BG107798A

BG107798A - Adjuvant combination formulations

Info

Publication number: BG107798A
Application number: BG107798A
Authority: BG
Inventors: Michael Hagen
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2003-05-10
Publication date: 2004-07-30
Also published as: EP1343527A2; JP2004523483A; EG24378A; HUP0600589A2; GEP20074077B; PL366031A1; SK5482003A3; KR20040043098A; CN1533285A; AU2002225972B2; JP2010001304A; AU2597202A; IL155690A0; US20040156820A1; NO20032086L; MXPA03004071A; US20070025959A1; EE200300172A; BR0115271A; TWI239848B

Description

Област на изобретението

Настоящето изобретение се отнася до приложението на едно аминоалкил глюкозамин фосфатно съединение, или негово производно или аналог, в комбинация с цитокин или лимфокин, поспециално гранулоцитен макрофагов колонии стимулиращ фактор или интерлевкин-12, като аджувантна форма в антигенен или имуногенен състав за повишаване на имунния отговор у гостоприемник гръбначни спрямо избран антиген.

Ниво на изобретението

Имунната система използва разнообразие от механизми за атакуване на патогените. Независимо от това, не всички от тези механизми са задължително активирани след имунизация. Защитният имунитет, индуциран от имунизацията, зависи от капацитета на подходящия имунен отговор за да устои или елиминира патогена. В зависимост от патогена, това може да изисква клетъчно- медииран и/или хуморален имунен отговор.

Приетата понастоящем теория за ролята на хелперните Т клетки в имунния отговор е, че Т клетките могат да бъдат разделени на подгрупи на базата на цитокините, които продуцират, и че наблюдавания в тези клетки отчетлив цитокинов профил определя тяхната функция. Този Т клетъчен модел включва две големи подгрупи: ТН-1 клетки, които продуцират интерлевкин-2 (IL-2) и гама интерферон, който увеличава както клетъчния, така и хуморалния (антитяло) имунни отговори; и ТН-2 клетки, които продуцират интерлевкин-4, интерлевкин-5 и интерлевкин-10 (IL-4, IL-5 и IL-10, съответно), които увеличават хуморалните имунни отоговори (под № 1 от библиографията).

Често е желателно увеличаването на имуногенния потенциал на един антиген с оглед получаване на по- силен имунен отговор в организма, който е имунизиран и за засилване устойчивостта на гостоприемника спрямо антиген- носещия агент. В някои ситуации е желателно да се промени имунният отговор от предоминантно хуморален (ТН-2) отговор на повече балансиран (ТН-1) и хуморален (ТН-2) отговор.

Клетъчният отговор включва генериране на CD8+ CTL (цитотоксичен Т-лимфоцитен) отговор. Такъв отговор е желателен за развиването на имуногенни състави срещу интрацелуларни патогени. Защитата срещу различни патогени изисква силни мукозни отоговори, високи серумни титри, индуциране на CTL и енергични клетъчни отговори. Такива отговори не се осигуряват от повечето антигенни продукти, включително субединици на конвенционални имуногенни състави. Сред такива патогени е вируса на човешкия имунодефицит (HIV).

По този начин е явна необходимостта от създаване на антигенни състави, които са способни да генерират както хуморален, така и клетъчен имунни отговори в гръбначни животни.

Общо за изобретението

Обект на настоящето изобретение е използването на аджувантни комбинирани форми в антигенни състави, съдържащи едно аминоалкил глюкозамин фосфатно съединение (AGP), или негово производно или аналог, комбинирано с цитокин или лимфокин, по- специално гранулоцитен- макрофагов колоний стимулиращ фактор (GM-CSF) или интерлевкин-12 или лимфокин. По- специално, AGP е 2-[(R)-3- тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]етил 2Дезокси-4-0-фосфоно-3-0-[(Р)-3-тетрадеканоиокситетрадеканоил]-2[(Р)-3-тетрадеканоиокситетрадеканоиламино]-р-О- глюкопиранозид, който е известен също като 529 (известен също и като RC529).

Аджуванта представлява вещество, което повишава имунния отговор когато е въведен заедно с имуноген или антиген. Аджувантната формула от това изобретение се прилага заедно с избран антиген в антигенен или имуногенен състав. Антигенните състави от това изобретение подсилват имунния отговор на гостоприемник гръбначно спрямо дадения избран антиген. Избраният антиген може да бъде полипептид, пептид или фрагмент, получен (1) от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит, или (2) от ракова клетка или туморна клетка, или (3) от алерген, така че да повлияе на продуцирането на IgE с оглед отслабване алергичните отговори на този алерген, или (4) от амилоидния прекурсорен протеин така че да предотврати или да излекува заболяване, характеризиращо се с отлагане на амилоид в гръбначните. В един вариант на изпълнение на изобретението, избраният антиген е от HIV. Избраният HIV антиген може да бъде HIV протеин, полипептид, пептид или фрагмент, получен от този протеин. В конкретен вариант на изпълнение на изобретението, HIV антигена е специфичен пептид. В друг вариант на изпълнение на изобретението, избраният антиген е β- амилоиден пептид (отнасян също като Αβ пептид), който е вътрешен, 39- 43 амино киселинен фрагмент на амилоид прекурсорен протеин (АРР), който е получен при въздействие на β и γ секретазни ензими върху АРР.

AGP може да бъде представен като воден разтвор, или като стабилизирана масло- във- вода емулсия (стабилна емулсия или SE). В предпочитан вариант на изпълнение на изобретението, емулсията масло- във- вода съдържа сквален, глицерол и фосфатидил холин. В SE формата, ACG се смесва с цитокина или лимфокин за формиране на антигенния състав преди въвеждането. Не се изисква цитокина или лимфокина да влезе в емулсията. В предпочитан вариант на изпълнение, AGP е във формата на SE. Антигенният състав може понататък да включва разтворител или носител.

Изобретението е насочено също към методи за повишаване стабилността на антигенен състав, съдържащ избран антиген (1) от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за да изяви имунния отговор на гостоприемник гръбначно животно, или (2) от раков антиген или туморно- свързан антиген от ракова клетка или туморна клетка за изявяване на терапевтичен или профилактичен противораков ефект в гостоприемник гръбначно, или (3) от алерген, така че да повлияе продуцирането на IgE с оглед смегчаване алергенните отговори спрямо алергена, или (4) от молекула или нейна част, която представя такива, продуцирани от гостоприемника (самата молекула) по нежелан начин, количество или локализация с оглед редуциране на такъв нежелан ефект, чрез включване на ефективно количество аджувант от комбинация на цитокин или лимфокин, по- специално AGP GM-CSF или IL-12, или агонист или антагонист на този цитокин или лимфокин.

Изобретението по- нататък е насочено към методи за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за изявяване цитотоксични Т лимфоцити у гръбначни гостоприемници чрез включване на ефективно количество аджувант от комбинация на цитокин или лимфокин, по- специално AGP с GM-CSF или IL-12, или агонст или антагонист на посоченият цитокин или лимфокин.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 показва геометричните средни титри на антитела спрямо Αβ1-42 пептид в трансгенна мишка, имунизирана както следва: Група 1 - Αβ1- 42 пептид плюс PBS (не е показано); Група 2Αβ1- 42 пептид плюс MPL™ SE (квадрати); Група 3- Αβ1- 42 пептид плюс MPL™ SE и GM-CSF (триъгълници); Група 4- Αβ1- 42 пептид плюс 529 SE и GM- CSF (обърнати триъгълници).

Фигура 2 показва общите критични нива в трансгенна мишка, имунизирана с четирите Групи, описани за Фигура 1.

Фигура 3 показва Αβ1- 42 пептидни кортикални нива в трансгенна мишка, имунизирана с четирите Групи, описани за Фигура

1.

Фигура 4 показва фронталното амилоидно натоварване на кортекса в трансгенна мишка, имунизирана с четирите Групи, описани за Фигура 1.

Фигура 5 показва фронталното натоварване с неврити на кортекса на трансгенна мишка, имунизирана с четирите Групи, описани за Фигура 1.

Фигура 6 показва нивата на ретросплениална кортекс астроцитоза в трансгенна мишка, имунизирана с четирите Групи, описани за Фигура 1.

Фигура 7 показва HIV С4 (E9V)- V3_896P пептид- специфични IgG геометричните стойности на антитяло титри в серум в две групи на макаки циномолгус (четири животни за група). Животните от Група 1 се имунизират интраназално само с С4 (E9V)- V3_896P Животните от Група 2 се имунизират интрамускулно с пептида С4 (E9V)- V3₈₉₆p формиран с 529 SE и GM-CSF. Стрелките показват имунизациите при седмици 0, 4, 8, 18 и 23.

Фигура 8 показва геометричните стойности на антитяло титри в цервиковагинални проби на същите животни, описани за Фигура 7.

Фигура 9 показва геометричните средни антитяло титри в проби от назални промивки на същите животни, описани за Фигура 7.

Подробно описание на изобретението

Аджуванти, цитокини и лимфокини са имуно модулиращи съединения, които имат способността да повишават и да води развитието и профила на имунните отговори спрямо различни антигени, които сами по себе си са слабо имуногенни. Подходящият подбор на аджуванти, цитокини и лимфокини могат да индуцират добри хуморални и клетъчни имунни отговори, които не биха се развили в отсъствие на аджувант, цитокин или лимфокин. Поспециално, аджуванти, цитокини и лимфокини имат значително влияние при повишаване на имунния отговор спрямо субединици и пептидни антигени в имуногенните състави. Тяхната стимулираща активност е също благоприятна за развиването на антигенспецифични имунни отговори, насочени срещу протеинови антигени. За различни антигени, които изискват силни отговори на мукозата, високи серумни титри, индукция на CTL и енергични клетъчни отговори, комбинации от аджувант и цитокин/лимфокин осигуряват стимул, който не се осигурява от повечето антигенни препарати.

Множество изследвания са оценили различните аджувантни формули в модели на животни, но алуминият (алуминиев хидроксид или алуминиев фосфат) е понастоящем единственият аджувант, разрешен за широка употреба при хора. Друг аджувант е Stimulon™ QS-21 (QS-21) (Antigenics Inc., Framingham, MA (2)). Една група от аджуванти, стабилни емулсии, състоящи се от различни вода-в-масло или масло-във-вода комбинации, са получили относително внимание за тяхната имунопотенцираща способност. Тези формули най- общо се състоят от различни комбинации от метаболизируеми или инертни масла, които действат за стабилизиране или отлагане на антиген в мястото на инжектирането. Един такъв аджувант е непълният аджувант на Фройнд (IFA), който включва минерално масло, вода и емулгиращо средство. Пълен аджувант на Фройнд (CFA) е IFA плюс термично умъртвени Микобактерии. Специален интерес при използване на тези типове аджуванти е инжекционна, свързана с мястото дразнимост, често резултат от мононуклеарни клетъчни инфилтрации, причиняващи грануломатозни лезии. Поради това са изследвани други съединения и форми като потенциални аджуванти.

Една група от такива съединения са аминоалкил глюкозамин фосфатните съединения (AGPs), кито са описани в Американски патент номер 6 113 918, например в колона 2, линия 14- колона 3, линия 38, които са включени в литературната справка (3). AGPs имат една аминоалкилна (агликонова) група, която е гликозидно свързана към 2-дезокси-2-амино-а-О-глюкопираноза (глюкозамин) за формиране на основната структура. Други субституенти включват фосфорилиране на 4-тия или 6-ти въглерод от глюкозаминовото ядро и три 3-алканоилоксиалканоилови остатъка.

Едно такова AGP е съединението, означено 529 (чието пълно химично наименование е 2-[(R)-3тетрадеканоилокситетрадеканиламино]етил 2- дезокси-4-О-фосфоно-

3-0- [(R)-3- тетрадеканоиокситетрадеканоил]-2- [(R)-3- тетрадеканоиокситетрадеканиламино]- β- D- глюкопиранозид), което е произведено от Corixa (Hamilton, MT).

Corixa имат също метаболизируеми масло-във-вода форми, които когато са комбинирани с 529, водят до формирането на стабилизирана емулсия, означена 529 SE. Стабилизираната емулсия е произведена чрез микрофлоидизация на 529 със скваленово масло, глицерол и фосфатидил холин. Формата понастоящем е с качеството на GMP микрофлуидизирана емулсия. Емулсии, съдържащи 1% масло (макар и да могат да бъдат използвани други концентрации) са описани в експериментите по- долу.

529 SE води до неразличимо нарастваща тъканна патология, когато е въвеждано субкутанно в Balb/c или Swiss-Webster мишка. За сравнителни нужди е получена и стабилизарна емулсия, съдържаща същите компоненти, но без 529. По- специално, субкутанна имунизация с цистеин- делетирана 39 амино киселинна версия (-Cys) на 40 амино киселинен HIV пептид T1SP10MN(A) (където липсва цистеиновият остатък на амино киселина номер 17 от 40 амино киселинния пептид (+Cys)), или с Αβ1-42 (вътрешен, 42- амино киселинен фрагмент на АРР), всеки формиран с комбинацията на аджуванти 529 SE и GM-CSF, води до получаване на незабележимо възпаление, зачервяване, подуване или втвърдяване.

Също в обхвата на това изобретение са производни и аналози на 529 и други AGPs. Такива съединения включват, но не се ограничават до съединенията, описани в Американски патент номер 6 113 918(3).

Включването на цитокини и лимфокини в имуногенни състави показват обещание за разширяването и засилването на потенциала на имуногенни състави (4). Показано е, че цитокиновият интерлевкин12 (IL-12) предизвикват и подсилват клетъчно медиираният имунитет, чрез придвижване в Т хелперна клетъчна подгрупова експанзия срещу Th1 цитокинов профил (напр., срещу lgG2 субкпас в модел на мишка) (5-7). В мишка, показано е, че рекомбинантен миши IL-12 засилва Th1 профила на доминираният имунен отговор (4).

IL-12 е продуциран от множество антиген- предсавляващи клетки, принципно микрофаги и моноцити. Това е критичен елемент при индуцирането на ТН1 клетки от нативни Т- клетки. Продуцирането на IL-12 или способността да му отговорят е показано, че е критично за развиването на протективен ТН1- подобни отговори, например, по време на паразитни инфекции, особено при Лайшманиози (8), а така също повишаване на клетъчно медиираният имунен отговор спрямо г·- антиген от патогенна бактерия или вирус (9) или от ракова клетка (10).

Ефектите на IL-12 са медиирани в голяма част от гама- интерферон, продуциран от NK клетки и Т хелперни клетки. Гама- интерферона е критичен за индуцирането на lgG2a антитела спрямо Т- зависими протеинови антигени (11) и lgG3 отговори спрямо Т- независими антигени (12). СВ-12, наричан природен фактор, стимулиращ килърните клетки, е хетеродимерен цитокин (13). Експресията и изолирането на IL-12 протеин в рекомбинантни гостоприемникови клетки е описано в публикувано патентно описание WO 90/05147 (14).

_г, Друг цитокин, който носи потенциално обещание като аджувант,

W е GM-CSF. GM-CSF е определен тип колонии стимулиращ фактор (CSF). CSF са семейство цитокини, които индуцират прогениторни клетки, намерени в костния мозък да се диференцират в специфични типове зрели кръвни клетки. Както е описано в Американски патент номир 5 078 996 (15), включен в литературната справка, GM-CSF активира макрофагни или прекурсорни моноцити за медииране на неспецифична туморицидна активност. Описана е нуклеотидната последователност, кодираща човешкия GM-CSF ген (15). Плазмид, съдържащ GM-CSF сДНК е трансформиран в Е. coli и е депозиран в АТСС, 10801 University Boulevard, Manassa, VA 20110-2209, под номер 39900. Както е описано в Американски патент номер 5 229 496 (16), който е включен в приложената литературна справка, GM-CSF гена също е инсертиран в дрождев експресионен плазмид и депозиран в АТСС под номер 53157. Нещо повече, както е описано в Американски патент 5 073 627 (17), който е включен в приложената литературна справка, ДНК последователност, кодираща GM-CSF с отстранени места за гликозилация, е депозиран в АТСС под номер 67231.

GSM-CSF е показано, че регулира възходящо протеиновите Q молекули върху представляващите антигена клетки, известни като повишаващи имунния отговор (18), и повлияващи секретирането на lg в пречистени по някякъв начин миши В клетки (19). GM-CSF са описани също като аджувант за имуногенни състави (20).

Показано е също, че други цитокини или лимфокини имат имуно модулираща активност, включително но без да се ограничават до, интерлевкините 1-алфа, 1-бета, 2,4,5,6,7,8,10,13,14,15,16,17 и 18, интерферонвите алфа, бета и гама, гранулоцитния колонийстимулиращ фактор и тумор некрозисните фактори алфа и бета.

Свързани със системното въвеждане на който и да е цитокин или лимфокин са биологичните обстоятелства, свързани с цитокиновата или лимфокинова активност. В допълнение, цитокинови или лимфокинови ефекти, свързани с развиването на антигенспецифичните имунни отговори, трябва да бъдат развити ако локалните концентрации на цитокин или лимфокин бъдат поддържани.

Изпитани са комбинациите от 3-0-деацилиран монофосфорил ли5пид А или монофосфорил липид A с GM-CSF или IL-12;

наблюдавано е разширяването на различни параметри на имунния отговор (21).

Изобретението, описано тук демонстрира, че посредством комбинирането на антиген, избран цитокинов или лимфокинов аджувант, и втори аджувант, един AGP (за предпочитане в стабилна метаболизируема емулсия), се засилват имунните отговори, специфични за антигена.

Антигените, избрани за включване в антигенните състави от това изобретение, обхващат пептиди или полипептиди, получени от протеини, протеини, а също и фрагменти на: захариди, протеини, ζ·? поли- или олигонуклеотиди, или други макромолекулярни компоненти. Както е използвано тук, един “пептид” включва серии от най- малко три амино киселини и съдържа най- малко една антигенна детерминанта или епитоп, докато “полипептид” е по- дълга молекула от пептид, която обаче не се състои от протеин в неговата пълна дължина. Такива пептиди, полипептиди или протеини могат да бъдат конюгирани към един несроден протеин, като тетанусен токсоид или дифтериен токсоид. Както е използван тук, “фрагмент” включва част, но по- малко от целия захарид, протеин, поли- или олигонуклеотид, или други макромолекулни компоненти. В случая на HIV, антигенните състави от това изобретение по- нататък включват HIV протеините с пълната им дължина.

Изобретението най- напред е представено в моделна система с помощта на антигени, получени от HIV. Тези пептиди са описани в или получени от US патент №№ 5 013 548 (22) и 5 019 387 (23), които са включени тук в литературната справка и са обобщени. Тези пептиди включват амино киселинни последователности, които кореспондират на участък на HIV покривния протеин, срещу които са продуцирани неутрализиращи антитела и Т клетъчни отговори.

HIV е човешки ретровирус, който е причинителя на синдрома на придобитата имунна недостатъчност (AIDS). HIV инфектира Т лимфоцити на имунната система чрез прикрепването на техния външен покривен гликопротеин към CD4 (Т4) молекулата на повърхността на Т лимфоцитите, като по този начин използва CD4 (Т4) молекулата като рецептор за навлизане и инфектиране на Т клетките. Направените опити за индуциране на протективен имунен отговор, специфичен за HIV- инфекцията чрез имунизация са с много ограничен успех. Използвани са понастоящем множество подходи в опитите за определяне на ефективна и протективна стратегия за развиването на имуногенни състави. Те включват използването на атенюирани и бактериални вектори, които експресират антигенни епитопи от HIV (24), рекомбинантен аденовирус (25) или ваксинални ретровирусни вектори (26), ДНК имунизация (27) и синтетични пептиди, които съдържат различни Т и В клетъчни епитопи на HIV (28).

Екстерналният HIV покривен гликопротеин др120 е показано, че е способен да индуцира неутрализиращи антитела в човека. Рекомбинантният протеин РВ1, който кодира приблизително една трета от пълната др120 молекула, е показано че включва частта от покривния протеин, която индуцира формирането на неутрализиращи антитела. Обаче, изследвания в шимпанзета показва, че нито интактния др120, нито РВ1 могат да индуцират продуцирането на високи титри на неутрализиращи антитела.

Синтезирани са къси пептиди чрез конвенционални методи, които съответстват на антигенните детерминанти на др120 и генерират антитяло отговор срещу др120, който неутрализира вируса и индуцира Т- хелперни и CTL отговори срещу вируса.

Един такъв пептид е C4/V3 съдържащият мултиепитоп HIV-1_MNпептид, означен T1SP10MN(A) (+Cys), и цистеин- делетираният вариант T1SP10MN(A) (-Cys). Тези пептиди включват Th, T_Ctl и В епитопи, но не индуцират антитела, които повлияват CD4 свързването. По- рано е показано, че тези C4/V3 HIV пептиди са обещаващи кандидати за индуциране на имунните отговори когато са въведени с CFA или подобни на CFA аджуванти (29- 34). Тези пептиди съдържат епитопи, за които по- рано е показано, че предизвикват CD4+ Th клетъчни отговори както при мишки, така и при хора, и съдържат основна неутрализираща детерминанта и място, което се разпознава от CD8+ CTL както в Balb/c мишка, така и в хора, които са HLA В7+. За амино киселинният пептид 39 напоследък е показано, че е както имунодефицитен, така и безопасен в инфектирани с HIV пациенти (28).

T1SP10MN (A) (+Cys) има следната последователност от 40 амино киселини:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (SEQ ID NO: 1).

T1SP10MN (A) (-Cys) е синтезиран без цистеина в позиция 17 и има следната последователност от 39 амино киселини:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 2).

Този цистеинов остатък е локализиран извън функционалните епитопи, разпознати от Th клетки, CTL или В клетки. Други HIV пептиди от различни участъци на вирусния геном са описани в US Pat № 5 861 243, US Pat. № 5 932 218 (36), US Pat. № 5 993 819 (38),

Публикувано европейско патентно описание № 671 947 (40), и US Pat. № 6 024 965 (41), които също са включени в литературната справка.

Използван е също и един 28 амино киселинен пептиден конюгат, означен ST1/p11C. Конюгата се състои от 16 амино киселинен SIV получен от env Т-хелперен пептид, означен ST-1, конюгиран към 12 амино киселини SIV mac 251 Gag пептид (амино киселини 179- 190 от Gag), означен р11С (42). Пептида р11С в тетрамерна форма показва CTL активност в SIV mac- инфектирана Manu-A*01 маймуна макак (43). Пептидният конюгат ST1- р11С има следната амино киселинна последователност:

Arg Gin lie lie Asn Thr Thr Hys Lys Vai Gly Lys Asn Vai Gly Lys Asn Vai Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO: 3);

Използван е също пептиден конюгат, означен C4-V3₈₉.₆p (44). Участъка С4 от този пептиден конюгат (16 амино киселини) е получен от четвъртия постоянен участък на HIV-1 епитопния протеин и представлява универсален Т- хелперен епитоп. V3 частта от пептида (23 амино киселинни) е получен от третия хипервариабилен участък на HIV-1 покривния протеин и представлява критична неутрализираща детерминанта. Конюгата C4-V3_896P притежава следната амино киселинна последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4).

HIV антигена може да бъде протеин, полипептид, пептид или фрагмент, получен от посочения протеин. Протеинът може да бъде гликопротеин като др41, др120 или др160. Обратно, протеина може да бъде протеин кодиран от такива гени като gag, pol, vif, rev, vrp, tat, nef или env. Пептиди, получени от такива протеини ще съдържат наймалко една антигенна детерминанта (епитоп) при най- малкото шест амино киселини в дължина.

Имунният отговор спрямо един HIV пептид може да бъде подсилен чрез ковалентно свързване (конюгиране) на пептида към фармацевтично приемлива носеща молекула. Примери за подходящи носещи молекули включват тетанусен токсоид, дифтериен токсоид, хемоцианин и други пептиди, кореспондиращи на Т клетъчни епитопи на HIV др120 гликопротеина.

Напоследък се счита, че успешната стратегия за имунизация срещу HIV би изисквала заличаването на мукозния имунитет срещу HIV, а така също и добър CTL отговор. В последните изследвания на мишки с участие на T1SP10MN(A) мулти- епитопен пептид, и мукозен аджувант, холерен токсин, е показано че интраназална имунизация индуцира серумни lgG1 антитела (45). Последващо изследване също с използване на HIV-V3 пептиди показва индуцирането на мукозно синтезирано IgA антитяло и силно клетъчно медиирани отговори, включително пептид- специфичен CTL (46). Функционалната роля на високотитъри системни и неутрализиращи антитела за предотвратяване на, или за стабилизиране на HIV- инфектирани индивиди, е неизвестна, макар че високотитърни вирусноспецифични антитела се счита, че са важни за предотвратяване на вирусното разпространение.

В предпочитан вариант на изпълнение на изобретението, се формира стабилна масло- във- вода емулсия, която съдържа 529, който след това се смесва с цитокините IL-12 или GM-CSF. Представените по- долу данни показват, че комбинацията от 529 плюс GM-CSF води до високи титри на HIV-неутрализиращи серумни антитела. Комбинирането на 529 SE и GM-CSF индуцира високи титри на антиген- специфични IgG антитела, включително двата субкласа lgG1 и lgG2a, във въгиналната кухина на имунизирана женска мишка. Имунизацията на мишка с T1SP10MN(A) (Cys) пептид, формиран с 529 SE и GM-CSF индуцира силен клетъчен имунен отговор, както е определено чрез повишена антиген- специфична клетъчна пролиферация и секреция в култура на цитокини, както и индуцирането на пептид- специфични CTL отговори. Сходни резултати са наблюдавани когато мишки са имунизирани с Αβ-42 пептида от АРР с 529 SE и GM-CSF.

Най- общо, антиген/ аджувантните форми на 529 или 529 SE, комбинирани с GM-CSF или IL-12 и избран протеин или пептид, индуцират високи титри на антиген- специфично и вируснеутрализиращо антитяло, значителна промяна в съотношението на IgG субкласа към по- голямо съотношение на комплементфиксиращите IgG антитела (в полза на IgG в мишка), повишена продукция на цитокини в отговор на антигенното стимулиране in vitro. Тези свойства не са наблюдавани с форми на антиген и SE в отсъствие на 529, както с така и без GM-CSF или IL-12. Формите от изобретението включват също добър клетъчен отговор както е определено чрез индуциране на CTL.

Ползата от 529 SE е, че формата не индуцира грануломатозно акумулиране и възпаление в мястото на инжектиране; такива реакции в мястото на инжектиране са типично индуцирани от аджувантни форми вода-в-масло или масло-във-вода.

Проведен е експеримент за сравнение на въвеждането на HIV пептида T1SP10MN(A)(-Cys) с 529 SE самостоятелно, или с IL-12, или с 529 SE плюс GM-CSF.

В този експеримент (Таблица 1 по- долу), Balb/c мишки, имунизирани субкутанн с HIV пептида T1SP10MN(A)(-Cys), формиран с 529 SE, проявява пептид- специфичните серумни IgG титри само след две инжектирания. Титрите на lgG1 и lgG2 субкласове също са изявени. Включването на втори аджувант, както GM-CSF, така и IL-12, подсилва тоталните титри на IgG, както и титрите на субклас lgG1. Добавянето на IL-12 подсилва тигъра на субклас lgG2a; добавянето на GM-CSF не подсилва титъра на субклас lgG2a.

В друг експеримент, като измерване на функционалнен клетъчно медииран имунитет, се измерва способността на спленоцити от мишка, имунизирана с 529 SE, 529 SE плюс IL-12, или 529 SE плюс GM-CSF, формирани заедно с мулти- епитопния пептид T1SP10MN)(-Cys) за генериране на HIV_MN- специфични CTL отговори.

Както е показано на Таблица 2, спленоцити от мишка, имунизирана с който и да е аджувант показват ниска активност спрямо мишенни клетки, които са както немаркирани, така и пулсативно маркирани с нерелевантен IIIB CTL епитоп. HIVMNспецифичен, медииран от CTL лизис на мишенни клетки е значително повишен, когато се прилага 529 SE плюс IL-12 в сравнение с 529 SE самостоятелно, и още повече се засилва когато се прилага 529 SE плюс GM-CSF (Таблица 2).

В още един експеримент, маймуни резус се имунизират с пептидите ST1-p11C или C4-V3₈9._6p и IFA или 529 SE плюс GM-CSF (групи, показани на Таблица 15). Резултатите от анализа са показани на Таблица 16- 22 и са обобщени.

ST1- р11С пептидните форми сами по себе си са добре балансирани във всички тествани животни. Обаче с аджуванта IFA са отбелязани са инжекционни места с особена реактивност. В допълнение, възможно е да се отчетат малки обратни ефекти на аджувантната форма 529 SE/GM-CSF след финалната имунизация. ST1 -р11С пептидната форма, съдържаща IFA е способна да индуцира потенциален р11С-специфичен клетъчен имунен отговор в една от двете тествани Mamu-A*01 позитивни резус маймуни. Пептидната форма ST1 -р11С, съдържаща 529 SE/GM-CSF също е в състояние да индуцира р11С- специфичен клетъчен имунен отгвор в една тествана Mamu-A*01 позитивна резус маймуна.

Пептидната форма C4-V3₈₉.₆p, съдържаща 529 SE/GM-CSF е способна да генерира пикови титри на плазма ELISA антитяло в границите на 1:6,400- 1:12,800 и ниско ниво на отговорите на неутрализиращо антитяло спрямо SHIV₈₉₆, но не и спрямо SHIV_{89 6}р.

Поради малкия брой животни в групата (две), трудно е да се изведат конкретни изводи. Обаче, нивото на имунния отговор, както хуморален, така и клетъчен, генериран от двете пептидни форми, съдържащи 529 SE/GM-CSF е количествено по- нисък от имунния отговор, наблюдаван в животни, на които е прилаган IFA. Винаги е отбелязвано, че IFA не е доказан компонент в състави за търговско използване при хора. В допълнение, има известни лимитирани доказателства, че функционалните свойства и фенотипа (напр. цитокиновите профили) на отговарящите клетки могат да бъдат различни в зависимост от използваната аджувантна форма.

В още един експеримент, животни от втори вид примати, макака циномолгус, се имунизират с C4-V3_{89 6P} пептид, който е модифициран чрез изменение на глутаминовата киселина при амино киселинен остатък 9 при валина. Полученият пептиден конюгат, означен C4(E9V)-V3₈₉ бр, има следната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Vai Vai Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn

Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5).

Животните се имунизират c C4-V3₈₉₆p пептид, или без аджувант или с комбинация от 529 SE плюс GM-CSF.

Резултатите показват, че когато пептида C4-V3₈₉₆p се прилага чрез интрамускулно инжектиране в комбинация с 529 SE/ GM-CSF проявява значително по- високи пептид- специфични IgG титри в серум в сравнение със същото количество от C4-V3₈₉₆p пептида, прилаган трансназално без аджувант (Фигури 7-9). Резултатите от този експеримент ясно показват, че когато един HIV пептиден имуноген се прилага в комбинация с подходящата комбинация от аджуванти, е способен да прояви системен хуморален имунитет.

Предпочитани имуногенни състави за предотвратяване или лечение на заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане (отделна молекула) в гостоприемник гръбначно, които съдържат аджувантните комбинации от настоящето изобретение, включват онези съдържащи части от бета амилоидния прекурсорен протеин (АРР). Това заболяване е отнесено към варианти на болеста на Алцхаймер, амилоидозис или амилоидогенно заболяване, βамилоидният пептид (означаван също като Αβ пептид) е един интернален, 39-43 амино фрагмент на АРР, който е генериран чрез обработка на АРР с β и γ секретазните ензими. Пептида Αβ1-42 пептида има следната последователност:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai lie Ala (SEQ ID NO: 6)

У някои п , отлагането на амилоид приема форма на агрегиран Αβ пептид. Изненадващо, понастоящем е установено, че прилагането на изолиран Αβ пептид индуцира имунен отговор спрямо Αβ пептидната компонента на едно амилоидно отлагане в гостоприемник гръбначно (47). Така, имуногенните състави от това изобретение включват аджувантните състави от настоящето изобретение плюс Αβ пептид, а така също и фрагменти, производни или модификации на Αβ пептид и антитела спрямо Αβ пептид или фрагменти, техни производни или модификации. Един такъв фрагмент на Αβ пептида е 28 амино киселинният пептид, притежаващ следната последователност:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys (SEQ ID N0:7)

Други фрагменти на Αβ пептида, които са от интерес включват, но не са ограничени до, амино киселини 1-10, 1-7, 1-6, 1-5, 3-7, 1-3 и 14, които могат да бъдат прилагани в неконюгирана форма, или конюгирани към един неродствен протеин.

Серии от изследвания са проведени с пептида Αβ1-42 пептида и различни аджуванти. Обобщението на резултатите ще бъдат представени сега.

В един първи експеримент, мишка Sw/ss- Webster имунизирана субкутанно в хълбока с Αβ1-42 пептида, генерира пептид- специфично антитяло IgG, lgG1 и lgG2a титри, които показват, че Αβ1-42 пептида е жизнеспособен кандидат антиген. Добавяне на GM-CSF към 529 SE към Αβ1-42 пептида води до получаване на повишени титри на серумни антитела IgG, lgG1 и lgG2a в сравнение с реципиенти на 529 SE към Αβ1-42 пептида (виж Таблици 3-8). Серумните антитела от отделна мишка, получаваща комбинацията от 529 SE плюс GM- CSF се повишават в повечето случаи и се повишават по- бързо в сравнение с мишка, получаваща 529 SE самостоятелно (данни не са посочени). Когато първият експеримент се повтори с по- възрастна Sw/ss- Webster мишка (6-8 месечна вместо 3 месечна(, се наблюдават сходни резултати като тези от Таблица 3-8 (данни не са представени).

Във втори експеримент, мишка Sw/ss- Webster се имунизира субкутанно в хълбока с Αβ1-42 пептида и 529 SE , с различни количества от GM-CSF. Крайните IgG титри се повишават по начин, зависещ от дозата на GM-CSF (от 0.1 до 1 до 10 цд). IgG титрите за всички комбинации от 529 SE плюс GM-CSF са по- високи от тези за групите, получаващи друг аджувант, QS-21, самостоятелно или с GMCSF. Титрите на IgG субклас също са повишени за различните 529 SE плюс GM-CSF групи в сравнение с групите, получили 529 SE плюс GM-CSF в първата доза и 529 SE самостоятелно във втората доза (Таблица 10). Титрите на lgG2a субклас също се повишават за различните групи 529 SE плюс GM-CSF в сравнение с 529 SE самостоятелно по зависим от дозата начин (Таблица 11).

В трети експеримент, мишка Swiss- Webster се имунизира субкутанно в хълбока с пептида Αβ-42 и 529 SE със или без различни количества GM-CSF. Крайните стойности на IgG се повишават за различните групи от 529 SE плюс GM-CSF (0.5 до 2 до 5 до 10 цд), макар и не в зависим от дозата мониер. Титрите както на lgG1, така и на lgG2 субкласове също се повишават за различните 529 SE плюс GM-CSF групи в сравнение с групата 529 SE самостоятелно, макар и не в зависим от дозата маниер (Таблици 13 (lgG1) и 14 (lgG2a)).

В четвърти експеримент, се използват трансгенни мишки, които експресират вариантна форма на β-амилоиднен прекурсорен протеин (АРР) притежаващ мутация при остатък 717, с валин заместен от фенилаланин (49). Тази мутация е свързана със семейното заболяване на Алцхаймер при хора. Тези трансгенни мишки (означени PDAPP мишки) прогресивно развиват много от патологичните прояви на болестта на Алцхаймер, включително отлагания на Αβ, невритни плаки и астроцитоза, и това служи като модел на животни за заболяването на Алцхаймер по хората.

В този четвърти експеримент, мишки PDAPP се имунизират субкутанно с пептида Αβ1-42 с или без различни ажуванти и в дозите, показани на Таблица А. Специфично, мишките от Група 1 получават пептида Αβ1-42 с MPL™ (Corixa, Hamilton, МТ) в стабилна емулсионна форма (SE) като позитивна контрола; мишките от Група 2 получават пептида Αβ1-42 с MPL™ SE плюс миша GM-CSF; мишките от Група 3 получават пептида Αβ1-42 с 529 SE плюс GM-CSF; мишките от Група 4 получават PBS като негативна контрола. Групите 2 и 3 проявяват по- остро повишение в анти- Αβ1-42 антитяло титърните стойности, а така също и по- висок пик на тигъра в сравнение с Групи 1 или 4. Обаче, титрите в Групите 2 и 3 се връщат до еквивалентния тигър на Група , позитивните контроли в рамките на 2-3 месеца (Фигура А). Групи 1, 2 и 3 показват значително понижение в нивата на мозъчен Αβ както е измерено с ELISA (Таблици В-С и Фигури В-С), по- ниско амилоидно натоварване (Таблица D и Фигура D) и по- малка атрофия на невритите (Таблица Е и Фигура Е) в сравнение с негативните контроли на Група 4. Групи 2 и 3 притежават значителна редукция в астроцитозата в сравнение с позитивните контроли на Група 1 (Фигура F).

Така, аджувантните свойства на 529 SE и GM-CSF или IL-12 се явяват синергистични когато са включени в една форма.

Антигенните състави от настоящето изобретение модулират имунния отговор чрез подобряване антитяло отговора на гръбначните гостоприемници и клетъчно- медиираният имунитет след въвеждане на антигенен състав, включващ антиген, избран от патогенен вирус, бактерия, гъбе или паразит и в ефективно стимулиращо количество на AGP като 529 (в водна или стабилна емулсионна форма) комбинирана с цитокин или лимфокин, по- специално GM- CSF или IL-

12.

Други цитокини или лимфокини е показано, че имат имуно модилираща активност, включително, но без ограничение до интерлевкини 1-алфа, 1-бета, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 и 18, интерлевкини- алфа, бета и гама, гранулоцитен колонии стимулиращ фактор и тумор некрозисните фактори алфа и бета.

Агонисти на или антагонисти на определени цитокини или лимфокини също са включени в обхвата на настоящето изобретение. Както е използван тук, терминът “агонист” означава молекула, която повишава активността на, или функциите по същия начин, както посочените цитокини или лимфокини. Пример на такъв агонист е имитирането на посочените цитокини или лимфокини. Както е използван тук, терминът “антагонист” означава молекула, която инхибира или придотвратява активността на посочените цитокини или лимфокини. Примери на такива антагонисти са разтворимият IL-4 рецептор и разтворимият TNF рецептор.

Както е използван тук, терминът “ефективно стимулиращо количество” означава доза от комбинациятя аджуванти, описана тук, която е подходяща да елиминира повишен имунен отговор спрямо избран антиген в гостоприемник гръбначно, сравнено с гостоприемник, получаващ този избран антиген в отсъствието на комбинацията от аджуванти. Конкретната доза ще зависи частично от възрастта, теглото и здравословното състояние на гостоприемника, а така също и от метода на прилагане и антигена. В предпочитан вариант на изпълнение, комбинацията от аджуванти ще включва 529 в границите на 0.1- 500 цд/доза; в повече предпочитан вариант на изпълнение, границата е 1- 100 цд/доза. Подходящите дози се определят от специалиста в областта. Антигенните състави от това изобретение може също да бъдат смесени с имунологично приемливи разредители или носители по обичаен маниер за получаване на инжекционни течни разтвори или суспенсии.

Антигенните или имуногенни състави от това изобретение се прилагат на гръбначни - хора или животни по различни начини, включително, но без да се ограничават до интраназално, орално, вагинално, ректално, парентерално, интрадермално, трансдермално (виж, напр. Международно пат. заявка WO 98/20734 (50), включена в приложената литературна справка), интрамускулно, интраперитонеално, субкутанно, интравенозно и интраартериално. Количеството на антигенната компонента или компоненти от антигенния състав ще варира в зависимост от идентичността на антигена, а така също и от възрастта, теглото и здравословното състояние на гостоприемника, а така също и от метода на приложение. Отново, подходящите дози се определят от специалистите в областта. За предпочитане е, макар и да не е задължително, антигена и комбинацията от аджуванти да бъдат прилагани по един и същи начин. Броя на доите в режима на приложение за антигенния състав също се определят от специалистите в областта. В някои случаи, стимулиращите свойства на комбинацията от дажуванти може да понижи броя на необходимите дози или времето на целия курс на режима на прилагане.

Комбинациите от аджуванти от настоящето изобретение са подходящи за използване в антигенни или имуногенни форми, съдържащи широко разнообразие антигени от патогенни микроорганизми, включително но без да се ограничават до вируси, бактерии, гъби или паразитни микроорганизми, които инфектират гръбначни- хора или животни, или от ракови клетки или туморни клетки. Антигена може да включва пептиди или полипептиди, получени от протеини, а така също фрагменти от който и да е от следните: захариди, протеини, поли- или олигонуклеотиди, ракови или туморни клетки, алергени, отделни молекули (като амилоиден прекурсорен протеин) или други макромолекулни компоненти. В някои случаи в антигенния състав са включени повече от един антиген.

Предпочитани вирусни имуногенни състави, съдържащи аджувантните комбинации от настоящето изобретение включват тези, които са насочени към предотвратяване и/или лечение на заболяване, причинено от, без да се ограничава до, вируса на имунна недостатъчност при хората, вируса на имунна недостатъчност Simian, респираторния синцитиален вирус, парагрипният вирус типове 1-3, грипният вирус, вируса на херпес симплекс, цитомегаловируса по хората, вируса на Хепатит А, вируса на Хепатит В, вируса на Хепатит С, човешки папиломавирус, полиовирус, ротавирус, калицивируси, вируса на дребната шарка, вируса на едрата шарка, вируса на рубеолата, вирус на беса, вируса на кучешка ... ? , вирус на кожа...?, метапневмониен вирус по хората, птичи пневмовирус (вирус на ринотрахеита по пуйките), Хендра вирус, Нипах вирус, коронавирус, парвовирус, вируса на инфекциозния ринотрахеит, котешки левкимиен вирус, вируса на инфекциозния перитонит по котките, вируса на инфекциозния бурсит по птиците, вируса на болестта на Нюкасъл, вируса на болестта на Марек, вируса на респираторен и репродуктивен синдром по свинете, вируса на конския артрит и различни енцефалитни вируси.

Предпочитаните бактериални имуногенни състави, съдържащи аджувантните комбинации от настоящето изобретение, съдържащи аджувантните комбинации от това изобретение включват, такива, насочени към предотвратяване и/или лечение на заболявания, причинени от, без да се ограничават до, Haemophilus influenzae (типичен и атипичен), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, Streptococcuspneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Naisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis, Chlamidia pneumoniae, Chlamidiapsitacci, Bordetella pertussis, Alloiococcus otiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Esherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium- Mycobacterium intracellularae complex, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, pasteurellla Haemolitica, Pasteurella multocida, . Actinobacillus pleuropneumoniae and Mycoplasma gallisepticum.

~ Предпочитаните имуногенни състави срещу гъбни патогени, съдържащи комбинациите от аджуванти съгласно настоящето изобретение включват такива, насочени към предотвратяване и/ или лечение на заболявания, причинени от, но без да се ограничават до Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus u Histoplasma.

Предпочитаните имуногенни състави срещу паразити, съдържащи комбинациите от аджуванти съгласно настоящето изобретение включват такива, насочени към предотвратяване и/ или лечение на заболявания, причинени от, но без да се ограничават до Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Shistosoma, Cryptospoidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii u Pneumocystis carinii.

Предпочитаните имуногенни състави за терапевтичен или профилактичен противораков ефект у гръбначни, които съдържат аджувантните комбинации от това изобретение, включват такива, използващи раков антиген или тумор- свързан антиген, включващ без да се ограничават до, специфичен за простата антиген, карциноембрионен антиген, MUC-1, Нег2, СА-125 и MAGE-3.

Предпочитаните имуногенни състави за смегчаване на отговорите спрямо алергени при бозайници, които съдържат аджувантните комбинации от това изобретение, включват такива с участието на един алерген или негов фрагмент. Примери на такива алергени са описани в US патент № 5 830 877 (51) и международна публикация на патентна заявка WO 99/51259 (52), включени в приложената литературна справка, и се отнасят до полен, инсектицидни отрови, гъбни спори и лекарства (като пеницилин). Имуногенните комбинации повлияват продуцирането на IgE антителата, известна причина за алергични реакции.

Предпочитаните имуногенни състави за смегчаване отговорите спрямо отделни молекули у гостоприемник гръбначни, които съдържат аджувантните комбинации от настоящето изобретение, включват отделна молекула или неин фрагмент. Примери на такива молекули, в допълнение към Αβ1-42 пептида, описан по- горе, включват β- верижния инсулин, участващ в диабета, G17 молекулата, участваща в заболяването гастроезофагиален рефлукс, и антигени, които низходящо регулират автоимунните отговори на заболявания като мултиплена склероза, лупус и ревматоиден артрит.

В случаите на HIV и SIV, антигенните състави включват наймалко един протеин, полипептид, пептид или фрагмент получен от този протеин. В някои случаи, мултиплените HIV и SIV протеини, полипептиди, пептиди и/или фрагменти са включени в антигенните състави.

Аджувантните комбинирани форми от настоящето изобретение са подходящи също за включване като аджувант в полинуклеотидни имуногенни състави (известни също като ДНК имуногенни състави). Такива имуногенни състави могат по- нататък да съдържат улесняващи средства като бупивикаин (виж амер. Патент № 5 593 972 (53), който се съдържа в приложената литературна справка).

За по- доброто разбиране на изобретението са приложени следните примери. Примерите са само за целите на илюстрация и не са конструирани като ограничаващи обхвата на изобретението.

ПРИМЕРИ

Пример 1

Материали и методи

В експериментите, описани в Примери 2- 7 по- долу са използвани следните материали и методи.

Животни

Женски Balb/c мишки, на възраст 7-9 седмици се закупуват от Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY). Женски Sw/ssWebster мишки, на възраст 7- 9 седмици, също се закупуват от Taconic Farms, Inc. Всички мишки се отглеждат при условия, одобрени от Американската асоциация за акредитация на грижите за лабораторни животни. Мишките се аклиматизират към условията за отглеждане за една седмица преди началото на изследванията.

Антигени

В HIV експериментите от Примери 2-3 по- долу се използват два различни синтетични пептида. Последователността на мултиепитопния HIV-1-_MN пептид T1SP10MN(A)(-Cys) (отнасян тук като MN-10) е както следва:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 2).

Този пептид по- рано е описан (33, 34) и съдържа последователности от HIV-1 др120 _MN , които предизвикват CD4* Th отговори както при мишки, така и при хора, принципно неутрализираща детерминанта, и място, разпознато от CD8⁺ CTL в Balb/c мишка. Пептида е осигурен от Dr. R. Scearce (Duke University, Durham, NC). 3a CTL анализ, се използва един ирелевантен пептид, означен IIIB за сравнителни цели. Този пептид съответства на CTL епитопа в рамките на V3 бримката на HIV-1ni_B (Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr lie (SEQ ID NO: 8)), и е закупена от Genosys Biotechnologies Inc. (The Woodlands, TX). Пептидите се солюбилизират в стерилна вода и се разреждат в подходящи буфери, или клетъчно културална среда, преди използването.

В амилоидните експерименти от Примери 4-6 и 8 по- долу, се използва пептид, означен Αβ1-42. Последователността на Αβ1-42 е както следва:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai Vai lie Ala (SEQ ID NO: 6).

Този пептид е описан по- рано (47) и съответства на един вътрешен, 42 амино киселинен фрагмент на амилоиден прекурсорен протеин. Αβ1-42 е осигурен от Elan Pharmaceuticals (South San Francisko, СА). Пептида се солюбилизира в стерилна вода и разрежда в подходящи буфери, или клетъчно културална среда, преди използване.

Аджуванти

Всички 529- съдържащи аджувантни продукти са получени от Corixa (Hamilton, NT). 529 SE се изготвя като предварително изготвен в емулсия масло- във- вода сквален (0.8- 2.5% масло), притежаваща 529 концентрация в границите от 0- 50 цд/т1. Изготвя се алуминиев фосфат, а пълният аджувант на Фройнд се закупува от Difco Laboratories, Detroit, Ml. T1SP10MN(A) пептиди и аджуванта на Фройнд се емулгират в съотношение 1:1 с помощта на два свързани шприца. Рекомбинантно експресираният миши IL-12 се осигурява от Genetics Institute (Cambridge, МА). Рекомбинантен миши GM-CSF се закупува от Biosource International (Camarillo, СА) като свободен от носителя лиофилизиран прах. Stimulon™ QS-21 се закупува от Antigenics Inc. (Framingham, МА).

Имунизации

от конска ряпа. След инкубация, ямките се промиват и развиват с ABTS. Ямките се разчитат на 405 nm. Титрите се стандартизират с помощта на контролен серум.

Същият протокол е следван за анализ на Αβ1-42 пептидспецифично антитяло и разпределение на субкласовете, с изключение на това, че се използва концентрация от 0.3 цд/т1 за микротитърна пластинка.

Клетъчна пролиферация

За анализ на пролиферацията и in vitro цитокинов анализ,

Г* клетки от слезката се получават от мишка при означените периоди от време. Суспенсии от самостоятелни клетки се получават от събраното от 2-3 мишки. За пролиферация и цитокинов анализ, клетките се суспендират в 96 кладенчови културални панички с кръгло дъно, предварително покрити за една нощ с HIV пептидни антигени, контролни протеини или само с RPMI-10. Спленоцитите се добавят към 5x10⁵ клетки/на кладенче с помощта на културална среда с 2х заместители. Клетъчно културалните супернатанти се събират от тройно количество кладенчета три или шест пъти дневно след иницииране на културата. Непосредствено след събирането на супернатантата, културите се обработват с ³Н- тимидин за 18- 24 часа, и се събират за количествено определяне на клетъчната пролиферация.

Пример 2

Реципрочни крайни титри на анти- T1SP10MN(A)(-Cys) пептида от клас IgG и на неговите субкласове

Реципрочните крайни титри за пептида от субкласовете на IgG се измерват от серум (n=5 Balb/c), взет пет седмици след изходната имунизация, две седмици след втората имунизация. Мишката се имунизира субкутанно в хълбока с 25 pg T1SP10MN(A)(-Cys), с общо 0.2 ml, разпределени еднакво в две 0.1 ml инжекции от всяка страна, на седмица 0 и седмица 3. 529 SE се разрежда за получаване на емулсия, съдържаща 1.25% скваленово масло и 25 цд 529 за една доза. SE е емулсионна среда масло- във вода, състояща се от сквален, глицерол и емулгиращо средство. Рекомбинантният миши IL12 се дава по 40 пд/ мишка. Рекомбинантният GM-CSF се дава в доза W 25 pg/мишка. Резултатите са представени на Таблица 1, с геометричните средни титри плюс стандартни грешки за всяка група.

Таблица 1

Крайни титри

Аджуванти	μ9 HIV пептид	IgG	igGi	lgG2a
529 (25) SE (1.25% масло)	25	206,301 +/- 175,149	37,567 +/- 31,526	180,671 +/- 277,211
529 (25) SE (1.25% масло) + rlL-12(.O4)	25	460,516+/- 690,712	74,269 +/- 169,868	222,446 +/- 400,716
529 (25) SE (1.25% масло) + GM-CSF(25)	25	1,085,658 +/- 1,064,924	238,379 +/- 62,199	117,657 +/- 25,301

Пример 3

CTL Анализ в мишки Balb/c

Протокола от Пример 2 е следван и по отношение имунизацията на мишките. Изследва се CTL активността на спленоцити, изолирани от мишка 14 дни след вторичната имунизация. 529 SE се формират с 25 цд 529 SE, съдържащ 1.25% масло, със или без 10 цд GM-CSF или 40 ng IL-12, плюс 25 цд T1SP10MN (A) (-Cys).

За CTL анализ, от имунизирана мишка, 14 дни след вторичната имунизация се отделят спленоцити. Протокола, описан по- рано (39) е следван по същество. Накратко, взимат се спленоцити от три мишки за група. Спленоцит- ефекторните клетки (4x10⁶/ml) се стимулират повторно в 24 кладенчови културални панички в обем от 1.5- 2 ml за седем дни или с 1 pg/ml от пептида “MN-10”, с “ШВ Ютег CTL епитопен пептид, или не- HIV пептид. И двата CTL епитопа са рестриктирани до H-2D^d. Културите се заместват с 10U/ml рекомбинантен миши IL-2 (Biosource) за последните пет дни от културата. За анализ на цитокиновата активност, Р815 клетки се маркират с Сг⁵¹ и обработват с 5gg/ml (ШВ или MN-10) за четири часа, и се добавят към спленоцит- ефекторни клетки. Когато се използва не- HIV пептид, комплекта от мишенни клетки не се обработва. Използват се трикратни разреждания на ефектора спрямо мишенни клетки (“Е:Т”), от 30:1 до 1.1:1. Процента на CTL активността се изчислява като процента на освобождаване на хром, с помощта на формулата: ((специфично освобождаване на хром- спонтанно освобождаване на хром)) х 100. Освобождаването на хром се изпитва след шест часов инкубационен период. Средното спонтанно освобождаване на хром е винаги по- малко от 15% от максималното освобождаване. Резултатите от данните от ден 28 са показани на Таблица 2.

Таблица 2

Съотношения на ефектор спрямо мишена

529 SE+:	Пептид MN-10	Пептид IIIB	Без пептид
Е: Т% специфично освобождаване	* IL-12	GM- CSF	‘IL-12	GM- CSF	* IL-12	GM- CSF
30: 1	31	53 71	8	11 19	4	8 8
10:1	19	41 70	5	8 21	2	5 9
3.3:1	5	11 35	2	1 5	-2	-2 -1
1.1:1	2	4 14	1	0 2	-3	-2 -3

* Без допълнителен аджувант

Пример 4

Реципрочни крайни титри на анти- Αβ 1 - 42 пептида от клас IgG и на неговите субкласове

Аутбредни мишки порода Swiss- Webster се разделят на групи от по 10 мишки всяка. Всяка група получава 10 pg от пептида Αβ1-42, което съответства на вътрешен, дълъг 42 амино киселини участък от АРР. Първата група не получава аджувант; втората група получава 50 pg от 529 SE, съдържащ 2.5% масло; третата група получава 50 pg 529 SE, съдържащ 2.5% масло плюс 10 pg GM-CSF; четвъртата група получава 10 pg GM-CSF; петата група получава SE, съдържащ 1.25% масло; шестата група получава SE, съдържащ 1.25% масло плюс 10 pg GM-CSF; седмата група получава 50 pg QS-21. Мишката се имунизира субкутанно в хълбока с общ обем от 0.2 ml, поделени по равно от двете страни в основата на опашката/хълбока. Имунизациите се провеждат в седмица 0 и седмица 3.

Взима се кръв от мишките в дните 0, 20, 35 и 70. Серума от отделните мишки се анализира. Реципрочни крайни анти- Αβ1-42 IgG точки, общи и за субкласовете титри се измерват от индивидуалните серуми (п=10 Swiss- Webster) в седмица 5 и седмица 10. Резултатите за крайните IgG точки са дадени на Таблици 3 (седмица 5) и 4 (седмица 10). Резултатите за lgG1 субклас са дадени на Таблици 5 (седмица 5; групите, не получаващи аджувант или QS-21 не са измервани) и 6 (седмица 10). Резултатите за субклас lgG2a са дадени на Таблица 7 (седмица 5; групите, не получаващи или QS-21 не се измерват) и 8 (седмица 10).

Таблица 3

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 IgG в седмица 5

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
без	12,976	+/-14,386
529 SE (50)	16,204	+/- 225,221
529 SE (50) + GM- CSF(10)	608,474	+/- 623,575
GM- CSF (10)	214,497	+/- 609,067
SE (1%)	33,342	+/-15,493
SE (1%) + GM-CSF (10)	453,367	+/- 162,750
QS-21 (50)	4,076	+/- 9,036

Таблица 4

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 IgG в седмица 10

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
без	21,426	+/- 24,959
529 SE (50)	86,847	+/- 187,792
529 SE (50) + GMCSF(10)	943,075	+/-989,177
GM- CSF (10)	1,049,414	+/- 390,525
SE (1%)	255,631	+/-114,025
SE (1%) + GM-CSF (10)	1,005,899	+/-407,108
QS-21 (50)	47,222	+/- 159,775

Таблица 5

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 IgG 1 в седмица 5

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (50)	461	+/- 627
529 SE (50) + GM- CSF(10)	1,936	+/-12,680
GM- CSF (10)	8,654	+/- 10,100
SE(1%)	4,515	+/- 6,273
SE(1%) + GM-CSF (10)	24,422	+/- 19,764

Таблица 6

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 lgG1 в седмица 10

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
без	2,086	+/- 2,448
529 SE (50)	969	+/- 521
529 SE (50) + GM- CSF(10)	2,076	+/- 4,901
GM- CSF (10)	8,483	+/-10,998
SE (1%)	3,623	+/- 3,456
SE (1%) +GM-CSF (10)	12,472	+/-11,502
QS-21 (50)	988	+/- 895

Таблица 7

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 lgG2a в седмица 5

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (50)	2,224	+/-10,099
529 SE (50) + GM- CSF(10)	94,764	+/-849,173
GM- CSF (10)	15,554	+/- 13,191
SE (1%)	1,484	+/- 2,271
SE(1%) + GM-CSF (10)	8,405	+/-31,303

Таблица 8

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 lgG2a в седмица 10

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
без	5,910	+/- 39,626
529 SE (50)	5,944	+/-9,100
529 SE (50) + GM- CSF(10)	47,694	+/- 88,053
GM- CSF(10)	64,910	+/- 54,824
SE (1%)	2,350	+/- 2,326
SE (1%) + GM-CSF (10)	7,421	+/-31,153
QS-21 (50)	3,544	+/- 26,332

Пример 5

Тотални реципрочни крайни титри на анти- Αβ1 - 42 пептида и на неговите субкласове с вариращи количества на GM-CSF

Аутбредни мишки порода Swiss- Webster се разпределят в групи от по десет мишки. Всяка от групите получава две имунизации от 30 цд от пептида Αβ1-42 в седмици 0 и 3. Първата група получава 25 цд от 529 SE плюс 10 ug GM-CSF; втората група получава 25 цд от 529 SE плюс 1 цд GM-CSF; третата група получава 25 цд от 529 SE плюс 0.1 цд GM-CSF; четвъртата група получава 25 цд от 529 SE плюс 10 цд GM-CSF в първичната доза, последвано само от 25 цд от 529 SE само във втората доза; петата група получава 25 pg QS-21; шестата група получава 25 цд QS-21 плюс 10 цд GM-CSF. Мишките се имунизират субкутанно в хълбока с тотален обем от 0.2 ml, разпределени по равно във всяка от двете страни в основата на опашката/ при хълбока.

Мишките се подлагат на кръвопускане в дните 0, 21 и 42. Реципрочни крайни титри на анти- Αβ1- 42 пептида от клас IgG и на неговите субкласове се измерват от индивидуален серум (п=10) в седмица 6. Крайните резултати за субклас IgG 1 са дадени на Таблица

10. Резултатите за субклас lgG2 са дадени на Таблица 11.

Таблица 9

Крайни титри на Анти- Αβ1-42 пептида от клас IgG в седмица 6

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (25) + GM- CSF(10)	353,660	+/-148,940
529 SE (25) + GM- CSF(1)	150,935	+/-218,332
529 SE (25) + GM- CSF(0.1)	86,145	+/-91,724
529 SE (25)*	25,365	+/- 54,083
QS-21 (25)	1,866	+/-18,430
QS-21 (25) + GM-CSF (10)	48,970	+/-116,106

*Първата доза е 529 SE (25) + GM-CSF (10); втората доза е 529 SE (25) самостоятелно

Таблица 10

Крайни титри на анти- Αβ1-42 пептида от lgG1 в седмица 6

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (25) + GM- CSF(10)	10,867	+/-18,333
529 SE (25) + GM- CSF(1)	24,909	+/-18,625
529 SE (25) + GM- CSF(0.1)	6,608	+/-17,736
529 SE (25)*	4,511	+/-8,154
QS-21 (25)	581	+/-126
QS-21 (25) + GM-CSF (10)	7,618	+/-29,145

‘Първата доза е 529 SE (25) + GM-CSF (10); втората доза е 529 SE (25) самостоятелно

Таблица 11

Крайни титри на анти- Ар 1-42 пептида от lgG1 в седмица 6

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (25) + GM- CSF(10)	243,758	+/- 354,383
529 SE (25) + GM- CSF(1)	116,222	+/-143,140
529 SE (25) + GM- CSF(0.1)	98,018	+/- 391,797

529 SE (25)*	16,018	+/- 165,298
QS-21 (25)	Не са дадени	+/- не са дадени
QS-21 (25) + GM-CSF (Ю)	30,133	+/- 134,774

Пример 6

Тотални реципрочни крайни титри на анти- Αβ 1 - 42 пептида и на неговите субкласове с вариращи количества на GM-CSF

Аутбредни мишки порода Swiss- Webster се разпределят в групи от по десет мишки. Всяка от групите получава имунизации в седмици 0 и 3. В седмица 0 на имунизацията, първата група получава 50 цд от 529 SE; втората група получава 50 цд от 529 SE плюс 10 цд GM-CSF; третата група получава 50 цд от 529 SE плюс 5 цд GM-CSF; четвъртата група получава 50 цд от 529 SE плюс 2 цд GM-CSF; петата група получава 50 цд от 529 SE плюс 0.5 цд GM-CSF; шестата група получава 1% SE. В третата седмица от имунизацията, първата до пета групи получават същата доза в седмица 0, с изключение на това, че 529 SE се редуцира от 50 на 25 цд. Количеството на полученият SE, получено от шестата група се повишава от 1% в седмица 0 до 1.2% в седмица 3. Мишките се имунизират субкутанно в хълбока с тотален обем от 0.2 ml, разпределени по равно във всяка от двете страни в основата на опашката/ при хълбока.

Мишките се подлагат на кръвопускане в дните 0, 20 и 35. Реципрочни крайни титри на анти- Αβ1- 42 пептида от клас IgG и на неговите субкласове се измерват от индивидуален серум (п=10) в седмица 5. Крайните резултати за субклас lgG1 са дадени на Таблица

13. Резултатите за субклас lgG2 са дадени на Таблица 14.

Таблица 12

Крайни титри на анти- Αβ1-42 пептида от IgG в седмица 5

Аджуванти	Г еометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (50)	6,119	+/-3,103
529 SE (50) + GMCSF(10)	53,312	+/- 78,421
529 SE (50) + GM- CSF (5)	16,392	+/-17,706
529 SE (50) + GM- CSF (2)	321,524	+/- 224,875
529 SE (50) + GM-CSF (0.5)	36,934	+/- 29,449
SE (1%)	7,784	+/- 9,041

Таблица 13

Крайни титри на анти- Αβ1-42 пептида от IgG 1 в седмица 5

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (50)	499	+/- 676
529 SE (50) + GM- CSF(10)	1,424	+/- 2,468
529 SE (50) + GM- CSF (5)	3,407	+/- 5,653

529 SE (50) + GM- CSF (2)	18,328	+/- 8,067
529 SE (50) + GM-CSF (0.5)	3,526	+/-17,606
SE (1%)	2,556	+/-5,615

Таблица 14

Крайни титри на анти- Αβ1-42 пептида от lgG2a в седмица 5

Аджуванти	Геометрична стойност	Стандартна грешка
529 SE (50)	1,386	+/-5,173
529 SE (50) + GM- CSF(10)	48,519	+/-148,981
529 SE (50) + GM- CSF (5)	11,659	+/-23,132
529 SE (50) + GM- CSF (2)	26,190	+/- 167,340
529 SE (50) + GM-CSF (0.5)	694	+/- 40,254
SE (1%)	2,556	+/-1,325

Пример 7

Имунизация с пептидите Th-CTL и C4-V3 на маймуни Резус

Построени са следните експерименти за директно сравняване на броя на комбинациите от пептидни и аджувантни форми във видове от приматите (маймуни резус) с оглед идентифициране на потенциалните пептидно/ аджувантни комбинации за подготовка на клинични изпитания на хора. По- специално, изследва се аджувантната форма 529 SE с човешки GM-CSF в сравнение с непълен аджувант на Фройнд (IFA) в комбинация с (1) един SIV envполучен Т- хелперен/ SIV gag CTL пептиден конюгат (ST1- р11С) със следната последователност:

Arg Gin lie Asn Thr Trp His Lys Vai Gly Lys Asn Vai Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO: 3);

или (2) един получен от HIV-1 С4- V3 пептиден конюгат (С4 V3₈₉₆p), притежаващ следната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4).

Построяване на изследването: Общо 8 животни са използвани за това изследване, 4 Mamu- А*01+ и 4 Mamu-A*01-, както е описано на Таблица 15.

Таблица 15

529 SE & GM-CSF спрямо IFA

Г рупа #	# Животни	Животно	Имуногенен състав	Аджувант
1	2 Mamu- А01 +	95X009 93 Х0211	ST1-p11C	IFA
2	2 Mamu- А01 +	98N002 98N008	ST1-p11C	529 SE/GM-CSF

3	2 Mamu- А01-	98N007 98N013	С4- V3ag.6P	IFA
4	2 Mamu- А01-	95X011 96X004	С4- V3ag.6P	529 SE/GM- CSF

Животните от група 1 получават 0.5 ml от Th-CTL пептида ST1р11С (1.0 mg/ml) в емулсия масло във вода с 0.5 ml IFA в тотален обем от 1.0 ml. Група 2 от животните получава 0.5 ml ST1-p11C (1.0 mg/ml) в комбинация с 250 pg човешки GM-CSF, 50 pg 529 SE с крайна концентрация на маслото от 1% в тотален обем 0.1 ml. Група 3 от животните получава 0.5 ml С4- V3_896P от пептида (2.0 mg/ml) в емулсия масло във вода с 0.5 ml IFA, с крайна концентрация на маслото от 1% в тотален обем 0.1 ml. Накрая група 4 от животните получава 0.5 ml С4- V3₈₉._6P от пептида (2.0 mg/ml) в комбинация с 250 pg човешки CM- CSF, 50 pg от 529 SE с крайна концентрация на маслото от 1% в тотален обем 0.1 ml.

Всички животни се имунизират интрамускулно по схема 0, 4 и 8 седмици. Проби от периферна кръв се взимат непосредствено преди и 1 или 2 седмици след всяка имунизация за наблюдаване на индуцирането на CTL чрез тетрамерно оцветяване, р11С (Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gin Met; SEQ ID NO: 3, амино киселини 19- 27)специфични ELISPOT отговори и културални CTL отговори (Групи 1 и

2), а така също за пептид специфични антитяло отговори (Групи 1-4).

Безопасност и толерантност

ST1- р11С + IFA: Формата ST1- р11С + IFA, която се прилага чрез интрамускулно инжектиране в определено място три пъти в група от 1 животно, се свързва със значима реакция в мястото на инжектиране. Едно животно (93 х 021) разви абсцес с големина 1.5 см в мястото на инжектирането две седмици след втората имунизация. Друго животно (95 х 009) също разви абсцес с размер 2.0 см в мястото на инжектирането две седмици след третата имунизация.

ST1- р11С + 529 SE/GM-CSF: Формата ST1- р11С + 529 SE/GMCSF, която се прилага чрез интрамускулно инжектиране в определено място три пъти в група от 2 животни, се асоциира със слаби неблагоприятни ефекти. И двете животни от групата повръщат скоро след като получат третата имунизация в седмица 8. Не са отбелязани други неблагоприятни ефекти.

С4-УЗ_Ядвр + IFA: Формата C4-V3₈₉._6P + IFA, която се прилага чрез интрамускулно инжектиране в определено място три пъти в групата от животни, се свързва със значима реакция в мястото на инжектирането. Едно животно (98п013) развива абсцес с размер 1.0 см в мястото на инжектирането една седмица след втората имунизация. Този абсцес на животното изисква подсушаване и превръзка четири седмици след това.

С4-УЗ_Яд др + 529 SE/GM-CSF: Формата С4-У3_896Р + 529 SE/GMCSF, която се прилага чрез интрамускулно инжектиране в определено място три пъти в групата от 4 животни, се свързва с един малък неблагоприятен ефект. Едно от групата от 4 животни (95 х 011) повърна скоро след получаването на третата имунизация в седмица

8. Не са отбелязани други неблагоприятни ефекти.

Във всички групи от по 1 и по 3 животни, които получават IFA като аджувант, са наблюдавани значими реакции в мястото на инжектирането. Тези резултати показват, че 0.5 mis от IFA е слабо толериран когато е даван чрез интрамускулно инжектиране в определно място на инжектиране. Несъществен е също факта, че 3 от животни, получили 529 SE/GM-CSF като аджувант в седмица 8, повръщат скоро след имунизирането. Доколкото използваният анестетик (кетамин) е известно, че предизвиква повръщане, няма друге случаи на повръщащи животни по време на целия курс на изследването. По същото време, съществуват недостатъчни доказателства за това да бъде приписано повръщането на животните към който и да е от неблагоприятните ефекти, свързвани с 529 SE/ GM-CSF.

Резултати: Индуциране на клетъчни имунни отговори (Групи 1 и 2)

Оцветяване на р11С тетрамер от пресно взета кръв: Преди имунизацията, и една и две седмици след имунизация, пресно изолирана периферна кръв от всички позитивни на Mamu-A*01 животни (Група 1 и 2) се скринират за присъствие на р11Сспецифични CD3⁺CD8⁺ лимфоцити чрез оцветяване с разтворим МНС тетрамер от клас I. Както е показано на Таблица 16, само 1 животно (96 х 021), което е получило ST1- р11С пептида в комбинация с IFA, показва доказателство за индуцирани от имунизацията клетъчни имунни отговори в нестимулирана периферна кръв.

Таблица 16

Процент оцветяване с тетрамера р11С и р11С- специфични ELISPOT отговори в пресно изолирана периферна кръв

		Седмица 0 Пре-имунизация	Седмица 5 1 седм. след 2-та имунизация	Седмица 6 2 седм след 2-та имунизация
Животно1 /(Група)	Форма	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв*	ELISPOT #SFC/10⁸клетки	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв	ELISPOT #SFC/10® клетки	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв	ELISPOT #SFC/10’ клетки

95x009(1)	ST1-p11C + IFA	0.02	0.0	0.00	0.0	0.00	3.8
93x021(1)	STl-pHC + IFA	0.02	Nd®	0.15	56.3	0.12	21.9
98п002(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	0.00	0.6	0.05	0.0	0.01	6.3
98п008(2)	ST1-P11C * 529 SE/ GM-CSF	0.05	0.0	0.04	15.0	0.01	9.4

		Седмица 8 4 седм. след 2-та- имунизация	Седмица 9 1 седм. след 3-та имунизация	Седмица 10 2 седм след 3-та имунизация
Животно1 /(Група)	Форма	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв	ELISPOT #SFC/10’ клетки	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв	ELISPOT #SFC/10* клетки	Оцветяв. с тетрамер на прясна кръв	ELISPOT #SFC/10’ клетки
95x009(1)	ST1-P11C + IFA	0.00	Nd	0.01	2.5	0.02	1.9
93x021(1)	ST1-p11C + IFA	0.02	Nd	0.14	Nd	0.02	Nd
98n002(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	0.06	Nd	0.00	Nd	0.00	3.8
98n008(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	0.02	Nd	0.02	Nd	0.00	0.0

^а Докладвано като процента на позитивно оцветяване на лимфоцити от прясна кръв CD3⁺CD8⁺ с р11С- тетрамер;

^b Nd = няма данни (в тази и следващите таблици) р11С- специфични ELISPOT отговори: За по- нататъшна оценка индукцията на клетъчните имунни отговори в Група 1 и Група 2 от животните, лимфоцити от прясно изолирана кръв се подлагат на скрининг за наличието на р11С- специфични CD3⁺CD8⁺T лимфоцити чрез ELISPOT анализ. Както е показано на Таблица 16, само животно 93x021, което показва откриваеми нива на р11С- специфични CD8⁺ лимфоцити чрез анализ с тетрамер от прясна кръв, има откриваеми р11С- специфични CD8⁺ Т лимфоцити чрез ELISPOT анализ. Във всеки случай, позитивен отговор чрез р11С- тетрамерен анализ е потвърден от позитивен р11С- специфичен ELISPOT отговор.

р11С- специфични клетъчни имунни отговори след in vitro стимулация с пептид р11С: В усилието си за повишаване броя на р11С- специфичните клетки преди анализа, пресно изолирани лимфоцити от периферна кръв се стимулират in vitro с пептид р11С и rhlL-2. След 14 дни, получените ефекторни клетки се скринират за свързване на р11С- тетрамер, а така също и за функционална р11Сспецифична литична активност в стандартна CTL проба за хромно освобождаване. Резултатите от р11С- тетрамерния анализ и функционалната CTL проба са показани на Таблица 17. Животно 93x021, което постоянно показва р11С- специфични имунни отговори в прясно изолирани лимфоцити, показва много високо ниво на тетрамерно свързване и функционална CTL активност една седмица след втората имунизация. Това показва индуцирането на силно потентен р11С- специфичен клетъчен имунен отговор. В противоположност на резултатите, наблюдавани в пресно изолирани лимфоцити, едно животно от Група 2 (98n008, ST1-p11С+529 SE/GMCSF) започва да показва доказателство за р11С- специфични клетъчни имунни отговори две седмици след втората имунизация. Независимо от това, р11С- специфичният имунен отговор, наблюдаван в Група 2 е със значително по- ниско ниво на значимост от това, наблюдавано в съответното животно от Група 1.

Таблица 17

Процент на р11С- тетрамерно оцветяване и функционални р11С- специфични CTL отговори след in vitro пептидна р11С стимулация

		Седмица 0 Пре-имунизация	Седмица 5 1 седм. след 2-та имунизация	Седмица 6 2 седм след 2-та имунизация
Животно1 /(Група)	Форма	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 Е: Т⁶	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 Е:Т	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 Е: Т
95x009(1)	ST1-p11C + IFA	0.03	0.6	0.23	Nd	0.27	0.0
93x021(1)	ST1-P11C + IFA	0.03	0.0	34.31	66.3	15.15	4.69
98п002(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	0.21	0.0	Nd	Nd	0.73	Nd
98п008(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	0.16	0.0	Nd	Nd	5.84	Nd

		Седмица 8 4 седм. след 2-та имунизация	Седмица 5 1 седм. след 3-та имунизация	Седмица 6 2 седм след 3-та имунизация
Животно1 /(Група)	Форма	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 E:T	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 Е: Т	Оцветяв. с тетрамер	CTL 20:1 Е:Т
95x009(1)	ST1-P11C + IFA	Nd	Nd	0.76	3.0	0.72	0.0
93x021(1)	ST1-p11C + IFA	Nd	Nd	4.90	7.3	Nd	Nd
98п002(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	Nd	Nd	0.07	5.7	0.39	0.0
98п008(2)	ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF	Nd	Nd	2.24	11.4	5.00	0.0

^а Докладвано като процент на CD3⁺CD8⁺ клетки, оцветяващи се позитивно с р11Стетрамера.

^ь Докладвано като процентно съотношение на р11С- специфичният лизис при един ефектор спрямо мишена в (Е:Т) от 20:1.

Интрацелуларен цитокинов анализ:

За по- нататъшно охарактеризиране на функционалните и фенотипни свойства на индуцираните от имуноген р11С- специфични лимфоцити, интрацелуларната експресия се наблюдава на INF-γ, INFa, IL2 от типа Th1 и IL-4 цитокин от типа Th2. Интрацелуларната цитокинова експресия се наблюдава в лимфоцити от периферна кръв след една изходна in vitro стимулация в присъствието на 10 μΜ от пептид р11С и rhlL-2. Културите след това се поддържат за 14 дни с 40U/ml IL-2. След две седмици, култивираните клетки се стимулират или само със среда, или с 10 μΜ пептид плюс анти- човешки CD28 и анти- човешки CD49d за един час. След един час, клетките се третират с Brefeldin А за допълнителни 5 часа, което да позволи интрацелуларните цитокини да се концентрират в ендоплазматичния ретикулум. Интрацелуларната цитокинова експресия след това се определя количествено чрез цитометрия в поток (таблици 18 и 19).

Както е показано на Таблица 18, две седмици след in vitro стимулацията с пептид р11С, лимфоцитите от периферна кръв CD3* от животни от група 1 93x021 (ST1-p11C + IFA) показват ниско ниво на Th1 тип цитокинова експресия, с по- малко от 1.5% от всички клетки, активно секретиращи INF-γ, INFa или IL2. Приблизително 8% от всички CD3* лимфоцити след in vitro пептидната р11С стимулация са активно секретиращи Th2 тип цитокина IL-4, и IL-4 секретиращите клетки е установено че са лимитирани до CD3⁺CD8⁺ лимфоцитната субгрупа. След повторно излагане за кратко време на въздействието на пептида р11С, р11С- тетрамер⁺ и CD3⁺CD8⁺ лимфоцитните субгрупи активно секретират Th1 тип цитокините INF-γ и INFa, но не може да бъде индуцирано секретирането на зночително повишени нива на IL-2. След повторното излагане на пептида р11С, секрецията на Th2 типа цитокин IL-4 е неповлияна.

Таблица 18

Интрацелуларен цитокинов анализ, група 1 животно 93x021, две седмици след втората имунизация

Лимфоцитна субгрупа	Среда	INF-γ Р11С	^aS. I.	Среда	INFa p11C	S. I.
^ьр11Стетрамер*	977	27,612	28.3	90	20,342	226.0
⁰ обем CD3⁺	7,628	65,567	8.6	12,256	51,361	4.2
^bCD3⁺CD4⁺	2,488	5,545	2.2	6,252	2,827	0.4
^bCD3⁺CD8⁺	5,273	60,573	11.5	6,865	48,439	7.1

	Среда	IL-2 P11C	^aS. I.	Среда	IL-4 p11C	S. I.
°p11Cтетрамер*	751	2,004	2.7	Nd	Nd	Nd
^ьобем CD3⁺	2,879	6,463	2.2	78,069	90,563	1.2
^bCD3⁺CD4⁺	1,377	1,683	1.2	71,275	81,437	1.1
^bCD3⁺CD8⁺	1,502	4,783	3.2	6,794	9,126	1.3

Таблица 19

Интрацелуларен цитокинов анализ, група 2 животно 98п008, една седмица след третата имунизация

Лимфоцитна субгрупа	Среда	INF-γ Р11С	^aS. I.	Среда	INFa р11С	S. I.
^ьр11Стетрамер*	545	560	1.0	748	454	0.0
^ь обем CD3*	6,829	10,489	1.5	3,402	13,443	4.0
^bCD3⁺CD4⁺	3,310	3,789	1.1	1,428	2,567	1.8
^bCD3⁺CD8⁺	3,189	6,825	2.1	2,587	11,324	4.4

	Среда	IL-2 P11C	^aS. I.	Среда	IL-4 p11C	S. I.
^bp11Cтетрамер*	77	456	5.9	Nd	Nd	Nd
^ьобем CD3⁺	385	2,868	7.4	219,789	202,122	0.9
^bCD3⁺CD4⁺	1,379	1,761	1.3	170,804	158,175	0.9
^bCD3⁺CD8⁺	36	2,095	58.2	49,053	44,083	0.9

^а s. I., Стимулационен индекс ^ь Докладвано като брой означени клетки, оцветяващи позитивно за посочения цитокин на 10⁶ CD⁺ клетки, минус базисното оцветяване (изотипната контрола)

Както е показано на Таблица 19, две седмици след in vitro пептидната стимулация, CD3* лимфоцити от периферна кръв от групата 2 животно 98n008 (ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF) показват ниско ниво на цитокинова експресия от Th1 тип , с по- малко от 1.0% от всички клетки, активно секретиращи INF-γ, INFa или IL2. Интересно е това, че приблизително 20% от всички CD3⁺ лимфоцити са активно секретиращи цитокин IL-4 от типа Th2 , а 2.5 кратно повишаване в броя на IL-4 продуциращите клетки в сравнение с животните от Група

1. Какъвто е случая с животното от Група 1, IL-4 секретиращи клетки е установено, че са лимитирани до лимфоцитната субгрупа CD3⁺CD4⁺. След повторно излагане (ре-експониране) за кратко на пептида р11С, р11С- тетрамер* и CD3⁺CD8⁺ лимфоцитните субгрупи от животните от група 2, могат да бъдат стимулирани да секретират INFa, но не INF-γ. В противоположност на животните от Група 1, след пептидното реекспониране, се демонстрира значително повишаване на IL-2 експресията от CD3⁺CD8⁺ клетки. Такъв, какъвто е случая с животни от Група 1, след ре-експонирането на пептида р11С, секрецията на цитокина IL-4 от типа Th2 се повишава.

Резултати: Имуноген- индуцирани хуморални имунни отговори (Групи 1 и 2):

За оценка на индуцирането на имуноген- специфични хуморални антитяло отговори, се измерват титрите на анти- ST1р11С ELISA антитяло в серума на животните от група 1 и 2 непосредствено преди имунизацията и 1 и 2 седмици след втората и трета имунизации. Резултатите са обобщени на Таблица 20.

Таблица 20

Крайни стойности на ELISA титрите на серум от маймуни резус, имунизирани с ST1- р11С (групи 1 и 2)

Животно	Група	Форма	Седмица	ST1-p11CAB тигър³
95x009	1	ST1-p11C + IFA	5	12,800
			6	12,800
			9	6,400
			10	12,800
93x021	1	ST1-р11С + IFA	5	51,200
			6	102,400
			9	51,200
			10	51,200
98x002	2	ST1-р11С + 529	5	<50
		SE/GM-CSF	6	<50
			9	1,600
			10	<50
98п008	2	ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF	5 6 9 10	200 200 12,800 6,400

^а Крайните стойности на титрите на свързване са определени като реципрочни на най- голямото разреждане на плазмата, което дава OD стойност на експеримент/ контрола (Е/С) от > 3.0.

Имуноген- индуцирани хуморални имунни отговори (Групи 3 и 4):

За оценка на индуцирането на имуноген- специфични и аджувант- специфични хуморални антитяло отговори, се измерват титрите на анти- С4- V3₈g.₆p и анти-GM-CSF ELISA антителата в плазмата на животните от група 3 и 4 непосредствено преди имунизацията и 1 и 2 седмици след втората и трета имунизации. Резултатите са обобщени на Таблица 21. Резултатите показват, че пика на плазменото С4- V3₈₉._6P антитяло титрите са генерирани една седмица след втората имунизация във всички тествани животни. Пика на плазмените антитяло титри в група 3 (С4- V3₈₉₆p⁺ IFA) са няколко степени по- високи от пика на плазмените антитяло титри, наблюдавани в групата 4 (С4- V3₈g.₆p ⁺ 529 SE/GM-CSF). Група 4 показва ниски, но откриваеми нива на анти- GM-CSF антитяло титри, една седмица след третата имунизация.

Таблица 21

Крайни стойности на ELISA титрите на серум от маймуни резус, имунизирани с С4- V3₈₉₆p (групи 3 и 4)

Животно/група	Форма	Седмица	С4- V3 Ав тигър³	Анти- човешки GM-CSF Ab тигър
98п007(3)	С4- V3₈₉.6p+ IFA	5	102,800	<10
		6	25,600	<10
		9	25,600	<10
		10	25,600	<10
98п013(3)	С4- V3e9.6P⁺ I FA	5	12,800	<10
		6	6,400	<10
		9	12,800	10
		10	12,800	<10
96x004(4)	С4- V3₈9.6P + 529	5	6,400	320
	SE/GM-CSF	6	1,600	160
		9	3,200	2,560
		10	1,200	1,280
95x011(4)	С4- V3q9 6p + 529 SE/GM-CSF	5 6 9 10	1,600 800 1,600 1,600	160 80 1,280 1,280

Наблюдавано е също индуцирането на неутрализиращи антитела в групи 3 и 4 от животните; ре зултатите са обобщени на Таблица 22. Резултатите показват, че двете групи животни от 3 и двете групи животни от 4 са развили неутрализиращи антитела, които са способни да неутрализират SHIV₈₉₆ вируса in vitro. Титрите на SHIV₈₉₆ неутрализиращото антитяло, наблюдавани в група 3 са найобщо по- високи от тези, наблюдавани при животните от група 4. В допълнение, след последвата имунизация, серума от животните от група 3 показва ниско ниво на неутрализираща активност спрямо SHIV₈₉.₆ щама на вируса, който е труден за неутрализиране.

Таблица 22

Крайни стойности на титрите на неутрализиращо антитяло от маймуни резус, имунизирани с С4- V3_{89 6Р} (групи 3 и 4)

Неутрализиращо антитяло спрямо^а

Животно/група	Форма	Седмица	SHIV₈₉₆	SHIV₈₉₆
98п007(3)	С4- V3_{89 6}p+ IFA	0	<10	<10
		5	22	<10
		6	46	<10
		9	113	46
		10	74	71
98п013(3)	С4- V3_896P+ IFA	0	<10	<10
		5	12	<10
		6	19	<10
		9	36	18

		10	22	<10
96x004(4)	С4- V3e9.6p ⁺ 529	0	<10	<10
	SE/GM-CSF	5	<10	<10
		6	<10	<10
		9	26	<10
		10	<10	<10
95x011(4)	С4- V3e9.6P + 529	0	<10	<10
	SE/GM-CSF	5	11	<10
		6	<10	<10
		9	19	<10
		10	<10	<10

^а Титрите на неутрализиращото антитяло реципрочните серумни разреждания, при които 50% от клетките са защитени от вирусиндуцираното умъртвяване, измерено при усвояване на неутрално червено.

Пример 8

Изследване на терапевтичната ефективност на PDAPP трансгенна мишка, третирана с Αβ1-42 и аджувант(и)

За сравняване броя на аджувантните комбинирани форми в PDAPP трансгенна мишка за тестване терапевтичната ефективност на пептида Αβ1 -42, е построен следният експеримент.

Структура на изследването: PDAPP трансгенни мишки на възраст от десет и половина до дванадесет и половина месеца (мъжки и женски) се разделят на четири групи от по 40 мишки, подбират се така, че всяка група да е възможно сходна на другата по възраст, пол и трансгенен родител. Групите са описани на Таблица 23:

Таблица 23

Третиране на групи трансгенни мишки

Група	Аджувант	Доза	Доза Αβ1- 42	Брой в началото	Брой в края
1	MPL SE	25 цд	75/ 60 цд	40	35
2	MPL SE + GM-CSF	25 цд/10 цд	64/60 цд	41	34
3	529 + GM- CSF	25 цд/10цд	64/60 цд	40	31
4	PBS	па	па	40	37

Пептида Αβ1-42 е от Elan Pharmaceuticals, 529 SE и MPL™ са от Corixa, и мишият GM- CSF е от Biosource. Всички мишки получават инжекции в седмици 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 и 24. Кръв от мишките се взима 5- 7 дни след инжектирането, започвайки от втората инжекция. Групи 1, 2 и 3 се инжектират субкутанно с обем от 200 μΙ , докато група 4 получава 250 μΙ. Животните се умъртвяват на седмица 25 от изследването. Титрите се получават с помощта на разреждания, които дават обем от 50% от максималната оптична плътност на четене.

Резултати:

Имуногенност и антитяло отговор: Всички групи достигат пика на геометричната стойност на титрите си (GMT) на антителата спрямо пептида Αβ1-42 при второ (RC529 + GM-CSF) или третото (MPL™ SE + GM-CSF) им взимане на кръв (виж Фигура 1). При пиковите стойности

GMT, MPL™ SE + GM-CSF e 16, 400, докато 529 SE + GM-CSF e 13,400 или приблизително 1.5 пъти от MPL™ SE контролата от 9,700. Обаче, титрите на двете GM-CSF- съдържащи форми (Групи 2 и 3) падат обратно до приблизителното ниво на MPL™ SE контролата, с крайни GMTs на MPL™ SE = 4600, MPL™ SE+ GM- CSF = 5350, 529 SE + GM-CSF = 4650.

За определяне дали евентуалното понижаване на титъра на двете GM- CSF- съдържащи форми се дължи на анти- GM- CSF антитяло отговор, се използва ELISA за определяне дали анти- GMCSF антитела са се формирали по време на имунизацията. Серум от всички животни, получаващи GM- CSF се титрува срещу мишият GMCSF, използван по време на този експеримент. Няма намерено доказателство за анти- GM- CSF антитела в което и да е от третираните животни (данни не са показани).

Нива на Αβ в мозъка: Всичките три третирани групи значително редуцират акумулирането както на Αβ пептида (фигура 2индивидуални резултати; Таблица 24- общи резултати) и Αβ1-42 (фигура 3- индивидуални резултати; таблица 25- събрани резултати) в кортикалния участък на мозъка на PDAPP мишка. Αβ ELISAs (общо и

1- 42 форми) са представени както е описано по- рано (54) с помощта на солюбилизирани с гуанидин мозъчни хомогенати. Статистическите сравнения използва теста за значимост на Mann- Whitney.

Таблица 24

Общи кортикални Αβ нива

	PBS	MPL SE	MPL- SE + GM- CSF	MPL- SE + GM- CSF
Средно (ng/g)	6,478	1,707	925	1,313
интервал	64- 17,208	33- 8,501	67- 5,293	79- 5,271
% редукция	—	74	86	80
Р Стойност (M-W)		<0.0001	<0.0001	<0.0001
N	37	35	34	31

Таблица 25

Общи кортикални Αβ1- 42 нива

	PBS	MPL SE	MPL- SE + GM- CSF	MPL- SE + GM- CSF
Средно (ng/g)	5,609	1,799	779	1,127
интервал	284- 14,004	10- 6,715	43- 4,824	29- 4,442
% редукция	—	68	86	80
Р Стойност (M-W)		<0.0001	<0.0001	<0.0001
N	36	35	34	31

Амилоидно натоварване: размера на амилоидозата се определя количествено във франталния кортекс с помощта на имунохистохимични методи както е описано по- рано (55). Всички три обработени групи показват значителна редукция в амилоидното натоварване (Фигура 4- индивидуални резултати; таблоца 26сумирани резултати).

Таблица 26

Фронтално кортикално амилоидно натоварване

	PBS	MPL SE	MPL- SE + GM- CSF	MPL- SE + GM- CSF
Средно (%АВ)	7.98	0.49	0.00	0.04
интервал	0.00- 27.37	0.00- 9.63	0.00- .83	0.00- 5.53
% редукция	—	94	100	99.5
Р Стойност (M-W)		<0.0001	<0.0001	<0.0001
N	29	33	29	30

Натоварване на невритите: Ефекта на третирането върху развитието на невритна дистрофия във фронталния кортекс се изпитва имунохистохимично както е описано по- рано (55). Всичките три третирани групи значително редуцират размера на невритното натоварване относително PBS контролата (Фигура 5- индивидуални резултати; Таблица 27- сумирани резултати).

Таблица 27

Фронтално кортикално невритно натоварване

	PBS	MPL SE	MPL- SE + GM- CSF	MPL- SE + GM- CSF
Средно (%АВ)	0.35	0.14	0.04	0.02
интервал	0.00-1.21	0.00- 0.82	0.00- 0.60	0.00- 0.91
% редукция	—	60	88	95
Р Стойност (M-W)		<0.0153	<0.0001	<0.0001
N	29	33	29	30

Астроцитоза: Размера на астроцитозата в ретросплениалния кортекс се определя количествено както е описано по- рано (55). Третираните групи съдържащи GM-CSF показват значително редуцирана астроцитоза (фигура 6).

Пример 9

С4(Е9У)-УЗяояр пептидна имунизация на маймуни циномологус

Обект на настоящия експеримент е оценка на имуногенността С на HIV-1, Env- получен пептиден конюгат, С4- У3_89бР, прилагани с и без комбинация от аджувант от това изобретение в други видове примати, маймуна циномологус (Macaca fascicularis). Пептида С4У3₈₉._еР, описан в Пример 7 е модифициран чрез изменение на глутаминовата киселина в амино киселинен остатък 9 при валин. Полученият пептиден конюгат, обозначен C4(E9V)- V3_896P, се използва и има следната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn

C Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg

Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5).

Глутаминовата киселина при валиновото заместване (E9V) в участъка С4 от пептида повишава имунаогенността на пептида над тази на немодифицираната последователност в модел на мишка.

Този HIV-1, Env- получен пептид е способен да изяви хуморалния имунен отговор в мишка. Обаче, благодарение на трудността на екстраполиране на мишите резултати в хора, необходимо е да се тестват потенциалните HIV-1 имуногенни състави в не- човешки примати преди преминаване във Фаза I на човешки клинични изпитвания. В този експеримент са изследвани както интрамускулни (IM), така и интраназални (IN) пътища на приложение. Животните са имунизирани пет пъти в седмици 0, 4, 8, 18 и 23. Седмично до 25-та седмица се събират кръвни проби и цервиковагинални и мукозни промивки и се анализират за наличите но антитела срещу имуногенните състави.

Последователност на експеримента: От общо осем маймуни циномологус, се използват четири животни за група (Таблица 28) за експеримента. Група 1 не получава аджувант; Група 2 получава аджувантната формула 529 SE плюс GM-CSF. Животните се отглеждат и изследват при стандартните условия за отглеждане.

Таблица 28

529 SE плюс GM-CSF срещу отсъствие на аджувант

Група #	Имуноген	Аджувант	Начин на приложение
1	С4 (E9V)- V3_{89 6}P пептид	няма	IN
2	C4(E9V)- V3_{89 6P} пептид	529 SE/ GM-CSF	IM

Имунизации: Всички интраназални имунизации се осъществяват с устройство за назален спрей с доза от 100 μΙ. Всички интрамускулни инжекции се дават в четириглавия мускул с игла или шприц. Всички животни се имунизират по схема- в седмица 0, 4, 8, 18 и 23-та.

Форми:

Група 1: 1000 gg C4(E9V-V3₈₉₆p пептид в стерилен нормален разтвор, краен обем 200 μΙ (100 μΙ всяка ноздра).

Група 2: 1000 μg C4(E9V-V3₈₉.₆p пептид, 50 μg 529 SE и 250 μg човешки GM-CSF, крайна маслена концентрация 1%, краен обем 1.0 ml (500 μΙ във всеки четириглав мускул чрез ΙΜ инжектиране).

Изследване за имуноген- индуцирани имунни отговори:

Непосредствено преди и след имунизация, всички животни се наблюдават за имуноген- индуцирани хуморални отговори по следният начин:

(1) Титри на серумно анти- C4(E9V-V3₈₉.₆p пептидно IgG серумно антитяло чрез ELISA (2) Титри на мукозно (цервиковагинално, назално) антиC4(E9V-V3_{89 6}p пептидно IgG антитяло чрез ELISA.

Резултати:

Безопасност и толерантност на имуногена:

Пептида C4(E9V-V3₈₉₆p , когато бъде приложен самостоятелно или в комбинация с аджувантите 529 SE/GM-CSF са изключително толерантни. За животните, имунизирани по интрамускулен път с помощта на игла или шприц, не са отбелязани реакции в мястото на инжектиране. Всички животни се наблюдават непрекъснато за изменения в телесната температура в продължение на 24 часа непосредствено след всяко прелагане на имуногена. Нито едно животно в нито един момент от изследването не демонстрира абнормално повишение на телесната температура (данни не са показани).

Имуноген- специфични серумни антитяло отговори:

Серумни проби от всички животни са получени непосредствено преди и една или две седмици след всяка имунизация (до 25 седмици). Две седмици след крайната имунизация, всички серумни проби се анализират за наличие на анти- C4(E9V)-V3 пептидни IgG антитела. Интраназално имунизираните животни от група 1 пептида C4(E9V-V3₈9.6p самостоятелно) не показа титри на серумното IgG антитяло по- високо от пре- имунизационните нива (Фигура 7). В противоположност на това, животните от група 2 (IM прилагане на C4(E9V-V3₈g.6P ⁺ 529 SE/ GM-CSF) показват значителни нива на серумни C4(E9V)-V3 IgG антитела (Фигура 7). Докладваните крайни геометрични стойности на титрите са изчислени с помощта на найниският титър от всяко отделно животни, който е 3- пъти над сумарния нативен серум при същото разреждане.

Животните от група 1 (без аджувант) имат анти- C4(E9V-V3_{89 6Р}IgG антитяло титри в проби от цервиковагиналната кухина, които са по- високи от пре- имунизационните нива само след четвъртата имунизация, но се понижават по- нататък (фигура 8). В противоположност на това, животните от Група 2 (с аджувант) имат анти- C4(E9V-V3₈₉ бр IgG антитяло титри в проби от цервиковагиналната кухина, които са по- високи от пре имунизационните нива след първата имунизация и се повишават след всяка последваща имунизация (макар и да има някои по- късни понижения във всеки от случаите) (Фигура 8).

Животните от Група 1 (без аджувант) не можаха да покажат C4(E9V-V3₈₉.₆p IgG антитяло титри в назални промивки по- високи от пре- имунизационните нива (Фигура 9). Противоположно на това, животните от Група 2 (с аджувант) развиват значителни нива на C4(E9V-V3₈₉.6p IgG антитяло титри в проби от назални промивки (Фигура 9).

Claims

1. Антигенен състав, включващ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит, или от ракова клетка или туморна клетка, или от алерген, или от отделна молекула, и ефективно аджувантно количество от комбинацията от: (1) едно аминоалкил глюкозамин фосфатно съединение (AGP), или негово производно или аналог, и (2) цитокин или лимфокин, или агонист на този цитокин или лимфокин, където комбинацията от аджуванти повишава имунния отговор в гостоприемник

С· гръбначно животно спрямо този антиген.

2. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че избраният антиген е полипептид, пептид или фрагмент, получен от протеин.

3. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във- вода.

4. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е избран от групата, състояща се от гранулоцитен макрофагов колоний стимулиращ фактор и

С интерлевкин-12.

5. Антигенен състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е гранулоцитен макрофагов колоний стимулиращ фактор.

6. Антигенин състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във- вода.

7. Антигенен състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е интерлевкин-12.

8. Антигенен състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във- вода.

9. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва и разтворител или носител.

10. Антигеннен състав съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във- вода.

11. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че AGP е:

2- [ (R) - 3- тетрадеканоилокситетрадеканоиламино] етил 2дезокси-4-О-фосфоно-3-О-[(Р)-3тетрадеканоиокситетрадеканоил] -2- [ (R)- 3- тетрадеканоиокситетрадеканоиламино]- β- D- глюкопиранозид (529).

12. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че избраният антиген е от вируса на човешката имунонедостатъчност (HIV).

13. Антигенен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че избраният HIV антиген е HIV протеин, полипептид, пептид или фрагмент, получен от този протеин.

14. Антигенен състав съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че избраните антигени са HIV пептиди, притежаващи амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (SEQ ID NO: 1).

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 2).

Arg Gin lie lie Asn Thr Thr Hys Lys Vai Gly Lys Asn Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO: 3);

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4) и

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5).

15. Антигенен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

16. Антигенен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

17. Антигенен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

18. Антигенен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4)

19. Антигенен състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Vai Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5).

20. Антигенен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във вода.

21. Антигенен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е избран от групата, състояща се от гранулоцитен макрофаг колоний стимулиращ фактор и интерлевкин-12.

22. Антигенен състав съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е гранулоцитен макрофаг колоний стимулиращ фактор.

23. Антигенен състав съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във вода.

24. Антигенен състав съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е интерлевкин-12.

25. Антигенен състав съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във вода.

26. Антигенен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че включва и разтворител или носител.

27. Антигенен състав съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във вода.

28. Антигенен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че AGP е 529.

29. Метод за повишаване способността на антигенен състав, характеризиращ се с това, че съдържа избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на имунния отговор на гостоприемник гръбначно, който включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 1.

30. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържау избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на имунния отговор на гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 9.

31. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържа HIV антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на имунния отговор на гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 12.

32. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържау HIV антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на имунния отговор на гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 26.

33. Метод съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че избраните антигени са HIV пептиди, избрани от групата, състояща се от пептидите притежаващи амино киселинната последователност:

Arg Gin lie lie Asn Thr Thr Hys Lys Val Gly Lys Asn Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO: 3);

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4) и

34. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO: 1).

35. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

36. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Arg Gin lie lie Asn Thr Thr Hys Lys Vai Gly Lys Asn Vai Gly Lys

Asn Vai Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO: 3);

37. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

38. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Vai Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 5).

39. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на цитотоксични Т лимфоцити в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 1.

40. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на цитотоксични Т лимфоцити в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 9.

41. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на цитотоксични Т лимфоцити в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 12.

42. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от патогенен вирус, бактерия, гъба или паразит за проявяване на цитотоксични Т лимфоцити в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав съгласно претенция 26.

43. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че избраните антигени са HIV пептиди, избрани от групата, състояща се от пептидите притежаващи амино киселинната последователност:

Lys Gin Ile lie Asn Met Trp Gin Glu Vai Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (SEQ ID NO: 1).

44. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

45. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

46. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

47. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO: 4)

48. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че HIV пептида е пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

49. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран раков антиген или свързан с тумор антиген от ракова клетка или туморна клетка за изявяване на терапевтичен или профилактичен противораков ефект в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав, включващ посочения избран раков антиген или свързан с туморите антиген от ракова клетка или туморна клетка и ефективно количество аджувант от комбинация от: (1) един EGP или негово производно или аналог и (2) цитокин или лимфокин, или агонист срещу посочения цитокин или лимфокин.

50. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран алерген за понижаване на алергичния отговор в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на антигенен състав, включващ посочения избрания алерген и ефективно количество аджувант от комбинация от: (1) един EGP или негово производно или аналог и (2) цитокин или лимфокин, или агонист срещу посочения цитокин или лимфокин.

51. Антигенен състав, съдържащ избран антиген от молекула иби част от нея, която представлява продуцираните по нежелан начин, количество или локализация от даден гостоприемник така че да редуцира такъв неоелан ефект, характеризиращ се с това, че включва на ефективно количество аджувант, представляващ комбинация от: (1) един EGP или негово производно или аналог и (2) цитокин или лимфокин, или агонист срещу посочения цитокин или лимфокин.

52. Антигенен състав съгласно претенция 51, характеризиращ се с това, че избраният антиген е полипептид, пептид или фрагмент, получен от амилоиден прекурсорен протеин, или антитяло срещу него.

53. Антигенен състав съгласно претенция 52, характеризиращ се с това, че избраният антиген е Αβ пептид, който е интернален, 39- 43 амино киселинен фрагмент на амилоиден прекурсорен протеин, или фрагмент на Αβ пептида.

54. Антигенен състав съгласно претенция 53, характеризиращ се с това, че избраният антиген е Αβ пептида, притежаващ амино киселинната последователност:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys

Gly Ala lie lie Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai lie Ala (SEQ ID NO: 6)

55. Антигенен състав съгласно претенция 54, характеризиращ се с това, че AGP е 529

56. Метод за повишаване способността на антигенен състав, съдържащ избран антиген от молекула или част от нея, която представлява такива, продуцирани по нежелан начин, количество или локализация от гостоприемник, така че да редуцира такъв нежелан ефект, характеризиращ се с това, че включва ефективно количество аджувант, представляващ комбинация от: (1) един AGP или негово производно или аналог, и (2) цитокин или лимфокин, или агонист на този цитокин или лимфокин.

57. Метод за повишаване способността на антигенен състав, да предотврати или да лекува заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане в гостоприемник гръбначно, характеризиращ се с това, че включва прилагане на посочения гостоприемник на ефективно количество аджувант, представляващ комбинация от: (1) един AGP или негово производно или аналог, и (2) цитокин или лимфокин, или агонист на този цитокин или лимфокин.

58. Метод съгласно претенция 57, характеризиращ се с това, че избраният антиген е Αβ пептид, който е вътрешен, 39- 43 амино киселинен фрагмент на амилоиден прекурсорен протеин или фрагмент на Αβ пептида.

59. Метод съгласно претенция 58, характеризиращ се с това, че избраният антиген е Αβ пептид, притежаващ амино киселинната последователност:

60. Метод съгласно претенция 59, характеризиращ се с това, че AGP е 529.

61. Аджувантна формула, характеризираща се с това, че включва комбинация от: (1) едно аминоалкил глюкозамин фосфатно съединение (AGP), или негово производно или аналог, и (2) цитокин или лимфокин, или агонист на този цитокин или лимфокин.

62. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризираща се с това, че AGP се използва под формата на стабилна емулсия масло- във вода.

63. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е избран от групата, състояща се от гранулоцитен макрофагов колонии стимулиращ фактор и интерлевкин-12.

64. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че включва и разтворител или носител

65. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е гранулоцитен макрофагов колоний стимулиращ фактор.

66. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че цитокина или лимфокина е интерлевкин-12.

67. Аджувантна формула съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че AGP е 529.