verificou-se que a coluna de TCX era capaz de resolver ADNase humana desamidada e ADNase humana não desamidada, de tal forma que cada uma das formas de ADNase podia ser separada eficazmente da outra e obtida na forma purificada. Neste método, a quantidade de ADNase desamidada e não desamidada na preparação inicial foi determinada através da medição, nos cromatogramas, das áreas dos picos que correspondiam às formas de ADNase separadas.

Embora estes dois métodos sejam praticamente igualmente eficazes na determinação e quantificação de ADNase desamidada, o método de TCX é especialmente eficiente,

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 9 requerendo muito menos tempo e trabalho que o outro método. Para além disso, a cromatografia de TCX proporciona um meio de separação das formas desamidada e não desamidada de ADNase, enquanto que as resinas de permuta catiónica convencionais e várias outras resinas de cromatografia que foram analisadas não foram capazes de tal separação.

Os princípios gerais da cromatografia de TCX foram descritos, por exemplo, por Miller, J. Chromatographv 510: 133 (1990); Janzen et al., J. C-hromatography 522: 77 (1990); e Heam et al., J. Chromatographv 548: 117 (1991). Sem limitar o invento a qualquer mecanismo ou teoria de operação específicos, crê-se que o resíduo de Asn-74 na ADNase humana que é susceptível à desamidação se localiza no sulco de ligação ao ADN da enzima, por analogia com a conhecida estrutura cristalina da ADNase bovina. O sulco de ligação ao ADN contém resíduos de aminoácidos básicos (de forma a ligar-se ao ADN) e este sulco é aparentemente acessível aos ligandos da resina de permuta catiónica com tentáculos mas não aos ligandos muito mais curtos das resina de permuta catiónica convencionais. Presumivelmente os ligandos da resina de permuta catiónica com tentáculos imitam ácidos nucleicos substratos naturais. Portanto, espera-se que a cromatografia de permuta catiónica com tentáculos seja útil para a purificação de outras nucleases, tais como a ribonuclease (ARNase) ou endonucleases de restrição, bem como proteínas de ligação a ADN.

Altemativamente, a separação de formas desamidadas e não desamidadas de ADNase pode ser alcançada através de cromatografia utilizando uma resina ou outra matriz de suporte contendo polímeros catiónicos ligados covalentemente tais como heparina ou um análogo de ADN não hidrolisável sintético. Colunas de cromatografia de heparina imobilizada estão comercialmente disponíveis (por exemplo, a partir de Toso Haas Co., Montgomeryville, Pennsylvania). .Análogos de ADN não hidrolisáveis foram descritos, por exemplo, por Spitzer et al., Nucl. Acids Res. 16: 11691 (1988). Uma coluna de análogo de ADN não hidrolisável imobilizado é convenientemente preparada sintetizando um tal análogo de ADN com um grupo aminoácido na extremidade 3’ de uma ou ambas as suas cadeias complementares. O grupo amino fica então disponível para conjugação com uma coluna activada com epoxi, tal como descrito, por exemplo, na literatura publicada por Rainin Biochemical LC Products (Wobum, Massachusetts).

Após a separação bem sucedida de ADNases humanas desamidadas e não desamidadas de acordo com os métodos do presente invento, verificou-se que a ADNase humana desamidada possui uma actividade enzimática diminuída em comparação com a ADNase humana não desamidada, tal como determinado por um ensaio com verde de metilo

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ (VM). Kumick, Arch. Biochem. 29: 41 (1950). Verificou-se que a ADNase humana desamidada exibe apenas pouco mais de metade da actividade enzimática da ADNase humana não desamidada. Assim, combinando as ADNases desamidadas purificadas e a ADNase não desamidada purificada do presente invento em várias proporções, é possível preparar composições farmacêuticas de ADNase humana possuindo qualquer actividade específica desejada na gama entre as actividades específicas de cada componente, conforme for óptimo para tratamento de determinadas desordens.

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas como meio de ilustração e não se pretende que limitem o invento de qualquer modo. C. Exemplos 1. Mapeamento Tríptico O procedimento utilizado para mapeamento tríptico da ADNase humana é resumido tal como se segue:

Passo 1. Levar a concentração de uma amostra de 1 mg de ADNase a 4 mg/ml através de concentração num aparelho Amicon Centricon-10 ou através de diluição com excipiente. Volume final: 250 μΐ.

Passo 2. Adicionar 250 μΐ de tampão de pré-tratamento (BisTris 40 mM, EGTA 10 mM, pH 6,0) à amostra. Incubar 1 hora a 37°.

Passo 3. Mudar o tampão da amostra para tampão de digestão (Tris 100 mM, pH 8) utilizando uma coluna Pharmacia NAP-5. Volume final: 1 ml.

Passo 4. Adicionar 10 μΐ de solução de tripsina (tripsina 1 mg/ml, HC1 1 mM) à amostra e incubar 2 horas a 37°.

Passo 5. Adicionar uma segunda alíquota de 10 μΐ de solução de tripsina à amostra e incubar mais 2 horas a 37°.

Passo 6. Parar a digestão através da adição de 6 μΐ de ácido trifluoroacético (TFA). Armazenar as amostras a, ou abaixo de, 5o até serem cromatografadas.

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Passo 7. Separar a mistura peptídica através de HPLC sob as seguintes condições:

Coluna: Nucleosil Cl8, 5 .um, 100 Â, 2,0 x 150 mm (Alltech, Co., Deerfield, Illinois).

Temperatura da coluna: 40°. agua. acetoni trilo.

Eluente A: TFA a 0,12% em Eluente B: TFA a 0,10% em Perfil do gradiente:

Tempo (min) % de A % de B 0 100 0 5 100 0 65 40 60 69 5 95 70 5 95

Caudal: 0,25 ml/min. Volume de injecção da amostra: 250 μΐ.

Tempo de reequilíbrio da coluna após a operação a 100% de A: 20 min.

Temperatura do compartimento de amostragem automática: 5o.

Detecção: Absorvância a 214 e 280 nm.

Passo 8. Identificar os péptidos trípticos T7, (D)T7, T7-8, (D)T7-8, T6-7-8 e T6-7 por comparação do tempo de retenção com o padrão.

Passo 9. Integrar o cromatograma obtido a 280 nm. Verificar a qualidade da integração por inspecção da linha basal e separação de picos que eluem muito próximos. Deve-se prestar especial atenção aos péptidos T7 e (D)T7 que eluem primeiro e que podem não ser bem resolvidos.

Passo 10. Normalizar as áreas dos picos dos seis péptidos repórteres quanto ao teor de tirosina. Os péptidos T7, (D)T7, T7-8 e (D)T7-8 contêm cada um único resíduo de Tyr, enquanto que T6-7-8 e T6-7 contêm três resíduos de Tyr. Calcular a proporção de espécies desamidadas com base nas áreas normalizadas dos picos de (D)T7, (D)T7-8, T6-7-8 e T6-7 em relação às áreas normalizadas totais dos picos dos seis péptidos. É necessário 1 miligrama de ADNase num volume de 250 μΐ de forma a realizar de forma precisa o método de mapeamento tríptico para determinação de ADNase desamidada de acordo com o procedimento delineado acima. Por isso, a preparação da amostra inicial

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 12 para este método requer concentração ou diluição da amostra para alcançar esse resultado. A ADNase na presença de cálcio é altamente resistente a proteases, incluindo tripsina. Portanto, o próximo passo no procedimento é o de remover parcialmente os iões de cálcio através de tratamento com ácido [etileno-bis(oxietilenonitrilo)]tetra-acético (EGTA). O tratamento em excesso com EGTA pode desnaturar e agregar a ADNase, de forma que este passo tem de ser efectuado com cuidado. A amostra tratada com EGTA num volume de 0,5 ml é então mudada para 1 ml de tampão de digestão, é-lhe adicionada tripsina e a amostra é incubada a 37° durante duas horas. Uma segunda alíquota de tripsina é então adicionada e a amostra é incubada mais duas horas. A digestão é parada por acidificação e a amostra é armazenada para posterior análise ou carregada directamente na coluna de HPLC. 250 μΐ (250 pg) da mistura peptídica que resulta da digestão triptica são separados numa coluna de HPLC de fase inversa de acordo com as condições delineadas acima. Um mapa tríptico típico de ADNase humana é mostrado na Figura 3. A HPLC foi efectuada com um modelo 1090M de HPLC da Hewlett-Packard. O efluente da coluna foi monitorizado simultaneamente a 214 e 280 nm pelo detector de agrupamento de díodos série que é uma característica deste instrumento. Uma vez que a porção inicial do mapa peptídico é crítica para a quantificação de ADNase desamidada, tal como descrito abaixo, outros instrumentos com maior retardamento do gradiente e outros volumes de coluna extra podem não ser adequados para esta análise. Cada análise através deste procedimento requer 70 minutos para a separação com o gradiente e 20 minutos para reequilibrar a coluna para um tempo total do ciclo de HPLC de 90 minutos. O racional e a aproximação à integração de picos para determinação da ADNase desamidada numa amostra são descritos abaixo. A desamidação da ADNase humana ocorre pelo menos no resíduo de asparagina que está presente na posição de aminoácido 74 (Asn-74) na ADNase humana madura nativa. O Asn-74 está no lado do terminal C de um local de clivagem triptica no resíduo de arginina na posição de aminoácido 73 (Arg-73), tal como observado na lista de péptidos trípticos esperados da ADNase humana mostrada na Tabela I.

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TABELA I PÉPTIDOS QUE SE ESPERA SEREM PRODUZIDOS POR DIGESTÃO DA ADNase HUMANA MADURA NATIVA COM TRIPSINA ID Resíduos Sequência de Aminoácidos do Péptido TI 1-2 LK T2 3-15 IAAFNIQTFGETK (SEQ ID NO: 3) T3 16-31 MSNATLVSYIVQILSR (SEQ ID NO: 4) T4 32-41 YDIALVQEVR (SEQ ID NO: 5) T5 42-50 DSHLTAVGK (SEQ ID NO: 6) T6 51-73 LLDNLNQDAPDTYHYWSEPLGR (SEQ ID NO: 7) T7 74-77 NSYK (SEQ ID NO: 8) T8 78-79 ER T9 80-111 YLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNR (SEQ ID NO: 9) TIO 112-117 EPAIVR (SEQ ID MO: 10) Til 118-121 FFSR (SEQ ID NO: 11) T12 122-126 FTEVR (SEQ ID NO: 12) T13 127-157 EFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEK (SEQ ID NO: 13) T14 158-185 WGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIR (SEQ ID NO: 14) T15 186-213 LWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDR (SEQ ID NO: 15) T16 214-222 IVVAGMLLR (SEQ ID NO: 16) T17 223-260 GAVVPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK (SEQ ID NO: 17)

Em vez do resíduo de Asn (designação de uma só letra “N”) no resíduo 74 na ADNase humana nativa não desamidada, a ADNase humana desamidada possui um resíduo de Asp ou iso-Asp, tal como mostrado na Figura 4. Iso-Asp é uma forma isomérica de beta-aminoácido do ácido aspártico. A ligação peptídica entre Arg-73 e iso-Asp é resistente à clivagem pela tripsina, pelo que a ADNase humana desamidada produz um péptido tríptico característico contendo os resíduos 51-77 e designado T6-7 uma vez que é uma conjunção dos péptidos T6 e T7. Sob as condições empregues para o mapeamento tríptico, a ligação peptídica Arg-73-Asn-74 na ADNase humana não desamidada e a ligação peptídica Arg-73-Asp-74 na forma Asp da ADNase humana desamidada são clivadas pela tripsina. Por isso, a ADNase não desamidada está indicada no mapa tríptico pela presença do péptido T7 mostrado na Tabela I, enquanto que a forma Asp-74 da ADNase humana desamidada está indicada no mapa tríptico pela presença do péptido T7 desamidado, designado (D)T7. Estes três péptidos repórter estão marcados na Figura 3. Infelizmente, a tripsina apenas cliva parcialmente a ligação peptídica no lado do terminal C de T7, entre os resíduos 77 e 78, de forma a que cada um dos péptidos repórteres T7, (D)T7 e T6-7 tem um conjugado de T8, T7-

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 14 8, (D)T7-8 e Τ6-7-8, respectivamente. Estes seis péptidos repórter têm portanto de ser tidos em conta para se quantificar a ADNase humana desamidada através do método de mapeamento tríptico.

Em princípio, os péptidos (D)T7, (D)T7-8, TS-7 e Tó-7-8 representam a ADNase humana desamidada e os péptidos T7 e T7-8 representam a .ADNase humana não desamidada e o conhecimento das proporções relativas destes péptidos permite um cálculo directo da extensão da desamidação numa preparação de .ADNase. De modo a calcular a fracção da amostra que é ADNase desamidada, é necessário um conhecimento das razões molares das espécies desamidada e não desamidada, mas

Existem dois problemas adicionais no procedimento do mapeamento tríptico que têm de ser superados: um problema cromatográfico e um problema de detecção. O problema cromatográfico é que o péptido T2 coelui com T6-7 e impede assim a integração de uma área de pico precisa deste péptido indicador de desamidação. Este problema pode ser superado através da integração do cromatograma obtido a 280 nm. uma vez que todos os seis péptidos relevantes possuem pelo menos um resíduo de tirosina (Tyr) e absorvem assim fortemente a 280 nm, enquanto que T2 não contém resíduos de Tyr ou de triptofano (Trp) e absorve assim de forma desprezável a este comprimento de onda. O problema de detecção é que os péptidos T6-7 e T6-7-8 contêm, cada um, três resíduos de Tyr, enquanto que os outros quatro péptidos contêm, cada um, apenas um. Assim os péptidos contendo T6 possuem uma capacidade de absorção molar mais elevada que os péptidos que contêm apenas T7 e uma simples comparação das áreas dos picos tenderia a sobrestimar o teor de espécies desamidadas numa amostra. Este problema é superado normalizando as áreas dos picos dos seis péptidos quanto ao número de resíduos de Tyr no péptido. A normalização das áreas dos picos deste modo implica que todos os resíduos de tirosina em cada um dos péptidos estejam num ambiente químico equivalente, o que é provavelmente bem assumido para péptidos relativamente pequenos tais como os que são aqui considerados. Após a normalização, as áreas dos picos corrigidas para péptidos desamidados e não desamidados podem ser comparadas para se chegar a uma estimativa do teor de ADNase desamidada numa amostra. 2. Cromatografia de Permuta Catiónica com Tentáculos

As resinas de permuta catiónica de tentáculos (TCX), ao contrário das resinas de permuta catiónica convencionais, possuem ligandos poli-iónicos ligados a uma superfície de sílica. Os Ligandos da coluna LiChrospher® 1000 SOf (EM Separations, Gibbstown, New Jersey) utilizados neste exemplo são anunciados como contendo entre 25 e 50 grupos

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 15 sulfopropilo juntamente com uma estrutura de polietileno que é unida numa extremidade à superfície da sílica. O cromatograma de TCX de uma amostra de ADNase humana recombinante corrida numa coluna LiChrospher® 1000 S03" é mostrado na Figura 5. A ADNase humana recombinante foi purificada a partir de culturas de células de ovário de hamster Chinês (CHO) transformadas com ADN que codifica ADNase humana. Shak, et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 9188-9192 (1990); Shak. et al.. Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 90/07572 (publicado a 12 de Julho de 1990).

Os dois picos obtidos foram recolhidos e sujeitos a várias análises de forma a identificá-los como as formas de .ADNase que diferem apenas no resíduo da posição de aminoácido 74. A Figura 6 mostra mapas trípticos dos dois picos recolhidos da coluna TCX, confirmando que são, respectivamente, as formas desamidada e não desamidada da ADNase humana. O mapa tríptico revela também que ambas as formas de ADNase desamidada (possuindo Asp e iso-Asp na posição de aminoácido 74) estão presentes no primeiro pico da separação por TCX. A Tabela II mostra as actividades específicas medidas para os dois picos, confirmando a relação entre a desamidação e a actividade específica inferida a partir da correlação mostrada na Figura 2, e apoiando ainda a identificação das fraeções de TCX. A actividade da fraeção de ADNase foi determinada através de um ensaio com verde de metilo (VM).

TABELA II ACTIVIDADES DAS FRACÇÕES RECOLHIDAS DA COLUNA DE TCX As concentrações de VM e ELISA são as médias das determinações em duas amostras Amostra VM (pg/ml) ELISA (qg/ml) Actividade Específica Preparação inicial de ADNase humana recombinante (carga) 8315 7828 1,06 Pico 1 de TCX (desamidada) 85,3 119,7 0,71 Pico 2 de TCX (não desamidada) 149,2 99,4 1,50

Foi produzida uma forma mutante de ADNase humana, possuindo um resíduo de Asp na posição de aminoácido 74, através de mutagénese dirigida ao local do ADN que codifica a ADNase humana madura nativa. Este mutante coelui com o primeiro pico obtido na cromatografia de cima, tal como mostrado na Figura 7.

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ Ο que se segue é o procedimento utilizado para empacotar a resina de permuta catiónica com tentáculos LiChrospher® 1000 S03\ Outra resina de permuta catiónica com tentáculos útil de forma semelhante na separação das formas desamidada e não desamidada de ADNase humana é a resina de permuta catiónica com tentáculos Fractogel® (EM Separatiòns, Gibbstown, New Jersey). LiChrospher e Fractogel são marcas registadas de EM Industries, Inc., Hawthome, N.Y., ou E. Merck, Darmstadt, Alemanha Ocidental. As forma “fortes” das resinas de permuta catiónica com tentáculos (sejam LiChrospher ou Fractogel), possuindo um grupo S03' funcional, parecem presentemente dar os melhores resultados. 3. Procedimento de Empacotamento da Coluna de HPLC com a Resina LiChrospher® 1000 SOf a. Materiais e Equipamento: 1. Leito de 1,0 cm χ 5,0 cm em cartucho de vidro de elevado rendimento. 2. Tampão de Empacotamento: acetato de sódio 10 mM, CaCl, 1 mM, pH até 4,5 com ácido acético. Filtrar através de um filtro de 0, 2 μ. 3. Reservatório para empacotamento da coluna com uma capacidade de 20 ml. (peça Alltech #9501 ou equivalente). 4. Esvaziar a coluna de aço inoxidável de 4,6 mm χ 50 mm com fritas de limite de exclusão de 0,5 μ. 5. Bomba de HPLC capaz de manter uma contrapressão de 2000 psi (Modelo Waters 510 ou equivalente). b. Procedimento de Empacotamento. 1. Limpeza da resina: a) Desempacotar a coluna de vidro de elevado rendimento de 1,0 cm χ 5,0 cm (Volume do leito = 3,93 ml de resina). Ressuspender a resina até 20 ml num vaso de vidro transparente com tampa, com tampão de empacotamento da coluna. Misturar formando uma suspensão uniforme e dividir em alíquotas de 2 χ 10 ml. Adicionar 10 ml de tampão de empacotamento da coluna a cada alíquota para conseguir suspensões de aprox. 1,95 ml de resina em 20 ml de tampão de empacotamento. b) Misturar a resina para alcançar uma suspensão uniforme. Permitir que assente até as partículas formarem um leito sólido no fundo do vaso (2-4 horas). Cuidadosamente decantar o sobrenadante contendo partículas finas.

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 17 c) Adicionar 20 ml de tampão de empacotamento à resina e repetir o passo b). Este procedimento deve ser repetido pelo menos quatro vezes para assegurar a remoção de todas as partículas finas de resina. 2. Empacotamento da Coluna: a) Ligar a coluna de HPLC de 4.6 mm χ 50 mm vazia ao reservatório de empacotamento. Suspender a resina em 20 ml de tampão de empacotamento. b) Adicionar a suspensão de resina ao reservatório e tapar rapidamente. Bombear tampão de empacotamento a uma pressão que não exceda 2000 psi. Ajustar o caudal de forma a que a pressão de empacotamento permaneça constante a cerca de 2000 psi e deixar escoar durante 15 minutos após a pressão ter estabilizado. Remover a coluna e ligar a extremidade superior. A coluna pode ser utilizada directamente ou armazenada em azida de sódio a 0,02%.

Para a maioria das amostras, incluindo ADNase formulada em NaCl 150 mM, não é necessária qualquer preparação da amostra antes da injecção da amostra na coluna. A coluna é equilibrada com tampão acetato pH 4,5 contendo iões de cálcio, a amostra é injectada e a coluna é então eluída com um gradiente salino. O procedimento seguinte é útil para preparações de pequena escala de formas desamidadas e não desamidadas de ADNase humana. As proporções das áreas dos picos no cromatograma resultante são iguais às proporções de ADNase desamidada e não desamidada na amostra.

Passo 1. Carregar a amostra, contendo iNaCl até 150 mM e a um pH de até 9 no frasco de amostragem automática. As amostras recolhidas de fluído de culturas celulares requerem ajustamento do pH para 4,5 e centrifugação para remover proteínas que sejam insolúveis nos tampões utilizados neste procedimento.

Passo 2. Separar as duas formas de ADNase por HPLC sob as seguintes condições:

Coluna: TCX LiChrospher3 1000 SO,' empacotada de novo numa coluna de aço. As dimensões da coluna são de 4,6 χ 50 mm e foram empacotados e empregues 4,6 x 150 mm.

Temperatura da coluna: ambiente.

Eluente A: acetato de sódio 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 4,5.

Eluente B: NaCl 1 M em tampão A.

Perfil do gradiente:

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Tempo (min) %A %B 0 100 0 4 100 0 30 30 70 30,1 5 95 37 5 95

Taxa de escoamento: 0,8 ml/mm (50 mm de coluna), 0,5 ml/mm (150 mm de coluna).

Volume de injecção da amostra: até 250 μΐ.

Tempo de reequilíbrio da coluna após a comida a 100% de A: 20 min.

Temperatura do compartimento de amostragem automática: 5o.

Detecção: Absorvância a 280 nm.

Passo 3. Integrar o cromatograma. Calcular a proporção de espécies desamidadas com base na área do pico da ADNase desamidada que elui inicialmente em relação à área total dos picos de ambas as formas. A cromatografía de permuta catiónica com tentáculos proporciona também um meio para separação, em grande escala, das formas desamidada e não desamidada de ADNase humana. As separações em grande escala são efectuadas de forma mais conveniente utilizando condições de operação de eluição mais simplificadas que as que estão descritas acima para separações analíticas de pequena escala das duas formas de ADNase. Assim, as separações em grande escala foram efectuadas no agente de permuta catiónica com tentáculos suportado em Fractogel de acordo com o seguinte procedimento com eluição por pH:

Passo 1. Empacotar uma coluna 31,6 (1,6 cm de d.i. χ 15,7 cm de altura) com resina de permuta catiónica com tentáculos Fractogel EMD S03‘ 650M (EM Separations, Gibbstown, New Jersey).

Passo 2. Diafiltrar a carga de ADNase com tampão de equilíbrio (acetato de sódio (NaAc) 30 mM, cloreto de cálcio (CaCl2) 1 mM, cloreto de sódio (NaCI) 50 mM, pH 5). Concentrar por ultrafiltração até um volume de 355 ml e concentração de 2,5 mg/ml.

Passo 3. Lavar a coluna com 2,5 volumes da coluna (VC) de hidróxido de

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 19 sódio (NaOH) a 2%.

Passo 4. Lavar a coluna com 2,5 VC de tampão de pré-equilíbrio (NaAc 300 mM, NaCl 1 M, pH 5).

Passo 5. Lavar a coluna com 2,5 VC de tampão de equilíbrio.

Passo 6. Carregar a coluna com 1-1,3 g de ADNase diafiltrada/ultrafiltrada (do

Passo 2). Iniciar a recolha das fracções do efluente da coluna após o começo da carga de ADNase.

Passo 7. Lavar a coluna com 5 VC de tampão de equilíbrio.

Passo 8. Lavar a coluna com 5 VC de tampão de lavagem a pH 5,3 (succinato 25 mM, CaCL 1 mM, pH 5,3).

Passo 9. Lavar a coluna com 10 VC de tampão de lavagem a pH 5,4 (succinato 25 mM, CaCL l mM, pH 5,4).

Passo 10. Lavar a coluna com 10 VC de tampão de lavagem a pH 6 (MES 25 mM, CaCL 1 mM, pH 6).

Passo 11. Combinar as fracções recolhidas durante os Passos 6-8 para formar um conjunto consistindo predominantemente em ADNase desamidada. Combinar as fracções recolhidas durante o Passo 10 para formar um conjunto de ADNase não desamidada. As fracções recolhidas durante o Passo 9 contêm uma mistura das duas formas de ADNase e podem ser recicladas. O protocolo descrito acima é um exemplo da utilização de uma resina de permuta catiónica com tentáculos para uma purificação preparativa das duas formas de ADNase humana recombinante de um modo que é ampiiável para recuperação em larga escala de ADNase desamidada purificada e não desamidada purificada. 4. Cromatografia em Heparina e Análogo de ADN Imobilizado.

Na Figura 8 estão alinhados cromatogramas de análises numa coluna de TSK-Heparina (Toso Haas, Montgomeryville, Pennsylvania) de amostras contendo uma

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 20 mistura de formas desamidadas e nào desamidadas de ADNase humana, ADNase humana desamidada purificada ou ADNase humana não desamidada purificada. A coluna de TSK-Heparina foi corrida sob as mesmas condições tal como descrito acima para a operação da coluna analítica de TCX. Os cromatogramas alinhados demonstram que a coluna de heparina imobilizada resolve as formas desamidada e não desamidada da ADNase.

Tal como descrito acima, outro meio para a separação das formas desamidada e não desamidada da ADNase consiste em empregar uma coluna contendo um análogo imobilizado de ADN que seja resistente à hidrólise pela .ADNase. Um exemplo desta abordagem a uma coluna de análogo de ADN imobilizado envolveu a síntese do oligonucleótido-fosforotioato 5,-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-NH?-3\ Esta sequência auto-complementar pode hibridar numa forma em cadeia dupla e ser conjugada com uma coluna Rainin Hydropore-EP (Rainin Co., Wobum, Massachusetts). A Figura 9 mostra cromatogramas alinhados das análises nesta coluna de amostras contendo uma mistura de formas desamidada e não desamidada da ADNase humana, ADNase humana desamidada purificada, ADNase humana nào desamidada purificada ou ADNase humana mutante purificada possuindo um resíduo de ácido aspártico (em vez de um resíduo de asparagina) na posição de aminoácido 74. A coluna foi corrida para estas análises num tampão contendo cloreto de cálcio 1 mM, MES 5 mM a um pH de 6, e eluída com um gradiente linear de concentração salina até cloreto de sódio 1M durante 20 minutos a um caudal de 1 ml/min. Tal como mostrado na Figura 9, sob estas condições as formas de ADNase desamidada e não desamidada são parcialmente separadas uma da outra. Adicionalmente, as duas formas isoméricas de ADNase desamidada, que diferem na posição de aminoácido 74 da sequência da ADNase por possuírem ácido aspártico ou ácido iso-aspártico nesta posição, são também resolvidas por esta coluna. Assim, um benefício adicional deste método cromatográfico é o de que permite o isolamento dos dois isómeros que surgem após desamidação da .ADNase humana. 5. Actividade Enzimática da ADNase Humana Desamidada e da ADNase Humana Não Desamidada.

Foram utilizados vários métodos analíticos para examinar o efeito da desamidação na actividade enzimática da ADNase humana. A ADNase humana desamidada purificada e a .ADNase humana não desamidada purificada para utilização nestes estudos foram preparadas por cromatografia de TCX, tal como descrito acima.

Num método de determinação da actividade enzimática da ADNase, foi marcado ADN de cadeia dupla sintético, 25 pares de bases de comprimento, com dinitrofenol (DNP)

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 21 numa extremidade e com biotina na outra extremidade. A hidrólise do substrato pela ADNase foi detectada através da captura dos produtos da reacção em poços de placas de microtítulo revestidos com anticorpo para DNP e por quantificação da sonda intacta com estreptavidina-peroxidase de rábano. A actividade específica das amostras de estabilidade foi correlacionada (r = 0,613; n = 5) com a extensão da desamidação da ADNase (gama de 27%-93%). A extrapolação da equação linear dos mínimos quadrados proporcionou uma estimativa de que a actividade específica da ADNase humana desamidada era aproximadamente 77% menor que a da ADNase humana não desamidada.

Outro método para determinação da actividade enzimática da ADNase envolveu hidrólise do substrato cromogénico p-nitrofenil-fenilfosfonato (PNPP) tal como descrito por Liao, et ciL, Biochem J. 255: 781-787 (1988). A cinética da hidrólise de PNPP pela ADNase humana é sigmoidal e foi ajustada à equação de Hill por regressão não linear. Através deste método a Vmax da ADNase humana totalmente desamidada foi determinada como sendo 77% mais baixa que a da .ADNase humana não desamidada. A concentração de substrato para de metade da actividade máxima (S0_5) não diferiu significativamente para as amostras de ADNase humana desamidada e não desamidada.

Outro método para determinação da actividade enzimática da ADNase é o ensaio descrito por Kunitz,Gen. Physiol. 33: 349 (1950), de preferência modificado de forma a que a reacção enzimática seja efectuada a pH de cerca de 7,0-7,5. Através deste método, também se determinou que a actividade enzimática da ADNase humana desamidada era inferior à da ADNase humana não desamidada. 6. .Armazenamento in vitro da ADNase Humana. ADNase humana purificada proveniente de células CHO recombinantes foi dissolvida numa concentração de 4 mg/ml, numa solução aquosa não tamponada de NaCl 150 mM e CaCl: 1 mM. As amostras da solução de ADNase resultante foram então colocadas em frascos de vidro e de plástico. Foram utilizados dois tipos diferentes de frascos de plástico, sendo um feito de resina plástica Dupon 20 (fabricada por E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, Delaware USA) e sendo o outro feito de resina plástica Escorene (fabricada por Exxon Corp.). Ambos os plásticos são polietileno de baixa densidade, mas podem também ser utilizados recipientes formulados com outros plásticos, tais como polipropileno, poliestireno ou outras poliolefinas. Os frascos contendo a solução de .ADNase foram armazenados a -70°C, 2-8°C ou 25°C. Inicialmente, cerca de 60%-65% da ADNase nas soluções era desamidada.

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As soluções de ADNase nos frascos foram ensaiadas a vários tempos após o armazenamento inicial para determinar a extensão da desamidação da ADNase. Os resultados desses ensaios são mostrados na Tabela III.

TABELA III % DE DESAMIDAÇÃO DA ADNase HUMANA RECOMBINANTE ARMAZENADA EM FRASCOS DE VIDRO E DE PLÁSTICO Amostra Dia -70°C 2-8°C 25°C Vidro 83 66 66 78 174 63 66 81 Dupont 20 83 65 66 71 174 63 63 70 Escorene 83 65 66 71 174 64 62 70

Após 83 e 174 dias de armazenamento a -70°C ou 2-8°C, não se verificou qualquer diferença na quantidade de ADN desamidada nos frascos de plástico nem na quantidade de ADNase desamidada nos frascos de vidro. Em cada um dos casos, aproximadamente 64% (-Í-/- 2%) da ADNase nos frascos era ADNase desamidada.

Inesperadamente, no entanto, após 83 ou 174 dias de armazenamento a 25°C, havia uma diferença na quantidade de .ADNase desamidada nos frascos de plástico e na quantidade de ADNase desamidada nos frascos de vidro. Estava presente significativamente menos ADNase desamidada nos frascos de plástico. Em particular, após 83 dias de armazenamento a 25°C, 78% da ADNase nos frascos de vidro era ADNase desamidada, enquanto que cerca de 70% da ADNase nos frascos de plástico era ADNase desamidada. Após 174 dias de armazenamento a 25°C, 81% da ADNase nos frascos de vidro era ADNase desamidada, enquanto que apenas cerca de 71% da ADNase nos frascos de plástico era ADNase desamidada.

Sem limitar o invento a qualquer mecanismo ou teoria de operação em particular, pode ser que as diferenças na desamidação da ADNase nos frascos de plástico e de vidro sejam uma consequência de diferenças no pH das soluções nos frascos. Inicialmente, o pH da solução de ADNase nos frascos de vidro era ligeiramente superior ao dos frascos de plástico

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EP 0 644 932/PT 23 (aproximadamente pH 6,7 e aproximadamente pH 6,5, respectivamente). O pH da solução de ADNase nos frascos de vidro continuou a aumentar ligeiramente ao longo do tempo (para aproximadamente pH 6,9 após 83 dias de armazenamento a 25°C, e para aproximadamente pH 7.0 após 174 dias de armazenamento a 25°C), talvez como consequência de silicatos ou iões da superfície do vidro que se dissolvem na solução. A um pH mais elevado, a taxa de desamidação da ADNase humana é aumentada. Uma vez que não foi considerado se a desamidação da ADNase ocorre a pH elevado, é uma concretização deste invento formular e/ou armazenar .ADNase humana em soluções possuindo pH ácido, tipicamente a pH cerca de 4,5-6,8 e de preferência a pH cerca de 5,0-6,8.

Assim, é obtida uma melhoria significativa na estabilidade da ADNase humana em solução colocando tal solução de .ADNase em frascos de plástico em vez de frascos de vidro, ocorrendo aparentemente menos desamidação da ADNase ao longo do tempo nos frascos de plástico do que nos frascos de vidro. Esta verificação pode ser especialmente relevante para a escolha da embalagem para a ADNase humana para utilização terapêutica, onde é especialmente desejável que a ADNase humana possa ser armazenada durante longos períodos de tempo sem perda significativa de actividade enzimática. Claro que, frascos de vidro com revestimentos que não de vidro, por exemplo, forros plásticos, seriam igualmente úteis. O que é importante é evitar o armazenamento da ADNase em contacto com vidro, especialmente para armazenamentos que excedam cerca de 15-30 dias.

Observações Gerais A descrição antecedente pormenoriza métodos específicos que podem ser empregues na prática do presente invento. Tendo aqui pormenorizado métodos específicos utilizados para identificar, caracterizar, separar e utilizar a ADNase pura, desamidada e não desamidada, e ainda divulgado sistemas modelo específicos que lhes pertencem, os peritos na arte saberão bem como idealizar métodos alternativos de confiança para chegar à mesma informação utilizando os frutos do presente invento. Assim, embora o antecedente possa aparecer detalhado no texto, não se deve entender como limitante do âmbito geral deste; pelo contrário, o âmbito do presente invento deve ser determinado apenas pela concepção legal das reivindicações anexas.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DO INVENTO: FORMAS PURIFICADAS DE ADNase (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 17 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech. Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete de 5.25 polegadas, 360 Kb

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patin (Genentech) (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE .APRESENTAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Johnston, Sean A. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35910 (C) NÚMERO DE REFERÈNCIA/REGISTO: 747 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 415/225-3562 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 346 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 25 (χχ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1

Ser Cys — Gly Ser Ala Leu Lys Cys Phe 10 Phe Arg Asp Leu Ser Ser Xaa Thr Thr ?he 20 ?iie Ser Leu Ser Ser 25 Lys Arg Arg Lys Leu 30 Ser Ser lys Asp Ile 3 Ξ Pro Asp Ser Xaa Gin 40 His Ser Arg His Leu 45 Xaa ... U-L/ Ha 3 His His 50 His Leu Arg Met Arg 55 Gly Met Lys Leu Leu 60 Gly Ala Leu leu Ala 65 Leu Ala Ala Leu Leu 70 Gla Gly Ala Vai Ser 75 Leu Lys “ " Λ Ala Ala Phe Asn Ile Gin Thr Phe Gly olU. Thr Lys ao 35 90 Mec Ser Asn Ala Tí^r 55 Leu Val Ser Tyr Ile 100 Val Gin Hs Leu Ser 105 ΑΓ3 Tyr Asp Ile Ai. a 110 Leu Val r· · ψβ. Glu Val 115 Arg Asp Ser His Leu 120 Thr Ala Vai Gly ivs 125 Leu Leu Asp Asn Leu 130 Asn Gla Asp Ala Pro 13 S Asp Thr Tyr His Tyr 140 vai Val Ser Glu ?ro 145 Leu Gly Arg Asn Ser 150 Tyr Lys Glu Arg Tyr 155 Leu Phe Val Tyr Arg ISO Pro Asp Glr Val Ser 165 Ala vai Asp Ser Tyr 170 Tyr Tyr ASp Asp Glv 175 Cys Glu ?rc Cys Gly 130 Asn Aap 7sr Phe Ass 135 Arg Glu *4*·*·· Ala Ile 120 Val Arg Phe Phe Ser 125 Arg Phe Thr Gl**i Vai 200 Arg Glu Phe Ala Ile 205 Val leu His Ala 210 Ala Pro Gly Asp Ala 215 Val Ala Glu Ile Asp 220 Ala X*eu Tyr Asp Val 225 Tyr leu Asp Vai Gin 230 Glu Lys Trp Gly Leu 235 Glu Asp Vai MeC Leu 240 Mec Gly Asç Phe Aan 245 Ala Gly Cys Ser Tyr 250 Val Arg ?r3 Ser Gin 2SS Trp Ser Ser lie Arg 260 Leu Trp Ser Pro 265 Thr Phe Trp Leu 270 Ile Pro Asp Ser Ala 275 Asp Thr Ala Thr 230 Pro Thr His Cys Ala 285 Asp Arg •le Vai 220 Val Ala Gly Mec Leu 225 Leu Arg Gly Ala Val 300 Vai Pro Asp Ser Ala 305 Leu Pro Phe Asn Phe 310 Gin Ala Ala Tyr Gly 315 leu Ser Asp Gin leu 320 Ala Gin Ala Ile Ser Asp 325 His Tyr Pro Val 330 Glu Vai Mer Leu Lys 335 Xaa Ala Ala PM Pro 340 His TJar* Ser Xaa Thr 345

Ala 346

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1039 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

TCCTGCACAG GCAGTGCCTT GAAGTGCTTC TTCAGAGACC TTTCITCATA GACTAC7TTT TTTTCTTTAA GCAGCAAAAG GAGAAAATTG TCA7CAAAGG

ATATTCCAGA TTCTTGACAG CAGTCTCGTC ATCTCTGAGG ACA7CACCAT

CATCTCAGGA TGAGGGGCAT GAAGCTGCTG GGGGCGCTGC TGGCACTGGC

GGCGCTACTG CASGGGGCCG TGTCCCTGAA GATCSCAGCC TTCAACATCC

AGACAT7TGG GGAGACCAAG ATGTCCAATG CCACCCTCGT CAGCTACATT

GT3CAGA.TCC TGAGCCGCTA TGAGATCGCC UItjGTCCAGG AGGTCAGAGA

CAGCCACCTG ACTGCC3TGG GGAAGCTGCT GGACAACCTC AATCAGGATG

CACCAGACAC GTATCACTAC GTGGTCAGTG AGCCACTGGG ACGGAACAGC

7ATAAGGAGC GCTACCTGTT C3TGTACAGG CCTGACCAGG TGTCTGCGGT

GGACAC-C7AC TACTACGATG ATGGCTGCGA GCCCTSC3GG AACGACACCT

TCAACCGAGA GCCAGCGATT GTCAGGTTCT TCTCCCGGTT CACAGAGGTC

AGGGAGTTTG CCATTG7TCC CCTGCATGCG GCCCCGGGGG ACGCAGTAGC

CGAGATCGAC GCTC7C7ATG ACGTC7ACCT GGATGTCCAA 3AGAAATGGG

3CTTGGAGGA CGTCATGTTG ATGGGCGACT TCAATGCGGG GTGCAGCTAT

GTGAGACCCT CCGAGTGGTC ATCCAGCCGC CT3TGGACAA GCCCCACCTT

CCAGTGGC7G ATCGCCGACA GCGCTGACAC CACAGCTACA CGCACGCACT

GTGCCtXTGA CAGGATCGTG GTTGCAGGGA TGCTGCTCCG AGGCGCC3TT

GTTCCCGACT CGCCTCTTCG CTTTAACGTC CAGGCTGCCT ATGGCCTGAG

TGACCAACTG GCCCAAGCCA TCAGTGACCA CTATCCAGTG GAGGTGATGC TGAAGTGAGC AGCCCCTCCC CACACGAGTT GAACTGCAG 1033

50 100 150 200 250 300 350 400 4 = 0 500 550 500 550 700 7S0 aoo 850 300 350 1000 27 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (ι) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gin Thr Phe Gly Glu Thr Lys 15 10 13 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Met Ser Asn Ala Thr Leu Vai Ser Tyr Ile Vai Gin Ile Leu 1 5 10

Arg 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Tyr Asp Ile Ala Leu Vai Gin Glu Vai Arg 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 28 (χι) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Asp Ser His Leu Thr Ala Vai Gly Lys 1 5 9 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gin Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr 1 5 10 15 Vai Vai Ser Glu Pro Leu Gly Arg 20 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 ammoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Asn Ser Tyr Lys 1 4 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 ammoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Tyr 1 Leu Phe Vai Tyr 5 Arg Pro Asp Gin Vai 10 Ser Ala Vai Asp Ser 15 Tyr Tyr Tyr Asp Asp 20 Gly Cys Glu Pro Cys 25 Gly Asn Asp Thr Phe 30

Arg 32

Asn 29 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10

Glu Pro Ala Ile Vai Arg 1 5 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11

Phe Phe Ser Arg 1 4 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12

Phe Thr Glu Vai Arg 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 30

(χι) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 13: Glu 1 Phe Ala Ile Vai 5 Pro Leu His Ala Ala 10 Pro Gly Asp Ala Vai 15 Ala Glu Ile Asp Ala 20 Leu Tyr Asp Vai Tyr 25 Leu Asp Vai Gin Glu 30

Lvs 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Trp 1 Gly Leu Glu Asp 5 Vai Met Leu Met Gly 10 Asp Phe Asn Cys Ser Tyr Vai Arg 20 Pro Ser Gin Trp Ser 25 Ser Ile Arg 28 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

Leu 1 Trp Thr Ser Pro 5 Thr Phe Gin Trp Leu 10 Ile Pro Asp Ser Ala 15 Asp Thr Thr Ala Thr 20 Pro Thr His Cys Ala 25 Tyr Asp Arg 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 31 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Ile Vai Vai Ala Gly Met Leu Leu Arg 1 5 9 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Gly Ala Vai Vai Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gin Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gin Leu Ala Gin Ala Ile Ser Asp His 20 25 30 Tyr Pro Vai Glu Vai Met Leu Lys 35 38

Lisboa, -o 2000

Por GENENTECH, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Claims

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Processo compreendendo a separação de ADNase' humana desamidada e não desamidada a partir de uma mistura destas.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1 o qual emprega uma resina de permuta catiónica com tentáculos.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 o qual emprega uma resina de heparina imobilizada.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1 o qual emprega uma resina de análogo de ADN não hidrolisável imobilizado.
5. ADNase humana desamidada purificada em que menos de 10% em peso da ADNase total é ADNase humana não desamidada.
6. -ADNase humana não desamidada purificada em que menos de 25% em peso da ADNase total é ADNase humana desamidada.
7. Composição farmacêutica que consiste essencialmente em ADNase humana não desamidada em que menos de 25% em peso da ADNase total é ADNase humana desamidada e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica que consiste essencialmente em ADNase humana desamidada em que menos de 10% em peso da ADNase total é ADNase humana não desamidada e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 em que o excipiente é água estéril.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 em que o excipiente é uma solução aquosa não tamponada estéril a pH de cerca de 4,5-6,8.
11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 ou 8 em que a referida composição está numa forma de aerossol.

85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 2/3
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 em que o referido excipiente é uma solução aquosa estéril, e a referida composição é disposta num recipiente selado fabricado de um material que não de vidro.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 disposta em contacto com um recipiente fabricado de um material que não de vidro.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 em que o excipiente farmacêutico é uma solução aquosa estéril, e a referida composição é disposta num frasco de plástico selado.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 ou 14 que é substancialmente isenta de proteínas humanas para além de ADNase humana.
16. Utilização de uma composição que consiste essencialmente em ADNase humana desamidada em que menos de 10% em peso da ADNase total é ADNase humana não desamidada, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um doente possuindo uma acumulação de material purulento.
17. Utilização de uma composição que consiste essencialmente em ADNase humana não desamidada em que menos de 25% em peso da ADNase total é ADNase humana desamidada, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um doente possuindo uma acumulação de material purulento.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 16 ou a reivindicação 17 em que o referido medicamento é substancialmente isento de proteases.
19. Utilização de uma composição que consiste essencialmente em ADNase humana desamidada em que menos de 10% em peso da ADNase total é ADNase humana não desamidada, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um doente possuindo uma doença pulmonar.
20. Utilização de uma composição que consiste essencialmente em ADNase humana não desamidada em que menos de 10% em peso da ADNase total é ADNase humana desamidada, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um doente possuindo uma doença pulmonar. 85 589 ΕΡ Ο 644 932/ΡΤ 3/3
21. Utilização de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que a doença pulmonar é fíbrose cística.
22. Utilização de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que a doença pulmonar é bronquite.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que a doença pulmonar é bronquiectasia.
24. Utilização de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que a doença pulmonar é pneumonia.
25. Utilização de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que a doença pulmonar é tuberculose. Lisboa, . -9. O. 2000 Por GENENTECH, INC. - O AGENTE OFICIAL - O ápj&TO

Ag. Of. Pr. Ind. Rmq das Flores, 74 - 4.® j 1SOO LISBOA ' EMG.° AMTÓNUO 10Ãô §>A CUNHA mmu