LU82018A1 - Vaccins contre des maladies provoquees par des reovirus et procede de preparation de ces vaccins - Google Patents

Description

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La présente invention concerne des vaccins contre des maladies causées par le réovirus aviaire chez la volaille^qui sont fréquentes ces dernières années et qui provoquent de graves pertes économiques dans les éleva-5 ges de volailles. L'invention concerne aussi des vaccins combinés contre des infections de la volaille, de même que la préparation de ces vaccins.

On sait que les réovirus peuvent provoquer dif-i férentes maladies chez la volaille, comme l'arthrite/té-10 nosynovite, la myocardite, l'hépatite, 1'hydropéricarde, et des maladies des voies digestives et/ou des voies . respiratoires.

On trouve dans Avian Pathology 6 (1977) pages 271 à 28½, par exemple, une revue de différents micro-15 organismes pathogènes qui peuvent causer eux-mêmes ou en combinaison 1'arthrite/ténosynovite virale, comme Staphylococcus, Salmonella, Pasteurella, Erysipelotrix, Mycobacterium avium, Bacterium arthropyogenes, Escherichia venezuelensis, Streptobacillus monilliformis, 20 Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae,et de réovirus comme l'isolat S 1133 de réovirus Connecticut, le virus LZ 671 ou le virus RAM-1, les réovirus étant considérés comme les principaux inducteurs de l'affection.

Il a été observé que l'arthrite/ténosynovit.e virale et 25 d'autres affections causées par le réovirus jouent un rôle important en provoquant de graves pertes économiques dans les élevages de volailles dans de nombreuses , régions du monde.

De plus, on y propose un procédé pour assurer 30 la protection contre l'arthrite virale par vaccination pendant la période de croissance de même que par.transfert ultérieur des anticorps maternels aux descendants, cette vaccination étant faite avec des vaccins de réoviriE.

Il a été observé expérimentalement sous ce rap-35 port que l'immunisation des animaux parents protège uniquement les descendants de la première génération,mais non ceux de la seconde génération.

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On savait, par exemple d'après Avian Pathology n° 3, 7 b07~^O?) qu'une relation de synergie pourrait exister entre M. synoviae et le réovirus, bien qu'elle n'ait pas été prouvée de façon satisfaisante par l'induction ex-5 périmentale de symptômes observés antérieurement chez le poulet, comme l'inflammation de la membrane synoviale et de la gaine tendineuse, en particulier dans la région tarsométatarsienne, et la myocardite.

* Il ressort également de différentes publications 10 qui ont été faites, par exemple de Neth. J. Vet. Sei.

volume 3, n° 1 (1970) pages 5 à 10, que les réovirus, com-s me le réovirus LZ 671, sont considérés comme étant res ponsables de façon prépondérante des symptômes de synovite chez les parents de la jeune volaille.

15 En outre, il est mentionné dans Poultry Digest, février 1978, page 102, que le réovirus peut provoquer, chez la volaille jeune, une inhibition de croissance et de la diarrhée et que des infections orales avec suspensions de la digestion peuvent causer une inhibition de croissance 20 chez le poulet. Bien que le virus cultivé dans des oeufs ne provoque pas d'inhibition de croissance après administration par voie orale, mais induise un empâtement, l'injection intrapéritonéale du virus cultivé dans des oeufs in-hibe la croissance. Les symptômes de maladie observés sont 25 mis en relation avec une combinaison apparemment nécessaire d'agents infectieux.

D'autres part, des publications plus récentes indiquent que la cause des symptômes rappelant le rachitisme peut être attribuée principalement à la présence 30 de composés toxiques produits par des moisissures comme Fusarium moniliforme Sheldon.

On trouve dans Zbl. Vet. Med. B, 25 (1978) pages 29 à M+, par exemple, que les symptômes de rachitisme observés sur les poulets au cours des dernières années dans 35 différents pays semblent provoqués principalement par des . composés toxiques produits par la moisissure précitée qui ä paraît propre à se développer dans les aliments courants 3 « t pour la volaille à partir des spores potentiellement présentes, surtout lorsqu'il fait relativement humide en automne et en hiver.

Au cours des années précédant celles où se sont 5 manifestés les symptômes décrits, les symptômes de rachitisme observés pouvaient être combattus avec une raisonnable efficacité par un traitement vitaminé, mais ce dernier n'a pas permis de remédier aux symptômes observés ultérieurement ou s'est révélé sensiblement insuffisant, i r 1 10 Les expériences ont par conséquent visé à repro- | duire les symptômes observés ensuite par administration i ^ d'aliments choisis spécialement sous ce rapport et à in- j fluencer ces symptômes par administration de vitamines j et/ou de minéraux, de même qu'à étudier ces symptômes plus 15 en détail en évitant autant que possible la présence de maladies provoquées par des parasites ou micro-organismes pathogènes pour la volaille comme les réovirus, Mycoplasma gallisepticum et M. synoviae outre d'autres bactéries, suivant des techniques propres à cette fin.

20 La conclusion a été qu'en raison des propriétés nuisibles des métabolites, spécialement de Fusarium monoliforme, découverts au cours des dernières années et des symptômes de maladies relevés sur la jeune volaille, il doit exister une relation de causalité malgré le fait » 25 qu'aucune identification précise et décisive des métaboli-' tes réellement à l'origine de l'affection n'ait eu lieu.

Il ressort, par exemple de Feedstuffs, 8 mai " 1978j pages 95 et 96, que la cause réelle principale de ces symptômes de rachitisme n'a pas encore été découverte.

I 30 La Demanderesse a cependant découvert avec sur prise que les aberrations du squelette toujours plus fréquentes, par exemple les symptômes rappelant le rachitisme et l'ostéoporose, en l'occurrence la dégénérescence du fémur, chez la volaille et spécialement les poulets, s'ac-35 compagnant souvent d'inhibitions de croissance et de diar-, rhée peuvent être combattues par vaccination des animaux mères de la jeune volaille et de la descendance au moyen >71 1+ * de vaccins inactivés provenant de certains réovirus aviaôies On sait cependant, par exemple comme indiqué d dans Avian Pathology 6, page 279, que des tentatives avaient déjà été faites pour inhiber 1’arthrite/ténosyno-5 vite virale chez la volaille par vaccination au moyen de vaccins de réovirus, mais il n’était absolument pas évident pour le spécialiste d’utiliser des vaccins de réovirus pour combattre, par exemple, des symptômes rappelant * le rachitisme qui deviennent de plus en plus graves au . ‘ 10 cours des dernières années dans tous les pays du monde au point d’être un inconvénient exigeant avec une urgence toujours croissante une solution efficace.

La vaccination au moyen de vaccins de réovirus proposés conformément à l’invention est effectuée de pré-15 férence sur les animaux mères des jeunes et de préférence immédiatement avant la ponte de ces animaux pour éviter les aberrations de squelette indiquées ci-dessus, de même que la diarrhée et l’inhibition de croissance provoquées par les réovirus aviaires chez la volaille jeune par des j 20 infections à virus transitant par les oeufs et, en outre, pour protéger la descendance contre cette infection par I transfert d’immunité maternelle pendant les premières se maines après la naissance.

i Les vaccins conformes à l’invention peuvent être j 25 obtenus en préparant un liquide contenant du réovirus sui- ί vant des techniques connues, de préférence par culture '! d’un réovirus convenable, comme le réovirus LZ 671 qui a -j ! déjà été décrit en détail et dont un échantillon est dé- ! posé à la Collection de l’Institut Pasteur à Paris sous 30 le n° I.O92, dans un oeuf de poule embryonné ou dans une culture de fibroblastes d’embryon de poulet exempts d’agents j j pathogènes spécifiques en collectant le virus cultivé -;| dans un liquide d’un titre convenable et en l’inactivant, I en le mettant en suspension dans une solution convenable- || 35 ment tamponnée et éventuellement en l’homogénéisant.

|| Suivant un procédé préféré de préparation d’un i| liquide contenant un réovirus approprié, comme la souche : f 1 —

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« ! 5 ! > ! de virus déposée sous le n° 1.092 à la Collection de j l'Institut Pasteur à Paris, le virus est cultivé dans une ί culture de fibroblastes d'embryon de poulet exempts d'agaibs 1 pathogènes spécifiques, par exemple une culture en couche 5 monocellulaire en flacon roulant ou une culture de cellules attachées à des supports solides inertes, mais de.préfé-rence une culture en couche mono cellulaire en flacon roulari.

Il est préférable d'utiliser une culture de cellules obtenue par mise en suspension des cellules de dé-10 part dans un milieu de culture contenant au moins 85 à 95 I parties de milieu d'Eagle, avec ou sans addition de 5 ^ 15 parties de sérum de veau, une solution aqueuse de bicarbonate de sodium d'un titre de 2 à b% et 1 à 5 parties ] d'une solution ou suspension d'un ou plusieurs antibioti- 1 15 ques comme la pénicilline G, la streptomycine et la natamy- cine, le milieu de culture étant collecté lorsque la cul-j ture de cellules est presque confluente, j La solution des antibiotiques contient, par 1 exemple, 2 à 3 x 10** unités de pénicilline, 20 à 30 mg I 20 de streptomycine et 0,k a 0,8 mg de natamycine par ml.

(Après inoculation au moyen d'une suspension de virus, la culture est mise à incuber à 37°C pendant 30 à 180 minutes pour que le virus adhère, puis du milieu d'entretien est ajouté, lequel consiste en milieu d'en-25 tretien Eagle additionné de h a 6 parties de sérum de ;| - veau, en 3 à 6 parties de bouillon au tryptose phosphate j (à 10 g/litre) et en 10 à 20 parties de liquide amnioti que de boeuf et en les additifs précités, le milieu contenant le virus et les cellules étant récolté 12 a 72 30 heures après manifestation des effets cytopathogènes.

ILa culture de cellules est de préférence inoculée au moyen d'une suspension de réovirus ayant une activité de 2 x 10 à 10 doses infectieuses 50 pour culture de tissu/flacon de culture roulant et de préférence supé-35 rieure ou égale à 30 x 10 doses infectieuses 50 pour cul- Ί s i ture de tissu/flacon de culture roulant.

S L'inactivation du liquide viral de départ peut ! 6 être effectuée à l'aide des agents d'inactivation habituels, par exemple au moyen de ß-propiolactone, en combinaison ou non avec un stabilisant, ou au moyen de formaldéhyde ( 0,02-0,5%)» mais plus particulièrement 5 par addition de ß-propiolactone en une concentration de 0,05 à 0,25% en poids (sur la base du poids de la phase aqueuse) au liquide tamponné contenant le virus, puis par incubation de ce liquide pendant 1 à 2 heures 4 et de préférence 90 minutes à environ 37°C. Le liquide 10 contenant le virus est ensuite homogénéisé de la manière habituelle, si nécessaire. Si la chose est désirée, un agent de conservation peut être ajouté ensuite à la phase aqueuse, par exemple du thiomersal ou du formaldéhyde en solution tamponnée.

15 Pour la préparation du vaccin à administrer en pratique, une quantité de liquide contenant du réo-virus homogénéisé éventuellement et inactivé de 300 à 500 ml est ajoutée à 500 à 700 ml d'une phase huileuse. Cette phase huileuse comprend comme constituant essen-20 tiel au moins un constituant choisi parmi les huiles minérales paraffiniques légères (satisfaisant aux critères de qualité de la Food and Drug Administration des Etats-Unis d'Amérique), les huiles végétales et les huiles minérales naphténiques, ainsi qu'un ou plusieurs émulsion-25 nants appropriés sous forme de composés tensio-actifs non ioniques issus d'un oxyde d'alkylène et/ou d'alcools hexahydroxylés et/ou d'acides gras naturels supérieurs (de 10 à 20 atomes de carbone) comme des esters et ester-éthers. Les exemples en sont le monooléate de mannide 30 (vendu sous le nom de Span 80 et d'Arlacel A) et le monooléate de polyoxyéthylène(20)sorbitan (par exemple celui vendu sous le nom de Tween 80).

Le rapport volumique de la phase aqueuse formée par le liquide contenant le virus à la phase huileuse 35 peut s'échelonner de 1:1 à 3:7 et de préférence d'envi- a ron 7:13·

La Demanderesse a découvert que la phase aqueu-

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i ».

» » i l 7 |: j se doit être ajoutée à la phase huileuse sous vive agi- ! tation et/ou homogénéisation pour la formation de l'émulsion finale liquide fluide stable désirée.

La phase huileuse contient 2 à 20fâ en poids 5 (sur la base du poids de la phase huileuse) d'un émul-

Isionnant et de préférence 2 à 1% en poids d'Arlacel A, d'Arlacel 80 ou de Span 80 et 0,2 à de Tween 80. Les

constituants de la phase huileuse sont de préférence s chauffés séparément à l'autoclave Jusqu'à au moins 110°C

10 ou stérilisés par filtration à l'état de mélange, i L'invention a aussi pour objet les vaccins de virus inactivé dérivant d'au moins un liquide contenant un réovirus, c'est-à-dire tant des vaccins inactivés simples dérivant de réovirus, que des vaccins inacti-15 vés combinés prêts à l'usage et dérivant de réovirus I et d'un ou plusieurs autres virus. Ces vaccins inacti- ! vés combinés sont administrés contre différentes mala- | dies qui peuvent être provoquées par les réovirus eux- mêmes, par exemple 1'arthrite/ténosynovite virale, la 20 myocardite, l'hépatite, 1'hydropéricardè, les maladies des voies digestives et/ou des voies respiratoires, les j aberrations du squelette, telles que les symptômes rappe- | lant le rachitisme, l’ostéoporose, en l’occurrence la dé- j ‘ générescence du fémur, la diarrhée et l’inhibition de cicà&- | I 25 sance, outre les maladies principalement attribuées à l’action ; . de virus d’autres types,par exemple la maladie de Newcastle.

Il est bien connu de tout spécialiste que les symptômes de maladie peuvent être provoqués par des com-! binaisons de divers types de virus en présence. Sous ce 3O rapport, la volaille est, pour des raisons pratiques,vaccinée simultanément ou en succession rapprochée à l’aide de deux ou plusieurs vaccins de virus contre les af-1 fections virales les plus fréquentes, le procédé Jus qu'à présent habituel consistant à mélanger des volumes 35 normalisés de différents vaccins prêts à l'administration et à administrer la dose de vaccin ainsi composée έ3ΐη place, laquelle dose composée a donc généralement 8 un volume double de celui des vaccins administrés séparément. De plus, un mélange exact est impossible ou difficile à garantir et des agents infectieux étrangers peuvent être une source d'inconvénients.

5 La Demanderesse a donc cherché à. mettre au point un vaccin combiné amélioré prêt à l'administration qui assure une protection suffisante contre la maladie de Newcastle, de même contre une ou plusieurs des maladies * provoquées par le réovirus comme l'arthrite/ténosynovite 10 virale, la myocardite, l'hépatite, 1'hydropéricarde, les affections des voies digestives et/ou des voies respiratoires, les aberrations du squelette, comme les symptômes rappelant le rachitisme, l'ostéoporose, en l'occurrence la dégénérescence du fémur, la diarrhée et l'inhibition de 15 croissance.

L'invention a donc pour objet des vaccins inactivés combinés contre la maladie de Newcastle et les infections par réovirus, qui dérivent au moins de liquides contenant du virus de la maladie de Newcastle et du réovirus. 20 II convient de noter que des vaccins inactivés combinés dérivant de plus de ces deux types de virus précités peuvent aussi entrer dans le cadre de l'invention, par exemple des vaccins combinés dérivant de réovirus, du virus de la maladie de Newcastle et de virus adenolike.

25 La maladie de Newcastle est restée l'une des af fections respiratoires les plus graves de la volaille et peut induire chez celle-ci à tout âge une mortalité fort élevée, surtout chez les jeunes.

Différents vaccins ont été mis au point contre 30 la maladie de Newcastle et il en est ressorti que ces vaccins sont administrés de préférence sous la forme inactivée, parce que cette forme procure une sécurité élevée et établit des titres élevés en anticorps humoraux, spécialement après revaccinations. De plus, l'administration du 35 vaccin vivant provoque parfois la dissémination du virus I d'inoculation à partir de la volaille vaccinée à de la cij- volaille susceptible d'être infectée ou non immunisée.

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Bien que différents vaccins vivants assurant une bonne immunité contre la maladie de Newcastle et relativement sûrs aient été mis au point entre-temps, comme il ressort du brevet anglais n° 1. 510· 100, il existe encore 5 un besoin évident pour des vaccins inactivés contre la maladie de Newcastle.

Des vaccins inactivés combinés contre les af-\ fections respiratoires chez la volaille,«caractérisés * " I s par la combinaison d'un vaccin mort contre le coryza . ' 10 infectieux, obtenu par culture d’une souche d’Haemophilus gallinarum dans un milieu nutritif naturel et par inactivation des bactéries, avec un vaccin mort d’un virus de bronchite infectieuse et un vaccin mort contre la j maladie de Newcastle sont connus, par exemple dans la 15 demande publiée de brevet hollandais n>°71-17 873 (publiéepour opposition sous le n°l57 209).

Le brevet des Etats-Unis d’Amérique n°2.798.835 décrit des vaccins combinés .qui consistent en une combi-i naison d'un vaccin contre la bronchite infectieuse et | 20 d’un vaccin contre la maladie de Newcastle, les deux con- J stituants provenant de virus vivants.

8 Suivant le procédé de l'invention pour préparer les vaccins combinés, on prépare un liquide inactivé contenant du virus de la maladie de Newcastle suivant 25 une technique connue, par exemple par ^culture du virus j - désiré dans un oeuf de poule embryonné, collecte du ί virus cultivé dans un liquide d'un titre habituel pour !ce genre de vaccin et inactivation, mise en suspension du virus dans une solution tamponnée appropriée et/ou 30 homogénéisation, et on mélange ce vaccin avec un liquide I inactivé de réovirus obtenu par culture du virus suivant les techniques décrites ci-dessus, collecte du virus formé dans un liquide d’un titre convenant pour ce genre de vaccin et inactivation du liquide contenant le virus sui- 135 vant des techniques connues.

t Pour la préparation du liquide contenant du virus jL de la maladie de Newcastle, on peut utiliser divers D? 10 virus de la maladie de Newcastl= peu virulents ou pratiquement avirulents, lentogènes ou vélogènes et qui ont un ; bon pouvoir immunisant, par exemple le virus La So ta ou :

Hitchner (lentogène) ou le virus Herts 33/56 (vélogène).

5 ‘ Des exemples de souches de virus convenables

sont les souches P/76/5, P/76/v et P/76/3 qui peuvent J

ûtre obtenues à l'Institut für Medizinische Mikrobiolo- j gie, Infections und Seuchenmedizin der Ludwig Maximi- | lians Universität, München, les souches VR-108, VR-107, j 3 10 VR-109, VE-699 Qt VE-623 qui peuvent être obtenues à j l’Américan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 1

Etats-Unis d'Amérique, la souche Queensland Yk qui peut être obtenu** au Centr. Vet. Lat-, Veybridge, Grande-Bretagne et le virus LZ258P. déposé à la Collection de 15 l'Institut Pasteur à Paris sous le n°I.09l.

Pour la préparation des vaccins combinés, on inactive 150 à 250 ml de liquide contenant du virus de la maladie vie Newcastle qu'on homogénéise éventuellement et on ajoute cette quantité de liquide, de même que 20 100 à 250 ml de liquide contenant du réovirus, inactivé et éventuellement préalablement homogénéisé, à 5°°"700 ml d’une phase huileuse de la composition déjà indiquée. Les » liquides contenant du virus ont de préférence été tampemés.

Le rapport volumique du liquide contenant du 25 virus de la maladie de Newcastle au liquide contenait-du réovirus peut s'échelonner de 3^ à 5:1 et de préférence d*environ 3:2.

Le rapport volumique de la phase aqueuse formée par les deux liquides contenant du virus à la phase hui-30 leuse peut varier de 1:1 à 3:7 et de préférence d'environ 7’·13·

La demanderesse a découvert que la phase aqueuse doit êtif ajoutée à la phase huileuse sous vive agitation et/cû homogénéisation peur la formation de.

35 l'émulsion finale liquide fluide stable qui est désirée. j' La phase huileuse contient 2 à 2QP/o en poids (sur la base du v°ids de la phase huileuse) d'un émulsionnant jp 11 .

i et contient de préférence 2 à 15% en poids d'Arlacel A, d'Arlacel 80 ou de Span 80 et 0,2 à k% de Tween 80. Les ; constituants de la phase huileuse sont de préférence I chauffés à au moins 110°C séparément à l'autoclave ou 5 stérlisés par filtration à l'état de mélange.

L'inactivation des deux liquides constitutifs de départ contenant du virus peut être effectuée à l'aide des agents d'inactivation habituels, par exemple' . au moyen de ß-propiolactone, éventuellement en combinai-10 son avec un stabilisant, ou de formaldéhyde. De préférence, la ß-propiolactone est ajoutée en concentration de 0,05 à 0,25% en poids (sur la base du poids de la phase aqueuse) à un liquide tamponné contenant du virus de la maladie de Newcastle et ce liquide est mis à incu-15 Lei1 à 37°C pendant 1 à 2 heures et de préférence 90 minutes, tandis que le liquide tamponné contenant du réo-virus est également inactivé au moyen de ß-propiolactone, | éventuellement en combinaison avec un stabilisant, en une concentration de 0,05 à 0,25% en poids à 37°C pendant 20 1 à 2 heures. Ensuite, les liquides contenant du virus sont homogénéisés de la manière habituelle, si la chose est nécessaire. Un agent de conservation peut être ajouté à la phase aqueuse, par exemple du thiomersal ou du formaldéhyde en solution tamponnée.

25 Pour la préparation de vaccins combinés appro priés ayant les bonnes propriétés désirées, un liquide contenant du virus de la maladie de Newcastle d'un titre de 10^1^ à 1010’^ doses infectieuses 50 pour embryon/ml

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et de préférence supérieur ou égal à 10 doses infec- 30 tieuses 50 pour embryon/ml et un liquide contenant du J 5 5 7 5 réovirus d'un titre de 10 ’ à 10'’' doses infectieuses 50 pour embryon/ml et de préférence de plus de 10 ,udoses infectieuses 50 pour embryon/ml doivent être utilisés.

Les vaccins préparés de la sorte sont de préfé-35 rence administrés à l'animal mère du jeune âgée de 1 à 30 : semaines et de préférence de 10 à 20 semaines, avant la I ponte.

r 12

Il convient de noter que la réponse immunologique qui est manifestée après l’administration des vaccins combinés, qui s’est révélée être du même ordre de grandeur que celle induite par les vaccins viraux dis-5 tincts, n’était nullement à prévoir ou prédire par le spécialiste, du fait que cette réponse immunologique aux vaccins combinés, comparée à celle induite par l’un des vaccins distincts ou les deux, aurait pû diminuer jusqu’à une valeur inacceptable à cause de nombreuses interactions 10 indésirables des liquides viraux constitutifs entre eux ou avec les agents auxiliaires utilisés, qu’il n’était pas possible d’exclure à priori.

En particulier, il pouvait être à prévoir que la Æ-propiolactone utilisée resterait active trop long-15 temp à l’égard de l’un des virus constitutifs en raison d’une décomposition moins rapide dans le mélange.

L’administration du vaccin combiné de l’invention offre l’avantage que le volume à administrer en une fois est plus petit, ce qui atténue les irritations locales et 20 réduit l’apport d’agents chimiques étrangers à l’organisme, ou que moins de vaccinations distinctes sont nécessaires. De plus, les inconvénients précités à propos du mélange et de la présence de matières infectieuses anormales sont supprimés.

25 L’invention est illustrée par les exemples sui vants.

EXEMPLE 1. -

Préparation d’un vaccin de réovirus a) Culture du réovirus 30 On inocule des oeufs exempts d’agents pathogènes spécifiques embryonnés depuis 10 jours au moyen de virus d’ensemencement IZ 67I. Après 76 heures d’incubation à 37°C, on recueille le liquide allantoîque d’amnios. Le liquide allantoîque d’amnios contient environ 10^’° doses 35 infectieuses 5° pour embryon/ml. On congèle la suspension à de virus à -20°C et on la conserve pour la préparation du vaccin.

! 13 j j : b) Traitement de la suspension de virus

On fait dégeler la suspension de virus congelée et on 1* inactive au bain-marie à 37°C pendant 90 minutes j au moyen de 0,05 à 0,25# de £-propiolactone. On conser- !5 ve la suspension alors jusqu’au lendemain à + **°0. On vérifie l’inactivation par observation de l’apparition des effets cytopathogènes sur fibroblaste d’embryon de poulet, puis par hémabsorption. De plus, on met des oeufs de poule exempts d’agents pathogènes spécifiques préalablement » ‘ 10 embryonnés à incuber avec le liquide inactivé contenant du virus et on vérifie ultérieurement leur état.

On homogénéise les suspensions de virus au moyen d’un homogénéiseur Ultra Turrax. On dilue l’émulsion éventuellement avec de la solution physiologique salée tam-Ί 15 ponnée au phosphate additionnée de 0,3# de solution de ) formaldéhyde, suivant la valeur de la dose infectieuse 50 j pour culture de tissu ou de la dose infectieuse 50 pour |i embryon du liquide allantolque d’amnios et aussi suivant le titre de la suspension de réovirus. On mélange le li-20 quide allantolque d’amnios contenant du virus de la mala- !die de Newcastle et la suspension de réovirus ensuite dans un rapport de 6:*+ et on utilise le mélange pour préparer l’émulsion.

c) Préparation de l’émulsion 25 On injecte la suspension de virus dans une phase huileuse à la température ambiante tandis qu’on homogé-! néise le tout à l’aide d’un homogénéiseur Ultra Turrax.

i On arrête l’addition de la phase aqueuse lorsque le rap- port de la phase huileuse à la phase de suspension de vi-30 rus est de 6,5*3)5· On poursuit l’homogénéisation jusqu’à J ce que la dimension des gouttelettes de la phase aqueuse i soit d’environ 0,05 a 0,5 micron.

I La constitution de la phase huileuse utilisée 'il -1 est la suivante : μ 35 Marcol 52 (huile paraffinique blanche, Société Esso)93,6# j Arlacel A, Arlacel 80 ou Span 800(monooléate de mannide), ^ 6 3 ! / 1k

Tvreen 80 (monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitan^,^ On chauffe séparément à 110°C à l’autoclave les différents constituants de la phase huileuse ou bien on les stérilise par filtration à l’état de mélange.

5 On obtient ainsi une émulsion stable dont on fait 1’épreuve 1) en pipettant, directement après la mise en émulsion, des gouttes sur une surface d’eau auquel cas les goutte-* lettes ne s’étalent pas et restent intactes; 10 2) en conservant l’émulsion à 37°C pendant *+· semaines sans qu’il se forme de phase aqueuse. Les concentrations finales de l’émulsion ainsi obtenue sont de 21% de liquide tamponné contenant du virus de la maladie de Newcastle et de lk% de liquide tamponné contenant du réovirus. Le vaccin 15 ainsi obtenu peut être administré en dose de 0,5 ml par animal par voie intramusculaire dans les muscles de la poitrine ou de la patte ou par voie sous-cutanée au cou. EXEMPLE 2. -

Préparation d’un vaccin combiné de réovirus et de virus 20 de la maladie de Newcastle a) Culture du réovirus (souche IZ 671)

On prépare des cultures de cellules à partir d’oeufs de poule embryonnés depuis 10 jours dans des flacons de culture roulants (Bellco) en utilisant fes fibro-25 blastes d’embryon de poulet dans du milieu d’Eagle additionné de 10% de sérum de veau nouvellement mis bas, contenant 0,22% en poids de bicarbonate de sodium et 2% en volume d’une solution d’antibiotiques comprenant, par ml, 25 x 10-3 unités de pénicilline G, 25 mg de streptomycine 30 et 0,6 mg de natamycine.

On aspire le milieu lorsque les cultures de cellules sont pratiquement confluentes. On inocule alors les cultures au moyen d’une suspension du virus LZ 671 et on les recouvre de milieu d’entretien d’Eagle contenant b% 35 en volume de sérum de veau, b% en volume de bouillon au tryptose phosphate (à 100 g/litre), 15% de liquide amnio-—tique de boeuf, 0,22% en poids de bicarbonate de sodium

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15 i et 3$ en poids de la solution d'antibiotiques précitée.

On récolte le milieu contenant le réovirus avec j les cellules 1 jour après la manifestation des effets | cytopathogènes.

! ^ 5 On congele la suspension de virus à -20°C et on la conserve pour la préparation du vaccin. On détermine la dose infectieuse 5° pour culture de tissu de cette suspen- i s ion.

Ib) Culture du virus de la maladie de Newcastle 10 On inocule un virus d»ensemencement LZ 258P à des oeufs exempts d'agents pathogènes spécifiques embryon-nés depuis 11 jours. Après incubation à 37°C pendant 72 heures, on recueille le liquide allantoîque d'amnios. Ce- ! 10 lui-ci contient alors environ 10 doses infectieuses 50 15 pour embryon/ml.

On congèle la suspension de virus à -20°C ou à I une température plus basse et on la conserve pour la pré paration du vaccin.

i j c) Traitement des suspensions de virus j 20 On fait dégeler les suspensions de virus conge- I lées et on les inactive au bain-marie à 37°c pendant 90 I minutes au moyen de 0,05 à 0,25$ de Æ-propiolactone. On j conserve les suspensions jusqu'au lendemain à +V°C. On vérifie l'inactivation en observant la manifestation des I 25 effets cytopathogènes sur fibroblaste d'embryon de poulet ou bien en effectuant une détermination de la dose infectieuse 50 pour embryon pour le réovirus et de la dose infectieuse 50 pour embryon pour le virus de la maladie de Newcastle.

! On homogénéise les suspensions de virus à l'aide 30 d'un homogénéiseur Ultra Turrax. Eventuellement, on dilue la suspension avec de la solution physiologique tamponnée au phosphate additionnée de 0,3$ de formaldéhyde suivant la valeur de la dose infectieuse 50 pour culture de tissu ou la dose infectieuse 50 pour embryon, j 35 On mélange alors les suspensions de virus de la j * maladie de Newcastle et du réovirus dans un rapport de 6:1* I et on les utilise pour préparer l'émulsion.

16 d) Préparation de l’émulsion On injecte le mélange des suspensions de virus dans la phase huileuse à la température ambiante en exécutant simultanément l’homogénéisation au moyen de l’homo-5 généiseur Ultra Turrax. On arrête l’addition de la phase aqueuse lorsque le rapport est de 6,5 parties de phase huileuse pour 3,î> parties de suspension de virus. On poursuit l’homogénéisation jusqu’à ce que la dimension des gouttelettes de la phase aqueuse soit d’environ 0,05 à 10 0,5 micron.

La phase huileuse utilisée a la composition suivante s

Marcol 52 (huile paraffinique blanche, Société Esso)93,6$ Arlacel A, Arlacel 80 ou Span 80 (monooléate de mannide) 15 6,0%

Tween 80 (monooléate de polyoxyéthylène(20)sorbitan)0,1+% On chauffe les constituants de la phase huileuse séparément à 110°C à l’autoclave ou bien on les stérilise par filtration à l’état de mélange.

20 Les concentrations finales de l’émulsion ainsi préparée sont de 21J6 de liquide tamponné contenant du virus de la maladie de Newcastle et de lb% de liquide tamponné contenant du réovirus. Le vaccin résultant est administré en dose de 0,5 ml par animal par voie intramus-25 culaire dans les muscles de la poitrine ou de la patte ou par voie sous-cutanée au cou. Des anticorps sont décelables par immunodiffusion 10 jours après la vaccination. EXEMPLE q.-

Préparation d’un vaccin combiné de réovirus et de virus de 3O la maladie de Newcastle a) On prépare un liquide contenant du réovirus en opérant çomme au stade correspondant de l’exemple 1.

On inactive la suspension de virus au moyn de 0,02 à 0,5$ de formaldéhyde pendant 20 heures à 22°C, puis on homo-3*? généise la suspension dans un homogénéiseur Ultra Turrax. ji b) On prépare du liquide contenant du virus de 1/ la maladie de Newcastle en opérant comme au stade corres- 9t · Λ ;ί 17 i -·} il il pondant de 1*exemple 2. On exécute le traitement de cette il suspension de virus de la maladie de Newcastle comme dans | l’exemple 2.

c) On mélange le liquide allantoîque d’amnios 5 contenant du virus de la maladie de Newcastle et le liquide allantoîque d’amnios contenant du réovirus ainsi traités ensuite dans un rapport de 5:k.

d) On ajoute le mélange des suspensions de virus . à une phase huileuse à laquelle on l’incorpore dans le 10 rapport de 6 parties de phase huileuse pour *+ parties de liquide contenant du virus et on en prépare une émulsion par passage au broyeur colloïdal. La phase huileuse utilisée a la composition suivante :

Mareol 52 (huile paraffinique blanche, Société Es so )91,^ |) 15 Arlacel A, Arlacel 80 ou Span 80 (monooléate de mannide) || 8,0% ! îween 80 (monooléate de polyoxyéthylène(20)sorbitan)0, β%- \: t ζ i: 1Γ i 7 ! l; : i ! l·'! ; I I i ! ·· i <

Claims (15)

1. Vaccin inactivé contre les aberrations du squelette comme les symptômes rappelant le rachitisme et l'ostéoporose, en l'occurrence la dégénérescence du fémur 5 provoquées par des réovirus aviaires isolément ou en combinaison avec d'autres chez la volaille.

2. Vaccin inactivé contre les aberrations du squelette comme les symptômes rappelant le rachitisme et l'ostéoporose, en l'occurrence la dégénérescence du fémur, 10 provoquées par des réovirus aviaires isolément ou en combinaison avec d'autres et contre la diarrhée et l'inhibition de croissance provoquées par des réovirus aviaires chez la volaille.

3. Vaccin inactivé suivant les revendications 1£ 1 et 2, caractérisé en ce qu'il dérive de la souche LZ 671· h - Procédé pour prévenir les aberrations du squelette comme les symptômes rappelant le rachitisme et l'ostéoporose, en l'occurrence la dégénérescence du fémur, provoquées par des réovirus chez la volaille, caractérisé 20 en ce qu'on vaccine la volaille au moyen du vaccin suivant les revendications 1, 2 et 3 de manière classique.

5. Vaccin inactivé combiné prêt à l'administration contre la maladie de Newcastle et les symptômes de ’ maladie provoqués par les réovirus chez la volaille. 25 6 - Vaccin inactivé combiné suivant la revendica tion 5, caractérisé en ce qu'il dérive d'un liquide contenant au moins un réovirus obtenu par culture de la souche ΙΣ 67I déposée à la Collection de l'Institut Pasteur à Paris sous le n° 1. 092. 30 7 - Vaccin inactivé suivant les revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce qu'il contient une phase huileuse dont au moins un constituant essentiel est choisi dans la classe comprenant les huiles minérales paraffiniques légères (satisfaisant aux critères de la 35 Food and Drug Administration des Etats-buis d'Amérique), t les huiles végétales et les huiles minérales naphténiques, I conjointement avec un ou plusieurs émulsionnants appropriés t i !9 ä i : sous forme de composés tensio-actifs non ioniques issus d'un oxyde d'alkylène et/ou d'alcools hexahydroxylés et/ou d'acides gras naturels supérieurs (en C-^q à C2q), comme des esters ou ester-éthers.

8. Vaccin inactivé suivant les revendications 1, 2, 3, 5, 6 eu 7, caractérisé en ce que le rapport volumique'de' la phase aqueuse formée par le liquide contenant du virus à la phase huileuse s'échelonne de * 1:1 à 3:7 et est de préférence d'environ 7·13· , 10 9 - Vaccin inactivé suivant les revendications 1, 2, 3» 5, 6, 7 et 8, caractérisé en ce que la phase I . huileuse contient 2 à 2CP/o en poids d'un émulsionnant ä (sur la hase du poids de la phase huileuse) et de pré férence de 2 à 15% en poids d'Arlacel A, d'Arlacel 80 15 ou de Span 80 et 0,2 à k% de Tween 80.

10. Vaccin inactivé combiné suivant les reven- ; dications 5 et 6, caractérisé en ce que le rapport vo- Ilumique du liquide contenant du virus de la maladie de Newcastle au liquide contenant du réovirus s'échelonne 20 de 3:½ à 5:1 et est de préférence d'environ 3:2.

11. Procédé pour prévenir les symptômes provoqués par le virus de la maladie de Newcastle et les réovirus aviaires chez la volaille par vaccination de celle-ci-au moyen du vaccin suivant l'une quelconque ! 25 des revendications 5 à 10 de manière classique. . i

12. Procédé de préparation d'un vaccin de réo- 3 virus inactivé, caractérisé en ce qu'on prépare du li- | quide contenant du réovirus en cultivant un réovirus i approprié comme la souche LZ 671 dans un oeuf de poule 3O embryonné ou dans une culture de fibroblastes d'embryon i de poulet exempts d'agents pathogènes spécifiques sous forme de culture en couche monocellulaire en flacon roulant ou d'uné culture de cellules fixées sur des supports inertes solides, on recueille le virus cultivé dans un i 35 liquide d'un titre convenable, on inactive le virus, on I *1 le met en suspension dans une solution tamponnée appro- J! priée et, éventuellement, on l'homogénéisé. 20

13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce qu'on cultive le réovirus dans une culture de cellules sous forme d'une culture en couche monocellulaire en flacon roulant ou d'une culture de cellules 5 fixées sur des supports inertes solides des cellules de départ dans un milieu de culture comprenant au moins 8? à 95 parties de milieu d'Eagle avec addition éventuelle de 5 à l5 parties de sérum de veau, une solution de bicarbonate de sodium d'un titre de 2 à \°/o et 1 à 5 * 10 parties d'une solution ou suspension d'un ou plusieurs antibiotiques comme la pénicilline G, la streptomycine et la natamycine, on sépare le liquide de culture lorsque la culture de cellules est presque confluente,on inocule la culture au moyen d'une suspension de virus, on 15 met la culture à incuber à 37°C pendant 30 minutes à 3 heures pour fixer le virus et on ajoute un milieu d'entretien consistant au moins en milieu d'Eagle avec ^ à 6 parties de sérum de veau,en3 à 6 parties de bouillon au tryptose phosphate (à 10 g/litre), en 10 à 20 20 parties de liquide amniotique de boeuf et en les additifs précités, puis on récolte le milieu contenant du virus et les cellules 12 à 72 heures après la manifestation des effets cytopathogèhes. * lh - Procédé suivant les revendications 12 et 25 13? caractérisé eh ce qu'on inocule la culture de cellules au moyen d'une suspension de réovirus ayant une activité de 2 x 10^ à 10 et de préférence de plus de 30 x 10^ doses infectieuses 50 pour culture de tissu par flacon de culture roulant. 30 15 - Procédé de préparation d'un vaccin inacti vé combiné prêt à l'administration contre la maladie de Newcastle et les symptômes de maladie provoqués par des réovirus, caractérisé en ce qu'on inactive un liquide contenant du virus de la maladie de Newcastle, 35 on l'homogénéisé éventuellement et, conjointement avec / un liquide contenant un réovirus qui a été inactivé et éventuellement homogénéisé au préalable, on l'ajoute à « 21 » une phase huileuse contenant comme constituant essentiel au moins un constituant choisi parmi les huiles minérales paraffiniques légères (de qualité satisfaisant auxcritères de la Food and Drug Administration des 5 Etats-Unis d'Amérique), les huiles végétales et les huiles minérales naphténiques et un ou plusieurs émulsion*” nants appropriés sous forme de composés non ioniques tensio-actif s dérivant d'un oxyde d'alkylène et/ou d'al-, cools hexahydroxylés et/ou d'acides gras naturels supé-10 rieurs (en C^q à C^q) comme des esters et ester-éthers, un agent de conservation étant éventuellement ajouté à la phase aqueuse.

16. Procédé suivant la revendication l5,caractérisé en ce qu'on utilise comme agent d'inactivation 15 pour les deux liquides contenant du virus de la ß-pro-piolactone, éventuellement mélangée avec un stabilisant.

17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'on ajoute la ß-propiolactone en concen- ! tration de 0,05 à 0,25% en poids (sur la base du poids I 20 de la phase aqueuse) au liquide tamponné contenant du i virus.

18. Procédé suivant la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce qu'on exécute l'incubation à 37°C pendant 1 à 2 heures. 25 19 - Procédé suivant la revendication l5, carac térisé en ce qu'on part d'un liquide contenant du virus de la maladie de Newcastle ayant un titre de 10^’^ à 1010>5 doses infectieuses 50 pour embryon/ml.

20. Procédé suivant la revendication 19, carac-ί 30 térisé en ce qu'on part d'un liquide contenant du virus j de la maladie de Newcastle ayant un titre de plus de j 1010 doses infectieuses 50 pour embryon/ml.

21. Procédé suivant la revendication 15, ca- ractérisé en ce qu'on part d'un liquide contenant du 35 réovirus ayant un titre d'au moins 10^’^ à 10^’^ doses /j infectieuses 50 pour embryon/ml et de préférence de _J^ plus de 10^’0 aux doses infectieuses 50 pour embryon/ml. H 22

22. La souche LZ 671 de réovirus déposée à la Collection de l’Institut Pasteur à Paris sous le n° 1. 092. * f « t