TWI239848B

TWI239848B - Adjuvant combination formulations

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Publication number: TWI239848B
Application number: TW090127895A
Authority: TW
Inventors: Michael Hagen
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2001-11-09
Publication date: 2005-09-21
Also published as: EP1343527A2; JP2004523483A; BG107798A; EG24378A; HUP0600589A2; GEP20074077B; PL366031A1; SK5482003A3; KR20040043098A; CN1533285A; AU2002225972B2; JP2010001304A; AU2597202A; IL155690A0; US20040156820A1; NO20032086L; MXPA03004071A; US20070025959A1; EE200300172A; BR0115271A

Description

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發明蓺喼本發明係關於胺基烷基葡萄糖胺磷酸化合物，或其衍生物或類似物與諸如特別是顆粒細胞巨嗜細胞群落刺激因子或細胞間素-12之細胞素或淋巴素組合，可作為抗原性組合物中之佐劑組合，以促進脊椎動物對選定抗原的免疫反應。發明背景免疫系統利用各種機轉對抗病原，然而，進行免疫作用後並非這些所有的機轉均需要被活化，免疫作用所謗導的保護性免疫力端視免疫組合物所引發對抗或消滅該病原的適當免疫反應能力而定，根據病原的不同，此需要細胞媒介及/或體液免疫反應。免疫反應中輔助T細胞扮演角色的最新例證，是根據τ細胞所產生的細胞素，及決定這些細胞功能所發現之不同細胞素，而將其分類。此T細胞模式包括兩種主要的細胞次群：會產生細胞間素-2(IL-2)及干擾素珈瑪，而增強細胞及體液（抗體）免疫反應的ΤΗ-1細胞；及產生細胞間素· 4、細胞間素-5及細胞間素-l〇(分別為il-4、IL-5及IL-10)，其可增強體液免疫反應（參考文獻1)的TH-2細胞。為了使進行免疫作用之生物體能獲得更強的免疫反應，並加強宿主對抗帶有抗原病原的能力，因此常欲增強抗原的免疫效能。在某些情況下，咸欲將具優勢體液免疫反應之免疫反應（TH-2)轉變成較具平衡性的細胞免疫反應（TH-1)及體液（TH-2)免疫反應。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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1239848 A7 B7 五、發明説明（2 細胞免疫反應與CD8+ CTL(細胞毒性T-淋巴細胞）反應的產生有關，而此種反應需要發展出能對抗細胞内病原之免疫組合物。對抗各種病原的保護作用需要強力的黏膜反應、鬲血清效價、CTL誘發作用及有力的細胞反應。大部分的抗原製劑不會產生此種反應，包括慣用的次單位免疫組合物。這些病原中有人類免疫不全病毒（HIV)。因此，有必要開發出能在脊椎動物宿主體中產生體液及細胞免疫反應的抗原組合物調配物。發明摘要因此，本發明主旨係使用含有胺基烷基葡萄糖胺磷酸化合物（AGP)，或其衍生物或類似物抗原組合物中之佐劑組合調配物與細胞素或淋巴素（特別是顆粒細胞巨嗜細胞群落刺激因子（GM-CSF)或細胞間素-12)，或該細胞素或淋巴素之促進劑或拮抗劑組合。明確言之，AGP是2-[(R)-3·四癸酿基氧四癸醯基胺基]乙基2-去氧-4-0-磷酸基 3-四癸醯基氧四癸醯基]-2-[(R)-3-四癸醯基氧四癸醯基胺基卜,5 -D-吡喃葡萄糖:y：，其亦稱為529 (前稱RC529)。所謂佐劑是指當其與免疫原或抗原一起投用時，可以増進免疫反應的物質。本發明佐劑調配物係與抗原組合物或免疫組合物中之選定抗原一起投用，本發明抗原組合物可以促進脊椎動物宿主對所選定抗原的免疫反應。所選定的抗原可為聚肽、肽或片段，其衍生自（〇病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，或（2)癌細胞或腫瘤細胞，或（3)可以干擾IgE的產生的過敏原，而調控對過敏原的過敏反應，或 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1239848 A7 B7 五、發明説明（3 ) (4)澱粉狀蛋白先驅物蛋白質，而預防或治療澱粉狀蛋白沉積在脊椎動物宿主的疾病。本發明一個具體實例中，選定抗原來自HIV。該選定HIV抗原可為HIV蛋白或衍生自該蛋白之聚肽、肽或片段。本發明一個特別具體實例中，HIV 抗原為專一性肽，本發明另一個具體實例中，選定抗原為冷-澱粉狀蛋白肽（另稱A沒肽），其為澱粉狀蛋白先驅蛋白 (APP)内部39-43個胺基酸片段，其係/5及r分泌酶酵素切割APP後所產生的。 AGP可以水溶液，或為穩定的水包油乳化液（穩定乳化液或SE)型式存在。本發明一個較佳的具體實例中，水包油乳化液中含有角鯊晞、甘油及磷酯醯膽鹼。在SE調配物中，投藥前先將AGP與細胞素或淋巴素混合形成抗原組合物，細胞素或淋巴素不需要加至乳化液中。本發明一個較佳的具體實例中，AGP是為SE型態，抗原組合物可另外含有稀釋劑或載劑。本發明亦揭示可以增進抗原組合物穩定性的方法，其係藉由包括組合細胞素或淋巴素之有效佐劑含量，特別是 AGP與GM-CSF或IL-12，或該細胞素或淋巴素之促進劑或拮抗劑的組合，該抗原組合物含有的選定抗原（1)源自可以引發脊椎動物宿主免疫反應之病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，或（2)源自可以引發脊椎動物中具療效或預防性抗癌效應之癌細胞或腫瘤細胞之癌抗原或腫瘤相關抗原，或 (3)源自可以干擾IgE產生之過敏原，以調控對過敏原的過敏反應，或（4)源自宿主所產生之分子或其部分（自體分 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（4 ) 子，此種分子不想要的、或含量或位置不當），以降低此種不要的效應。本發明另外揭示增進含有源自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲之選足抗原仏原組合物的能力，以引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞，其包括有效佐劑含量之細胞素或淋巴素組合’特別是AGP與GM-CSF或IL-12，或該細胞素或淋巴素促進劑或拮抗劑的組合。圖形簡要說明圖1所示是轉植老鼠經免疫作用後，體内對抗A冷142肽之抗體的幾何平均效價，其免疫接種如下··第1組-A/Sl-42肽加上PBS(未列）；第2組-A /3 1-42肽加MPLtm SE(方形），第3組-A /5 1- 42肽加上MPLtm SE及GM- CSF(三角形）；第4組-A /3 1-42肽加上529 SE及GM-CSF(倒三角形）。圖2所示是以圖1所示的四組方式免疫轉植老鼠後，所得之總A々皮質含量。圖3所示是以圖1所示的四組方式免疫轉植老鼠後，所得之A冷1-42肤皮質含量。圖4所示是以圖1所示的四組方式免疫轉植老鼠後，所得之前皮質澱粉狀蛋白負荷量。圖5所示是以圖1所示的四組方式免疫轉植老鼠後，所得之前皮質神經性負荷量。圖6所示是以圖1所示的四組方式免疫轉植老鼠後，所得膨大後部皮質星形細胞增多症程度。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）

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1239848 A7 B7 五、發明説明（5 ) 發明詳細說明佐劑、細胞素及淋巴素為免疫調控化合物，其具有促進及引導對抗各種低度免疫抗原之免疫反應的發展及過程的能力。適當選用佐劑、細胞素及淋巴素可以誘導出當不含佐劑、細胞素及淋巴素時不會發展之體液及細胞免疫反應。明確言之，佐劑、細胞素及淋巴素在促進對免疫組合物中之次單位體及肽的免疫反應上具有明顯的效果，這些刺激活性亦對發展對抗蛋白抗原之抗原專一性免疫反應有益處。對各種需要強力黏膜反應、高血清效價、CTL誘發作用及強力的細胞反應之各式抗原而言，佐劑及細胞素/淋巴素組合所提供的刺激活性是大部分抗原藥劑所無法提供的。雖然已有些研究以動物模式評估不同的佐劑調配物，但是明礬（氧化鋁或磷酸鋁）是目前唯一許可廣泛用於人類的佐劑，另一種佐劑是 StimulonTM QS-21(QS-21)(Antigenics 公司.，Framingham，MA(2))。其中一群由各種水溶油或水包油組合之佐劑（穩定的乳化液）的免疫效能已受到相當的注意，這些調配物通常含有各種可代謝或惰性油的組合，其作用係穩定抗原並使抗原留置注射位置處。其中一種佐劑係不完全伏氏佐劑（IFA)，其包括礦物油，水及乳化劑。完全伏氏佐劑（CFA)是IFA加上經熱殺死的分枝菌 (Mycobacteria)而成。使用這些類型的佐劑時，特別引人關切的是有關注射位置處的刺激反應，常會引起單核細胞滲透，導致肉芽腫。因此，需研究開發其他具有作為佐劑可 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 _ B7___ 五、發明説明（6 ) 能性之化合物及調配物。其中一群此種化合物係胺基烷基葡萄糖胺磷酸化合物 (AGPs)，其揭示於美國專利案6，113,918號，如第二段，第三段第14行，第38行，該文獻一併併入本專利說明書參考 (3)〇 AGPs具有以糖甞鍵將胺基烷基（糖:y：配基）連結至2-去氧- 2- 胺基-a - D-吡喃葡萄糖（葡萄糖胺）而組成之基本結構。另外的取代基包括將葡萄糖胺環上第4或6碳原子及三個3-垸驢基氧燒酸基殘基鱗酸化。其中一種AGP係名為529的化合物（其完全化學名稱為2-[(11)-3-四癸醯基氧癸醯基胺基]乙基2-去氧-4-0-磷酸基- 3- 0-[(11)-3-四癸醯基氧四癸醯基]-2-[(11)-3-四癸醯基氧四癸酿基胺基]-/5 - D- p比喃葡萄糖嘗），係由Corixa製造 (Hamilton，MT) 〇

Corixa亦已調配出可代謝水包油調配物，其當與529組合時，會形成穩定的乳化液，命名為529 SE。該穩定乳化液係將529與角鯊烯油、甘油及磷脂醯膽鹼進行微液化作用後產生的，該調配物是種GMP品質之微液化乳化液。後文實驗所揭示的乳化液中含有1%油（雖然亦可以使用其他的濃度）。當Balb/c或Swiss-Webster老鼠以皮下注射方式投用529 SE後，不會產生明顯的組織病理變化，為便比較之用，同時製備含有相同成分但不含529之穩定乳化液。明確言之，將40個胺基酸組成之HIV肽TISPIOMN(A)中的半胱胺酸刪 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

-線 1239848 A7 B7 五、發明説明（7 ) 除而成之39個胺基酸（_Cys)(其缺少40個胺基酸肽（ + Cys)中的第17半胱胺酸），或α々1-42(為APP之内部42個胺基酸片段）與佐劑529 SE及GM-CSF調配後，以皮下注射方式進行免疫後’不會產生明顯的發炎、紅腫、腫服或硬塊現象。本發明範圍亦包括529的衍生物及類似物與其他AGPs。此種化合物包括（但不侷限於）美國專利申請案6,113,918號 (3) 所揭示之化合物。在免疫組合物中併入細胞素及淋巴素可以擴展及增進免疫組合物的效能（4)。經由T輔細胞次群擴展變換成Thl細胞素的細胞範圍（換言之，老鼠模式中IgG2次群）（5-7)，細胞間素-12(IL-12)已證明可增強及促進細胞媒介免疫力。在老鼠中，重組鼠類IL-12已證明可促進Thl優勢的免疫反應 (4) 〇 IL-12係由各種抗原-處理細胞所產生的，主要係巨嗜細胞及單細胞，此是誘導自然T-細胞成TH1細胞時重要的元素。業已證明IL-12的產生及對IL-12的反應能力是發展保護性類似TH1反應（例如，寄生性感染（最常見者為萊什曼病（Leishmaniasis) (8))，及促進對抗源自病原性細菌或病毒（9 )或癌細胞（1 0 )抗原細胞媒介免疫反應時重要的因素。 N K細胞及T輔細胞所產生的干擾素-珈瑪可媒介〗l -1 2效應。干擾素-珈瑪在誘導抗T-依賴性蛋白抗原之igG2a抗體 (11)及T-獨立抗原之IgG3反應（12)上是重要的。IL-12原稱天然殺死細胞刺激因子，為異雙體細胞素（13)。重組宿主細胞中IL-12蛋白的表現及分離發表於國際專利案w〇 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

-線 1239848 A7 _B7__ 五、發明説明（8 ) 90/05147(14)。另一種具有佐劑效能之細胞素為GM-CSF。GM-CSF是種特別的群落刺激因子（CSF)。CSFs為一群淋巴素，其可以誘導骨髓中原細胞分化成特定的成熟血液細胞。如美國專利案5,078,996( 15)(該文獻一併併入本專利說明書參考）中所揭示，GM - CSF可活化巨嗜細胞或先驅單細胞，以媒介非專一性殺腫瘤活性。編碼人類gm- csf的核：y：酸序列業已揭示（15)，含有GM-CSF cDNA質體業已轉植至E. Coli中，並存放於美國組織類型收集中心（ATCC，10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)，編號為 39900。如美國專利案5,229,496(16)中揭示（該文獻一併併入本專利說明書參考），GM-CSF基因亦已插入至酵母菌表現質體中，存放在ATCC，編號53157。另外，如美國專利案 5,073,627(17)(該文獻一併併入本專利說明書參考），編碼去除糖化作用位置之GM-CSF的DNA序列存放於ATCC，編號67231 。業已證明GM-CSF可以升調節具有促進免疫反應之抗原處理細胞上之蛋白分子（18)，並可影響分類純化老鼠B-細胞之Ig分泌（19)。GM-CSF亦揭示可為免疫組合物中之佐劑 (20” 其他的細胞素或淋巴素亦已證明具有免疫調控活性，包括（但不侷限於）細胞間素1-阿爾法、1-貝它、2、4、5、 6、7、8、10、13、14、15、16、17 及 18，干擾素-阿爾法、貝它及珈瑪、顆粒細胞群落刺激因子及腫瘤壞疽因子 -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝訂

.線 1239848 A7 一 B7 五、發明説明（9 ) 阿爾法及貝它。全身性投用任何細胞素或淋巴素時，令人關切的是與細胞素或淋巴素活性有關的生物性結果。除此之外，假若可以維持細胞素或淋巴素局部濃度，則可促進有關發展抗原專一性免疫反應之細胞素或淋巴素效應。

3- 0-脫醯化單磷醯基脂肪A或單磷醯基脂肪八與gm_ cSF 或IL-12的組合業經評估，發現可以促進各種的免疫反應參數（21)。本發明專利說明書揭示，藉由抗原、選定細胞素或淋巴素佐劑，及第二種佐劑，AGP(較佳係穩定可代謝乳化液）的組合使用，可促進對抗原的專一性免疫反應。本發明抗原組合物中所包含之選定抗原有源自蛋白質之肽或聚肽、蛋白質，及下列任何之片段：醣類、蛋白質、永-或暴核S•酸’或其他大分子成分。本專利說明書所用，，肽”係包括一系列至少三個胺基酸及含有至少一個抗原性決定子或抗原子，而”聚肽”係比肽長的分子，但不是全長的蛋白質。此種肽、聚肽或蛋白質可與不相關的蛋白共軛，諸如破傷風類毒素或白喉類毒素。本專利說明書所用，，片段 M係包括醣類、蛋白質、聚-或寡核苷酸，或其他大分子成分的一部份，但比全部少。以HIV為例，本發明抗原組合物另外包括全長的HIV蛋白。本發明第一個實例係以源自HIV的肽抗原為模式系統。這些肽揭示於或源自美國專利案5,013,548號（22)及5,〇19,387 號（23)，該文獻一併併入本專利說明書參考，以下摘要 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（10 ) 之。這些肽係包括相對於HI V外套膜蛋白之胺基酸序列，所產生的中和抗體及T細胞反應可對抗之。 HIV為人類反轉錄病毒，是造成後天免疫不全症候群 (AIDS)之致病原。HIV係藉由其外部外套膜醣蛋白接合至T 淋巴細胞表面上的CD4(T4)分子而感染免疫系統的T淋巴細胞，因此，其係利用CD4(T4)為受體而進入並感染T細胞。藉由進行免疫作用而誘導對HIV感染有專一性之保護性免疫反應鮮有成功的。近來所採用的一些方法係開發免疫組合物之有效及保護性方法，這些包括利用可表現HIV(24)抗原性決定子之減毒性及重組性細菌載劑、重組性腺病毒( 25) 或疫苗病毒載劑（26)、DNA免疫作用（27)，及包含HIV之各種T細胞及B細胞抗原子合成肽（28)。 HIV外部外套膜醣蛋白gpl20已證明可以誘導人類中和抗體。編碼約三分之一 gpl20分子之重組蛋白PB1已證明包括部分外套膜蛋白，其可誘發形成中和抗體。然而，在黑猩猩研究發現，不論是完整的gpl20或PB1均可誘發產生高效價的中和抗體。利用慣用方法合成相對於gpl20抗原決定子之短肽，並產生可中和病毒之抗gp 120的抗體反應，及誘導出對抗病毒之 T-輔細胞及CTL反應。

其中一種肽係含有HIV-1MN肽之C4/V3複抗原子（命名為 T1SP10MN(A)( + Cys)，及刪除半胱胺酸的變體T1SP10MN (A)(-Cys)。這些肽包括Th、Tctl及B抗原子，但不能誘導干擾CD4鍵結之抗體。前已說明，咸已證明這些C4/V3 HIV -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

.線 1239848 A7 B7 五、發明説明（11 ) 肽與CFA，或CFA-類似佐劑一起投用時，可為謗導免疫反應的可能候選物（29-34)。這些肽所含的抗原子前已證明可以促進老鼠及人類中CD4+ Th細胞的反應，且其含有主要中和抗原決定子及具有可為HLA B7+之Balb/c老鼠及人類 CD8+ CTL辨識的位置。近來已證明該39個胺基酸肽對HIV 感染病患具有免疫性及安全性（28)。 T1SP10MN(A)( + Cys)具有下列40個胺基酸：

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys

Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys

Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (31) (SEQ ID NO ： 1) 合成缺少位置17半胱胺酸之T1SP10MN(A)(-Cys)，其具有下列39個胺基酸序列：

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys

Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg

Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO ： 2) 此半胱胺酸殘基位於可被Th細胞、CTL或B細胞辨識功能性抗原子的外部。其他源自各種病毒基因體區域之HIV肽揭示於美國專利案5,861，243號（35)、美國專利案5,932,218 號（36)、美國專利案5,939,074號（37)、美國專利案 5,993,819號（38)、美國專利案6,037，135號（39)、公告歐洲專利案671，947號（40)，及美國專利案6,024,965號（41)，這 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（12 ) 些文獻一併併入本專利說明書參考。亦使用名為STl/pUC的28個胺基酸肽共軛物，該共軛物係將名為ST-1之16個胺基酸SIV外套膜-衍生T-輔細胞肽共軛至名為pllC之12個胺基酸SIV mac 251 Gag肽（Gag胺基酸 179-190)(42)。業已證明四體型式的pi 1C在SIV mac-感染 Mamu-A*01恆河猴上具有CTL活性（43)。STl-pllC肽共軛物具有下列胺基酸序列：

Arg Gin lie He Asn Thr Trp His Lys Val Gly

Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO ： 3) 亦使用名為C4-V389.6Pi39個胺基酸肽共軛物（44)。此肽共軛物C4區域（16個胺基酸）源自HIV-1外套膜蛋白的第四固定區域，並代表一般性T-輔細胞抗原子。肽V3部分（23個胺基酸）源自HI V-1外套膜蛋白的第三超變化驅物，代表重要的中和抗原決定子。C4-V389.6P*軛物具有下列的序列： Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn

Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg

Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO ： 4) HIV可為蛋白質或源自該蛋白質之聚肽、肽或片段。蛋白質可為醣蛋白，諸如gp41、gpl20或gpl60。另一種方式是，蛋白質可為諸如 gag、pol、vif、rev、vpr、tat、nef或 env基因所編碼之蛋白，源自此種蛋白的肽含有至少一個抗原決定子（抗原子），其至少有六個胺基酸的長度。 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（13 ) 以共價鍵（共軛）將肽連結至醫藥上可接受載劑分子上，可增加對HIV肽的免疫反應。適當載劑分子的實例包括破傷風類毒素、白喉類毒素、鑰孔蜮血藍蛋白及其他相對 HIV gpl20醣蛋白之T細胞抗原子的肽。近來已發現對抗HIV免疫作用之成功策略是必須引發對抗 HIV之黏膜免疫，及良好的CTL反應。在最近採用 TISPIOMN(A)複-抗原子肽，及黏膜佐劑，霍亂毒素之老鼠研究中，已證明以鼻腔免疫作用可誘發中和血清IgGl抗體（45)。其後利用HIV-V3曲肽的研究證明可謗發黏膜性合成IgA抗體及強力細胞媒介反應，包括肽專一性CTL(46)。高效價全身性及中和抗體在預防或穩定HIV-感染個體上所扮演的功能尚未得知，雖然咸信高效價病毒專一性抗體在預防病毒傳播上具有重要的功能。本發明較佳的一個具體實例中，調配含有529之穩定水包油乳化液，而後與細胞素IL-12或GM-CSF混合。後文實驗數據證明529與GM-CSF組合會產生高效價的HIV-中和血清抗體。529 SE及GM-CSF的組合會謗發經以生殖道進行免疫雌性老鼠體中產生高效價的抗原專一性IgG抗體，包括IgGl 及IgG2a兩者。與529 SE及GM-CSF所調配之T1SP10MN (A) (· Cys)肽免疫老鼠後，經測所增加之抗原專一性細胞增生及在組織中分泌出細胞素得知，其可謗導強力的細胞免疫反應，及誘導肽專一性CTL反應。當老鼠以源自APP之 1-42肽與529 SE及GM-CSF免疫後，亦有相似的結果產生0 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（14 ) 一般而言，與GM-CSF或IL-12及蛋白質或選定之肽及529 或529 SE抗原/佐劑組合調配物會謗導高效價的抗原專一性及病毒中和抗體，IgG次群比例會明顯的轉換成較大部分之補體-固定IgG抗體（在老鼠中較佳為IgG2a)，並可於活體外促進對抗原刺激作用之單核細胞中的細胞素產量及細胞增生。這些特性在缺乏529之抗原及SE調配物中並未發現，不論是否該調配物含有GM-CSF或IL-12。經測謗導CTL發現，本發明調配物亦可誘發良好的細胞反應。 529 SE的好處是調配物不會誘發肉芽腫產生，且在注射位置處不會有發炎現象；此種注射位置反應典型係因水溶油或水包油佐劑調配物所誘發的。進行實驗比較投用只含529 SE之HIV肽TISPIOMN(A) (-Cys)，或含529及IL-12組合，或含529 SE及GM-CSF組合之 HIV 肽 T1SP10MN(A)(-Cys)結果。在此實驗中（如下表1)，Balb/c老鼠以皮下注射投與529 SE調配之HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)，經兩次注射後即可引發肽專一性血清IgG效價，亦可引發IgGl及IgG2a次群效價，而含有第二種佐劑（含有GM-CSF或IL-12)可加強IgG總效價，及IgGl次群的效價，加入IL-12可加強IgG2a次群效價；添加GM-CSF則不會加強IgG2a次群的效價。另一個實驗中，為測定功能性細胞媒介免疫，評估以529 SE，或529 SE及IL-12，或529 SE及GM-CSF與複-抗原子肽 T1SP10MN( A) (- Cys) —起調配後免疫老鼠所得之胰臟細胞產生HIVMN·專一性CTL反應。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（15 ) 如表2中所示，任何佐劑免疫老鼠後所得之胰臟細胞證明對未標記或以不相關IIIB CTL抗原子脈衝標記之標的細胞具有低活性。與只投用529 SE相較，投用529 SE及IL-12 後，HIVMN-專一性CTL-媒介標的細胞溶解作用明顯增加，另外當投用529 SE及GM- CSF後亦會增加（表2)。在另一個實驗中，以STl-pllC或C4-V389.6P肽及IFA或529 SE加上GM-CSF免疫恆河猴（組別示於表15)，分析結果示於表16-22，以下摘要之。 ST1-pi 1C肽調配物本身似乎在所有的測試動物中相當的具有耐受性，然而，投與佐劑IFA會在注射位置處有明顯的反應，除此之外，佐劑調配物529 SE/GM-CSF的可能輕微副作用是在最後免疫作用立即發生。兩隻測試Mamu-A*01 陽性恆河猴中的一隻經以含有IFA之ST1-pi 1C肽調配物免疫後，可以誘導潛在性pi 1C-專一性細胞免疫反應，兩隻測試Mamu-A*01陽性恆河猴中的一隻經以含有529 SE/GM-CSF之STl-pllC肽調配物免疫後，亦可誘導pllC-專一性細胞免疫反應。含有IFA的C4-V389.6p肽調配物產生最高的血漿ELISA抗體效價在1 : 25,600 - 1 : 102,400範圍内，並產生對抗 SHIV89.6及SHIV89.6P之血清中和抗體效價。含有529 SE/GM -CSF之C4- V389.6P肽調配物產生最高的血漿ELIS A抗體效價在1 : 6,400 - 1 : 12,800範圍内，及產生低量對抗SHIV89.6 的中和抗體，但不會對抗shiv89.6P。由於每一組只有少數的動物（兩隻），故難以有明確的結 -18 - ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（16 ) 論。然而，含有529 SE/GM-CSF的兩種肽調配物所產生的免疫反應程度（包括體液免疫反應及細胞免疫反應）低於經 IFA佐劑免疫動物所見之免疫反應。但必須要了解的是， IF A係非核准使用於人類之商用組合物成分。除此之外，有些有限的證據顯示，反應細胞的功能特性及外觀（例如細胞素資料）可能係根據所用的佐劑調配物而有所不同。本發明咸欲開發用以預防或治療特徵為脊椎動物宿主中澱粉狀蛋白沉積（自體分子）疾病之含有本發明佐劑組合之免疫組合物，包括含有貝它澱粉狀蛋白先驅物蛋白質（APP) 部分者，此疾病係泛指阿兹海默症、殿粉狀蛋白變性病，或澱粉狀蛋白生成病。/S -澱粉狀蛋白肽（亦稱A/9肽）是為 APP内部39-43個胺基酸片段，其係泠及7分泌酵素處理 APP後所產生的。A/3 1-42肽具有下列序列：

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val

Gly Gly Val Val lie Ala (SEQ ID NO : 5)。在某些病患中，澱粉狀蛋白沉積係為凝集A 肽型式，令人驚訝的是，現今已發現投用分離的A 肽可以誘導對抗為脊椎動物宿主澱粉狀蛋白沉澱成分A/S肽的免疫反應（47)。因此，本發明免疫組合物包括本發明佐劑加上A /3肽，及A /3肽的片段、衍生物或修飾體及抗A /5肽或其片段、衍生物或修飾體抗體之組合。其中一種A yS肽片段具有下列28個胺基酸序列（48): -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（17

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO : 6)。其他有趣的A冷肽片段包括（但不侷限於）胺基酸1-10、1-7 、1-6、1-5、3-7、1-3及1-4，其可以未共輛型式，或與不相關蛋白共軛型式投用。進行一系列Ay31-42肽及各種佐劑的研究，結果摘要如下。第一個實驗中，Swiss-Webster老鼠經皮下注射臀部方式以A/3 1-42肽進行免疫後，產生肽專一性抗體IgG、IgGl及 IgG2a效價，證明A/3 1-42肽是具有活力的候選抗原。在529 SE及A/S1-42肽中加入GM-CSF後，所產生之血清抗體IgGl 及IgG2a效價，比只接種529 SE及A)S 1-42肽者增加（參考表 3-8)。接種529 SE加上GM-CSF組合之個別老鼠在多個案例中血清抗體上升，且效價比只接種529 SE者上升的快速（數據未列）。當以年齡較長的Swiss-Webster老鼠（6-8月不小於 3月大）試驗此第一個實驗時發現，所見與表3- 8的結果相似 (數據未列）。第二個實驗中，Swiss- Webster老鼠經皮下注射臀部方式以A /5 1-42肽及529 SE與不同含量的GM-CSF進行免疫， IgG終點效價係隨著GM-CSF含量的增加而增加（自0.1至1微克）（表9)，所有529 SE加上GM-CSF組合之IgG效價均較接種另種佐劑QS-21或QS-21及GM-CSF組合來的高。與第一劑接種529 SE加上G1VI-CSF，而第二劑只接種529 SE的老鼠組別比較’各種接種529 SE加上GM-CSF組別老鼠所得之 -20 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 裝訂

，線 1239848 A7 B7 18 ) 五、發明説明（

IgGl次群效價亦增加（表10)，與只接種529 SE的老鼠組別比較，接種各種529 SE加上GM-CSF組別老鼠所得之IgGa次群效價亦隨著劑量增加而增加（表11)。第三個實驗中，Swiss-Webster老鼠經皮下注射臀部方式以A/S 1-42肽及529 SE與含/不含各式含量的GM-CSF進行免疫，各組接種529 SE加上GM-CSF之IgG終點效價均增加 (0.5至2至5至10微克），雖然不是隨著劑量的增加而增加（表 12)。與只接種529 SE的組別老鼠比較，接種各種529 SE加上GM-CSF組別老鼠的IgGl及IgG2a次群效價亦增加，雖然不是雖著GM-CSF劑量的增加而增加（表13[IgGl]及表 14[IgG2a])。第四個實驗係利用表現冷-澱粉狀蛋白先驅蛋白質（APP) 變體（以苯基丙胺酸取代頡胺酸，使該蛋白在殘基717處產生突變）的轉植老鼠，該突變作用與人類家族性阿茲海默症相關。這些轉植老鼠（名為PDAPP老鼠）漸進式的發展出許多兹阿兹海默症的病理症狀，包括A点沉積、神經深色斑及星形細胞增多症，因此可作為研究人類阿茲海默症的動物模式。此第四個實驗中，PDAPP老鼠經皮下注射方式以A/S 1-42 肽及含/不含各種佐劑進行免疫，接種劑量示於表A中。明確言之，第1組老鼠接種混於穩定乳化液（SE)中之A/S 1-42 肽及MPLTM(Corixa，Hamilton，MT)，穩定乳化液為控制組；第2組老鼠接種八/5 1-42肽及]^1?1^^5£加上老鼠〇1^-CSF;第3組接種1-42肽及529 SE加上老鼠GM-CSF;第 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明劑"一詞係指抑制或預防該細胞素或淋巴素活性的分子，此種拮抗劑的實例為可溶性IL_4受體及可溶性TNF受體。本專利說明書所用”有效佐劑含量”係指本發明所揭示佐劑組合的劑量，與接種不含該佐劑組合之選定抗原之動物相較，其適以促進脊椎動物宿主對選定抗原的免疫反應。特定劑量端視年齡、重量及宿主疾病狀態與投用方式及抗原而定。在一個較佳的具體實例中，佐劑組合係採用範圍 0.1-500微克/劑之529 ;在更佳的具體實例中，範圍微克/劑。熟知技藝者可輕易的定出適當的劑量。本發明抗原組合物亦可以慣用方式與免疫學上可接受的稀釋劑或載劑混合，以製備注射用液態溶液或懸浮液。人類或非-人類脊椎動物可以各式的方法投用本發明抗原或免疫組合物’包括（但不侷限於）鼻腔内、口服、陰道内、肛門、非經腸、皮膚内、經皮（參考例如國際專利案 WO 98/20734(50)，該文獻一併併入本專利說明書參考）、肌肉内、腹膜内、皮下、靜脈及動脈注射。抗原成分或組合物成分含量端視抗原本身，及宿主年齡、重量及疾病狀態，及投用方法而定。另外，熟知技藝者可輕易的定出適量劑量。較佳的是（雖然不一定需要），在同時間投用抗原及佐劑組合。熟知技藝者可輕易的定出劑量數目及抗原組合物的劑量療程。同理，佐劑組合的佐劑特性可減少所需劑量數目或劑量療程的時程。本發明佐劑組合適合用於廣泛含有各式源自病原微生物的抗原或免疫組合物中，包括（但不侷限於）可感染人類及 -23 -

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-線 1239848 A7 B7 五、發明説明（21 ) 非-人類脊椎動物之病毒、細菌、真菌或寄生性微生物，或癌細胞或腫瘤細胞。抗原包括源自蛋白質的肽或聚肽，及下列的片段：聚糖、蛋白質、聚-或寡核甞酸，癌細胞或腫瘤細胞、過敏原、自體分子（諸如澱粉狀蛋白先驅蛋白質），或其他大分子成分。在某些情況下，抗原組合物中可含有一種以上的抗原。病毒、副感冒病毒第1-3型、感冒病毒、早純泡療病毒、人類細胞巨病毒、肝炎A病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、人類乳突病毒、小兒麻痺病毒、輪狀病毒、十字病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、德國麻疹病毒、腺病毒、狂犬病毒、犬溫熱病毒、牛疫病毒、人類後肺炎病毒、烏肺炎病毒（前稱火雞鼻氣管炎病毒）、Hendra病毒、Nipah病毒、冠狀病毒、巨病毒、感染性鼻氣管炎病毒、描白血症病毒、描感染腹膜炎病毒、新堡疾病病毒、瑪瑞克氏疾病病毒、豬、呼吸及生殖症狀病毒、馬動脈炎病毒及各式腦膜炎病毒。含本發明佐劑組合之所要的細菌性免疫組合物包括可以預防及/或治療下列所引起疾病者（但不侷限於）： Haemophilus influenzae(典型及非典型）、Haemophilus somnus 、 Moraxella catarrhalis 、肺炎鏈球菌、 Streptococcus pyogenes 、 Streptococcus agalactiae 、 Streptococcus faecalis、Helicobacter pylori、肺炎雙球菌、淋病雙球菌、Chlamydia trachomatis 、 Chlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaci、Bordetella pertussis、 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（22 )

Alloiococcus otiditis 、 Salmonella typhi 、 Salmonella typhimurium、Salmonella choleraesuis、大腸桿菌、志賀菌、霍亂汰菌、白喉桿菌、肺結核菌、Mycobacterium avium- Mycobacterium intracellulare 複合體、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、金黃葡萄球菌、白色葡萄球菌、破傷風菌、Leptospira interrogans、Borrelia burgdorferi 、Pasteurella haemolytica 、 Pasteurella multocida 、 Actinobacillus pleuropneumoniae 及 Mycoplasma gallisepticum o 含本發明佐劑組合之所要的真菌性免疫組合物包括可以預防及/或治療下列所引起疾病者（但不侷限於）： Aspergillis、Blastomyces、Candida、Coccidiodes、 Cryptococcus及 Histoplasma 〇含本發明佐劑組合之所要的寄生蟲免疫組合物包括可以預防及/或治療下列所引起疾病者（但不侷限於）： Leishmania major 、 Ascaris 、 Trichuris 、 Giardia Schistosoma、Cryptosporidium、Trichomonas、Toxoplasma gondii及Pneumocystis carinii o 可引發脊椎動物宿主中治療或預防抗癌效應之含本發明佐劑組合者包括（但不侷限於）：癌抗原或腫瘤相關抗原，包括（但不侷限於）前列腺專一性抗原、癌胚胎抗原、MUC-1 、Her2、CA-125及MAGE-3。用以調控脊椎動物宿主過敏原反應之含本發明佐劑組合之所欲免疫組合物包括過敏原或其片段。此種過敏原實例 -25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

罈 1239848 A7 B7 五、發明説明（23 ) 揭示於美國專利案5,830,877號（51)及國際專利案W0 99/51259(52)中（這些文獻一併併入本專利說明書參考），及包括花粉、昆蟲毒液、動物皮毛屑垢、真菌孢子及藥物 (諸如青黴素）。免疫組合物可以干擾已知為造成過敏反應之IgE抗體產生。用以調控脊椎動物宿主對自體分子反應之含本發明佐劑之所要免疫組合物包括自體分子或其片段。除了上述的A/51-42肽外，此種自體分子的實例包括與糖尿病相關之石-鏈胰島素、胃食道迴流疾病相關之G17分子及諸如降調節自體免疫反應疾病之抗原，諸如多發性硬皮症、紅斑性狼瘡及類風濕性關節炎。在HIV及SIV例子中，抗原組合物至少包括一種蛋白質或源自該蛋白質之聚肽、肽或片段。在某些情況下，抗原組合物可包括多重HIV或SIV蛋白質、聚肽、肽及/或片段。本發明佐劑組合調配物亦可作為聚核甞酸免疫組合物（前稱DNA免疫組合物）的佐劑，此種免疫組合物可另外含有輔助劑，諸如佈皮威可（bupivicaine)(參考美國專利案 5,593,972(53)，該文獻一併併入本專利說明書參考）。為使本發明更為清楚易懂，列有下列實例。實例目的係只為闡述本發明之用，本發明非侷限於實例中所述。實例實例1 物質及方法後文實例2- 7所報告之實驗係使用下列的物質及方法。 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（24 ) 動物自Taconic Farms公司（Germantown，紐約）購買7 - 9週大的雌性Balb/c老鼠，7-9週大的雌性Swiss-Webster老鼠亦購自 Taconic Farms公司。以美國實驗動物認證協會所核准認可之設施眷養所有的老鼠，進行研究開始前，老鼠需適應眷養設施一週。抗原下列實例2-3之HIV實驗中，使用兩種不同的合成肽，複抗原子111¥-1-1^肽丁15?101^1^(八）（-€丫5)(本專利說明書亦稱為MN-10)的序列如下：

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO ·· 2)。此肽前已揭示（33，34)，含有源自能夠促進老鼠及人類CD4+ Th細胞反應之HIV-1 gpl20MN的序列，主要係中和抗原決定子，及可被Balb/c老鼠CD8+ CTL辨識之位置。該肽係由R. Scearce博士（Duke大學，Durham，NC)提供。為便CTL分析，使用名為IIIB之不相關肽，以為比較之用，此肽相對於位於HIV- 1-IIIB V3 曲部分（Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile(SEQ ID NO ·· 7)之CTL抗原子，講自Genosys生技公司（The Woodlands，TX)。將肽溶解於無菌水中，並在使用之前，以適當緩衝液或細胞培養液稀釋之。在下列實例心6及8的澱粉狀蛋白實驗中，使用名為Α^Ι- Α- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

，線 r 1239848 A7 B7 五、發明説明（25 ) 42。A/5 1-42的序列如下：

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly

Gly Val Val lie Ala (SEQ ID NO : 5)。此肽前已揭示（47)，其相對於澱粉狀蛋白先驅蛋白質的内部42個胺基酸片段。A/3 1-42係由Elan藥廠（South San Francisco，CA)提供。將肽溶解於無菌水中，並在使用之前，以適當緩衝液或細胞培養液稀釋之。佐劑所有含529佐劑製藥均獲自Corixa(Hamilton，MT)。529 SE係以角鯊晞為基礎所調配之水包油（0.8-2.5%油）乳化液，所含529濃度範圍為（0_ 50微克/毫升）。磷酸鋁自行配製。伏氏完全佐劑（CFA)及不完全佐劑（IFA)購自Difco實驗公司，Detroit，MI。TISPIOMN(A)肽及伏氏佐劑係以1 : 1 比例，以兩個連接的注射筒乳化成之。重組性表現老鼠IL-12係由 Genetics Institute(Cambridge，MA)提供，而重組性老鼠 GM-CSF 掉自 Biosource International(Camarillo， CA)，為不含載劑的冷凍乾燥粉末。StimulonTM QS-21購自 Antigenics公司（Framingham，ΜΑ)。免疫作用以皮下注射臀部方式免疫老鼠，總體積0.2毫升等量注射在臀部的兩邊，在不同的時間間隔（如下所示）進行免疫作用。以鱗酸緩衝鹽液將抗原及細胞素稀釋至適當的濃度， -28 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）裝訂

r 1239848 A7 B7 五、發明説明（26 ) 並在進行免疫作用至少少於16小時前，於無菌條件下與佐劑調配。溫和震盪具免疫性組合物，並保存於4°C。進行免疫作用之前’立即強力的震盛調配物。利用酵素連結免疫吸附分析法分析血清在開始進行免疫作用之前，及所示的時間點取出動物血液。血清分析係以個體效價的幾何平均值表示。為便分析 HIV肽專一性抗體及次群的分布，將肽懸浮於碳酸緩衝液 (15mM Na2C03，35mM NaHC03，ρΗ9·6)或 PBS 中，濃度為 1微克/毫升，並以體積100 : 1將其置於96槽孔的微量盤 (Nunc)。於37°C下隔夜培養後，清洗微量盤，室溫下阻斷 (0.1%動物膠/PBS)2-4小時。添加連續稀釋的血清之前 (PBS，0.1% 動物膠，0.05% TweenTM20，0.02% 疊氮化鈉），用清洗緩衝液（PBS，0.1% TweenTM20)清洗ELISA 盤，培養4小時後，清洗槽孔，加入適當稀釋之生物素化抗同型/次群抗體，4°C隔夜培養。清洗槽孔，與抗生蛋白鏈菌素共軛之山葵過氧化酶培養，培養之後，清洗槽孔，以 AB丁S顯色，以405毫微米讀取槽孔，利用控制組血清標準化效價。以相同的步驟分析A冷1- 42肽專一性抗體及次群分布，除了每個微量盤中所使用的濃度為0.3微克/毫升。細胞製備為便增生分析及活體外細胞素分析，在所示的時間點取出老鼠的胰臟細胞。從3- 5隻老鼠的細胞庫中製備單一細胞懸浮液。為便增生及細胞素分析，將細胞懸浮於事先業經 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（27 ) HIV肽抗原、控制組蛋白塗覆或只經RPMI-10隔夜塗覆之圓底96槽孔培養盤，以含有2X補充物之組織培養液添加胰臟細胞（濃度為5X105細胞/槽孔），組織培養開始後3或6天後，收集三個重複槽孔細胞組織澄清液分析細胞素。收集澄清液後，組織立即以3H-胸腺嘧啶脈衝處理18-24小時，並收集定量細胞增生。實例2 抗-T1SP10MN(A)(-Cvs)之IgG終點總效價及次群效價倒數測定免疫後5週，第二次免疫後2週的混合血清（n= 5 Balb/c)中終點IgG次群效價倒數。在第0及3週時，將25微克T1SP10MN(A)(-Cys)以皮下注射臀部方式免疫老鼠，總體積0.2毫升等量注射於臀部兩邊，每邊注射0.1毫升。稀釋 529 SE使每劑含有1.25%角鯊晞油及25微克529之乳化液。 SE為水包油的乳化液媒劑，其含有角鯊烯、甘油，及乳化劑。重組老鼠IL-12係注射40毫微克/老鼠，重組老鼠GM· CSF係注射25毫微克/老鼠。所得結果示於表1，每組老鼠係以幾何平均值加上標準誤差表示。 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（28 ) 表1 抗-T1 SP10MN( A) (- Cys)之IgG終點總效價及次群效價倒數終點效價佐劑微克HIV肽 IgG IgGl IgG2a 529(25)SE 25 206,301 37,567 180,671 (1.25% 油） +/- +/- +/- 175,149 31,526 277,211 529(25)SE 25 460,516 74,269 222,446 (1·25% 油)+ +/- +/- +Λ rIL-12(.04) 690,712 169,868 400,716 529(25)SE 25 1,085,658 238,379 117,657 (1·25% 油)+ +/- +/- +/- GM-CSF(25) 1,064,924 62,199 25,301 實例3

Balb/c老鼠之CTL分折有關免疫老鼠的步驟係依循實例2。評估老鼠經第二次免疫作用後14天所分離胰臟細胞之CTL活性。以含/不含10微克 GM-CSF 或 40 毫微克 IL-12，加上 25 微克 T1SP10MN(A)(-Cys)之 1.25% 油之 25微克 529 SE調配 529 SE。為便CTL分析，第二次免疫作用後14天取出胰臟細胞，依循先前揭示的步驟（39)。簡而言之，將每組三隻老鼠的 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1239848 A7 B7 五、發明説明（29 ) 胰臟細胞（去除紅血球）混合一起。用1微克/毫升的” MN-10”肽' ”IIIB”10體CTL抗原子肽，或無HIV肽再刺激置於 24槽孔微量盤之1.5-2毫升胰臟效應細胞（4X106/毫升）7天。 CTL抗原子兩者侷限於H-2Dd 〇最後5天時，補充組織培養 10單位/毫升重組老鼠IL-12( Biosource)。為便分析細胞毒性分析，用Cr51標記P815細胞，並以5微克/毫升肽（IIIB或 MN10)脈衝處理4小時，加入至培養的胰臟效應細胞中。當無HIV肽時，那組的標的細胞不脈衝處理。效應細胞與標的細胞比例（“E : T”）係為三倍稀釋，從30 : 1至1.1 : 1。利用（（專一性鉻釋放量-自然鉻釋放量）/(最大鉻釋放量-自然鉻釋放量）X100的百分比計算出CTL的活性百分比。在培養 6小時後評估鉻的釋放量，平均自然鉻釋放量總是低於最大釋放量15%。從28天所得之結果示於表2。表2 效應細胞對標的細胞比例肽 MN-10 肽 IIIB 無肽 529 SE+ ： E ： T% 專一性釋放氺 IL-12 GM-CSF * IL-12 GM-CSF * IL-12 GM-CSF 30 ： 1 31 53 71 8 11 19 4 8 8 10 ： 1 19 41 70 5 8 21 2 5 9 3.3 ： 1 5 11 35 2 1 5 -2 -2 -1 1:1 2 4 14 1 0 2 -3 -2 -3 *未添加佐劑 -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1239848 A7 B7 五、發明説明（30 ) 實例4 抗-A沒1-42 IgG終點總效價及次群效價倒數雜交Swiss-Webster老鼠分組，每組10隻老鼠。每組接種 30微克A/31-42肽，其相對於APP内部42個胺基酸長度區域。第一組未接種佐劑，第二組接種含有2.5%油之50微克 529 SE ;第三組接種含有2.5%油加上10微克GM-CSF之50 微克529 SE ;第四組接種10微克GM-CSF ;第五組接種含有 1.25%油之SE ;第六組接種含有1.25%油加上10微克GM-CSF之SE ;第七組接種接種50微克QS-21。以皮下注射臀部方式免疫老鼠，總體積0.2毫升，等量注射在尾部/臀部基部的兩邊，於第0及3週進行.免疫作用。第0、20、35及70天取出老鼠血液，分析個別老鼠的血清。在第5週及第10週時，從個別老鼠血清（n=10 Swiss-Webster)中測定終點抗-AyS 1-42肽IgG終點總效價及次群效價倒數。IgG終點結果示於表3(第5週）及表4(第10週）。 IgGl次群效價結果示於表5(第5週；未測定未接種佐劑或 QS-21之組別）及表6(第10週）。IgG2a次群效價結果示於表7 (第5週；未測定未接種佐劑或QS-21之組別）及表8(第10 週）〇 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表3 第5週抗 •A冷1-42的IgG終點效價佐劑均值標準誤差無 12,976 +/-14,386 529 SE(50) 16,204 +Λ 225,221 529 SE(50)+GM-CSF(10) 608,474 +/- 623,575 GM-CSF(IO) 214,497 +A 609,067 SE(1%) 33,342 +Λ 15,493 SE(1%)+GM-CSF(10) 453,367 +/- 162,750 QS-21(50) 4,076 +/-9,036 表4 第10週抗 -Αβ 1-42的IgG終點效價佐劑幾何平均值標準誤差無 21,426 +/- 24,959 529 SE(50) 86,847 +/- 187,792 529 SE(50)+GM-CSF(10) 943,075 +/- 989,177 GM-CSF(IO) 1,049,414 +/- 390,525 SE(1%) 255,631 +/-114,025 SE(1%)+GM-CSF(10) 1,005,899 +/- 407,108 QS-21(50) 47,222 +/- 159,775 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1239848 A7 B7 五、發明説明（32 ) 表5 第5週抗 -A/? 1-42的IgGl終點效價佐劑幾何平均值標準誤差 529 SE(50) 461 +/-627 529 SE(50)+GM-CSF(10) 1,936 +/- 12,680 GM-CSF(IO) 8,654 +/- 10，100 SE(1%) 4,515 +/-6,273 SE(1%)+GM-CSF(10) 24,422 +/-19,764 表6 10週抗-A/5 1-42.第的IgGl終點效價佐劑幾何平均值標準誤差無 2,086 +/-2,448 529 SE(50) 969 +/- 521 529 SE(50)+GM-CSF(10) 2,076 +/-4,901 GM-CSF(IO) 8,483 +/- 10,998 SE(1%) 3,623 +/- 3,456 SE(1%)+GM-CSF(10) 12,472 +/- 11,502 QS-21(50) 988 +/- 895 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（33 ) 表7 第5週抗- AyS 1-42的IgG2a終點效價佐劑幾何平均值標準誤差 529 SE(50) 2,224 +/-10,099 529 SE(50)+GM-CSF(10) 94,764 +/- 849,173 GM-CSF(IO) 25,554 +/-13,191 SE(1%) 1,484 +/- 2,271 SE(1%)+GM-CSF(10) 8,405 +/-31,303 表8 第10週抗 -A/5 1-42的IgG2a終點效價佐劑幾何平均值標準誤差無 5,910 +/- 39,626 529 SE(50) 5,944 +/-9,100 529 SE(50)+GM-CSF(10) 47,694 +/- 88,053 GM-CSF(IO) 64,910 +/- 54,824 SE(1%) 2,350 +/- 2,326 SE(1%)+GM-CSF(10) 7,421 +/- 31,153 S-21(50) 3,544 +/- 26,332 實例5 不同GM-CSF含量之抗-AyS 1-42終點總效價及次群效價倒氣雜交Swiss-Webster老鼠分組，每組10隻老鼠。在第0週及 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（34 ) 第3週時，每組接種30微克A冷1-42肽。第一組25微克529 SE加上GM-CSF ;第二組接種25微克529 SE加上1微克GM-CSF;第三組接種25微克529 SE加上0.1微克GM-CSF;第四組第一劑接種25微克529 SE加上10微克GM-CSF，而後第二劑只接種25微克529 SE ;第五組接種25微克QS-21 ;第六組接種25微克QS-21加上1〇微克GM-CSF。以皮下注射臀部方式免疫老鼠，總體積0.2毫升，等量注射在尾部/臀部基部的兩邊。第0、21及42天取出老鼠血液。在第6週時，從個別老鼠血清（n=10 )中測定抗-AyS 1-42肽IgG群及次群終點效價倒數。IgG終點結果示於表9，IgGl次群效價結果示於表1〇， IgG2a次群效價結果示於表11。表9 第6週抗-A/3 1-42的IgG終點效價佐劑_^可平均值標準誤差 529(25) + GM-CSF(IO) 529(25) + GM-CSF(l) 529(25) + GM-CSF(O.l) 529 SE(25)* QS-21(25) QS-21(25) + GM-CSF * 第一劑 529 SE(25) 353,660 +/- 148,940 150,935 +/- 218,332 86,145 +Λ 91,724 25,365 +/- 54,083 1,866 +/- 18,430 48,970 +/- 116,106 GM-CSF(IO);第二劑只有 529 SE(25) -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表10 第6週抗 -A冷1-42的IgG終點效價佐劑平均值標準誤差 529 SE(25) + GM-CSF(IO) 10,867 +/- 18,333 529 SE(25) + GM-CSF(l) 24,909 +/- 18,625 529 SE(25) + GM-CSF(O.l) 6,608 +/- 17,736 529 SE(25)* 4,511 +/- 8,154 QS-21(25) 581 +/- 126 QS-21(25) + GM-CSF(IO) 7,618 +/-29,145 * 第一劑 529 SE(25) + GM-CSF(IO)；第二劑只有529 SE(25) 表11 第6週抗％八泠1-42的IgG2a終點效價佐劑幾何平均值標準誤差 529 SE(25) + GM-CSF(IO) 243,758 +/- 354,383 529 SE(25) + GM-CSF(l) 116,222 +/- 143,140 529 SE(25) + GM-CSF(O.l) 98,018 +/- 391,797 529 SE(25)* 16,018 +/- 165,298 QS-21(25) 未測 +/- 未測 QS-21(25) + GM-CSF(IO) 30,133 +/- 134,774 * 第一劑 529 SE(25) + GM-CSF(IO)；第二劑只有529 SE(25) 實例6 不.同GM- CSF含量之抗-A /5 1- 42終點總效價及次群效價倒 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（36 ) 數雜交Swiss-Webster老鼠分組，每組10隻老鼠。在第〇週及第3週時，每組每次接種30微克A)S 1-42肽。第0週進行免疫作用時，第一組接種50微克529 SE ;第二組接種50微克529 SE加上10微克GM-CSF ;第三組接種50微克529 SE加上5微克GM-CSF ;第四組接種50微克529 SE加上2微克GM-CSF :第五組接種50微克529 SE加上0.5微克GM-CSF ;第六組接種1%SE。第3週進行免疫作用時，第一至第五組接種的與第0週進行免疫作用接種者是相同劑量，除了 529 SE劑量從50微克減少至25微克。接種SE的第六組在第〇週係以進行免疫作用，在第3週進行免疫作用時則增加至1.2%。接種以皮下注射臀部方式免疫老鼠，總體積〇·2毫升，等量注射在尾部/臀部基部的雨邊。第2、20及35天取出老鼠血液。在第5週時，從個別老鼠血清（η == 10)中測定抗-A /5 1 - 42肽IgG群及次群終點效價倒數。IgG終點結果示於表12，IgGl次群效價結果示於表13， IgG2a次群效價結果示於表14。 -39 - 本纸張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（37 ) 表12 第5週抗 -Ay? 1-42的IgG終點效價佐劑幾何平均值標準誤差 529 SE(50) 6,119 +/-3,103 529(50) + GM-CSF(IO) 52,312 +/- 78,421 529(50) + GM-CSF(5) 16,392 +/-17,706 529(50) + GM-CSF(2) 321,524 +/-224,875 529 SE(25) + GM-CSF(0.5) 36,934 +/- 29,449 SE (1%) 7,784 +/-9,041 表13 第5週抗- AyS 1-42的IgGl終點效價佐劑幾何平均值標準誤差 529 SE(50) 499 +/-676 529 SE(50) + GM-CSF(IO) 1,424 +/- 2,468 529 SE(50) + GM-CSF(5) 3,407 +/-5,653 529 SE(50) + GM-CSF(2) 18,328 +/- 8,067 529 SE(50) + GM-CSF(0.5) 3,526 +/-17,606 SE (1%) 2,556 +/-5,615 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（38 ) 表14 第5週抗-八泠1-42的IgG2a終點效價佐劑均值標準誤差 529 SE(50) 1,386 +/- 5,173 529 SE(50) + GM-CSF(IO) 48,519 +/- 148,981 529 SE(50) + GM-CSF(5) 11,659 +/- 23,132 529 SE(50) + GM-CSF(2) 124,815 +A 167,340 529 SE(25) + GM-CSF(0.5) 26,190 +/- 40,254 SE (1%) 694 +A 1,325 實例7

ThU及C—4- V3月夫务‘痛'应河猴下列實驗設計係直接在靈長類（恆河猴）中比較一些肽及佐劑組合物，以鑑別具有性肽/佐劑組合物移至人體臨床試驗的可能性。明確言之，比較529 SE與人類GM- CSF之佐劑調配物與不完全伏氏佐劑（IFA)與（Uwv env•衍生輔細胞/SIV gag CTL肽共軛物（STl-pllC)(序列如下）組合，

Arg Gin lie lie Asn Thr Trp His Lys Val Gly

Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr

Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO ： 3)；或與（2)HIV-1衍生C4-V3肽共軛物（C4-V389.6P)(序列如下）組合。

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly

Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 x 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（39

Thr Arg Glu Leu Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO : 4)。研究設計：研究共使用八隻動物，如表15所示，有4隻 Mamu-A*01 +及 4 隻 Mamu-A*01-。表15 529 SE及GM-CSF與IFA的比較

組別 #動物動物免疫組合物佐劑 1 2 Mamu-A01+ 95X009 STl-pllC IFA 93X021 2 2 Mamu-A01+ 98N002 STl-pllC 529 SE/GM-CSF 98N008 3 2 Mamu-A01- 98N007 C4-V389.6P IFA 98N013 4 2 Mamu-A01- 95X011 C4-V389.6p 529 SE/GM-CSF 96X004 第1組動物接種含有0.5毫升Th-CTL肽STl-pllC(1.0毫克/ 毫升）之水溶油乳化液，及〇·5毫升IFA，總體積為1.0毫升。第2組動物接種〇·5毫升ST1-pllc(1.0毫克/毫升），其與250 微克人類GM-CSF、50微克含最終油濃度為1%之529 SE組合’最終體積為1·〇毫升。第3組動物接種〇.5毫升C4-V389.6p 肽（2.0¾克/亳升）之水溶油乳化液，及〇·5毫升IFA，最終體積為1.0毫升。最後第4組動物接種〇·5毫升€4-¥389.6!5肽（2.0 -42 - 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（40 ) 毫克/毫升），其與250微克人類GM-CSF、50微克含最終油濃度為1%之529 SE組合，最終體積為1.0毫升。所有的動物係以肌肉内注射方式分別在0、4及8週時進行免疫作用，在每次進行免疫作用之前及進行免疫作用1或2 週後取出動物週邊血液，利用四體染色法監測CTL謗發作用，pllC(Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met ; SEQ ID NO : 3，胺基酸19-27) -專一性ELISPOT反應及大宗組織 CTL反應（第1組及第2組）與肽專一性抗體反應（第1-4組）。安全性及耐受性 STl-pllC + IFA :第1組動物以肌肉内注射方式在單一位置處接種三次STl-pllC + IFA調配物後，注射位置會產生明顯的反應。其中一隻動物（93X021)在第二次免疫作用2週後，在注射位置處產生了大小1.5公分的膿腫，另一隻動物 (95X009)在第三次免疫作用後2週，亦在注射位置處產生了大小2.0公分的膿腫，且破皮，需要包紮傷口。 STl'pllC + 529 SE/GM-CSF ••第2組動物以肌肉内注射方式在單一位置處接種三次STl-pllC + 529 SE/GM-CSF 後，注射位置只有輕微的副作用產生。第2組的兩隻動物於第8週接種第三次免疫作用後，有短暫的嘔吐現象，沒有發現其他的副作用。 C4-V_389.6p + IFA :第3組動物以肌肉内注射方式在單一位置處接種三次C4-V389.6P + IFA調配物後，注射位置會產生明顯的反應。其中一隻動物（98n013)在第二次免疫作用1週後’在注射位置處產生大小1 .〇公分的膿腫，另一隻動物 -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（41 ) (98n007)在第二次免疫作用後1週，亦在注射位置處產生了大小1·5公分的膿腫，此動物的膿腫需要排膿，且包紮四周之久。 C4-V3«9.6p + 529 SE/GM-CSF :第4組動物以肌肉内注射方式在單一位置處接種三次C4-V389.6P + 529 SE/GM-CSF 後，注射位置只有輕微的副作用產生。第4組其中一隻動物 (95X011)於第8週接種第三次免疫作用後，有短暫的嘔吐現象，沒有發現其他的副作用。第1組及第3組中的所有動物均係以IFA為佐劑，而在注射位置處均有明顯反應產生。這些結果顯示以肌肉内注射方式在單一位置處注射而言，0.5毫升的IFA是較差耐受性，值得注意的是，4隻動物中有3隻動物於第8週接種529 SE/GM-CSF佐劑後，會在免疫作用後發生短暫的嘔吐現象，而已知使用麻醉劑（k它命）時，亦與嘔吐有關。在研究的過程中尚無其他動物唱吐例子報導。此時，無明顯的證據顯示動物的嘔吐與529 SE/GM-CSF之副作用有關。結果：諸發細胞免疫反應（第1組及第2組）新鮮血液pllC-四體染色:進行免疫作用之前，及進行免疫作用1及2週後，自所有的Mamu- A* 01陽性動物（第1組及第2組）中分離出新鮮週邊血液，利用可溶性MHC第I群四體染色法篩選pllC-專一性CD3+CD8 + T淋巴球的存在。如表16所示，只有其中一隻接種STl-pllC肽及IFA組合之動物（93X021)的未刺激週邊血液中，顯示有免疫作用誘發細胞免疫反應。 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1239848 五、發明説明（42 表16 新鮮週邊血液中pllC-四體染色及P11C-專一性ELISPOT反應百分比第〇週免疫作用之前第5週第2次免疫作用後1週第6週第2次免疫作用後2週動物组別調配物新鮮血液四體 ELISPOT 染色a #SFC每106細胞新鮮血液 ELISPOT 四體染色#SFC每106細胞新鲜血液四體染色 ELISPOT #SFC每106細胞. 95X009(1) STl-pllC + IFA 0.02 0.0 0.00 0.0 0.00 3.8 93X021(1) STl-pllC + IFA 0.02 Ndb 0.15 56.3 0.12 21.9 98n002(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF 0.00 0.6 0.05 0.0 0.01 6.3 98n008(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF 0.05 0.0 第8週 0.04 15.0 第9週 0.01 9.4 第10週第2次免疫作用後4週第Ρ次免疫作用，後1週第3次免疫作用後2週動物組別調配物新鮮血液 ELISPOT 新鮮血液 ELISPOT 新鮮血液 ELISPOT 95X009(1) STl-pllC + IFA 0.00 Nd .0.01 2.5 0.02 1.9 93X021(1) STl-pllC + IFA 0.02 Nd 0.14 Nd 0.02 Nd 98n002(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF 0.06 Nd 0.00 Nd 0.00 3.8 98n008(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF 0.02 Nd 0.02 Nd 0.00 0.0 &用？110四體染色為新鮮血液〇03+€08+淋巴球染色’陽性的百分比；ND，未測^ · b Nd=沒有數據（此表格及以後的表格） 45 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（43 ) pllC-鼻一性ELISPOT反應：為進一步評估第1組及第2組動物細胞免疫反應的謗發作用，利用ELISPOT分析法篩選新鮮分離週邊血液淋巴球是否存在pllC-專性CD3+CD8+ T 淋巴球。如表16所示，只有經以新鮮血液四體分析顯示具有可測含量pllC-專一性CD8+淋巴球的動物93X021以 ELISPOT檢測才具有可測性pllC-專一性T淋巴球。在每一個例子中，pi 1C-四體分析的陽性反應與陽性pi 1C-專一性 ELISPOT反應相互確認。活體外肽Pile刺激作用後的pile-專一性細胞务疬及龐：分析之前，為增加pile-專一性細胞的數目，用肽pile及 rhIL-2在活體外刺激新鮮分離週邊血液淋巴球，14天後，以標準鉻釋放CTL分析法篩選所得pllC-四體鍵結之效應細胞及功能性pi 1C-專一性溶解活性。pi 1C四體分析及功能 CTL分析的結果示於表17中。動物93X021在第二次免疫作用後1週，（其在新鮮分離淋巴球中一直顯示有pi 1C-專一性免疫反應）顯示具有非常高含量的四體鍵結及功能CTL活性，此表示可以誘發高效價的p 11C-專一性免疫反應。與新鮮分離淋巴球結果相異的是，第2組的一隻動物（98η008， STl-pllC + 529 SE/GM-CSF)在第二次免疫作用後2週，開始有p 11C-專一性細胞免疫反應，然而，第2組動物所見的 pi 1C-專一性免疫反應明顯低於第1組動物相對所見者。 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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•線 1239848 A7 B7 五、發明説明（44 表17 活體外肽pi 1C刺激作用後pi 1C-四體染色及功能pile-專一性CTL反應百分比第0週第5週第6週免疫作用之前第2次免疫作用第2次免疫作用後1週後2週動物组別調配物四體染色3 CTL 四體染色 CTL 四體染色 CTL 20 ： 1 E ： T6 20 ： 1 Ε ： Τ 20 ： 1E 95X009(1) STl-pllC + IFA 0.03 0.6 0.23 Nd 0.27 0.0 93X021(1) STl-pllC 0.03 0.0 34.31 66.3 15.15 4.69 + IFA 98n002(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF 0.21 0.0 Nd Nd 0.73 Nd 98n008(2) STl-pllC 0.16 0.0 Nd Nd 5.84 . Nd + 529SE/ GM-CSF 第8週第9週第10週第2次免疫作用第3次免疫作用第3次免疫作用後4週後1週後2週動物組別調配物四體染色 CTL 20 : IE : T6 四體染色 CTL 20 ： 1 E ： T 四體染色 CTL 20 ： IE 95X009(1) STl-pllC + IFA Nd Nd 0.76 3.0 0.72 0.0 93X021(1) STl-pllC + IFA Nd Nd 4.90 7.3 Nd Nd 98n002(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF Nd Nd 0.07 5.7 0.39 0.0 98n008(2) STl-pllC + 529SE/ GM-CSF Nd Nd 2.24 11.4 5.00 0.0 裝訂 a用口11(：-四體染色為€03+€08+培養細胞陽性的百分比。 b效應細胞與標的細胞比例（E ·· T)為20 : 1時所測之pllC· 專一性分析（減去背景值）百分比。 47 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1239848 A7 B7 五、發明説明（45 )

•線細胞内細胞素分析:為進一步定出免疫原-誘發肽pllC-專一性淋巴球的功能及外觀特性，監測Thl型細胞素…？-r、TNF a、IL-2及Th2型細胞素IL-4在細胞内表現。以10 # Μ肽pi 1C及rhIL-2於活體外刺激週邊血液淋巴球，以監測細胞内細胞素表現，而後培養細胞以40單位IL- 2維持14 天。兩週之後，培養細胞只以培養液刺激，或以10 # Μ肽 pllC +抗-人類CD28及抗-人類CD49d刺激1小時，1小時後，再用布瑞非丁 A(Brefeldin A)處理細胞5小時，讓細胞内細胞素濃縮在内質網。而後用流動細胞學定量出細胞内細胞素表現（表18及19)。如表18所示，活體外肽ρ 11C刺激2週後，收集第1組動物 93X021(STl-pllC + IFA)的CD3+週邊血液淋巴球，其顯示 Thl型細胞素表現低含量，所有的細胞活性分泌INF- 7、丁\?0或11^2低於1.5%。經過活體外卩11(：刺激作用後，約 8%所有的CD3+淋巴球可分泌Th2型細胞素IL-4，而IL-4分泌細胞發現侷限於CD3+ CD4+淋巴球次群。在經過簡短暴露於肽pllC後，pllC-四體+及CD3+CD8+淋巴球次群可分泌 Thl型細胞素INF- r及TNFa，但不能明顯誘發分泌IL-2。經過肽pllC再暴露後，Th2型細胞素IL-4的分泌未受影響。 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（46 ) 表18 第1組動物93X021第二次免疫作用2週後的細胞内細胞素分析淋巴球次群培養液 INF-r aS.I 培養液 TNFa pllC pllC S.I. bPllC-四體+ 977 27,612 28.3 90 20,342 226.0 b大宗CD3+ 7,628 65,567 8.6 12,256 51,361 4.2 bCD3+CD4+ 2,488 5,545 2.2 6,252 2,827 0.4 bCD3+CD8+ 5,273 60,573 11.5 6,865 48,439 7.1 培養液 IL-2 S.I 培養液 IL-4 S.I. pllC pllC bPllC-四體+ 751 2,004 2.7 Nd Nd Nd b大宗CD3+ 2,879 6,463 2.2 78,069 90,563 1.2 bCD3+CD4+ 1,377 1,683 1.2 71,275 81,473 1.1 bCD3+CD8+ 1,502 4,783 3.2 6,794 9,126 1.3 表19 第2組動杨98n008第三次免疫作用1週後的細胞内細胞素分析淋巴球次群培養液 INF- γ aS.I 培養液 TNF a S.I. pllC pllC bPllC-四體+ 545 560 1.0 748 454 0.0 b大宗CD3+ 6,829 10,489 1.5 3,402 13,443 4.0 bCD3+CD4+ 3?31〇 3,789 1.1 1,428 2,567 1.8 bCD3+CD8+ 3,189 6,825 2.1 2,587 11,324 4.4 -49 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（47 培養液 IL-2 PllC S.I 培養液 IL-4 pllC S.I. bPllC-四體+ 77 456 5.9 Nd Nd Nd b大宗CD3+ 385 2,868 7.4 219,789 202,122 0.9 bCD3+CD4+ 1,379 1,761 1.3 170,804 158,175 0.9 bCD3+CD8+ 36 2,095 58.2 49,053 44,083 0.9 a S. I..，刺激指數。 b 每106 CD3+細胞所示細胞素染色陽性細胞減去背景值 (同型控制組）染色者的數目。如表19所示，經活體外肽pllC刺激作用2週後，第2組動物 98n008(STl-pllC + 529 SE/GM-CSF)之 CD3+週邊血液淋巴球的Thl型細胞素表現含量低，所有的細胞活性分泌 INF- r、TNF α或IL-2均低於1·0%。有趣的是，約有20% 之CD3+淋巴球可活性分泌Th2型細胞素IL-4，IL-4生產細胞的數目比第1組動物的數目增加2.5倍。如第1組動物例子，IL-4分泌細胞發現侷限於CD3+CD4+淋巴球次群。經過簡短再暴露肽pllC，第2組動物之？11<3-四體+及€〇3+0〇8 + 淋巴球次群可刺激分泌TNF α，而非INF- r。與第1組動物相反的是，經過肽再暴露後，CD3+CD8+細胞IL-2表現明顯增加，如第1組動物例子，經過肽pllC再暴露後，Th2型細胞素IL- 4的分泌未改變。結果：免疫原-誘發體液免疫反應（第1組及第2組）為評估免疫原-專一性體液抗體反應的誘發作用，在免疫 -50 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（48 ) 作用之前及接種第二次及第三次免疫作用1及2週後，測定第1組及第2組動物血清中抗- ST1-pi 1C ELIS A抗體效價，結果示於表20。表20 ST1-pi 1C免疫恆河猴（第1組及第2組）後血清中之ELIS A終點效價動物組別調配物週數 STl-pllC抗體效價 95X009 1 STl-pllC + 5 12,800 IFA 6 12,800 9 6,400 10 12,800 93X021 1 STl-pllC + 5 51,200 IFA 6 102,400 9 51,200 10 51,200 98X002 2 STl-pllC + 5 <50 529SE/GM- 6 <50 CSF 9 1,600 10 <50 98n008 2 STl-pllC + 5 200 529SE/GM- 6 200 - CSF 9 12,800 10 6,400

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.線

a 抗體終點鍵結效價係測定實驗組/控制組（E/C)OD讀值 >3.0時，最高稀釋血漿倒數。免疫原誘發體液免疫反應（第3組及第4組）：

為評估免疫原-專一性及佐劑-專一性體液抗體反應，在免疫作用之前及接種第二次及第三次免疫作用1及2週後，測定第3組及第4組動物血漿中抗- C4-V389.6P及抗-GM-CSF -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（49 ) ELISA抗體效價’結果不於表21。結果顯不所有測試動物在接種第二次免疫1週後，血漿中C4-V389.6P抗體效價達到最高，第3組最高血漿抗體效價（C4-V389.6P + IFA)較第4組 (C4-V389.6p + 529 SE/GM-CSF)所得之最高血漿抗體效價高出數次方，第4組動物在第三次免疫作用1週後，抗-GM-CSF抗體效價達到高峰，但含量低，可偵測到。表21 C4- V389.6P免疫恒河猴（第3組及第4組）後血漿中之ELIS A終點效價動物組別調配物週數 C4-V3抗體效價3 抗-人類GM-CSF抗體 98n007(3) C4-V389.6P + IFA 5 102,400 <10 6 25,600 <10 9 25,600 <10 10 25,600 <10 98n013(3) C4-V389.6P + IFA 5 12,800 <10 6 6,400 <10 9 12,800 10 10 12,800 <10 96X004(4) C4-V389.6P + 5 6,400 320 529SE/GM-CSF 6 1,600 160 9 3,200 2,560 10 1,600 1,280 95X011(4) C4-V3s9.6p + 5 1,600 160 529SE/GM-CSF 6 800 80 9 1,600 1,280 10 1,600 1,280 a抗體終點鍵結效價係測定實驗組/控制組（E/C) 0D讀值 >3.0時，最高稀釋血漿倒數。亦監測第3組及第4組動物誘發中和抗體；該結果摘要於 -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（50 ) 表22。結果顯示第3組及第4組動物會產生中和抗體’其能夠於活體外中和SHIV89.6病毒，而第3組的SHIV89.6中和抗體效價一般較第4組動物高。除此之外，最後免疫作用後’第 3組動物血清顯示具有低含量抗SHIVs9.6p病毒株（其難以中和）之中和活性。表22

C4-V389.6P免疫恆河猴（第3組及第4組）後血清終點中和抗體效價動物組別調配物週數 shiv896 SHIV896p 98n007(3) C4-V389.6P + 0 <10 <10 IFA 5 22 <10 6 46 <10 9 113 46 10 74 71 98n013(3) C4-V389.6P + 0 <10 <10 IFA 5 12 <10 6 19 <10 9 36 18 10 22 <10 96X004(4) C4-V389.6p + 0 <10 <10 529SE/GM- 5 <10 <10 CSF 6 <10 <10 9 26 <10 10 <10 <10 95X011(4) C4-V3g9.6p + 0 <10 <10 529SE/GM- 5 11 <10 CSF 6 <10 <10 9 19 <10 10 <10 <10 裝訂

-53 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 _ B7 ___；_ 五、發明説明（51 ) a是50%細胞免於被病毒誘發殺死時（測定中性紅吸收）血清稀釋的倒數。實例& 以A汐1-42及佐劑虛理PDAPP轉植走直治癌^,果研究下列實驗係用以比較PDAPP轉植老鼠投用一些佐劑組合調配物後，測試Ay5 1-42肽的治療效果。研究設計:40隻十個半月至十二個半月大的PDAPP轉植老鼠（雄性及雌性）分成4組，每組分類盡可能年齡、性別及轉植親代相近。組別如表23所示：表23 轉植老鼠處理組別組別佐劑劑量 A M2劑量 N at start N at end 1 MPLSE 25微克 75/60微克 40 35 2 MPLSE+GM-CSF 25微克/10微克 64/60微克 41 34 3 529+GM-CSF 25微克/10微克 64/60微克 40 31 4 PBS na na 40 37 A冷1-42肽購自Elan藥學公司，529 SE及MPLtm購自 Corixa，而老鼠GM- CSF則購自Biosource。所有的老鼠在第〇、2、4、8、12、16、20及24週時注射接種，注射後5-7天取血，開始第二次注射。第1、2及3組皮下注射200微升，而第4組則注射接種250微升，研究的第25週殺死動物，產 -54 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 A7 B7 五、發明説明（52 生50%最高光學密度讀值得稀釋度計算出效價。結果免疫性及抗體反應：所有的動物之A/S 1-42肽抗體最高幾何平均效價（GMT)發生在第二（RC529 + GM-CSF)或第三次取血（MPL丁MSE、MPLtmSE + GM-CSF)(參考圖 1)。在最高 GMT時，MPLtm SE +GM-CSF為 16,400，而 529 SE + GM轉 CSF為13,400或約為MPLtm SE控制組9,700的1.5倍。然而，含有GM-CSF之兩個調配物中（第2組及第3組）會回落至約 MPLtm SE控制組的含量，MPLtm SE的最終GMTs= 4600， MPLtm SE + GM-CSF=5350，529 SE + GM-CSF=4650。為測定兩個含有GM- CSF調配物最終效價的降低是否是因為抗-GM-CSF抗體反應的原因，利用ELISA測定是否在免疫作用的過程中形成抗- GM-CSF抗體。接種GM-CSF的所有動物血清測定對本實驗所用老鼠GM- CSF的效價，在任何處理的動物中並未發現抗· GM- CSF抗體的存在（數據未列）。腦人>3含哥:所有三組PDAPP處理動物腦部皮質區域之總 A/3肽（圖2-個別結果；表24-混合結果）及1-42(圖3-個別結果；表25-混合結果）累積含量明顯降低。利用前已揭示（54)的胍可溶性腦均質物進行A冷ELIS As(總量及1 - 42型式）’利用Mann-Whitney測試統計比較的意義。 -55 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 裝訂

.線 1239848 A7 B7 五、發明説明（53 ) PBS 表24 皮質總A 含量 MPL SE MPL SE + GM-CSF 529 SE + GM-CSF 平均值 6,478 1,707 925 1,313 (毫微克/克）範圍 64-17,208 33-8,501 67-5,293 79-5,271 %減少量 74 86 80 P 值(M-W) — <0.0001 <0.0001 <0.0001 N 37 35 34 31 表25 皮質AyS 1-42含量 PBS MPLSE MPL SE + 529 SE + GM-CSF GM-CSF 平均值 5,609 1,799 779 1,127 (毫微克/克）範圍 284-14,004 10-6,715 43-4,824 29-4,442 %減少量 —- 68 86 80 P 值(M-W) ·— <0.0001 <0.0001 <0.0001 N 36 35 34 31 澱粉狀蛋白負荷：利用前所揭示免疫組織化學方法（55) 定量出前皮質中澱粉狀蛋白生成症的程度。所有三組處理動物顯示澱粉狀蛋白負荷明顯降低（圖4-個別結果；表26- 混合結果）〇 -56 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐)

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'線 1239848 A7 B7 五、發明説明（ 54 ) 表26 前皮質澱粉狀蛋白負荷 PBS MPL SE MPL SE +GM-CSF 529 SE + GM-CSF 平均值(％AB) 7.98 0.49 0.00 0.04 範圍 0.00-27.37 0.00-9.63 0.00-.83 0.00-5.53 %減少量 94 100 99.5 P 值(M-W) <0.0001 <0.0001 <0.0001 N 29 33 29 30 神經負荷 :利用前已揭示.的免疫組織化學方法（5 5)評估處理動物於前皮質神經失調效應。與PBS控制組比較，所有的三組動物在神經負荷程度明顯的降低（圖5-個別結果；表27-混合結果）。表27 前皮質神經負荷 PBS MPLSE MPL SE +GM-CSF 529 SE + GM-CSF 平均值(％NB) 0.35 0.14 0.04 0.02 範圍 0.00-1.21 0.00-0.82 0.00-0.60 0.00-0.91 %減少量 60 88 95 P 值(M-W) 0.0153 <0.0001 <0.0001 N 29 33 29 30 -57 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1239848 A7 B7 五、發明説明（55 ) 星形細胞增多症：利用前已揭示方法（55)定量膨大後部皮質中星形細胞增多症的程度。以GM- CSF處理的組別之星形細胞增多症明顯降低（圖6)。 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1239848 A7 B7 五、發明説明（56 ) 參考文獻 1· Mosmann, T.R., et al·, J·工mmunol·, 136, 2348-2357 (1986). 2. U.S. Patent Number 5,057,540 3. U.S. Patent Number 6,113,918· 4· Ahlers, J.D·, et al·, J· Immunol·, 158, 3947-3958 (1997). 5. Scharton-Kersten, T·, et al·, J· 工mmunol. 154, 5320-5330 (1995)· Ghalib, H.W·, et al·, J· Immunol., 154, 4623-4629 (1995). 7· Murray, H.W·, and Hariprashad, J. Exp. Med·, 181, 387-391 (1995). 8. U.S. Patent Number 5,571,515. U.S· Patent Number 5,723,127. U.S. Patent Number 5,976,539. Finkelman, F.D., and Holmes, J., j 8, 303-333 (1990). 9.10. 11- Rev. Iinnrunol. J. 12· Snapper, C.M·, et al·, J· Exp. Med·, 175, 1367-1371 (1992). 13. Kobayashi, M·, et al·, J· Exp· Med·· 170, 827-845 (1989). 14. Published International Patent Application Number WO 90/05147· 15· U.S. Patent Number 5,078,996. 16· O.S. Patent Number 5,229,496· 17· U.S· Patent Number 5,073,627 · 18· Alderson, M.R., et al·, J. Exp· Med·, 669-674 (1993). 19 . Snapper, C.M., et al«, J·工imminol·, _ 5842-5850 (1995). 20· U.S. Patent Number 5,679,356. 21· Pxiblished International Patent Application Number 22. 178』 154, WO 00/69456. U.S. Patent Number 5,013,548. 59 - :尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱） 1239848 A7 B7 五、發明説明（57 ) 一 23. U.S. Patent Number 5,019,387· 24. Charbit, A·, et al·, Vaccine, 11, 1221- 1228 (1993). 25. Natuk, R.J., et al. ,AIDS Res. Hum. Retroviruses # 9, 395-404 (1993). 26. Johnson, R.P·, et al·， J· Virol” 68, 3145-3153 (1994). 27. Fuller# D.H., et al·， AIDS Res· Hum. Retroviruses/ 10, 1433-1441 (1994) • 28. Berzofsky, J«A., et al., J. Clin. Invest·, 88, 876-884 (1991). 29. Palker# T.J., et al J. Immunol·, 142, 3612-3619 (1989). 30. Hart, Μ·Κ·, et al·. J. Immunol·, 145, 2677-2685 (1990). 31. Haynes# B.F., et al ·, J.工irammol·, 151, 1646-1653 (1993)· 32. Hart, M.K., et al·, Proc. Natl· Acad· Sci·, USA, 88, 9448-9452 (1991). 33. Bartlett, J.A·, et'al·, AIDS, 12, 1291- 1300 (1998). 34. Haynes# B.F·, et al ·, AIDS Res· Hum· Retroviruses f 11# 211-221 (1998). 35. U.S. Patent Number 5,861,243. 36. U.S. Patent Number 5,932,218. 37· U.S. Patent Number 5,939,074. 38· U.S· Patent Number 5,993,819. 39. U.S. Patent Number 6,037,135. 40. Published European Patent Application Number 671,947 • 41. D*S· Patent Nxamber 6#024r965. 42. Miller, M.D·, et al ·, J. Immunol., 147, 320-329 (1991) • . 43. Kuroda, M.J., et al • / J · Ei^cp 4 Med · / X 8 7 / 1373-1381 (1998). -60 - 本纸張尺Jl適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

1239848 A7 B7 五、發明説明（58 44· Liao, H-X, et al·, J· Virol·, 74, 254· 263 (2000). 45« Staats, H.F·, et al·, J· Iimminol·, 157, 462-472 (1996). 46· Porgador, A·, et al·, J· Immunol,, 158, 834-841 (1997). 47· Published 工nternational Patent Application Number WO 99/27944. 48. U.S. Patent Number 4,666,829. 49. Games/ D·, et al·. Nature, 373, 523-527 (1995)· 50· Published International Patent Application Number WO 98/20734. 51· U,S. Patent Number 5,830,877. 裝 52· Published, International Patent Application Number WO 99/51259. 53· U.S. Patent Number 5,593,972· 54. Johnson-Wood, D·, et al., Proc· Natl· Acad· Sci” PSA, ££, 1550-1555 (1997). 訂 55. Schenk, D·, et alw Nature, 400, 173-177 (1999)· .線 -61 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims

1239848 第090127895號專利申請案中文申請專利範圍替換本(93年12月） A8 B8 C8 D8 年，申請專利範圍 1 · 一種抗原組合物，其包括源自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，或源自癌細胞或腫瘤細胞，或源自過敏原，或源自自體分子之選定抗原，及有效佐劑含量之（U胺基火元基匍萄糖胺鱗酸化合物（AGP) ’或其衍生物或類似物，及（2)選自顆粒細胞巨嗜細胞群落刺激因子（GM-C SF)及細胞間素-12(IL-12)所組成之群之細胞素或淋巴素之組合。 2 ·根據申請專利範圍第1項之抗原組合物源自蛋白質的聚肽、肽或片段。 3·根據申請專利範圍第丨項之抗原組合物穩定水包油乳化液型式。 4 ·根據申請專利範圍第1項之抗原組合物劑或載劑。 5·根據申請專利範圍第4項之抗原組合物穩定水包油乳化液型式。 6·根據申請專利範圍第1項之抗原組合物，其中agp為2-[(R)-3-四癸醯基氧四癸醯基胺基]乙基2-去氧磷酸基-3-〇-[(r)-3_四癸醯基氧四癸醯基卜^以幻-弘四癸醯基氧四癸醯基胺基卜冷-D-吡喃葡萄糖甞（529)。 7·根據申請專利範圍第1項之抗原組合物，其中選定抗原源自人類免疫不全病毒（HIV)。 8·根據申請專利範圍第7項之抗原組合物原為HIV蛋白質或源自該蛋白質之聚肽 9·根據申請專利範圍第8項之抗原組合物其中選定抗原為其中所用AGP為其另外包含稀釋其中所用AGP為其中選定HIV抗肽或片段。其中選定抗原為本紙張尺度翻準(CNS) Μ規格 8 8 8 8 ABCD 1239848 六、申請專利範圍 HIV肽，其選自具有下列胺基酸序列所組成之群之肽： Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO : 1); Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys ( SEQ ID NO : 2); Arg Gin lie lie Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO : 3);及 Lys Gin He lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO : 4) o 10·根據申請專利範圍第9項之抗原組合物，其中HIV肽是具有下列胺基酸序列的肽： Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO : 1)。 11·根據申請專利範圍第9項之抗原組合物，其中HIV肽是具有下列胺基酸序列的肽： -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1239848 A8 Β8 C8 __D8 、申請專利私圍 Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys ( SEQ ID NO : 2)。 12. 根據申請專利範圍第9項之抗原組合物，其中HIV肽是具有下列胺基酸序列的肽： Arg Gin lie lie Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu (SEQ ID NO : 3) 0 13. ·根據申請專利範圍第9項之抗原組合物，其中HIV肽是具有下列胺基酸序列的肽： Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO ·· 4)。 14·根據申請專利範圍第7項之抗原組合物，其中所用AGP為穩定水包油乳化液型式。 15·根據申請專利範圍第7項之抗原組合物，其另外包含稀釋劑或載劑。 16·根據申請專利範圍第7項之抗原組合物，其中AGP為 529 ° 17. —種佐劑調配物，其包括：（1)胺基酸烷基葡萄糖胺磷酸化合物（AGP)，或其衍生物或類似物，及（2)選自顆粒巨嗜細胞群落刺激因子（GM-CSF)及細胞間素-12(IL-12)所 -3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1239848 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍組成之群之細胞素或淋巴素之組合。 18. 根據申請專利範圍第17項之佐劑調配物，其中所用AGP 為穩定水包油乳化液型式。 19. 根據申請專利範圍第17項之佐劑調配物，其中可另外包含稀釋劑或載劑。 20. 根據申請專利範圍第17項之佐劑調配物，其中AGP為 529 ° -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239848 第090127895號專利申請案中文補充序列表(93年12月）序列表 <110>美商惠氏控股公司 <120>佐劑組合調配物 <140> 090127895 <141> 2001-11-9 <150〉US 60/247,100 <151> 2000-11-10 <150> US 60/330,345 <151> 2001-10-18 <160> 8 <170> Patentlnversion 3.2 <210> 1 1239848 <211> 40 <212〉蛋白質 <213〉人類免疫不全病毒 <220〉 <221〉MISC—FEATURE <223〉HIV之片段 <400〉 1 Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 15 10 15 Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro 20 25 30 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35

40 1239848 <210〉2 <211> 39 <212>蛋白質 <213〉人類免疫不全病毒 <220〉

<221〉MISC—FEATURE <223〉HIV之片段 <400> 2 Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 15 10 15

Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg lie His lie Gly Pro Gly 20 25 30 Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys 35 1239848 <210〉 3 <211〉 28 <212>蛋白質 <213〉人類免疫不全病毒

<220> <221〉MISC一FEATURE <223〉HIV之片段 <400〉 3 Arg Gin lie lie Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu 15 10 15

Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gin Met Leu 20 25 <210> 4 <211〉 39 1239848 <212>蛋白質 <213>人類免疫不全病毒 <220〉 <221〉MISC—FEATURE <223〉HIV之片段

<400〉 4 Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 15 10 15

Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly 20 25 30 Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg 35 <210> 5 1239848 <211〉 39 <212〉蛋白質 <213〉人類免疫不全病毒 <220〉

<221〉MISC一FEATURE <223〉HIV之片段 <400〉 5 Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15

Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser lie Gly Pro Gly 20 25 30 Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg 35 1239848 <210〉 6 <211〉 42 <212〉蛋白質 <213〉人類 <220〉

<221〉MISC—FEATURE <223>澱粉狀蛋白先驅蛋白質之片段 <400〉 6 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 1239848 <210〉 7 <211> 28 <212〉蛋白質 <213〉人類

<220> <221〉MISC一FEATURE <223>澱粉狀蛋白先驅蛋白質之片段 <400〉 7 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 <210> 8 <211〉 10 1239848 <212〉蛋白質 <213>人類免疫不全病毒 <220〉 <221〉MISC—FEATURE <223〉HIV之片段

<400> 8 Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr lie 1 5 10