KR20040043098A - 조합 보조 제제 - Google Patents

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Abstract

시토킨 또는 림포킨, 특히 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 또는 인터루킨-12와 조합시킨 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 또는 이의 유도체 또는 유사체의 사용은 척추동물 숙주에서의 소정의 항원에 대한 면역반응을 향상시키는 항원성 조성물 중의 조합 보조제로서 유용하다.

Description

조합 보조 제제{ADJUVANT COMBINATION FORMULATIONS}
면역계는 병원균을 공격하기 위해 다양한 기전을 사용한다. 하지만, 면역화 후 이러한 기전이 모두 반드시 활성화되어야 하는 것은 아니다. 면역화에 의해 유도된 예방면역성은 병원균을 제거하거나 저지하기 위해 적당한 면역반응을 유도해내는 면역원성 조성물의 능력에 의존적이다. 병원균에 따라 세포 매개 면역반응 및/또는 체액 면역반응이 요구될 수 있다.
면역반응에서 헬퍼 T 세포의 역할에 대해 현재 제시되고 있는 전형적인 예는 T 세포가 생산하는 시토킨에 따라 T 세포가 아군(subset)으로 분리될 수 있고, 이 세포들에서 관찰되는 특정 시토킨의 프로필에 따라 기능이 결정된다는 점이다. 이러한 T 세포 모델은 2가지 주요 아군을 포함하는데, 그 하나는 인터루킨 2(IL-2)와 감마 인터페론을 생산하고 세포 및 체액(항체) 면역 반응을 증강시키는 TH-1 세포이고; 다른 하나는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5) 및 인터루킨-10(IL-10)을 생산하고 체액 면역 반응을 증강시키는 TH-2 세포이다(참고문헌 1).
종종, 면역화되는 유기체내에서 면역반응을 보다 강화시키고 항원 보유인자에 대한 숙주 내성을 증강시키기 위해 항원의 면역원능을 향상시키는 방안이 모색되고 있다. 어떤 경우에는 주로 체액반응(TH-2)인 면역 반응을 보다 균형을 이룬 세포반응(TH-1)과 체액반응(TH-2)으로 면역 반응을 이동시키는 방안이 모색되기도 한다.
세포 반응은 CD8+ CTL(세포독성 T 림프구) 반응의 생성을 포함한다. 이러한 반응은 세포내 병원균에 대한 면역원성 조성물의 개발시 필요한 것이다. 다양한 병원균에 대한 예방에는 강한 점막 반응과 높은 혈청 역가, CTL 및 강력한 세포 반응의 유도를 필요로 한다. 이와 같은 반응들은 종래의 서브유닛 형태의 면역원성 조성물을 비롯한 대부분의 항원 제제에 의해서는 제공된 바 없다. 이와 같은 병원균 중에는 인간면역결핍바이러스(HIV)가 있다.
이에, 척추동물 숙주에서 체액 및 세포 면역반응을 모두 생성시킬 수 있는 항원성 조성물 제제의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 시토킨 또는 림포킨, 특히 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 또는 인터루킨-12와 조합시킨 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 또는 이의 유도체 또는 유사체를 척추동물 숙주에서의 소정의 항원에 대한 면역반응을 향상시키는 항원성 또는 면역원성 조성물 중의 보조 제제로서 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
도 1은 다음과 같은 것으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 Aβ1-42 펩타이드에 대한 항체의 기하 평균가를 도시한 것이다: 그룹 1 - Aβ1-42 펩타이드 + PBS(도시되지는 않음); 그룹 2 - Aβ1-42 펩타이드 + MPLTMSE(■); 그룹 3 - Aβ1-42 펩타이드 + MPLTMSE 및 GM-CSF(▲); 그룹 4 - Aβ1-42 펩타이드 + 529SE 및 GM-CSF(▼).
도 2는 도 1에 기술한 4 그룹으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 총 Aβ 피질 농도를 나타낸 것이다.
도 3은 도 1에 기술한 4 그룹으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 Aβ1-42 펩타이드 피질 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 도 1에 기술한 4 그룹으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 전두면 피질 아밀로이드 양을 나타낸 것이다.
도 5는 도 1에 기술한 4 그룹으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 전두면 피질 신경염 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 도 1에 기술한 4 그룹으로 면역화시킨 돌연변이 생쥐에 존재하는 팽대후부 피질의 성상세포증식증 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 사이노몰로고스 마카커 원숭이 2 그룹(그룹 당 4마리)의 혈청에서 측정된 HIV C4(E9V)-V389.6P펩타이드-특이적 IgG 기하 평균 항체 역가를 도시한 것이다. 그룹 1의 동물은 C4(E9V)-V389.6P펩타이드 단독물을 비내 투여하여 면역화시켰다. 그룹 2의 동물은 C4(E9V)-V389.6P 펩타이드를 529 SE 및 GM-CSF와 배합하여 근육내로 투여하여 면역화시켰다. 화살표는 0주, 4주, 8주, 18주 및 23주째의 면역화를 표시한 것이다.
도 8은 도 7에 기술한 바와 같은 동물의 경질 세척 시료에 존재하는 기하 평균 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 9는 도 7에 기술한 바와 같은 동물의 코 세척 시료에 존재하는 기하 평균 항체 역가를 나타낸 것이다.
상세한 설명
보조제, 시토킨과 림포킨은 면역원성이 낮은 다양한 항원에 대하여 면역 반응의 형성 및 프로필을 향상시키고 조정하는 능력을 가진 면역 조절 화합물이다. 보조제, 시토킨 및 림포킨의 적당한 선택은 보조제, 시토킨이나 림포킨 없이는 형성되지 않을 수 있는 체액 및 세포 면역반응을 양호하게 유도할 수 있다. 구체적으로, 보조제, 시토킨 및 림포킨은 면역원성 조성물에서 서브유닛 항원 및 펩타이드 항원에 대한 면역반응을 증강시키는데 유의적인 효과를 나타낸다. 이들의 자극적 활성은 또한 단백질 항원에 대하여 지향성인 항원 특이적 면역 반응을 형성시키는데 유리하다. 강한 점막 반응, 높은 혈청 역가, CTL 및 강력한 세포 반응의 유도를 필요로 하는 다양한 항원들을 위해 보조제와 시토킨/림포킨 조합물은 대부분의 항원 제제가 제공하지 못하는 자극을 제공한다.
수많은 연구들에서 여러 보조 제제가 동물 모델에서 평가되었지만, 현재 인간들에 널리 사용되도록 인가된 유일한 보조제는 명반(수산화알루미늄 또는 인산알루미늄) 뿐이다. 다른 보조제는 StimulonTMQS-21(QS-21)(Antigenics Inc., Framingham, MA(2))이다. 다양한 유중수 또는 수중유 조합물로 이루어지는 안정된 유제인 보조제의 일 그룹은 면역강화성에 대하여 상당한 관심을 받아왔다. 이 조합물은 일반적으로 주사 부위에서 항원을 안정화시키고 축적시키는 작용을 하는 대사성 또는 불활성 오일의 다양한 조합물로 이루어진다. 이러한 보조제 중 하나가 광유, 물 및 유화제를 포함하는 불완전 프로인트 보조제(IFA)이다. 완전 프로인트 보조제(CFA)는 IFA에 열사멸된 마이코박테리아를 더 포함하는 것이다. 이러한 유형의 보조제를 사용하는데 있어서 나타나는 특별한 문제점은 주사 부위 부근의 자극으로, 종종 단핵 세포 침윤의 결과로 육아종 병변부를 유발하곤 한다. 따라서, 잠재적 보조제로서 다른 화합물과 제제가 연구되는 중이다.
이러한 화합물의 일 그룹은 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGPs)로서, 참고문헌(3)인 미국 특허 제6,113,918호, 예컨대 컬럼 2, 라인 14 내지 컬럼 3, 라인 38에 기술되어 있다. AGP는 기본 구조로서 2-데옥시-2-아미노-α-D-글루코피라노스(글루코사민)에 글리코사이드 결합된 아미노알킬(아글리콘) 기를 가지고 있다. 또 다른 치환체로서, 글루코사민 고리의 4번 또는 6번 탄소의 인산화 및 3개의 3-알카노일옥시알카노일 잔기를 포함한다.
이러한 AGP 중 하나는 코릭사(몬타나주 해밀톤에 소재) 제품인 529 라는 화합물(전체 화합물명은 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일아미노]-β-D-글루코피라노사이드]이다.
코릭사는 또한 529와 배합했을 때 529SE 라는 안정화된 유제를 생산하는 대사성 수중유 제제도 제조하였다. 안정화된 유제는 스쿠알렌 오일, 글리세롤 및 포스파티딜 콜린과 529의 마이크로유동화를 통해 만든다. 현재 통용되는 제제는 GMP급의 마이크로유동화된 유제이다. 이하 실험에서는 1% 오일(다른 농도도 사용할 수 있음)을 포함하는 유제를 기술하고 있다.
529 SE는 Balb/c 또는 스위스 웹스터(Swiss-Webster) 생쥐에게 피하 투여했을 때 식별할 수 있는 큰 조직 병리 상태를 나타내지 않았다. 비교용으로 529 없이 동일한 성분을 함유하는 안정화된 유제도 제조하였다. 구체적으로, 보조제 529 SE 및 GM-CSF의 조합물과 각각 배합한, 40개 아미노산 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)의 시스테인이 결실된 39개 아미노산 버전(-Cys) (40개 아미노산 펩타이드(+Cys) 중 아미노산 17번에 있는 시스테인 잔기가 결실됨) 또는 Aβ1-42(APP의 내부 42개 아미노산 단편)을 이용하여 피하 면역화시킨 결과 식별가능한 염증, 발적, 팽창 또는 경화를 나타내지 않았다.
또한, 본 발명의 영역에는 529의 유도체 및 유사체와 다른 AGP도 포함된다. 이러한 화합물로는 미국 특허 제6,113,918호(3)에 기술된 화합물이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
시토킨 및 림포킨의 면역원성 조성물내로의 첨가가 면역원성 조성물의 잠재성을 확장 및 향상시킬 수 있다는 가능성이 제시된 바 있다(4). 시토킨 인터루킨-12(IL-12)는 T 헬퍼 세포 서브세트 확장을 Th1 시토킨 프로필(즉, 생쥐 모델에서의 IgG2 서브클래스로) 쪽으로 이동시켜 세포 매개 면역성을 자극하여 향상시키는 것으로 입증된 바 있다(5 내지 7). 생쥐에서, 재조합 쥐의 IL-12는 Th1 우성 면역 반응 프로필을 향상시키는 것으로 밝혀진 바 있다(4).
IL-12는 다양한 항원 발현 세포, 주로 대식세포 및 단핵구에 의해 생산된다. 이것은 순수한 T 세포로부터 TH1 세포를 유도하는데 중요한 인자이다. IL-12의 생산이나 IL-12에 대한 반응성은 예를 들어 기생균 감염시, 가장 현저하게는 레이슈마니아증에서 예방적 TH1 유사 반응을 발생시킴은 물론 병원성 박테리아 또는 바이러스 유래(9) 또는 암세포 유래(10)의 항원에 대한 세포 매개 면역반응을 향상시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. IL-12의 효과는 NK 세포 및 T 헬퍼 세포에 의해 생산되는 감마 인터페론에 의해 주로 매개된다. 감마 인터페론은 T 의존적 단백질 항원에 대한 IgG2a 항체 유도(11) 및 T 의존적 항원에 대한 IgG3 반응의 유도(12)에 중요한 역할을 한다. 본래 천연 사멸 세포 자극인자라고 불리는 IL-12는 이종이량체 시토킨(13)이다. 재조합 숙주 세포에서의 IL-12 단백질의 발현 및 분리에 대해서는 공개된 국제특허출원 WO90/05147(14)에 기술되어 있다.
보조제로서 잠재적 가능성을 갖고 있는 다른 시토킨은 GM-CSF이다. GM-CSF는 특별한 유형의 콜로니 자극 인자(CSF)이다. CSF는 골수에서 발견되는 선조 세포를 특정 유형의 성숙 혈액 세포로 분화 유도하는 림포킨 군이다. 본원에 참고 인용되는 미국 특허 제5,078,996호(15)에 기술된 바와 같이, GM-CSF는 비특이적종양사멸(tumoricidal) 활성을 매개하는 대식세포 또는 전구체 단핵구를 활성화시킨다. 인간의 GM-CSF 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 개시된 바 있다(15). GM-CSF cDNA를 함유하는 플라스미드는 대장균을 형질전환시켜 미국 모식균 배양수집소(ATCC)(미국 버지니아 20110-2209 매너사스 유니버시티 부울러바드 10801에 소재)에 수탁번호 39900으로 기탁되어 있다. 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,229,496호(16)에 기술된 바와 같이 GM-CSF 유전자는 또한 효모 발현 플라스미드에 삽입되어 ATCC에 수탁번호 53157로 기탁되어 있다. 또한, 본원에 참고인용된 미국 특허번호 제5,073,627호(17)에 기술된 바와 같이, 글리코실화 부위를 제거시킨 GM-CSF를 암호화하는 DNA 서열은 ATCC에 수탁번호 67231로서 기탁되어 있다.
GM-CSF는 면역반응을 향상시키고(18), 종류별로 정제된 쥐의 B 세포에서 Ig 분비에 영향을 미치는 것(19)으로 알려진 항원 발현 세포에서 단백질 분자를 상승조절하는 것으로 밝혀져 있다. GM-CSF는 또한 면역원성 조성물의 보조제로서 기술된 바 있다(20).
면역 조절 활성이 있는 것으로 밝혀진 다른 시토킨이나 림포킨으로는 인터루킨 1-알파, 1-베타, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론 알파, 베타 및 감마, 과립구 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 알파 및 베타가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
임의의 시토킨이나 림포킨의 전신 투여와 관련된 문제점 중에 시토킨이나 림포킨 활성과 관련된 생물학적 영향이 있다. 또한, 항원 특이적 면역 반응의 형성과 관련된 시토킨 또는 림포킨 효과는 시토킨 또는 림포킨의 국소적 농도가 유지되는 한 향상되어야 한다.
3-O-아실기 제거된 모노포스포릴 지질 A 또는 모노포스포릴 지질 A와 GM-CSF 또는 IL-12와의 조합은 평가된 바 있는데, 다양한 면역 반응 변수들의 향상이 관찰되었다(21).
본 명세서에 기술된 본 발명은 항원과 소정의 시토킨 또는 림포킨 보조제 및 제2 보조제인 AGP의 조합을 통해(바람직하게는 안정된 대사성 유제로) 상기 항원에 특이적인 면역반응의 향상을 입증하고 있다.
본 발명의 항원성 조성물에 포함시키기 위해 선택한 항원으로는 단백질 유래의 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 단백질 및 다음과 같은 것 중 임의의 단편을 포함한다: 당류, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 거대분자 성분. 본 명세서에 사용된 "펩타이드"는 일련의 3개 이상의 아미노산을 포함하는 것으로서, 적어도 하나의 항원성 결정인자 또는 에피토프를 포함하는 것인 반면, "폴리펩타이드"는 펩타이드보다 길지만 전장의 단백질을 구성하지는 않는 분자이다. 이러한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 비관련 단백질, 예를 들어 파상풍 유독소 또는 디프테리아 유독소에 접합될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "단편"이란 용어는 당류, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 거대분자 성분 전부보다는 적은 일부분을 포함한다. HIV의 경우에, 본 발명의 항원성 조성물은 추가로 전장의 HIV 단백질을 포함한다.
본 발명은 먼저 HIV 유래의 펩타이드 항원을 사용하는 모델 시스템으로 예시된다. 이 펩타이드는 본원에 참고인용되고 이하 개략되는 미국 특허제5,013,548호(22) 및 제5,019,387호(23)에 기술된 것이거나 또는 이로부터 유도되는 것이다. 이 펩타이드는 중화 항체 및 T 세포 반응을 생성시키는 HIV 엔벨로프 단백질의 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
HIV는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 원인 인자인 인간 레트로바이러스이다. HIV는 표면 엔벨로프 당단백질을 T 림프구의 표면 상에 존재하는 CD4(T4) 분자에 부착시켜 이 CD4(T4) 분자를 T 세포로 유입되어 T 세포를 감염시키기 위한 수용체로서 사용함으로써 면역계의 T 림프구를 감염시킨다. 면역화를 통해 HIV 감염에 특이적인 예방 면역반응을 유도하고자 하는 시도는 매우 제한적인 성공만을 거두었다. 현재 면역원성 조성물을 향상시키고자 하는 효과적이고 예방적인 전략을 결정하기 위한 시도로 다수의 접근법이 수행되고 있다. 그 예로는 HIV 유래의 항원성 에피토프를 발현하는 약독화된 재조합 박테리아 벡터(24), 재조합 아데노바이러스(25) 또는 백시니아 바이러스 벡터(26), DNA 면역화(27), 및 HIV의 다양한 T 세포 및 B 세포 에피토프를 포함하는 합성 펩타이드(28)를 사용하는 방법이 있다.
HIV 표면 엔벨로프 당단백질 gp120은 인간에 있어서 중화 항체를 유도시킬 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 전체 gp120 분자의 약 1/3을 암호화하는 재조합 단백질 PB1은 중화 항체의 형성을 유도하는 엔벨로프 단백질의 일부분을 포함하는 것으로 밝혀져 있다. 하지만, 침팬지를 이용한 연구에서는 본래의 gp120 이나 PB1 모두 고역가의 중화 항체의 생성을 유도할 수는 없는 것으로 입증되어 있다.
gp120의 항원성 결정인자에 상응하여, 바이러스를 중화하고 그 바이러스에대한 T-헬퍼 및 CTL 반응을 유도하는 gp120에 대한 항체 반응을 생성시키는 짧은 펩타이드를 통상적인 방법으로 합성하였다.
이러한 펩타이드 중 하나는 T1SP10MN(A)(+Cys)라고 표시한 C4/V3 다중에피토프 함유 HIV-1MN펩타이드 및 시스테인 결실된 변형체 T1SP10MN(A)(-Cys) 이다. 이 펩타이드는 Th, TCTL및 B 에피토프를 포함하지만 CD4 결합을 방해하는 항체를 유도하지는 않는다. 이러한 C4/V3 HIV 펩타이드가 CFA 또는 CFA 유사 보조제와 함께 투여될 때 면역반응을 유도하는 유력한 후보라는 것은 이미 입증된 바 있다(29-34). 이 펩타이드는 생쥐와 인간 모두에서 CD4+ Th 세포 반응을 자극하는 것으로 이미 밝혀져 있는 에피토프를 포함하며, HLA B7+인 Blab/c 생쥐와 인간 모두에서 CD8+ CTL에 의해 인식되는 부위 및 주요 중화 결정인자를 모두 포함한다. 최근, 39개 아미노산 펩타이드가 HIV 감염 환자내에서 면역원성 및 안전성을 나타내는 것으로 입증되었다(28).
T1SP10MN(A)(+Cys)는 다음과 같은 40개 아미노산의 서열을 갖고 있다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (서열번호 1).
T1SP10MN(A)(-Cys)는 위치 17에 시스테인을 생략한 채 합성하였고, 다음과 같은 39개 아미노산의 서열을 갖는다:
Lys Gln Ile Ils Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr ArgPro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2)
이 시스테인 잔기는 Th 세포, CTL 또는 B 세포에 의해 인식되는 기능성 에피토프의 외측에 존재한다. 바이러스 게놈의 다양한 영역에서 유래하는 다른 HIV 펩타이드들에 대해서는 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,861,243호(35), 미국 특허 제5,932,218호(36), 미국 특허 제5,939,074호(37), 미국 특허 출원 제5,993,819호(38), 미국 특허 제6,037,135호(39), 공개된 유럽 특허출원 제671,947호(40), 및 미국 특허 제6,024,965호(41)에 기술되어 있다.
ST1/p11C로 표시한 28개 아미노산 펩타이드 접합체도 사용된다. 이 접합체는 p11C로 표시한 12개 아미노산 SIV mac 251 Gag 펩타이드(Gag의 179 내지 190 아미노산)와 접합시킨 ST-1이라고 표시한 16개 아미노산 SIV env 유래의 T-헬퍼 펩타이드로 이루어진다(42). 이 p11C 펩타이드는 4량체 형태로서 SIV mac 감염된 Mamu-A*01 붉은털 원숭이에서 입증된 CTL 활성을 갖고 있다(43). ST1-p11C 펩타이드 접합체는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:
Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3).
또한, C4-V389.6P로 표시한 39개 아미노산 펩타이드 접합체(44)도 사용된다. 이 펩타이드 접합체의 C4 영역(16개 아미노산)은 HIV-1 엔벨로프 단백질의 제4 불변 영역에서 유래된 것으로서 유니버설 T-헬퍼 에피토프를 나타낸다. 이 펩타이드의 V3 부분(23개 아미노산)은 HIV-1 엔벨로프 단백질의 제3 초가변 영역에서 유래된 것으로서 중요한 중화 결정인자를 나타낸다. C4-V389.6P접합체는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg
Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr
Ala Arg Arg (서열번호 4).
HIV 항원은 단백질, 이 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 이 단백질은 gp41, gp120 또는 gp160과 같은 당단백질일 수 있다. 또는, 이 단백질은 gag, pol, vif, rev, vpr, tat, nef 또는 env와 같은 유전자에 의해 암호화된 단백질일 수 있다. 이러한 단백질 유래의 펩타이드는 길이가 6개 이상의 아미노산인 1개 이상의 항원성 결정인자(에피토프)를 포함한다.
HIV 펩타이드에 대한 면역반응은 이 펩타이드에 약학적 허용성 담체 분자를 공유 결합(접합)시킴으로써 향상될 수 있다. 적합한 담체 분자의 예로는 파상풍 유독소, 디프테리아 유독소, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 HIV gp120 당단백질의 T 세포 에피토프에 상응하는 다른 펩타이드를 포함한다.
현재, HIV에 대한 면역화를 위한 성공적인 전략에는 양호한 CTL 반응은 물론 HIV에 대해 점막 면역성을 유도해낼 필요성이 있음을 실감하고 있다. 최근, T1SP10MN(A) 다중에피토프 펩타이드와 점막 보조제인 콜레라 독소를 이용한 쥐에 대한 연구에서는 비내 면역화가 중화 혈청 IgG1 항체를 유도함을 밝힌 바있다(45). 또한, 뒤이은 HIV-V3 루프 펩타이드를 이용한 연구에서는 점막 합성된 IgA 항체의 유도와 강한 세포 매개 반응, 예컨대 펩타이드 특이적 CTL 유도를 입증하였다(46). 고역가의 바이러스 특이적 항체가 바이러스 전파 방지에 중요한 역할을 하는 것으로 추정되고 있지만 HIV 감염 개체의 예방이나 안정화에 있어서 고역가의 전신 및 중화 항체의 기능적 역할은 아직 밝혀져 있지 않다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는 529를 포함하는 안정된 수중유 유제를 제조한 다음, 시토킨 IL-12 또는 GM-CSF를 혼합한다. 하기에 제시한 데이터는 529와 GM-CSF의 조합이 고역가의 HIV 중화 혈청 항체를 생성함을 입증한다. 529 SE 및 GM-CSF의 조합은 면역화된 생쥐 암컷의 질 원개에서 IgG1 및 IgG2a 서브클래스를 비롯한 고역가의 항원 특이적 IgG 항체를 유도하였다. 529 SE 및 GM-CSF와 T1SP10MN(A)(-Cys)를 배합하여 면역화시킨 생쥐에서는 향상된 항원 특이적 세포 증식 및 시토킨 배양물내로의 분비, 및 펩타이드 특이적 CTL 반응의 유도에 의해 측정되듯이 강한 세포 면역 반응이 유도되었다. 이와 유사한 결과는 529 SE 및 GM-CSF와 함께 APP 유래의 Aβ1-42 펩타이드로 면역화시킨 생쥐에서도 관찰되었다.
일반적으로, GM-CSF 또는 IL-12 및 소정의 단백질이나 펩타이드와 조합된 529 또는 529 SE의 항원/보조제 제제는 고역가의 항원 특이적인 바이러스 중화 항체, 대부분 보체 고정성 IgG 항체(생쥐에서는 IgG2a)로의 IgG 서브클래스 비율의 유의적인 변환, 시험관내 항원 자극에 대한 반응으로 단핵 세포로부터의 세포 증식 및 시토킨 생성 증가를 유도한다. 이와 같은 성질은 GM-CSF 또는 IL-12의 존재 유무에 관계없이 529가 결실된 항원 및 SE 배합물에 의해서는 관찰되지 않았다. 또한, 본 발명의 배합물은 CTL 유도를 통해 측정되듯이 양호한 세포 반응을 유도한다.
529 SE의 장점은 배합물이 주사 부위에 육아종성 축적 및 염증을 유도하지 않는다는 점이다. 이러한 주사 부위 반응들은 유중수 또는 수중유 보조제 제제에 의해 일반적으로 유도되는 반응이다.
HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)과 함께 529 SE 단독물 투여 또는 520 SE + IL-12 투여 또는 529 SE + GM-CSF 투여의 효과를 비교하는 실험을 실시하였다.
이 실험에서(하기 표 1), 529 SE와 배합된 HIV 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)를 경피투여하여 면역화시킨 Balb/c 생쥐는 단지 2회 주사 후 펩타이드 특이적 혈청 IgG 역가를 나타냈다. 또한 IgG1 및 IgG2a 서브클래스 역가도 유도되었다. 제2 보조제인 GM-CSF 또는 IL-12의 첨가는 IgG1 서브클래스 역가는 물론 IgG의 총 역가를 증폭시켰다. IL-12의 첨가는 IgG2a 서브클래스 역가를 증폭시켰지만, GM-CSF의 첨가는 IgG2a 서브클래스 역가를 증폭시키지 못했다.
또 다른 실험에서는, 기능성 세포 매개 면역성의 척도로서 다중에피토프 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)와 함께 배합된 529 SE, 또는 529 SE + IL-12 또는 529 SE + GM-CSF로 면역화시킨 생쥐의 비장 세포가 HIVMN-특이적 CTL 반응을 나타내는지 평가하였다.
표 2에 제시된 바와 같이, 상기 보조제들로 면역화시킨 모든 생쥐의 비장 세포는 무관련 IIIB CTL 에피토프로 펄스 표지되거나 비표지된 표적 세포에 대하여낮은 활성을 나타내었다. HIVMN-특이적 CTL 매개 표적 세포 용균성은 529 SE 단독물이 투여된 경우 보다 529 SE + IL-12가 투여되었을 때 현저하게 향상되었고, 529 SE + GM-CSF가 투여되었을 때 더욱 향상되었다(표 2).
또 다른 실험으로서, 붉은털 원숭이를 ST1-p11C 또는 C4-V389.6P펩타이드 및 IFA 또는 529 SE + GM-CSF(표 15에 제시된 그룹)로 면역화시켰다. 이 분석의 결과는 표 16 내지 22에 제시하였고, 이하 간략히 요약하였다.
ST1-p11C 펩타이드 제제 자체는 시험한 모든 동물에서 양호한 내성력이 있는 것으로 나타났다. 하지만, 보조제 IFA의 경우에는 유의적인 주사 부위 반응성이 관찰되었다. 또한, 최종 면역화 직후 보조제 제제 529 SE/GM-CSF의 가능한 부작용이 약하게 관찰되었다. IFA를 함유하는 ST1-p11C 펩타이드 제제는 시험한 2마리의 Mamu-A*01 양성 붉은털 원숭이 중 한 마리에서 유효한 p11C-특이적 세포 면역 반응을 유도할 수 있었다. 또한, 529 SE/GM-CSF를 함유하는 ST1-p11C 펩타이드 제제는 시험한 2마리의 Mamu-A*01 양성 붉은털 원숭이 중 한 마리에서 p11C 특이적 세포 면역반응을 유도할 수 있다.
IFA를 함유하는 C4-V389.6P펩타이드 제제는 1:25,600 내지 1:102,400 범위에서 최고의 혈장 ELISA 항체 역가를 유발시킬 수 있고, SHIV89.6및 SHIV89.6P에 대한 혈청 중화 항체 역가를 유발시킬 수 있었다. 529 SE/GM-CSF를 함유하는 C4-V389.6P펩타이드 제제는 1:6,400 내지 1:12,800 범위에서 최고 혈장 ELISA 항체 역가를 유발시킬 수 있고 SHIV89.6P는 아니지만 SHIV89.6에 대해 낮은 수준의 중화 항체 반응을 유발시킬 수 있었다.
그룹 당 동물의 수가 적으면(2마리), 정확한 결론을 도출해내기가 어렵다. 하지만, 529 SE/GM-CSF를 함유하는 두 펩타이드 제제에 의해 유발되는 체액 및 세포 면역 반응의 수준은 IFA 보조제가 첨가된 동물에서 관찰되는 면역 반응 보다 정량적으로 더 낮았다. 하지만, IFA는 인간에게 시판용 조성물로 승인된 성분이 아니라는 것을 반드시 유념해야 한다. 또한, 반응 세포의 표현형(즉, 시토킨 프로필) 및 기능적 성질이 사용된 보조제 제제에 따라 다르게 나타날 수 있다는 일부에 한정적인 증거도 있다.
또 다른 실험에서는, 또 다른 영장류 종 유래의 동물인 사이노몰로고스 마카커 원숭이를 잔기 9 아미노산인 글루탐산을 발린으로 바꾸어 변형시킨 C4-V389.6P펩타이드로 면역화시켰다. 결과적으로 얻은 펩타이드 접합체, C4(E9V)-V389.6P는 다음과 같은 서열을 갖고 있다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg
Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr
Ala Arg Arg (서열번호 5).
동물을 보조제 없이 또는 529 SE + GM-CSF 조합물과 함께 상기 C4(E9V)-V389.6P펩타이드로 면역화시켰다.
그 결과는 C4(E9V)-V389.6P펩타이드를 529 SE/GM-CSF와 조합하여 근육내 주사로 투여한 경우 보조제 없이 비내로 투여한 동량의 C4(E9V)-V389.6P펩타이드 보다 혈청내에서 유의적으로 높은 펩타이드 특이적 IgG 역가를 유도해내는 것으로 나타났다(도 7 내지 9). 이와 같은 실험의 결과는 적합한 조합의 보조제와 함께 HIV 펩타이드 면역원을 투여하면 전신 체액 면역성을 유도해낼 수 있음을 분명하게 입증하는 것이다.
본 발명의 보조제 조합을 포함하여 척추동물 숙주내에서 아밀로이드 침착(자가 분자)을 특징으로 하는 질병을 치료하거나 예방하는데 바람직한 면역원성 조성물로는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 일부를 포함하는 것이 있다. 이 질병은 알쯔하이머병, 아밀로이드증 또는 아밀로이드발생성 질병과 같이 다양하게 불리고 있다. β-아밀로이드 펩타이드(Aβ 펩타이드로도 불림)는 β 및 γ 분비효소에 의한 APP의 프로세싱시 생성되는 APP의 내부 39 내지 43개 아미노산 단편이다. 이 Aβ1-42 펩타이드는 다음과 같은 서열을 갖고 있다:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (서열번호 6)
일부 환자의 경우에 아밀로이드 침착은 응집된 Aβ 펩타이드 형태를 취한다. 본 발명에 이르러, 놀랍게도 분리된 Aβ 펩타이드의 투여가 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착의 Aβ 펩타이드 성분에 대한 면역 반응을 유도한다는 것을 발견하였다(47). 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 조합 보조제 및 Aβ 펩타이드는 물론 Aβ 펩타이드의 단편, 유도체 또는 변형체 및 Aβ 펩타이드 또는 단편, 이의 유도체 또는 변형체에 대한 항체를 포함한다. 이러한 Aβ 펩타이드 단편 중 하나는 다음과 같은 서열을 갖는 28개 아미노산 펩타이드이다(48):
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (서열번호 7).
당해의 Aβ 펩타이드의 다른 단편은 비관련 단백질과 접합체 형태 또는 비접합 형태로 투여될 수 있는 아미노산 1-10, 1-7, 1-6, 1-5, 3-7, 1-3 및 1-4를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
Aβ1-42 펩타이드 및 다양한 보조제를 가지고 일련의 연구를 실시하였다. 그 결과를 이하 요약하여 제시한다.
제1 실험으로, Aβ1-42 펩타이드를 둔부에 피하 주사하여 면역화시킨 스위스-웹스터 생쥐는 펩타이드 특이적 항체 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 나타냈고, 이는 Aβ1-42 펩타이드가 유력한 항원 후보임을 입증하고 있다. 529 SE와 Aβ1-42 펩타이드에 첨가된 GM-CSF는 529 SE 및 Aβ1-42 펩타이드의 수용체들에 비하여 혈청 항체 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가의 상승을 나타내었다(표 3 내지 8 참조). 529 SE + GM-CSF 조합을 투여받은 각 생쥐 유래의 혈청 항체는 대부분 상승되었고, 529 SE 단독물을 투여한 각 생쥐(데이타는 제시안됨) 보다 훨씬 빠르게 상승되었다. 이 제1 실험을 고령의 스위스-웹스터 생쥐(3개월 미만 대신 6 내지 8개월령)를 가지고 반복하였을 때에도 표 3 내지 8에 제시된 결과와 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 제시안됨).
제2 실험에서는 다양한 양의 GM-CSF와 함께 Aβ1-42 펩타이드 및 529 SE를 스위스-웹스터 생쥐 둔부로 피하 주사하여 면역화시켰다. IgG 적정점 역가는 GM-CSF의 양이 증가함에 따라(0.1㎍에서 1㎍로, 다시 10㎍으로) 용량 의존적 방식으로 증가하였다(표 9). 모든 529 SE + GM-CSF 조합의 IgG 역가는 다른 보조제인 QS-21 만을 투여한 그룹이나 QS-21과 GM-CSF를 함께 투여한 그룹 보다 더 높게 나타났다. 또한, IgG1 서브클래스 역가도 529 SE + GM-CSF를 제1 용량으로 투여한 그룹 및 529 SE 단독물을 제2 용량으로 투여한 그룹에 비해 다양한 529 SE + GM-CSF 그룹에서 증가된 것으로 나타났다(표 10). IgG2a 서브클래스 역가 역시 용량 의존적 방식으로 529 SE 단독물 그룹에 비해 다양한 529 SE + GM-CSF 그룹에서 증가된 것으로 나타났다(표 11).
제3 실험에서는 다양한 함량의 GM-CSF 첨가 또는 무첨가하에 Aβ1-42 펩타이드 및 529 SE를 스위스-웹스터 생쥐의 둔부에 피하 주사하여 생쥐를 면역화시켰다. 다양한 529 SE + GM-CSF 그룹(0.5㎍, 2㎍, 5㎍, 10㎍)의 경우 용량 의존적 방식은 아니지만(표 12) IgG 적정점 역가가 모두 증가되었다. IgG1 및 IgG2a 서브클래스 역가도 모두 용량 의존적 방식은 아니지만, 529 SE 단독물 그룹에 비해 다양한 529 SE + GM-CSF 그룹에서 증가하는 것으로 나타났다[표 13(IgG1) 및 14(IgG2a)].
제4 실험에서는, 잔기 717에서 발린이 페닐알라닌으로 치환된 돌연변이를 갖는 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 변형체 형태를 발현하는 돌연변이 생쥐를 사용하였다(49). 이 돌연변이는 인간의 가족성 알쯔하이머병과 관련이 있는 것이다. 이러한 돌연변이 생쥐(PDAPP 생쥐로 지칭함)는 Aβ 침착, 신경염 병반 및 성상세포 증식증을 비롯한 알쯔하이머병의 다수의 병리학적 지표를 점차적으로 발전시키는 바, 인간 알쯔하이머병의 동물 모델로서 사용된다.
제4 실험에서는 표 A에 제시한 투여량으로 다양한 보조제의 존재 유무하에 Aβ1-42 펩타이드를 피하 주사하여 PDAPP 생쥐를 면역화시켰다. 구체적으로, 그룹 1 생쥐에게는 양성 대조군으로서 안정된 유제 형태(SE)의 MPLTM과 함께 Aβ1-42 펩타이드를 투여하였고; 그룹 2 생쥐에게는 MPLTMSE + 쥐의 GM-CSF와 함께 Aβ1-42 펩타이드를 투여하였으며; 그룹 3 생쥐에게는 529 SE + 쥐의 GM-CSF와 함께 Aβ1-42 펩타이드를 투여하였고; 그룹 4 생쥐에게는 음성 대조군으로서 PBS를 투여하였다. 그룹 2와 3은 그룹 1 또는 4 보다 높은 피크 역가는 물론 항-Aβ1-42 역가 값의 보다 신속한 증가를 나타내었다. 하지만, 그룹 2와 3의 역가는 2 내지 3개월 내에 그룹 1 양성 대조군의 역가와 동등한 값으로 떨어졌다(도 A). 그룹 1, 2 및 3은 음성 대조군인 그룹 4와 비교했을 때 ELISA로 측정된 뇌 Aβ 농도의 유의적인 저하(표 B 및 C, 도 B 및 C), 아밀로이드 정도의 저하(표 D 및 도 D) 및 완화된 신경염 장애(표 E 및 도 E)를 나타냈다. 그룹 2와 3은 그룹 1 양성 대조군과 비교했을 때 성상교세포 증식의 유의적인 감소를 나타냈다(도 F).
따라서, 529 SE 및 GM-CSF 또는 IL-12의 보조 성질은 함께 배합했을 때 상승작용성인 것으로 나타난다.
본 발명의 항원성 조성물은 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균유래의 소정의 항원 및 유효 보조 함량의 AGP, 예컨대 529(수성 또는 안정된 유제 형태)와 조합된 시토킨 또는 림포킨, 구체적으로 GM-CSF 또는 IL-12를 포함하는 항원성 조성물의 투여 후 척추동물 숙주의 항체 반응 및 세포 매개 면역성을 향상시킴으로써 면역 반응을 조절한다. 다른 시토킨이나 림포킨도 면역 조절 활성이 있는 것으로 관찰되었는데, 그 예로는 인터루킨 1-알파, 1-베타, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-알파, 베타 및 감마, 과립구 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 알파 및 베타가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
특정 시토킨 또는 림포킨의 작동물질 또는 길항물질 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 본 명세서에 사용된 "작동물질"이란 용어는 상기 시토킨이나 림포킨의 활성을 향상시키거나 상기 시토킨이나 림포킨과 동일한 방식으로 작용하는 분자를 의미한다. 이러한 작동물질의 일예는 상기 시토킨 또는 림포킨의 모방체이다. 본 명세서에 사용된 "길항물질"이란 용어는 상기 시토킨 또는 림포킨의 활성을 억제하거나 차단하는 분자를 의미한다. 이러한 길항물질의 예로는 가용성 IL-4 수용체 및 가용성 TNF 수용체가 있다.
본 명세서에 사용된 "유효 보조 함량"이란 용어는 보조제 조합의 부재하에 소정의 항원을 투여한 숙주와 비교했을 때 척추동물 숙주에서 소정의 항원에 대해 증가된 면역 반응을 유도해내기에 적합한, 본 명세서에 기술한 보조제 조합의 투여량을 의미한다. 특정 투여량은 부분적으로 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태는 물론, 투여 방법 및 항원에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 보조제 조합물은 0.1 내지 500㎍/투여량 범위의 529를 사용하는 것이 좋고; 보다 바람직한 구체예에서, 그 범위는 1 내지 100㎍/투여량인 것이 좋다. 적합한 투여량은 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 항원성 조성물은 또한 주사용 액제 또는 현탁제를 제조하는 통상적인 방식으로 면역학적 허용성 희석제 또는 담체와 혼합할 수 있다.
본 발명의 항원성 또는 면역원성 조성물은 다양한 경로, 예컨대 비제한적으로 비내, 경구, 질내, 직장내, 비경구, 피내, 경피(예컨대, 본원에 참고인용되는 국제출원 WO98/20734(50) 참조), 근육내, 복강내, 피하, 정맥내 및 동맥내 경로로 인간 또는 인간을 제외한 척추동물에게 투여한다. 항원성 조성물 중 항원 성분의 함량은 부분적으로 항원의 종류는 물론 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태, 및 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 또한, 적합한 투여량은 당업자라면 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 반드시 그렇지는 않지만, 항원과 보조제 조합물은 동시에 투여하는 것이 바람직하다. 항원성 조성물의 투여 회수 및 투여량 섭생 역시 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 몇몇 경우에, 보조제 조합물의 보조제 성질은 필요한 투여 회수 또는 투여량 섭생의 시간 코스를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 보조제 조합물은 다양한 병원성 미생물, 예컨대 비제한적으로 인간 및 인간을 제외한 척추동물을 감염시키는 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균, 또는 암세포 또는 종양 세포 유래의 다양한 항원을 함유하는 항원성 또는 면역원성 조성물에 사용하기에 적합하다. 이 항원은 단백질 유래의 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 물론 다음과 같은 것 중 임의의 단편을 포함할 수 있다: 당류, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 암세포 또는 종양 세포, 알레르기원, 자가분자(예컨대, 아밀로이드 전구체 단백질) 또는 다른 거대분자 성분. 몇몇 경우에는, 1종 이상의 항원이 항원성 조성물에 포함되기도 한다.
본 발명의 조합 보조제를 포함하는 바람직한 바이러스 면역원성 조성물은 비제한적으로 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스 타입 1 내지 3, 인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 인간 유두종바이러스, 회백염바이러스, 로타바이러스, 칼리시바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 아데노바이러스, 광견병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 우역 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스(이전의 칠면조 비기관지염 바이러스), 헨드라 바이러스, 니파 바이러스, 코로나바이러스, 파르보바이러스, 전염성 비기관지염 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 조류 전염성 활액낭 질병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 마렉병 바이러스, 돼지 호흡 및 생식 증후군 바이러스, 말 동맥염 바이러스 및 각종 뇌염 바이러스에 의해 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료에 관한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조합물을 포함하는 바람직한 박테리아 면역원성 조성물은 비제한적으로 헤모필러스 인플루엔자(유형성 및 무형성 모두), 헤모필러스 솜누스, 모라크셀라 카타랄리스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스, 파이오제네스, 스트렙토코커스 아갈락티에, 스트렙토코커스 페칼리스, 헬로코박터 피롤리, 나이제리아 메닝지티디스, 나이제리아 고노로에, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아뉴모니애, 클라미디아 프시타시, 보르데텔라 페르터시스, 알로이오코커스 오티디티스, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피뮤리엄, 살모넬라 콜레라수스, 에스케리치아 콜리, 쉬겔라, 비브리오 콜레라, 코리네박테리움 디프테리아, 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 인트라셀룰라레 콤플렉스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 스타필로코커스 아루레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 클로스트리디움 테타니, 렙토스피라 인터로간스, 보렐리아 부르도페리. 파스퇴렐라 헤몰리티카, 파스퇴렐라 뮬토시다, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 마이코플라스마 갈리셉티컴에 의해 일어나는 질병의 치료 및/또는 예방에 관한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조합물을 포함하는 곰팡이 병원균에 대한 바람직한 면역원성 조성물은 비제한적으로 아스퍼질리스, 블라스토마이세스, 칸디다, 코시디오데스, 크립토코커스 및 히스토플라스마에 의해 일어나는 질병의 예방 및/또는 치료에 관한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조합물을 포함하는 기생균에 대한 바람직한 면역원성 조성물은 비제한적으로 레시마니아 메이저, 아스카리스, 트리춰리스, 기아르디아, 쉬스토소마, 크립토스포리디움, 트리코모나스, 톡소플라스마 곤디 및 뉴모시스티스 카리니에 의해 일어나는 질병의 예방 및/또는 치료에 관한 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조합물을 포함하는 척추동물 숙주에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 유도해내기에 바람직한 면역원성 조성물은 비제한적으로 전립선 특이적 항원, 암종배아성 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3을 비롯한 암 항원 또는종양 관련 항원을 이용하는 것을 포함한다.
본 발명의 보조제 조합물을 포함하는 척추동물 숙주에서 알레르기원에 대한 반응을 조절하는데 바람직한 면역원성 조성물은 알레르기원 또는 이의 단편을 함유하는 것을 포함한다. 이러한 알레르기원의 예에 대해서는 본원에 참고인용되는 미국 특허 제5,830,877호(51) 및 공개된 국제 특허출원 WO99/51259(52)에 기술되어 있으며, 그 예로는 화분, 곤충 독, 동물 비듬, 곰팡이 포자 및 약(예, 페니실린)을 포함한다. 이 면역원성 조성물은 알레르기 반응의 공지의 원인인 IgE 항체의 생산을 방해한다.
본 발명의 보조제 조합물을 함유하는 척추동물 숙주에서 자가 분자에 대한 반응을 조절하는데 바람직한 면역원성 조성물은 자가 분자 또는 이의 단편을 포함한다. 이러한 자가 분자의 예로는 전술한 Aβ1-42 펩타이드 외에도 당뇨병에 관련된 β쇄 인슐린, 위식도 역류병에 관련된 G17 분자, 및 다발성 경화증, 낭창 및 류마티스양 관절염과 같은 질병에서 자가면역 반응을 억제조절하는 항원을 포함한다.
HIV 및 SIV의 경우에, 항원성 조성물은 1종 이상의 단백질, 이 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편을 포함한다. 몇몇 경우에, 복수의 HIV 또는 SIV 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및/또는 단편도 항원성 조성물에 포함되기도 한다.
본 발명의 보조제 조합 제제는 또한 보조제로서 폴리뉴클레오타이드 면역원성 조성물(DNA 면역원성 조성물로도 알려져 있음)에 함유시키기에 적합하다. 이러한 면역원성 조성물은 추가로 부피비카인과 같은 촉진제를 포함할 수도 있다(참고인용되는 미국 특허 제5,593,972호(53) 참조).
본 발명의 보다 상세한 이해를 돕기 위해 이하 실시예를 제시한다. 이 실시예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
따라서, 본 발명의 목적은 시토킨 또는 림포킨, 특히 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 또는 인터루킨-12(IL-12)와 함께 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이의 유도체 또는 유사체를 함유하는 조합 보조 제제를 항원성 조성물에 사용하기 위한 것이다. 구체적으로, AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일아미노]-β-D-글루코피라노사이드로서, 529라고도 알려져 있다(이전에는 RC529로 알려져 있었음).
보조제는 면역원 또는 항원과 함께 투여했을 때 면역반응을 향상시키는 물질이다. 본 발명의 보조 제제는 소정의 항원과 함께 항원성 또는 면역원성 조성물로 투여한다. 본 발명의 항원성 조성물은 척추동물 숙주에서 상기 소정의 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 소정의 항원은 (1) 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래 또는 (2) 암세포 또는 종양 세포 유래, 또는 (3) 알레르기원에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위해 IgE 생산을 방해하는 알레르기원 유래 또는 (4) 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 아밀로이드 전구체 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 소정의 항원은 HIV 유래의 것일 수 있다. 소정의 HIV 항원은 HIV 단백질, 이 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 특정 일 구체예에서, HIV 항원은 특정 펩타이드이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 소정의 항원은 β 및 γ 분비효소에 의한 APP의 프로세싱에 의해 생성되는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 내부 39개 내지 43개 아미노산 단편인 β-아밀로이드 펩타이드(또한, Aβ펩타이드라고도 불림)이다.
AGP는 수용액이나 또는 안정화된 수중유 유제(안정된 유제 또는 SE)으로 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 수중유 유제는 스쿠알렌, 글리세롤및 포스파티딜 콜린을 포함한다. SE 제제에서 ACG는 투여하기 전에 시토킨이나 림포킨과 혼합하여 항원성 혼합물을 만든다. 시토킨이나 림포킨은 유제에 첨가할 필요는 없다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, AGP는 SE 형태이다. 항원성 조성물은 추가로 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 시토킨이나 림포킨, 특히 AGP와 GM-CSF 또는 IL-12 또는 상기 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질이나 길항물질의 조합물을 유효 보조 함량으로 포함시켜, (1) 척추동물 숙주의 면역반응을 유도하는 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정 항원 또는 (2) 척추동물 숙주에서 치료적 또는 예방적 항암 효과를 유도하는 암세포 또는 종양 세포 유래의 암항원이나 종양 관련 항원 중에서 선택되는 소정 항원, 또는 (3) 알레르기원에 대한 알레르기 반응을 완화시키기 위해 IgE 생산을 방해하는 알레르기원 유래의 소정 항원 또는 (4) 바람직하지 않은 방식, 양 또는 위치에서 숙주에 의해 생산되는 것(자가 분자)을 나타내는 분자 또는 이의 일부분에서 유래하는 소정 항원을 함유하는 항원성 조성물의 능력을 그러한 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위해 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 시토킨 또는 림포킨, 특히 AGP와 GM-CSF 또는 IL-12 또는 상기 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질이나 길항물질의 조합물을 유효 보조 함량으로 포함시켜, 척추동물 숙주내에서 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 세포독성 T 림프구 유도능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
다음과 같은 재료 및 방법을 실시예 2 내지 7에 기술한 실험에 이용하였다.
동물
7-9주된 암컷 Balb/c 생쥐를 타코닉 팜스 인코포레이티드(Taconic Farms, Inc., Germantown, NY)로부터 구입했다. 7-9주된 암컷 Swiss-Webster 생쥐 또한 타코닉 팜스 인코포레이티드(Taconic Farms, Inc.)로부터 구입했다. 모든 생쥐를 미국실험동물관리공인협회(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)의 인증을 받은 시설에 가뒀다. 생쥐를 연구 시작 전 1주일 동안 우리 시설에 순화시켰다.
항원
하기 실시예 2 내지 3의 HIV 실험에서, 두개의 상이한 합성 펩타이드가 사용되었다. 다중에피토프 HIV-1-MN 펩타이드 T1SP10MN(A)(-Cys)(본원에서는 MN-10으로도 언급됨)의 서열은 하기와 같다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2). 이 펩타이드는 이미 기술되어 있고(33, 34), 생쥐와 인간 둘다에서 CD4+Th 세포 반응을 일으키는 HIV-1 gp120MN으로부터의 서열, 중요 중화 결정인자, 및 Balb/c 생쥐 내에서 CD8+CTL에 의해 인식되는 부위를 함유한다. 이 펩타이드는 알. 시어스(R. Scearce) 박사(Duke University, Durham, NC)가 제공했다. CTL 분석에서, IIIB로 표시되는 무관련 펩타이드가 비교의 목적으로 사용되었다. 이 펩타이드는 HIV-1-IIIB의 V3 루프 내 CTL 에피토프(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile (서열번호 8))에 상응하고, 지노시스 바이오테크놀러지즈 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, TX)로부터 구입했다. 펩타이드를 사용 전에 멸균수에 용해시키고, 적절한 완충액, 또는 세포 배양액으로 희석시켰다.
하기 실시예 4 내지 6 및 8의 아밀로이드 실험에서, Aβ1-42로 표시되는 펩타이드가 사용되었다. Aβ1-42의 서열은 하기와 같다:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(서열 번호 6).
이 펩타이드는 전술되었고(47), 아밀로이드 전구체 단백질의 내부 42 아미노산 단편에 상응한다. Aβ1-42는 엘란 파머수티컬즈(Elan Pharmaceuticals, South San Francisco, CA)가 제공했다. 펩타이드를 사용 전에 멸균수에 용해시키고, 적절한 완충액, 또는 세포 배양액으로 희석시켰다.
보조제
모든 529-함유 보조 제제는 코릭사(Corixa, Hamilton, MT)로부터 입수했다. 529 SE는 0-50㎍/ml 범위의 529 농도를 갖는, 미리 제형된 스쿠알렌계 수중유(0.8-2.5% 오일) 유제로 제조되었다. 인산 알루미늄은 직접 제조했다. 프로인드 완전 보조제(CFA) 및 불완전 보조제(IFA)를 디프코 래버러토리즈(Difco Laboratories, Detroit, MI)로부터 구입했다. T1SP10MN(A) 펩타이드 및 프로인드 보조제를 두개의 연결된 주사기를 사용하여 1:1의 비율로 유화시켰다. 재조합적으로 발현된 쥐의 IL-12는 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute, Cambridge, MA)에서 제공받았다. 재조합 쥐의 GM-CSF는 무담체 냉동건조 분말로써 바이오소스 인터내셔널(Biosource International, Camarillo, CA)로부터 구입했다. StimulonTMQS-21은 안티제닉스 인코포레이티드(Antigenics Inc., Framingham, MA)로부터 구입했다.
면역화
총부피 0.2ml를 둔부 양쪽에 동일하게 나누어 피하주사함으로써, 생쥐를 면역시켰다. 면역화는 하기한 바와 같이, 다양한 시간 간격으로 실시되었다. 항원 및 시토킨을 인산염 완충액으로 적절한 농도까지 희석하고, 면역화 전 16시간 내에 멸균 조건 하에서 보조제와 배합시켰다. 면역원 조성물을 부드럽게 교반하여 혼합시키고, 4℃에 보관했다. 제제는 면역화 바로 전에 교반기로 혼합했다.
효소-결합 면역흡착제 분석을 사용한 혈청 분석
1차 면역화 전, 지정된 시점에 동물로부터 채혈했다. 혈청 분석은 개별 역가의 기하평균으로 수행했다. HIV 펩타이드 특이적 항체 및 서브클래스 분포의 분석을 위해, 펩타이드를 탄산염 완충액(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9,6), 또는 PBS에 1㎍/ml의 농도로 현탁시키고, 100:1의 부피로 96웰 미세적정 플레이트(Nunc)에 플레이팅했다. 37℃에서 철야 배양 후, 플레이트를 세척하고, 2-4시간 동안 실온에서 블로킹시켰다(0.1% 젤라틴/PBS). ELISA 플레이트를 연속적으로 희석된 혈청(PBS, 0.1% 젤라틴, 0.05% TweenTM20, 0.02% 아지드화 나트륨)의 첨가 전에 세척 완충액(PBS, 0.1% TweenTM20)으로 세척했다. 4시간 배양 후, 웰을 세척하고, 4℃에서 철야로 배양하는 동안 비오틴 표지 항-아이소타입/서브클래스 항체의 적절한 희석물을 첨가했다. 웰을 세척하고 스트렙트아비딘-접합 양고추냉이 페록시다제와 함께 배양시켰다. 배양 후 웰을 세척하고, ABTS로 발색시켰다. 웰을 405nm에서 판독했다. 역가를 대조군 혈청을 사용하여 표준화했다.
Aβ1-42 펩타이드 특이적 항체 및 서브클래스 분포의 분석을 위해, 미세적정 플레이트당 0.3㎍/ml의 농도가 사용된 것을 제외하고는 동일한 프로토콜을 따랐다.
세포 표본 제조
증식 분석 및 시험관내 시토킨 분석을 위해, 지정된 시점에 생쥐로부터 비장세포를 떼어냈다. 3-5마리 생쥐 집단으로부터 단일 세포 현탁액을 제조했다. 증식 및 시토킨 분석을 위해, 세포를 HIV 펩타이드 항원, 대조군 단백질, 또는 RPMI-10만으로 철야 예코팅한 둥근 바닥의 96웰 배양 플레이트에 현탁시켰다. 비장 세포를 2x 보족물을 갖는 배양액을 사용하여 웰당 5x105세포수로 첨가했다. 배양 시작 후 3일 또는 6일에 시토킨 분석을 위해 3개의 웰로부터 세포 배양 상등액을 회수했다. 상등액 회수 즉시, 배양물에 18-24시간 동안3H-티미딘을 적용하고, 세포 증식량을 측정하기 위해 회수했다.
실시예 2
상호적 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 적정점 전체 및 서브클래스 역가
상호적 적정점 IgG 서브클래스 역가를 1차 면역화 후 5주, 2차 면역화 후 2주에 혈청 집단(n = 5 Balb/c)으로부터 측정했다. 생쥐를 0주 및 3주에 T1SP10MN(A)(-Cys) 25㎍을 둔부에 피하주사하여 면역시키는데, 총 0.2ml를 0.1ml씩 동일하게 분할하여 양쪽에 주사했다. 529 SE를 희석하여 투여량당 1.25% 스쿠알렌 오일 및 25㎍ 529를 함유하는 유제를 제조했다. SE는 스쿠알렌, 글리세롤, 및 유화제로 구성된 수중유 유제 부형제이다. 재조합 쥐의 IL-12를 생쥐당 40ng씩 투여했다. 재조합 쥐의 GM-CSF를 생쥐당 25㎍씩 투여했다. 결과를 각 그룹에 대한 기하평균가 + 표준 오차로 표 1에 나타냈다.
상호적 항-T1SP10MN(A)(-Cys) IgG 적정점 전체 및 서브클래스 역가
보조제 ㎍ HIV 펩타이드 적정점 역가
IgG IgG1 IgG2a
529 (25) SE(1.25% 오일) 25 206,301+/-175,149 37,567+/-31,526 180,671+/-277,211
529 (25) SE(1.25% 오일) + rIL-12 (.04) 25 460,516+/-690,712 74,269+/-169,868 222,446+/-400,716
529 (25) SE(1.25% 오일) + GM-CSF (25) 25 1,085,658+/-1,064,924 238,379+/-62,199 117,657+/-25,301
실시예 3
Balb/c 생쥐 내 CTL 분석
생쥐의 면역화에 관해서는 실시예 2의 프로토콜을 따랐다. 2차 면역화 후 14일에 생쥐로부터 분리한 비장 세포의 CTL 활성을 평가했다. 1.25% 오일을 함유하고, GM-CSF 10㎍ 또는 IL-12 40ng과 함께 또는 이것 없이, T1SP10MN(A)(-Cys) 25㎍이 더해진 529 SE 25㎍으로 529 SE를 제형했다.
CTL 분석을 위해, 2차 면역화 후 14일에 면역된 생쥐로부터 비장 세포를 떼어냈다. 본질적으로 종래 기술된 프로토콜(39)을 따랐다. 간략히 설명하면, 그룹당 3마리의 생쥐로부터 적혈구-방혈 비장 세포를 수집했다. 비장 작동인자 세포(4x106/ml) 1.5-2ml를 24웰 배양 플레이트에서 7일 동안 "MN-10" 펩타이드, "IIIB" 10량체 CTL 에피토프 펩타이드 1㎍/ml로, 또는 HIV 펩타이드 없이 재자극시켰다. 두 CTL 에피토프는 H-2Dd로 제한되었다. 배양 마지막 5일 동안 배양물에 10U/ml 재조합 쥐의 IL-2(바이오소스(Biocouce))를 보충했다. 세포독성 활성 분석을 위해, P815 세포를 Cr51로 표지하고, 4시간 동안 5㎍/ml 펩타이드(IIIB 또는 MN-10)를 펄스적용한 뒤, 배양된 비장 작동인자 세포에 첨가했다. HIV 펩타이드가 사용되지 않았을 때는, 표적 세포 세트에는 펄스적용하지 않았다. 3배 희석률의 작동인자 대 표적 세포의 비율("E:T")이 30:1 내지 1.1:1로 사용되었다. CTL 활성율%는 ((특이적 크로뮴 방출량 - 자연적 크로뮴 방출량) / (최대 크로뮴 방출량 - 자연적 크로뮴 방출량)) x 100을 사용하여 크로뮴 방출량의 %로 계산되었다. 크로뮴 방출량은 6시간의 배양 기간 후에 평가되었다. 크로뮴의 평균 자연적 방출량은 항상 최대 방출량의 15% 미만이었다. 28일째부터의 자료의 결과를 표 2에 나타냈다.
작동인자 대 표적 세포의 비율
펩타이드 MN-10 펩타이드 IIIB 펩타이드 없음
529 SE+: * IL-12 GM-CSF * IL-12 GM-CSF * IL-12 GM-CSF
E:T%특이적 방출량
30:1 31 53 71 8 11 19 4 8 8
10:1 19 41 70 5 8 21 2 5 9
3.3:1 5 11 35 2 1 5 -2 -2 -1
1.1:1 2 4 14 1 0 2 -3 -2 -3
*첨가 보조제 없음
실시예 4
상호적 항-Aβ1-42 IgG 적정점 전체 및 서브클래스 역가
이종교배한 Swiss-webster 생쥐를 각 10마리씩의 그룹으로 나눴다. 각 그룹에 APP의 내부 42개 아미노산 길이 영역에 상응하는 Aβ1-42 펩타이드 30㎍을 투여했다. 첫번째 그룹에게는 보조제를 투여하지 않았다; 두번째 그룹에게는 2.5% 오일을 함유한 529 SE 50㎍을 투여했다; 세번째 그룹에게는 2.5% 오일을 함유한 529 SE50㎍ + GM-CSF 10㎍을 투여했다; 네번째 그룹에게는 GM-CSF 10㎍을 투여했다; 다섯번째 그룹에게는 1.25% 오일을 함유한 SE를 투여했다; 여섯번째 그룹에게는 1.25% 오일을 함유한 SE + GM-CSF 10㎍을 투여했다; 일곱번째 그룹에게는 QS-21 50㎍을 투여했다. 총부피 0.2ml를 꼬리/둔부 기부의 두 부위에 각각 동일하게 나누어 둔부에 피하주사함으로써 생쥐를 면역시켰다. 면역화는 0주 및 3주에 실시되었다.
생쥐를 0, 20, 35 및 70일에 채혈했다. 각 생쥐의 혈청을 분석했다. 상호적 적정점 항-Aβ1-42 펩타이드 IgG 적정점 전체 클래스 및 서브클래스 역가를 5주 및 10주에 개별 혈청(n = 10 Swiss Webster)으로부터 측정했다. IgG 적정점 결과를 표 3(5주) 및 표 4(10주)에 나타냈다. IgG1 서브클래스 결과는 표 5(5주; 보조제를 투여받지 않거나 QS-21을 투여받은 그룹은 측정하지 않았다) 및 표 6(10주)에 나타냈다. IgG2a 서브클래스 결과는 표 7(5주; 보조제를 투여받지 않거나 QS-21을 투여받은 그룹은 측정하지 않았다) 및 표 8(10주)에 나타냈다.
항-Aβ1-42 5주 IgG 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
없음 12,976 +/- 14,386
529 SE (50) 16,204 +/- 225,221
529 SE (50) + GM-CSF (10) 608,474 +/- 623,575
GM-CSF (10) 214,497 +/- 609,067
SE (1%) 33,342 +/- 15,493
SE (1%) + GM-CSF (10) 453,367 +/- 162,750
QS-21 (50) 4,076 +/- 9,036
항-Aβ1-42 10주 IgG 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
없음 21,426 +/- 24,959
529 SE (50) 86,847 +/- 187,792
529 SE (50) + GM-CSF (10) 943,075 +/- 989,177
GM-CSF (10) 1,049,414 +/- 390,525
SE (1%) 255,631 +/- 114,025
SE (1%) + GM-CSF (10) 1,005,899 +/- 407,108
QS-21 (50) 47,222 +/- 159,775
항-Aβ1-42 5주 IgG1 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (50) 461 +/- 627
529 SE (50) + GM-CSF (10) 1,936 +/- 12,680
GM-CSF (10) 8,654 +/- 10,100
SE (1%) 4,515 +/- 6,273
SE (1%) + GM-CSF (10) 24,422 +/- 19,764
항-Aβ1-42 10주 IgG1 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
없음 2,086 +/- 2,448
529 SE (50) 969 +/- 521
529 SE (50) + GM-CSF (10) 2,076 +/- 4,901
GM-CSF (10) 8,483 +/- 10,998
SE (1%) 3,623 +/- 3,456
SE (1%) + GM-CSF (10) 12,472 +/- 11,502
QS-21 (50) 988 +/- 895
항-Aβ1-42 5주 IgG2a 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (50) 2,224 +/- 10,099
529 SE (50) + GM-CSF (10) 94,764 +/- 849,173
GM-CSF (10) 25,554 +/- 13,191
SE (1%) 1,484 +/- 2,271
SE (1%) + GM-CSF (10) 8,405 +/- 31,303
항-Aβ1-42 10주 IgG2a 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
없음 5,910 +/- 39,626
529 SE (50) 5,944 +/- 9,100
529 SE (50) + GM-CSF (10) 47,694 +/- 88,053
GM-CSF (10) 64,910 +/- 54,824
SE (1%) 2,350 +/- 2,326
SE (1%) + GM-CSF (10) 7,421 +/- 31,153
QS-21 (50) 3,544 +/- 26,332
실시예 5
다양한 GM-CSF 함량에 의한 상호적 항-Aβ1-42 적정점 전체 및 서브클래스 역가
이종교배한 Swiss-webster 생쥐를 각 10마리씩의 그룹으로 나눴다. 각 그룹은 0주 및 3주에 두번 Aβ1-42 펩타이드 30㎍의 면역화를 받았다. 첫번째 그룹에게는 529 SE 25㎍ + GM-CSF 10㎍을 투여했다; 두번째 그룹에게는 529 SE 25㎍ + GM-CSF 1㎍을 투여했다; 세번째 그룹에게는 529 SE 25㎍ + GM-CSF 0.1㎍을 투여했다; 네번째 그룹에게는 1차 투여량으로 529 SE 25㎍ + GM-CSF 10㎍을 투여하고, 2차 투여량으로 529 SE 25㎍만을 투여했다; 다섯번째 그룹에게는 QS-21 25㎍을 투여했다; 여섯번째 그룹에게는 QS-21 25㎍ + GM-CSF 10㎍을 투여했다. 총부피 0.2ml을 꼬리/둔부 기부의 두 부위에 각각 동일하게 나누어 피하주사함으로써 생쥐를 면역시켰다.
생쥐를 0, 21 및 42일에 채혈했다. 6주에 상호적 적정점 항-Aβ1-42 펩타이드 IgG 전체 및 서브클래스 역가를 개별 혈청(n = 10)으로부터 측정했다. IgG 적정점 결과를 표 9에 나타냈다. IgG1 서브클래스 결과는 표 10에 나타냈다. IgG2a 서브클래스 결과는 표 11에 나타냈다.
항-Aβ1-42 6주 IgG 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (25) + GM-CSF (10) 353,660 +/- 148,940
529 SE (25) + GM-CSF (1) 150,935 +/- 218,332
529 SE (25) + GM-CSF (0.1) 86,145 +/- 91,724
529 SE (25)* 25,365 +/- 54,083
QS-21 (25) 1,866 +/- 18,430
QS-21 (25) + GM-CSF (10) 48,970 +/- 116,106
*첫번째 투여량은 529 SE (25) + GM-CSF (10); 두번째 투여량은 529 SE (25)만
항-Aβ1-42 6주 IgG1 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (25) + GM-CSF (10) 10,867 +/- 18,333
529 SE (25) + GM-CSF (1) 24,909 +/- 18,625
529 SE (25) + GM-CSF (0.1) 6,608 +/- 17,736
529 SE (25)* 4,511 +/- 8,154
QS-21 (25) 581 +/- 126
QS-21 (25) + GM-CSF (10) 7,618 +/- 29,145
*첫번째 투여량은 529 SE (25) + GM-CSF (10); 두번째 투여량은 529 SE (25)만
항-Aβ1-42 6주 IgG2a 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (25) + GM-CSF (10) 243,758 +/- 354,383
529 SE (25) + GM-CSF (1) 116,222 +/- 143,140
529 SE (25) + GM-CSF (0.1) 98,018 +/- 391,797
529 SE (25)* 16,018 +/- 165,298
QS-21 (25) 측정하지 않음 +/- 측정하지 않음
QS-21 (25) + GM-CSF (10) 30,133 +/- 134,774
*첫번째 투여량은 529 SE (25) + GM-CSF (10); 두번째 투여량은 529 SE (25)만
실시예 6
다양한 GM-CSF 분량의 상호적 항-Aβ1-42 IgG 적정점 전체 및 서브클래스 역가
이종교배한 Swiss-webster 생쥐를 각 10마리씩의 그룹으로 나눴다. 각 그룹에게는 0주 및 3주에 각 회 Aβ1-42 펩타이드 30㎍씩의 면역화를 실시했다. 면역화 0주째에, 첫번째 그룹에게는 529 SE 50㎍을 투여했다; 두번째 그룹에게는 529 SE 50㎍ + GM-CSF 10㎍을 투여했다; 세번째 그룹에게는 529 SE 50㎍ + GM-CSF 5㎍을 투여했다; 네번째 그룹에게는 529 SE 50㎍ + GM-CSF 2㎍을 투여했다; 다섯번째 그룹에게는 529 SE 50㎍ + GM-CSF 0.5㎍을 투여했다; 여섯번째 그룹에게는 1% SE를 투여했다. 면역화 3주째에, 첫번째 내지 다섯번째 그룹에게는 529 SE가 50㎍에서 25㎍으로 감소한 것을 제외하고는, 면역화 0주째와 동일한 투여량을 투여했다. 여섯번째 그룹에게 투여한 SE 분량은 0주 면역화에서 1%였던 것이 3주에서는 1.2%로 증가시켰다. 총부피 0.2ml를 꼬리/둔부 기부의 두 부위에 각각 동일하게 나누어 피하주사함으로써 생쥐를 면역시켰다.
생쥐를 2, 20 및 35일에 채혈했다. 5주에 상호적 적정점 항-Aβ1-42 펩타이드 IgG 클래스 및 서브클래스 역가를 개별 혈청(n = 10)으로부터 측정했다. IgG 적정점 결과를 표 12에 나타냈다. IgG1 서브클래스 결과는 표 13에 나타냈다. IgG2a 서브클래스 결과는 표 14에 나타냈다.
항-Aβ1-42 5주 IgG 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (50) 6,119 +/- 3,103
529 SE (50) + GM-CSF (10) 52,312 +/- 78,421
529 SE (50) + GM-CSF (5) 16,392 +/- 17,706
529 SE (50) + GM-CSF (2) 321,524 +/- 224,875
529 SE (50) + GM-CSF (0.5) 36,934 +/- 29,449
SE (1%) 7,784 +/- 9,041
항-Aβ1-42 5주 IgG1 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (50) 499 +/- 676
529 SE (50) + GM-CSF (10) 1,424 +/- 2,468
529 SE (50) + GM-CSF (5) 3,407 +/- 5,653
529 SE (50) + GM-CSF (2) 18,328 +/- 8,067
529 SE (50) + GM-CSF (0.5) 3,526 +/- 17,606
SE (1%) 2,556 +/- 5,615
항-Aβ1-42 5주 IgG2a 적정점 역가
보조제 기하평균 표준 오차
529 SE (50) 1,386 +/- 5,173
529 SE (50) + GM-CSF (10) 48,519 +/- 148,981
529 SE (50) + GM-CSF (5) 11,659 +/- 23,132
529 SE (50) + GM-CSF (2) 124,815 +/- 167,340
529 SE (50) + GM-CSF (0.5) 26,190 +/- 40,254
SE (1%) 694 +/- 1,325
실시예 7
붉은털원숭이의 Th-CTL 및 C4-V3 펩타이드 면역화
하기 실험은 잠재적 펩타이드/보조제 배합물을 인간 임상실험에도 적용할 수 있는지 확인할 목적으로 영장류(붉은털원숭이)에서 다수의 펩타이드 및 보조제 배합 제제를 직접적으로 비교하기 위해 계획되었다. 구체적으로는, 인간 GM-CSF가 포함된 보조 제제 529 SE가 하기 서열을 갖는 (1)SIV env-유래 T-helper/SIV gag CTL 펩타이드 접합체(ST1-p11C):
Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly
Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3);
또는 하기 서열을 갖는 (2)HIV-1 유래 C4-V3 펩타이드 접합체(C4-V389.6P)와 배합된 프로인드 불완전 보조제(IFA)와 비교 평가되었다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg
Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr
Ala Arg Arg (서열번호 4).
연구 계획:연구를 위해 표 15에 기술된 바와 같이 Mamu-A*01+ 4마리 및 Mamu-A*01- 4마리의 총 8마리 동물이 사용되었다.
529 SE & GM-CSF 대 IFA
그룹 # # 동물들 동물 면역원 조성물 보조제
1 2 Mamu-A01+ 95X00993X021 ST1-p11C IFA
2 2 Mamu-A01+ 98N00298N008 ST1-p11C 529 SE/GM-CSF
3 2 Mamu-A01- 98N00798N013 C4-V389.6P IFA
4 2 Mamu-A01- 95X01196X004 C4-V389.6P 529 SE/GM-CSF
그룹 1 동물에게는 IFA 0.5ml와 함께 유중수 유제 내 Th-CTL 펩타이드 ST1-p11C(1.0mg/ml) 0.5ml를 총부피 1.0ml로 투여했다. 그룹 2 동물에게는 인간 GM-CSF 250㎍, 최종 오일 농도 1%의 529 SE 50㎍과 배합된 ST1-p11C(1.0mg/ml) 0.5ml를 총부피 1.0ml로 투여했다. 그룹 3 동물에게는 IFA 0.5ml와 함께 유중수 유제 내 C4-V389.6P펩타이드(2.0mg/ml) 0.5ml를 최종부피 1.0ml로 투여했다. 끝으로 그룹 4 동물에게는 인간 GM-CSF 250㎍, 최종 오일 농도 1%의 529 SE 50㎍과 배합된 C4-V389.6P펩타이드(2.0mg/ml) 0.5ml를 총부피 1.0ml로 투여했다.
모든 동물은 0, 4, 및 8주의 스케줄로 근육내 주사에 의해 면역되었다. 사량체 염색, p11C(Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met; 서열번호 3, 아미노산 19-27) 특이적 ELISPOT 반응 및 대량 배양 CTL 반응에 의한 CTL 유도(그룹 1 및 2)뿐 아니라 펩타이드 특이성 항체 반응(그룹 1 내지 4)을 위해 각 면역화 바로 전 및 면역화 후 1주 또는 2주에 말초 혈액 샘플을 채취했다.
안정성 및 내성
ST1-p11C + IFA:그룹 1 동물의 단일 부위에 3번의 근육내 주사로 투여되는ST1-p11C + IFA 제형은 유의적인 주사 부위 반응과 관련되어 있다. 2차 면역화 후 2주에 한 동물(93x021)에게 1.5cm 크기의 종기가 주사 부위에 발달했다. 3차 면역화 후 2주에 다른 동물(95x009)에서 또한 2.0cm 크기의 종기가 주사 부위에 발달하여 피부를 절개해야 하고 드레싱을 필요로 하였다.
ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF:그룹 2 동물의 단일 부위에 3번의 근육내 주사로 투여되는 ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF 제제는 미소한 부작용과 관련되어 있다. 그룹 2의 동물 둘다 8주에 3차 면역화를 받은 후 짧게 구토증세를 보였다. 그밖에 다른 부작용은 관찰되지 않았다.
C4-V3 89.6P + IFA:그룹 3 동물의 단일 부위에 3번의 근육내 주사로 투여되는 C4-V389.6P+ IFA 제제는 유의적인 주사 부위 반응과 관련되어 있다. 2차 면역화 후 1주에 한 동물(98n013)에게 1.0cm 크기의 종기가 주사 부위에 발달했다. 2차 면역화 후 1주에 다른 동물(98n007)에서 또한 1.5cm 크기의 종기가 주사 부위에 발달했다. 이러한 동물 종기는 4주 후에 짜내고 붕대로 감는 것이 필요했다.
C4-V3 89.6P + 529 SE/GM-CSF:그룹 4 동물의 단일 부위에 3번의 근육내 주사로 투여되는 C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF 제제는 한가지 미소한 부작용과 관련되어 있다. 그룹 4 동물 중 한마리(95x011)가 8주에 3차 면역화를 받은 후 짧게 구토증세를 보였다. 그밖에 다른 부작용은 관찰되지 않았다.
그룹 1 및 그룹 3 동물 모두 중에서, 보조제로 IFA를 받은 동물은 유의적인 주사 부위 반응을 나타냈다. 이러한 결과는 IFA 0.5ml가 단일 주사 부위에 근육내주사로 주어지면 내성이 거의 없음을 시사한다. 8주에 보조제로 529 SE/GM-CSF를 받은 4마리 동물 중 3마리가 면역된 후 짧게 구토증세를 보이는 것 또한 주목할 가치가 있다. 사용된 마취제(케타민)가 구토증세와 관련있다고 알려졌지만, 연구 과정 중 나타난 동물 구토의 다른 증례는 입증된 것이 없다. 이번에도, 동물 구토증상의 원인을 529 SE/GM-CSF와 관련된 임의의 부작용으로 돌릴 수 있는 증거는 불충분하다.
결과: 세포 면역 반응의 유도(그룹 1 및 2)
새로운 혈액 p11C-사량체 염색:면역화 전, 및 면역화 후 1주 및 2주에 모든 Mamu-A*01 양성 동물(그룹 1 및 2)로부터 새로 분리한 말초 혈액에서, 가용성 MHC Class I 사량체 염색에 의해 p11C 특이적 CD3+CD8+T 림프구의 존재를 검색했다. 표 16에 나타난 바와 같이, IFA와 배합된 ST1-p11C 펩타이드를 받은 오직 한 동물(93x021)만 비자극 말초 혈액에서 면역화-유도 세포 면역 반응의 증거를 나타냈다.
새로 분리한 말초 혈액 내 p11C-사량체 염색율% 및 p11C 특이적 ELISPOT 반응율%
0주면역화 전 5주2차 면역화 후 1주 6주2차 면역화 후 2주
동물(그룹) 제형 새로운 혈액 사량체 염색a 106세포당 ELISPOT # SFC 새로운 혈액 사량체 염색 106세포당 ELISPOT # SFC 새로운 혈액 사량체 염색 106세포당 ELISPOT # SFC
95x009(1) ST1-p11C + IFA 0.02 0.0 0.00 0.0 0.00 3.8
93x021(1) ST1-p11C + IFA 0.02 Ndb 0.15 56.3 0.12 21.9
98n002(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.00 0.6 0.05 0.0 0.01 6.3
98n008(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.05 0.0 0.04 15.0 0.01 9.4
8주2차 면역화 후 4주 9주3차 면역화 후 1주 10주3차 면역화 후 2주
동물 제형 새로운혈액 ELISPOT 새로운혈액 ELISPOT 새로운혈액 ELISPOT
95x009(1) ST1-p11C + IFA 0.00 Nd 0.01 2.5 0.02 1.9
93x021(1) ST1-p11C + IFA 0.02 Nd 0.14 Nd 0.02 Nd
98n002(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.06 Nd 0.00 Nd 0.00 3.8
98n008(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.02 Nd 0.02 Nd 0.00 0.0
a새로운 혈액 CD3+CD8+림프구의 p11C-사량체 염색 양성반응 %로 기록; ND, 측정하지 않음.bNd = 자료 없음(본 표 및 하기 표에서).
p11C 특이적 ELISPOT 반응:그룹 1 및 2 동물에서 세포 면역 반응의 유도를 추가로 평가하기 위해, 새로 분리한 말초 혈액 림프구에서, ELISPOT 분석으로 p11C 특이적 CD3+CD8+T 림프구의 존재를 검색했다. 표 16에 나타난 바와 같이, 새로운혈액 사량체 분석에 의해 p11C 특이적 CD8+림프구의 검출가능 수준을 나타내는 유일한 동물 93x021에서, ELISPOT 분석으로 p11C 특이적 CD8+T 림프구를 검출할 수 있었다. 모든 경우에서, p11C-사량체 분석의 양성반응은 양성 p11C 특이적 ELISPOT 반응에 의해 확증되었다.
시험관내 펩타이드 p11C 자극 후의 p11C 특이적 세포 면역 반응:분석 전에 p11C 특이적 세포의 수를 증가시키기 위한 노력으로, 새로 분리한 말초 혈액 림프구를 시험관내에서 펩타이드 p11C 및 rhIL-2로 자극했다. 14일 후, 생성된 작동인자 세포에서 표준 크로뮴 방출 CTL 분석으로 기능적 p11C 특이적 세포용해 활성뿐 아니라 p11C-사량체 결합을 검색했다. p11C-사량체 분석 및 기능적 CTL 분석의 결과를 표 17에 나타냈다. 새로 분리한 림프구에서 일관되게 p11C 특이적 면역 반응을 나타내는 동물 93x021은 2차 면역화 후 1주에 사량체 결합 및 기능적 CTL 활성의 매우 높은 수준을 나타냈다. 이는 매우 유력한 p11C 특이적 세포 면역 반응의 유도를 시사했다. 새로 분리한 림프구에서 나타난 결과에 반해, 그룹 2 중 한 동물(98n008, ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF)은 2차 면역화 후 2주에 p11C 특이적 세포 면역 반응의 증거를 나타내기 시작했다. 그러나, 그룹 2 동물에 나타난 p11C 특이적 면역 반응은 그룹 1의 반응 동물에서 나타난 것보다는 유의적으로 낮은 양이었다.
시험관내 펩타이드 p11C 자극 후의 p11C-사량체 염색율% 및 기능적 p11C 특이적 CTL 반응율%
0주면역화 전 5주2차 면역화 후 1주 6주2차 면역화 후 2주
동물(그룹) 제형 사량체염색a CTL20:1 E:Tb 사량체염색 CTL20:1 E:T 사량체염색 CTL20:1 E:T
95x009(1) ST1-p11C + IFA 0.03 0.6 0.23 Nd 0.27 0.0
93x021(1) ST1-p11C + IFA 0.03 0.0 34.31 66.3 15.15 4.69
98n002(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.21 0.0 Nd Nd 0.73 Nd
98n008(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF 0.16 0.0 Nd Nd 5.84 Nd
8주2차 면역화 후 4주 9주3차 면역화 후 1주 10주3차 면역화 후 2주
동물 제형 사량체염색 CTL20:1 E:T 사량체염색 CTL20:1 E:T 사량체염색 CTL20:1 E:T
95x009(1) ST1-p11C + IFA Nd Nd 0.76 3.0 0.72 0.0
93x021(1) ST1-p11C + IFA Nd Nd 4.90 7.3 Nd Nd
98n002(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF Nd Nd 0.07 5.7 0.39 0.0
98n008(2) ST1-p11C + 529 SE/ GM-CSF Nd Nd 2.24 11.4 5.00 0.0
aCD3+CD8+림프구의 p11C-사량체 염색 양성반응 %로 기록.b20:1 작동인자:표적세포 비(E:T)에서 p11C-특이적 용균율(-배경값)로서 기록.
세포내 시토킨 분석:면역원-유도 펩타이드 p11C 특이적 림프구의 기능적 성질 및 표현형 성질을 추가로 특징짓기 위해, Th1형 시토킨 INF-γ, TNFα, IL-2 및 Th2형 시토킨 IL-4의 세포내 발현을 모니터했다. 세포내 시토킨 발현을 10μM 펩타이드 p11C 및 rhIL-2 존재 하에 시험관내 1차 자극 후 말초 혈액 림프구에서 모니터했다. 이어서 배양물을 14일 동안 40U/ml IL-2와 함께 유지시켰다. 2주 후, 배양된 세포를 1시간 동안 배양액 단독, 또는 10μM 펩타이드 p11C + 항-인간 CD28 및 항-인간 CD49d로 자극시켰다. 1시간 후, 세포를 추가 5시간 동안 Brefeldin A로 처리하여 세포내 시토킨을 소포체에 농축시켰다. 이어서 세포내 시토킨 발현량을 세포유량계로 측정했다(표 18 및 19).
표 18에 나타난 바와 같이, 시험관내 펩타이드 p11C 자극 후 2주에, 그룹 1 동물 93x021(ST1-p11C + IFA)의 CD3+말초 혈액 림프구는 모든 세포의 1.5% 미만만이 INF-γ, TNFα, 또는 IL-2를 활발하게 분비하는, Th1형 시토킨 발현의 낮은 수준을 나타냈다. 시험관내 펩타이드 p11C 자극 후 모든 CD3+림프구의 약 8%가 Th2형 시토킨 IL-4을 활발하게 분비하며, IL-4 분비 세포는 CD3+CD4+림프구 서브셋으로 제한됨이 발견되었다. 펩타이드 p11C에의 간단한 재노출 후, p11C-사량체+및 CD3+CD4+림프구 서브셋은 Th1형 시토킨 INF-γ및 TNFα를 활발하게 분비하지만, 유의적으로 증가한 수준의 IL-2 분비는 유도할 수 없었다. 펩타이드 p11C 재노출 후에도, Th2형 시토킨 IL-4의 분비는 영향을 받지 않았다.
2차 면역화 후 2주, 그룹 1 동물 93x021의 세포내 시토킨 분석
림프구 서브셋 배양액 INF-γp11C aS.I. 배양액 TNFαp11C S.I.
bp11C-사량체+ 977 27,612 28.3 90 20,342 226.0
b벌크 CD3+ 7,628 65,567 8.6 12,256 51,361 4.2
bCD3+CD4+ 2,488 5,545 2.2 6,252 2,827 0.4
bCD3+CD8+ 5,273 60,573 11.5 6,865 48,439 7.1
배양액 IL-2 p11C S.I. 배양액 IL-4 p11C S.I.
bp11C-사량체+ 751 2,004 2.7 Nd Nd Nd
b벌크 CD3+ 2,879 6,463 2.2 78,069 90,563 1.2
bCD3+CD4+ 1,377 1,683 1.2 71,275 81,437 1.1
bCD3+CD8+ 1,502 4,783 3.2 6,794 9,126 1.3
3차 면역화 후 1주, 그룹 2 동물 98n008의 세포내 시토킨 분석
림프구 서브셋 배양액 INF-γp11C aS.I. 배양액 TNFαp11C S.I.
bp11C-사량체+ 545 560 1.0 748 454 0.0
b벌크 CD3+ 6,829 10,489 1.5 3,402 13,443 4.0
bCD3+CD4+ 3,310 3,789 1.1 1,428 2,567 1.8
bCD3+CD8+ 3,189 6,825 2.1 2,587 11,324 4.4
배양액 IL-2 p11C S.I. 배양액 IL-4 p11C S.I.
bp11C-사량체+ 77 456 5.9 Nd Nd Nd
b벌크 CD3+ 385 2,868 7.4 219,789 202,122 0.9
bCD3+CD4+ 1,379 1,761 1.3 170,804 158,175 0.9
bCD3+CD8+ 36 2,095 58.2 49,053 44,083 0.9
aS.I., 자극 지수.b106CD3+세포당 제시된 시토킨에 대한 제시된 세포의 염색 양성반응의 수 - 배경(아이소타입 대조군) 염색으로 기록.
표 19에 나타난 바와 같이, 시험관내 펩타이드 p11C 자극 후 2주, 그룹 2 동물 98n008(ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF)의 CD3+말초 혈액 림프구는 모든 세포의 1.0% 미만만이 INF-γ, TNFα, 또는 IL-2를 활발하게 분비하는, Th1형 시토킨 발현의 낮은 수준을 나타냈다. 흥미롭게도, 모든 CD3+림프구의 약 20%가 그룹 1 동물과 비교할 때 IL-4 생성 세포 수가 2.5배 증가하여, Th2형 시토킨 IL-4를 활발하게 분비했다. 그룹 1 동물의 경우와 같이, IL-4 분비 세포는 CD3+CD4+림프구 서브셋으로 제한됨이 발견되었다. 펩타이드 p11C에의 간단한 재노출 후, 그룹 2 동물의 p11C-사량체+및 CD3+CD4+림프구 서브셋은 TNFα의 분비를 자극할 수 있지만, INF-γ에 대해서는 그렇지 못했다. 그룹 1 동물에 반해, 펩타이드 재노출 후, CD3+CD4+세포에 의한 IL-2 발현의 유의적인 증가가 나타났다. 그룹 1 동물의 경우와 같이, 펩타이드 p11C 재노출 후에도, Th2형 시토킨 IL-4의 분비는 변하지 않았다.
결과: 면역원-유도 체액 면역 반응(그룹 1 및 2):
면역원 특이적 체액 항체 반응의 유도를 평가하기 위해, 항-ST1-p11C ELISA 항체 역가를 면역화 바로 전 및 2차 및 3차 면역화 후 1주 및 2주에 그룹 1 및 2 동물의 혈청에서 측정했다. 결과를 표 20에 요약했다.
ST1-p11C로 면역된 붉은털원숭이 혈청의 ELISA 적정점 역가(그룹 1 및 2)
동물 그룹 제형 주 ST1-p11C 항체역가a
95x009 1 ST1-p11C + IFA 56910 12,80012,8006,40012,800
93x021 1 ST1-p11C + IFA 56910 51,200102,40051,20051,200
98x002 2 ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF 56910 <50<501,600<50
98n008 2 ST1-p11C + 529 SE/GM-CSF 56910 20020012,8006,400
a항체 적정점 결합 역가는 3.0 이상의 실험군/대조군(E/C) OD값을 부여하는 혈장 최대 희석량의 역수로 측정했다.
면역원 유도 체액 면역 반응(그룹 3 및 4)
면역원 특이적 및 보조제 특이적 체액 항체 반응의 유도를 평가하기 위해, 항-C4-V389.6P및 항-GM-CSF ELISA 항체 역가를 면역화 바로 전 및 2차 및 3차 면역화 후 1주 및 2주에 그룹 3 및 4 동물의 혈장에서 측정했다. 결과를 표 21에 요약했다. 결과는 시험된 모든 동물에서 최대 혈장 C4-V389.6P항체 역가가 2차 면역화 후 1주에서 생성됨을 시사했다. 그룹 3 동물(C4-V389.6P+ IFA)에서의 최대 혈장 항체 역가는 그룹 4(C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF)에서 나타난 최대 혈장 항체 역가보다 각각 수배까지의 범위로 높았다. 그룹 4 동물은 3차 면역화 후 1주에 최대인, 항-GM-CSF 항체 역가의 낮지만 검출 가능한 수준을 나타냈다.
C4-V389.6P로 면역된 붉은털원숭이 혈장의 ELISA 적정점 역가(그룹 3 및 4)
동물/그룹 제형 주 C4-V3 항체 역가a 항-인간 GM-CSF항체 역가
98n007(3) C4-V389.6P+ IFA 56910 102,40025,60025,60025,600 <10<10<10<10
98n013(3) C4-V389.6P+ IFA 56910 12,8006,40012,80012,800 <10<1010<10
96x004(4) C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF 56910 6,4001,6003,2001,600 3201602,5601,280
95x011(4) C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF 56910 1,6008001,6001,600 160801,2801,280
a항체 적정점 결합 역가는 3.0 이상의 실험군/대조군(E/C) OD값을 부여하는 혈장 최대 희석량의 역수로 측정했다.
그룹 3 및 4 동물의 중화 항체의 유도를 또한 모니터했다; 결과를 표 22에 요약했다. 결과는 그룹 3 동물 둘다 및 그룹 4 동물 둘다 시험관내에서 SHIV89.6바이러스를 중화시킬 수 있는 중화 항체를 형성시킴을 시사했다. 그룹 3 동물에서 나타난 SHIV89.6중화 항체 역가는 일반적으로 그룹 4 동물에서 나타나는 것보다 높았다. 또한, 최종 면역화 후 그룹 3 동물의 혈청은 중화하기 어려운 바이러스 SHIV89.6균주에 대한 중화 활성을 낮은 수준으로 나타냈다.
C4-V389.6P로 면역된 붉은털원숭이의 혈청 적정점 중화 항체 역가(그룹 3 및 4)
동물/그룹 제제 주 SHIV89.6 SHIV89.6P
에 대한 중화 항체a
98n007(3) C4-V389.6P+ IFA 056910 <10224611374 <10<10<104671
98n013(3) C4-V389.6P+ IFA 056910 <1012193622 <10<10<1018<10
96x004(4) C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF 056910 <10<10<1026<10 <10<10<10<10<10
95x011(4) C4-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF 056910 <1011<1019<10 <10<10<10<10<10
a중화 항체 역가는 중성 레드 흡수율로 측정했을 때 세포의 50%가 바이러스-유도 사멸로부터 보호되는 혈청 희석율의 역수이다.
실시예 8
Aβ1-42 및 보조제(들)로 처리한 PDAPP 돌연변이 생쥐의 치료 효과 연구
하기 실험은 Aβ1-42 펩타이드의 치료 효과를 시험할 목적으로 PDAPP 돌연변이 생쥐에서 다수의 조합 제제를 비교하기 위해 계획되었다.
연구 계획:10개월 반 내지 12개월 반 된 PDAPP 돌연변이 생쥐(수컷 및 암컷)를 40마리씩 4 그룹으로 나누고, 각 그룹을 서로 나이, 성 및 돌연변이 부모별로 가능한한 가깝게 분류했다. 그룹을 표 23에 기술했다:
돌연변이 생쥐 치료 그룹
그룹 보조제 투여량 Aβ1-42 투여량 시작 N 끝 N
1 MPL SE 25㎍ 75/60㎍ 40 35
2 MPL SE + GM-CSF 25㎍/10㎍ 64/60㎍ 41 34
3 529 + GM-CSF 25㎍/10㎍ 64/60㎍ 40 31
4 PBS na na 40 37
Aβ1-42 펩타이드는 엘란 파머수티컬즈(Elan Pharmaceuticals)로부터 입수했고, 529 SE 및 MPLTMSE는 코릭사(Corixa)로부터 입수했으며, 쥐의 GM-CSF는 바이오소스(Biosource)로부터 입수했다. 모든 생쥐는 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 및 24주에 주사를 받았다. 쥐를 주사 후 5-7일에 채혈하는데, 이는 2차 주사 후 시작되었다. 그룹 1, 2, 및 3에는 200㎕를 피하주사했고, 그룹 4에는 피하주사 투여량 250㎕를 투여했다. 역가는 최대 최적 밀도의 50% 값을 부여하는 희석율을 사용하여 수득했다.
결과
면역원성 및 항체 반응:모든 그룹은 2차(RC529 + GM-CSF) 또는 3차 채혈(MPLTMSE, MPLTMSE + GM-CSF)에서 Aβ1-42 펩타이드에 대한 항체의 최대 기하평균 역가(GMT)에 도달했다(도 1 참조). 최대 GMT에서, MPLTMSE + GM-CSF는 16,400이었고, 529 SE + GM-CSF는 13,400 또는 9,700인 MPLTMSE 대조군의 약 1.5 배였다. 그러나, 두 GM-CSF-함유 제형(그룹 2 및 3) 상의 역가는 대략 MPLTMSE 대조군 수준까지 떨어져서, 최종 GMT는 MPLTMSE = 4600, MPLTMSE + GM-CSF = 5350, 529 SE + GM-CSF = 4650이 되었다.
두 GM-CSF-함유 제형의 역가의 결과적 감소가 항-GM-CSF 항체 반응 때문인지를 측정하기 위해, ELISA를 사용하여 항-GM-CSF 항체가 면역화 과정 동안에 형성되는지를 측정하였다. GM-CSF를 받은 모든 동물의 혈청을 본 실험에 사용된 쥐의 GM-CSF에 대해 적정했다. 항-GM-CSF 항체가 임의의 치료된 동물에서 발견되었다는 증거는 없었다(자료 나타내지 않음).
뇌 Aβ수준: 세 치료 그룹 모두 PDAPP 생쥐 뇌의 피질 영역에서 총 Aβ펩타이드(도 2 - 개별 결과; 표 24 - 전체 결과) 및 Aβ1-42(도 3 - 개별 결과; 표 25 - 전체 결과) 둘다의 축적이 유의적으로 감소했다. AβELISAs(총합 및 1-42 형태)를 구아니딘-용해 뇌 균질현탁액을 사용하여 종래 기술된 것처럼(54) 시행했다. 통계 비교는 맨-휘트니(Mann-Whitney) 유의성 테스트를 사용했다.
피질의 총 Aβ수준
PBS MPL SE MPL SE + GM-CSF 529 SE + GM-CSF
평균값(ng/g) 6,478 1,707 925 1,313
범위 64 - 17,208 33 - 8,501 67 - 5,293 79 - 5,271
감소율% --- 74 86 80
P 값(M-W) --- <0.0001 <0.0001 <0.0001
N 37 35 34 31
피질의 Aβ1-42 수준
PBS MPL SE MPL SE + GM-CSF 529 SE + GM-CSF
평균값(ng/g) 5,609 1,799 779 1,127
범위 284 - 14,004 10 - 6,715 43 - 4,824 29 - 4,442
감소율% --- 68 86 80
P 값(M-W) --- <0.0001 <0.0001 <0.0001
N 36 35 34 31
아밀로이드 축적:아밀로이드증의 정도를 종래 기술된 면역조직화학법(55)을 사용하여 전두면 피질에서 측정했다. 세 치료 그룹 모두 아밀로이드 축적량의 유의적인 감소를 나타냈다(도 4 - 개별 결과; 표 26 - 전체 결과).
전두면 피질 아밀로이드 양
PBS MPL SE MPL SE + GM-CSF 529 SE + GM-CSF
평균값(%AB) 7.98 0.49 0.00 0.04
범위 0.00 - 27.37 0.00 - 9.63 0.00 - .83 0.00 - 5.53
감소율% --- 94 100 99.5
P 값(M-W) --- <0.0001 <0.0001 <0.0001
N 29 33 29 30
신경염 축적:전두면 피질 내 신경염 장애 발생에 대한 치료 효과를 종래 기술된 것처럼 면역조직화학적으로(55) 평가했다. 세 치료 그룹 모두 PBS 대조군에 비해서 신경염 정도가 유의적으로 감소했다(도 5 - 개별 결과; 표 27 - 전체 결과).
전두면 피질 신경염 정도
PBS MPL SE MPL SE + GM-CSF 529 SE + GM-CSF
평균값(%NB) 0.35 0.14 0.04 0.02
범위 0.00 - 1.21 0.00 - 0.82 0.00 - 0.60 0.00 - 0.91
감소율% --- 60 88 95
P 값(M-W) --- <0.0153 <0.0001 <0.0001
N 29 33 29 30
성상세포증식증:팽대후부피질 내 성상세포증식증의 정도를 종래 기술된 것처럼(55) 측정했다. GM-CSF를 함유한 치료 그룹은 유의적으로 감소된 성상세포증을 나타냈다(도 6).
실시예 9
사이노몰로거스 머카크(Cynomologous Macaque)의 C4(E9V)-V3 89.6P 펩타이드 면역화
본 실험의 목적은 또다른 영장류인 사이노몰로거스 원숭이(머카카 퍼시큘라리스(Macaca fascicularis))에서 본 발명의 보조제 배합 제제와 함께 또는 이것 없이 투여된 HIV-1 Env-유래 펩타이드 결합체, C4(E9V)-V389.6P의 면역원성을 평가하기 위한 것이다. 아미노산 잔기 9의 글루탐산을 발린으로 교체함으로써 실시예 7에 기술된 C4-V389.6P펩타이드를 변형시켰다. C4(E9V)-V389.6P로 표시되는 생성된 펩타이드 결합체가 사용되었고, 이는 하기 서열을 가진다:
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg
Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr
Ala Arg Arg (서열번호 5)
펩타이드의 C4 영역 내에서 글루탐산의 발린으로의 치환(E9V)은 생쥐 모델의 비변형 서열보다 펩타이드의 면역원성을 증가시켰다.
이러한 HIV-1 Env-유래 펩타이드는 생쥐에서 체액 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 그러나, 생쥐의 결과를 인간에게 적용하기가 곤란하기 때문에, 상 I 인간 임상실험을 진행하기 전에 비인간 영장류에 잠재적 HIV-1 면역원성 조성물을 시험하는 것이 필요하다. 이 실험에서, 근육내(IM) 및 비내(IN) 경로의 투여가 평가되었다. 동물을 0, 4, 8, 18 및 23주에 5회 면역시켰다. 25주 동안 매주, 혈액 샘플 및 경질 및 점막 세정액을 수집하여 면역원 조성물에 대한 항체의 존재를 분석했다.
실험 계획:실험에 사이노몰로거스 원숭이를 그룹당 4마리씩(표 28) 총 8마리 사용했다. 그룹 1에게는 보조제를 투여하지 않았다; 그룹 2에게는 보조제 제제 529 SE + GM-CSF를 투여했다. 동물을 우리에 가두고 동물 관리 시설에서 평가했다.
529 SE + GM-CSF 대 보조제 없음
그룹 # 면역원 보조제 경로
1 C4(E9V)-V389.6P펩타이드 없음 IN
2 C4(E9V)-V389.6P펩타이드 529 SE/GM-CSF IM
면역화:모든 비내 면역화는 100㎕들이 투여 코 스프레이 장치로 실시했다. 모든 근육내 주입은 바늘 및 주사기로 사두근 내에 주어졌다. 모든 동물을 0, 4, 8, 18 및 23주의 스케줄에 따라 면역시켰다.
제제:
그룹 1: 멸균 정상 염수 내 1000㎍ C4(E9V)-V389.6P펩타이드, 최종 부피 200㎕(각 콧구멍당 100㎕).
그룹 2: 1000㎍ C4(E9V)-V389.6P펩타이드, 50㎍ 529 SE, 및 250㎍ 인간 GM-CSF, 최종 오일 농도 1%, 최종 부피 1.0ml(IM 주입으로 각 사두근당 500㎕).
면역원-유도 면역 반응을 모니터하기 위한 분석:
면역화 바로 전 및 후에, 하기 분석으로 모든 동물을 면역원-유도 체액 면역 반응에 대해 면밀하게 모니터했다:
(1)ELISA에 의한 혈청 항-C4(E9V)-V389.6P펩타이드 IgG 혈청 항체 역가.
(2)ELISA에 의한 점막(경질, 코) 항-C4(E9V)-V389.6P펩타이드 IgG 항체 역가.
결과:
면역원 안전성 및 내성:
C4(E9V)-V389.6P펩타이드는 단독으로 주입하거나 또는 보조제 529 SE/GM-CSF와 배합하여 주입했을 때 극단적으로 좋은 내성이 있다. 바늘 및 주사기를 사용하여 근육내 경로로 면역시킨 동물에서, 역 주사 부위 반응성은 나타나지 않았다. 모든 동물을 각 면역원 투여 직후부터 24시간 동안 체온 변화에 대해 면밀하게 모니터했다. 연구기간 동안, 어느 동물도 비정상적인 체온 증가를 나타내지 않았다(자료 나타내지 않음).
면역원 특이적 혈청 항체 반응:
모든 동물로부터의 혈청 샘플을 각 면역화 바로 전 및 면역화 후 1주 및 2주 에(25주 동안) 채취했다. 최종 면역화 후 2주에, 모든 혈청 샘플을 항-C4(E9V)-V3 펩타이드 IgG 항체에 대해서 분석했다. 비내로 면역화시킨 그룹 1 동물(C4(E9V)-V389.6P펩타이드 단독)은 면역 전 수준보다 높은 혈청 항-C4(E9V)-V389.6PIgG 항체 역가를 나타내는 데 실패했다(도 7). 반면에, 그룹 2 동물(C4(E9V)-V389.6P+ 529 SE/GM-CSF의 IM 투여)은 혈청 C4(E9V)-V3 특이적 IgG 항체를 유의적인 수준으로 발생시켰다(도 7). 보고된 기하평균 적정점 역가는 각 개별 동물의 가장 낮은 역가를 사용하여 계산되었는데 이는 동일한 희석율의 수집한 순수 혈청에 대한 값의 3배이다.
그룹 1 동물(보조제 없음)은 경질 세척 샘플에서 오직 4차 면역화 후에만 면역 전 수준보다 높은 항-C4(E9V)-V389.6PIgG 항체 역가를 가졌지만, 그 이후엔 감소했다(도 8). 반면에, 그룹 2 동물(보조제 있음)은 경질 세척 샘플에서 1차 면역화 후에 면역 전 수준보다 높은 항-C4(E9V)-V389.6PIgG 항체 역가를 가졌고, 이는 각각의 후속 면역화 후에도 증가했다(몇번 이후에는 각 경우에 감소가 있었다)(도 8).
그룹 1 동물(보조제 없음)은 비측 세척액에서 면역 전 수준보다 높은 항-C4(E9V)-V389.6PIgG 항체 역가를 나타내는 데 실패했다(도 9). 반면에, 그룹 2 동물(보조제 있음)은 비측 세척액 샘플에서 항-C4(E9V)-V389.6PIgG 항체 역가가 유의적인 수준으로 발달했다(도 9).

Claims (67)

  1. 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균에서 유래하거나 암세포 또는 종양 세포에서 유래하거나, 또는 알레르기원에서 유래하거나 또는 자가 분자에서 유래하는 소정의 항원과, (1) 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 유효 보조 함량으로 포함하고, 이 보조제 조합이 척추동물 숙주에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 것이 특징인 항원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 소정의 항원이 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편인 것이 특징인 항원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 및 인터루킨-12로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자인것이 특징인 항원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 인터루킨-12인 것이 특징인 항원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 추가로 희석제 또는 담체를 포함하는 것이 특징인 항원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  11. 제1항에 있어서, AGP가 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노이옥시테트라데카노일아미노]-β-D-글루코피라노사이드(529)인것이 특징인 항원성 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 소정의 항원이 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 유래인 것이 특징인 항원성 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 선택된 HIV 항원이 HIV 단백질, 이 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편인 것이 특징인 항원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 소정의 항원이 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 구성된 군 중에서 선택되는 HIV 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2);
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr AlaArg Arg (서열번호 4); 및
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  15. 제14항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1).
  16. 제14항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2).
  17. 제14항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu GlyCys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3).
  18. 제14항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 4).
  19. 제14항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  20. 제12항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  21. 제12항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 및 인터루킨-12로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자인 것이 특징인 항원성 조성물.
  23. 제22항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 인터루킨-12인 것이 특징인 항원성 조성물.
  25. 제24항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  26. 제12항에 있어서, 추가로 희석제 또는 담체를 포함하는 것이 특징인 항원성 조성물.
  27. 제26항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 항원성 조성물.
  28. 제12항에 있어서, AGP가 529 인 것이 특징인 항원성 조성물.
  29. 척추동물 숙주에게 제1항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정의 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 면역반응 유도능을 증가시키는 방법.
  30. 척추동물 숙주에게 제9항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정의 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 면역반응 유도능을 증가시키는 방법.
  31. 척추동물 숙주에게 제12항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, HIV 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 면역반응 유도능을 증가시키는 방법.
  32. 척추동물 숙주에게 제26항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, HIV 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 면역반응 유도능을 증가시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 선택된 항원이 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 구성된 군 중에서 선택되는 HIV 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys ThrArg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2);
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 4); 및
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  34. 제33항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1).
  35. 제33항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2).
  36. 제33항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3).
  37. 제33항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 4).
  38. 제33항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  39. 척추동물 숙주에게 제1항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정의 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 세포독성 T 림프구 유도능을 증가시키는 방법.
  40. 척추동물 숙주에게 제9항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 병원성 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생균 유래의 소정의 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 세포독성 T 림프구 유도능을 증가시키는 방법.
  41. 척추동물 숙주에게 제12항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, HIV 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 세포독성 T 림프구 유도능을 증가시키는 방법.
  42. 척추동물 숙주에게 제26항에 기재된 항원성 조성물을 투여하는 것을 포함하여, HIV 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주의 세포독성 T 림프구 유도능을 증가시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 선택된 항원이 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 구성된 군 중에서 선택되는 HIV 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2);
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3);
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 4); 및
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  44. 제43항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 1).
  45. 제43항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (서열번호 2).
  46. 제43항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu (서열번호 3).
  47. 제43항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr AlaArg Arg (서열번호 4).
  48. 제43항에 있어서, HIV 펩타이드가 하기 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (서열번호 5).
  49. 암세포 또는 종양 세포 유래의 소정의 암 항원이나 종양 관련 항원과, (1) AGP 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 유효 보조 함량으로 포함하는 항원성 조성물을 척추동물 숙주에게 투여하는 것을 포함하여, 암세포 또는 종양 세포 유래의 소정의 암항원이나 종양 관련 항원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주에서의 치료적 또는 예방적 항암 효과 유도능을 증가시키는 방법.
  50. 소정의 알레르기원과, (1) AGP 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 유효 보조 함량으로 포함하는 항원성 조성물을 척추동물 숙주에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 알레르기원을 함유하는 항원성 조성물에 의한 상기 숙주에서의 알레르기 반응의 완화능을 증가시키는 방법.
  51. 바람직하지 않은 방식, 양 또는 위치에서 숙주에 의해 생성되는 것을 나타내는 분자 또는 그 일부에서 유래하는 소정의 항원을 함유하고, (1) AGP 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 유효 보조 함량으로 포함시켜, 상기 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위한 항원성 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 소정의 항원이 아밀로이드 전구체 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편 또는 이에 대한 항체인 것이 특징인 항원성 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 소정의 항원이 아밀로이드 전구체 단백질의 내부 39 내지 43 아미노산 단편인 Aβ펩타이드, 또는 이 Aβ펩타이드의 단편인 것이 특징인 항원성 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 소정의 항원이 하기 아미노산 서열을 갖는 Aβ펩타이드인 것이 특징인 항원성 조성물:
    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (서열번호 6)
  55. 제54항에 있어서, AGP가 529인 것이 특징인 항원성 조성물.
  56. 바람직하지 않은 방식, 양 또는 위치에서 숙주에 의해 생성되는 것을 나타내는 분자 또는 그 일부에서 유래하는 소정의 항원을 함유하여 상기 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위한 항원성 조성물의 능력을 유효 보조 함량의 (1) AGP 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 포함시켜 증가시키는 방법.
  57. 아밀로이드 전구체 단백질 유래의 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단편, 또는 이에 대한 항체와 유효 보조 함량의 (1) AGP 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 척추동물 숙주에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 숙주에서 나타나는 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 항원성 조성물의 능력을 증가시키는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 선택된 항원이 아밀로이드 전구체 단백질의 내부 39 내지 43개 아미노산 단편인 Aβ펩타이드, 또는 이 Aβ펩타이드의 단편인 것이 특징인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 선택된 항원이 하기 아미노산 서열을 갖는 Aβ펩타이드인 것이 특징인 방법:
    Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (서열번호 6)
  60. 제59항에 있어서, AGP가 529인 것이 특징인 방법.
  61. (1) 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이의 유도체 또는 유사체 및 (2) 시토킨 또는 림포킨, 또는 이 시토킨이나 림포킨에 대한 작동물질의 조합을 포함하는 보조 제제.
  62. 제61항에 있어서, AGP가 안정된 수중유 유제 형태로 사용되는 것이 특징인 보조 제제.
  63. 제61항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 및 인터루킨-12로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 보조 제제.
  64. 제61항에 있어서, 추가로 희석제 또는 담체를 포함하는 것이 특징인 보조 제제.
  65. 제61항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 과립구 대식세포 콜로니 자극인자인 것이 특징인 보조 제제.
  66. 제61항에 있어서, 시토킨 또는 림포킨이 인터루킨-12인 것이 특징인 보조 제제.
  67. 제61항에 있어서, AGP가 529인 것이 특징인 보조 제제.
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