CZ293105B6 - Způsob oddělování deamidované lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy, čistá nedeamidovaná a deamidovaná lidská DNáza a farmaceutický prostředek obsahující tyto formy - Google Patents

Způsob oddělování deamidované lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy, čistá nedeamidovaná a deamidovaná lidská DNáza a farmaceutický prostředek obsahující tyto formy Download PDF

Info

Publication number
CZ293105B6
CZ293105B6 CZ19943032A CZ303294A CZ293105B6 CZ 293105 B6 CZ293105 B6 CZ 293105B6 CZ 19943032 A CZ19943032 A CZ 19943032A CZ 303294 A CZ303294 A CZ 303294A CZ 293105 B6 CZ293105 B6 CZ 293105B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dnase
deamidated
human dnase
human
amino acid
Prior art date
Application number
CZ19943032A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303294A3 (en
Inventor
John Frenz
Steven J. Shire
Mary B. Sliwkowski
Original Assignee
Genentech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech, Inc. filed Critical Genentech, Inc.
Publication of CZ303294A3 publication Critical patent/CZ303294A3/cs
Publication of CZ293105B6 publication Critical patent/CZ293105B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
    • C12Y301/21001—Deoxyribonuclease I (3.1.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Řešení se týká vyčištěné deamidované lidské DNázy a vyčištěné nedeamidované lidské DNázy. Je popsán způsob dělení těchto složek, farmaceutický prostředek, který obsahuje tyto složky a jeho použití u pacientů, kteří trpí plicními obtížemi.ŕ

Description

Tento vynález se týká výsledků získaných při výzkumu deoxyribonukleázy (DNázy), fosfodiesterázy, která je schopna hydrolyzovat polydeoxyribonukleovou kyselinu. Tento vynález se týká 10 forem DNázy, způsobu jejich čištění, a farmaceutického prostředku obsahující tyto formy.
Dosavadní stav techniky
Tato přihláška souvisí s předmětem popsaným v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/07 572, jejíž obsah je zde zahrnut jako citace. DNáza je fosfodiesteráza, která je schopna hydrolyzovat polydeoxyribonukleovou kyselinu. DNáza byla čištěna z různých zdrojů do různého stupně. Úplná aminokyselinová sekvence savčí DNázy byla poprvé dostupná v roce 1973. Viz např. Liao a spol.: J. Biol. Chem. 248, 1489 (1973).
DNáza má četná známá použití aje používána pro terapeutické účely. Jejím základním terapeutickým použitím je snížení viskoelasticity pulmonámích sekrecí u takových onemocnění, jako je pneumonie a cystická fíbróza, čímž se napomáhá vyčištění dýchacích cest. Viz např. Lourenco a spol.: Arch. Intem. Med. 142, 2 299 (1982), Shak a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 87, 9 188 25 (1990), Hubbard a spol.: New Engl. J. Med. 326, 812 (1992).
Byla izolována a sekvenována DNA kódující lidskou DNasu I. Tato DNA byla získána expresí v rekombinantních hostitelských buňkách, což umožnilo získávání lidské DNázy v komerčně použitelných množstvích. Viz např. Shak a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 87, 9 188 (1990). Bylo 30 zjištěno, že rekombinantní lidská DNáza (rhDNáza) je klinicky použitelná, zvláště ve vyčištěné formě, v takové, v níž DNáza neobsahuje proteinázy a další proteiny, s nimiž se obvykle vyskytuje v přírodě. Viz např. Hubbard a spol.: New Engl. J. Med. 326, 812 (1992).
Prostředky a způsoby, kterými se lidská DNáza může získávat ve farmaceuticky účinné formě, 35 jsou popsány ve shora uvedených patentových přihláškách. Odborníkům jsou známy různé specifické způsoby čištění DNázy. Viz např. Khouw a spol.: US patent č. 4 065 355 (vydaný 27. prosince 1977), Markey: FEBS Letters 167, 155 (1984) a Nefsky a spol.: Eur. J. biochem. 179.215(1989).
I když o tom v době, kdy byly podány shora uvedené patentové přihlášky, nebylo uvažováno, DNázový produkt získaný z kultur rekombinantních hostitelských buněk typicky obsahuje směs deamidované a nedeamidované formy DNázy. Existence deamidovaných forem DNázy zůstala nedoceněna přesto, že je známa deaminace zbytků asparaginu a glutaminu v některých proteinech. Viz např. Eipper a spol.: Ann. Rev. Physiol. 50, 333 (1988), Kossiakoff: Science 240, 191 (1988), Bradbury a spol.: trends in Biochem. Sci. 16, 112 (1991) a Wright: Protein Engineering
4,283(1991).
Tento vynález je založen na dříve nedoceněné skutečnosti, že rekombinantní lidská DNáza může existovat jako směs deamidované a nedeamidované formy. Způsoby podle tohoto vynálezu bylo 50 zjištěno, že deamidovaná lidská DNáza je enzymaticky méně aktivní než nedeamidovaná lidská
DNáza. Přítomnost deamidované DNázy a nedeamidované DNázy společně ve směsi a možnost další deamidace, jako například při skladování in vitro přípravků lidské DNázy, může komplikovat úsilí získat stále jednotný DNázový produkt, který se podává klinicky. Jelikož existence a vlastnosti deamidované DNázy nebyly před tímto vynálezem známy a jelikož způsoby identifi
-1 CZ 293105 B6 kování deamidované DNázy a její oddělení od přípravků DNázy, v nichž se může nalézat, nebyly zřejmé, byl vypracován tento vynález.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká způsobu oddělování lidské DNázy deamidované v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím Asn-74 původní lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy z jejich směsi, vyznačující se tím, že se směs chromatografuje a formy DNáz se oddělují na nosiči prys10 kyřice s imobilizovaným kationtovým iontoměničem.
Tento způsob ve výhodných uspořádáních se vyznačuje tím, že se směs chromatografuje na pryskyřici nebo jiném nosiči, na který je navázán kationtový polymer, jako je heparin nebo nehydrolyzovatelný analog deoxyribonukleové kyseliny (DNA), nebo se chromatografuje na tak zvaném 15 TCX nosiči (katex s prodlouženým raménkem). Tento vynález se také týká použití těchto způsobů chromatografie nelidských DNáz, jako je například hovězí DNáza.
Tento vynález se také týká deamidované lidské DNázy jako vyčištěného produktu, který v podstatě neobsahuje nedeamidovanou lidskou DNázu. Tento vynález se týká také nedeamidované 20 lidské DNázy jako vyčištěného produktu, který v podstatě neobsahuje deamidovanou lidskou
DNázu. V tomto vynálezu bylo zjištěno, že vyčištěná nedeamidovaná lidská DNáza je plně enzymaticky aktivní při srovnání s deamidovanou lidskou DNázu.
Tento vynález se týká také farmaceutických prostředků, které jako aktivní složku obsahují vyčiš25 těnou deamidovanou lidskou DNázu nebo vyčištěnou nedeamidovanou lidskou DNázu.
Tento vynález se týká také způsobu podávání terapeuticky efektivního množství vyčištěné deamidované lidské DNázy nebo vyčištěné nedeamidované lidské DNázy při léčení pacientů, například těch, kteří mají nahromaděný viskózní materiál obsahující DNA. Podávání těchto vyčištěných 30 DNáz se s výhodou provádí přímou inhalací do plic.
Tento vynález se zvláště týká způsobu léčení pacienta s onemocněním plic, jako je bronchitida, cystická fibróza nebo emfyzém, vyznačujícího se tím, že se podává terapeuticky efektivní množství vyčištěné nedeamidované lidské DNázy, zvláště přímo do cest, kterými prochází vzduch.
Tento vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují nedeamidovanou lidskou DNázu, která je k dispozici v ampulkách z umělé hmoty, popřípadě v přítomnosti farmaceuticky přijatelného vehikula.
Obrázek 1 zobrazuje sekvenci aminokyselin vzorce I
Ser Cys Thr Gly Ser Ala Leu Lys Cys Phe Phe Arg Asp Leu Ser
10 15
Ser Xaa Thr Thr Phe Phe Ser Leu Ser Ser Lys Arg Arg Lys Leu
25 30
-2CZ 293105 B6
Ser Ser Lys Asp Ile 35 Pro Asp Ser Xaa Gin His Ser Arg 40 His Leu 45
Xaa Gly His His His His Leu Arg Met Arg Gly Met Lys Leu Leu
50 55 60
Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Gin Gly Ala Val Ser
65 70 75
Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gin Thr Phe Gly Glu Thr Lys
80 85 90
Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gin Ile Leu Ser
95 100 105
Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gin Glu Val Arg Asp Ser His Leu
110 115 120
Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gin Asp Ala Pro
125 130 135
Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser
140 145 150
Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gin Val Ser
155 160 165
Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly
170 175 180
Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser
185 190 195
Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala
200 205 210
Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val
215 220 225
Tyr Leu Asp Val Gin Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu
230 235 240
Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gin
245 250 255
Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gin Trp Leu
260 265 270
Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala
275 280 285
Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Val
290 295 300
-3CZ 293105 B6
Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe
305
Leu Ser Asp Gin Leu Ala Gin Ala
320
Glu Val Met Leu Lys Xaa Ala Ala
335
Ala
346 (i) a DNA sekvence vzorce II
Asn Phe 310 Gin Ala Ala Tyr Gly 315
Ile Ser Asp His Tyr Pro Val
325 330
Pro Pro His Thr Ser Xaa Thr
340 345
TCCTGCACAG GCAGTGCCTT GAAGTGCTTC TTCAGAGACC TTTCTTCATA 50
GACTACTTTT TTTTCTTTAA GCAGCAAAAG GAGAAAATTG TCATCAAAGG 100
ATATTCCAGA TTCTTGACAG CATTCTCGTC ATCTCTGAGG ACATCACCAT 150
CATCTCAGGA TGAGGGGCAT GAAGCTGCTG GGGGCGCTGC TGGCACTGGC 200
GGCCCTACTG CAGGGGGCCG TGTCCCTGAA GATCGCAGCC TTCAACATCC 250
AGACATTTGG GGAGACCAAG ATGTCCAATG CCACCCTCGT CAGCTACATT 300
GTGCAGATTC TGAGCCGCTA TGACATCGCC CTGGTCCAGG AGGTCAGAGA 350
CAGCCACCTG ACTGCCGTGG GGAAGCTGCT GGACAACCTC AATCAGGATG 400
CACCAGACAC CTATCACTAC GTGGTCAGTG AGCCACTGGG ACGGAACAGC 450
TATAAGGAGC GCTACCTGTT CGTGTACAGG CCTGACCAGG TGTCTGCGGT 500
GGACAGCTAC TACTACGATG ATGGCTGCGA GCCCTGCGGG AACGACACCT 550
TCAACCGAGA GCCAGCCATT GTCAGGTTCT TCTCCCGGTT CACAGAGGTC 600
AGGGAGTTTG CCATTGTTCC CCTGCATGCG GCCCCGGGGG ACGCAGTAGC 650
CGAGATCGAC GCTCTCTATG ACGTCTACCT GGATGTCCAA GAGAAATGGG 700
GCTTGGAGGA CGTCATGTTG ATGGGCGACT TCAATGCGGG CTGCAGCTAT 750
GTGAGACCCT CCCAGTGGTC ATCCATCCGC CTGTGGACAA GCCCCACCTT 800
CCAGTGGCTG ATCCCCGACA GCGCTGACAC CACAGCTACA CCCACGCACT 850
GTGCCTATGA CAGGATCGTG GTTGCAGGGA TGCTGCTCCG AGGCGCCGTT 900
GTTCCCGACT CGGCTCTTCC CTTTAACTTC CAGGCTGCCT ATGGCCTGAG 950
TGACCAACTG GCCCAAGCCA TCAGTGACCA CTATCCAGTG GAGGTGATGC 1000
TGAAGTGAGC AGCCCCTCCC CACACCAGTT GAACTGCAG 1039
OD lidské DNázy I. Sekvence přírodního signálu na obrázku 1 je podtržena, potenciální iniciační 5 kodony jsou uvedeny v obdélníku a maturovaná sekvence je uvedena v hranatých závorkách.
Obrázek 2 zobrazuje korelaci mezi enzymatickou aktivitou a rozsahem deamidace vzorků lidské DNázy. Specifická aktivita byla stanovena normalizováním DNázové aktivity stanovené testem s methylzelení (MG) (v koncentračních jednotkách vzhledem ke standardní křivce) na koncent
-4CZ 293105 B6 raci DNázy změřené testem ELISA. Procenta deamidace byla stanovena mapováním po štěpení trypsinem. Vzorky lidské DNázy v „den izolace“ byly vyčištěny z kultury rekombinantních buněk CHO (buňky z vaječníků čínského křečka) expresí DNA kódující lidskou DNázu I. Tyto vzorky byly odebrány 3, 5, 7, 9, 11, 13 a 20 dnů po počátku kultivace. Vzorky s „vysokým pH“ byly vzorky vyčištěné DNázy z 13. Dne, které byly inkubovány in vitro dva dny při pH 8 a teplotě 37 °C. Vzorky „stability“ byly vzorky vyčištěné DNázy z 13. Dne, které byly různou dobu skladovány in vitro při teplotě 5,25 nebo 37 °C. Obrázek 3 je příkladem mapy štěpení trypsinem DNázy použité pro stanovení rozsahu deamidace. Vzorek, který je zde uveden, znamená ze 65 % hmotn. deamidovanou DNázu. Označení „mAU“ znamená jednotky miliabsorbance při 214 nm.
Obrázek 4 je schematické znázornění deamidace asparaginového zbytku v poloze 74 aminokyseliny (Asn-74) v přírodní lidské DNáze. Deamidace převádí Asn-74 buď na zbytek kyseliny aspartové (Asp) nebo izoaspartátu (izo-Asp). Každá z těchto tří forem DNáz poskytuje štěpením trypsinem pár peptidů, což ukazuje na identitu s příslušnou formou DNázy.
Obrázek 5 je chromatogram vzorku lidské DNázy frakcionované na TCX koloně. Tento vzorek má 67 % hmotn. deamidované DNázy.
Obrázek 6 ukazuje mapu po štěpení trypsinem dvou frakcí z dělení na TCX uvedeném na obrázku 5. Nepřítomnost tiypsinového peptidu T6-7 na mapě štěpu maxima 2 označuje nepřítomnost deamidované DNázy.
Obrázek 7 ukazuje chromatogramy několika vzorků lidské DNázy frakcionované na TCX koloně. Vzorek, který je označen „Ml-28 STD“, je přípravek lidské DNázy získané z kultury buněk CHO transformovaných DNA kódující přírodní lidskou DNázu I. Vzorek označený „DNázový ASP mutant“ znamená DNázu, která má zbytek kyseliny aspartové (spíše než zbytek asparaginu) v poloze 74 aminokyseliny a který má stejnou sekvenci aminokyselin jako Asp forma deamidované DNázy uvedené na obrázku 4. DNázový ASP mutant byl získán z kultury buněk transformovaných DNA, která kóduje tuto formu mutantu lidské DNázy. DNA kódující DNázový ASP mutant byla připravena místně řízenou mutagenezi DNA kódující přírodní lidskou DNázu. Srovnání chromatogramů ukazuje, že jedna z těchto forem lidské DNázy v Ml-28 STD se eluuje z TCX kolony ve stejné poloze jako DNázový ATP mutant.
Obrázek 8 ukazuje chromatogramy několika vzorků lidské DNázy frakcionované na koloně TSK-heparin (Toso-Hass, Montgomeryville, Pensylvánie, USA). Vzorek označený „12K#8“ je přípravek lidské DNázy získané z kultury buněk CHO transformovaných DNA kódující přírodní lidskou DNázu I. Vzorek označený „deamidovaný standard“ znamená vyčištěnou deamidovanou lidskou DNázu. Vzorek označený „nedeamidovaný standard“ se týká vyčištěné nedeamidované lidské DNázy. Vyčištěná deamidovaná lidská DNáza a vyčištěná nedeamidovaná lidská DNáza byly připraveny TCX chromatografíí.
Obrázek 9 ukazuje chromatogramy několika vzorků DNázy frakcionovaných na imobilizované koloně s DNA analogem. Vzorek označený „Ml-28“ znamená přípravek lidské DNázy získané z kultury buněk CHO transformovaných DNA kódující přírodní lidskou DNázu. Vzorek označený „deamidovaný standard“ znamená vyčištěnou deamidovanou lidskou DNázu.
Vzorek označený „nedeamidovaný standard“ se týká vyčištěné nedeamidované lidské DNázy. Vyčištěná deamidovaná lidská DNáza a vyčištěná nedeamidovaná lidská DNáza byly připraveny TCX chromatografíí. Vzorek označený „DNázový ASP mutant“ znamená DNázu, která má zbytek kyseliny aspartové (spíše než zbytek asparaginu) v poloze 74 aminokyseliny.
Pojem „lidská DNáza“ tak, jak se zde používá, znamená polypeptid s aminokyselinovou sekvencí lidské maturované DNázy I vzorce I uvedeného na obrázku I a také varianty této aminokyselinové sekvence (včetně alelických variant), které jsou enzymaticky aktivní při hydrolyzování
-5CZ 293105 B6
DNA. Pojem „lidská DNáza“ zde tedy označuje definici těch materiálů, které jsou popsány a připraveny ve shora popsaných patentových přihláškách.
Pojem „lidská DNáza“ nutně zahrnuje přírodní maturovanou lidskou DNázu, která má v poloze 74 polypeptidu zbytek asparaginu (Asn). Bylo zjištěno, že tento asparagin je citlivý na deamidaci, kterou se může připravit směs deamidované a nedeamidované formy lidské DNázy.
Deamidovaná DNáza má na místo Asn zbytku v poloze 74 aminokyseliny zbytek ky seliny aspartové (Asp) nebo izoaspartátu (izo-Asp) (viz obrázek 4).
Pojem „deamidovaná lidská DNáza“ tak, jak je zde používán, tedy znamená lidskou DNázu, která je deamidována na asparaginovém zbytku, který se nachází v poloze 74 aminokyselinové sekvence přírodní maturované lidské DNázy. Bylo zjištěno, že deamidovaná lidská DNáza může vznikat při produkci lidské DNázy rekombinantními prostředky a že se může nalézat v přípravcích lidské DNázy získané z rekombinantních hostitelských buněk. Deamidovaná lidská DNáza může vznikat také in vitro při skladování nedeamidované lidské DNázy.
I když asparaginový zbytek v poloze 7 aminokyselinové sekvence přírodní maturované lidské DNázy může být také deamidován (vedle asparaginového zbytku v poloze 74 aminokyseliny), bylo zjištěno, že taková dvojnásobně deamidovaná DNáza je enzymaticky neaktivní.
Pojem „směs“ tak, jak se zde tento pojem používá v souvislosti s přípravky lidské DNázy, znamená přítomnost jak deamidované tak nedeamidované formy lidské DNázy. Například bylo zjištěno, že v přípravcích lidské DNázy získané rekombinantní expresí je deamidováno až 50 až 80 nebo více % hmotn. lidské DNázy.
Pojem „vyčištěná deamidovaná lidská DNáza“ tak, jak se zde používá, znamená deamidovanou lidskou DNázu, která v podstatě neobsahuje nedeamidovanou lidskou DNázu. Jinými slovy, nedeamidovaná lidská DNáza bude představovat méně než 10, s výhodou méně než 5, nejvýhodněji méně než 1 % hmotn. z celkové DNázy v prostředku vyčištěné deamidované lidské DNázy.
Pojem „vyčištěná nedeamidovaná lidská DNáza“ tak, jak se zde používá, znamená nedeamidovanou lidskou DNázu, která v podstatě neobsahuje deamidovanou lidskou DNázu. Jinými slovy, deamidovaná lidská DNáza bude představovat méně než 25, s výhodou méně než 5, nejvýhodněji méně než 1 % hmotn. z celkové DNázy v prostředku vyčištěné nedeamidované lidské DNázy.
Pojem „vehikulum (excipient)“ tak, jak se zde používá, znamená farmaceuticky přijatelný materiál, který se používá společně s DNázou pro patřičné a úspěšné podávání DNázy pacientovi. Vhodná vehikula jsou dobře známa odborníkům. Jsou popsána například v příručkách „Physicians Desk Reference“, „Měrek Index“ a „Remingtonů Phatmaceutical Sciences“.
Výhodným prostředkem pro lidskou DNázu je pufrovaný nebo nepufrovaný vodný roztok, s výhodou izotonický solný roztok, jako je 150 mM chlorid sodný obsahující 1,0 mM chlorid vápenatý s pH 7. Tyto roztoky jsou zvláště přizpůsobeny pro použití v komerčně dostupných rozprašovačích, včetně tryskových rozprašovačů a ultrazvukových rozprašovačů, pro podávání, například přímo do dýchacích cest nebo do plic zasaženého pacienta. Pro další podrobnosti týkající se přípravy prostředků s lidskou DNázou a jejich podávání pro efektivní použití lze odkázat na shora uvedené patentové přihlášky.
Pojem „terapeuticky efektivní množství“ tak, jak se zde používá, znamená dávky od 1 pg do 100 mg lidské DNázy na kilogram tělesné hmotnosti pacienta, podávané ve formě farmaceutických prostředků, jak je to zde popsáno. Terapeuticky efektivní množství lidské DNázy bude záviset například na terapeutických podmínkách, na cestě podávání a na stavu pacienta. Pro lékaře tedy bude nutné přesně stanovit dávku a modifikovat způsob podávání podle potřeby tak, aby se dosáhlo optimálního terapeutického účinku. Vzhledem k rozdílům enzymatické akti
-6CZ 293105 B6 vity deamidované a nedeamidované DNázy množství vy čištěné nedeamidované DNázy potřebné pro dosažení stejného terapeutického účinku za stejných podmínek bude menší než množství vyčištěné deamidované lidské DNázy nebo množství směsi těchto dvou forem.
Vyčištěné DNázy, zvláště nedeamidovaná forma, se používají pro enzymatickou změnu viskoelasticity (pružnost) sliznic. Tak vyčištěné lidské DNázy jsou zvláště užitečné pro léčení pacientů s chorobami plic, kteří mají abnormální viskózní hnisavé sekrece, a stavů, jako je akutní nebo bronchiální onemocnění plic včetně infekčního zánětu plic, bronchitidy nebo tracheobronchitidy, bronchiektázie, cystické fibrózy, astma, tuberkulózy a plísňových infekcí. Při této léčbě se roztok nebo jemně rozemletý suchý přípravek vyčištěné deamidované lidské DNázy nebo vyčištěné nedeamidované lidské DNázy vnese konvenčním způsobem do průdušek, například vehnáním jako aerosol.
Po úspěšném klonování a expresi lidské DNázy v rekombinantních hostitelských buňkách a po usilovném výzkumu bylo objeveno, že DNázový produkt získaný touto rekombinantní expresí typicky existuje jako směs až dosud ještě nedefinovaných složek. Zvláště analýza izoelektrickou fokusací (IEF) lidské DNázy vyčištěné z kultur rekombinantních buněk CHO odhalila složitou sestavu DNázových částí. Byly stanoveny různé DNázy' jako výsledek několika posttranslačních modifikací DNázy, včetně deamidace.
Pro stanovení přítomnosti a množství deamidované DNázy v těchto přípravcích byly použity dva typy analýz. Jednou metodou je štěpení výchozího přípravku DNázy trypsinem a analýza výsledných peptidů HPLC na obrácených fázích. Při této metodě bylo změřením množství šesti deamidaci indukujících peptidů rozštěpených trypsinem stanoveno množství deamidované DNázy ve výchozím přípravku.
Další způsob zahrnuje chromatografii výchozího přípravku DNázy na TCX koloně. Bylo objeveno, že TCX kolona je schopna oddělit deamidovanou lidskou DNázu od nedeamidované DNázy. Každá tato forma může být tedy účinně oddělena od druhé a získána tak ve vyčištěném stavu. Při tomto způsobu se množství deamidované DNázy a nedeamidované DNázy ve výchozím přípravku stanovuje změřením ploch maxim, které odpovídají odděleným formám DNázy na chromatogramech.
I když tyto dva způsoby jsou při stanovování a kvantitativním vyhodnocení deamidované DNázy přibližně stejně účinné, TCX způsob je zvláště účinný, vyžaduje daleko méně času a práce než druhý způsob. Navíc TCX chromatografíe poskytuje prostředky pro oddělení deamidované formy od nedeamidované formy DNázy, zatímco konvenční katexy a různé další chromatografické pryskyřice, které byly analyzovány, nejsou schopny toto dělení provést.
Obecné principy TCX chromatografíe byly popsány například Millerem: J. Chromatography 510, 133 (1990), Janzenem a spol.: J. Chromatography 522, 77 (1990) a Heamem a spol.: J. Chromatography 548, 117 (1991). Aniž bychom tento vynález omezili nějakým zvláštním mechanismem nebo teorií, předpokládá se, že zbytek Asn-74 lidské DNázy, který je citlivý na deamidaci, je umístěn uvnitř DNA vazebné drážky enzymu, analogicky jako je tomu u známé krystalové struktury hovězí DNázy. Tato DNA-vázající drážka obsahuje bazické aminokyselinové zbytky (aby navázala DNA) a tato drážka je zřejmě přístupná pro ligandy použitého TCX, ale nikoliv pro mnohem kratší ligandy konvenčních katexů. Ligandy TCX pravděpodobně napodobují substráty přírodní nukleové kyseliny. Očekává se tedy, že TCX chromatografíe bude užitečná pro čištění dalších nukleáz, jako je ribonukleóza (RNáza) nebo restrikční endonukleázy, a také proteinů vázajících DNA.
Oddělení deamidovaných a nedeamidovaných forem DNázy může být doprovázeno chromatografií na pryskyřici nebo jiné nosné matrici, která obsahuje kovalentně navázané kationtové polymery, jako je heparin nebo syntetický nehydrolyzovatelný analog DNA. Chromatografické kolony s imobilizovaným heparinem jsou komerčně dostupné (např. od firmy Toso Haas Co.,
-7CZ 293105 B6
Montgomeryville., Pensylvánie, USA). Nehydrolyzovatelné DNA analogy byly popsány například Spitzerem a spol.: Nucl. Acid: Res. 16, 11 691 (1988). Kolona s mobilizovaným nehydrolyzovatelným analogem DNA se konvenčně připravuje tak, že se syntetizuje DNA analog se skupinou aminové kyseliny na 3-konci jednoho nebo obou jeho doplňkových vláken. Aminová skupina je pak dostupná pro kondenzaci s kolonou aktivovanou epoxidovou skupinou, jak je to popsáno například v literatuře publikované firmou Rainin Biochemical LC Products (Wobum, Massachusetts, USA).
Po úspěšném oddělení deamidované a nedeamidované lidské DNázy způsoby podle tohoto vynálezu bylo zjištěno, že deamidovaná DNáza má sníženou enzymatickou aktivitu ve srovnání s nedeamidovanou lidskou DNázou podle analýzy methylzelení (MG). Kumick: Arch. Biochem. 29, 41 (1950). Bylo zjištěno, že deamidovaná lidská DNáza vykazuje právě přes polovinu enzymatické aktivity nedeamidované lidské DNázy. Spojením vyčištěné deamidované DNázy a vyčištěné nedeamidované DNázy podle tohoto vynálezu v různých poměrech je tedy možné připravit farmaceutické prostředky lidské DNázy, které mají žádanou specifickou aktivitu v rozmezí mezi specifickými aktivitami jednotlivých složek, což může být optimální pro léčení příslušných onemocnění.
Následující příklady jsou pouze způsobem ilustrace vynálezu. Nejsou zamýšleny jako jakékoliv omezení tohoto vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Mapování štěpením trypsinem
Postup použitý pro mapování lidské DNázy štěpením trypsinem je souhrnně shrnut do následujících stupňů:
Stupeň 1:
Koncentrace vzorku (1 mg) DNázy se upraví na 4 mg/ml koncentraci na zařízení Amicon Centricon-10 nebo zředěním vehikulem. Konečný objem: 250 μΐ.
Stupeň 2:
Ke vzorku se přidá 250 μΐ předem připraveného pufru (40 mM bis-ris, 10 mM EGTA, pH 6,0). Směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C.
Stupeň 3:
Pufrovaný vzorek se dá do štěpícího pufru (100 mM Tris, pH 8) pomocí kolony Pharmacia NAP-5. Konečný objem: 1 ml.
Stupeň 4:
Ke vzorku se přidá 10 μΐ roztoku trypsinu (1 mg/ml trypsinu, 1 mM HCI) a směs se inkubuje 2 hodiny při 37 °C.
Stupeň 5:
Ke vzorku se přidá 10 μΐ podíl roztoku trypsinu a směs se inkubuje další 2 hodiny při 37 °C.
-8CZ 293105 B6
Stupeň 6:
Štěpení se zastaví přidáním 6 μΐ trifluoroctové kyseliny (TFA). Vzorek se skladuje při teplotě 5 °C nebo nižší dokud se nechromatografuje.
Stupeň 7:
Směs peptidů se rozdělí HPLC za následujících podmínek:
kolona: Nucleosil Cl8, 5 pm, 1 000 nm, 2,0 x 150 mm (Alltech, Co., Deerfield, Illinois, USA), teplota kolony: 40 °C, eluent A: 0,12 % TFA ve vodě, eluent B: 0,10 % TFA v acetonitrilu, gradientový profil:
doba (min) % A %B
0 100 0
5 100 0
65 40 60
69 5 95
70 5 95
průtok: 0,25 ml/min, objem injektovaného roztoku: 250 μΐ, doba reekvilibrace po eluci při 100 % A: 20 minut, teplota komůrky automatického zásobníku: 5 °C, detekce: absorbance při 214 a 280 nm.
Stupeň 8:
Identifikují se peptidy (získané štěpením trypsinem): T7, (D)T7, T7-8, (D) T708, T6-7-8 a T6-7 podle retenčního času ve srovnání se standardem.
Stupeň 9:
Integruje se chromatogram získaný při 280 nm. Zkontroluje se kvalita integrace kontrolou základní čáry a oddělení blízko sebe se eluujících maxim. Zvláštní pozornost se musí věnovat rozdělení brzy vycházejících peptidů T7 a (D)T7, které nemusí být dobře rozděleny.
Stupeň 10:
Normalizují se plochy maxim šesti reportérových peptidů na obsah tyrosinu. Každý z peptidů T7, (D)T7, T7-8, a (D) T7-8 obsahuje jeden zbytek Tyr, zatímco T6-7-8 a T6-7 obsahují tři zbytky Tyr. Vypočte se poměr deamidovaných částí na základě normalizovaných ploch maxim (D)T7, (D)T7-8, T6-7-8 a T6-7 vzhledem k celkové normalizované ploše maxim šesti peptidů.
-9CZ 293105 B6
Pro přesné provedení mapování štěpení trypsinem ke stanovení deamidované DNázy podle shora uvedeného postupuje potřeba jeden miligram DNázy v objemu 250 μΐ. počáteční příprava vzorku pro tento způsob tedy vyžaduje buď zahuštění nebo zředění vzorku. DNáza je v přítomnosti vápníku velice odolná vůči proteinázám, včetně trypsinu. Dalším stupněm tohoto postupuje tedy částečné odstranění vápenatých iontů zpracováním s [ethylenbis(oxyethylennitril)]tetraoctovou kyselinou (EGTA). Nadbytečné zpracování s EGTA může denaturovat a agregovat DNázu, takže tento stupeň se musí provádět pečlivě. Vzorek zpracovaný s EGTA v objemu 0,15 ml se potom vnese do 1 ml štěpícího pufru, přidá se trypsin a vzorek se inkubuje dvě hodiny při 37 °C. přidá se druhý podíl trypsinu a vzorek se inkubuje další dvě hodiny. Štěpení se zastaví okyselením. Vzorek se buď skladuje pro pozdější analýzu nebo se přímo nanese na HPLC kolonu.
250 pl (250 μg) směsi peptidů získané štěpením trypsinem se rozdělí na HPLC koloně s obrácenými fázemi podle shora popsaných podmínek. Typická mapa štěpení trypsinem je uvedena na obrázku 3. HPLC byla prováděna na přístroji Hewlett-Packard model 1090MHPLC. Výtok z kolony byl sledován detektorem současně při 214 a 280 nm. Jelikož je pro kvantitativní vyhodnocení deamidované DNázy rozhodující první část peptidové mapy, jak je to popsáno níže, nejsou pro tuto analýzu vhodné jiné přístroje s větším zpožděním gradientu a dalšími objemy kolony. Každá analýza podle tohoto postupu vyžaduje 70 minut pro gradientově oddělení a 20 minut pro reekvilibraci kolony, celkový čas HPLC je tedy 90 minut. Princip a postup integrace maxim pro stanovení deamidované DNázy ve vzorku jsou popsány níže.
K deamidaci lidské DNázy dochází alespoň na asparaginovém zbytku, který je přítomen v poloze 74 aminokyseliny (Asn-74) v přirozené maturované lidské DNáze. Asn-74 je na Ckonci místa štěpení trypsinem na argininovém zbytku v poloze 73 aminokyseliny (Arg-73), jak je vidět ze seznamu očekávaných peptidů lidské DNázy při štěpení trypsinem, který je uveden v tabulce I.
-10CZ 293105 B6
Tabulka I
Peptidy, od kterých se očekává, že budou vznikat při štěpením přírodní maturované lidské DNázy trypsinem
id.č. zbytky sekvence aminokyselin peptidu
T1 1 až 2 LK
T2 3 až 15 1AAFNIQTFGETK (sekvence vzorce III)
T3 16 až 31 MSNATLVSYIVQILSR (sekvence vzorce IV)
T4 32 až 41 VDIALVQEVR (sekvence vzorce V)
T5 42 až 50 DSHLTAVGK (sekvence vzorce VI)
T6 51 až 73 LLDNLNQDAPDTYHYWSEPLGR (sekvence vzorce VII)
T7 74 až 77 NSYK (sekvence vzorce Vlil)
T8 78 až 79 ER
T9 80 až 111 YLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNR
(sekvence vzorce IX)
T10 112až117 EPAIVR (sekvence vzorce X)
T11 118 až 121 FFSR (sekvence vzorce XI)
T12 122 až 126 FTEVR (sekvence vzorce XII)
T13 127 až 157 EPAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDVQEK
(sekvence vzorce XIII)
T14 158 až 185 WGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIR
(sekvence vzorce XIV)
T15 186 až 213 LWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDR
(sekvence vzorce XV)
T16 214 až 222 IWAGMLLR (sekvence vzorce XVI)
T17 223 až 260 GAWPDSALPFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK
(sekvence vzorce XVII)
Místo zbytku Asn (v jednopísmenkovém označení „N“) v poloze 74 v přírodní nedeamidované lidské DNáze má deamidovaná lidská DNáza buď zbytek Asp nebo izo-Asp, jak je to uvedeno na obr. 4. Izo-Asp je izomemí, - aminokyselinová forma kyseliny aspartové. Peptidová vazba mezi Arg-73 a izo-Asp je odolná vůči štěpení trypsinem, takže deamidovaná lidská DNáza poskytuje ío při štěpení trypsinem charakteristický peptid, který obsahuje zbytky 51 až 77 a nazývá se T6-7, protože jde o spojené peptidy T6 a T7. Za podmínek, které jsou použity pro štěpení trypsinem,
-11 CZ 293105 B6 peptidová vazba Arg-73-Asn-74 v nedeamidované lidské DNáze a peptidová vazba Arg-73Asp-74 v Asp formě deamidované lidské DNázy jsou štěpeny trypsinem.
Nedeamidovaná DNáza v mapě štěpení trypsinem je tedy indikována přítomností peptidu T7 uvedeného v tabulce I, zatímco Asp-74 forma deamidované lidské DNázy je v této mapě indikována přítomností deamidovaného T7 peptidu, který se nazývá (D)T7. Tyto tři formy reportérové peptidy jsou označeny na obrázku 3. Naneštěstí trypsin pouze částečně štěpí peptidovou vazbu na C-konci T7, mezi zbytky 77 a 78, takže každý z reportérových peptidu T7, (D)T7 a T6-7 mají T8-konjugát, T7-8, (D)T7-8 as T6-7-8. Těchto šest reportérových peptidů musí být tedy objasněno, aby se kvantitativně vyhodnotila deamidovaná lidská DNáza štěpením trypsinem. V zásadě peptidy (D)T7, (D)T7-8, T6-7 a T6-7-8 představují deamidovanou lidskou DNázu a peptidy T7 a T7-8 představují nedeamidovanou lidskou DNázu. Znalosti relativních poměrů těchto peptidů umožňují přímý výpočet rozsahu deamidace při přípravě frakce vzorku, kterou představuje deamidovaná DNáza, je potřeba znát molámí poměry deamidovaných a nedeamidovaných částí.
Při způsobu mapování štěpením trypsinem existují dva další problémy, které musí být překonány. Jedním je chromatografický problém, druhým je problém detekce. Chromatografický problém spočívá v tom, že peptid T2 je eluován současně s peptidem T6-7, což zabraňuje integraci přesné plochy maxima tohoto peptidu indukujícího deamidaci. Tento problém lze překonat integrací chromatogramu získaného při 280 nm, neboť všech šest relevantních peptidů má alespoň jeden trypsinový zbytek (Tyr), takže silně absorbují při 280 nm, zatímco peptid T2 neobsahuje žádný Tyr nebo tryptofanový (Trp) zbytek a tedy při této vlnové délce absorbuje pouze zanedbatelně: Detekční problém spočívá v tom, že peptidy T6-7 a T6-7-8 obsahují po třech Tyr zbytcích, zatímco další čtyři peptidy pouze po jednom zbytku. Peptidy obsahující Tómají tedy vyšší molární absorptivitu než peptidy, které obsahují pouze T7. Jednoduché srovnání ploch maxim vede tedy k tendenci přeceňovat obsah deamidovaných částí ve vzorku. Tento problém se překoná normalizováním ploch maxim šesti peptidů na počet Tyr zbytků v peptidu. Normalizování ploch maxim tímto způsobem v sobě zahrnuje to, že všechny tyrosinové zbytky v každém z peptidů mají ekvivalentní chemické okolí, což je možná dobrý předpoklad u relativně malých peptidů, jako jsou ty, které jsou zde uvažovány. Po normalizaci se mohou srovnávat plochy maxim deamidovaných a nedeamidovaných peptidů, čímž se dojde k posouzení obsahu deamidované DNázy ve vzorku.
Příklad 2
Chromatografíe na TCX
TCX-pryskyřice (katex s prodlouženým raménkem) na rozdíl od konvenčních katexů má polyiontové ligandy navázané na povrch oxidu křemičitého. O ligandech kolony LiChrospher(R) 1000 SO3' (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, USA) používaných v tomto příkladu se uvádí, že obsahují mezi 25 a 50 sulfopropylovými skupinami podél polyethylenového základního řetězce, který je napojen na jeden konec povrchu oxidu křemičitého. TCX chromatogram vzorku rekombinantní lidské DNázy na koloně LiChrospher(R) 1000 SOfje uveden na obr. 5. Rekombinantní lidská DNáza se vyčistí z kultur buněk CHO transformovaných DNA kódující lidskou DNázu. Shak a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 87, 9 198 (1990), Shak a spol.: spis mezinárodní patentové přihlášky č. WO 90/07 572 (publikované 12. července 1990).
Dvě získaná maxima byla spojena a podrobena několika analýzám, aby byla identifikována jako formy DNázy lišící se pouze zbytkem v poloze 74 aminokyseliny. Obrázek 6 ukazuje mapy štěpení trypsinem těchto dvou maxim izolovaných z TCX kolony. Tyto mapy potvrzují, že jde o deamidovanou a nedeamidovanou formu lidské DNázy. Mapa štěpení trypsinem také ukázala, že v prvním maximu z TCX dělení jsou přítomny obě formy deamidované DNázy (s Asp a izo-Asp v poloze 74 aminokyseliny). Tabulka II ukazuje specifické aktivity změřené pro tato
-12CZ 293105 B6 dvě maxima, které potvrzují vzájemný vztah mezi deamidací a specifickou aktivitou, na kterou je usuzováno z korelace uvedené na obr. 2, a dále podrobují identifikaci TCX frakci. Aktivita DNázové frakce byla stanovena testem s methylzelení (MG).
Tabulka II
Aktivity frakcí získaných z TCX kolony (koncentrace MG a EL1SA jsou průměrem ze stanovení dvou vzorků).
vzorek MG (pg/ml) ELISA (pg/ml) specifická aktivita
výchozí přípravek rekombinantní lidské DNázy (náplň) 8315 7828 1,06
TCX maximum 1 (deamidovaná) 85,3 119,7 0,71
TCX maximum 2 (nedeamidovaná) 149,2 99,4 1,50
Mutovaná forma lidské DNázy, která má zbytek Asp v poloze 74 aminokyseliny, se připravuje místně řízenou mutagenezí DNA kódující přírodní maturovanou DNázu. Tento mutant současně s prvním maximem získaným ve shora uvedené chromatografii, jak ukazuje obrázek 7.
Následující postup je postup s TCX LiChrospher(R) 1000 SO3-. Jiným TCX nosičem s podobnými použitím pro dělení deamidované a neamidované formy DNázy je TCX Fractogel(R) (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, USA). LiChrospher a Fractogel jsou registrované obchodní značky EM Industries, Inc.m Hawthom, N.Y., USA nebo E. Měrek, Darmstadt, SRN. Zdá se, že nejlepší výsledky v dnešní době poskytují “silné“ formy TCX (ať jde o DiChrospher nebo Fractogel), které mají funkční skupinu SO3).
Příklad 3
Postup plnění HPLC kolony nosičem LiChrospher(R) 1000 SO3~
a) Materiály a zařízení
1. Superúčinná skleněná kolona (1,0 cm krát 5,0 cm).
2. Plnicí pufr:10mM octan sodný, ImM chlorid vápenatý, upravit pH do 4,5 kyselinou octovou, zfiltrovat 0,2μ filtrem.
3. Zásobní nádržka pro kolonu o obsahu 20 ml (Alltech díl č. 9501 nebo ekvivalentní).
4. Prázdná kolona z nerez oceli (4,6 mm krát 50 mm) s 0,5 pm uzavřenými fritami.
5. HPLC pumpa, která má schopnost udržovat tlak 14MPa (model Waters 510 nebo ekvivalentní).
b) Postup plnění
1. Definování pryskyřice:
a) Rozbalí se skleněná kolona s vysokou účinností (1,0 cm krát 5,0 cm) (základní objem: 3,93 ml pryskyřice). Pryskyřice se resuspenduje na objem 20 ml v průhledné, skleněné, uzavřené nádobce plnicím pufrem. Rozmíchá se na kaši tak, aby se vytvořila jednotná suspenze, která se rozdělí na dva 10 ml podíly. Ke každému podílu se přidá 10 ml plnicího pufru, takže se získají suspenze o objemu přibližně 1,95 ml pryskyřice ve 20 ml plnicího pufru.
-13CZ 293105 B6
b) Pryskyřice se rozmíchá na kaši tak, aby se získala jednotná suspenze. Tato suspenze se nechá usazovat, dokud částice nevytvoří pevný základ na dně nádoby (2 až 4 hodiny). Supernatant, který obsahuje jemné částice, se pečlivě odlije.
c) K pryskyřici se přidá 20 ml plnicího pufru a zopakuje se stupeň ad b). Tento postup by se měl zopakovat alespoň čtyřikrát, aby se zajistilo odstranění všech jemných částeček pryskyřice.
2. Plnění kolony:
a) Spojí se prázdná HPLC kolona (4,6 mm x 50 mm) s plnicí zásobní nádobkou. Pryskyřice se rozmíchá ve 20 ml plnicího pufru.
b) Kašovitá pryskyřice se přidá do zásobní nádobky' a rychle se uzavře. Plnicí pufr se pumpuje za tlaku, který nepřevyšuje 14 MPa. Průtok se upraví tak, aby plnicí tlak zůstával konstantní kolem 14 MPa a po stabilizování tlaku se nechá téci 15 minut. Kolona se odpojí a připojí se horní konec. Tato kolona se může používat přímo nebo se může skladovat v 0,02 % (hmotn.) azidu sodném.
U většiny vzorků, včetně DNázy připravené ve 150 mM chloridu sodném, není před injektováním vzorku na kolonu potřeba žádná příprava vzorku. Kolona se ekvilibruje octanovým pufrem o pH 4,5, který obsahuje vápenaté ionty, vzorek se nanese na kolonu injekční jehlou a kolona se pak eluuje solným gradientem. Pro dělení deamidované od nedeamidované formy lidské DNázy v malém měřítku se použije následující postup. Poměry ploch maxim na výsledném chromatogramu jsou shodné s poměry deamidované a nedeamidované DNázy ve vzorku.
Stupeň 1:
Naplní se vzorek obsahující až 150 mM NaCl při pH až 9 do nádobky automatického zásobníku. Vzorky kapaliny kultury izolovaných buněk vyžadují úpravu pH na 4,5 a odstřeďování, aby se odstranily proteiny, které nejsou rozpustné v pufrech používaných v tomto postupu.
Stupeň 2:
Dvě formy DNázy se dělí na HPLC za následujících podmínek:
kolona: TCX LiChrospher(R) 1000 SO3~ se opětovně naplní do kolony z nerezavějící ocele. Plní se kolona o rozměrech 4,6 x 50 mm a 4,6 x 150 mm, teplota kolony: teplota místnosti, eluent A: 10 mM octan sodný, 1 mM chlorid vápenatý, pH 4,5, eluent B: 1 M chlorid sodný v pufru A, gradientový profil:
doba (min.) % hmot. A % hmot. B
0 100 0
4 100 0
30 30 70
30,1 5 95
37 5 95
průtok: 0,8 ml/min (50 mm kolona), 0,5 ml/min (150 mm kolona), objem injektovaného vzorku: až 250 μΐ,
- 14CZ 293105 B6 reekvilibrační doba kolony při 100 % hmotn. A: 20 min, teplota komůrky automatického zásobníku vzorků: 5 °C, detekce: absorbance při 280 nm.
Stupeň 3:
Integruje se chromatogram. Vypočte se podíl deamidovaných částí na základě ploch maxim dříve eluované deamidované DNázy vzhledem k celkové ploše obou forem.
TCX chromatografie poskytuje také prostředky pro dělení deamidované a nedeamidované DNázy ve velkém měřítku. Dělení ve velkém měřítku se výhodněji provádějí za jednodušších elučních podmínek než jsou shora popsané eluční podmínky pro analytická dělení obou forem DNázy v malém měřítku. Dělení ve velkém měřítku se tedy provádí na TCX nosiči Fractogel podle následujícího postupu:
Stupeň 1:
Kolona 31.6 (1,6 cm vnitřní průměr krát 15,7 cm výška) se naplní TCX nosičem Fractogel EMD SO3“ 650M (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, USA).
Stupeň 2:
DNázová náplň se diafiltruje ekvilibračním pufrem (30 mM octan sodný (NaOAc), 1 mM chloridem vápenatým (CaCl2), 50 mM chloridem sodným (NaCl). pH 5). Ultrafiltrací se zahustí na objem 355 ml a koncentraci 2,5 mg/ml.
Stupeň 3:
Kolona se promyje 2,5 objemy kolony (CV) 2 % (hmotn.) hydroxidu sodného (NaOH).
Stupeň 4:
Kolona se promyje 2,5 CV předekvilibračního pufru (300 mM NaOAc, 1 M NaCl, pH 5).
Stupeň 5:
Kolona se promyje 2,5 CV ekvilibračního pufru.
Stupeň 6:
Kolona se naplní 1 až 1,3 g diafiltrované/ultrafiltrované DNázy (ze stupně 2). Po naplnění DNázou se začnou shromažďovat frakce eluentu z kolony.
Stupeň 7:
Kolona se promyje 5 CV ekvilibračního pufru.
Stupeň 8:
Kolona se promyje 5 CV promývacího pufru (25 mM sukcinát, 1 mM chlorid vápenatý, pH 5,3).
-15CZ 293105 B6
Stupeň 9:
Kolona se promyje 10 CV promvvacího pufru o pH 5,4 (25 mM sukcinát, 1 mM chlorid vápenatý, pH 5,4).
Stupeň 10
Kolona se promyje 10 CV promývacího pufru o pH 6 (24 mM MES, 1 mM chlorid vápenatý, pH 6,0).
Stupeň 11:
Spojí se frakce shromážděné během stupňů 6 až 8. Získá se tak směs, která převážně obsahuje deamidovanou DNázu. Spojí se frakce shromážděné ve stupni 10. Získá se tak nedeamidovaná DNáza. Frakce, které se shromáždí během stupně 9, obsahují směs dvou forem DNázy a mohou se recyklovat. Shora popsaný protokol je jedním příkladem použití TCX nosiče pro preparativní vyčištění dvou forem rekombinantní lidské DNázy způsobem, kterým je možno provádět izolaci vyčištěné deamidované a vyčištěné nedeamidované DNázy ve velkém měřítku.
Příklad 4
Chromatografie na heparinu a imobilizovaném analogu DNA. Na chromatogramech na obr. 8 jsou analýzy na koloně s nosičem TSK-Heparin (Toso Haas, Montgomeryville, Pensylvánie, USA) vzorků, které obsahují buď směs deamidovaných a nedeamidovaných forem lidské DNázy, vyčištěnou deamidovanou lidskou DNázu nebo vyčištěnou nedeamidovanou lidskou DNázu. Kolona s nosičem TSK-Heparin byla podrobena stejným podmínkám jako je shora popsáno pro analytickou TCX kolonu. Seřazené chromatogramy ukazují, že kolona s imobilizovaným heparinem dělí deamidovanou a nedeamidovanou formu DNázy.
Jak bylo shora uvedeno, jiným způsobem dělení deamidované a nedeamidované formy DNázy je používat kolonu, která obsahuje imobilizovaný analog DNA, který je rezistentní na hydrolýzu působením DNázy. Jedním příkladem tohoto přístupu ke koloně s imobilizovaným analogem DNA je syntéza fosforthioátového oligonukleotidu 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCNH3 3 . Tato samo-doplňková sekvence se může anelovat na dvouvláknovou formu a navázat na Rainin HydroporeEP kolonu (Rainin Co., Wobum, Massachusetts, USA). Obrázek 9 ukazuje seřazené chromatogramy analýz vzorků, které obsahují buď směs deamidované a nedeamidované formy lidské DNázy, vyčištěné deamidované lidské DNázy, vyčištěné nedeamidované lidské DNázy nebo vyčištěné mutované lidské DNázy se zbytkem kyseliny aspartové (spíše než asparaginovým zbytkem) v poloze 74 aminokyseliny, z této kolony. Analýzy na této koloně se provádějí v pufru, který obsahuje 1 mM chlorid vápenatý a 5 mM MES při pH 6, a eluují se lineárním gradientem do 1M koncentrace chloridu sodného 20 minut při průtoku 1 ml/min. Jak je uvedeno na obrázku 9, za těchto podmínek se od sebe částečně oddělí deamidovaná a nedeamidovaná forma DNázy. Navíc se na této koloně rozdělí také dvě izomemí formy deamidované DNázy, které se liší v poloze 74 sekvence aminokyselin DNázy tím, že v této poloze mají buď kyselinu aspartovou nebo kyselinu izoaspartovou. Další výhodou tohoto chromatografického způsobu je tedy to, že umožňuje izolaci dvou izomerů, které vznikají při deamidaci lidské DNázy.
-16CZ 293105 B6
Příklad 5
Enzymatická aktivita deamidované lidské DNázy a nedeamidované lidské Dnázy
Pro zkoumání vlivu deamidace na enzymatickou aktivitu lidské DNázy bylo použito několik analytických metod. Vyčištěná deamidovaná lidská DNáza a vyčištěná nedeamidovaná lidská DNáza pro použití v těchto studiích byly připraveny shora popsanou TCX chromatografii.
Podle jednoho způsobu stanovení enzymatické aktivity DNázy se syntetická dvouvláknová DNA o délce 25 párů nukleotidů na jednom konci označí dinitrofenolem (DNP) a na druhém konci biotinem. Hydrolýza substrátu DNázou se detekuje zachycením reakčních produktů na mikrotitrovací desce s jamkami potaženými protilátkou na DNP a kvantitativním vyhodnocením neporušené sondy streptavidin-křenovou peroxidázou. Specifická aktivita stability vzorků byla korelována (r2 = 0,613; n = 5) s rozsahem deamidace DNázy (v rozsahu 27 až 95 % hmot.). Extrapolace lineární rovnice nejmenších čtverců poskytla očekávaný výsledek, že specifická aktivita deamidované lidské DNázy byla přibližně o 77 % nižší než nedeamidované lidské DNázy.
Jiný způsob stanovení enzymatické aktivity DNázy zahrnuje hydrolýzu chromogenního substrátu p-nitrofenyl-fenylfosfátu (PNPP), jak to popsali Liao a spol.: Biochem. J. 255, 781 (1988). Kinetiky PNPP hydrolýzy lidskou DNázou jsou esovité a odpovídají Hillově rovnici nelineární regrese. Tímto způsobem byla stanovena Vmax plně deamidované lidské Dnázy jako o 77 % menší než u nedeamidované lidské DNázy. Koncentrace substrátu pro polovinu maximální aktivity (So,s) se významně nelišila pro vzorky deamidované a nedeamidované lidské DNázy.
Jiným způsobem stanovení enzymatické aktivity DNázy je test popsaný Kunitzem: J. Gen. Physiol. 33, 349 (1950), s výhodou modifikovaný tak, že enzymatická reakce se provádí při pH 7,0 až 7,5. Také podle tohoto způsobu byla enzymatická aktivita deamidované lidské DNázy nižší než aktivita nedeamidované lidské DNázy.
Příklad 6
In vitro skladování lidské Dnázy
Lidská DNáza vyčištěná z rekombinantních buněk CHO se rozpustí na koncentraci 4 mg/ml v nepufrovaném vodném roztoku 150 mM NaCl a 1 mM CaCl2. Vzorky výsledného roztoku DNázy se pak přenesou do skleněných ampulek a ampulek z umělé hmoty. Byly použity dva různé typy ampulek z umělé hmoty, jeden vyrobený z umělé pryskyřice Dupont 20 (vyráběné E.I. du Pont de Nemours and Co., Inc., Wilmington, Delaware, USA), druhý vyrobený z umělé pryskyřice Escorene (vyráběné firmou Exxon Corp.). Obě tyto umělé hmoty jsou polyethylen o nízké hustotě. Mohou se však používat nádobky vyrobené z jiných umělých hmot, jako je polypropylen, polystyren nebo další polyolefiny. Ampulky obsahující roztok DNázy se skladují buď při -70 °C, 2 až 8 °C nebo 25 °C. Původně se deamidovalo 60 až 65 % hmotn. DNázy v roztocích.
Roztoky DNázy v ampulkách byly po počátečním uložení několikrát analyzovány, aby se stanovil rozsah deamidace DNázy. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v tabulce III.
-17CZ 293105 B6
Tabulka III
Deamidace (%hmotn.) rekombinantní lidské DNázy skladované ve skleněných ampulkách a ampulkách z umělé hmoty
vzorek den -70 °C 2až8°C 25 °C
sklo 83 66 66 78
174 63 66 81
Dupont 20 83 65 66 71
174 63 63 70
Escorene 83 65 66 71
174 64 62 70
Při skladování při teplotě -70 °C nebo při teplotě 2 až 8 °C nebyl po 83 a 174 dnech nalezen žádný rozdíl v množství deamidované DNázy v ampulkách z umělé hmoty a množství deamidované DNázy v ampulkách ze skla. V všech těchto případech množství deamidované DNázy v ampulkách bylo přibližně 64 % hmotn (± 2 % hmotn.) z celkové DNázy.
Po 83 nebo 174 dnech skladování při teplotě 25 °C byl však nečekaně zjištěn rozdíl mezi množstvím deamidované DNázy v ampulkách z umělé hmoty a množstvím deamidované DNázy ve skleněných ampulkách.
Významně méně deamidované DNázy bylo přítomno v ampulkách z umělé hmoty. Zvláště po 83 dnech skladování při teplotě 25 °C bylo ve skleněných ampulkách zjištěno 78 % hmotn. deamidované DNázy, zatímco v ampulkách z umělé hmoty pouze kolem 70% hmotn. Po 174 dnech skladování při 25 °C ve skleněných ampulkách bylo 81 % hmotn. deamidované DNázy, zatímco v ampulkách z umělé hmoty pouze kolem 71 % hmotn. deamidované DNázy z celkového množství DNázy.
Aniž by se brala v úvahu jakákoliv teorie nebo mechanismus, rozdíly v deamidacích DNázy v ampulkách ze skla a z umělé hmoty mohou být důsledkem rozdílného pH roztoku v ampulkách. Původní pH roztoku DNázy ve skleněných ampulkách bylo nepatrně vyšší než pH v ampulkách z umělé hmoty (přibližně 6,7 a 6,5). Hodnota pH roztoků DNázy ve skleněných ampulkách se časem nepatrně zvyšovala (na přibližně 6,9 po 83 dnech skladování při 25 °C a na přibližně 7,0 po 174 dnech skladování při téže teplotě), možná jako důsledek křemičitanů nebo iontů z povrchu skal rozpouštějících se v roztoku. Při vyšším pH se rychlost deamidace lidské DNázy zvyšuje. Jelikož nebylo vyhodnoceno, že k deamidaci lidské DNázy dochází při zvýšeném pH, uspořádáním tohoto vynálezu je připravovat a/nebo skladovat lidskou DNázu v roztocích, které mají kyselé pH, typicky 4,5 až 6,8 nejvýhodněji 5,0 až 6,8.
Významného zvýšení stability lidské DNázy v roztoku se tedy dosáhne tím, že se tento roztok DNázy umístí raději do ampulek z umělé hmoty než do ampulek skleněných. Časem zřetelně dochází k nižší deamidaci DNázy v ampulkách z umělé hmoty než v ampulkách skleněných. Toto zjištění může být zvláště důležité při výběru adjustace lidské DNázy pro terapeutické použití, kde je zvláště žádoucí, aby lidská DNáza byla skladovatelná po prodlouženou dobu bez významné ztráty enzymatické aktivity. Stejně užitečné budou i skleněné ampulky s neskleněnými potahy, například s vložkami z umělé hmoty. Co je důležité je to, aby se skladovaná DNáza vyhnula kontaktu se sklem, zvláště při skladování přesahujícím 15 až 30 dnů.
Předcházející popis podrobně specifikuje způsoby, které se mohou používat při praktickém využívání tohoto vynálezu. Jakmile existují podrobné specifické způsoby používané pro identifikování, charakterizování, dělení a používání čisté deamidované a nedeamidované lidské DNázy a další popis specifických modelových systémů, zručný odborník je schopen odvodit alternativní způsoby získání stejných informací využitím plodů tohoto vynálezu. I když předchozí text je
-18CZ 293105 B6 jakkoliv podrobný, nebyl konstruován jako omezení celkového rozsahu tohoto vynálezu; spíše je rozsah tohoto vynálezu stanoven pouze zákonnou konstrukcí připojených nároků.

Claims (11)

1. Způsob oddělování lidské DNázy deamidované v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím Asn-74 původní lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy z jejich směsi, vyznačující se tím, že se směs chromatografuje a formy DNáz se oddělují na nosiči pryskyřice s imobilizovaným kationtovým iontoměničem.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se směs chromatografuje a formy DNáz se oddělují na nosiči pryskyřice s imobilizovaným heparinem.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se směs chromatografuje a formy DNáz se oddělují na nosiči pryskyřice s nehydrolyzovatelným analogem DNA.
4. Čištěná částečně deamidovaná lidská DNáza, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou DNázu nedeamidovanou v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím ASn-74 přirozené lidské DNázy a lidskou DNázu deamidovanou v aminokyselinovém zbytku, kde je deamidovaná DNáza přítomna v množství menším než 25 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v kompozici.
5. Čištěná částečně deamidovaná lidská DNáza, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou DNázu nedeamidovanou v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím ASn-74 přirozené lidské DNázy a lidskou DNázu deamidovanou v aminoky selinovém zbytku, kde je deamidovaná DNáza přítomna v množství menším než 5 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v kompozici.
6. Čištěná částečně deamidovaná lidská DNáza, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou DNázu nedeamidovanou v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím ASn-74 přirozené lidské DNázy a lidskou DNázu deamidovanou v aminokyselinovém zbytku, kde je deamidovaná DNáza přítomna v množství menším než 1 % hmotn., vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v kompozici.
7. Farmaceutický DNázový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou DNázu nedeamidovanou v aminokyselinovém zbytku odpovídajícím Asn-74 původní lidské DNázy a lidskou DNázu deamidovanou v aminokyselinovém zbytku, kde deamidovaná lidská DNáza je přítomna v množství menším než 25 hmotn. % vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v prostředku.
8. Farmaceutický DNázový prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že deamidovaná lidská DNáza je přítomna v množství menším než 5 hmotn. % vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v prostředku.
-19CZ 293105 B6
9. Farmaceutický DNázový prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že deamidované lidská DNáza je přítomna v množství menším než 1 hmotn. % vztaženo na celkovou hmotnost DNázy v prostředku.
10. Farmaceutický DNázový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako farmaceuticky účinnou složku deamidovanou DNázu podle nároku 4 a farmaceuticky přijatelný nosič.
11. Farmaceutický DNázový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinío nou složku nedeamidovanou lidskou DNázu podle nároků 5 a 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.
10 výkresů
-20CZ 293105 B6
TCCTGCACAG AGGACGTGTC SerCysThrG
101
ATATTCCAGA TATAAGGTCT IleProAs
GCAGTGCCTT CGTCACGGAA lySerAlaLe
TTCTTGACAG AAGAACTGTC pSerOP*Gln
GAAGTGCTTC CTTCACGAAG uLysCysPhe
CATTCTCGTC GTAAGAGCAG HisSerArgH
TTCAGAGACC AAGTCTCTGG PheArgASpL
ATCTCTGAGG TAGAGACTCC isLeuOP*Gl
TTTCTTCATA AAAGAAGTAT euSerSerAM
ACATCACCAT TGTAGTGGTA yHisHisHis
201
GGCCCTACTG CCGGGATGAC AlaLeuLeu
CAGGGGGCCG
GTCCCCCGGC
GlnGlyAlaV alSerjLeuLy
TGTCCCTGAA ACAGGGACTT
GATCGCAGCC CTAGCGTCGG sIleAlaAla
TTCAACATCC AAGTTGTAGG PheAsnlleG
301
101
GTGCAGATCC CACGTCTAGG ValGlnlleL
401
135
CACCAGACAC GTGGTCTGTG ProAspTh
501
168
GGACAGCTAC CCTGTCGATG AspSerTyr •601
201
AGGGAGTTTG TCCCTCAAAC ArgGluPheA
701
235
GCTTGGAGGA CGAACCTCCT LeuGluAs
801
268,
CCAGTGGCTG GGTCACCGAC GlnTrpLeu
901
301
GTTCCCGACT CAAGGGCTGA ValProAspS
TGAGCCGCTA ACTCGGCGAT euSerArgTy
CTATCACTAC GATAGTGATG rTyrHisTyr
TACTACGATG ATGATGCTAC TyrTyrAspA
CCATTGTTCC GGTAACAAGG lalleValPr
CGTCATGTTG GCAGTACAAC pValMetLeu
ATCCCCGACA TAGGGGCTGT IleProAspS
CGGCTCTTCC GCCGAGAAGG erAlaLeuPr
TGACATCGCC ACTGTAGCGG rAspIleAla
GTGGTCAGTG CACCAGTCAC ValValSerG
ATGGCTGCGA TACCGACGCT spGlyCysGl
CCTGCATGCG GGACGTACGC oLeuHisAla
ATGGGCGACT TACCCGCTGA MetGlyAspP
GCGCTGACAC CGCGACTGTG erAlaAspTh
CTTTAACTTC GAAATTGAAG oPheAsnPhe
CTGGTCCAGG GACCAGGTCC LeuValGlnG
AGCCACTGGG TCGGTGACCC luProLeuGl
GCCCTGCGGG CGGGACGCCC uProCysGly
GCCCCGGGGG CGGGGCCCCC AlaProGlyA
1CAATGCGGG AGTTACGCCC heAsnAlaGl
CACAGCTACA GTGTCGATGT rT.hrAlaThr
CAGGCTGCCT GTCCGACGGA GlnAlaAlaT
AGGTCAGAGA TCCAGTCTCT luValArgAs
ACGGAACAGC TGCCTTGTCG yArgAsnSer
AACGACACCT TTGCTGTGGA AsnAspThrP
ACCGAGTAGC TGGCTCATCG spArgValAl
CTGCAGCTAT GACGTCGATA yCysSerTyr
CCCACGCACT GGGTGCGTGA ProThrHisC
ATGGCCTGAG TACCGGACTC yrGlyLeuSe
1001
335
TGAAGTGAGC ACTTCACTCG LysOP*Al
AGCCCCTCCC TCGGGGAGGG aAlaProPro
CACACCAGTT GTGTGGTCAA HisThrSerO
GAACTGCAG CTTGACGTC P*ThrAla
Obr. 1A
-21 CZ 293105 B6
GACTACTTTT TTTTCTTTAA GCAGCAAAAG GAGAAAATTG TCATCAAAGG
CTGATGAAAA AAAAGAAATT CGTCGTTTTC CTCTTTTAAC AGTAGTTTCC *ThrThrPhe PheSerLeuS erSerLysAr gArgLysLeu SerSerLysAsp
CATCTCAGG|Á~ŤG}AGGGGC|ÁŤ~G}AAGCTGCTG GGGGCGCTGC TGGCACTGGC
GTAGAGTCCT ACTCCCCGTA CTTCGACGAC CCCCGCGACG ACCGTGACCG
HisLeuArgM etArgGlyMe tLysLeuLeu GlyAlaLeuL euAlaLeuAla
AGACATTTGG TCTGTAAACC InThrPheGl
CAGCCACCTG GTCGGTGGAC pSerHisLeu
TATAAGGAGC ATATTCCTCG TyrLysGluA
TCAACCGAGA AGTTGGCTCT heAsnArgGl
CGAGATCGAC GCTCTAGCTG aGlulleAsp
GTGAGACCCT CACTCTGGGA ValArgProS
GTGCCTATGA CACGGATACT ysAlaTyrAs
TGACCAACTG ACTGGTTGAC rAspGlnLeu
GGAGACCAAG CCTCTGGTTC yGluThrLys
ACTGCCGTGG TGACGGCACC ThrAlaValG
GCTACCTGTT CGATGGACAA rgTyrLeuPh
GCCAGCCATT CGGTCGGTAA uProAlalle
GCTCTCTATG CGAGAGATAC AlaLeuTyrA
CCCAGTGGTC GGGTCACCAG erGlnTrpSe
CAGGATCGTG GTCCTAGCAC pArglleVal
GCCCAAGCCA CGGGTTCGGT AlaGlnAlal
ATGTCCAATG TACAGGTTAC MetSerAsnA
GGAAGCTGCT CCTTCGACGA lyLysLeuLe
CGTGTACAGG GCACATGTCC eValTyrArg
GTCAGGTTCT CAGTCCAAGA ValArgPheP
ACGTCTACCT TGCAGATGGA spValTyrLe
ATCCATCCGC TAGGTAGGCG rSerlleAxg
GTTGCAGGGA CAACGTCCCT ValAlaGlyM
TCAGTGACCA AGTCACTGGT leSerAspHi
CCACCCTCGT GGTGGGAGCA laThrLeuVa
GGACAACCTC CCTGTTGGAG uAspAsnLeu
CCTGACCAGG GGACTGGTCC ProAspGlnV
TCTCCCGGTT AGAGGGCCAA heSerArgPh
GGATGTCCAA CCTACAGGTT uAspValGln
CTGTGGACAA GACACCTGTT LeuTrpThrS
TGCTGCTCCG ACGACGAGGC etLeuLeuAr
CTATCCAGTG GATAGGTCAC sTyrProVal
CAGCTACATT GTCGATGTAA lSerTyrlle
AATCAGGATG TTAGTCCTAC AsnGlnAspAla
TGTCTGCGGT ACAGACGCCA alSerAlaVal
CACAGAGGTC GTGTCTCCAG eThrGluVal
GAGAAATGGG CTCTTTACCC GluLysTrpGly
GCCCCACCTT CGGGGTGGAA erProThrPhe
AGGCGCCGTT TCCGCGGCAA gGlyAlaVal
GAGGTGATGC CTCCACTACG GluValMetLeu
Obr. 1B
-22CZ 293105 B6
Obr. 2
-23CZ 293105 B6 doba (min.
Obr. 3
2000 nvw
-24CZ 293105 B6
NH2
I
C=NH
NH
NH2 I CH2 | 1 C=NH CH2 CH | | NH CH2 0 CH2 1 II 1 CH2 1 II 1 ...-N-C-O-N-C-C-N-C-CII 1 II 1 CH2 | CH i II 1 II 0 CH2 0 | 1 CH2 0 1 CH2 C=O
...-Arg , „-Asn s 73
NH2
CH „-Asp
7 3 7 4
Ser
NH
CH2
CH2 I CH 1 CH2 1 1 0 CH2 II 1 1 N-C-C-N-C-CH2II 1 C-N-C-CII II 1 0 C—0 II 0
CH
-Arg 73-isoAsp74-Ser75 Obr. 4
-25CZ 293105 B6
LC A 280,4 450,80 z 1002DNA3.D
Obr. 5 nvw doba (min.
-26CZ 293105 B6 doba (min.
Obr. 6 nvw < ----------1
-27CZ 293105 B6 eoTudn^s
Obr. 7
-28CZ 293105 B6 ooxudn^s
Obr. 8 nedeamidováný standard
-29CZ 293105 B6 sojudnqs
Obr. 9
CZ19943032A 1992-06-08 1993-05-28 Způsob oddělování deamidované lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy, čistá nedeamidovaná a deamidovaná lidská DNáza a farmaceutický prostředek obsahující tyto formy CZ293105B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/895,300 US5279823A (en) 1992-06-08 1992-06-08 Purified forms of DNASE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ303294A3 CZ303294A3 (en) 1995-06-14
CZ293105B6 true CZ293105B6 (cs) 2004-02-18

Family

ID=25404292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19943032A CZ293105B6 (cs) 1992-06-08 1993-05-28 Způsob oddělování deamidované lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy, čistá nedeamidovaná a deamidovaná lidská DNáza a farmaceutický prostředek obsahující tyto formy

Country Status (30)

Country Link
US (4) US5279823A (cs)
EP (2) EP1013284B1 (cs)
JP (1) JP3383307B2 (cs)
KR (2) KR100302092B1 (cs)
AT (2) ATE195340T1 (cs)
AU (1) AU682822B2 (cs)
BG (1) BG62335B1 (cs)
BR (1) BR9306670A (cs)
CA (1) CA2137237C (cs)
CZ (1) CZ293105B6 (cs)
DE (3) DE4392749T1 (cs)
DK (1) DK0644932T3 (cs)
ES (1) ES2150447T3 (cs)
FI (1) FI945549A0 (cs)
GB (1) GB2282140B (cs)
GE (1) GEP20002300B (cs)
GR (1) GR3034718T3 (cs)
HU (1) HU219549B (cs)
IL (1) IL105724A (cs)
MD (1) MD960288A (cs)
NO (1) NO318644B1 (cs)
NZ (1) NZ253559A (cs)
PL (1) PL175873B1 (cs)
PT (1) PT644932E (cs)
RO (1) RO117188B1 (cs)
RU (1) RU2238320C2 (cs)
SK (1) SK282957B6 (cs)
TJ (1) TJ396B (cs)
UA (1) UA46693C2 (cs)
WO (1) WO1993025670A1 (cs)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE176924T1 (de) * 1988-12-23 1999-03-15 Genentech Inc Verfahren zur herstellung von menschlicher dnase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE
ATE268605T1 (de) * 1994-03-04 2004-06-15 Genentech Inc Pharmazeutische akzeptabel dnase zusammensetzung
JP3009224B2 (ja) * 1994-03-04 2000-02-14 ジェネンテック インコーポレイテッド 改良されたｄｎアーゼ液体溶液
JPH09512715A (ja) * 1994-05-05 1997-12-22 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ヒトｄｎａｓｅ
US6251648B1 (en) 1998-04-03 2001-06-26 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US5830744A (en) * 1995-06-06 1998-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Gene encoding human Dnase
US5602110A (en) * 1994-08-31 1997-02-11 Case Western Reserve University Method and composition for treating cystic fibrosis
WO1996007735A1 (fr) * 1994-09-06 1996-03-14 Seiichi Tanuma Nouvelle desoxyribonuclease
US5863563A (en) * 1994-10-20 1999-01-26 Alphagene Inc. Treatment of pulmonary conditions associated with insufficient secretion of surfactant
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
SK284191B6 (sk) 1995-02-24 2004-10-05 Genentech, Inc. Aktín-rezistentný variant humánnej DNázy I
NZ331063A (en) * 1996-02-05 2000-03-27 Inc Genentech Isolated nucleotide sequences encoding for mature LS- DNase which is resistant to actin inhibition
US6482626B2 (en) * 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
ATE370961T1 (de) * 1998-05-06 2007-09-15 Genentech Inc Reinigung von antikörpern durch ionenaustauschchromatographie
US8820316B2 (en) * 2000-02-11 2014-09-02 Respironics Respiratory Drug Delivery (Uk) Ltd Drug delivery apparatus
CA2635489A1 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Respironics Respiratory Drug Delivery (Uk) Ltd Drug delivery apparatus
ES2312447T3 (es) * 2000-05-31 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Procedimiento para la purificacion de particulas de replicon alfavirus.
MD20010375A (ro) * 2001-11-19 2003-06-30 АНДРИЕВСКИ Сергей Malaxor
MD2260C2 (ro) * 2001-11-22 2004-03-31 АНДРИЕВСКИ Сергей Malaxor
HUE033623T2 (en) 2002-09-11 2017-12-28 Genentech Inc protein purification
US7067298B2 (en) * 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7595179B2 (en) 2004-04-19 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Recombinant reverse transcriptases
US20080160577A1 (en) * 2005-02-04 2008-07-03 Glaxo Group Limited Optimization of Heterologous Polypeptide Expression
KR100655438B1 (ko) * 2005-08-25 2006-12-08 삼성전자주식회사 자기 기억 소자 및 그 형성 방법
WO2007143206A2 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 Epicentre Technologies Compositions and methods for removal of dna from a sample
WO2008047364A2 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 Periness Ltd. Method and pharmacological composition for the diagnosis and treatment of male sub-fertility
HUE037409T2 (hu) 2007-10-30 2018-08-28 Genentech Inc Antitest-tisztítás kationcserés kromatográfiával
WO2009123950A2 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimera comprising bacterial cytotoxin and methods of using the same
GB2474225A (en) * 2009-07-21 2011-04-13 Biotec Pharmacon Asa DNase for decontamination of reverse transcription and amplification reactions
EP2699680B1 (en) 2011-04-21 2017-12-27 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
US20150010527A1 (en) * 2012-02-01 2015-01-08 Protalix Ltd. Dnase i polypeptides, polynucleotides encoding same, methods of producing dnase i and uses thereof in therapy
CN103920144B (zh) * 2013-01-15 2016-09-14 吴庄民 重组人的脱氧核糖核酸酶i的新应用
WO2015200645A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Jhl Biotech, Inc. Methods and reagents for purification of proteins
WO2016067944A1 (ja) 2014-10-31 2016-05-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換えヒトＤＮａｓｅＩの製造方法
CA2988471A1 (en) * 2015-07-28 2017-02-02 University Of Massachusetts Transgenic expression of dnase i in vivo delivered by an adeno-associated virus vector
EP4094780A3 (en) 2016-02-12 2023-02-08 University of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
JP7125392B2 (ja) 2016-11-17 2022-08-24 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド レムナント腫瘍浸潤リンパ球並びにそれを調製及び使用する方法
EP3351263A1 (en) 2017-01-20 2018-07-25 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Pharmaceutical preparation for treating or preventing tissue adhesion
US20230226138A1 (en) 2020-06-01 2023-07-20 Black Cat Bio Limited Compositions and methods for treating infections and netopathy

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2801956A (en) * 1954-08-24 1957-08-06 Merck & Co Inc Process for preparing pancreatic desoxyribonuclease
US2834710A (en) * 1955-06-29 1958-05-13 Merck & Co Inc Pancreatic desoxyribonuclease penicillin composition and process of preparation
US3208908A (en) * 1961-11-16 1965-09-28 Parke Davis & Co Fibrinolysin-desoxyribonuclease for enzymatic debridement
US3663690A (en) * 1969-08-12 1972-05-16 Hoechst Co American Mucolytic composition and method of treatment of broncho-pulmonary disorders therewith
CA1059937A (en) * 1975-03-25 1979-08-07 Boen T. Khouw Isolation and purification of deoxyribonuclease
US5077211A (en) * 1988-07-06 1991-12-31 Applied Genetics, Inc. Purification and administration of dna repair enzymes
ATE176924T1 (de) * 1988-12-23 1999-03-15 Genentech Inc Verfahren zur herstellung von menschlicher dnase
US5279823A (en) * 1992-06-08 1994-01-18 Genentech, Inc. Purified forms of DNASE

Also Published As

Publication number Publication date
NO944752L (no) 1994-12-08
DE69334317D1 (de) 2010-03-11
FI945549A (fi) 1994-11-25
GB9423695D0 (en) 1995-01-11
WO1993025670A1 (en) 1993-12-23
GB2282140A (en) 1995-03-29
RO117188B1 (ro) 2001-11-30
DK0644932T3 (da) 2001-01-02
BR9306670A (pt) 1998-12-08
DE69329200D1 (de) 2000-09-14
PL175873B1 (pl) 1999-02-26
NO944752D0 (no) 1994-12-08
BG62335B1 (bg) 1999-08-31
US5783433A (en) 1998-07-21
US5279823A (en) 1994-01-18
JPH07507455A (ja) 1995-08-24
BG99234A (bg) 1995-07-28
UA46693C2 (uk) 2002-06-17
TJ396B (en) 2004-12-29
HUT70468A (en) 1995-10-30
RU94046424A (ru) 1997-03-10
EP0644932B1 (en) 2000-08-09
EP1013284B1 (en) 2010-01-20
FI945549A0 (fi) 1994-11-25
GR3034718T3 (en) 2001-01-31
US6440412B1 (en) 2002-08-27
DE4392749T1 (de) 1995-07-20
HU9403512D0 (en) 1995-02-28
ES2150447T3 (es) 2000-12-01
EP0644932A1 (en) 1995-03-29
CA2137237C (en) 2004-10-26
EP1013284A2 (en) 2000-06-28
NZ253559A (en) 1996-11-26
DE69329200T2 (de) 2001-04-26
IL105724A0 (en) 1993-09-22
RU2238320C2 (ru) 2004-10-20
CZ303294A3 (en) 1995-06-14
CA2137237A1 (en) 1993-12-23
IL105724A (en) 1997-06-10
ATE455557T1 (de) 2010-02-15
SK282957B6 (sk) 2003-01-09
MD960288A (ro) 1998-01-31
AU4398193A (en) 1994-01-04
GB2282140B (en) 1996-04-17
PT644932E (pt) 2001-02-28
US20030077267A1 (en) 2003-04-24
US6932965B2 (en) 2005-08-23
NO318644B1 (no) 2005-04-25
KR100323357B1 (ko) 2002-02-19
SK149594A3 (en) 1996-01-10
HU219549B (hu) 2001-05-28
AU682822B2 (en) 1997-10-23
GEP20002300B (en) 2000-11-25
EP1013284A3 (en) 2000-08-30
JP3383307B2 (ja) 2003-03-04
KR100302092B1 (ko) 2001-10-22
ATE195340T1 (de) 2000-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ293105B6 (cs) Způsob oddělování deamidované lidské DNázy od nedeamidované lidské DNázy, čistá nedeamidovaná a deamidovaná lidská DNáza a farmaceutický prostředek obsahující tyto formy
Cockcroft et al. Phospholipase D: a downstream effector of ARF in granulocytes
Gamm et al. The type II isoform of cGMP-dependent protein kinase is dimeric and possesses regulatory and catalytic properties distinct from the type I isoforms
Copeland et al. Enzymatic characterization of the individual mammalian primase subunits reveals a biphasic mechanism for initiation of DNA replication.
CA2264484C (en) Human plasma hyaluronidase
Silverman et al. Synthesis, Characterization and Properties of ppp (A2′ p) nApCp and Related High‐Specific‐Activity 32P‐Labelled Derivatives of ppp (A2′ p) nA
JP2006519800A (ja) 未分化リンパ腫キナーゼアッセイ、試薬及びその組成物
US6228989B1 (en) Peptide substrates phosphorylated by P21-activated protein kinase
Tanaka et al. Proteasomes (multicatalytic proteinase complexes) in eukaryotic cells
US6207393B1 (en) Inhibition of intracellular signal transduction by 14-3-3-binding peptides
Zhou et al. Heparin protein interactions
Feller et al. Identification and characterization of a cytosolic protein tyrosine kinase of HeLa cells
Sugahara et al. Regulation of serum glycosaminoglycan sulfotransferase activities: inhibition by sulfated glycosaminoglycans and activation by polyamines and basic peptides including a polylysine-containing segment of the c-Ki-ras 2 protein
US7217527B2 (en) Assay for phosphodiesterase function
EP1179050B1 (en) Method for the purification of protein kinase by affinity chromatography
Fioretti et al. Characterization of three new Kunitz-type inhibitors from bovine spleen: preparation of specific antibodies
McILHINNEY et al. Characterization, regional and subcellular distribution of an N-myristoyl-CoA: glycyltransferase activity in rat brain

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20130528