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Procédé de préparation d'un vaccin. liquide des bactéries de Brucella abortus.
On sait depuis de nombreuses années que l'homme, les bovidés, les moutons, les chèvres et les porcs sont suscepti- bles d'être contaminés par des bactéries du groupe Brucella .
La bactérie Brucella abortus doit sa notoriété au fait qu'elle provoque notamment l'avortement épizootique chez les vaches.
Cette forme de brucellose entraîne non seulement la perte du foetus, mais peut être une cause directe de maladies et de baisse de production chez la mère. Chez les moutons et les chèvres, on rencontre des Infections provoquées par les Brucella melitensis qui engendrent également de graves maladies.
De très larges recherches ont été effectuées en vue de combattre efficacement les infections causées par la Brucella abortus. C'est ainsi qu'on est parvenu à cultiver cette bactérie
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sur milieu artificiel, tant solide que liquide, ce qui en principe, permettait de préparer des vaccins. D'autre part, on s'est effor- cé de déterminer quelles étaient les souches de cette bactérie qui, en pratique, procuraient l'immunité la plus efficace, sans provo- quer d'effets secondaires indésirables.
Parmi les différentes souches du groupe Bruoella abor- tus, on a notamment préparé des vaccins de la souche dite 19. Cet- te souche est avirumleetnet, administrée à l'état vivant, elle procure une bonne immunité. L'inconvénient est que les animaux traités à l'aide de ce vaccin présentât des titres d'agglutina- tion positifs, souvent persistants. Dès lors, ces animaux ne peu- vent plus être distingués sérologiquement par la suite, d'un ani- mal qui a contracté une infection naturelle. Une autre souche de
Brucella abortus, qui ne présente pas les inconvénients précités, est la souche 45/2- rough, sélectionnée par Mc. Ewen )Vet. Rec,
50, 1097, 1938).
Administrée à l'état vivant, cette souche procure une bonne immunité contre les infections produites par la Brucella abortus, alors qu'il n'apparaît pratiquement pas d'effets agglu- tinogènes. Du fait qu'après passage dans des animaux elle peut à nouveau reprendre une forme virulente, cette souche ne peut être appliquée que sous forme de vaccins inactivés.
Différents chercheurs se sont penchés sur le problème de la mise en formule la plus efficace du vaccin inactivé de
Brucella, Diverses publications ont apporté la démonstration du fait qu'un vaccin inactivé de Brucella abortus mis sous forme d'adjuvant procure une plus grande immunité que ce même vaccin placé dans un milieu uniquement aqueux (Live, J. Am. Veto Res.
10,34 (1949), Watkin & Dzenes, Can. J. of Comp. Med. and Veto
Sc. 16,78,1952 a).
Pour ces essais l'adjuvant était constitué par une huile minérale additionnée d'un émulsifiant. Comme émulsifiant, on utilisait l'Arlacel A, l'Arlacel B et le Falba.
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Ma. Ewen à également préparé un vaccin adjuvant inac- ttv4 à partir de la souche 45/20 rough, l'adjuvant étant constitué par quatre parties de paraffina -liquide B,P, et une partie de Falba (Vote Bec. 67, 546 (1955 . Il obtint une très bonne immuni- te su? des animaux d'expérience, sans qu'il se produise de titres dEEa'M-on géants, Me, Diarmid (Vêt. Poo ka 1067, 1957, 9et .
Roc, , Vit, 1960t Anne de l'Institut Pasteur 2,U, 792-799, 1962) a poursuivi les essais de Ma Ewen sur de petits animaux d'expérience . et sur des bovidés, et en a confirma les résultats,
Par contre, on a constate que ce vaccin provoquait un fâcheux gonflement local, que l'injection soit pratiquée par voie
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ântyamnsculaire ou sous-cutanée, Cet inconvénient est loin d'être ; négligeable du fait que la valeur des bovidés baisse, lorsque des gestions provoquent des modifications locales des tissus.
Or, la Demanderesse a mis au point un procédé de pré- parution d'un vaccin adjuvant d'une souche inactivée de Brucella
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afeortws, ainsi qu'un procédé d'administration d'un vaccin de ce genre gs'âce auquel on peut obtenir une immunité relativement élevée chez les bovidés, sans que la valeur du bétail en soit diminuée pour autant.
Des expériences effectuées par la Demanderesse ont per- mis de constater que la culture dans un milieu liquide donne un Fondement notablement plus élevé en bactéries de Brucella abor- tus que la culture sur milieu solide. D'autre part, la Deman- deresse à constaté qu'un vaccin fabriqué à l'aide d'une culture de ces bactéries dans un milieu liquide procure une plus grande immunité qu'un vaccin contenant le même nombre de ces bactéries cultivées sur un milieu solide. Ces résultats ont notamment été
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notes avec des bactéries de Brucella abortus Me. Ewen 45/20 rough ou avec des stades d'évolution de ces bactéries.
Suivant une forme préférée de l'invention on utilise spécialement les bactérien
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- de cette souche ou des stades d'évolution de ces bactéries.
De plus, la Demanderesse a constaté que les résultats atteints avec un vaccin adjuvant dont l'émulsifiant était consi- tué par un émulsifiant ea-dans-hytle .avec. une valeur H.L.B. de
1-8 et un émulsifiant huile-dans-eau avec une valeur H.L.B. de
13-18, alors que la quantité d'émulsifiant huile-dans-eau repré- sente 10 à 2% en volume, de l'émulsifiant eau-dans-huie, étaient meilleurs que ceux obtenus avec un vaccin adjuvant correspondant,, dans lequel on n'utilise qu'un émulsifiant, du type eau-dans-huile.
Le vaccin oonsidéré en premier lieu a une plus grande stabilité ! que le vaccin adjuvant de l'autre type et présente, à basse tem- pérature, une viscosité nutablement plus faible,
Ces avantages se manifestent en particulier lorsqu'on utilise comme ém7lifiant eau-dans-huile, les mono-, bi-, ou triesters d'oléate de mannide, de sorbitane, de mantine, ou des mélanges de ces esters, de préférence du mono-oléate de man- nide, et comme émulsifiant hile-dans-eau, des dérivés de poly- oxyéthylène d'esters d'un polyalcool et d'un acide gras, avec 12-20 atomes de carbone,
de préférence un dérivé de polyoxyéthy- lène d'huile de ricin qui contient en moyenne 35-45 groupes d'oxy- éthylène par molécule d'huile de ricin. Grâce à cette dernière propriété, le vaccin cité en premier lieu est plus aisément in- jectable que celui de l'autre type, alors que la grande stabilité de l'émulsion permet d'obtenir une longue action antigène et une haute immunité. La Demanderesse a également constaté qu'en in- jectant un vaccin adjuvant par voie intramusculaire, on évite en grande partie l'apparition d'un gonflement à l'endroit bü s'ef- fectue l'injection, ce qui n'est pas le cas lorsque le vaccin est administré par voie sous-cutanée. L'injection se fait de préférence dans les muscles du cou, juste devant l'omoplate.
A cet endroit, l'injection est pratiquement indolore, alors que le gonflement,' s'il se produit, n'a qu'une faible étendue, et se situe en un
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endroit où la viande a peude valeur. D'autre part, les muscles situés juste devant l'omoplate sont peu contractiles, de sorte que le vaccin reste bien localisé et qu'il ne peut se produire aucun gonflement en dehors de l'endroit où s'est effectuée l'in- jection. La vaccination est répétée au moins une fois, en vue d'obtenir une immunité maximale.
On procède de préférence à deux injections, séparées par un intervalle de 8 à 12 semaines. ! Lordqu'on procède de cette façon, l'immunité, compte tenu de différences éventuelles d'animal à animal, est aussi bonne que celle qui peut être obtenue avec une injection d'un vaccin vivant de la souche 19, avec l'avantage qu'il ne se pré- sente pas ou guère de titres d'agglutination.
Par suite du haut rendement en bactéries par ml de liquide de culture et de leur valeur immunisante, l'invention offre l'avantage supplémentaire qu'il est possible d'injecter-, A chaque vaccination une petite quantité de vaccin adjuvant (2 si) contenant un grand nombre de bactéries inaotivées, à avoir 40.109 par ml. de liquide de vaccin. En pratique, un Dopage plus faible, à savoir 200.109 bactéries suffit par in- Section.. En général, on administre 50-500.109 bactéries par injection par animal.
EXEMPLE On a ajouté, dans une ampoule contenant; des germes vivants ayant subi une cryodessichtion de Brucella abortus de al souche 45/20 (nombre total de germen 50.109). 2 ml d'une so- luiton saline tryptose, physiologique. Ensuite, dans 20 tubes rem- plis d'agar tryptose, on a versé 0,05 ml de la suspension pré- citée. Les tubes ont été conservés pendant 24 heures, tout en étant agités à l'air, à 37 C.
Ensuite on a ajouté à chaque tube,
2 ml d'un'agent liquide, dont on avait préparé un litre de la façon suivante:100- ml d'eau du robinet, 30 gr de protéose paptoj "Difco". 30 gr do glucose (qualité pharmaceutique) , 10 gr
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de complexe de vitamine B, sous forme d'extrait de levure, 2,004 gr de phosphate secondaire de sodium (NaNPO.2H2O).
A l'aide des cultures ainsi obtenues on a ensemencé des agitateurs contenant chacun 200 ml de l'agent liquide cité dans le précédent alinéa. Les agitateurs furent aérés deux fois pen- dant 24 heures, à 37 C Le contenu de chaque agitateur fut en- suite divisé en 10 parties égales et chaque partie versée dans un agitateur contenant 200 ml de l'agent liquide précité.
Chaque agitateur fut aéré deux fois, pendant 24 heures à 37 c. A la.fin.du troisième joue,con a compté le nombre de ger- mes (inacivéwou vivants) par ml. Celui-ci s'élevait en moyenne à 150.109 En d'autres mots, le facteur de multiplication était de 6 (concentration de départ des germes : 25.10 germes par ml).
Le nombre de germes vivants par ml. s'élevait dans les cultures, environ 75.10'. Ensuite les bactéries furent inactivées en chauffant les cultures à 60 c pendant deux heures. Le liquide fut centrifugé, le liquide clair rejeté et le produit de centrifgug- tion fut remis en suspension dans le l'eau additionnée de morthi- olate, dans le 'rapport de l à 10.000. La concentration finale des 'germes- s'élevait à 400.109 par m;l.
55 ml de la suspension ainsi obtenue furent homogé- néisés, goutte à goutte, tout en agitant énergiquement, dans des conditions stériles, dans un mélange stérile de 40 cm' d'huile de vaccin (marque Bayai F), viscosité 9 c.p.à 37,7 C trakret d'ébulltion 314-357 c. 4,7 cm3 de monaléage de mannide et 0,3 cm3 d'huile de ricin polyoxyéthylée contenant environ 40 moles d'oxyéthylène par mole d'huile de ricin.
Le vaccin ainsi préparé fut conservé pendant 4 mois, à 40 C, après quoi il était encore parfaitement stable et ne présentait aucune séparation d'huile. Lorsque, dans exactement les mêmes conditions, et avec l'utilisation des mêmes composants, mais en omettent l'huile de ricin polyoxyéthylée, on réalisa un second vaccin adjuvant,
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celui-ci présentait, après conservation dans les mêmes conditions, au bout de 4 mois, 65% de séparation d'huile rapportée à la quan- tité d'huile minérale initiale, tandis que la possibilité d'in- jection de ce dernier vaccin étaient notablement moindre, surtout à basse température (5-10 C)
Avec le vaccin adjuvant ainsi préparé,
on a vacciné des - bovidés dans les muscles du cou juste devant l'omoplate. On a in- jeeté à chaque animal 2 ml, contenant environ 400.109 bactéries ou germes. Parmi les sept animaux vaccinés, un seul d'entre eux présenta une réaction, alors que chez les autres animaux ne s'est mani- festé aucun gonflement ou ce gonflement n'était guère étendu.
Dix semaines après la première vaccination, on procéda à une se- conde injection du même vaccin, également à raison de 2 ml par animal.
Suivant un autre plan d'expérience, on a préparé un vaccin adjuvant d'un vaccin liquide obtenu hors d'une culture sur milieu solide de bactéries de Brucella abortus de la souche 4.5/20. Sur milieu solide, le rendement en germes est inférieur celui obtenu dans le milieu liquide.
Lors de la préparation du liquide de vaccin on a veillé à atteindre également une concen- tration de 400.109 germes par ml. La transformation de liquide de vaccin en vaccin adjuvant s'est faite de la même façon que pour la préparation du vaccin adjuvant d'un liquide de vaccin provenant d'une culture dans un milieu liquide, de sorte que l'on a obtenu finalement deux vaccins adjuvants contenant le même nombre de germes par ml. et qui ne différaient que par le mode de culture des germes, On a également injecté le second type de vaccin adju- vant à un groupe de sept bovidés, par voie intramusculaire, dans le cou, devant l'omoplate. Les dosages étaient identiques pour chaque animal et pour chaque groupe.
En vue de déterminer l'efficacité des vaccinations, on
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a déterminé, 6 et 12 semaines après la seconde vaccination, la concentration en anticorps protecteurs, en mesurant le titre de Coombs du sérum. Dans les deux cas, on a constaté que le vaccin adjuvant préparé à l'aide de bactéries cultivées dans le milieu liquide procurait un titre de Coo'mbs supérieur- à celui produit par le vaccin adjuvant préparé à l'aide de bactéries cultivées sur milieu solide.